WO2012148130A1 - 배아줄기세포유래 마이크로베시클을 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법 - Google Patents

배아줄기세포유래 마이크로베시클을 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법 Download PDF

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WO2012148130A1
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embryonic stem
stem cells
induced pluripotent
stem cell
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박재성
고용송
김윤근
김준호
장수철
이남우
정다영
최은정
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포항공과대학교 산학협력단
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing induced pluripotent stem cells by dedifferentiating somatic cells using microvesicles derived from embryonic stem cells.
  • Reverse differentiation refers to the regeneration of somatic cells, which are mature cells, to stem cells, which are young cells. It occurs in insects, amphibians, and plants. In mammals such as humans, this is not a naturally occurring phenomenon, but only through artificial means.
  • the cell dedifferentiation method started with a method using cell fusion. When fusion of embryonic stem cells and somatic cells occurs, the first method of de-differentiating somatic cells using the property that the traits of the embryonic stem cells are predominantly discovered. Since then, research has been conducted to induce somatic cell dedifferentiation through fusion of not only embryonic stem cells (ESCs) but also embryonic germinal cells (EGCs), embryonic carcinoma cells (ECCs), and the like.
  • ESCs embryonic stem cells
  • ECCs embryonic germinal cells
  • ECCs embryonic carcinoma cells
  • cells in which cell fusion has occurred may occur at random or remain in a fused form without division.
  • Cells that divide have one nucleus, but cells that do not divide (heterokaryons) have the problem of having the nuclei of two cells at the same time, so most cells form cancer cells and only some cells function normally. Do it.
  • the cell fusion research method (cell, cytoplasm) has a disadvantage that many cells die because fusion was induced by using polyethylene glycol (PEG), which can damage cells to help fusion of large cells.
  • PEG polyethylene glycol
  • Existing studies have been conducted to reverse differentiation using only a part of embryonic stem cells instead of the entire embryonic stem cells.
  • One way was to separate the cytoplasm from the cell so that the nucleus was not included in the fusion.
  • Using a chemical (streptolysin) to make the cell membrane of the somatic cell permeability and then administered the cytoplasm derived from embryonic stem cells.
  • cytoplasmic dedifferentiation no successful dedifferentiation with similar properties to embryonic stem cells until 2010 has occurred.
  • iPS induced pluripotent stem cells
  • the present inventors have studied to solve the problems of the prior art, and found that the embryonic stem cell-derived microvesicles can effectively and safely proceed with the differentiation of somatic cells to complete the present invention.
  • the present invention is to provide a method for producing induced pluripotent stem cells by efficiently proceeding the reverse differentiation of somatic cells without side effects using embryonic stem cell-derived microvesicles, induced pluripotent stem cells prepared by the above method.
  • the present invention provides a method for producing induced pluripotent stem cells comprising the step of treating the somatic cells with a composition comprising microvesicles derived from embryonic stem cells.
  • the present invention provides an induced pluripotent stem cell prepared by treating a composition comprising an embryonic stem cell-derived microvesicle to somatic cells.
  • the present invention also provides a cell therapy comprising the induced pluripotent stem cells.
  • the cytoplasmic delivery method using the fusion of microvesicles does not require the use of cytotoxic substances such as PEG (polyethylene glycol) used for cell fusion or Streptolysin used for cytoplasmic injection, and thus there is little damage to cells.
  • microvesicles are highly efficient in their delivery and have the advantage of protecting the contents of delivery well. The problem with existing cytoplasmic delivery studies was that complete reverse differentiation did not occur due to the decrease in cytoplasmic delivery efficiency by the amount of protein expressed in the nucleus.
  • the microvesicle of the present invention has the advantage of being able to freely adjust the concentration of the cytoplasm according to the method of making and to prevent the loss of intracellular material during fusion, thereby increasing the efficiency of dedifferentiation of somatic cells using the cytoplasm.
  • the method using the microvesicles of the present invention is capable of targeting to induce differentiation in-vivo.
  • the signal generated in the wounded organ of the patient is a major factor of targeting, it is expected that the dedifferentiation method that has only been performed in vivo in the future may be a new means of in vivo.
  • 1 is a transmission electron micrograph of an embryonic stem cell-derived microvesicle made by the extrusion method.
  • Figure 2 is a graph showing the size of the embryonic stem cell-derived microvesicle made by the extrusion method.
  • FIG. 3 is a diagram showing the presence of embryonic stem cell-specific protein Oct3 / 4 in embryonic stem cells and embryonic stem cell-derived microvesicles.
  • FIG. 4 is a diagram showing the presence of embryonic stem cell-specific genes Oct3 / 4 and Nanog in embryonic stem cells and embryonic stem cell-derived microvesicle.
  • Figure 5 is a colony generated after the differentiation of mouse fibroblasts (NIH3T3 cells) using embryonic stem cell-derived microvesicles.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating colonies generated after dedifferentiation of mouse fibroblasts (NIH3T3 cells) using embryonic stem cell-derived microvesicles.
  • FIG. 7 is a colony diagram generated after reverse differentiation of GFP-transformed mouse fibroblasts (NIH3T3 GFP cells) using embryonic stem cell-derived microvesicles.
  • FIG. 8 is a diagram showing the expression of embryonic stem cell specific proteins Oct3 / 4 and Nanog in dedifferentiated mouse fibroblasts (NIH3T3 dedifferentiated cells).
  • FIG. 9 is a diagram showing that the differentiated mouse fibroblasts (NIH3T3 retrodifferentiated cells) are capable of differentiation.
  • FIG. 10 is a diagram showing the expression of differentiation-specific genes AFP, Foxf1, and ⁇ -III tubulin when differentiated mouse differentiated mouse fibroblasts (NIH3T3 dedifferentiated cells).
  • FIG. 11 is a colony image generated after de-differentiation of mouse fibroblasts (NIH3T3 cells) by simultaneously treating embryonic stem cell-derived microvesicles and BFA (brefeldin A).
  • the present invention provides a method for producing induced pluripotent stem cells by treating the composition comprising embryonic stem cell-derived microvesicles to somatic cells to cause differentiation of somatic cells.
  • Embryonic stem cells used in the present invention may be derived from human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses and cattle, but is not limited thereto.
  • the 'microvesicle' of the present invention is distinguished from the inside and the outside by a lipid bilayer consisting of the cell membrane components of the cell derived, has cell membrane lipids and cell membrane proteins, nucleic acids and cellular components of the cell, and larger than the original cell Means small, but is not limited thereto.
  • microvesicles of the present invention can be prepared using a method selected from the group consisting of extrusion, sonication, cell lysis, homogenization, freeze-thaw, electroporation, mechanical degradation, and chemical treatment. May be, but is not limited to this.
  • the membrane of the microvesicle may further comprise components other than the cell membrane of the embryonic stem cells.
  • Components other than the cell membrane may include a targeting molecule, a substance required for cell membrane fusion with a target cell, a fudexogen, a cyclodextrin, polyethylene glycol, and the like.
  • components other than the cell membrane may be added by various methods, and include chemical modification of the cell membrane.
  • the membrane component of the microvesicle is modified by a chemical method using a thiol group (-SH) or an amine group (-NH2), or by chemically bonding polyethylene glycol to the microvesicle.
  • the membrane component may be chemically modified.
  • the method may further include chemically modifying the membrane component of the microvesicle.
  • the embryonic stem cells of the present invention include transformed cells.
  • the transformed cell may be a cell transformed to express a specific protein, a target-inducing substance, or a substance necessary for cell membrane fusion with the target cell; And transformed cells consisting of two or more combinations thereof.
  • the embryonic stem cells may be transformed by material processing or gene introduction, and may be transformed two or more times.
  • the embryonic stem cells may be transformed to inhibit the expression of one or more specific proteins.
  • the embryonic stem cells are transformed to express one or more selected from the group consisting of cell junction molecule, antibody, target-induced protein, membrane fusion protein itself, and fusion proteins thereof It may be.
  • the embryonic stem cells may be cells transformed to overexpress the embryonic stem cell specific protein Oct3 / 4, Nanog, or Sox-2 protein.
  • composition of the present invention may further comprise components other than embryonic stem cell-derived microvesicle.
  • somatic cells may be treated with a composition comprising an embryonic stem cell-derived microvesicle and a substance that promotes somatic cell dedifferentiation.
  • additional materials include brefeldin A (BFA), BiP inducer X (BIX), and valproic acid (VPA).
  • Mouse embryonic stem cells were suspended in 3 ml of PBS (phosphate buffered saline) solution at a concentration of 5 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • the suspension solution was passed ten times through a membrane filter with a pore size of 10 ⁇ m and then ten times with a membrane filter with a pore size of 5 ⁇ m.
  • a membrane filter with a pore size of 10 ⁇ m In a 5 ml ultracentrifuge tube, 1 ml of 50% Optiprep, 1 ml of 5% Optiprep and 3 ml of cell suspension passed through the membrane filter were in turn. After ultracentrifugation for 2 hours at 100,000 ⁇ g. Microvesicles were obtained in the layer between 50% Optiprep and 5% Optiprep.
  • Microvesicles prepared from embryonic stem cells according to the method of Example 1 were adsorbed for 3 minutes on a glow-discharged carbon-coated copper grid.
  • the grid was washed with distilled water, stained with 2% uranyl acetate for 1 minute, and observed with a JEM101 (Jeol, Japan) transmission electron microscope.
  • the microvesicle prepared by the extrusion method from embryonic stem cells consists of a lipid bilayer, it can be seen that the size is 100 ⁇ 200 nm and is generally spherical.
  • Microvesicles prepared from embryonic stem cells according to the method of Example 1 were diluted in 1 ml of PBS at a concentration of 5 ⁇ g / ml. 1 ml of PBS containing microvesicles was placed in a cuvette and analyzed by a dynamic light scattering particle size analyzer, and the results are shown in FIG. 2.
  • the size of the microvesicle is 50 ⁇ 100 nm, the average size was confirmed as 70 nm.
  • Oct3 / 4 and beta-actin antibodies were treated at 4 ° C. for 12 hours. After washing twice with PBS, secondary antibodies each attached with peroxidase were treated at room temperature for 1 hour. After washing for 30 minutes with PBS, it was confirmed by ECL (enhanced chemiluminescence, Amersham Co. No. RPN2106) substrate (substrate) is shown in Figure 3.
  • ECL enhanced chemiluminescence, Amersham Co. No. RPN2106
  • the microvesicles prepared from embryonic stem cells was confirmed that the presence of the embryonic stem cell specific protein Oct3 / 4 protein.
  • RNAs whole genes
  • RNeasy® Mini kit QIAGEN, Cat. No. 74104
  • the extracted RNA was identified by ETBR (Ethidium Bromide) staining using a specific gene primer and PCR kit (BIOLAB, Cat. No. E5000) to obtain a large number of cDNA and isolated through agarose gel electrophoresis.
  • GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenas
  • 5'-AGACCATGTTTCTGAAGTGC-3 'and 5'-GAACCATACTCGAACCACA-3' are used as the antisense primer and 5'-GAACCATACTCGAACCACA-3 'as the sense primer of Oct-3 / 4, an embryonic stem cell specific gene.
  • 5'-CTAGTTCTGAGGAAGCATCG-3 ' was used as a specific gene, Nanog's sense primer, and 5'-TCTCAGTAGCAGACCCTTG-3' was used as an antisense primer.
  • Gene expression photographs for characterization of embryonic stem cell-derived microvesicles are shown in FIG. 4.
  • NIH 3T3 cells were inoculated with 8 ⁇ 10 4 cells, and then cultured in 6 wells for 24 hours. Thereafter, each well was washed with PBS (phosphate buffered saline) and the microvesicles prepared from embryonic stem cells according to the method of Example 1 were treated with 2 ml of fibroblast medium (DMEM, 10% FBS) at a concentration of 100 ⁇ g / ml. , Diluted to 100 U / ml penicillin-streptomysin) and treated to the cultured NIH 3T3 cells. After 48 hours, two to three colonies (colony) could be identified in each well, and the size was confirmed to be about 10 to 100 ⁇ m. The results of the observation with an electron microscope are shown in FIG. 5.
  • NIH3T3 cells were dedifferentiated using embryonic stem cell-derived microvesicles to induce populations.
  • the whole cells were diluted in 2 ml of embryonic stem cell medium using 1 ⁇ TE and passaged in 6% wells coated with 0.1% gelatin.
  • the passage was carried out with a 100 mm culture dish coated with 0.1% gelatin coated with 8 ml of medium at the time when 80% was full again, and then passaged once every 2-3 days.
  • NIH 3T3 cells were injected with the GFP gene onto the genome using retrovirus (pMSCV).
  • the modified cells show green fluorescence while the embryonic stem cells making microvesicles do not fluoresce.
  • 0.1% gelatin was coated on a 6 well plate, inoculated with 8 ⁇ 10 4 NIH 3T3 GFP cells and incubated for 24 hours. Thereafter, each well was washed with PBS and the embryonic stem cell-derived microvesicles prepared in Example 1 were treated with 2 ml of fibroblast medium (DMEM, 10% FBS, 100 U / ml penicillin-) at a concentration of 100 ⁇ g / ml. diluted in streptomysin) and treated with NIH 3T3 GFP cells. After 48 hours, about 2-3 clusters per well could be identified, and the size was confirmed between about 10 and 100 ⁇ m, and the results of electron microscopy are shown in FIG. 7.
  • DMEM fibroblast medium
  • the conventional studies have a long period of dedifferentiation from 7 days to 30 days, while using the embryonic stem cell-derived microvesicles of the present invention for 48 hours. It can be seen that colonies form in the bay, which can significantly shorten the period of dedifferentiation.
  • NIH3T3 dedifferentiated cells induced pluripotent stem cells
  • Embryonic stem cells have the ability to spontaneously differentiate into all cells when they become an embryonic body.
  • the same principle was induced to force agglomeration of cells induced by the hanging drop method.
  • Clustered cells were suspended using trypsin and diluted in differentiation medium (IMDM, 20% FBS, 4 mM L-glutamin, Gentamysin 10 ⁇ g / ml, 100 U / ml Penicillin-streptomycin) at a concentration of 3.3 ⁇ 10 4 / ml. .
  • the diluted solution was stuck to the bacterial culture dish ceiling by 30 ⁇ l (1 ⁇ 10 3 pieces) to induce agglomeration for two days.
  • Cells clustered on the ceiling were washed with differentiation medium and incubated for two days in suspension in bacterial dishes.
  • 8 is a photograph of induced pluripotent stem cells suspended in a clustered form in a bacterial dish.
  • NIH 3T3 cells and embryonic stem cells were induced to aggregate in a conventional manner.
  • Cells were diluted to 3 / ml in differentiation medium and cultured by injecting 2 ml into 6 wells coated with 0.1% gelatin. The cultures were replaced twice every 8 days for 16 days. 9 shows the shape of the cells after differentiation induction.
  • RNA Differentiated cells were extracted whole genes (RNA) using the RNeasy® Mini kit (QIAGEN, Cat. No. 74104). The extracted RNA was identified by ETBR (Ethidium Bromide) staining using a specific gene primer and PCR kit (BIOLAB, Cat. No. E5000) to obtain a large number of cDNA and isolated through agarose gel electrophoresis. Actin, which always expresses (Housekeeping gene), was identified to confirm that the same amount of RNA was used as the positive control group (embryonic stem cells).
  • ETBR Ethidium Bromide
  • AFP endoderm
  • mesoderm meoderm
  • ectoderm b-III tubulin
  • endoderm endoderm
  • mesoderm meoderm
  • ectoderm b-III tubulin
  • endoderm endoderm
  • mesoderm meoderm
  • ectoderm b-III tubulin
  • AFP used 5'-AACTCTGGCGATGGGTGTT-3 'as a sense primer and 5'-AAACTGGAAGGGTGGGACA-3' as an antisense primer
  • Foxf1 used 5'-CGTGTGTGATGTGAGGTGAG-3 'and 5'-CTCCGTGGCTGGTTTCA as an antisense primer.
  • NIH3T3 dedifferentiated cells As shown in FIG. 10, it was confirmed that genes of endoderm, mesoderm, and ectoderm are expressed in NIH3T3 dedifferentiated cells, which shows that NIH3T3 dedifferentiated cells have spontaneous differentiation ability.
  • Example 1 0.1% gelatin was coated on 6-well plates, inoculated with 8 ⁇ 10 4 cells of NIH 3T3 cells, and then incubated in 6 wells for 24 hours. After washing each well with PBS, 2 ml each of the embryonic stem cell-derived microvesicles prepared in Example 1 at a concentration of 100 ⁇ g / ml and BFA (brefeldin A) 2 ⁇ M, respectively, were used in fibroblast medium (DMEM, 10 Diluted in% FBS, 100 U / ml penicillin-streptomysin) and treated to the cultured NIH 3T3 cells. After 48 hours, two to three clusters per well were identified, and the size was confirmed to be between about 10 and 100 ⁇ m, and the results of the observation with an electron microscope are shown in FIG. 11.
  • DMEM 10 Diluted in% FBS, 100 U / ml penicillin-streptomysin
  • the differentiation of somatic cells can be efficiently carried out without side effects, and the cell therapeutic agent has secured immunocompatibility for each individual. It is expected to be very useful for developing the system.

Abstract

본 발명은 배아줄기세포유래 마이크로베시클을 이용하여 체세포를 역분화시키는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 배아줄기세포로부터 유래된 마이크로베시클을 포함하는 조성물을 체세포에 처리하여 유도만능줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 유도만능줄기세포의 제조방법은 배아줄기세포유래 마이크로베시클을 이용하여 부작용 없이 체세포의 역분화를 효율적으로 진행할 수 있으며, 나아가 각 개체 별로 면역적합성이 확보된 세포치료제를 개발하는데 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

배아줄기세포유래 마이크로베시클을 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법
본 발명은 배아줄기세포에서 유래한 마이크로베시클을 이용하여 체세포를 역분화시켜 유도만능줄기세포를 제조하는 방법 등에 관한 것이다.
역분화는 성숙한 세포인 체세포가 젊은 세포인 줄기세포로 되돌아가는 것을 말하며 곤충, 양서류나 식물 등에서 일어나는 현상으로 생체 내 재생과 관련된 과정이다. 인간과 같은 포유동물에서는 자연적으로 일어나는 현상이 아니며 인위적인 방법만을 통해서만 가능하다. 세포 역분화 방법은 세포 융합을 이용한 방식으로부터 시작되었다. 배아줄기 세포와 체세포를 융합시키면 베아줄기 세포의 형질이 우세하게 나타나는 성질을 이용하여 체세포를 역분화하는 방법이 최초로 밝혀졌다. 그후 배아줄기세포 (ESCs)뿐 아니라 그와 흡사한 능력의 줄기세포인 embryonic germinal cells (EGCs), embryonic carcinoma cells (ECCs) 등과 체세포의 융합을 통해 체세포의 역분화를 유도하는 연구가 진행되었다.
그러나 세포 융합이 일어난 세포는 분열이 일어나거나 또는 분열이 일어나지 않고 융합된 형태로 유지되는 경우가 무작위적으로 일어난다. 분열이 일어나는 세포 (hybrid)는 한 개의 핵을 가지지만, 분열이 일어나지 않는 세포 (heterokaryons)는 두 가지 세포의 핵을 동시에 가지는 문제를 가지기에 대부분의 세포는 암세포를 형성하고 일부 세포만이 정상적인 기능을 한다.
또한, 세포 융합 연구 방식 (세포, 세포질체)은 크기가 큰 세포의 융합을 돕기 위해 세포에 피해를 줄 수 있는 PEG (Polyethylene glycol)를 이용하여 융합을 유도하였기에 많은 세포가 죽는 단점을 가지고 있다. 기존 연구들은 이와 같은 문제점을 해결하기 위해 배아줄기세포 전체가 아닌 그의 일부분만을 이용하여 역분화를 하려는 연구가 진행되었다. 그 중 하나의 방식은 세포에서 세포질만을 분리하여 핵이 융합 시에 포함되지 않도록 진행하였다. 화학 물질 (streptolysin)을 이용해 체세포의 세포막이 투과성을 가지도록 만든 후 배아줄기 세포에서 유래한 세포질을 투여하는 방식을 사용하였다. 그러나 세포질을 이용한 역분화의 경우 2010년까지 배아줄기세포와 비슷한 성질을 가지는 역분화를 성공한 사례는 없다.
그 외에 특정인자의 전달 시스템이 있다. 2006년 일본 교토대학의 yamanaka 연구팀은 배아줄기 세포내의 4가지의 유전자만으로 역분화가 가능함을 밝혔다. 4가지 유전자 (Oct-4, klf4, Sox2, and c-Myc)를 생쥐의 피부세포에 도입하여 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPS)를 제조하였다. 세포의 전체융합이 아닌 일부를 합성하여 넣는 관점으로 시작된 연구이다. iPS 기술은 초기에 바이러스의 능력을 이용하여 게놈 (genome) 상에 유전자들을 삽입시키고 강제적 RNA의 발현 후 단백질이 생산되도록 하는 방식을 사용하였다. 그러나 바이러스의 특성상 게놈의 여러 부위에 통합하여 원하지 않는 변형을 발생시키는 문제가 있다. 현재는 이러한 문제를 해결하기 위해 mRNA전달 방식이나, 단백질 자체를 전달하는 방식이 사용되고 있지만, mRNA는 분해가 잘되고 합성과정이 어렵다는 단점 뿐 아니라 합성 RNA의 면역반응 유발등의 문제가 있고, 단백질 만의 전달은 완벽한 역분화를 이루기가 어렵다는 것을 보여주었다.
따라서, 상기와 같은 문제점들을 극복할 수 있는 역분화 만능줄기세포의 제조방법에 관한 연구의 필요성이 요구되고 있다.
본 발명자들은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 연구한 결과, 배아줄기세포 유래 마이크로베시클을 이용하여 체세포의 역분화를 효과적이고 안전하게 진행할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에 본 발명은 배아줄기세포 유래 마이크로베시클을 이용하여 부작용 없이 체세포의 역분화를 효율적으로 진행하여 유도만능줄기세포를 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 유도만능줄기세포 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 배아줄기세포로유래 마이크로베시클을 포함하는 조성물을 체세포에 처리하는 단계를 포함하는 유도만능줄기세포의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 일 구현예로, 배아줄기세포유래 마이크로베시클을 포함하는 조성물을 체세포에 처리하여 제조된 유도만능줄기세포를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 유도만능줄기세포를 포함하는 세포치료제를 제공한다.
본 발명은 마이크로베시클의 융합을 이용한 세포질 전달 방식은 세포융합에 사용된 PEG (polyethylene glycol)나 세포질 주입 시 사용되는 Streptolysin등의 세포 독성물질의 사용이 필요 없기에 세포의 피해가 적다. 또한 세포질 전달 시에 마이크로베시클은 그 전달 효율이 높고, 전달 내용물을 잘 보호하는 장점을 가지기에 세포질의 특이적 전달이 가능하다. 기존 세포질 전달 연구에서의 문제점은 핵에서 발현하는 단백질의 양 만큼 세포질의 전달 효율이 떨어짐으로 인해 완벽한 역분화가 일어나지 아니한다는 것이었다. 그러나 본 발명의 마이크로베시클은 만드는 방식에 따라 세포질의 농도를 자유롭게 조절 가능하고 융합 시 세포내 물질의 손실을 막을 수 있어 세포질을 이용한 체세포의 역분화의 효율성을 높일 수 있는 장점이 있다.
이에 더하여, 본 발명의 마이크로베시클을 이용한 방법은 생체 내 (in-vivo) 에서의 역분화를 유도하도록 타겟팅 (targeting)이 가능하다. 특히나 환자의 상처 입은 기관 내에 생성되는 신호는 타겟팅의 주요한 인자이기 때문에 앞으로 생체 밖에서만 진행되었던 역분화 방법이 체내에서 이루어질 수 있는 새로운 수단이 될 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 압출법으로 만든 배아줄기세포 유래 마이크로베시클의 투과전자현미경 사진이다.
도 2는 압출법으로 만든 배아줄기세포 유래 마이크로베시클의 크기를 나타내는 그래프이다.
도 3은 배아줄기세포와 배아줄기세포 유래 마이크로베시클에 배아줄기세포 특이 단백질인 Oct3/4이 존재함을 보여주는 그림이다.
도 4는 배아줄기세포와 배아줄기세포 유래 마이크로베시클에 배아줄기세포 특이 유전자인 Oct3/4 및 Nanog 가 존재함을 보여주는 그림이다.
도 5는 배아줄기세포 유래 마이크로베시클을 이용하여 마우스 섬유아세포 (NIH3T3 세포)를 역분화 한 후 생성된 콜로니 그림이다.
도 6은 배아줄기세포 유래 마이크로베시클을 이용하여 마우스 섬유아세포 (NIH3T3 세포)를 역분화 한 후 생성된 콜로니가 시간이 지날수록 증식하는 것을 나타내는 그림이다.
도 7은 배아줄기세포 유래 마이크로베시클을 이용하여 GFP가 형질전환된 마우스 섬유아세포 (NIH3T3 GFP 세포)를 역분화 한 후 생성된 콜로니 그림이다.
도 8은 역분화된 마우스 섬유아세포 (NIH3T3 역분화 세포)에 배아줄기세포 특이 단백질인 Oct3/4 및 Nanog가 발현됨을 보여주는 그림이다.
도 9는 역분화된 마우스 섬유아세포 (NIH3T3 역분화 세포)가 분화 능력이 있음을 나타내는 그림이다.
도 10은 역분화된 마우스 섬유아세포 (NIH3T3 역분화 세포)를 분화시켰을 때, 분화 특이 유전자인 AFP, Foxf1, 및 β-III tubulin이 발현됨을 보여주는 그림이다.
도 11은 배아줄기세포 유래 마이크로베시클과 BFA (brefeldin A)를 동시에 처리하여, 마우스 섬유아세포 (NIH3T3 세포)를 역분화 한 후 생성된 콜로니 그림이다.
본 발명은 배아줄기세포유래 마이크로베시클을 포함하는 조성물을 체세포에 처리하여 체세포의 역분화를 일으킴으로써 유도만능줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 배아줄기세포는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등에서 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 ‘마이크로베시클’은 유래한 세포의 세포막 성분으로 이루어진 지질 이중막에 의해 내부와 외부가 구분되며, 세포의 세포막 지질과 세포막 단백질, 핵산 및 세포 성분 등을 가지고 있으며, 원래 세포보다 크기가 작은 것을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 마이크로베시클은 배아줄기세포를 포함하는 현탁액을 압출, 초음파 분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기천공, 기계적 분해, 및 화학 물질 처리로 이루어진 군에서 선택된 방법을 사용하여 제조할 수 있으나 이제 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 마이크로베시클의 막이 상기 배아줄기세포의 세포막 이외의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포막 이외의 성분은 표적유도 물질(targeting molecule), 표적세포와의 세포막 융합에 필요한 물질(fusogen), 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 폴리에틸렌글리콜 등을 포함할 수 있다. 또한 상기 세포막 이외의 성분은 다양한 방법에 의해 추가될 수 있으며, 세포막의 화학적 변형 등을 포함한다.
예를 들어, 상기 마이크로베시클의 막 성분이 티올기(-SH) 또는 아민기(-NH2)를 이용한 화학적 방법으로 변형되거나, 상기 마이크로베시클에 폴리에틸렌글리콜을 화학적으로 결합시킴으로써 상기 마이크로베시클의 막 성분이 화학적으로 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 마이크로베시클 제조시 상기 마이크로베시클의 막 성분을 화학적으로 변형하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 배아줄기세포는 형질전환된 세포를 포함한다. 구체적으로, 상기 형질전환된 세포는 특정 단백질, 표적유도 물질, 또는 표적세포와의 세포막 융합에 필요한 물질을 발현하도록 형질전환된 세포; 및 이들의 2개 이상의 조합으로 이루어진 형질전환된 세포를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배아줄기세포는 물질 처리 또는 유전자 도입에 의해 형질전환된 것일 수 있으며, 2회 이상 형질전환된 것일 수 있다.
상기 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 배아줄기세포가, 하나 이상의 특정 단백질의 발현을 억제하도록 형질전환된 것일 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 배아줄기세포가, 세포 접합 분자, 항체, 표적유도 단백질, 세포막융합 단백질 자체, 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 것일 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서 배아줄기세포가 배아줄기세포 특이 단백질인 Oct3/4, Nanog, 또는 Sox-2 단백질을 과발현하도록 형질전환된 세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 본 발명의 조성물은 배아줄기세포 유래 마이크로베시클 이외의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 배아줄기세포유래 마이크로베시클 및 체세포 역분화를 촉진하는 물질이 포함된 조성물을 체세포에 처리할 수 있다. 상기 추가의 물질은 BFA (brefeldin A), BIX (BiP inducer X), 및 VPA (valproic acid)를 포함한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예1. 배아줄기세포 유래 마이크로베시클의 제조
마우스 배아줄기세포를 5 × 106 cells/ml의 농도로 PBS(phosphate buffered saline) 용액 3 ml에 현탁(resuspension)하였다. 상기 현탁 용액을 구멍 크기가 10 μm인 멤브레인 필터(membrane filter)에 10회 통과시킨 후, 구멍 크기가 5 μm인 멤브레인 필터에 10회 통과시켰다. 5 ml 용량의 초원심분리 튜브(ultracentrifuge tube)에 각각 50% 옵티프렙 1 ml, 5% 옵티프렙 1 ml, 멤브레인 필터를 통과한 세포 현탁액 3 ml을 차례로 담았다. 이후 100,000 × g에서 2 시간 동안 초원심분리(ultracentrifugation)하였다. 50% 옵티프렙과 5% 옵티프렙 사이의 층에서 마이크로베시클을 얻었다.
실시예 2. 배아줄기세포 유래 마이크로베시클의 특성 분석
실시예 1의 방법에 따라 배아줄기세포에서 제조한 마이크로베시클을 글로방전 탄소 코팅 구리 그리드(glow-discharged carbon-coated copper grid)에서 3 분간 흡착시켰다. 상기 그리드를 증류수로 세척한 후, 2% 우라닐아세테이트(uranylacetate)로 1 분 동안 염색(staining)하여, JEM101(Jeol, Japan) 투과전자현미경으로 관찰한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 투과전자현미경 이미지에 나타난 바와 같이, 배아줄기세포로부터 압출법으로 제조한 마이크로베시클은 지질이중층으로 이루어져 있으며, 크기가 100 ~ 200 nm이고 대체로 구형을 이루고 있음을 알 수 있다.
실시예 1의 방법에 따라 배아줄기세포로부터 제조한 마이크로베시클을 5 μg/ml의 농도로 PBS 1ml에 희석(dilution)하였다. 마이크로베시클이 들어있는 PBS 1 ml을 큐벳(cuvette)에 넣고 동적 광산란 입도 분석기로 분석하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 마이크로베시클의 크기는 50 ~ 100 nm이며, 평균 크기는 70 nm 로 확인되었다.
실시예 1의 방법에 따라 배아줄기세포에서 제조한 마이크로베시클 50 μg과 배아줄기세포 전체 단백질 (Whole cell lysate) 10 μg을 준비한 후, 5 x 로딩 염색제(loading dye, 250 mM Tris-HCl, 10% SDS, 0.5% bromophenol blue, 50% glycerol)가 최종적으로 1 x로 되도록 넣고, 100℃에서 5분간 처리하였다. 8% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)을 준비하고, 샘플을 로딩하였다. 80V에서 2시간 전기영동 한 후, 400 mA에서 2시간 동안 단백질을 PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인으로 트랜스퍼(transfer)하였다. 탈지유(Skim milk)를 PBS에 3%가 되도록 녹인 후, 멤브레인을 이 용액에서 2시간 블로킹(blocking)하였다. Oct3/4과 베타-액틴 (β-actin) 항체를 4℃에서 12시간 처리하였다. PBS로 2번 세척한 후, 각각 페록시다아제(peroxidase)가 붙어있는 이차 항체를 실온에서 1 시간 처리하였다. PBS로 30분 세척한 후, ECL(enhanced chemiluminescence, Amersham Co. No. RPN2106) 기질(substrate)로 확인하여 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 배아줄기세포에서 제조한 마이크로베시클에는 배아줄기세포 특이 단백질인 Oct3/4 단백질이 존재함을 확인하였다.
실시예 1의 방법에 따라 배아줄기세포로부터 제조한 마이크로베시클과 배아줄기세포 내에서 RNeasy®Mini kit (QIAGEN, Cat. No. 74104)를 사용해 전체 유전자(RNA)를 추출하였다. 추출된 RNA를 특정 유전자 프라이머와 PCR kit(BIOLAB, Cat. No. E5000)를 사용해 다수의 cDNA를 얻고 아가로스 겔 영동을 통해 분리하여 ETBR(Ethidium Bromide)염색으로 확인하였다. 유전자가 양성대조군(배아줄기세포)과 같은 양의 RNA가 사용되었는지 확인하기 위해 항상 발현(Housekeeping gene)하는 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenas)을 같이 확인하였다. 이때, 배아줄기세포 특이 유전자인 Oct-3/4의 센스 프라이머(primer)로 5’- AGACCATGTTTCTGAAGTGC-3’와 안티센스 프라이머(primer)로 5’-GAACCATACTCGAACCACA-3’를 사용하고, 또 다른 배아줄기세포 특이 유전자인 Nanog의 센스 프라이머로 5’-CTAGTTCTGAGGAAGCATCG-3’와 안티센스 프라이머로 5’-TCTCAGTAGCAGACCCTTG-3’를 사용하였다. 배아줄기세포 유래 마이크로베시클의 특성 분석을 위한, 유전자 발현 사진은 도 4에 나타내었다.
도 4 에 나타난 바와 같이, 배아줄기세포에서 제조한 마이크로베시클에는 배아줄기세포 특이 유전자인 Oct3/4와 Nanog가 발현되고 있음을 확인하였다.
실시예 3. 배아줄기세포 유래 마이크로베시클을 이용한 체세포의 역분화
6 웰 플레이트에 0.1% 젤라틴을 코팅하고, NIH 3T3 세포 8×104cells를 접종한 후, 6 웰에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 각 웰을 PBS (phosphate buffered saline)로 세척하여 주고 실시예 1의 방법에 따라 배아줄기세포에서 제조한 마이크로베시클을 100 μg/ml의 농도로 2ml를 섬유아세포 배지(DMEM, 10% FBS, 100 U/ml penicillin-streptomysin)에 희석하여 상기 배양된 NIH 3T3 세포에 처리해 주었다. 48시간 이후, 각 웰 당 2~3개 정도의 군집(colony)를 확인할 수 있었고, 크기는 약 10 ~ 100 μm 사이로 확인되었으며, 이를 전자현미경으로 관찰한 결과는 도 5 에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 배아줄기세포 유래 마이크로베시클을 이용하여 NIH3T3 세포를 역분화시킨 후, 군집을 유도할 수 있음을 확인하였다.
각 웰을 PBS로 세척하고 0.1 × TE (Typsin-EDTA) 400 μl를 넣어주었다. 1분 후, 피펫을 이용하여 1 x TE를 10 μl를 군집부위에 흘려주고 피펫의 팁(tip)이 군집을 감싸도록 꽂은 뒤 흡입하여 집어내었다. 상기 집어낸 군집은 배아줄기세포 배지(knock out DMEM, 15% knock out FBS, 10 ng/ml LIF, 0.1 mM 2-Mercaptoethanol, 4 mM L-glutamin, Gentamysin 10 μg/ml, 100 U/ml Penicillin-streptomycin) 500 μl에 희석하여 0.1% 젤라틴 코팅된 24 웰에 접종하고 5일 이상 배양하였다.
세포가 80% 이상 가득 찬 시점에 1 × TE를 이용해 전체세포를 배아줄기세포 배지 2 ml에 희석하여 0.1% 젤라틴 코팅된 6웰에 계대하였다. 동일한 방법을 통해 80 % 다시 가득 찬 시점에 배지 8 ml에 희석하여 0.1% 젤라틴 코팅된 100 mm 배양접시로 계대를 수행하였고, 이 후 2~3일에 한번씩 계대를 진행하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 5일 이상 군집의 증식을 관찰한 결과 군집이 계속적으로 증식함을 확인하였다.
실시예 4. 유도만능줄기세포의 기원 확인
NIH 3T3 세포에 레트로 바이러스 (pMSCV)를 이용해 게놈(genome) 상에 GFP 유전자를 주입하였다. 변형된 세포는 녹색 형광을 나타내는 반면 마이크로베시클을 만든 배아줄기세포는 형광을 나타내지 않는다. 6 웰 플레이트에 0.1% 젤라틴을 코팅하고, NIH 3T3 GFP세포 8×104를 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 이후, 각 웰을 PBS로 세척하여 주고 실시예 1에 의해 제조된 배아줄기세포 유래 마이크로베시클을 100 μg/ml의 농도로 2ml를 섬유아세포 배지(DMEM, 10% FBS, 100 U/ml penicillin-streptomysin)에 희석하여 NIH 3T3 GFP세포에 처리해 주었다. 48시간 이후, 각 웰당 2~3개 정도의 군집을 확인할 수 있었고, 크기는 약 10 ~ 100 μm 사이로 확인되었고 전자현미경으로 관찰한 결과는 도 7 에 나타내었다.
도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 종래의 연구들에 있어서 짧게는 7일에서 30일까지의 긴 시간의 역분화 기간을 갖는 반면, 본 발명의 배아줄기세포 유래 마이크로베시클을 사용한 경우 48시간 만에 군집을 형성하는 것을 알 수 있으며, 이는 역분화 기간을 현저히 단축시킬 수 있음을 의미한다.
실시예 5. 유도만능줄기세포의 특징 확인
실시예 3의 방법에 따라 40일 이상 증식된 군집(NIH3T3유래 역분화 세포), 배아줄기세포, 및 NIH3T3 세포의 전체 단백질(Whole cell lysate)을 DC(Detergent Compatible protein assay)로 정량하여 각각 50 μg을 준비한 후, 5 x 로딩 염색제가 최종적으로 1 x로 되도록 넣고, 100℃에서 5분간 처리하였다. 8% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)을 준비하고, 샘플을 로딩하였다. 80V에서 2시간 전기영동한 후, 400 mA에서 2시간 동안 단백질을 PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인으로 트랜스퍼(transfer)하였다. 멤브레인은 적용할 항체(antibody)마다 다른 블로킹 버퍼 (blocking buffer)를 사용하였다. Actin의 경우 탈지유(Skim milk)를 PBS에 3%가 되도록 녹이고, Oct 3/4의 경우 탈지분유(non fat dry milk)를 PBS에 5%가 되도록 녹이고, Nanog의 경우는 10% non fat dry milk 10% 가 되도록 녹인 후 멤브레인을 이 용액에서 2시간 동안 블로킹 하였다. Oct3/4과 Nanog와 베타-액틴(β-actin) 항체를 4℃에서 12시간 처리한 후, PBS로 2번 세척한 다음, 각각 페록시다아제(peroxidase)가 붙어있는 이차 항체를 실온에서 1 시간 처리하였다. PBS로 30분 세척한 후, ECL(enhanced chemiluminescence, Amersham Co. No. RPN2106) 기질(substrate)로 확인하여 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 배아줄기세포 유래 마이크로베시클에 의해 역분화된 NIH3T3 역분화 세포(유도만능줄기세포)에는 배아줄기세포 특이 단백질인 Oct3/4 및 Nanog가 발현되고 있음을 확인하였다.
실시예 6. 유도만능줄기세포의 자발적 분화 기능 확인
실시예 3의 방식으로 40일 이상 증식된 유도된 만능성 세포의 기능을 확인하기 위해 모든세포로의 자발적 분화 능력을 확인하였다. 배아줄기세포는 세포 덩어리(embryonic body)가 되었을 경우, 자발적으로 모든 세포로 분화되는 능력을 가진다. 같은 원리로 현적 방식(hanging drop method)으로 유도된 세포를 강제적으로 뭉치도록 유도하였다. 군집 세포를 trypsin을 사용하여 부유시키고 3.3 × 104 /ml의 농도로 분화 배지(IMDM, 20% FBS, 4 mM L-glutamin, Gentamysin 10 μg/ml, 100 U/ml Penicillin-streptomycin)에 희석하였다. 희석시킨 용액을 30 μl(1 ×103개)씩 박테리아 배양 접시 천장 면에 달라 붙게 하여 이틀 동안 뭉치도록 유도하였다. 천장 면에 뭉쳐진 세포를 분화배지로 씻어내어 다시 이틀 동안 박테리아 접시에서 부유시킨 채 배양하였다. 도 8은 박테리아 접시에 뭉쳐진 형태로 부유된 유도만능줄기세포의 사진이다. 같은 과정으로 NIH 3T3 세포와 배아줄기 세포를 현적방식으로 뭉치도록 유도하였다.
분화 배지에 3개/ml의 개수로 세포 덩어리(embryonic body)를 희석하고 0.1% 젤라틴 코팅된 6 웰에 2 ml을 주입하여 배양하였다. 16일 동안 8일마다 두번 배양액을 교체하여 주었다. 도 9은 분화 유도 후 세포의 모양을 나타내었다.
분화된 세포를 RNeasy®Mini kit (QIAGEN, Cat. No. 74104)를 사용해 전체 유전자(RNA)를 추출하였다. 추출된 RNA를 특정 유전자 프라이머와 PCR kit(BIOLAB, Cat. No. E5000)를 사용해 다수의 cDNA를 얻고 아가로스 겔 영동을 통해 분리하여 ETBR(Ethidium Bromide)염색으로 확인하였다. 유전자가 양성대조군(배아줄기세포)과 같은 양의 RNA가 사용되었는지 확인하기 위해 항상 발현(Housekeeping gene)하는 Actin을 같이 확인하였다. 유도 만능줄기세포의 자발적 분화 능력을 확인한 결과, NIH3T3 역분화 세포의 내배엽(endoderm, AFP), 중배엽(mesoderm, Foxf1), 및 외배엽 (ectoderm, b- III tubulin)으로 분화됨을 확인할 수 있었다. 이때, AFP는 센스 프라이머로 5’-AACTCTGGCGATGGGTGTT-3’와 안티 센스 프라이머로 5’-AAACTGGAAGGGTGGGACA-3’를 사용하였고, Foxf1는 센스 프라이머로 5’-CGTGTGTGATGTGAGGTGAG-3’와 안티센스 프라이머로 5’-CTCCGTGGCTGGTTTCA-3’를 사용하였으며, b- III tubulin는 센스 프라이머로 5’-TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG-3’와 안티센스 프라이머로 5’-GGCCCTGGGCACATACTTGTG-3’를 사용하였다. NIH3T3 역분화 세포(유도만능줄기세포)의 자발적 분화 능력을 확인하기 위한, 유전자의 발현 여부에 대한 사진은 도 10 에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, NIH3T3 역분화 세포에는 내배엽, 중배엽, 외배엽의 유전자가 발현되고 있음을 확인하였고, 이는 NIH3T3 역분화 세포가 자발적인 분화 능력이 있음을 보여주는 결과이다
실시예 7. 배아줄기세포 유래 마이크로베시클과 BFA의 동시 처리에 따른 체세포의 역분화
6 웰 플레이트에 0.1% 젤라틴을 코팅하고, NIH 3T3 세포 8×104 cell를 접종한 후, 6 웰에서 24시간 동안 배양하였다. 각 웰을PBS로 세척한 후, 실시예 1에 의해 제조된 배아줄기세포 유래 마이크로베시클 100 μg/ml의 농도 와 BFA (brefeldin A)2 μM의 농도로 각각 2ml를 섬유아세포 배지(DMEM, 10% FBS, 100 U/ml penicillin-streptomysin)에 희석하여 상기 배양된 NIH 3T3 세포에 처리해 주었다. 48시간 이후, 각 웰당 2~3개 정도의 군집을 확인할 수 있었고, 크기는 약10 ~ 100 μm 사이로 확인되었으며, 이를 전자현미경으로 관찰한 결과는 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 배아줄기세포 유래 마이크로베시클과 BFA를 동시에 처리한 경우에도 군집을 유도할 수 있음을 확인하였다.
각 웰을 PBS로 세척하고 0.1 × TE (Typsin-EDTA) 400 μl를 넣어준다. 1분 후, 피펫을 이용하여 1 x TE 10 μl를 군집 부위에 흘려주고, 피펫의 팁(tip)이 군집을 감싸도록 꽂은 뒤 흡입하여 집어낸다. 상기 집어낸 군집은 배아줄기세포 배지(knock out DMEM, 15% knock out FBS, 10 ng/ml LIF, 0.1 mM 2-Mercaptoethanol, 4 mM L-glutamin, Gentamysin 10 μg/ml, 100 U/ml Penicillin-streptomycin) 500 μl에 희석하여 0.1% 젤라틴 코팅이 된 24 웰에 접종하고 5일 이상 배양하였다.
도 11에 나타난 바와 같이, 군집이 계속적으로 증식함을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 따른 유도만능줄기세포의 제조방법은, 마이크로베시클의 융합을 이용한 세포질 전달 방식을 사용함으로써, 부작용 없이 체세포의 역분화를 효율적으로 진행할 수 있어, 각 개체 별로 면역적합성이 확보된 세포 치료제를 개발하는데 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (12)

  1. 배아줄기세포유래 마이크로베시클을 포함하는 조성물을 체세포에 처리하는 단계를 포함하는 유도만능줄기세포 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 배아줄기세포가 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것으로부터 유래된 것인, 유도만능줄기세포 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 배아줄기세포가 형질전환된 세포인, 유도만능줄기세포 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 배아줄기세포가 배아줄기세포 특이 단백질인 Oct3/4, Nanog, 또는 Sox-2 단백질을 과발현하도록 형질전환된 세포인, 유도만능줄기세포 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 배아줄기세포가 세포 접합 분자, 항체, 표적유도 단백질, 세포막융합 단백질 자체 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 세포인, 유도만능줄기세포 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로베시클의 막이 상기 배아줄기세포의 세포막 이외의 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 유도만능줄기세포 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 세포막 이외의 성분이 사이클로덱스트린 또는 폴리에틸렌글리콜인, 유도만능줄기세포 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로베시클의 막 성분이 화학적으로 변형된 것을 특징으로 하는, 유도만능줄기세포 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 조성물이 배아줄기세포유래 마이크로베시클 이외의 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 유도만능줄기세포 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 배아줄기세포유래 마이크로베시클 이외의 성분이 BFA (brefeldin A), BIX(BiP inducer X), 또는 VPA (valproic acid)인, 유도만능줄기세포 제조 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 유도만능줄기세포.
  12. 제 11항의 유도만능줄기세포를 포함하는 세포치료제.
PCT/KR2012/003019 2011-04-28 2012-04-19 배아줄기세포유래 마이크로베시클을 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법 WO2012148130A1 (ko)

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