WO2012171084A1 - Sistema polimerico de confinamento de insulina, processo e uso de dito sistema - Google Patents

Sistema polimerico de confinamento de insulina, processo e uso de dito sistema Download PDF

Info

Publication number
WO2012171084A1
WO2012171084A1 PCT/BR2012/000183 BR2012000183W WO2012171084A1 WO 2012171084 A1 WO2012171084 A1 WO 2012171084A1 BR 2012000183 W BR2012000183 W BR 2012000183W WO 2012171084 A1 WO2012171084 A1 WO 2012171084A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
insulin
polymeric
release
phase
pva
Prior art date
Application number
PCT/BR2012/000183
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Luis Maurício TRAMBAIOLI DA ROCHA E LIMA
Camile Moreira Mascarenhas
Eduardo RICCI JÚNIOR
Luiz Henrique Guerreiro Rosado
Original Assignee
Universidade Federal Do Rio De Janeiro - Ufrj
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidade Federal Do Rio De Janeiro - Ufrj filed Critical Universidade Federal Do Rio De Janeiro - Ufrj
Publication of WO2012171084A1 publication Critical patent/WO2012171084A1/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1641—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poloxamers
    • A61K9/1647—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones

Definitions

  • the present invention relates to a polymeric insulin confinement system developed for use, among others, as a medicament in the replacement therapy of this pancreatic hormone in diabetes.
  • the present invention also discloses the process of preparing said polymeric system.
  • Insulin is a pancreatic protein with hormonal activity involved in the regulation of blood glucose in postprandial and basal situations. Insulin replacement therapy has been in place for decades, especially with the advent of recombinant human insulin.
  • Human insulin therapy is currently performed by subcutaneous administration of formulations of this hormone obtained by biosynthetic or semi-biosynthetic route, aiming at the control of glycemia at various levels and time scales.
  • Regular human insulin has a range of action around 2 to 5 hours. In order to use this insulin, it must be given before about 30 min before meal. This way, it is not able to take immediate action, nor can it maintain circulating insulin levels for a long time.
  • Patent application WO 2010/028257 discloses the use of non-aqueous vehicles such as di- and triglycerides or fatty acids for formulations containing microparticles without, however, describing the preparation of the microparticles.
  • This document addresses the resuspension of protein lyophilisate in an oil as a carrier without the use of nano technology and / or polymeric microencapsulation.
  • WO 96/31231 discloses the preparation of insulin-containing polycyanoacrylate nanoparticles.
  • different polymers are used for the formation of nano and microparticles. From a process point of view, the differences are also striking, since in WO 96/31231, matrix polymerization occurs in situ and is concurrent with insulin nanoencapsulation and nanoparticle formation.
  • the polymer used is already formed and it is only dissolved in compatible solvent which, after solubilization of the polymer, is incorporated into the formulation using kinetic energy for microparticle formation and insulin encapsulation. .
  • WO 2006/088473 describes chitosan micro and nanoparticles containing peptides or proteins, and such particles may or may not be coated by lipophilic polymers such as polycaprolactone.
  • ⁇ - ⁇ -caprolactones are the matrix forming agents and there is no particle coating.
  • the system is totally chitosan independent for its functionality. It is further noted that the processes for obtaining the particles also differ as the present formulations are obtained by double emulsion followed by extraction of volatile solvents, whereas in the cited application, WO 2006/088473, insulin is incorporated directly into the particles.
  • the present invention discloses a polymeric insulin confinement system developed for use, among others, as a medicine in the replacement therapy of this pancreatic hormone in diabetes.
  • the present invention also discloses the process of preparing said polymeric system.
  • a polymeric particulate system in order to obtain a formulation capable of being administered as a drug capable of prolonged glycemic control based on human insulin, a polymeric particulate system was developed, with size distribution particularly in the micro and nanometric bands, with biphasic release profile. insulin, able to act on blood glucose in the fast phase (1 to 4 hours after subcutaneous injection) and in the slow phase, with in vitro release for at least 10 days.
  • Figure 1 Size distribution of insulin-containing microparticles (data obtained by dynamic light scattering).
  • Figure 2 Image of particles containing human insulin obtained by scanning electron microscopy (SEM) (magnification and size bar indicated at the bottom of the microscopy).
  • Figure 3 In vitro release kinetics (saline phosphate buffer - PBS pH 7.4 at 37 ° C) of microencapsulated insulin in poly-s-caprolactone - PCL particles.
  • Inset: Detail showing initial times. Continuous lines are adjustments with equation C 0bS C 0 + Ai * e ("kl * t) + A 2 * and (" k2 * t) double-order first kinetics.
  • Figure 4 Pharmacological effect of insulin-containing microparticles in diabetic mice (streptozotocin induction, blood glucose greater than 300 mg / dL).
  • Figure 5 Release of human insulin from 50:50 poly D, L-laticoglycolic acid polymer microparticles, M ⁇ 43,000 to 65,000.
  • the polymeric insulin confinement system of the present invention preferably contains particles of polycaprolactone and poly D 1 -loglycolic acid. Its use as a medicine for insulin replacement therapy occurs in the slow and rapid phases.
  • the process of preparing said polymeric system uses double emulsion followed by extraction of volatile solvents.
  • the problem that the present invention lends itself to The solution is to provide a biphasic profile polymeric confinement system with mixed actions.
  • a system based on polymer particles selected from the group consisting of polycaprolactone and poly D, L-laticoglycolic acid capable of sustaining fast and slow two-phase insulin release was developed, as evidenced by pharmacological measures in vivo.
  • the system is preferably injectable, even more preferably subcutaneous, biocompatible, bioerosible, capable of decomposition in vivo to non-toxic products, capable of controlled release in vitro for at least 240 hours.
  • In vivo pharmacological trials in fasting diabetic mice demonstrated the efficacy of controlled release, as observed by their ability to significantly reduce basal glucose (compared with control) for at least 48 h compared with controls administered with regular soluble human insulin. This data together establishes a proof of concept of the ability to overcome the technological challenge of a sustained / extended release biocompatible human insulin system, which is not yet available worldwide.
  • a slow and controlled release system in which the preparation is a form of insulin confined in a polymeric matrix for injection (subcutaneous or otherwise), oral, transdermal or other administration for use in human insulin replacement therapy and the like;
  • a slow and controlled release system in which the preparation is a form of insulin confined in a polymeric matrix for injection (subcutaneous or otherwise), oral, transdermal or other administration, wherein the polymeric matrix is selected from the group consisting of polycaprolactone, poly D, L-laticoglycolic acid (as shown in Figure 5) and others for use in human insulin replacement therapy and the like.
  • polycaprolactone poly D, L-laticoglycolic acid (as shown in Figure 5) and others for use in human insulin replacement therapy and the like.
  • the use of these polymers is desirable because of their biocompatibility, their atoxicity in the polymeric form and their decomposition products. Their use is determined by the desired parameters of release rate, in vivo degradation rate, and absorption, compatibility with encapsulated drug;
  • the production process consists of a method of emulsifying and evaporating the solvent as follows:
  • 10 to 4,000 ⁇ , preferably 400 ⁇ ] regular human insulin 0.5 to 20 mg / mL human insulin, preferably 3.7 mg / mL stabilized with 0 to 30 mg / mL metacresol or phenol, preferably 3 mg / mL metacresol, 0 to 1 mg / mL ZnCl 2 preferably at 7 ⁇ g / mL, and 0 to 200 mg / mL deglycerol, preferably 16 mg / mL
  • PVA polyvinyl alcohol
  • this A / O emulsion is dripped dispersed under flow from 0.1 to 50 mL / min, preferably at 5 mL / min, over 0.1 to 250 mL of PVA, preferably 25 mL, from 0 to PVA, 01 to 20% w / v, preferably 1.5% w / v, under gentle agitation at 50 to 1,000 rpm, preferably at 500 rpm with magnetic stirring, forming the water-in-water (A / O / A) microemulsion .
  • This microemulsion is then subjected to vacuum (200 to 700 mmHg, preferably 600 mmHg) at a temperature of 10 to 60 ° C, preferably 25 ° C, for removal of the DCM
  • the particulate suspension is washed three times with PVA aqueous solution at a concentration between 0 and 20% w / v, preferably 1.5% w / v, and then preferably dried by lyophilization for storage, or used immediately for testing. release
  • Process yield is calculated based on the mass recovered after lyophilization and the encapsulation efficiency obtained by dosing insulin in the supernatants after washing.
  • the efficiency calculated from the wash supernatants was 64.5% with a standard deviation of 6.8%.
  • the yield was obtained from weighing the material after lyophilization which was 88.4% ⁇ 4.2%.
  • Insulin-containing samples were quantified by the modified Bradford method. To quantify the insulin present, 500 ⁇ of each sample was mixed with 500 ⁇ . of the twice concentrated Bradford reagent (200 mg Coomassie G-250, 100 mL 95% ethanol, 200 mL H 3 PO 4 85% and ultrapure water qsp 1 L) and after vortexing the samples, absorbances at 595 nm were measured on a spectrophotometer.
  • the insulin calibration curve in the release buffer PBS pH 7.4, 0.02% azide and 0.1% polysorbate-80 was performed to verify the adequacy of the method to the expected concentrations during the release experiments. and to obtain the linearity of the method. The specificity of this methodology was verified using samples containing all components of the formulation except insulin itself.
  • Particle suspensions particularly nanoparticles and microparticles, were diluted in water and kept in sealed acrylic cuvettes. The flasks were placed in the light scattering equipment analysis chamber so that the laser beam passed through the suspension without any internal filter effect.
  • the mean diameter value and polydispersity index were provided by Shimadzu- SALD-2201 and Brookhaven Instruments Corporation - ZetaPlus Zeta Potential Analyzer.
  • the particles resulting from the double-emulsion method employing magnetic stirrer presented varying sizes. Dynamic light scattering analysis showed that they had mean diameter and standard deviation values of 9.82 ⁇ and 0.56 ⁇ respectively (as shown in Figure 1).
  • the particulate suspension was spread on glass slides and cooled in liquid nitrogen. After After lyophilization, the samples received treatment (gold coating) and were observed under the scanning electron microscope, as shown in Figure 2.
  • samples were diluted in 15 mL of the release buffer (PBS pH 7.4 and 0.02% azide). After dilution, the material was divided into fifteen 1.5 mL microtubes, with each tube receiving 1 mL of sample, which was then transferred to a greenhouse and maintained at 37 ° C during the experiment. At each time point a microtube was removed from the oven and centrifuged at 20,000 g for 30 minutes at 12 ° C. Insulin present in supernatants was measured by the previously described Bradford method.
  • the release buffer PBS pH 7.4 and 0.02% azide
  • Cobs Co + A ⁇ e ' "1 ⁇ + A ⁇ e' " 2 ⁇
  • Cobs is the insulin concentration at time t
  • C 0 is the insulin concentration at time 0
  • A is the total effect
  • k is the kinetic constant
  • 1 and 2 are the kinetic phases.
  • the animals were housed in a temperature controlled room with a 12h light-dark cycle and had free access to water and feed.
  • Type 1 diabetes was induced by an intraperitoneal (Ip.) Injection of streptozotocin (STZ, 200 mg / kg) dissolved in fresh citrate buffer (100 mM, pH 4.5).
  • the control group received only the vehicle (0.1 ml).
  • the tail blood of the mice was collected, and glucose levels were measured using a glucometer (Accu-Chek s Active - Roche). The animals with glucose levels above 300 mg / dl were considered diabetic.
  • the diabetic group was subdivided into three new groups.
  • the animals' blood glucose was determined at time zero, and 100 ⁇ ] 1 ⁇ from each sample was injected subcutaneously into each animal. All mice were in fed state.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

A presente invenção revela um sistema polimérico de confinamento de insulina consistindo em uma matriz polimérica, preferencialmente sob a forma de nanopartículas e micropartículas, de liberação controlada e sustentada da insulina diretamente no organismo, assim com seu uso para a preparação de um medicamento para tratamento de diabetes. O processo para a preparação desse sistema consiste em um método de dupla emulsificação e evaporação do solvente.

Description

SISTEMA POLIMERICO DE CONFINAMENTO DE INSULINA, PROCESSO E USO DE DITO SISTEMA
Campo da Invenção
A presente invenção se refere a um sistema polimérico de confinamento de insulina, desenvolvido para uso, dentre outros, como medicamento na terapia de reposição deste hormônio pancreático em diabetes. A presente invenção também revela o processo de preparação de dito sistema polimérico .
Antecedentes da Invenção
A insulina é uma proteína pancreática com atividade hormonal, envolvida na regulação da glicemia em situações pós-prandiais e basais. A terapia de reposição de insulina tem sido feita há décadas, em especial com o advento da insulina humana recombinante .
No Brasil há uma prevalência de 5,2% de portadores de diabetes mellitus na população adulta, o que gera elevados gastos com a aquisição e distribuição de medicamentos pelo ministério da saúde (SCHMIDT, M.I. et al . Prevalence of diabetes and hypertension based on self -reported morbidity survey, Brazil, 2006. Rev Saúde Pública 2009;43(Supl 2).-74- 82) .
A terapia com insulina humana se faz atualmente por administração subcutânea de formulações desse hormônio cuja obtenção foi feita por via biosintética ou semi- biosintética, visando o controle da glicemia em diversos níveis e escalas de tempo.
A insulina humana regular possui uma faixa de atuação em torno de 2 a 5 horas. Para que seja feito o uso desta insulina, ela deve ser administrada com antecedência de cerca de 30 min antes da refeição. Desta forma, ela não é capaz de realizar uma ação mais imediata, tampouco de manter os níveis circulantes de insulina por tempo prolongado .
Hoje em dia, somente análogos de insulina humana mantém os níveis circulantes de insulina por esse tempo prolongado. Esses análogos são baseados em mutações pontuais (ex: B28LysB29Pro, B28Arg, B24Asp) ou ainda derivatizados quimicamente (com ácido graxo ou PEG preso à cadeia polipeptídica) . Essas inovações trazem como inconveniente reações imunogênicas , a exemplo do uso passado de insulina bovina que difere da humana em apenas um aminoácido.
Existem diversos produtos comerciais baseados em insulinas, tanto nativas quanto modificadas quimicamente (derivatização ou mutações pontuais) alcançando uma faixa de ação farmacocinética ampla.
A reposição dos níveis basais de insulina nos indivíduos diabéticos, com cobertura prolongada dos níveis basais de insulina no estado de jejum, não conta com insulina humana nativa (não modificada quimicamente) . Existem alguns desses produtos no mercado farmacêutico, mas estes possuem como características o fato de não serem homólogos à insulina ou estarem na presença de protamina, uma proteína heteróloga ao organismo humano. Isso traz o problema da imunogenicidade, barreira que foi transposta com a introdução da insulina humana recombinante e a insulina humana semi-sintética na década de 80.
Existem diversos documentos no estado da técnica que revelam formulações de liberação controlada contendo insulina. Entretanto, não foi encontrada qualquer referência que antecipasse o objeto da presente invenção.
0 pedido de patente WO 2010/028257, por exemplo, apresenta o uso de veículos não-aquosos como di- e triglicerídeos ou ácidos graxos para formulações contendo micropartículas sem, entretanto, descrever a preparação das micropartículas . Este documento trata da ressuspensão do liofilizado de proteína em um óleo como veículo, sem o uso de tecnologia de nano e/ou microencapsulação polimérica.
O pedido WO 96/31231, por sua vez, revela a preparação de nanopartículas de policianoacrilato contendo insulina. Ao comparar esta referência com a presente invenção nota- se que são utilizados diferentes polímeros para a formação das nano e micropartículas. Do ponto de vista de processo, as diferenças também são marcantes, pois, no pedido WO 96/31231, a polimerização da matriz ocorre in situ sendo simultânea ao nanoencapsulamento de insulina e à formação das nanopartículas. Por outro lado, na presente invenção o polímero utilizado já se encontra formado e este é apenas dissolvido em solvente compatível que, após a solubilização do polímero, é incorporado à formulação empregando- se energia cinética para a formação de micropartículas e para a encapsulação de insulina. Outrossim, neste documento do estado da técnica WO 96/31231, os autores fazem uso de uma classe diferente de material polimérico, o que impõe o uso de uma tecnologia completamente distinta da presente invenção. A diferença na duração do efeito farmacológico é outro ponto a ser ressaltado, uma vez que na presente invenção houve efeito assegurado por no mínimo 24h, enquanto que os dados apresentados no documento WO 96/31231 apontam para efeitos com duração de até 6 horas.
Por fim, o pedido WO 2006/088473 descreve micro e nanopartículas de quitosana contendo peptídeos ou proteínas, sendo que tais partículas podem ou não ser recobertas por polímeros lipofílicos como poli- caprolactona . Na presente invenção, as ροΐί-ε-caprolactonas são os agentes formadores de matriz e não há recobrimento das partículas. Na tecnologia ora revelada, o sistema é totalmente independente de quitosana para sua funcionalidade. Nota-se ainda que os processos de obtenção das partículas também apresentam diferenças, pois as presentes formulações são obtidas por dupla-emulsão seguida por extração dos solventes voláteis, enquanto que no pedido citado, WO 2006/088473, a insulina é incorporada diretamente nas partículas de quitosana.
Sumário da Invenção
De forma surpreendente, a presente invenção revela um sistema polimérico de confinamento de insulina, desenvolvido para uso, dentre outros, como medicamento na terapia de reposição deste hormônio pancreático em diabetes. A presente invenção também revela o processo de preparação de dito sistema polimérico.
Neste contexto, visando obter uma formulação capaz de ser administrada como um medicamento capaz de realizar o controle glicêmico prolongado com base em insulina humana, foi desenvolvido um sistema particulado polimérico, com distribuição de tamanho particularmente nas faixas micro e nanométricas , com perfil bifásico de liberação de insulina, capaz de atuar sobre a glicemia tanto na fase rápida (1 a 4 horas após injeção subcutânea) quanto na fase lenta, com liberação in vitro por pelo menos 10 dias.
Breve Descrição das Figuras
Figura 1: Distribuição de tamanhos das micropartículas contendo insulina (dados obtidos por espalhamento de luz dinâmico) .
Figura 2 : Imagem das partículas contendo insulina humana obtidas por microscopia eletrônica de varredura - MEV (aumento e barra de tamanho indicados no rodapé das microscopias) .
Figura 3: Cinética de liberação in vitro (tampão fosfato salino - PBS pH 7,4 a 37°C) de insulina microencapsulada em partículas de poli-s-caprolactona - PCL. A) escala linear. Inset: detalhe mostrando tempos iniciais. Linhas contínuas são ajustes com equação C0bS = C0 + Ai*e("kl*t) + A2*e("k2*t) de dupla cinética de primeira ordem.
Figura 4 : Efeito farmacológico das micropartículas contendo insulina em camundongos diabéticos (indução por streptozotocina, glicemia maior que 300 mg/dL) .
Figura 5: Liberação de insulina humana a partir de micropartículas poliméricas de ácido poli D,L- laticoglicólico 50:50, M ~ 43.000 a 65.000.
Descrição da Invenção
O sistema polimérico de confinamento de insulina da presente invenção contém preferencialmente partículas de policaprolactona e ácido poli D, Llaticoglicólico . Seu uso como medicamento na terapia de reposição de insulina se dá nas fases lenta e rápida. O processo de preparação de dito sistema polimérico usa dupla-emulsão seguida por extração dos solventes voláteis.
O problema que a presente invenção se presta a resolver é de prover um sistema polimérico de confinamento de insulina de perfil bifásico, com ações mistas. Foi desenvolvido um sistema com base em partículas poliméricas selecionadas do grupo que consiste em policaprolactona e ácido poli D,L- laticoglicólico capaz de sustentar a liberação de insulina em duas fases, rápida e lenta, conforme evidenciado por medidas farmacológicas in vivo.
O sistema é de uso preferencialmente injetável, ainda mais preferencialmente subcutâneo, biocompatível , bioerosível, passível de decompor- se in vivo a produtos não tóxicos, capaz de realizar liberação controlada in vitro por ao menos 240 horas. Ensaios farmacológicos in vivo em camundongos diabéticos em jejum demonstraram a eficácia da liberação controlada, como observado pela capacidade em reduzir significativamente a glicemia basal (comparado com controle) por ao menos 48 h comparado com controles administrados com insulina humana solúvel regular. Esses dados em conjunto estabelecem uma prova de conceito, da capacidade de transpor o desafio tecnológico de um sistema biocompatível de insulina humana para liberação sustentada / prolongada, até hoje não disponível mundialmente.
As necessidades imediatas a serem atendidas pela presente invenção são o fornecimento de:
- um sistema para uso na terapia com insulina humana e análogos;
- um sistema de liberação controlada e lenta para uso na terapia de reposição com insulina humana e análogos;
- um sistema de liberação controlada e lenta na qual a preparação é uma forma de insulina confinada em uma matriz polimérica para uso na terapia de reposição com insulina humana e análogos ;
- um sistema de liberação controlada e lenta na qual a preparação é uma forma de insulina confinada em uma matriz polimérica para administração por via injetável (subcutânea ou outra) , oral, transdérmica ou outras para uso na terapia de reposição com insulina humana e análogos;
- um sistema de liberação controlada e lenta no qual a preparação é uma forma de insulina confinada em uma matriz polimérica para administração por via injetável (subcutânea ou outra) , oral, transdérmica ou outras, onde a matriz polimérica é selecionada do grupo que consiste em policaprolactona, ácido poli D,L- laticoglicólico (conforme Figura 5) e outros para uso na terapia de reposição com insulina humana e análogos. O uso desses polímeros se faz desejável pela biocompatibilidade , sua atoxicidade na forma polimérica e em seus produtos de decomposição. O uso dos mesmos é determinado pelos parâmetros desejados de velocidade de liberação, velocidade de degradação in vivo e absorção, compatibilidade com o fármaco encapsulado;
- um processo para a preparação do sistema contendo uma matriz para confinamento molecular de insulina humana e análogos ;
- o uso do sistema para a preparação de um medicamento para tratamento de diabetes;
- um sistema contendo um pó liofilizado contendo insulina encapsulada, particularmente microencapsulada ou nanoencapsulada e um veículo aquoso; e
um produto para uso extemporâneo, que após a reconstituição com veículo adequado pode ser aplicado com auxílio de seringa. Os exemplos abaixo são meramente ilustrativos e não devem limitar o escopo da presente invenção.
Preparação das partículas contendo insulina
0 processo de produção consiste em um método de emulsificação e evaporação do solvente, como segue:
- Primeiramente, 10 a 4.000 μΐ., preferencialmente 400 μ]_ι de insulina humana regular (insulina humana a 0,5 a 20 mg/mL, preferencialmente a 3,7 mg/mL estabilizada com 0 a 30 mg/mL de metacresol ou fenol, preferencialmente 3 mg/mL de metacresol; 0 a 1 mg / mL de ZnCl2 preferencialmente a 7 μg/mL, e 0 a 200 mg/mL deglicerol, preferencialmente 16 mg/mL) e 0 a 1.000 ^iL de álcool polivinílico (PVA) a 0,01 a 10 % p/v, preferencialmente 100 μL a 5% p/v (fase aquosa interna - F.A.i.) são homogeneizados com 0 a 2.000 mg de PCL, preferencialmente 100 mg, dissolvidos em 0,01 a 20 mL de diclorometano - DCM (fase oleosa - F.O.), preferencialmente 5 mL, usando um misturador de cisalhamento (ultra-turrax TIO) com ponteira S10N-5G a 1.000 a 50.000 rpm, preferencialmente a 18.000 a 22.000 rpm, formando a emulsão primária água em óleo (A/O) .
- A seguir, esta emulsão A/O é gotejada dispersa sobre fluxo de 0,1 a 50 mL / min, preferencialmente a 5 mL/min, sobre 0,1 a 250 mL de PVA, preferencialmente 25 mL, de PVA a 0,01 a 20 % p/V, preferencialmente a 1,5% p/v, sob agitação branda entre 50 a 1.000 rpm, preferencialmente a 500 rpm com agitação magnética, formando a microemulsão água em óleo em água (A/O/A) .
- Esta microemulsão é então submetida a vácuo (200 a 700 mmHg, preferencialmente 600 mm Hg) a uma temperatura de 10 a 60 °C, preferencialmente a 25 °C, para a remoção do DCM .
- A suspensão de partículas é lavada três vezes com solução aquosa de PVA a uma concentração entre 0 e 20 % p/v, preferencialmente a 1,5% p/v, e posteriormente seca preferencialmente por liofilização para conservação, ou usada imediatamente nos ensaios de liberação.
O rendimento do processo é calculado com base na massa recuperada após a liofilização e a eficiência de encapsulação obtida através da dosagem de insulina nos sobrenadantes após as lavagens.
É importante ressaltar que diversas formulações foram testadas empregando-se emulsão simples (com a insulina dissolvida diretamente em solvente orgânico) em vez de emulsão dupla, ou ainda emulsão dupla, mas empregando-se insulina sem estar estabilizada. Nenhuma dessas tentativas resultou em uma formulação adequada, tendo- se obtido resultados insatisfatórios, possivelmente devido à degradação estrutural da insulina.
A eficiência calculada a partir dos sobrenadantes das lavagens foi igual a 64,5% com desvio padrão igual a 6,8%. 0 rendimento foi obtido a partir da pesagem do material após a liofilização sendo este igual a 88,4 % ± 4,2 %.
Analise espectrofotométrica quantitativa de insulina
As amostras contendo insulina foram quantificadas pelo método de Bradford modificado. Para a quantificação da insulina presente, 500 μϋι de cada amostra foram misturados com 500 μΐ. do reagente de Bradford duas vezes concentrado (200 mg de Coomassie G-250, 100 mL de etanol 95 %, 200 mL de H3PO4 85% e água ultrapura q.s.p. 1 L) e após homogeneizar as amostras, usando um vórtex, as absorbâncias em 595 nm das mesmas foram aferidas em um espectrofotômetro . A curva de calibração da insulina no tampão usado na liberação (PBS pH 7,4, azida 0,02 % e polissorbato-80 0,1 %) foi realizada para se verificar a adequação do método às concentrações esperadas durante os experimentos de liberação, e para se obter a linearidade do método. A especificidade desta metodologia foi verificada usando amostras contendo todos os componentes da formulação, à exceção da própria insulina.
Análise de tamanho de partícula
As suspensões de partículas, particularmente nanopartxculas e micropartículas , foram diluídas em água e mantidas em cubetas de acrílico seladas. Os frascos foram colocados na câmara de análise do equipamento de espalhamento de luz de modo que o feixe de luz laser atravessasse a suspensão em toda sua extensão sem que houvesse efeito de filtro interno. 0 valor médio do diâmetro e o índice de polidispersividade foram fornecidos pelos equipamentos Shimadzu- SALD-2201 e Brookhaven Instruments Corporation - ZetaPlus Zeta Potential Analyzer.
As partículas resultantes do método de dupla-emulsão empregando agitador magnético apresentaram tamanhos variados. A análise das amostras por espalhamento de luz dinâmica mostrou que as mesmas possuíam valores de diâmetro médio e desvio padrão iguais a 9,82 μπι e 0,56 μτη respectivamente (conforme Figura 1) .
Análise morfológica por microscopia eletronica de varredura (MEV)
A suspensão de partículas foi espalhada sobre lâminas de vidro e resfriada em nitrogénio líquido. Após a liofilização, as amostras receberam tratamento (cobertura de ouro) e foram observadas no microscópio eletrônico de varredura, conforme Figura 2.
Perfil cinético de liberação de insulina das partículas in vitro
Após as lavagens, as amostras foram diluídas em 15 mL do tampão de liberação (PBS pH 7,4 e 0,02 % azida) . Após a diluição, o material foi dividido em quinze microtubos de 1,5 mL, sendo que cada tubo recebeu 1 mL de amostra, que foi então transferido para estufa e mantido a 37°C durante o experimento. A cada intervalo de tempo um microtubo foi retirado da estufa e centrifugado a 20.000 g por 30 minutos a 12 °C. A insulina presente nos sobrenadantes foi dosada pelo método de Bradford previamente descrito.
Diversos experimentos realizados em dias diferentes indicaram que este sistema apresenta uma cinética de liberação bifásica, com amplitudes de 50 % para cada uma, sendo a primeira de duração de cerca de 2h e a segunda até 48h. Na Figura 3 é possível observar o perfil de liberação obtido das preparações das partículas contendo insulina.
Os dados foram ajustados com uma função dupla de cinética de primeira ordem, como segue:
Cobs = Co + A^e'" 1^ + A^e'" 2^
onde Cobs é a concentração de insulina do tempo t, C0 é a concentração de insulina no tempo 0 , A é o efeito total, k é constante cinética e 1 e 2 são as fases cinéticas. Considerando que o efeito glicêmico é bifásico, ocorrendo restauração dos níveis originais de glicemia, os dados farmacológicos in vivo foram ajustados usando Al = A2.
A tabela abaixo mostra dados cinéticos de liberação in vitro e efeitos farmacológicos in vivo de amilina humana a partir de partículas de PCL:
Figure imgf000014_0001
Avaliação farmacológica da preparação de partículas contendo insulina
Camundongos suíços machos com 8 semanas foram divididos em dois grandes grupos: controle (n = 4) e Diabético (n = 13) . Os animais foram alojados em uma sala de temperatura controlada, com ciclo luz-escuro de 12h e tiveram livre acesso à água e ração. 0 diabetes Tipo 1 foi induzido através de uma injeção intraperitoneal (Ip.) de estreptozotocina (STZ, 200 mg/kg) dissolvida em tampão citrato fresco (100 mM, pH 4,5) . O grupo controle recebeu apenas o veículo (0,1 ml) . Cinco dias após a administração de STZ, foi coletado o sangue da cauda dos camundongos, e os níveis de glicose foram medidos através de um glicosímetro (Accu-Cheks Active - Roche) . Foram considerados diabéticos os animais que apresentaram glicemia superior a 300 mg/dl.
Em seguida, o grupo diabético foi subdividido em três novos grupos. O primeiro grupo (grupo placebo, n=3) recebeu 100 μΐ. de formulação de partículas sem insulina produzidas segundo o mesmo protocolo do preparo da formulação de partículas contendo insulina; o segundo grupo (grupo Insulina Humana Regular 100 U/mL, n = 5) foi tratado com 5 U/kg de insulina humana regular comercial (Humulin*) ; e o terceiro grupo (grupo Teste, n = 5) recebeu 100 μΐ. da formulação com insulina microencapsulada . No sexto dia, a glicemia dos animais foi determinada no tempo zero, e 100 μ]1ι de cada amostra foi injetado por via subcutânea em cada animal. Todos os camundongos estavam em estado alimentado. A partir de então, a concentração de glicose no sangue foi monitorada nos tempos: 15, 30, 60, 120, 360, 1440 e 2880 minutos. Este protocolo foi aprovado pela comissão de bioética em experimentação animal do Centro de Ciências da Saúde (CCS) - UFRJ, sob o número de registro DFBCICB 038.
Os animais que receberam partículas vazias (sem insulina) não apresentaram variações significativas em suas glicemias. A comparação entre as glicemias médias do grupo que recebeu insulina humana regular comercial (100 U/mL) e o grupo que recebeu partículas contendo insulina mostrou que estas glicemias diferiam de forma estatisticamente significante nos tempos de 6h e 24h, indicando que a insulina liberada pelas partículas foi capaz de reduzir a glicemia destes animais por um período superior à forma farmacêutica comercial.
Na Figura 4 são destacadas as primeiras horas do experimento. A fase inicial de declínio da glicemia se mostrou similar ao observado para insulina humana solúvel. Por sua vez, foi notável que a preparação testada manteve a glicemia dos animais mais baixa por período de tempo mais prolongado, havendo retorno da glicemia, mas ainda mantendo por até 48 h um patamar mais baixo que o grupo controle administrado com a formulação comercial (a avaliação farmacológica por tempo mais prolongado não se tornou possível neste protocolo experimental por necessidade de retornar a alimentação dos animais) . As constantes cinéticas das duas fases de efeito glicêmico, de declínio e recuperação, se mostraram equivalentes ao observado para a liberação in vitro (Tabela acima) sugerindo uma forte correlação in vitro x in vivo para esta formulação.

Claims

Reivindicações
1. Sistema polimérico de confinamento de insulina caracterizado pelo fato de consistir em uma matriz polimérica, de liberação controlada e sustentada da insulina diretamente no organismo.
2. Sistema polimérico de confinamento de insulina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a matriz polimérica está na forma de nanopartículas e microparticulas .
3. Sistema polimérico de confinamento de insulina de acordo com a reivindicação 1 ou 2 , caracterizado pelo fato da matriz polimérica consistir em um composto selecionado do grupo que consiste em poli-s-caprolactona e ácido poli D,L- laticoglicólico .
4. Sistema polimérico de confinamento de insulina de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que apresenta um perfil bifásico de liberação de insulina .
5. Processo para a preparação do sistema polimérico de confinamento de insulina como definido na reivindicação 1, 2, 3 ou 4 , caracterizado pelo fato de que consiste em um método de emulsificação e evaporação do solvente em que:
- primeiramente, 10 a 4.000 μΐ, de insulina humana regular e 0 a 1.000 μΐ, de álcool polivinílico (PVA) a 0,01 a 10 % p/v (fase aquosa interna - F.A.i.) são homogeneizados com 0 a 2.000 mg de ροΐί-ε-caprolactona (PCL) , dissolvidos em 0,01 a 20 mL de diclorometano - DCM (fase oleosa - F.O.), usando um misturador de cisalhamento a 1.000 a 50.000 rpm, formando a emulsão primária água em óleo (A/0) ; - a seguir, esta emulsão A/O é gotejada dispersa sobre fluxo de 0,1 a 50 mL / min, sobre 0,1 a 250 mL de PVA, de PVA a 0,01 a 20 % p/V, sob agitação branda entre 50 a 1.000 rpm com agitação magnética, formando a microemulsão água em óleo em água (A/O/A) ;
- esta microemulsão é então submetida a vácuo (200 a 700 mmHg) a uma temperatura de 10 a 60 °C, para a remoção do DCM;
- a suspensão de partículas é lavada três vezes com solução aquosa de PVA a uma concentração entre 0 e 20 % p/v, e posteriormente seca, ou usada imediatamente nos ensaios de liberação.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato da insulina humana regular consistir de insulina humana a 0,5 a 20 mg/mL, estabilizada com 0 a 30 mg/mL de metacresol ou fenol, 0 a 1 mg/mL de ZnCl2, e 0 a 200 mg/mL de glicerol.
7. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a velocidade de mistura na primeira etapa do processo é de 18.000 a 22.000 rpm.
8. Uso de um sistema como definido na reivindicação 1, 2, 3 ou 4 , caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para a terapia de reposição de isulina humana .
9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o sistema é capaz de realizar liberação bifásica de insulina, sendo uma fase rápida e outra fase lenta .
10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a fase rápida ocorre 1 a 4 horas após injeção subcutânea e a fase lenta apresenta um efeito farmacológico por ao menos 48h.
PCT/BR2012/000183 2011-06-13 2012-06-13 Sistema polimerico de confinamento de insulina, processo e uso de dito sistema WO2012171084A1 (pt)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BRPI1103164-6 2011-06-13
BRPI1103164-6A BRPI1103164A2 (pt) 2011-06-13 2011-06-13 sistema polimÉrico de confinamento de insulina, processo e uso de dito sistema

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012171084A1 true WO2012171084A1 (pt) 2012-12-20

Family

ID=47356443

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/BR2012/000183 WO2012171084A1 (pt) 2011-06-13 2012-06-13 Sistema polimerico de confinamento de insulina, processo e uso de dito sistema

Country Status (2)

Country Link
BR (1) BRPI1103164A2 (pt)
WO (1) WO2012171084A1 (pt)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0134318A2 (en) * 1983-06-10 1985-03-20 Connaught Laboratories Limited Controlled release of injectable and implantable insulin compositions
JPH04173746A (ja) * 1990-11-07 1992-06-22 Unitika Ltd 徐放性機能を有する薬剤・ポリマー複合体
WO2002000207A1 (en) * 2000-06-27 2002-01-03 Mi Tech Company Limited The controlled release preparation of insulin and its method
US20040224030A1 (en) * 2003-05-06 2004-11-11 Shastri Venkatram R. Microsphere delivery systems
JP2006213600A (ja) * 2005-02-01 2006-08-17 Kawasumi Lab Inc 薬剤徐放システム

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0134318A2 (en) * 1983-06-10 1985-03-20 Connaught Laboratories Limited Controlled release of injectable and implantable insulin compositions
JPH04173746A (ja) * 1990-11-07 1992-06-22 Unitika Ltd 徐放性機能を有する薬剤・ポリマー複合体
WO2002000207A1 (en) * 2000-06-27 2002-01-03 Mi Tech Company Limited The controlled release preparation of insulin and its method
US20040224030A1 (en) * 2003-05-06 2004-11-11 Shastri Venkatram R. Microsphere delivery systems
JP2006213600A (ja) * 2005-02-01 2006-08-17 Kawasumi Lab Inc 薬剤徐放システム

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DINESH B. SHENOY ET AL.: "Potential Applications of Polymeric Microsphere Suspension as Subcutaneous Depot for Insulin", DRUG DEVELOPMENT AND INDUSTRIAL PHARMACY, vol. 29, no. 5, 2003, pages 555 - 563 *
KEIZO FUKUSHIMA ET AL.: "Insulin micropiles comprising biodegradable polymers for production of a long-term hypoglycemic effect", JOURNAL OF DRUG TARGETING, vol. 19, no. 3, 2011, pages 212 - 218 *

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI1103164A2 (pt) 2013-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Peng et al. A rapid-acting, long-acting insulin formulation based on a phospholipid complex loaded PHBHHx nanoparticles
CN100462066C (zh) 药剂的新制剂及其制备和应用方法
JP2006519840A (ja) 経口インスリン組成物およびその製造および使用方法
AU2015208699B2 (en) Nanoencapsulation of hydrophilic active compounds
Watnasirichaikul et al. In-vitro release and oral bioactivity of insulin in diabetic rats using nanocapsules dispersed in biocompatible microemulsion
KR20030078740A (ko) 파클리탁셀을 기본으로 하는 개선된 항종양 조성물
BR122021025344B1 (pt) Composições compreendendo nanoveículos sintéticos, seus usos, método para produzir os mesmos e kit
BRPI0908686B1 (pt) Método de produção de nanopartículas não-imunogênicas, nanopartícula nãoimunogênica terapeuticamente ativa, composição terapêutica, uso de uma nanopartícula nãoimunogênica e kit para a produção de nanopartículas não-imunogênicas
BR112012015977B1 (pt) Complexo de um polímero iônico, composição de micropartícula de liberação prolongada de droga, e, método para preparar a composição de liberação prolongada de droga
PT1317254E (pt) Disperção de partículas de libertação prolongadaa
CN102357077B (zh) 一种包裹难溶性药物的蛋白纳米颗粒及其制备方法
ES2662927T3 (es) Composiciones farmacéuticas de microesferas de triptorelina
CN105617362A (zh) 一种新型的胰岛素－磷脂－壳聚糖自组装微粒载体及其制剂
Hsieh et al. An in situ slow-releasing H2S donor depot with long-term therapeutic effects for treating ischemic diseases
WO2012113116A1 (zh) 含亲水性生物大分子的乳剂、其制备方法及用途
CN107412783B (zh) 一种包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒的制备方法
JP2009523791A (ja) １．０〜１００ｋＤａの分子量を有するデキストランを含む薬剤及びその調製方法
Paul et al. Tricalcium phosphate delayed release formulation for oral delivery of insulin: a proof-of-concept study
CN108403659A (zh) 一种硬乳液纳微球及其制备方法和应用
CN109568601B (zh) 一种蛋白多肽类药物双重微球及其制备方法和胰岛素双重微球
Lebre et al. Chitosan-based nanoparticles as a hepatitis B antigen delivery system
JP6530480B2 (ja) 微小インスリン、微小インスリン類似体及びそれらの製造方法
CZ20031559A3 (cs) Mikročástice se zlepšeným profilem uvolňování a způsob jejich výroby
CN101579335B (zh) 药剂的制剂及其制备和应用方法
WO2012171084A1 (pt) Sistema polimerico de confinamento de insulina, processo e uso de dito sistema

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12800608

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12800608

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1