WO2012165262A1 - ベンジルアミン誘導体 - Google Patents

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WO2012165262A1
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alkyl
substituent
benzylamine derivative
cells
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PCT/JP2012/063213
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大輔 辻
伊藤　孝司
章 大高
章 重永
正博 安倍
雅博 日浅
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国立大学法人徳島大学
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    • C07C259/00—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C259/04—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups without replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group, e.g. hydroxamic acids
    • C07C259/06—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups without replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group, e.g. hydroxamic acids having carbon atoms of hydroxamic groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms

Definitions

  • the present invention is effective for blood cancer and a novel benzylamine derivative, a medicament comprising the benzylamine derivative, a blood cancer therapeutic agent comprising the benzylamine derivative, and the benzylamine for treating blood cancer
  • a novel benzylamine derivative a medicament comprising the benzylamine derivative, a blood cancer therapeutic agent comprising the benzylamine derivative, and the benzylamine for treating blood cancer
  • Blood cancer is a disease in which cells contained in blood become cancerous, and is classified according to the type of cancerous cells. It is roughly classified into three types: leukemia in which hematopoietic stem cells in the bone marrow become cancerous, malignant lymphoma in which lymphocytes become cancerous, and multiple myeloma in which plasma cells in the bone marrow become cancerous.
  • melphalan and prednisolone combination therapy (MP therapy) or cyclophosphamide and prednisolone combination therapy (CP therapy) are used as chemotherapy, but they are difficult to cure, so new treatments such as thalidomide Drugs are being developed.
  • anticancer drugs By the way, conventionally, various compounds have been developed as development candidates as anticancer drugs.
  • examples of the anticancer drug having a benzylamine structure include those described in Patent Document 1.
  • the present invention provides a novel compound that is effective in the treatment of blood cancer, particularly multiple myeloma, and is also effective in suppressing SP cells (Side Population Cell) that cause cancer recurrence.
  • SP cells Side Population Cell
  • the inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above problems. As a result, the inventors have found that a novel compound having a specific benzylamine structure exhibits selective cytotoxicity against hematological cancer cells, and is particularly effective against SP cells, thereby completing the present invention.
  • the benzylamine derivative according to the present invention is represented by the following formula (I).
  • X represents a carbonyl group (—C ( ⁇ O) —), an oxycarbonyl group (—C ( ⁇ O) O—), a sulfoxide group (—S ( ⁇ O) —) or a sulfonyl group (—S ( ⁇ O)).
  • Y represents a carbonyl group or —CH (OR 5 ) —;
  • R 1 represents a hydrogen atom, a C 1-6 alkyl group or a benzyl group;
  • R 2 represents a C 1-6 alkyl group, a C 2-6 alkenyl group, a C 2-6 alkynyl group, or a phenyl group which may have a substituent ⁇ ;
  • R 3 represents a C 1-6 alkyl group which may have a substituent ⁇ ;
  • R 4 represents a hydrogen atom, an amino group, a hydroxyamino group, a C 1-6 alkoxyamino group, a carboxy group or a (C 1-6 alkoxy) carbonyl group;
  • R 5 represents a hydrogen atom, a C 1-7 alkanoyl group or a tri (C 1-6 alkyl) silano group;
  • the substituent ⁇ represents one or more groups selected from the group consisting of a C 1-6 alkyl
  • methyl group ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, t-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group and the like.
  • a C 1-4 alkyl group is preferred, a C 1-2 alkyl group is more preferred, and a methyl group is most preferred.
  • the “C 2-6 alkenyl group” refers to a linear or branched unsaturated aliphatic hydrocarbon group having 2 to 6 carbon atoms and having at least one carbon-carbon double bond. Examples include ethenyl group, 1-propenyl group, 2-propenyl group (allyl group), isopropenyl group, 2-butenyl group, 3-butenyl group, isobutenyl group, pentenyl group, hexenyl group and the like. A C 2-4 alkenyl group is preferable, and a 2-propenyl group (allyl group) is more preferable.
  • C 2-6 alkynyl group refers to a linear or branched unsaturated aliphatic hydrocarbon group having 2 to 6 carbon atoms and having at least one carbon-carbon triple bond.
  • ethynyl group 1-propynyl group, 2-propynyl group, 2-butynyl group, 3-butynyl group, pentynyl group, hexynyl group and the like.
  • a C 2-4 alkynyl group is preferable, and a C 2-3 alkynyl group is more preferable.
  • Examples of the “amino group” include —NH 2 group, mono (C 1-6 alkyl) amino group and di (C 1-6 alkyl) amino group. More specifically, examples of the mono (C 1-6 alkyl) amino group include a methylamino group, an ethylamino group, an isopropylamino group, a t-butylamino group, an n-pentylamino group, and an n-hexylamino group. Etc.
  • the two C 1-6 alkyl groups in the di (C 1-6 alkyl) amino group may be the same as or different from each other.
  • di (C 1-6 alkyl) amino group examples include dimethylamino group, diethylamino group, diisopropylamino group, t-butylmethylamino group, t-butylethylamino group, di (t-butyl) amino group, (N-pentyl) amino group, di (n-hexyl) amino group and the like can be mentioned.
  • hydroxyamino group examples include —NHOH group and N— (C 1-6 alkyl) hydroxyamino group. More specifically, N- (C 1-6 alkyl) hydroxyamino groups include, for example, N-methylhydroxyamino group, N-ethylhydroxyamino group, N-isopropylhydroxyamino group, Nt-butylhydroxy group. An amino group, an Nn-pentylhydroxyamino group, an Nn-hexylhydroxyamino group, and the like can be given.
  • C 1-6 alkoxyamino group examples include —N (C 1-6 alkoxy) H group and (C 1-6 alkyl) (C 1-6 alkoxy) amino group. More specifically, examples of the —N (C 1-6 alkoxy) H group include a methoxyamino group, an ethoxyamino group, an isopropoxyamino group, and a t-butoxyamino group.
  • (C 1-6 alkyl) (C 1-6 alkoxy) amino group includes, for example, methoxymethylamino group, methoxyethylamino group, ethoxymethylamino group, ethoxyethylamino group, isopropoxymethylamino group, t-butoxy Examples thereof include a methylamino group.
  • C 1-6 alkoxy group refers to a C 1-6 alkyloxy group.
  • a C 1-4 alkoxy group is preferred, a C 1-2 alkoxy group is more preferred, and a methoxy group is still more preferred.
  • (C 1-6 alkoxy) carbonyl refers to a C 1-6 alkyloxycarbonyl group.
  • a (C 1-4 alkoxy) carbonyl group is preferred, a (C 1-2 alkoxy) carbonyl group is more preferred, and a methoxycarbonyl group is more preferred.
  • C 1-7 alkanoyl group refers to a formyl group and a C 1-6 alkylcarbonyl group.
  • a C 1-4 alkanoyl group is preferable, a C 1-3 alkanoyl group is more preferable, and an acetyl group is more preferable.
  • tri (C 1-6 alkyl) silano group examples include a trimethylsilano group, a triethylsilano group, a triisopropylsilano group, a dimethylisopropylsilano group, a diethylisopropylsilano group, and a t-butyldimethylsilano group.
  • it is a tri (C 1-4 alkyl) silano group, more preferably a tri (C 1-2 alkyl) silano group.
  • Halogen atom includes fluorine atom, chlorine atom, bromine atom and iodine atom, preferably chlorine atom or bromine atom.
  • the number of substitutions is 1 or more, 5 or less, 4 or less is preferable, 3 or less is more preferable, and 2 or less is more preferable.
  • R 3 When the alkyl group as R 3 has a substituent ⁇ , the number of substitutions depends on the carbon number of the alkyl group, the type of the substituent ⁇ , etc., but is usually 1 or more and 5 or less, preferably 4 or less, 3 or less is more preferable, and 2 or less is more preferable.
  • R 3 is preferably a benzyloxy (C 1-6 alkyl) group, more preferably a benzyloxy (C 1-4 alkyl) group, and even more preferably a benzyloxy (C 1-2 alkyl) group.
  • the substituents may be the same as or different from each other.
  • the benzylamine derivative (I) according to the present invention may have one or more asymmetric centers, in which case optical isomers exist.
  • the present invention includes both these mixtures and separate individual isomers.
  • the benzylamine derivative (I) according to the present invention can be converted into a salt by a conventional method.
  • Suitable salts of the benzylamine derivative (I) are pharmaceutically acceptable known non-toxic salts, for example, inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, etc .; acetate, malon Acids, tartrate, maleate, methanesulfonate, benzenesulfonate, formate, toluenesulfonate, trifluoroacetate and other organic acid salts; alginate, aspartate, glutamate, etc.
  • inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, etc .
  • alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts
  • alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts
  • ammonium salts organic base salts such as trimethylamine salts, triethylamine salts, pyridine salts, picoline salts and dicyclohexylamine salts Can be mentioned.
  • Preferred examples of the benzylamine derivative (I) according to the present invention include the following.
  • Benzylamine derivative where n is 2 or more is Benzylamine derivative where n is 2 or more.
  • a benzylamine derivative in which R 2 is a C 2-6 alkenyl group is a benzylamine derivative in which R 2 is a C 2-6 alkenyl group.
  • a benzylamine derivative in which R 3 is a benzyloxymethyl group is a benzylamine derivative in which R 3 is a benzyloxymethyl group.
  • the pharmaceutical and hematological cancer therapeutic agent according to the present invention are characterized by comprising the above benzylamine derivative (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the benzylamine derivative (I) according to the present invention is an active ingredient of the above-mentioned medicine and blood cancer therapeutic agent, and is used for treating blood cancer.
  • the method for treating blood cancer according to the present invention is characterized by comprising a step of administering the benzylamine derivative (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the benzylamine derivative according to the present invention exhibits selective cytotoxicity against hematological cancer cells, particularly multiple myeloma cells. More specifically, it does not show cytotoxicity to normal cells as well as general epithelial cancers. Furthermore, the benzylamine derivative according to the present invention is also effective in suppressing SP cells (Side Population Cell) that cause cancer recurrence. Therefore, the benzylamine derivative according to the present invention is very useful as a safer drug or a hematological cancer therapeutic agent, unlike a conventional anticancer drug having low selectivity and harmful to normal cells.
  • FIG. 1 is a graph showing the anti-cancer activity of benzylamine derivative according to the present invention and melphalan generally used as a therapeutic agent for multiple myeloma against human multiple myeloma cells.
  • FIG. 2 is a graph showing cytotoxicity of the benzylamine derivative according to the present invention to various types of cancer cells and normal cells.
  • FIG. 3 shows (1) a photograph of human multiple myeloma cells treated with the benzylamine derivative according to the present invention, stained with Hoechst 33258, which is a nuclear stain, and (2) Annexin V, which is a marker of apoptosis. It is the photograph at the time of dyeing
  • FIG. 1 is a graph showing the anti-cancer activity of benzylamine derivative according to the present invention and melphalan generally used as a therapeutic agent for multiple myeloma against human multiple myeloma cells.
  • FIG. 4 shows (1) when only a solvent is allowed to act as a negative control, (2) when melphalan is allowed to act as a positive target, and (3) benzyl according to the present invention. It is a flow cytometry result at the time of making an amine derivative act.
  • FIG. 5 shows colony formation in a methylcellulose medium when (1) the solvent alone is allowed to act on human multiple myeloma cells and (2) the benzylamine derivative according to the present invention is allowed to act. It is a photograph showing the situation.
  • FIG. 6 is a graph showing the anticancer activity of the benzylamine derivative according to the present invention against human multiple myeloma cells, human acute myeloid leukemia cells and human promyelocytic leukemia cells.
  • melphalan which is generally used as a therapeutic agent for multiple myeloma, against human multiple myeloma cells, human acute myeloid leukemia cells and human promyelocytic leukemia cells. It is a graph to show.
  • the benzylamine derivative according to the present invention can be synthesized, for example, according to the following scheme.
  • each group is as defined above]
  • a compound having a reactive group that inhibits each reaction may be appropriately protected or deprotected.
  • the types of protecting groups and reaction conditions in such a protection reaction or deprotection step are described in “PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS Second Edition” W. Green and P. G. M. Wuts, John Wiley & Sons, INC. (Incorporated herein by reference).
  • compound (IV) is synthesized by reacting benzaldehyde compound (II) with amine compound (III). Such a reaction is known as reductive amination.
  • the benzaldehyde compound (II) has a simple chemical structure. Therefore, if it is commercially available, it can be used, and those skilled in the art can easily synthesize it from known compounds.
  • the amine compound (III) is described in Hart, S .; A. Org. It can be synthesized from a serine derivative or the like by the method described in Lett, Vol. 3, pages 1789 to 1791 (2001) (incorporated into the present application for reference) or a method analogous thereto.
  • the above reaction is performed, for example, by dissolving amine compound (III) in a solvent, adding benzaldehyde compound (II) to the solution to make a Schiff base, and further adding a reducing agent.
  • the solvent that can be used in the above reaction is not particularly limited as long as it can dissolve the raw material compound moderately and does not inhibit the reaction.
  • halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, 1,2-dichloroethane, chloroform, etc.
  • Alcohols such as methanol and ethanol; ethers such as diethyl ether and tetrahydrofuran; aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene; amides such as dimethylformamide and dimethylacetamide.
  • the concentration of the amine compound (III) solution may be adjusted as appropriate, and can be, for example, about 1 mg / mL or more and 20 mg / mL or less.
  • the benzaldehyde compound (II) and the amine compound (III) may theoretically be used in an equimolar amount, but if one is cheaper or easier to obtain than the other, it is 1.01 moles relative to the other. As described above, it may be used in excess of about 1.2 times mole or less.
  • the temperature and time of the Schiff basification reaction may be appropriately adjusted. However, since they generally proceed rapidly, they may be about 10 ° C. or more and 50 ° C. or less for about 1 minute or more and about 1 hour or less.
  • the reducing agent may be added to the reaction solution as it is.
  • the reducing agent include sodium borohydride, lithium aluminum hydride, diisobutylaluminum hydride, sodium cyanoborohydride, lithium borohydride, lithium triethylborohydride, borane complex, triethylsilane, nickel borohydride, Sodium triacetoxyborohydride can be used. What is necessary is just to use a reducing agent equimolar or more and about 1.2 times mole or less with the lesser number of moles of benzaldehyde compound (II) or amine compound (III).
  • the temperature of the reaction solution is once lowered to 5 ° C. or less by ice cooling or the like. After the addition, the temperature is gradually raised and the reaction may be carried out at about 10 ° C. or more and 50 ° C. or less for about 5 hours or more and 50 hours or less.
  • the compound (IV) can be purified by column chromatography, recrystallization or the like.
  • the —X—R 2 group is introduced into the compound (IV).
  • a reagent for introducing the —X—R 2 group acid chloride, acid bromide, active ester or the like of the corresponding acid (HO—X—R 2 ) can be used.
  • compound (IV) may be reacted with the above reagent in the presence of a base.
  • the solvent that can be used in the reaction is not particularly limited, and the same solvent as that used in the reductive amination reaction can be used.
  • the reagent for introducing the —X—R 2 group is preferably used in excess relative to the compound (IV). For example, it can be used in an amount of about 1.05 times to 20 times the amount of compound (IV).
  • an organic base is preferably used because the reaction is performed in an organic solvent.
  • triethylamine, pyridine, diazabicycloundecene, 1,8-bis (dimethylamino) naphthalene and the like can be used.
  • the amount of the base used is at least equimolar to the reagent for introducing the —X—R 2 group.
  • the above compound or the like may be mixed in a solvent.
  • the compound (IV) can be purified by column chromatography, recrystallization or the like.
  • the target benzylamine derivative can be synthesized by a functional group conversion reaction known to those skilled in the art.
  • the benzylamine derivative (I) and the pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention are pharmaceutically acceptable suitable for oral administration or parenteral administration with the compound as an active ingredient.
  • the pharmaceutical preparation can be in the form of capsules, tablets, dragees, granules, inhalants, suppositories, solutions, lotions, dispersions, emulsions and the like. If necessary, auxiliaries, stabilizers, wetting and emulsifying agents, buffering agents and other commonly used additives may be incorporated into these preparations.
  • the dose of the benzylamine derivative (I) according to the present invention effective for treatment depends on the severity, age, sex, condition, etc. of the patient, but is, for example, 0.001 mg / kg or more based on the patient's body weight
  • a dose of about 500 mg / kg or less may be effective for the treatment of blood cancer.
  • an amount of, for example, about 0.005 mg / kg or more and 1000 mg / kg or less can be administered per day based on the weight of the patient.
  • 3-butenoic acid (0.443 g, 5.15 mmol) was dissolved in methylene chloride (2.0 mL), thionyl chloride (0.613 g, 5.15 mmol) was added at 0 ° C., and 1 at room temperature was added. Stir for hours. After the solvent and the like were distilled off under reduced pressure, the resulting residue was mixed with the above amine compound (0.200 g, 0.515 mmol) in methylene chloride (2.0 mL) and triethylamine (0.718 mL, 5. 15 mmol) was added. The reaction solution was stirred for 3 hours while gradually warming to room temperature.
  • Lithium aluminum hydride (6.6 mg, 170 ⁇ mol) was added to a tetrahydrofuran solution (860 ⁇ L) of the compound obtained in Example 1 (40 mg, 88 ⁇ mol) at ⁇ 78 ° C., and the mixture was stirred at the same temperature for 4 hours. Then, after adding ethyl acetate and saturated ammonium chloride aqueous solution at the same temperature, it heated up to room temperature, and also added saturated citric acid aqueous solution. The reaction mixture was extracted with ethyl acetate, and the obtained organic layer was washed with saturated brine and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Example 3 Anticancer Activity against Multiple Myeloma Cells Human multiple myeloma cell line RPMI8226 was seeded at a density of 1 ⁇ 10 4 cells / well in a 96-well plate and incubated at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide atmosphere. Incubated overnight. Separately, the compound of Example 2 was dissolved in dimethyl sulfoxide and added to each well so that the final concentration of the compound was 0.5 ⁇ M, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 12.5 ⁇ M, 25 ⁇ M, or 50 ⁇ M.
  • melphalan a therapeutic agent for multiple myeloma
  • melphalan a therapeutic agent for multiple myeloma
  • the final concentration was 10 ⁇ M, 20 ⁇ M, 30 ⁇ M, 40 ⁇ M, or 50 ⁇ M.
  • the case where only the dimethyl sulfoxide (final concentration: 0.5 v / v%) was added without adding the compound was also provided.
  • FIG. 1 shows the relative absorbance when the absorbance when the compound of the present invention and melphalan are not added is taken as 100. Further, IC 50 values were determined from the results obtained.
  • the compound according to the present invention exhibits anticancer activity against multiple myeloma cells at a clearly lower concentration than melphalan generally used as a therapeutic agent for multiple myeloma. It became clear to show.
  • the IC 50 value of melphalan for multiple myeloma cells is 21.0 ⁇ M
  • the IC 50 value of the compound of the present invention is 1.12 ⁇ M, which is the same as melphalan at a concentration of about 1/20. Showed anticancer activity.
  • Example 4 Selectivity Test In Example 3, as test cells, human multiple myeloma cell lines RPMI8226 and U266, human gastric cancer cell line AZ521, human colon cancer cell line HCT116, human lung cancer cell A549, which is a strain, and mouse brain-derived astrocytes and human skin-derived fibroblasts, which are normal cells, were used in the same manner except that the final concentration of the compound of the present invention in each well was fixed at 5 ⁇ M. Cytotoxicity on the cells was tested. The results are shown in FIG. 2 as relative absorbances when the absorbance when no compound is added is 100.
  • the compound of the present invention is not cytotoxic to general cancer cells such as gastric cancer cells, colon cancer cells and lung cancer cells as well as normal cells, but is a kind of blood cancer cell. It shows clear cytotoxicity against multiple myeloma cells. Thus, since the compound of the present invention exhibits selective cytotoxicity, it was proved to be very useful as a therapeutic agent for blood cancer.
  • Example 5 Apoptosis activity test It was confirmed whether or not the cell death by the compound of the present invention was due to apoptosis.
  • human multiple myeloma cell line RPMI8226 was incubated in the same manner as in Example 3 except that the final concentration of the compound of the present invention was fixed at 5 ⁇ M. After 24 hours, the cells were collected, stained with Hoechst 33258, a nuclear stain, and fluorescent photographs were taken using a fluorescence microscope (Zeiss). Separately, after staining with annexin V and propidium iodide, which are apoptosis markers, using an annexin V staining kit (Roche), fluorescent photographs were taken in the same manner, and a flow cytometer (Beckman Coulter, Analysis was performed using the product name “EPICS ALTRA”).
  • annexin V and propidium iodide which are apoptosis markers
  • FIG. 3 (1) A micrograph of the cells stained with Hoechst 33258 is shown in Fig. 3 (1), a micrograph of the cells stained with annexin V and propidium iodide is shown in Fig. 3 (2), and the flow site of the cells stained with annexin V and propidium iodide. The result of the measurement analysis is shown in FIG.
  • Example 6 Anticancer activity test against SP cells
  • SP cells Stem cells that can be differentiated into various tissues and cells such as hematopoietic stem cells have the property of discharging fluorescent chemicals such as Hoechst 33342 out of the cells.
  • Flow cytometry analysis is performed after the cells are stained with, and when the results are two-dimensionally developed at wavelengths of 450 nm and 675 nm, they are distributed in regions with low staining properties.
  • a cell having such a property is called an SP cell (Side Population Cell).
  • SP cells are also included in cancer cell groups, and are known to exhibit drug resistance and cause recurrence. Therefore, the effect of the compound of the present invention on cancerous SP cells was tested.
  • the human multiple myeloma cell line RPMI8226 was incubated in the presence of the compound of the present invention in the same manner as in Example 4.
  • the cells were suspended in 3% FBS DMEM to 1 ⁇ 10 6 cells / mL, heated to 37 ° C., and Hoechst 33342 was added to a concentration of 5 ⁇ g / mL.
  • the mixture was incubated at 37 ° C. for 60 minutes under light shielding with stirring every 20 minutes. Subsequently, it centrifuged at 800 g for 3 minutes, and the supernatant was removed. Further, the washing operation of adding cooled 2% FBS PBS and centrifuging to remove the supernatant was repeated twice.
  • propidium iodide was dissolved in PBS to prepare a 200 ⁇ g / mL solution, and the washed cells were resuspended at about 5 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • a flow cytometer manufactured by Beckman Coulter, product name “EPICS ALTRA”
  • the cells are irradiated with 365 nm laser light, and the emitted fluorescence is developed through a 450 nm bandpass filter and a 675 nm bandpass filter.
  • a dimensional dot plot was obtained.
  • the ratio of the stained cells to the total cells in the SP region was 0.163 ⁇ 0.0503% compared to 0.680 ⁇ 0.0173% of the control. It is suppressed. Therefore, according to the compound of the present invention, it is considered that not only apoptosis is caused in multiple myeloma cells, but also the SP cells are suppressed, and as a result, recurrence can be suppressed.
  • Example 7 As an experiment highly correlated with a tumor formation experiment using mice or the like, a colony formation assay using a methylcellulose medium was performed.
  • Example 3 human multiple myeloma cell line RPMI8226 was incubated in the same manner except that the final concentration of the compound of the present invention was fixed to 5 ⁇ M. After 24 hours, the cells were collected, and after counting the number of cells, 1 ⁇ 10 5 cells and 1 mL of methylcellulose medium (manufactured by Stem Cell Technology) were mixed. After mixing at 37 ° C. for 1 hour using a rotator, 6 wells were added. The whole amount was added to the plate. After 14 days of incubation at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide atmosphere, a photograph was taken using a microscope (manufactured by Zeiss). For comparison, the same experiment was performed on a medium supplemented with 0.5% dimethyl sulfoxide as a control. The results of the control are shown in FIG. 5 (1), and the results of using the compound of the present invention are shown in FIG. 5 (2).
  • colonies of multiple myeloma cells were formed in the control, while colonies were not formed at all in the medium containing the compound of the present invention, and were markedly inhibited. Therefore, even if multiple myeloma cells are infiltrated by the compound of the present invention, it is difficult to form a tumor, and as a result, recurrence is unlikely to occur.
  • Example 8 The effect of the compounds of the present invention on blood cancer cells other than human multiple myeloma cells was tested.
  • human acute myeloid leukemia cell line KG1 and human promyelocytic leukemia cell line HL60 in 1 ⁇ 10 3 in high nutrient medium (RPMI1640, 100 ⁇ L) containing 10% FBS. Cells / well were seeded and incubated overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide atmosphere. Separately, the compound of Example 2 was dissolved in DMSO, and the resulting solution was diluted with the same medium. The final concentration of the compound was 0.39 ⁇ M, 0.78 ⁇ M, 1.56 ⁇ M, 3.13 ⁇ M, 6.25 ⁇ M, 12 It added to each well so that it might become 5 micromol, 25 micromol, or 50 micromol.
  • melphalan a therapeutic agent for multiple myeloma, was added to each well so as to have the same final concentration. Furthermore, there was also provided a case where only dimethyl sulfoxide (final concentration: 0.2 to 0.8 v / v%) was added without adding the compound.
  • the medium was removed, and a medium (a mixture of 100 ⁇ L of the above medium and 10 ⁇ L of WST-8) added with WST-8, a cell number measuring reagent, was added to each medium. Added to the well. After culturing at 37 ° C. for 2 hours in a 5% carbon dioxide atmosphere, the absorbance at 450 nm was measured. The ratio of absorbance at each concentration of the compound of the present invention or melphalan when the absorbance when treated with DMSO alone was taken as 100% was calculated as the survival rate of each blood cancer cell.
  • the 50% effective concentration (EC 50 ) of each compound for each blood cancer cell was calculated.
  • the results of the survival rate of the compound of the present invention are shown in FIG. 6, and the results of the survival rate of melphalan are shown in FIG.
  • the results of 50% effective concentration (EC 50 ) are shown in Table 2.
  • the compound of the present invention is generally used as a therapeutic agent for multiple myeloma not only for multiple myeloma cells but also for acute myeloid leukemia cells and promyelocytic leukemia cells. It has been demonstrated that the anticancer activity is shown at a clearly lower concentration than that of melphalan used in Japan.

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Abstract

　本発明は、血液がん、特に多発性骨髄腫の治療に有効な新規化合物であって、がん再発の原因となるＳＰ細胞（Side Population Cell）の抑制にも効果的な化合物を提供することを目的とする。本発明に係る化合物は、特定のベンジルアミン構造を有する新規なものである。

Description

ベンジルアミン誘導体
　本発明は、血液がんに対して有効で且つ新規なベンジルアミン誘導体、当該ベンジルアミン誘導体からなる医薬、当該ベンジルアミン誘導体からなる血液がん治療薬、血液がんを治療するための当該ベンジルアミン誘導体の使用、および、当該ベンジルアミン誘導体を用いて血液がんを治療するための方法に関するものである。
　血液がんとは血液中に含まれている細胞ががん化する疾患であり、がん化した細胞の種類により分類されている。大きくは、骨髄中の造血幹細胞ががん化する白血病、リンパ球ががん化する悪性リンパ腫、骨髄中の形質細胞ががん化する多発性骨髄腫の三つに分類される。
　血液がんはかつて不治の病といわれていたが、医学の進歩により治癒率は向上してきており、白血病や悪性リンパ腫は、早期に適切な治療を行うことで長期生存が可能にもなってきている。しかし、薬剤耐性の問題などもあり、新たな抗がん薬は常に求められている。
　また、血液がんの中でも、多発性骨髄腫は治癒が困難であるといえ、しかも予後が好ましくない場合が多く、再発率が高い。一般的には、メルファランとプレドニゾロンの併用療法（ＭＰ療法）やシクロホスファミドとプレドニゾロンの併用療法（ＣＰ療法）が化学療法として用いられるが、治癒が困難であるため、サリドマイドなど新たな治療薬が開発されている。
　ところで、従来、抗がん薬としては様々な化合物が開発候補品として開発されている。例えば、ベンジルアミン構造を有する抗がん薬としては、特許文献１に記載されているものを挙げることができる。
特表２００７－５１５４１３号公報
　上述したように、従来、抗がん薬として様々な化合物が開発されている。しかし、血液がんの中でも多発性骨髄腫の治癒は非常に困難であり、より有効な治療薬が求められている。また、たとえいったんは症状が抑制されたとしても、がんには常に再発の問題が伴うため、再発の抑制に有効な化合物が必要である。
　そこで本発明は、血液がん、特に多発性骨髄腫の治療に有効な新規化合物であって、がん再発の原因となるＳＰ細胞（Side Population Cell）の抑制にも効果的な化合物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、特定のベンジルアミン構造を有する新規化合物が、血液がん細胞に選択的な細胞毒性を示し、特にＳＰ細胞にも効果的であることを見出して、本発明を完成した。
　本発明に係るベンジルアミン誘導体は、下記式（Ｉ）で表されることを特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
［式中、
　Ｘは、カルボニル基（－Ｃ（＝Ｏ）－）、オキシカルボニル基（－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－）、スルホキシド基（－Ｓ（＝Ｏ）－）またはスルホニル基（－Ｓ（＝Ｏ）2－）を示し；
　Ｙは、カルボニル基または－ＣＨ（ＯＲ5）－を示し；
　Ｒ1は、水素原子、Ｃ1-6アルキル基またはベンジル基を示し；
　Ｒ2は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、または置換基αを有していてもよいフェニル基を示し；
　Ｒ3は、置換基βを有していてもよいＣ1-6アルキル基を示し；
　Ｒ4は、水素原子、アミノ基、ヒドロキシアミノ基、Ｃ1-6アルコキシアミノ基、カルボキシ基または（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基を示し；
　Ｒ5は、水素原子、Ｃ1-7アルカノイル基またはトリ（Ｃ1-6アルキル）シラノ基を示し；
　置換基αは、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、ハロゲン原子、シアノ基およびニトロ基からなる群より選択される１以上の基を示し；
　置換基βは、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ1-6アルコキシ基およびベンジルオキシ基からなる群より選択される１以上の基を示し；
　ｎは、１以上、５以下の整数を示す］
　本発明において「Ｃ1-6アルキル基」は、炭素数１～６の直鎖状または分枝鎖状の飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基等である。好ましくはＣ1-4アルキル基であり、より好ましくはＣ1-2アルキル基であり、最も好ましくはメチル基である。
　「Ｃ2-6アルケニル基」は、炭素数２～６であり、少なくとも一つの炭素－炭素二重結合を有する直鎖状または分枝鎖状の不飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、エテニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基（アリル基）、イソプロペニル基、２－ブテニル基、３－ブテニル基、イソブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基等である。好ましくはＣ2-4アルケニル基であり、より好ましくは２－プロペニル基（アリル基）である。
　「Ｃ2-6アルキニル基」は、炭素数２～６であり、少なくとも一つの炭素－炭素三重結合を有する直鎖状または分枝鎖状の不飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、エチニル基、１－プロピニル基、２－プロピニル基、２－ブチニル基、３－ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基等である。好ましくはＣ2-4アルキニル基であり、より好ましくはＣ2-3アルキニル基である。
　「アミノ基」としては、－ＮＨ2基、モノ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基およびジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基を挙げることができる。さらに具体的には、モノ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ｔ－ブチルアミノ基、ｎ－ペンチルアミノ基、ｎ－ヘキシルアミノ基等を挙げることができる。ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基における２つのＣ1-6アルキル基は、互いに同一であっても異なっていてもよい。ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基としては、例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ｔ－ブチルメチルアミノ基、ｔ－ブチルエチルアミノ基、ジ（ｔ－ブチル）アミノ基、ジ（ｎ－ペンチル）アミノ基、ジ（ｎ－ヘキシル）アミノ基等を挙げることができる。
　「ヒドロキシアミノ基」としては、－ＮＨＯＨ基およびＮ－（Ｃ1-6アルキル）ヒドロキシアミノ基を挙げることができる。さらに具体的には、Ｎ－（Ｃ1-6アルキル）ヒドロキシアミノ基としては、例えば、Ｎ－メチルヒドロキシアミノ基、Ｎ－エチルヒドロキシアミノ基、Ｎ－イソプロピルヒドロキシアミノ基、Ｎ－ｔ－ブチルヒドロキシアミノ基、Ｎ－ｎ－ペンチルヒドロキシアミノ基、Ｎ－ｎ－ヘキシルヒドロキシアミノ基等を挙げることができる。
　「Ｃ1-6アルコキシアミノ基」としては、－Ｎ（Ｃ1-6アルコキシ）Ｈ基および（Ｃ1-6アルキル）（Ｃ1-6アルコキシ）アミノ基を挙げることができる。さらに具体的には、－Ｎ（Ｃ1-6アルコキシ）Ｈ基としては、例えば、メトキシアミノ基、エトキシアミノ基、イソプロポキシアミノ基、ｔ－ブトキシアミノ基等を挙げることができる。（Ｃ1-6アルキル）（Ｃ1-6アルコキシ）アミノ基としては、例えば、メトキシメチルアミノ基、メトキシエチルアミノ基、エトキシメチルアミノ基、エトキシエチルアミノ基、イソプロポキシメチルアミノ基、ｔ－ブトキシメチルアミノ基等を挙げることができる。
　「Ｃ1-6アルコキシ基」は、Ｃ1-6アルキルオキシ基をいう。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔ－ブトキシ基、ｎ－ペントキシ基、ｎ－ヘキソキシ基等である。好ましくはＣ1-4アルコキシ基であり、より好ましくはＣ1-2アルコキシ基であり、さらに好ましくはメトキシ基である。
　「（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基」は、Ｃ1-6アルキルオキシカルボニル基をいう。例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ－プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ－ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、ｎ－ペントキシカルボニル基、ｎ－ヘキソキシカルボニル基等である。好ましくは（Ｃ1-4アルコキシ）カルボニル基であり、より好ましくは（Ｃ1-2アルコキシ）カルボニル基であり、さらに好ましくはメトキシカルボニル基である。
　「Ｃ1-7アルカノイル基」は、ホルミル基およびＣ1-6アルキルカルボニル基をいう。例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基（エチルカルボニル基）、ブチリル基、イソブチリル基（イソプロピルカルボニル基）、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、ヘキサノイル基等である。好ましくはＣ1-4アルカノイル基であり、より好ましくはＣ1-3アルカノイル基であり、さらに好ましくはアセチル基である。
　「トリ（Ｃ1-6アルキル）シラノ基」としては、例えば、トリメチルシラノ基、トリエチルシラノ基、トリイソプロピルシラノ基、ジメチルイソプロピルシラノ基、ジエチルイソプロピルシラノ基、ｔ－ブチルジメチルシラノ基を挙げることができ、好ましくはトリ（Ｃ1-4アルキル）シラノ基であり、より好ましくはトリ（Ｃ1-2アルキル）シラノ基である。
　「ハロゲン原子」にはフッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子が含まれ、好適には塩素原子または臭素原子である。
　Ｒ2であるフェニル基が置換基αを有する場合、その置換数は１以上、５以下であり、４以下が好ましく、３以下がより好ましく、２以下がさらに好ましい。
　Ｒ3であるアルキル基が置換基βを有する場合、その置換数はアルキル基の炭素数や置換基βの種類などに依存するが、通常、１以上、５以下であり、４以下が好ましく、３以下がより好ましく、２以下がさらに好ましい。Ｒ3としては、ベンジルオキシ（Ｃ1-6アルキル）基が好ましく、ベンジルオキシ（Ｃ1-4アルキル）基がより好ましく、ベンジルオキシ（Ｃ1-2アルキル）基がさらに好ましい。
　上記置換基数が２以上である場合、置換基は互いに同一であっても異なっていてもよい。
　本発明に係るベンジルアミン誘導体（Ｉ）は１以上の不斉中心を有し得、その場合には光学異性体が存在する。本発明には、これらの混合物と分離した個々のアイソマーの両方が含まれるものとする。
　本発明に係るベンジルアミン誘導体（Ｉ）は、常法により塩にすることができる。ベンジルアミン誘導体（Ｉ）の好適な塩は薬事上許容される公知の非毒塩であり、例えば、塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩；酢酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ギ酸塩、トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩などの有機酸塩；アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などのアミノ酸塩；ナトリウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩やマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩などの有機塩基塩などを挙げることができる。
　本発明に係るベンジルアミン誘導体（Ｉ）として、好適には以下のものを挙げることができる。
　ｎが２以上であるベンジルアミン誘導体。
　Ｘがカルボニル基であるベンジルアミン誘導体。
　Ｒ2がＣ2-6アルケニル基であるベンジルアミン誘導体。
　Ｒ3がベンジルオキシメチル基であるベンジルアミン誘導体。
　Ｙがカルボニル基であり且つＲ4が水素原子であるベンジルアミン誘導体。
　本発明に係る医薬および血液がん治療薬は、上記ベンジルアミン誘導体（Ｉ）またはその薬事上許容される塩からなることを特徴とする。
　本発明に係るベンジルアミン誘導体（Ｉ）は、上記医薬および血液がん治療薬の有効成分であり、血液がんを治療するために用いられる。
　また、本発明に係る血液がんの治療方法は、上記ベンジルアミン誘導体（Ｉ）またはその薬事上許容される塩を投与する工程を含むことを特徴とする。
　本発明に係るベンジルアミン誘導体は、血液がん細胞、特に多発性骨髄腫細胞に対して選択的な細胞毒性を示す。より詳しくは、一般的な上皮がんのみならず、正常細胞には細胞毒性を示さない。さらには、本発明に係るベンジルアミン誘導体は、がん再発の原因となるＳＰ細胞（Side Population Cell）の抑制にも効果的である。従って本発明に係るベンジルアミン誘導体は、選択性が低く正常細胞にも有害な従来の抗がん薬と異なり、より安全な医薬や血液がん治療薬として非常に有用である。
図１は、本発明に係るベンジルアミン誘導体と、多発性骨髄腫の治療薬として一般的に用いられているメルファランの、ヒト多発性骨髄腫細胞に対する抗がん活性を示すグラフである。 図２は、本発明に係るベンジルアミン誘導体の、様々な種類のがん細胞と正常細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。 図３は、本発明に係るベンジルアミン誘導体を作用させたヒト多発性骨髄腫細胞を、（１）核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色した場合の写真、（２）アポトーシスのマーカーであるアネキシンＶで染色した場合の写真、および、（３）フローサイトメトリーで分析した結果である。 図４は、ヒト多発性骨髄腫細胞に対して、（１）陰性対照として溶媒のみ作用させた場合、（２）陽性対象としてメルファランを作用させた場合、および（３）本発明に係るベンジルアミン誘導体を作用させた場合の、フローサイトメトリー結果である。 図５は、ヒト多発性骨髄腫細胞に対して、（１）陰性対照として溶媒のみ作用させた場合と、（２）本発明に係るベンジルアミン誘導体を作用させた場合の、メチルセルロース培地におけるコロニー形成状況を示す写真である。 図６は、本発明に係るベンジルアミン誘導体の、ヒト多発性骨髄腫細胞、ヒト急性骨髄性白血病細胞およびヒト前骨髄球性白血病細胞に対する抗がん活性を示すグラフである。 図７は、多発性骨髄腫の治療薬として一般的に用いられているメルファランの、ヒト多発性骨髄腫細胞、ヒト急性骨髄性白血病細胞およびヒト前骨髄球性白血病細胞に対する抗がん活性を示すグラフである。
　本発明に係るベンジルアミン誘導体は、例えば、下記スキームにより合成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
［上記スキーム中、各基等は上記と同義とする］
　以下、工程ごとに説明する。なお、各反応を阻害するような反応性基を有する化合物は、適宜保護や脱保護を行なってもよい。かかる保護反応または脱保護工程における保護基の種類や反応条件は、「PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS Second Edition」T．W．GreenとP．G．M．Wuts，John　Wiley＆Sons，INC．（参照のため、本願に組み込まれる）を参照することができる。
　先ず、ベンズアルデヒド化合物（ＩＩ）とアミン化合物（ＩＩＩ）を反応させることにより化合物（ＩＶ）を合成する。かかる反応は、還元的アミノ化として知られているものである。
　原料化合物のうちベンズアルデヒド化合物（ＩＩ）はシンプルな化学構造を有するので、市販のものがあればそれを利用すればよいし、また、当業者であれば公知化合物から容易に合成することができる。アミン化合物（ＩＩＩ）は、Hart，S．A．ら，Org．Lett，第３巻，第１７８９～１７９１頁（２００１年）（参照のため、本願に組み込まれる）などに記載の方法やそれに準じた方法により、セリン誘導体などから合成することができる。
　上記反応は、例えば、アミン化合物（ＩＩＩ）を溶媒に溶解した後、当該溶液にベンズアルデヒド化合物（ＩＩ）を添加してシッフ塩基とし、さらに還元剤を添加することにより行う。
　上記反応に用い得る溶媒は、原料化合物を適度に溶解することができ且つ反応を阻害するものでなければ特に制限されないが、例えば、ジクロロメタン、１，２－ジクロロエタン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類；メタノールやエタノールなどのアルコール類；ジエチルエーテルやテトラヒドロフランなどのエーテル類；ベンゼンやトルエンなどの芳香族炭化水素類；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミド類を挙げることができる。
　アミン化合物（ＩＩＩ）溶液の濃度は適宜調整すればよいが、例えば、１ｍｇ／ｍＬ以上、２０ｍｇ／ｍＬ以下程度とすることができる。
　ベンズアルデヒド化合物（ＩＩ）とアミン化合物（ＩＩＩ）は、理論上、等モル用いればよいが、一方が他方よりも安価であったり入手し易かったりする場合には、他方に対して１．０１倍モル以上、１．２倍モル以下程度過剰に用いてもよい。
　シッフ塩基化反応の温度と時間は適宜調整すればよいが、一般的に迅速に進行することから、１０℃以上、５０℃以下程度で１分間以上、１時間以下程度とすればよい。
　シッフ塩基化反応後、還元剤は反応溶液へそのまま添加してもよい。還元剤としては、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化アルミニウムリチウム、水素化ジイソブチルアルミニウム、水素化シアノホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化トリエチルホウ素リチウム、ボラン錯体、トリエチルシラン、水素化ホウ素ニッケル、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウムを用いることができる。還元剤は、ベンズアルデヒド化合物（ＩＩ）またはアミン化合物（ＩＩＩ）のモル数のうち少ない方と等モル以上、１．２倍モル以下程度用いればよい。
　還元剤を添加する際には、氷冷などにより反応溶液の温度をいったん５℃以下にすることが好ましい。添加後は徐々に温度を上げ、１０℃以上、５０℃以下程度で５時間以上、５０時間以下程度反応させればよい。
　反応終了後には、一般的な後処理をすればよい。例えば、溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィーや再結晶などで化合物（ＩＶ）を精製することができる。
　次に、化合物（ＩＶ）へ－Ｘ－Ｒ2基を導入する。－Ｘ－Ｒ2基を導入するための試薬としては、対応する酸（ＨＯ－Ｘ－Ｒ2）の酸クロライドや酸ブロマイド、活性エステルなどを用いることができる。当該反応では、塩基の存在下、化合物（ＩＶ）と上記試薬を反応させればよい。
　当該反応に用いることができる溶媒は特に制限されず、上記還元的アミノ化反応で用いた溶媒と同様のものを用いることができる。
　－Ｘ－Ｒ2基を導入するための試薬は、化合物（ＩＶ）に対して過剰に用いることが好ましい。例えば、化合物（ＩＶ）に対して１．０５倍モル以上、２０倍モル以下程度用いることができる。
　塩基としては、有機溶媒中で反応を行うことから、有機塩基を用いることが好ましい。例えば、トリエチルアミン、ピリジン、ジアザビシクロウンデセン、１，８－ビス（ジメチルアミノ）ナフタレンなどを用いることができる。塩基の使用量は、少なくとも－Ｘ－Ｒ2基を導入するための試薬と等モルとする。
　当該反応では、溶媒中、上記化合物等を混合すればよい。但し、－Ｘ－Ｒ2基を導入するための試薬の反応性は高いため、混合時には反応液の温度を氷冷などで５℃以下に冷却することが好ましい。混合後においては温度を徐々に上げ、１０℃以上、５０℃以下程度で１時間以上、１０時間以下程度反応させればよい。
　反応終了後には、一般的な後処理をすればよい。例えば、溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィーや再結晶などで化合物（ＩＶ）を精製することができる。
　さらに、反応性基の脱保護反応の他、当業者公知の官能基変換反応により、目的のベンジルアミン誘導体を合成することができる。
　血液がんの治療のために、本発明に係るベンジルアミン誘導体（Ｉ）とその薬事上許容される塩は、活性成分としての当該化合物と、経口投与または非経口投与に適した薬事上許容される有機または無機の固体または液体賦形剤を含む医薬製剤の形で用いることができる。当該医薬製剤は、カプセル剤、錠剤、糖衣錠、顆粒、吸入剤、座薬、溶液、ローション、分散液、エマルション等の剤形とすることができる。必要な場合には、助剤、安定化剤、湿潤剤や乳化剤、緩衝剤や他の一般的に用いられる添加剤をこれら製剤に配合してもよい。
　治療に有効な本発明に係るベンジルアミン誘導体（Ｉ）の投与量は、患者の重篤度、年齢、性別、状態などにもよるが、患者の体重を基準として、例えば０．００１ｍｇ／ｋｇ以上、５００ｍｇ／ｋｇ以下程度という投与量は、血液がんの治療にとり有効であり得る。一般的には、患者の体重基準で、例えば０．００５ｍｇ／ｋｇ以上、１０００ｍｇ／ｋｇ以下程度の量を１日に投与することができる。
　本願は、２０１１年５月２７日に出願された日本国特許出願第２０１１－１１９６６８号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１１年５月２７日に出願された日本国特許出願第２０１１－１１９６６８号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
　実施例１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　上記原料化合物を、Hart，S．A．ら，Org．Lett，第３巻，第１７８９～１７９１頁（２００１年）（参照のため、本願に組み込まれる）に記載の方法に従って合成した。当該原料化合物（２．００ｇ，６．２１ｍｍｏｌ）へ０°Ｃにおいて塩化水素／酢酸エチル（４Ｍ，３０．０ｍＬ）を加え、同温にて２時間攪拌した。続いて溶媒などを減圧留去し、得られた残渣に１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えた後、クロロホルムを用いて抽出した。その後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣（１．３５ｇ，５．６７ｍｍｏｌ）を１，２－ジクロロエタン（１８２ｍＬ）に溶解した後、室温にて２，４－ジメトキシベンズアルデヒド（０．９４２ｇ，５．６７ｍｍｏｌ）を加えて１０分間攪拌した。反応液を０°Ｃに冷却後、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（１．２０ｇ，５．６７ｍｍｏｌ）を加え、徐々に室温へ昇温しながら１日攪拌した。反応液へ飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、クロロホルムを用いて抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにより乾燥した後ろ過し、溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／４）により精製し、合成中間体である黄色油状のアミン化合物（１．７７ｇ，４．５６ｍｍｏｌ）を７３％の収率で得た。
　別途、塩化メチレン（２．０ｍＬ）へ３－ブテン酸（０．４４３ｇ，５．１５ｍｍｏｌ）を溶解した後、０°Ｃにおいて塩化チオニル（０．６１３ｇ，５．１５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間攪拌した。溶媒などを減圧留去した後、得られた残渣に、０°Ｃにおいて、上記アミン化合物（０．２００ｇ，０．５１５ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（２．０ｍＬ）とトリエチルアミン（０．７１８ｍＬ，５．１５ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を徐々に室温へ昇温しながら３時間攪拌した。反応液へ飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた後、酢酸エチルにより抽出し、得られた有機層を、蒸留水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で順次洗浄した。続いて無水硫酸マグネシウムで乾燥した後ろ過し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）により精製し、無色油状の目的化合物（０．１７２ｇ，０．３７７ｍｍｏｌ）を７３％の収率で得た。
　実施例２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　実施例１で得た化合物（４０ｍｇ，８８μｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（８６０μＬ）へ、－７８°Ｃにおいて水素化アルミニウムリチウム（６．６ｍｇ，１７０μｍｏｌ）を加え、同温にて４時間攪拌した。その後、同温にて酢酸エチルと飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた後、室温へ昇温し、さらに飽和クエン酸水溶液を加えた。反応混合物を酢酸エチルにより抽出した後、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過した後、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で精製し、黄色油状の目的化合物（６．８ｇ，１７μｍｏｌ）を２０％の収率で得た。
1H-NMR（CDCl3，400MHz）δ=3.30（1H，dd，J=16.8 and 6.8Hz），3.37（1H，dd，J=16.8 and 6.8Hz），3.78-3.90（1H，m），3.79（3H，s），3.81（3H，s），4.11（1H，dd，J=9.6 and 4.0Hz），4.42-4.60（2H，m），4.46（1H，d，J=12.4Hz），4.50（1H，d，J=12.4Hz），4.73（1H，d，J=16.0Hz），5.16（1H，dd，J=16.8 and 1.2Hz），5.19（1H，dd，J=8.8 and 1.2Hz），5.97（1H，ddt，J=16.8，8.8 and 6.8Hz），6.42-6.47（2H，m），7.12（H，d，J=8.8Hz），7.24-7.34（5H，m），9.29（1H，s）
　実施例３　多発性骨髄腫細胞に対する抗がん活性
　ヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６を、９６ｗｅｌｌプレートに１×１０4細胞／ｗｅｌｌの密度で播種し、５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で一晩インキュベートした。別途、実施例２の化合物をジメチルスルホキシドに溶解し、化合物の最終濃度が０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、１２．５μＭ、２５μＭまたは５０μＭとなるように各ｗｅｌｌへ添加した。
　また、比較のための陽性対照として多発性骨髄腫治療薬であるメルファランを、その最終濃度が１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭまたは５０μＭとなるように各ｗｅｌｌへ添加した。さらに、化合物を添加せずジメチルスルホキシド（最終濃度：０．５ｖ／ｖ％）のみを添加した場合も設けた。
　次いで、５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で３日間培養した後、細胞培養／細胞毒性測定用試薬（同仁化学社製，Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８）を用い、生細胞から産生される橙色色素（ホルマザン）の吸光度（４２０ｎｍ）を測定した。本発明化合物やメルファランを添加しない場合の吸光度を１００とした場合の相対吸光度を図１に示す。また、得られた結果からＩＣ50値を求めた。
　図１に示すとおり、本発明に係る化合物は、多発性骨髄腫の治療薬として一般的に用いられているメルファランよりも明らかに低濃度で多発性骨髄腫細胞に対して抗がん活性を示すことが明らかとなった。また、多発性骨髄腫細胞に対するメルファランのＩＣ50値が２１．０μＭであるのに対して、本発明化合物のＩＣ50値は１．１２μＭと、約２０分の１の濃度でメルファランと同様の抗がん活性を示した。
　実施例４　選択性試験
　実施例３において、被検細胞として、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＲＰＭＩ８２２６とＵ２６６、ヒト胃がん細胞株であるＡＺ５２１、ヒト大腸がん細胞株であるＨＣＴ１１６、ヒト肺がん細胞株であるＡ５４９、および正常細胞であるマウス脳由来星状膠細胞とヒト皮膚由来線維芽細胞を用い、また、各ｗｅｌｌにおける本発明化合物の最終濃度を５μＭに固定した以外は同様にして、各細胞に対する細胞毒性を試験した。結果を、化合物を添加しない場合の吸光度を１００とした場合に対する相対吸光度として図２に示す。
　図２のとおり、本発明化合物は、正常細胞のみならず胃がん細胞、大腸がん細胞、肺がん細胞といった一般的ながん細胞に対しては細胞毒性を示さない一方で、血液がん細胞の一種である多発性骨髄腫細胞に対しては明確な細胞毒性を示す。このように、本発明化合物は選択的な細胞毒性を示すことから、血液がんの治療薬として非常に有用であることが証明された。
　実施例５　アポトーシス活性試験
　本発明化合物による細胞死がアポトーシスによるものであるか否かを確認した。
　詳しくは、実施例３において、本発明化合物の最終濃度を５μＭに固定した以外は同様にして、ヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６をインキュベートした。次いで、２４時間後に細胞を回収し、核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色し、蛍光顕微鏡（ｚｅｉｓｓ社製）を用いて蛍光写真を撮影した。また、別途、アネキシンＶ染色キット（ロシュ社製）を用いてアポトーシスマーカーであるアネキシンＶとヨウ化プロピジウムで染色した後、同様に蛍光写真を撮影し、また、フローサイトメーター（ベックマンコールター社製，製品名「ＥＰＩＣＳ　ＡＬＴＲＡ」）を用いて分析を行った。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８により染色した細胞の顕微鏡写真を図３（１）に、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムにより染色した細胞の顕微鏡写真を図３（２）に、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムにより染色した細胞のフローサイトメトリー解析の結果を図３（３）に示す。
　図３（１）のとおり、本発明化合物をヒト多発性骨髄腫細胞に作用させた場合には、細胞内にＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８が顕著に取り込まれて蛍光を発していた。かかる結果は、アポトーシスを起こしている細胞の核内でクロマチンの凝集が起こり、凝集したクロマチンにＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８が結合したことによると考えられる。また、図３（２）のとおり、本発明化合物を作用させたヒト多発性骨髄腫細胞は、アポトーシスのマーカーであるアネキシンＶに対しても陽性であった。さらに、図３（３）のとおり、本発明化合物を作用させたヒト多発性骨髄腫細胞では、ヨウ化プロピジウム陰性で且つアネキシンＶ陽性で示される初期アポトーシスと、ヨウ化プロピジウム陽性で且つアネキシンＶ陽性で示される初期アポトーシスで示される後期アポトーシスが起っていた。以上の結果のとおり、本発明化合物は多発性骨髄腫細胞にアポトーシスを起こすことが実験的に証明された。
　実施例６　ＳＰ細胞に対する抗がん活性試験
　造血幹細胞など様々な組織や細胞に分化できる幹細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２などの蛍光化学物質を細胞外へ排出する性質を有していることから、かかる蛍光化学物質で細胞を染色した後にフローサイトメトリー解析を行い、結果を波長４５０ｎｍと６７５ｎｍで二次元展開すると、染色性の低い領域に分布する。このような性質を有する細胞はＳＰ細胞（Side Population Cell）と呼ばれている。ＳＰ細胞はがん細胞群にも含まれており、薬剤耐性を示したり、再発の原因となることが知られている。そこで、がん性ＳＰ細胞に対する本発明化合物の効果を試験した。
　具体的には、実施例４と同様に本発明化合物の存在下でヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６をインキュベートした。当該細胞を３％ＦＢＳ　ＤＭＥＭに１×１０6細胞／ｍＬとなるように懸濁し、３７℃に加温後、濃度が５μｇ／ｍＬとなるようにＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を添加した。２０分毎に攪拌しつつ、遮光下、３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、８００ｇで３分間遠心し、上清を除去した。さらに、冷却した２％ＦＢＳ　ＰＢＳを添加してから遠心し、上清を除去するという洗浄操作を２回繰り返した。別途、ヨウ化プロピジウムをＰＢＳに溶解して２００μｇ／ｍＬ溶液を調製し、洗浄細胞を５×１０6細胞／ｍＬ程度に再懸濁した。フローサイトメーター（ベックマンコールター社製，製品名「ＥＰＩＣＳ　ＡＬＴＲＡ」）を使い、細胞に３６５ｎｍのレーザー光を照射し、放出される蛍光を４５０ｎｍのバンドパスフィルタと６７５ｎｍのバンドパスフィルタを通して展開し、二次元ドットプロットを得た。また、陰性対照として化合物を添加せずジメチルスルホキシド（最終濃度：０．５ｖ／ｖ％）のみを添加した場合、および陽性対象としてメルファランを同最終濃度（５μＭ）添加した場合について、同様に試験を行った。陰性対照の結果を図４（１）に、陽性対象の結果を図４（２）に、本発明化合物を用いた結果を図４（３）に示す。また、フローサイトメトリーの結果から求められた、ＳＰ領域における染色細胞と非ＳＰ領域における染色細胞の全細胞に対する割合を表１にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　上記結果のとおり、ジメチルスルホキシドのみをヒト多発性骨髄腫細胞に作用させた場合、両方の波長での発光が低い領域ではＳＰ細胞の存在を確認することができた。また、メルファランを作用させた場合にはコントロールに比してその割合は多少低減されるが、ＳＰ細胞は十分に存在していた。メルファランは多発性骨髄腫の治療に用いられるが、治癒が困難であり予後が好ましくない。その理由としては、メルファランによる治療ではこのようなＳＰ細胞が残留し、残留したがん化ＳＰ細胞が再増殖したり転移したりすることが考えられる。これらに対して、本発明化合物を作用させた場合には、ＳＰ領域における全細胞に対する染色細胞の割合が、コントロールの０．６８０±０．０１７３％に対して０．１６３±０．０５０３％まで抑制されている。従って、本発明化合物によれば、多発性骨髄腫細胞にアポトーシスを引き起こすのみならず、そのＳＰ細胞を抑制し、結果として再発を抑制できると考えられる。
　実施例７
　マウスなどを用いた腫瘍形成実験と相関性が高い実験として、メチルセルロース培地を用いたコロニー形成アッセイを行った。
　詳しくは、実施例３において、本発明化合物の最終濃度を５μＭに固定した以外は同様にして、ヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６をインキュベートした。２４時間後に細胞を回収し、細胞数を計数した後に１×１０5個の細胞とメチルセルロース培地（ステムセルテクノロジー社製）１ｍＬと混合し、ローテイターを用いて、３７℃で１時間混合した後、６ｗｅｌｌプレートに全量加えた。５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で１４日間インキュベートした後、顕微鏡（ｚｅｉｓｓ社製）を用いて写真撮影した。また、比較のため、コントロールとしてジメチルスルホキシドを０．５％添加した培地についても同様の実験を行った。コントロールの結果を図５（１）に、本発明化合物を用いた結果を図５（２）に示す。
　図５のとおり、コントロールでは多発性骨髄腫細胞のコロニーが形成された一方で、本発明化合物を含んだ培地ではコロニーの形成が全く見られず、顕著に阻害されていた。よって、本発明化合物により、たとえ多発性骨髄腫細胞が浸潤等しても腫瘍は形成され難く、その結果、再発も起り難いと考えられる。
　実施例８
　ヒト多発性骨髄腫細胞以外の血液がん細胞に対する本発明化合物の効果を試験した。
　ヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６に加え、ヒト急性骨髄性白血病細胞株ＫＧ１とヒト前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ６０を、１０％ＦＢＳを含む高栄養培地（ＲＰＭＩ１６４０，１００μＬ）中、１×１０3細胞／ｗｅｌｌの密度で播種し、５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で一晩インキュベートした。別途、実施例２の化合物をＤＭＳＯに溶解し、得られた溶液を同培地で希釈し、化合物の最終濃度が０．３９μＭ、０．７８μＭ、１．５６μＭ、３．１３μＭ、６．２５μＭ、１２．５μＭ、２５μＭまたは５０μＭとなるように各ｗｅｌｌへ添加した。
　また、比較のための陽性対照として多発性骨髄腫治療薬であるメルファランを、同様の最終濃度となるように各ｗｅｌｌへ添加した。さらに、化合物を添加せずジメチルスルホキシド（最終濃度：０．２～０．８ｖ／ｖ％）のみを添加した場合も設けた。
　次いで、５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で７２時間培養した後、培地を除去し、細胞数測定試薬であるＷＳＴ－８を加えた培地（上記培地１００μＬとＷＳＴ－８　１０μＬの混合物）を各ｗｅｌｌへ添加した。５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で２時間培養した後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。ＤＭＳＯ単独処理した場合の吸光度を１００％とした場合の本発明化合物またはメルファランの各濃度における吸光度の比を各血液がん細胞の生存率として算出した。また、得られた結果より、各血液がん細胞に対する各化合物の５０％効果濃度（ＥＣ50）を算出した。本発明化合物の生存率の結果を図６に、メルファランの生存率の結果を図７に示す。また、５０％効果濃度（ＥＣ50）の結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　図６～７に示すとおり、本発明に係る化合物は、多発性骨髄腫細胞のみならず急性骨髄性白血病細胞と前骨髄球性白血病細胞に対しても、多発性骨髄腫の治療薬として一般的に用いられているメルファランよりも明らかに低濃度で抗がん活性を示すことが実証された。

Claims (11)

  1. 　下記式（Ｉ）で表されることを特徴とするベンジルアミン誘導体またはその薬事上許容される塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    ［式中、
    　Ｘは、カルボニル基、オキシカルボニル基、スルホキシド基またはスルホニル基を示し；
    　Ｙは、カルボニル基または－ＣＨ（ＯＲ5）－を示し；
    　Ｒ1は、水素原子、Ｃ1-6アルキル基またはベンジル基を示し；
    　Ｒ2は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、または置換基αを有していてもよいフェニル基を示し；
    　Ｒ3は、置換基βを有していてもよいＣ1-6アルキル基を示し；
    　Ｒ4は、水素原子、アミノ基、ヒドロキシアミノ基、Ｃ1-6アルコキシアミノ基、カルボキシ基または（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基を示し；
    　Ｒ5は、水素原子、Ｃ1-7アルカノイル基またはトリ（Ｃ1-6アルキル）シラノ基を示し；
    　置換基αは、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、ハロゲン原子、シアノ基およびニトロ基からなる群より選択される１以上の基を示し；
    　置換基βは、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ1-6アルコキシ基およびベンジルオキシ基からなる群より選択される１以上の基を示し；
    　ｎは、１以上、５以下の整数を示す］
  2. 　Ｒ1がＣ1-6アルキル基である請求項１に記載のベンジルアミン誘導体。
  3. 　ｎが２以上である請求項１または２に記載のベンジルアミン誘導体。
  4. 　Ｘがカルボニル基である請求項１～３のいずれかに記載のベンジルアミン誘導体。
  5. 　Ｒ2がＣ2-6アルケニル基である請求項１～４のいずれかに記載のベンジルアミン誘導体。
  6. 　Ｒ3がベンジルオキシメチル基である請求項１～５のいずれかに記載のベンジルアミン誘導体。
  7. 　Ｙがカルボニル基であり且つＲ4が水素原子である請求項１～６のいずれかに記載のベンジルアミン誘導体。
  8. 　請求項１～７のいずれかに記載のベンジルアミン誘導体またはその薬事上許容される塩からなる医薬。
  9. 　請求項１～７のいずれかに記載のベンジルアミン誘導体またはその薬事上許容される塩からなる血液がん治療薬。
  10. 　血液がんの治療のために用いられる、下記式（Ｉ）で表されるベンジルアミン誘導体またはその薬事上許容される塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    ［式中、
    　Ｘは、カルボニル基、オキシカルボニル基、スルホキシド基またはスルホニル基を示し；
    　Ｙは、カルボニル基または－ＣＨ（ＯＲ5）－を示し；
    　Ｒ1は、水素原子、Ｃ1-6アルキル基またはベンジル基を示し；
    　Ｒ2は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、または置換基αを有していてもよいフェニル基を示し；
    　Ｒ3は、置換基βを有していてもよいＣ1-6アルキル基を示し；
    　Ｒ4は、水素原子、アミノ基、ヒドロキシアミノ基、Ｃ1-6アルコキシアミノ基、カルボキシ基または（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基を示し；
    　Ｒ5は、水素原子、Ｃ1-7アルカノイル基またはトリ（Ｃ1-6アルキル）シラノ基を示し；
    　置換基αは、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、ハロゲン原子、シアノ基およびニトロ基からなる群より選択される１以上の基を示し；
    　置換基βは、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ1-6アルコキシ基およびベンジルオキシ基からなる群より選択される１以上の基を示し；
    　ｎは、１以上、５以下の整数を示す］
  11. 　血液がんを治療するための方法であって、
    　下記式（Ｉ）で表されるベンジルアミン誘導体またはその薬事上許容される塩を投与する工程を含むことを特徴とする方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    ［式中、
    　Ｘは、カルボニル基、オキシカルボニル基、スルホキシド基またはスルホニル基を示し；
    　Ｙは、カルボニル基または－ＣＨ（ＯＲ5）－を示し；
    　Ｒ1は、水素原子、Ｃ1-6アルキル基またはベンジル基を示し；
    　Ｒ2は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、または置換基αを有していてもよいフェニル基を示し；
    　Ｒ3は、置換基βを有していてもよいＣ1-6アルキル基を示し；
    　Ｒ4は、水素原子、アミノ基、ヒドロキシアミノ基、Ｃ1-6アルコキシアミノ基、カルボキシ基または（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基を示し；
    　Ｒ5は、水素原子、Ｃ1-7アルカノイル基またはトリ（Ｃ1-6アルキル）シラノ基を示し；
    　置換基αは、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、ハロゲン原子、シアノ基およびニトロ基からなる群より選択される１以上の基を示し；
    　置換基βは、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ1-6アルコキシ基およびベンジルオキシ基からなる群より選択される１以上の基を示し；
    　ｎは、１以上、５以下の整数を示す］
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