WO2012164990A1 - 担子菌を用いるエタノールの製造方法 - Google Patents

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貞利 目黒
近藤　隆一郎
森　智夫
浩文 平井
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Shizuoka University NUC
Kyushu University NUC
University of Miyazaki NUC
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    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ethanol from a carbon source (preferably polysaccharides such as cellulose in water-insoluble form such as plant biomass, hemicellulose and starch, and sugars such as glucose and xylose) using basidiomycetes.
  • a carbon source preferably polysaccharides such as cellulose in water-insoluble form such as plant biomass, hemicellulose and starch, and sugars such as glucose and xylose
  • General sulfuric acid processes include sulfuric acid method and enzymatic method.
  • the sulfuric acid method has a high environmental load and corrosion of the reaction vessel is a problem.
  • Enzymatic methods have a problem in that the cost of cellulase is high.
  • Biomass resources to be subjected to enzymatic methods usually need to be delignified as a pretreatment.
  • an alkali treatment method or the like is known.
  • the ethanol fermentation process is generally performed using yeast.
  • the conventional method for producing ethanol from biomass material requires a multi-step process.
  • Patent Document 1 discloses a method for producing a substrate for an enzymatic saccharification reaction from a lignocellulosic biomass raw material by a process including alkali treatment, that is, a pretreatment method for a lignocellulosic biomass raw material for a saccharification process.
  • the produced substrate is saccharified by an enzyme, and the saccharified product is further ethanol-fermented by a microorganism (yeast).
  • Patent Document 2 describes a saccharification and fermentation system using woody biomass as a raw material.
  • saccharification and fermentation reaction of woody biomass using cellulose-degrading enzyme, hemicellulose-degrading enzyme, and alcohol-fermenting microorganism (yeast), and pentoses remaining in the reaction product are separated, And a step of fermenting sugar using a microorganism (yeast) capable of subjecting sugar to alcohol fermentation.
  • Patent Document 3 describes a method of carrying out enzymatic saccharification and alcohol fermentation in the same tank. However, even in this method, it is necessary to use a combination of a microorganism such as a filamentous fungus having the ability to produce a saccharifying enzyme and a yeast that performs alcohol fermentation.
  • a microorganism such as a filamentous fungus having the ability to produce a saccharifying enzyme and a yeast that performs alcohol fermentation.
  • the conventional technology for producing ethanol from plant biomass material requires a multi-step process, and thus is not satisfactory in terms of energy consumption and cost.
  • Plant biomass materials such as rice straw, bamboo, and hardwood wood contain hemicellulose containing pentoses such as xylose as structural units.
  • pentoses such as xylose
  • ordinary ethanol-fermenting microorganisms do not have the ability to assimilate pentose and produce ethanol. For this reason, when ethanol is produced from a saccharified product of hemicellulose using a normal ethanol-fermenting microorganism, there is a problem that the pentose sugar cannot be used and the ethanol yield is lowered.
  • Patent Document 4 alcohol is produced from a carbon source by alcohol fermentation as a technology that enables the delignification process, the saccharification process, and the ethanol fermentation process to be carried out by a single means.
  • a method is disclosed.
  • the ability to assimilate hexoses of white mushrooms has been confirmed, but it has not been confirmed whether pentoses can be assimilated simultaneously. That is, a technology that can perform the delignification process, the saccharification process, and the ethanol fermentation process by a single means, and that allows ethanol fermentation using both hexose and pentose as a carbon source has been established. Not.
  • the white mushroom used in Patent Document 4 is a kind of white rot fungus.
  • White rot fungi are known to have the ability to produce lignin peroxidase, manganese peroxidase, laccase, and the like to degrade wood-derived lignin (Patent Document 5).
  • White rot fungi are also known to have the ability to saccharify cellulose.
  • Phlebia sp. MG-60 strain belonging to the genus Phlebia was isolated as one of white rot fungi capable of degrading lignin under high salt concentration conditions (Patent Document 6). Whether white rot fungi belonging to the genus Phlebia have alcohol fermentability has not been studied.
  • the object of the present invention is to provide means for easily and efficiently producing ethanol from a carbon source derived from plant biomass resources and the like.
  • the inventors have surprisingly found that basidiomycetes belonging to the genus Phlebia not only have lignin resolution and polysaccharide saccharification ability, but also have the ability to produce ethanol from sugar, and not only glucose. It has been found that even when xylose is used as a carbon source, it has an ability to produce ethanol.
  • the inventor further performs a pretreatment step of culturing basidiomycetes belonging to the genus Phlebia together with a carbon source containing lignin under aerobic conditions, and then performing the basidiomycetes under semi-aerobic conditions or anaerobic conditions.
  • the present invention includes the following inventions: (1) A method for producing ethanol, comprising a step of producing ethanol by culturing basidiomycetes belonging to the genus Phlebia together with a carbon source.
  • the step of producing ethanol comprises A pretreatment step of culturing the basidiomycetes with a carbon source under aerobic conditions;
  • the method of (1) including a fermentation step of further culturing the basidiomycetes with the carbon source to produce ethanol under a semi-aerobic condition or anaerobic condition after the pretreatment step.
  • An inoculum for producing ethanol from a carbon source comprising a basidiomycete belonging to the genus Phlebia and a carrier carrying the basidiomycete.
  • a means for easily and efficiently producing ethanol from a carbon source derived from plant biomass resources or the like is provided.
  • FIG. 1 is a flowchart showing an outline of the method of the present invention.
  • FIG. 2 is a flowchart showing an outline of a preferred embodiment of the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the period of the pretreatment step and the reduction in the lignin content.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the fermentation process period and the ethanol conversion rate.
  • Basidiomycetes The present invention is based on the surprising finding that basidiomycetes belonging to the genus Phlebia have the ability to assimilate carbon sources and produce ethanol.
  • the basidiomycete used in the present invention is not particularly limited as long as it is a basidiomycete belonging to the genus Phlebia and having the ability to produce ethanol when cultured with a carbon source to be described later, and has the ability to degrade lignin as a wood cell wall component.
  • a white rot fungus is more preferable.
  • microorganisms include Phlebia sp. MKFC40001 (NITE-BP-1099, hereinafter simply referred to as “MKFC40001”).
  • MKFC40001 is disclosed in Patent Document 6 and Applied and Environmental Microbiology 74 (9), pp. It is the same strain as Phlebia sp.
  • MG-60 which is a highly salt-tolerant white rot fungus isolated from tropical trees, disclosed in 2709-2716.
  • the present inventors obtained the Phlebia sp. MG-60 strain from a collection stored at Kyushu University. On May 11, 2011, the strain was registered under the name of Phlebia sp. MKFC40001 to the Patent Microorganism Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation (2-5-8 Kazusa Kamashitsu, Kisarazu City, Chiba, Japan). Deposited domestically and given the deposit number NITE P-1099.
  • MKFC40001 (NITE P-1099) is an independent administrative agency of the National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microorganism Depositary Center (2-5-8 Kazusa Kama feet, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818, Japan). As of January 21, it was transferred to a deposit under the Budapest Treaty (international deposit) and deposited internationally. The Phlebia sp. MKFC40001 deposited internationally on February 21, 2012 has been assigned the deposit number NITE BP-1099 by the above organization.
  • Taxonomic position As a result of analysis of ITS-5.8SDrDNA sequence (DDBJ accession number AB210077), it entered the Phlebia genus cluster from the phylogenetic tree and 90% coincided with Phlebia radiate strain ATCC64658 To be judged.
  • the range of Phlebia sp. MKFC40001 used in the present invention is a mutant of Phlebia sp. MKFC40001 and substantially retains the ability to produce ethanol when cultured with a carbon source described below. Variants are also encompassed.
  • the mutant is a mutant obtained by mutagenesis treatment of Phlebia sp. MKFC40001.
  • the mutagenesis treatment can be performed using any suitable mutagen.
  • “mutagen” includes not only a drug having a mutagen effect but also a treatment having a mutagen effect such as UV irradiation.
  • sugars that can be used as a carbon source include hexoses such as glucose, mannose, galactose, and fructose, monosaccharides such as pentoses such as xylose and arabinose, and disaccharides such as cellobiose.
  • Plant biomass materials such as rice straw, bamboo, and hardwood wood contain hemicelluloses having pentoses such as xylose and hexoses such as glucose as structural units, and celluloses having glucose as structural units.
  • the method of the present invention has the surprising effect that ethanol can be efficiently produced from a plant biomass material containing hemicellulose and cellulose by a single step.
  • polysaccharides including oligosaccharides
  • polysaccharides include cellulose, hemicellulose, and starch.
  • the polysaccharide may be in a water-insoluble form.
  • water-insoluble polysaccharides especially cellulose and / or hemicellulose
  • water-insoluble polysaccharides that can be used as a carbon source include plant biomass materials, crystalline cellulose, papers such as waste paper, and polysaccharides in forms such as pulp and cotton linter. It is done.
  • the plant biomass material may be a woody biomass material or a herbaceous biomass material.
  • Wood based biomass materials include wood derived from trees such as conifers, hardwoods, gymnosperms, etc. (including building waste, thinned wood, etc.), sawdust, and mushroom waste beds.
  • Examples of herbaceous biomass materials include materials derived from rice, wheat, corn, sugarcane, bamboo, Japanese pampas grass, and the like, for example, residues generated during harvesting and processing of agricultural products.
  • the plant biomass material can be used as a carbon source that has been previously subjected to physical treatment such as pulverization treatment and explosion treatment and chemical treatment such as alkali treatment.
  • the method for producing ethanol of the present invention includes step S100 (FIG. 1) for producing ethanol by culturing basidiomycetes belonging to the genus Phlebia together with a carbon source.
  • the culture conditions are not particularly limited. Typically, the above-mentioned carbon source is contained in appropriate properties such as liquid, solid, slurry, etc. containing the necessary components such as a nitrogen source and inorganic salts as necessary.
  • the culture medium is inoculated with basidiomycetes belonging to the genus Phlebia.
  • the culture may be any of anaerobic culture, semi-aerobic culture, and aerobic culture, but is preferably anaerobic culture or semi-aerobic culture.
  • anaerobic culture or semi-aerobic culture refers to culturing a medium inoculated with basidiomycetes without substantially aeration with the outside air.
  • anaerobic conditions refer to culture conditions that are substantially free of free oxygen.
  • basidiomycetes and a medium are contained in a container, and the atmosphere in the container is replaced with nitrogen gas or the like.
  • Examples include culture conditions for culturing in a state that does not substantially contain oxygen and in which the inside of the container and the outside air do not substantially vent.
  • the semi-aerobic condition refers to a culture condition in which free oxygen is reduced compared with that in an air atmosphere.
  • basidiomycetes and a medium are accommodated in a container, and the atmosphere in the container is at least started to be cultured.
  • a culture condition for culturing in a state where oxygen is filled with air or the like, but in a state where the inside of the container and the outside air are not substantially aerated can be mentioned.
  • the aerobic condition refers to a culture condition in which free oxygen is present to the same extent as in an air atmosphere.
  • basidiomycetes and a medium are accommodated in a container, and the inside and outside air can be aerated.
  • Examples include culture conditions for culturing in a state.
  • the temperature is preferably 25 ° C. to 35 ° C.
  • the culture time can be about 24 hours to 500 hours.
  • the step S100 of producing ethanol by culturing basidiomycetes belonging to the genus Phlebia together with a carbon source is a pretreatment step of culturing basidiomycetes belonging to the genus Phlebia together with a carbon source in an aerobic condition.
  • This embodiment is particularly effective for a carbon source contained with lignin, such as plant biomass material.
  • the pretreatment step S101 is a step of inoculating the basidiomycetes in a medium containing a carbon source and water as appropriate and culturing under aerobic conditions.
  • the pretreatment step when lignin is contained in the carbon source, the lignin is decomposed.
  • the pretreatment step is preferably performed until the lignin is 20% (w / w) or less, preferably 15% (w / w) or less, based on the total amount of the carbon source (dry matter basis).
  • the temperature in the pretreatment step is preferably 25 ° C to 35 ° C.
  • the culture period of the pretreatment step is preferably 250 to 3000 hours, more preferably 300 to 2000 hours, more preferably 500 to 1500 hours, and most preferably 500 to 1000 hours.
  • the pretreatment step may be performed using a medium containing a carbon source and water as appropriate, with necessary components such as a nitrogen source and inorganic salts added as necessary. Etc., such as nitrogen sources, inorganic salts, etc., it is not essential to add additional components.
  • Fermentation step S102 is a step of generating ethanol by further culturing the basidiomycetes with the carbon source under semi-aerobic conditions or anaerobic conditions after the pretreatment step S101. After adding a necessary component such as a nitrogen source and inorganic salts to the mixture containing the basidiomycete and the carbon source after the pretreatment step, if necessary, fermentation under semi-aerobic conditions or anaerobic conditions A process can be performed. The fermentation process is preferably carried out at a temperature of 25 ° C. to 35 ° C., preferably 120 to 720 hours, particularly preferably 240 to 480 hours.
  • the pretreatment step S101 is not essential, the step S100 does not perform the pretreatment step S101, and the basidiomycetes are present in the presence of a carbon source, preferably in a semi-aerobic condition or anaerobic condition. It may be a step of culturing to produce ethanol.
  • the other embodiment is suitable, for example, when a carbon source not containing lignin (or a carbon source having a lignin content equal to or lower than the target amount in the pretreatment step) is used.
  • Step S100 in this case is preferably performed at a temperature of 25 ° C. to 35 ° C., preferably 24 to 720 hours, particularly preferably 48 to 480 hours.
  • step S200 for recovering ethanol produced by the culture from the medium is not particularly limited.
  • the present invention also provides an inoculum for producing ethanol from a carbon source, comprising a basidiomycete belonging to the genus Phlebia and a carrier carrying the basidiomycete.
  • An inoculum is a composition containing mycelium of basidiomycetes together with a carrier having an appropriate shape such as a solid carrier or a liquid carrier.
  • the present invention also relates to the use of an inoculum composition containing a basidiomycete belonging to the genus Phlebia and a carrier carrying the basidiomycete for producing ethanol from a carbon source.
  • Phlebia sp. MKFC40001 (same as NITE P-1099 deposited in Japan on May 11, 2011, February 21, 2012) cultured on PDA (potato, dextrose, agar) flat medium at 28 ° C for 7 days Mycelium of NITE BP-1099) deposited internationally on the day was used for the following tests.
  • mycelium of wood-rotting fungi containing the following 29 types of white-rotting fungi were also used for the following tests.
  • glucose As carbon sources, glucose (Wako Pure Chemicals, special grade), xylose (Wako Pure Chemicals, special grade), crystalline cellulose (Cellulose (microcrystalline: MERCK), hardwood unbleached kraft pulp (Oji Paper), conifer unbleached kraft pulp (Oji Paper Co., Ltd.), newspaper (lightly cut with a mixer), and oak wood flour (100 mesh pass, methanol degreased) were used.
  • glucose or xylose As a carbon source: A 100 ml Erlenmeyer flask containing 18 ml of the medium excluding the carbon source was autoclaved. 20% glucose aqueous solution and xylose aqueous solution were sterilized by filtration, and 2 ml glucose aqueous solution, 2 ml xylose aqueous solution, or 1 ml each of both aqueous solutions were added to the Erlenmeyer flask after autoclaving (final concentration 2% in the medium of carbon source) .
  • the target strain cultured in PDA medium was taken out together with agar with a cork borer (diameter 5 mm), inoculated into an Erlenmeyer flask, sealed with a silicon stopper, and the ventilation was blocked. Thereafter, the cells were statically cultured in an incubator set at 28 ° C. in the dark, and samples were collected after 5 days, 10 days, and 20 days of culture.
  • a predetermined carbon source was added to a 100 ml Erlenmeyer flask containing 20 ml of a medium excluding the carbon source so as to have the concentration shown in the following table (2% (w / v) or 1% (w / v)), and autoclaved.
  • the target strain was inoculated according to the same procedure and conditions as described above, cultured, and sample collected.
  • HPLC conditions are as follows.
  • MKFC40001 A high-efficiency ethanol fermentation (more than 60% of the theoretical yield) was observed (MKFC40001), and a high-efficiency ethanol fermentation using a glucose-xylose mixed system as a substrate (70 theoretical yield) %) was observed in one species (MKFC40001), and ethanol fermentation using crystalline cellulose as a substrate was observed only in MKFC40001. Only MKFC40001 was able to produce ethanol from all substrates.
  • MKFC40001 produced ethanol with a theoretical yield of 70% or more from glucose on the fifth day of culture. This indicates that MKFC40001 has high glucose fermentability.
  • MKFC40001 produced ethanol with a theoretical yield of 60% or more from xylose on the 10th day of culture. This indicates that MKFC40001 has the ability to ferment xylose.
  • MKFC40001 produced ethanol of 70% or more of its theoretical yield from a mixed solution of glucose and xylose on the 10th day of culture. This indicates that simultaneous fermentation of glucose and xylose is possible.
  • MKFC40001 can be directly ethanol-fermented from insoluble cellulose (crystalline cellulose).
  • MKFC40001 was confirmed to be directly ethanol-fermented from unbleached kraft pulp (hardwood kraft pulp, conifer kraft pulp) obtained by kraft cooking of wood.
  • MKFC40001 was confirmed to be ethanol-fermented directly from newspapers containing a lot of impurities such as lignin and ink.
  • MKFC40001 was confirmed to be ethanol-fermented directly from hardwood wood flour.
  • Experiment 2 Methanol-defatted quercus wood flour (42-100 mesh) was used as a fermentation substrate. A 100 mL Erlenmeyer flask was weighed with about 0.8 g of dry powder, and pure water was added to a water content of about 80%. After autoclave sterilization, Phlebia sp. MKFC40001 cultured in PDA (potato, dextrose, agar) medium was cut out with PDA medium with a cork borer and inoculated with one piece. The lid was covered with a sponge-like silicone resin plug having air permeability (aerobic conditions), and cultured in the dark at 28 ° C. to perform delignification treatment (pretreatment) of the wood flour.
  • PDA potential, dextrose, agar
  • the amount of ethanol produced was measured by collecting 1.5 ml of the liquid layer from the medium cultured for a predetermined period, centrifuging at 13,600 g ⁇ 10 min, 4 ° C., and then diluting the collected supernatant 5 times with sterilized water. The sample filtered through 0.45 ⁇ m was analyzed by HPLC.
  • the ethanol conversion rate is the theoretical yield of ethanol (glucose) calculated from the sugar composition (Table 1) of the wood flour sample after pretreatment under aerobic conditions used as a substrate for ethanol fermentation under semi-aerobic conditions. , When 2 mol of ethanol is produced from 1 mol of galactose and 1 mol of mannose, and 5 mol of ethanol is produced from 3 mol of xylose), respectively, is the ratio of the amount of ethanol actually produced.
  • the lignin content of the untreated wood flour was 23.1%, but when cultured under aerobic conditions for 4 weeks and 8 weeks, the lignin content decreased to 18.1% and 13.7%, respectively.
  • the ratio of the polysaccharide in the wood flour was calculated from the monosaccharide in the sulfate hydrolyzate, the content of glucan was relatively increased. That is, it was shown that delignification with high selectivity was performed.
  • Phlebia sp. MKFC40001 alone can perform delignification and saccharification / fermentation in a single container.

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Abstract

　本発明は、植物バイオマス資源等に由来する炭素源からエタノールを簡便に、かつ高効率で製造するための手段を提供することを目的とする。本発明は、Phlebia属に属する担子菌を炭素源とともに培養することによりエタノールを生成する工程を含む、エタノールの製造方法に関する。炭素源としては、セルロース、ヘミセルロース、グルコース、キシロース等や、これらを含む植物バイオマス資源が利用可能である。

Description

担子菌を用いるエタノールの製造方法
　本発明は、担子菌を用いて炭素源（好ましくは、植物バイオマス等の水不溶性形態のセルロース、ヘミセルロース、デンプン等の多糖類、並びに、グルコース、キシロース等の糖類）からエタノールを製造する方法に関する。
　近年、植物バイオマス資材からエタノールを製造する技術の開発が盛んである。
　通常は水不溶性形態のセルロース及び／又はヘミセルロースを含む植物バイオマス資材からエタノールを製造するためには糖化工程と、エタノール発酵工程が少なくとも必要であり、糖化工程の前処理として脱リグニン工程が別途必要となる場合もある。
　一般的な糖化工程としては硫酸法と酵素法がある。硫酸法は環境負荷が高いことと、反応容器の腐食が問題である。酵素法はセルラーゼのコストが高いという点で問題がある。酵素法に供されるバイオマス資源は、通常、前処理として脱リグニンされている必要がある。脱リグニン工程としてはアルカリ処理法などが知られている。エタノール発酵工程は、酵母を用いて行われることが一般的である。このように、バイオマス資材からエタノールを製造する従来の方法は多段階の工程が必要である。
　例えば特許文献1にはリグノセルロース系バイオマス原料から、アルカリ処理を含む工程により酵素糖化反応のための基質を製造する方法、すなわち糖化工程のためのリグノセルロース系バイオマス原料の前処理方法が開示されている。この文献では、製造された基質は、酵素により糖化され、糖化物は更に微生物（酵母）によりエタノール発酵される。
　特許文献2には木質系バイオマスを原料とする糖化発酵システムが記載されている。このシステムでは、セルロース分解酵素と、ヘミセルロース分解酵素と、アルコール発酵微生物（酵母）とを用いて木質系バイオマスを糖化発酵反応させる工程と、反応物に残存する五炭糖物質を分離し、五炭糖をアルコール発酵させることが可能な微生物（酵母）を用いて発酵反応させる工程とが実施される。
　特許文献3には、酵素糖化とアルコール発酵とを同一槽において実施する方法が記載されている。しかしながらこの方法でも、糖化酵素を産生する能力を有する、糸状菌等の微生物と、アルコール発酵を行う酵母とを組み合わせて用いる必要があった。
　このように、植物バイオマス資材からエタノールを製造する従来技術は多段階の工程を必要とするため、エネルギー消費及びコストの面で満足できるものではなかった。単一の手段を用いて、脱リグニン工程、糖化工程、及びエタノール発酵工程を実施するための技術が求められている。
　稲藁、竹、広葉樹木材等の植物バイオマス資材はキシロース等の五炭糖を構成単位として含むヘミセルロースを含む。しかしながら通常のエタノール発酵性微生物は、五炭糖を資化してエタノールを生成する能力を有していない。このため、ヘミセルロースの糖化物から、通常のエタノール発酵性微生物を用いてエタノールを製造する場合、五炭糖を利用できずエタノール収率が低下する問題がある。特許文献2に記載されているように、グルコース等の六炭糖を資化してエタノールを発酵生成する微生物と、キシロース等の五炭糖を資化してエタノールを発酵生成する微生物とを組み合わせて用いた場合には反応系が複雑となりコストの面で問題がある。
　特許文献4には、脱リグニン工程、糖化工程、及びエタノール発酵工程を単一の手段により実施することを可能にする技術として、シロアミタケ（Trametes suaveolens）を用いて炭素源からアルコール発酵によりアルコールを製造する方法が開示されている。しかしながら特許文献4では、シロアミタケの六炭糖の資化能力は確認されているが、五炭糖を同時に資化することができるかどうかは確認されていない。すなわち、脱リグニン工程、糖化工程、及びエタノール発酵工程を単一の手段により実施することができ、なおかつ、六炭糖と五炭糖を共に炭素源としてエタノール発酵させることができる技術は従来確立されていない。
　特許文献4に用いられているシロアミタケは白色腐朽菌の一種である。白色腐朽菌はリグニンパーオキシダーゼ、マンガンパーオキシダーゼ、ラッカーゼ等を産生し木材由来のリグニンを分解する能力を有することが知られている（特許文献5）。白色腐朽菌はまたセルロースを糖化する能力を有することが知られている。Phlebia属に属するPhlebia sp. MG-60株は高塩濃度条件においてリグニンを分解することができる白色腐朽菌の1種として単離された（特許文献6）。Phlebia属に属する白色腐朽菌がアルコール発酵能を有するか否かは従来検討されていない。
特開2011-4730号公報 特開2010-17084号公報 特開2008-54676号公報 特開2010-183859号公報 特開2008-6372号公報 特開2001-169775号公報
　本発明は、植物バイオマス資源等に由来する炭素源からエタノールを簡便に、かつ高効率で製造するための手段を提供することを目的とする。
　本発明者らは、驚くべきことに、Phlebia属に属する担子菌が、リグニン分解能及び多糖類の糖化能を有するだけでなく、糖からエタノールを生成する能力を有すること、並びに、グルコースだけでなくキシロースを炭素源とした場合でもエタノールを生成する能力を有することを見出した。本発明者は更に、Phlebia属に属する担子菌を、リグニンを含有する炭素源と共に好気的条件において培養する前処理工程を行った後に、半好気的条件又は嫌気的条件において、前記担子菌を前記炭素源とともに更に培養して前記炭素源を基質とするエタノール発酵を行うことにより、エタノールの生成効率を更に高めることができることを見出した。これらの知見に基づき、以下の発明を完成させるに至った。すなわち本発明は以下の発明を包含する：
（1）Phlebia属に属する担子菌を炭素源とともに培養することによりエタノールを生成する工程を含む、エタノールの製造方法。
（2）エタノールを生成する前記工程が、
　前記担子菌を炭素源とともに好気的条件において培養する前処理工程と、
　前処理工程後に、半好気的条件又は嫌気的条件において、前記担子菌を前記炭素源とともに更に培養してエタノールを生成する発酵工程と
を含む、（1）の方法。
（3）Phlebia属に属する担子菌がPhlebia sp. MKFC40001（NITE BP-1099）である、（1）又は（2）の方法。
（4）炭素源が多糖類である、（1）～（3）のいずれかの方法。
（5）多糖類が、植物バイオマス資材、結晶性セルロース、紙類、パルプ又はコットンリンターの形態である、（4）の方法。
（6）炭素源がグルコース、キシロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース及びアラビノースからなる群から選択される1種以上の糖類である、（1）～（3）のいずれかの方法。
（7）Phlebia属に属する担子菌と、該担子菌を担持する担体とを含む、炭素源からエタノールを生成するための種菌。
（8）Phlebia属に属する担子菌がPhlebia sp. MKFC40001（NITE BP-1099）である、（7）の種菌。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2011-122579号の明細書に記載される内容を包含する。
　本発明によれば、植物バイオマス資源等に由来する炭素源からエタノールを簡便に、かつ高効率で製造するための手段が提供される。
図1は本発明の方法の概要を示すフローチャートである。 図2は本発明の方法の好適な実施形態の概要を示すフローチャートである。 図3は、前処理工程の期間とリグニン含有率の低減との関係を示すグラフである。 図4は、発酵工程の期間とエタノール変換率との関係を示すグラフである。
1．担子菌
　本発明は、フレビア（Phlebia）属に属する担子菌が、炭素源を資化してエタノールを生成する能力を有するという驚くべき知見に基づく発明である。
　本発明に用いる担子菌は、Phlebia属に属し、後述する炭素源とともに培養した場合にエタノールを生成する能力を有する担子菌であれば特に限定されず、木材細胞壁成分のリグニンを分解する能力を有する白色腐朽菌であればより好ましい。このような微生物としては、フレビア・エスピー（Phlebia sp.）MKFC40001（NITE BP-1099，以下単に「MKFC40001」と称することがある）が挙げられる。MKFC40001は、特許文献6及びApplied and Environmental Microbiology 74 (9)， pp． 2709-2716において開示されている、熱帯性樹木から分離された高耐塩性の白色腐朽菌であるPhlebia sp. MG-60と同一の株である。本発明者らは当該Phlebia sp. MG-60株を九州大学において保存されていたコレクションから入手した。当該株は、Phlebia sp. MKFC40001の名称のもと、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に2011年5月11日に国内寄託され、受託番号NITE P-1099が付与された。当該Phlebia sp. MKFC40001（NITE P-1099）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）において、2012年2月21日付けで、ブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）へと移管され、国際寄託された。2012年2月21日付けで国際寄託されたPhlebia sp. MKFC40001には、前記機関により受託番号NITE BP-1099が付与された。
　Phlebia sp. MKFC40001（NITE BP-1099）の分類学上の位置及び科学的性質は以下の通りである。
分類学上の位置：ITS-5.8S rDNA配列の解析を行った結果（DDBJ accession number AB210077）、系統樹からはPhlebia属のクラスターに入り、Phlebia radiate strain ATCC64658と90％一致し近縁であると判断される。
科学的性質：木材腐朽菌のなかでも木材細胞壁成分のリグニンを分解することができる白色腐朽菌である。PDA培地上、30℃で良好な生育を示し、糸状、白色の菌糸を示す。培地蔓延後は薄い黄色を呈する。0.02％グアヤコール含有PDA培地で生育させると、培地がグアヤコール酸化物に由来する赤色を呈する。低窒素条件下で大量のマンガンペルオキシダーゼを生産しフェノール性化合物を酸化する。3％程度のSea salts含有培地でも良好な生育を示す耐塩性菌である。
　本発明に用いられるPhlebia sp. MKFC40001の範囲には、Phlebia sp. MKFC40001の変異株であって、後述する炭素源とともに培養した場合にエタノールを生成することができる能力が実質的に保持されている変異株もまた包含される。ここで変異株とはPhlebia sp. MKFC40001が変異誘発処理された変異株である。変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行われ得る。ここで、「変異原」とは、変異原効果を有する薬剤だけでなく、UV照射のごとき変異原効果を有する処理をも包含する。
2．炭素源
　Phlebia属に属する担子菌は、糖類を資化してエタノールを生成する能力に加えて、リグニン分解能、多糖類の糖化能を有していることから、本発明の方法では種々の炭素源を利用することができる。炭素源としては、糖類、多糖類、水不溶性形態の多糖類、多糖類を含む植物バイオマス資源等が挙げられる。
　炭素源として利用可能な糖類としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース等の六炭糖、キシロース、アラビノース等の五炭糖等の単糖類、セロビオース等の二糖類が挙げられる。稲藁、竹、広葉樹木材等の植物バイオマス資材は、キシロース等の五炭糖と、グルコース等の六単糖とを構成単位とするヘミセルロースと、グルコースを構成単位とするセルロースとを含む。本発明の方法は、ヘミセルロースとセルロースとを含む植物バイオマス資材から単一の工程により効率的にエタノールを生成することができるという驚くべき効果を奏する。
　更に、炭素源としては、糖化を受けて上記の糖類を供給可能な多糖類（オリゴ糖類を含む）を使用することができる。多糖類としてセルロース、ヘミセルロース、デンプンが挙げられる。多糖類は水不溶性の形態であってもよい。炭素源として利用可能な水不溶性の形態の多糖類（特にセルロース及び／又はヘミセルロース）としては、植物バイオマス資材、結晶性セルロース、古紙等の紙類、パルプ、コットンリンター等の形態の多糖類が挙げられる。
　植物バイオマス資材は、木本系バイオマス資材であってもよいし、草本系バイオマス資材であってもよい。木本系バイオマス資材としては針葉樹、広葉樹、裸子植物等の樹木に由来する木材（建築廃材、間伐材等を含む）、おが屑、きのこ廃菌床等が挙げられる。草本系バイオマス資材としては稲、麦、トウモロコシ、サトウキビ、竹、ススキ等に由来する資材、例えば農産物の収穫や加工処理の際に生じる残渣等が挙げられる。植物バイオマス資材は、予め粉砕処理、爆砕処理等の物理的処理や、アルカリ処理等の化学的処理が施されたものを炭素源として使用することもできる。
3．エタノールの生成
　本発明のエタノール製造方法は、Phlebia属に属する担子菌を炭素源とともに培養することによりエタノールを生成する工程S100（図1）を含む。
　培養条件は特に限定されないが、典型的には上述の炭素源を、必要に応じて窒素源、無機塩類等の必要な成分とともに含有する、液体状、固体状、スラリー状等の適当な性状の培地にPhlebia属に属する担子菌を接種して培養する。培養は嫌気的培養、半好気的培養、好気的培養のいずれでもよいが、嫌気的培養又は半好気的培養であることが好ましい。嫌気的培養又は半好気的培養とは具体的には、担子菌を接種した培地を、外気と実質的に通気させることなく培養することを指す。本発明において嫌気的条件とは、実質的に遊離酸素が存在しない培養条件を指し、例えば、担子菌と培地とを容器内に収容し、容器内の雰囲気を窒素ガス等で置換するなどして実質的に酸素を含まない状態とし、容器内と外気とが実質的に通気しない状態で培養する培養条件が挙げられる。本発明において半好気的条件とは、空気雰囲気下よりも遊離酸素が低減された培養条件を指し、例えば、担子菌と培地とを容器内に収容し、容器内の雰囲気を、少なくとも培養開始時には空気等で満たされた酸素を含む状態であるが、容器内と外気とが実質的に通気しない状態で培養する培養条件が挙げられる。本発明において好気的条件とは、空気雰囲気下と同程度に遊離酸素が存在する培養条件を指し、例えば、担子菌と培地とを容器内に収容し、容器内と外気とが通気可能な状態で培養する培養条件が挙げられる。
　他の培養条件は適宜決定することができる。例えば、温度は25℃～35℃が好ましく、培養時間は24時間～500時間程度とすることができる。
　本発明の好ましい実施形態では、Phlebia属に属する担子菌を炭素源とともに培養することによりエタノールを生成する工程S100が、Phlebia属に属する担子菌を炭素源とともに好気的条件において培養する前処理工程S101と、前処理工程S101後に、半好気的条件又は嫌気的条件において、前記担子菌を前記炭素源とともに更に培養してエタノールを生成する発酵工程S102との2つの工程（図2）を少なくとも含む。この実施形態は、植物バイオマス資材等の、リグニンとともに含有する炭素源に対して特に有効である。
　前処理工程S101は、前記担子菌を、炭素源及び適宜水を含む培地に接種し、好気的条件にて培養する工程である。前処理工程では、炭素源にリグニンが含まれる場合、該リグニンが分解される。前処理工程は、炭素源（乾燥物基準）の総量に対してリグニンが20％（w/w）以下、好ましくは15％（w/w）以下となるまで行うことが好ましい。前処理工程の温度は25℃～35℃とすることが好ましい。前処理工程の培養期間は、好ましくは250～3000時間、より好ましくは300～2000時間、より好ましくは500～1500時間、最も好ましくは500～1000時間である。前処理工程は、炭素源及び適宜水を含む培地に、必要に応じて窒素源、無機塩類等の必要な成分を更に添加した状態で用いて行われても良いが、炭素源が植物バイオマス資材等の、窒素源、無機塩類等を含むものである場合には追加の成分の添加は必須ではない。
　発酵工程S102は、前処理工程S101後に、半好気的条件又は嫌気的条件において、前記担子菌を前記炭素源とともに更に培養してエタノールを生成する工程である。前処理工程後の前記担子菌と前記炭素源とを含む混合物に、必要に応じて、窒素源、無機塩類等の必要な成分を追加してから、半好気的条件又は嫌気的条件において発酵工程を行うことができる。発酵工程は、25℃～35℃の温度において実施することが好ましく、120～720時間実施することが好ましく、240～480時間実施することが特に好ましい。
　図2に示す実施形態を効率的に実施するためには、前処理工程S101と発酵工程S102とを同一の容器内で実施することが好ましい。
　他の実施形態では、前処理工程S101は必須ではなく、工程S100が、前処理工程S101を行わず、前記担子菌を炭素源の存在下で、好ましくは半好気的条件又は嫌気的条件において培養して、エタノールを生成する工程であってもよい。当該他の実施形態は、例えばリグニンを含有しない炭素源（或いは、リグニン含有量が、上記の前処理工程での目標量以下である炭素源）を用いた場合に適している。この場合の工程S100は、25℃～35℃の温度において実施することが好ましく、24～720時間実施することが好ましく、48～480時間実施することが特に好ましい。
　培養により生成されたエタノールを培地から回収する工程S200（図1、図2）の具体的な手段は特に限定されない。
4．種菌
　本発明はまた、Phlebia属に属する担子菌と、該担子菌を担持する担体とを含む、炭素源からエタノールを生成するための種菌を提供する。
　種菌は担子菌の菌糸体を、固体担体、液体担体等の適当な形状の担体とともに含む組成物である。
　本発明はまた、Phlebia属に属する担子菌と、該担子菌を担持する担体とを含む種菌組成物の、炭素源からエタノールを生成するための使用に関する。
実験1
1．使用菌株
　PDA（ポテト，デキストロース，寒天）平面培地で28℃・7日間培養したPhlebia sp. MKFC40001（2011年5月11日に日本国内寄託されたNITE P-1099と同一の、2012年2月21日に国際寄託されたNITE BP-1099）の菌糸体を、以下の試験に用いた。
　同様に培養した下記29種の白色腐朽菌を含む木材腐朽菌の菌糸体についても以下の試験に用いた。
Ceriporia lacerata（1株）、Phanerochaete sordida（2株）、Phanerochaete chrysosporium（1株）、Pleurotus ostreatus（1株）、Pleurotus pulmonarius （1株）、Pycnoporus coccineus（3株）、Trametes versicolor（2株）、Trametes hirsuta（2株）、Trametes suaveolens（2株）、Gloeophyllum trabeum (2株)、Fomitopsis palustris (1株)、Punctularia sp.（2株）、その他未同定株（9株）
2．培養培地組成・培養条件
　培地組成は以下の通り：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　炭素源として、グルコース（和光純薬製，特級）、キシロース（和光純薬製，特級）、結晶性セルロース（Cellulose microcrystalline: MERCK）、広葉樹未晒クラフトパルプ（王子製紙製），針葉樹未晒クラフトパルプ（王子製紙製），新聞紙（ミキサーで軽く裁断したもの），コナラ木粉（100メッシュパス，メタノール脱脂済）を使用した。
　炭素源としてグルコース又はキシロースを用いる場合：
　炭素源を除いた培地18mlを含む100ml三角フラスコをオートクレーブ滅菌した。20％に調製したグルコース水溶液およびキシロース水溶液をろ過滅菌し、オートクレーブ後の三角フラスコにグルコース水溶液2ml、又はキシロース水溶液2ml、又は両水溶液各1mlを加えた（炭素源の培地中の最終濃度2％）。ここにPDA培地で培養した対象菌株を寒天ごとコルクボーラーで取り出し（直径5mm）、三角フラスコに接種し、シリコン栓で密封し通気を遮断した。その後28℃に設定したインキュベーター内、暗所で静置培養し5日、10日、20日培養後にサンプル回収を行った。
　炭素源として結晶性セルロース、広葉樹未晒クラフトパルプ、針葉樹未晒クラフトパルプ、新聞紙、又はコナラ木粉を用いる場合：
　炭素源を除いた培地20mlを含む100ml三角フラスコに所定の炭素源を下記表に示す濃度（2％（w/v）又は1％（w/v））となるように加え、オートクレーブ滅菌した。ここに上記と同様の手順及び条件に従い対象菌株を接種し、培養を行い、サンプル回収を行った。
3．分析方法
　所定期間培養した培地から液層を1.5ml回収し、13,600g×10min，4℃で遠心分離した後、上清を1.0ml採取した。採取した上清を滅菌水で5倍希釈し、フィルター（0.45μm）を通して濾過し、分析試料とした。分析試料は、HPLCにて分析した。
　HPLC条件は以下の通り。
カラム：Shodex KS-802
移動相：Distilled water
流速：　1.0ml/min
検出器：Shimadzu RID-10A
4．結果
　試験に供した30種の木材腐朽菌のうちグルコースを基質として高効率のエタノール発酵（理論収率の70％以上）が観察されたものは3種（MKFC40001、Punctularia sp. Trametes suaveolens）、キシロースを基質とした高効率のエタノール発酵（理論収率の60％以上）が観察されたものは1種（MKFC40001）、グルコース－キシロース混合系を基質とした高効率のエタノール発酵（理論収率の70％以上）が観察されたものは1種（MKFC40001）、結晶性セルロースを基質としたエタノール発酵が観察されたものはMKFC40001のみであった。MKFC40001のみが全ての基質からエタノールを生成することができた。
　MKFC40001についての結果を次表に示す。
　MKFC40001は培養5日目で、グルコースから理論収率の70％以上のエタノールを生産した。このことからMKFC40001はグルコースの発酵能が高いことが示された。
　MKFC40001は培養10日目で、キシロースから理論収率の60％以上のエタノールを生産した。このことからMKFC40001はキシロースの発酵能を有することが示された。
　MKFC40001は培養10日目で、グルコースとキシロースの混合溶液から、その理論収率の70％以上のエタノールを生産した。このことからグルコースとキシロースの同時発酵が可能であることが示された。
　MKFC40001は不溶性のセルロース（結晶性セルロース）から直接エタノール発酵することができることが確認された。
　MKFC40001は木材をクラフト蒸解することで得られる未晒クラフトパルプ（広葉樹クラフトパルプ，針葉樹クラフトパルプ）から直接エタノール発酵することが確認された。
　MKFC40001はリグニンおよびインク等の不純物を多く含む新聞紙から直接エタノール発酵することが確認された。
　MKFC40001は広葉樹木粉（コナラ）から直接エタノール発酵することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実験2
1．実験方法
　発酵基質として、メタノール脱脂済コナラ木粉（42～100メッシュ）を使用した。100 mL三角フラスコに全乾重量約0.8gの木粉を秤取り、含水率が約80％となるよう純水を加えた。オートクレーブ滅菌後、PDA（ポテト，デキストロース，寒天）培地で培養したPhlebia sp. MKFC40001をPDA培地ごとコルクボーラーでくり抜き、1片を接種した。通気性を有するスポンジ状のシリコン樹脂製栓で蓋をし（好気的条件）、28℃、暗所で培養することで木粉の脱リグニン処理（前処理）を行った。好気的条件で所定期間培養（前処理）した三角フラスコに、オートクレーブ滅菌済の発酵用培地（表1）20mLを加え、シリコンゴム栓で密栓し（半好気的条件）28℃、暗所で培養を行った。培養後、培養液をHPLC分析に供し，生成エタノール量を測定し、エタノール変換率を求めた。
2．分析方法
　木粉の化学組成分析はNREL（米国 National Renewable Energy Laboratory）が公開している方法に従った。具体的には、木粉サンプルを硫酸加水分解し、得られた還元糖を高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）により分析した。検出されたグルコース、キシロース、ガラクトース、マンノースを、それぞれグルカン、キシラン、ガラクタン、マンナンとして換算した（表3）。リグニンは木粉サンプルの硫酸加水分解物残渣（酸不溶物）の全乾重量を測定し、リグニン量とした。その他の成分はメタノール脱脂済み木粉の全乾重量から、算出されたグルカン、キシラン、ガラクタン、マンナンおよびリグニンの重量を差し引いた値とした。
　生成エタノール量の測定は、所定期間培養した培地から液層を1.5ml回収し、13，600g×10min，4℃で遠心分離した後、採取した上清を滅菌水で5倍希釈し、フィルター（0.45μm）を通して濾過した試料をHPLCにて分析した。エタノール変換率は、半好気的条件でのエタノール発酵の基質として用いられる、好気的条件での前処理後の木粉サンプルの糖組成（表1）から算出されたエタノールの理論収量（グルコース、ガラクトースおよびマンノース1molからそれぞれエタノールが2 mol、キシロース3 molからエタノール5 molが生産された場合）を100％としたときの、実際に生成されたエタノール量の割合である。
3．結果および考察
　前処理工程の結果を表3及び図3に、発酵工程の結果を表4及び図4にそれぞれ示す。
　未処理木粉のリグニン含有率が23．1％であったのに対し、好気的条件での培養を4週間および8週間行うと、それぞれリグニン含有率は18.1％、13.7％に減少した。一方、硫酸加水分解物中の単糖から木粉中の多糖の割合を算出したところ、グルカンの含有率が相対的に上昇していた。すなわち、選択性の高い脱リグニンが行われていることが示された。
　2、4、6および8週間好気的条件下で培養したサンプルをそれぞれ半好気的条件に切替えて培養したところ、好気的条件での培養期間が長いサンプルほど、エタノール生成量は増加した。好気的条件下での培養（前処理）を6週間行い半好気的条件での培養を20日間行った処理木粉から理論収率の37.7％、好気的条件下での前処理を8週間行い半好気的条件での培養を20日間行った処理木粉から理論収率の43.9％のエタノールが得られた。
　これらの結果は、Phlebia sp. MKFC40001単独で、脱リグニン処理と糖化・発酵を、単一容器内で行うことが可能であることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (8)

  1. 　Phlebia属に属する担子菌を炭素源とともに培養することによりエタノールを生成する工程を含む、エタノールの製造方法。
  2. 　エタノールを生成する前記工程が、
    　前記担子菌を炭素源とともに好気的条件において培養する前処理工程と、
    　前処理工程後に、半好気的条件又は嫌気的条件において、前記担子菌を前記炭素源とともに更に培養してエタノールを生成する発酵工程と
    を含む、請求項1の方法。
  3. 　Phlebia属に属する担子菌がPhlebia sp. MKFC40001（NITE BP-1099）である、請求項1又は2の方法。
  4. 　炭素源が多糖類である、請求項1～3のいずれか1項の方法。
  5. 　多糖類が、植物バイオマス資材、結晶性セルロース、紙類、パルプ又はコットンリンターの形態である、請求項4の方法。
  6. 　炭素源がグルコース、キシロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース及びアラビノースからなる群から選択される1種以上の糖類である、請求項1～3のいずれか1項の方法。
  7. 　Phlebia属に属する担子菌と、該担子菌を担持する担体とを含む、炭素源からエタノールを生成するための種菌。
  8. 　Phlebia属に属する担子菌がPhlebia sp. MKFC40001（NITE BP-1099）である、請求項7の種菌。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016077293A (ja) * 2014-10-20 2016-05-16 株式会社ヨネクニ 菌類を用いた植物バイオマスからのバイオガスの製造装置および方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2614263C1 (ru) * 2015-12-29 2017-03-24 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский государственный университет нефти и газа( национальный исследовательский университет) имени И.М. Губкина" Штамм базидиального гриба Trametes hirsuta - продуцент этилового спирта
RU2630997C1 (ru) * 2016-12-21 2017-09-15 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский государственный университет нефти и газа (национальный исследовательский университет) имени И.М. Губкина" Штамм базидиомицета trametes hirsuta - продуцент этилового спирта

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006223159A (ja) * 2005-02-16 2006-08-31 Tottori Univ アルコール製造方法、アルコール飲料の製造方法、アルコール含有食品の製造方法およびそれらに用いる種菌
JP2007319114A (ja) * 2006-06-02 2007-12-13 Kyushu Univ マンガンペルオキシダーゼの製造方法
JP2010183859A (ja) * 2009-02-10 2010-08-26 Tottori Univ アルコールの製造方法、アルコール飲料の製造方法、アルコール含有食品の製造方法、および、それらに用いる種菌

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001169775A (ja) 1999-10-06 2001-06-26 Meiji Seika Kaisha Ltd 耐塩性マンガンパーオキシダーゼ及びその生産菌
JP2008006372A (ja) 2006-06-29 2008-01-17 Oji Paper Co Ltd 木質系バイオマスの前処理方法
JP2008054676A (ja) 2006-08-04 2008-03-13 National Institute Of Advanced Industrial & Technology バイオマスからのエタノールの製造方法
JP5233452B2 (ja) 2008-07-08 2013-07-10 王子ホールディングス株式会社 糖化発酵システム
JP5633839B2 (ja) 2009-05-22 2014-12-03 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 リグノセルロース系バイオマスの変換方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006223159A (ja) * 2005-02-16 2006-08-31 Tottori Univ アルコール製造方法、アルコール飲料の製造方法、アルコール含有食品の製造方法およびそれらに用いる種菌
JP2007319114A (ja) * 2006-06-02 2007-12-13 Kyushu Univ マンガンペルオキシダーゼの製造方法
JP2010183859A (ja) * 2009-02-10 2010-08-26 Tottori Univ アルコールの製造方法、アルコール飲料の製造方法、アルコール含有食品の製造方法、および、それらに用いる種菌

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KENJI OKAMOTO ET AL.: "Alcohol Hakkosei Tanshikin no Tansaku to Seishitsu", JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY TAIKAI KOEN YOSHISHU, vol. 2009TH, 2009, pages 100 *
MAURICE, G.: "Fermentation Alcoolique par deux Basidiomycete Phlebia dariata Fr. et Corticium ochracefulvum", COMPT. REND., vol. 254, 1962, pages 2213 - 14 *
MOTOKI YONEDA ET AL.: "Peniophora cinerea ni yoru Ethanol Seisan", JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY TAIKAI KOEN YOSHISHU, vol. 2010TH, 2010, pages 72 *
YOSHIYUKI HIROTA ET AL.: "Hakushoku Fukyukin o Mochiita Cellulose Kishitsu kara no Chokusetsu Ethanol Hakko", KI KAGAKU JOHO, vol. 18, no. 1, August 2011 (2011-08-01), pages 25 - 26 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016077293A (ja) * 2014-10-20 2016-05-16 株式会社ヨネクニ 菌類を用いた植物バイオマスからのバイオガスの製造装置および方法

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