WO2012137967A1 - リン酸カルシウム類マイクロカプセル - Google Patents

リン酸カルシウム類マイクロカプセル Download PDF

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WO2012137967A1
WO2012137967A1 PCT/JP2012/059689 JP2012059689W WO2012137967A1 WO 2012137967 A1 WO2012137967 A1 WO 2012137967A1 JP 2012059689 W JP2012059689 W JP 2012059689W WO 2012137967 A1 WO2012137967 A1 WO 2012137967A1
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WO
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calcium phosphates
microcapsules
dna
fine particles
calcium
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Application number
PCT/JP2012/059689
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English (en)
French (fr)
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八尾　健
武史 薮塚
陽平 島田
史帆里 山根
Original Assignee
国立大学法人京都大学
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Publication date
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/501—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to calcium phosphates microcapsules, and more particularly to calcium phosphates microcapsules encapsulating an oily substance inside.
  • gene transfer into cells is important because it has various uses such as gene expression analysis and gene therapy, but a safe and efficient one has not yet been established.
  • There are various methods for introducing genes into cells so far such as virus method, gene gun, electroporation, liposome method, and calcium phosphate method.
  • the highly efficient virus method is in a state in which there is an unavoidable risk of infectious diseases and canceration, and still has major problems.
  • the gene transfer method using gene gun which is considered to be the next most efficient, has a major drawback in that there are problems in terms of cost, such as poor cell survival efficiency and the need for expensive equipment.
  • the current situation is that there is not enough versatility.
  • the electroporation method applies a high-voltage electric field to the cell membrane to temporarily make the cell membrane unstable, and introduces genes from the generated holes on the cell membrane. Both floating and adherent cells can be used. However, the system is very reproducible, but the damage to the cells is large, and there is a problem of versatility because a large-scale device is used.
  • the liposome method cationic synthetic lipids such as lipofectin are mixed in the liposome, a negatively charged gene is bound to the resulting liposome surface, and then interacted with the cell to introduce the gene into the cell. is there. Although this method can perform gene transfer relatively easily, the degradation that occurs when it is incorporated by endocytosis is severe, and the gene transfer efficiency is low.
  • a gene is bound to particles formed by complex formation of phosphate and calcium, and effective delivery to cells is performed by endocytosis.
  • endocytosis the gene tends to be destroyed, but in the calcium phosphate method, the calcium phosphate carrier itself is preferentially degraded by acidification in the endosome, making it difficult for the gene to break down and from calcium phosphate.
  • a distant gene has the feature that it is likely to move into the cell, a sufficiently practical one has not been developed so far.
  • Patent Documents 1 and 2 Particles in which a polymer or the like is coated with calcium phosphates or hydroxyapatites are known (Patent Documents 1 and 2).
  • An object of the present invention is to provide a calcium phosphates microcapsule encapsulating or encapsulating a soft substance.
  • the present invention provides the following microcapsules.
  • Item 1. A microcapsule having a core-shell structure, wherein the core contains an oily substance and the shell is composed of calcium phosphates.
  • Item 2. Item 2. The microcapsule according to Item 1, further comprising a nucleic acid substance, protein or drug in the core.
  • Item 3. Item 3. The microcapsule according to Item 2, wherein the nucleic acid substance is selected from the group consisting of mRNA, DNA, antigene, antisense, aptamer, siRNA, miRNA, shRNA, lipozyme, gene, plasmid, decoy oligonucleotide, and DNAzyme.
  • Item 4. Item 3.
  • the microcapsule according to Item 2 wherein the oily substance is oil or a wax-like substance.
  • Item 5. The microcapsule according to any one of Items 1 to 4, wherein the oily substance is vegetable oil or phospholipid.
  • Item 6. Microcapsules having a core-shell structure, wherein the core contains at least one substance selected from the group consisting of nucleic acid substances, proteins and drugs, and an oily substance, and the shell is made of calcium phosphates, introduction of substances into cells Agent.
  • Item 7. Item 6. The production of microcapsules according to any one of Items 1 to 5, wherein an oily substance and seed crystals are mixed, and the mixture is dispersed in a calcium phosphates forming solution to grow a shell composed of calcium phosphates. Method.
  • Item 8. Item 8. The method for producing a microcapsule according to Item 7, wherein the seed crystal is calcium phosphates fine particles.
  • a liquid substance such as vegetable oil or phospholipid or a soft substance such as wax can be encapsulated in the calcium phosphates microcapsules. It is easy to coat solids such as metal particles or polymer particles with calcium phosphates, but coating oily substances such as phospholipids or vegetable oils such as oil (liquid) or soft properties has a fixed shape of the oily substance. It was difficult for not.
  • a minute seed crystal habit (crystal seeds) is mixed with an oily substance, and the obtained mixture is dispersed in a solution containing phosphoric acid and calcium to precipitate calcium phosphates, whereby a shell containing calcium phosphates is obtained.
  • An oily substance (core) can be coated with (shell). Calcium phosphate fine particles can be used as seed crystals.
  • the microcapsule of the present invention is suitable for introducing a core substance into cells.
  • DNA when DNA is introduced into a cell by the microcapsule of the present invention, it exhibits a very high DNA expression efficiency without expressing toxicity to the cell.
  • oligonucleotides that are easily degraded such as siRNA, shRNA, and miRNA, are encapsulated, they are not only easily introduced into cells but also can be inhibited from degradation in blood before reaching the cells.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram when producing the microcapsule (DNA containing calcium phosphate microcapsule) of this invention which enclosed the phosphatidylcholine small particle containing DNA with calcium phosphates.
  • the upper row shows a state where calcium phosphates fine particles and DNA are mixed with an oily substance (for example, phosphatidylcholine).
  • the middle row is a diagram when this mixture is treated with ultrasonic waves to form particles.
  • the lower part is a schematic view of the DNA-containing calcium phosphates microcapsule of the present invention produced by growing calcium phosphates in a simulated body fluid.
  • A The microcapsule of the present invention (DNA-containing calcium phosphate microcapsule) encapsulating DNA is shown.
  • (B) It is an enlarged view of one microcapsule of (a).
  • (C) It is a chart which shows the result of the EDX analysis of the microcapsule of (b). It is the fluorescence-microscope photograph 24 hours after introduction
  • the SEM image (15000 times) and EDX data of a calcium phosphates microcapsule encapsulating a UV absorber (ethyl hexyl methoxycinnamate) are shown.
  • the SEM image (8000 times) and the data of EDX of the calcium phosphates coat sample which enclosed soybean oil are shown.
  • the SEM image (20,000 times) and the data of EDX of the calcium phosphates coat sample which enclosed castor oil are shown.
  • the calcium phosphates fine particles which are seed crystals are also called apatite nuclei and have a function of promoting the growth of calcium phosphates.
  • the calcium phosphates fine particles can be prepared by a known method, for example, according to the method described in WO2007 / 020928, Patent No. 4506067.
  • the calcium phosphates microcapsule of the present invention has a function of introducing a substance encapsulated in a core into a cell.
  • the calcium phosphates microcapsules of the present invention have a sustained release action of the core substance and can be applied to drug DDS and the like.
  • the oily substance is an amphipathic substance such as a phospholipid, and after mixing a substance (for example, a drug) that is slowly released into the oily substance, the capsule is encapsulated. Is preferably formed.
  • the oily substance of the core is a liquid
  • the liquid is covered with a shell of calcium phosphates so that it can be handled as a solid powder.
  • the calcium phosphates microcapsules of the present invention are blended in a skin external preparation.
  • the liquid can be carried as a solid powder on the skin.
  • the liquid retained in the core include oily substances, ultraviolet absorbers, humectants, and essential oils.
  • the calcium phosphates microcapsules of the present invention are preferable not only for pharmaceutical use such as substance introduction into cells but also as cosmetics.
  • the microcapsule of the present invention has a core-shell structure, the core includes an oily substance, and the shell is composed of calcium phosphates.
  • the core portion may further contain calcium phosphates fine particles.
  • As the calcium phosphates constituting the shell hydroxyapatites are preferable.
  • calcium phosphates examples include primary calcium phosphate (Ca (H 2 PO 4 ) 2 ), dibasic calcium phosphate (CaHPO 4 ), tricalcium phosphate (Ca 3 (PO 4 ) 2 ), and tetracalcium phosphate (Ca 4 (PO 4 ) 2 O), octacalcium phosphate (Ca 8 H 2 (PO 4 ) 6 ), apatites including hydroxyapatites, amorphous calcium phosphate, etc., all of which include crystal water. Calcium phosphates include hydroxyapatites.
  • Hydroxyapatite refers to a compound represented by the chemical formula Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 .
  • Hydroxyapatites refer to hydroxyapatite or ones whose constituent elements are substituted and / or missing. Hydroxyapatites are, for example, elements of the hydroxyapatite or a part of the group consisting of elements of Group I of the periodic table such as Na and K, elements of Group II of the periodic table such as Mg and Zn, F, An element of Group VII of the periodic table, such as Cl; may be substituted with a group such as CO 3 2 ⁇ , HPO 4 2 ⁇ , SO 4 2 ⁇ . Furthermore, it may be substituted with a rare earth. Such hydroxyapatites are derived from various elements or groups contained in the solution “calcium phosphates forming solution” for forming calcium phosphates.
  • the shell structure containing calcium phosphates of the present invention is obtained by mixing an oily substance and seed crystals, dispersing the mixture as small particles (small particles) in an aqueous solution capable of growing calcium phosphates, and growing seed crystals. It can be formed. Small particles may be liquid or colloidal or wax-like substances and include micellar particles.
  • the seed crystal promotes the precipitation of calcium phosphates, and more specifically, is a fine particle that induces and accelerates the growth of calcium phosphates. Calcium phosphates fine particles can be used as seed crystals, and particularly include those manufactured according to the method described in WO2007 / 020928, which are sometimes referred to as apatite nuclei.
  • the seed crystal may be a substance other than calcium phosphates, such as wollastonite, as long as it can be a nucleus for the growth of calcium phosphates.
  • the calcium phosphates fine particles that are seed crystals may contain calcium phosphates other than hydroxyapatite, and any fine particles can be used as long as they can serve as a nucleus for the growth of calcium phosphates.
  • the size and shape of the seed crystal are not particularly limited.
  • the average particle diameter of the seed crystals is 0.5 nm to 1 mm, preferably 1 nm to 100 ⁇ m, more preferably 5 nm to 10 ⁇ m, and particularly 10 nm to 0.5 ⁇ m from the viewpoint of promoting the growth of calcium phosphates.
  • Examples of the method for measuring the average particle size of the seed crystal include laser scattering type particle size distribution measurement method, SEM, and TEM.
  • An aqueous solution capable of growing calcium phosphates can be prepared, for example, by preparing a supersaturated aqueous solution with respect to calcium phosphates and adjusting the pH thereof.
  • the same solution can be used for the growth of calcium phosphates and the formation of calcium phosphates fine particles.
  • the calcium phosphates fine particles can be obtained by preparing a supersaturated aqueous solution with respect to calcium phosphates, adjusting the pH to alkaline, and collecting the precipitated fine particles by filtration or the like. Alternatively, it can be obtained by preparing a supersaturated aqueous solution with respect to calcium phosphates, adjusting the pH to alkaline, and simultaneously increasing the temperature of the solution, and collecting the precipitated fine particles by filtration.
  • a solution capable of forming calcium phosphates fine particles and / or growing calcium phosphates may be referred to as a “calcium phosphates forming solution”.
  • the formation of calcium phosphates fine particles / growth of calcium phosphates can be achieved by the concentration of ions in the calcium phosphates formation solution, particularly calcium ions (Ca 2+ ) And hydrogen phosphate ion concentration, and further it is important that the pH is set appropriately. As the pH increases (becomes more basic), the calcium phosphates fine particles in the solution become larger, and aggregation and precipitation easily occur / calcium phosphates grow faster.
  • the calcium phosphates fine particles are small / the growth of the calcium phosphates is slow, and when the pH is further lowered, the calcium phosphates fine particles are not formed / the calcium phosphates do not grow or the formed calcium phosphates
  • the fine particles dissolve / the formed calcium phosphates dissolve.
  • the formation of calcium phosphates microparticles and the size / growth rate of calcium phosphates are controlled at pH. That is, preparation of calcium phosphates fine particles / growth of calcium phosphates microcapsule shells can be carried out by adjusting the pH of the solution.
  • the calcium phosphates forming solution preferably contains 0.02 to 25 mM calcium ions, 0.01 to 10 mM hydrogen phosphate ions, and preferably has a pH of 4 to 9. More preferably, it contains 0.2 to 20 mM calcium ions, 0.1 to 8 mM hydrogen phosphate ions, and pH is 6.2 to 8.0. More preferably, the calcium ion is 1.2 to 5 mM, the hydrogen phosphate ion is 0.5 to 2 mM, and the pH is 7.2 to 7.9. It is particularly preferred that the pH is adjusted between about 7.4 and 7.8.
  • the pH of the calcium phosphates forming solution is preferably adjusted by using an appropriate buffer, for example, NH 2 C (CH 2 OH) 3 , and further adding an acid such as hydrochloric acid.
  • a solution for the formation of calcium phosphates fine particles having excellent biocompatibility and the growth of calcium phosphates from the calcium phosphate fine particles in addition to calcium ions and hydrogen phosphate ions, for example, sodium chloride, sodium hydrogen carbonate, potassium chloride, It is preferable to use a so-called simulated body fluid (SBF), which is a solution further containing magnesium chloride hexahydrate, sodium sulfate, and the like, the composition of which is similar to the concentration of inorganic ions in human plasma.
  • SBF simulated body fluid
  • sodium ion (Na + ) is 1.4 to 1420 mM
  • potassium ion (K + ) is 0.05 to 50 mM
  • magnesium ion (Mg 2+ ) is 0.01 to 15 mM
  • chloride ion ( Cl ⁇ ) may be contained in 1.4 to 1500 mM
  • bicarbonate ion (HCO 3 ⁇ ) in 0.04 to 45 mM
  • sulfate ion (SO 4 2 ⁇ ) in 5.0 ⁇ 10 ⁇ 3 to 5 mM.
  • sodium ion is 14 to 1140 mM
  • potassium ion is 0.5 to 40 mM
  • magnesium ion is 0.1 to 12 mM
  • chloride ion is 14.5 to 1200 mM
  • bicarbonate ion is 0.4 to 36 mM
  • sulfate ion 0.05 to 4 mM More preferably, sodium ions are 70 to 290 mM, potassium ions are 2.5 to 10 mM, magnesium ions are 0.7 to 3.0 mM, chloride ions are 70 to 300 mM, and bicarbonate ions are 2.0 to 9.0 mM. Further, it may contain 0.2 to 1.0 mM sulfate ion.
  • 1.0SBF SBF having an inorganic ion concentration close to that of body fluid
  • 1.0SBF is composed of 142.0 mM sodium ion, 5.0 mM potassium ion, 1.5 mM magnesium ion, 2.5 mM calcium ion, 147.8 mM chloride ion, and bicarbonate ion.
  • 4.2 mM hydrogen phosphate ion 1.0 mM, and sulfate ion 0.5 mM.
  • An aqueous solution having an inorganic ion concentration x times the inorganic ion concentration of SBF is described as xSBF.
  • the solution for forming the calcium phosphates fine particles if the solution is supersaturated with respect to the calcium phosphates, the calcium phosphates fine particles can be formed only by preparing the solution without any other treatment.
  • the supersaturation in this invention is the state which considered the influence of pH. That is, the solubility of calcium phosphates in the solvent varies depending on the pH even at the same concentration and the same temperature.
  • the supersaturation here is not a term that merely defines the concentration of the solute, but indicates that the conditions including the pH satisfy the conditions sufficient to form the calcium phosphates fine particles.
  • the precipitation and growth of calcium phosphates fine particles can be promoted by raising the temperature of the solution.
  • the calcium phosphates fine particles can be formed / the calcium phosphates fine particles can be grown by heating the calcium phosphates forming solution having a low pH to such an extent that the calcium phosphates fine particles are not formed as they are.
  • a calcium phosphates forming solution such as the above simulated body fluid can be used.
  • Dispersion of the mixture containing the seed crystal and the oily substance is performed by, for example, evaporating the solvent from a solution in which the mixture is dissolved or dispersed in a solvent to form a film on the inner wall of the container, and adding a calcium phosphates forming solution to the container. It can be prepared according to a method such as sonication. By the ultrasonic treatment, the mixture containing the seed crystal and the oily substance formed in a film form is dispersed as small particles in the calcium phosphates growth solution.
  • Calcium phosphates forming solution is added to a container containing a mixture containing seed crystals and the oily substance, and a device used for forming an emulsion such as a homogenizer, an ultrasonic pulverizer, a homomixer, a disper colloid mill, and a micro braidizer is used.
  • a liquid in which the mixture is dispersed as small particles can be obtained.
  • the solution is stirred, or ultrasonic vibration is applied to the solution, and the mixture is dispersed as small particles in the solution. be able to.
  • the biomimetic method is particularly preferable as a method for growing calcium phosphates.
  • the biomimetic method is a method for growing calcium phosphates in a state close to the internal environment.
  • the state close to the internal environment means that the above-mentioned simulated body fluid is used and the temperature condition is about 36 to 37 ° C. which is a body temperature.
  • the present invention is not limited to this.
  • Calcium phosphates grown by the biomimetic method are called biological apatite, and have such characteristics that the phosphate group is partially replaced by carbonate ions. Therefore, the biomimetic method can form calcium phosphates having high biocompatibility and high bioactivity, and is therefore suitable for producing microcapsules for use in living bodies.
  • the calcium phosphates grow from the seed crystal to form a shell composed of the calcium phosphates, and a core containing the oily substance (core) ), And calcium phosphates microcapsules are formed.
  • the oily substance in the present invention includes fats and oils and an amphiphilic substance, and these have a boundary with the aqueous solution when added to the aqueous solution.
  • examples thereof include fat-soluble vitamins, amphiphiles such as phospholipids, ultraviolet absorbers, drugs (for example, anti-inflammatory agents and antitumor agents), vegetable oils, animal oils, fragrances, and essential oils. These oily substances can be used singly or in combination of two or more.
  • the oily substance is an amphipathic substance such as phospholipid (for example, phosphatidylcholine), a water-soluble substance (for example, a physiologically active substance such as a drug, protein) is dissolved in the oily substance to form a capsule.
  • phospholipid for example, phosphatidylcholine
  • a water-soluble substance for example, a physiologically active substance such as a drug, protein
  • the “calcium phosphates fine particles” are those that promote the growth of calcium phosphates and have a “seed crystal” function.
  • fat-soluble vitamins examples include fat-soluble vitamins such as vitamin A, vitamin D, vitamin E, and vitamin K, fat-soluble vitamin C derivatives (for example, ascorbyl tetrahexyl decanoate), coenzyme Q10 (also referred to as ubiquinone or vitamin Q), and the like.
  • examples include docosahexaenoic acid (DHA), eicosapentaenoic acid (EPA), conjugated linoleic acid (CLA) triglyceride, CLA, squalene, ceramide, ⁇ -linolenic acid, ⁇ -linolenic acid, or medium-chain fatty acid triglyceride (MCT).
  • DHA docosahexaenoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • CLA conjugated linoleic acid
  • CLA conjugated linoleic acid
  • ceramide ⁇ -linolenic acid
  • amphipathic substances such as phospholipids include lecithin (soybean, egg yolk), phosphatidic acid, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, and surfactants, which can form micelles.
  • UV absorbers include para-aminobenzoic acid derivatives, salicylic acid derivatives, cinnamic acid derivatives, ⁇ , ⁇ -diphenyl acrylate derivatives, benzophenone derivatives, benzylidene camphor derivatives, phenylbenzimidazole derivatives, triazine derivatives, phenylbenzotriazole derivatives, Examples include anthranyl derivatives, imidazoline derivatives, benzalmalonate derivatives, 4,4-diarylbutadiene derivatives, and the like, for example, phenylbenzimidazolesulfonic acid, 2-hydroxy-4-methoxybenzophenonesulfonic acid, ethylhexyl methoxycinnamate, octocrylene, etc. It is done.
  • anti-inflammatory agents examples include steroidal anti-inflammatory agents such as parameterzone fatty acid esters, and non-steroidal anti-inflammatory agents such as indomethacin or derivatives thereof.
  • Antitumor agents include alkylating agents, various antimetabolites, antitumor plant components, BRM (biological response regulator), angiogenesis inhibitors, cell adhesion inhibitors, matrix metalloprotease inhibitors or hormones
  • BRM biological response regulator
  • angiogenesis inhibitors include rapeseed oil, soybean oil, safflower oil, sunflower oil, rice bran oil, corn oil, cottonseed oil, sesame oil, wheat germ oil, evening primrose oil or shiso oil.
  • Animal oils include butter, lard, milk fat and the like.
  • fragrance for example, essential oils such as natural flowers, trees, fruits, etc. that are allowed as pharmaceutical additives or food additives are preferable.
  • Essential oils include limonene and its related substances, neem oil, peppermint oil, lemongrass oil, clove oil, oregano oil, tea tree oil, geranium oil, perilla oil, lavender oil, and oregano, garlic, fennel, cumin, allspice, Nutmeg, ginger, paprika, thyme, rosemary, marjoram, basil, rose hips, caraway, coriander, pepper, star anise, lemon peel, gum masala, sage, laurel, cinnamon, turmeric, cardamom, lemon balm, mint, bergamot Can be mentioned.
  • oily substances can be used alone or in admixture of two or more.
  • a poorly water-soluble fat-soluble drug can be dissolved in a liquid oily substance such as vegetable oil and encapsulated in microcapsules composed of calcium phosphates.
  • Oily substances can coexist by dispersing or dissolving other materials.
  • Materials that can coexist with oily substances include drugs (for example, anticancer drugs, anticancer drugs, etc.), radioactive substances, antibodies, antioxidants, magnetic substances for therapeutic purposes, osteogenesis promoters, proteins, nucleic acid substances, enzymes , Nutrients, magnetic substances, metals, semiconductors, glass, ceramics, carbon materials (for example, amorphous carbon), diamond, gypsum and other salts, organic polymers, natural products, poisonous substances, deleterious substances, cells, microorganisms, and the like. These materials can be absorbed into the living body by using calcium phosphates.
  • nucleic acid substances include nucleic acid drugs such as oligonucleotides, polynucleotides, and DNA plasmids, specifically, mRNA, DNA, antigene, antisense, aptamer, siRNA, miRNA, shRNA, lipozyme, gene, plasmid, decoy oligonucleotide, DNAzyme and the like can be mentioned.
  • nucleic acid drugs such as oligonucleotides, polynucleotides, and DNA plasmids, specifically, mRNA, DNA, antigene, antisense, aptamer, siRNA, miRNA, shRNA, lipozyme, gene, plasmid, decoy oligonucleotide, DNAzyme and the like can be mentioned.
  • These drugs are nucleic acids that encode one or more specific sequences for proteins, polypeptides, or RNA, as well as proteins that specifically control protein expression levels or interfering with splicing and artificial cleavage
  • the nucleic acid material may include nucleic acids that can be transcribed into one or more RNAs in vertebrate cells, and these RNAs can be mRNAs, shRNAs, miRNAs, or ribozymes, such as An mRNA encodes one or more proteins or polypeptides.
  • Such nucleic acid therapeutics include circular DNA plasmids, linear DNA constructs such as MIDGE vectors (MinimalisticliImmunogenously Define Gene Expression) disclosed in WO 98/21322 or DE 19753182, or mRNA ready for translation ( For example, EP 1392341) can be used.
  • oligonucleotides that can target intracellular nucleic acids or proteins may be used.
  • the nucleic acid encodes a specific gene such that the oligonucleotide is adapted to attenuate or regulate transcription, alter transcript processing, or otherwise interfere with protein expression Can do.
  • target nucleic acid includes DNA encoding a particular gene, and all RNAs derived from such DNA, which are either mRNA precursors or mRNA. Specific hybridization of the target nucleic acid with one or more oligonucleotides directed to such sequences can result in suppression or regulation of protein expression.
  • the oligonucleotide should preferably comprise a stretch of nucleotides that are substantially complementary to the sequence of the target nucleic acid.
  • Oligonucleotides that meet the above criteria may be constructed with several different chemistries and steric configurations.
  • Oligonucleotides can be DNA, RNA, locked nucleic acid (LNA), 2′O-methyl RNA (2′Ome), 2′O-methoxyethyl RNA (2′MOE) (in their phosphate or phosphothioate form), or morpholino Alternatively, it may include natural or modified nucleosides, including but not limited to peptide nucleic acids (PNA). Oligonucleotides may be single stranded or double stranded.
  • LNA locked nucleic acid
  • 2′Ome 2′O-methyl RNA
  • 2′MOE 2′O-methoxyethyl RNA
  • Oligonucleotides may be single stranded or double stranded.
  • Oligonucleotide is a polyanionic structure having 8 to 60 charges. In most cases, these structures are polymers containing nucleotides.
  • the present invention is not limited to a particular mechanism of action of the oligonucleotide and an understanding of the mechanism is not necessary to practice the present invention.
  • Oligonucleotides may have different mechanisms of action, and may include effects on splicing, transcription, nuclear-cytoplasmic transport, and translation, among others.
  • single stranded oligonucleotides can be used, including DNA-based oligonucleotides, locked nucleic acids, 2′-modified oligonucleotides, etc., commonly referred to as antisense oligonucleotides.
  • DNA-based oligonucleotides locked nucleic acids
  • 2′-modified oligonucleotides etc.
  • antisense oligonucleotides commonly referred to as antisense oligonucleotides.
  • the backbone or base or sugar modifications include phosphothioate DNA (PTO), 2′O-methyl RNA (2′Ome), 2′fluoro RNA (2′F), 2′O-methoxyethyl-RNA (2′MOE ), Peptide nucleic acid (PNA), N3′-P5 ′ phosphoramidate (NP), 2 ′ fluoroarabino nucleic acid (FANA), locked nucleic acid (LNA), morpholine phosphoramidate (morpholino), cyclohexene nucleic acid (CeNA), Examples include, but are not limited to, tricyclo-DNA (tcDNA). Furthermore, hybrid chemistries are known in the art and are constructed from two or more nucleotide species as a copolymer, block copolymer, or gapmer, or in other configurations.
  • RNA molecules containing complementary sequence motifs can be used to suppress protein expression.
  • RNA molecules are referred to in the art as siRNA molecules (eg, WO 99/32619 or WO 02/055693).
  • Other siRNAs include single stranded siRNAs or double stranded siRNAs with one non-contiguous strand. Again, various chemistries were adapted to this class of oligonucleotides. DNA / RNA hybrid systems are also known in the art.
  • decoy oligonucleotides can be used. These double-stranded DNA molecules and chemically modified versions thereof target transcription factors rather than nucleic acids. This is because decoy oligonucleotides bind to sequence-specific DNA binding proteins and interfere with transcription (eg Cho-Chung, et al. In Curr. Opin. Mol. Ther., 1999).
  • oligonucleotides that can affect transcription by hybridizing with the promoter region of a gene under physiological conditions may be used. Again, various chemistries can be adapted to this class of oligonucleotides.
  • DNAzymes are single-stranded oligonucleotides and their chemically modified forms by enzymatic activity.
  • a typical DNAzyme called the “10-23” model, can cleave single-stranded RNA at specific sites under physiological conditions.
  • the 10-23 model of DNAzyme has 15 highly conserved deoxyribonucleotide catalytic domains flanked by two substrate recognition domains that are complementary to a target sequence on RNA. Cleavage of the target mRNA can result in its destruction, and the DNAzyme recycles and cleaves multiple substrates.
  • Ribozymes are single-stranded oligoribonucleotides and their chemically modified forms by enzymatic activity. These can be divided into two components: a conserved stem-loop structure that forms the catalytic core and a flanking sequence that is reverse complementary to the sequence surrounding the target site of a given RNA transcript.
  • the flanking sequences can confer specificity and generally constitute a total of 14-16 nt extending on either side of the selected target site.
  • aptamers may be used to target proteins.
  • Aptamers are macromolecules composed of nucleic acids such as RNA or DNA and their chemical modifications that bind tightly to a specific molecular target and are typically 15-60 nt long. Nucleotide chains can form intramolecular interactions that fold the molecule into a complex three-dimensional shape. The shape of the aptamer allows intimate binding of the target molecule to the surface, including but not limited to acidic proteins, basic proteins, membrane proteins, transcription factors, and enzymes. Aptamer molecule binding can affect the function of the target molecule.
  • oligonucleotides may vary in length by only 5 nucleotides per strand, preferably between 8 and 50. More specifically, an oligonucleotide is 8-50 nucleotides long that catalyzes RNAseH-mediated degradation of its target sequence or prevents translation or redirects splicing or acts as an antogomir
  • An antisense oligonucleotide having These can be siRNAs having a base pair length of 15-30. These can further represent decoy oligonucleotides having a length of 15-30 base pairs and can be complementary oligonucleotides that affect transcription of genomic DNA having a length of 15-30 nucleotides.
  • oligonucleotides can further represent DNAzymes having a length of 25-50 nucleotides, or ribozymes having a length of 25-50 nucleotides, or aptamers having a length of 15-60 nucleotides.
  • Such subclasses of oligonucleotides are often functionally defined and may be the same or different, or their chemistry or structure without substantially affecting the teachings of the present invention. Share some but not all of the characteristics.
  • the match between the oligonucleotide and the target sequence is preferably complete at each base of the oligonucleotide that forms a base pair with its complementary base on the target nucleic acid throughout the series of several oligonucleotides described above.
  • a sequence pair may contain one or more mismatches within the stretch of base pairs.
  • the type and chemical composition of such nucleic acids has little effect on the performance of the liposomes of the invention as a vehicle, and those skilled in the art will be able to interact with the lipid aggregates of the invention.
  • Other types of oligonucleotides or nucleic acids suitable for combination can be found.
  • a protein can be used. Proteins include protease, lipase, oxygenase, catalase, ATP synthase, DNA polymerase, RNA polymerase, nuclease, restriction enzyme, kinase, phosphatase, transferase, isomerase, DNA methylase and other enzymes, IgM, IgD, IgG, IgA, IgE Antibodies or fragments thereof, pollen allergy, food allergies, pathogens, antigens such as viruses, fluorescent proteins, labeled proteins such as luciferase, growth hormone, luteinizing hormone, follicle stimulating hormone, insulin, glucagon, somatostatin, pancreatic polypeptide, Growth hormone releasing hormone, prolactin (PRL), melatonin, oxytocin, vasopressin, thyroid stimulating hormone releasing hormone, thyroid stimulating hormone and other hormones, interferon, in Roikin, chemokines
  • drugs include antihypertensives, antihypertensives, antipsychotics, analgesics, antidepressants, antidepressants, anxiolytics, sedatives, hypnotics, antidepressants, opioid agonists, asthma treatments, Anesthetic, Antiarrhythmic, Arthritis, Antispasmodic, ACE Inhibitor, Decongestant, Antibiotic, Antianginal, Diuretic, Antiparkinsonian, Bronchodilator, Delivery promoter, Antidiuretic, Anti Hyperlipidemia agent, immunosuppressant, immunomodulator, antiemetic, anti-infective agent, anti-neoplastic agent, antifungal agent, antiviral agent, antidiabetic agent, antiallergic agent, antipyretic agent, antitumor agent, anti Goutants, antihistamines, antidiarrheals, bone regulators, cardiovascular agents, cholesterol lowering agents, antimalarials, drugs for quitting smoking, antitussives, expect
  • the average particle size of the calcium phosphates microcapsules of the present invention is 0.01 to 20 ⁇ m, preferably 0.05 to 1 ⁇ m.
  • the calcium phosphates microcapsules should be small enough to be introduced into the cells.
  • hydroxyapatite microcapsules those in which the calcium phosphates are hydroxyapatites may be referred to as hydroxyapatite microcapsules.
  • Reference Example 1 Preparation of simulated body fluid (SBF) 1.0SBF was prepared by the following procedure. Ultra-pure water, NaCl (Wako special grade purity 99.5%), NaHCO 3 Hayashi Pure Chemical grade 99.5% or higher, KCl (Hayashi Pure Chemical grade purity 99.5%), K 2 HPO 4 / 3H 2 O (Nacalai Tesque special grade purity) 99.0%), MgCl 2 ⁇ 6H 2 O (Hayashi Junyaku Special Grade Purity 98.0%), 1 M-HCl (Hayashi Junyaku), CaCl 2 (Hayashi Junyaku Special Grade Purity 95.0%), Na 2 SO 4 (Hayashi Junyaku) After dissolving to the concentrations shown in Table 1 in the order of special grade purity (99.0%), trishydroxymethylaminomethane (Tris buffer) was gradually added to the solution, and the pH was adjusted to 7.40 at 36.5 ° C.
  • Tris buffer trishydroxymethylaminomethane
  • Example 1 Preparation of DNA-containing calcium phosphates microcapsules (1-1) Preparation of calcium phosphates fine particles and small phosphatidylcholine particles containing DNA Fine particles were deposited. The precipitated calcium phosphates fine particles were collected by suction filtration using a filter paper made of cellulose mixed ester having a pore size of 50 nm (MF-Millipore, Millipore, USA). After washing with ultrapure water, the filter paper was dried with a dryer for one day, and then calcium phosphates fine particles were collected.
  • a filter paper made of cellulose mixed ester having a pore size of 50 nm (MF-Millipore, Millipore, USA). After washing with ultrapure water, the filter paper was dried with a dryer for one day, and then calcium phosphates fine particles were collected.
  • the collected microcapsules were observed using a scanning electron microscope (SEM) (SU6600, Hitachi High-Technologies) and an energy dispersive X-ray analyzer (EDX) (Xflash 5010, BRUKER).
  • SEM scanning electron microscope
  • EDX energy dispersive X-ray analyzer
  • FIG. 2 shows SEM photographs and EDX of DNA-containing calcium phosphate microcapsules obtained after 1.0SBF immersion. The analysis results are shown.
  • FIG. 2 (a) is an SEM photograph.
  • FIG. 2 (c) is a high-magnification SEM photograph of the sample, and
  • FIG. 2 (b) is the EDX measurement result.
  • FIG. 2 (a) and 2 (b) show that the surfaces of calcium phosphates fine particles and phosphatidylcholine small particles containing DNA immersed in 1.0SBF for 7 days are covered with a thin film composed of needle-like crystals.
  • FIG. 2 (c) Ca and P peaks were detected in the EDX results on the surface of the DNA-containing calcium phosphate microcapsules. From these results, by immersing calcium phosphates fine particles and DNA-containing small particles in 1.0SBF, calcium phosphates grow from the calcium phosphate fine particles to the surface and inside, and cover the calcium phosphates fine particles and phosphatidylcholine small particles containing DNA It is thought that. Further, in FIG. 2 (a), all the observed calcium phosphates fine particles and small phosphatidylcholine particles containing DNA were coated with calcium phosphates, indicating high productivity. Since similar results were obtained in the reproduction experiment, this method is considered to be highly reproducible.
  • DNA-containing calcium phosphate microcapsules were separated using a centrifuge (1,000 ⁇ g, 10 min). Thereafter, the DNA-containing calcium phosphates microcapsules were washed twice with PBS. Finally, DNA-containing calcium phosphate microcapsules were suspended in 10 ml of PBS.
  • HEK293 cells were seeded in a 4-well plate. When the cells became confluent about 80%, the medium was replaced with a medium in which the DNA-containing calcium phosphate microcapsules of the present invention were suspended.
  • Fig. 3 shows an image (example after 24 hours) after the first gene transfer experiment into HEK293 cells using DNA-containing calcium phosphates microcapsules. Even after 72 hours, green fluorescence was observed with a fluorescence microscope.
  • FIG. 3 shows that in the observation 24 hours after the addition of the DNA-containing calcium phosphates microcapsules, green fluorescence was observed in the cells incorporating the DNA-containing calcium phosphates microcapsules, and EGFP was expressed.
  • FIG. 4 shows a fluorescence microscope image of HEK293 cells 72 hours after the addition of DNA-containing calcium phosphate microcapsules. As shown in FIG. 4, green fluorescence was observed in the cells incorporating the DNA-containing calcium phosphate microcapsules even after 72 hours, confirming that EGFP was expressed.
  • Example 2 Coat of calcium phosphates on ethylhexyl methoxycinnamate (UV absorber) Trishydroxymethylaminomethane was added to 1.0SBF and adjusted to pH 8.60 at 25.0 ° C. to precipitate calcium phosphates fine particles. The precipitated calcium phosphates fine particles were collected by suction filtration using a filter paper having a pore diameter of 50 nm, washed with ultrapure water, and dried. 1 ml of UV absorber (ethylhexyl methoxycinnamate) was added dropwise to 50 mg of calcium phosphates fine particles and mixed well.
  • UV absorber ethylhexyl methoxycinnamate
  • FIG. 5 shows SEM / EDX on the filter paper after collection. A large amount of calcium phosphate microcapsules was confirmed. The produced calcium phosphates microcapsules retained the ethyl hexyl methoxycinnamate while having a dry powder state.
  • Example 3 Coat of calcium phosphates to vegetable oil (soybean oil, castor oil, corn oil, olive oil)
  • Tris buffer was added to 1.0SBF, adjusted to pH 9.00 at 25.0 ° C, and then high frequency output of 500 W was subjected to microwave heating for 1 minute to precipitate calcium phosphates fine particles. It filtered with the filter paper of the hole diameter 50nm. After washing with ultrapure water, the filter paper was dried in an incubator at 36.5 ° C. a day and then collected and stored with a spoon.
  • iodine-containing oil 0.5 ml of 0.5 mol / L iodine solution was added to 10 ml each of soybean oil and castor oil and mixed to prepare 0.025 mol / L iodine-containing soybean oil and iodine-castor oil. .
  • Calcium phosphates coating on vegetable oil Samples were prepared by adding 0.25 ml and 0.05 ml iodine-containing soybean oil and iodine-containing castor oil respectively to 50 mg calcium phosphates fine particles and stirring well. This was all put into 1.0 SBF 100 ml, stirred with a dropper, then subjected to ultrasonic waves for 5 minutes, and held for 7 days on a shaker in an incubator at 36.5 ° C. Seven days later, this solution was filtered using a filter paper having a pore size of 0.1 ⁇ m, and the obtained material on the filter paper was dried overnight in an incubator and then collected and stored.
  • FIG. 6 shows an SEM image and EDX data of calcium phosphate microcapsules encapsulating soybean oil.
  • Fig. 7 shows SEM images and EDX data of calcium phosphate microcapsules encapsulating castor oil.
  • the produced calcium phosphates microcapsules retained a vegetable oil (soybean oil, castor oil, corn oil, olive oil), and the touch was in a dry powder state.
  • Example 4 Preparation of calcium phosphates coated calcium phosphate fine particles in an aqueous insulin solution: Tris buffer was added to 1.0SBF and adjusted to pH 9.00 at 25.0 ° C., followed by microwave heating at a high frequency output of 500 W for 1 minute to obtain calcium phosphate Similar fine particles were precipitated. It filtered with the filter paper of the hole diameter 50nm. After washing with ultrapure water, the filter paper was dried in an incubator at 36.5 ° C. a day and then collected and stored with a spoon. Calcium phosphate coat of aqueous insulin solution: Tris buffer was added to 100 ml of ultrapure water to prepare a solution at 36.5 ° C. and pH 10.7.
  • a phosphatidylcholine solution was prepared by dissolving 500 mg of phosphatidylcholine in 50 ml of ethanol. 1 ml of an aqueous insulin solution was dropped into 1 ml of a phosphatidylcholine solution and mixed well by applying ultrasonic waves. Thereafter, 50 mg of calcium phosphates fine particles were mixed.
  • Insulin was dissolved in 1.0SBF to a concentration of 354 mg / l to prepare insulin-containing SBF.
  • the above mixture is immersed in 100 ml of insulin-containing SBF, ultrasonically applied again, and the solution is well dispersed.
  • the solution is kept in a rotating incubator in an incubator at 36.5 ° C for 7 days to grow calcium phosphates. Capsules were made. This was filtered using a filter paper having a pore size of 100 nm, washed with ultrapure water, and dried in an incubator at 36.5 ° C. in air.
  • Fig. 8 shows the SEM photograph and EDX analysis results of the calcium phosphates microcapsules.
  • Trishydroxymethylaminomethane was dissolved in physiological saline (0.01 mol / l phosphate buffered physiological saline, pH 7.2-7.4, 36.5 ° C, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and adjusted to pH 10.7 at 36.5 ° C.
  • Capsule 500 mg was immersed in 50 ml of physiological saline adjusted to pH 10.7, and after 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 60 minutes, 90 minutes, 120 minutes, using an ICP emission spectrometer, The Zn concentration was measured. The measurement results are shown in Table 2.
  • Example 5 Preparation of hydroxyapatite-coated apatite nuclei in vegetable oil: Tris buffer was added to 1.0SBF and adjusted to pH 9.00 at 25.0 ° C, followed by microwave heating at a high frequency output of 500 W for 1 minute to apatite nuclei Precipitated. It filtered with the filter paper of the hole diameter 50nm. After washing with ultrapure water, the filter paper was dried in an incubator at 36.5 ° C. a day and then collected and stored with a spoon.
  • Aluminum stearate-containing soybean oil was prepared by adding 50 mg of aluminum stearate to 10 ml of soybean oil.
  • hydroxyapatite coating on vegetable oil 0.5 ml of the above-mentioned aluminum stearate-containing oil was added dropwise to 50 mg of apatite core and mixed well. Put all of this in 100 ml of 1.0SBF, stir with a dropper, mix well by applying ultrasonic waves for 5 minutes, hold for 7 days in a rotary incubator in an incubator at 36.5 ° C., grow hydroxyapatite, hydroxyapatite A microcapsule was prepared. Filtration was performed using a filter paper having a pore diameter of 100 nm, and the hydroxyapatite microcapsules on the filter paper were dried in an incubator at 36.5 ° C. in air.
  • Fig. 9 shows SEM photographs and EDX analysis results of hydroxyapatite microcapsules.
  • EDX analysis since the peaks of Ca and P, which are components of hydroxyapatites, are seen, it was found that microcapsules coated with soybean oil with hydroxyapatites could be produced.
  • Example 6 Calcium Phosphate Microcapsules Containing Two Types of DNA (1) Preparation of Phosphatidylcholine Small Particles Containing Calcium Phosphate Fine Particles and Two Types of DNA Add trishydroxymethylaminomethane to 1.0SBF to pH 8.60 at 25.0 ° C After adjustment, calcium phosphates fine particles were precipitated. The precipitated calcium phosphates fine particles were collected by suction filtration using a filter paper made of cellulose mixed ester having a pore size of 50 nm (MF-Millipore, Millipore, USA). After washing with ultrapure water, the filter paper was dried with a dryer for 1 day, and then calcium phosphates fine particles were collected.
  • a filter paper made of cellulose mixed ester having a pore size of 50 nm (MF-Millipore, Millipore, USA). After washing with ultrapure water, the filter paper was dried with a dryer for 1 day, and then calcium phosphates fine particles
  • the collected microcapsules were observed using a scanning electron microscope (SEM) (SU6600, Hitachi High-Technologies) and an energy dispersive X-ray analyzer (EDX) (Xflash 5010, BRUKER).
  • SEM scanning electron microscope
  • EDX energy dispersive X-ray analyzer
  • FIG. 10 SEM of calcium phosphates microcapsules containing two types of DNA obtained after 1.0SBF immersion Photo and EDX analysis result are shown.
  • FIG. 10 (a) is an SEM photograph.
  • FIG. 10 (b) and FIG. 10 (c) are high-magnification SEM photographs of the sample, and
  • FIG. 10 (d) shows the EDX measurement results.
  • HEK293 cells were seeded in a 4-well plate, and when they became about 80% confluent, they were replaced with a medium in which calcium phosphate microcapsules containing two types of DNA were suspended.
  • FIG. 11 shows an image (example after 24 hours) after a gene transfer experiment into HEK293 cells using calcium phosphates microcapsules containing two types of DNA.
  • green fluorescence of EGFP and red fluorescence of mCherry were expressed simultaneously.
  • Yellow fluorescence is where green fluorescence and red fluorescence overlap. It was found that two types of EGFP and mCherry were taken up by cells and expressed simultaneously.
  • Example 7 Insulin-containing calcium phosphate capsule (1) Preparation of insulin-containing calcium phosphate capsule Tris buffer was added to 1 L of ultrapure water to prepare a solution at 36.5 ° C and pH 10.7. 354 mg insulin (containing 0.5 wt% Zn) was dissolved in this to prepare an aqueous insulin solution.
  • a phosphatidylcholine solution was prepared by dissolving 40 mg of phosphatidylcholine in 200 ml of ethanol. In 200 ml of the phosphatidylcholine solution, 0.5 mg of calcium phosphates fine particles were mixed. This was transferred to an eggplant flask and distilled under reduced pressure using a rotary evaporator. A thin film layer was formed at the bottom of the flask.
  • This thin film layer contains calcium phosphates fine particles.
  • An aqueous solution of insulin was added thereto and dispersed by applying ultrasonic vibration to produce small phosphatidylcholine particles containing calcium phosphates fine particles and insulin. Small particles were collected by centrifugation (25000 rpm, 4 min).
  • Insulin was dissolved in 1.0 SBF to a concentration of 354 mg / l to prepare insulin-containing SBF. Immerse the above small particles in SBF ⁇ 2 L containing insulin, apply ultrasonic waves again, disperse the solution well, hold it in a rotary incubator in a 36.5 °C incubator for 7 days, grow calcium phosphates, and calcium phosphate A microcapsule was prepared. This was filtered using a filter paper having a pore size of 1.0 ⁇ m and washed with ultrapure water.
  • Fig. 12 shows SEM photographs and EDX analysis results of calcium phosphate microcapsules.
  • the ratio of insulin released was obtained by dividing the amount of Zn released from the capsule by the total Zn content contained in the capsule. It was found that the amount of insulin released gradually increased and insulin was released gradually.
  • Example 8 Formation of calcium phosphates microcapsules in a short period of time (1) Preparation of SBF with pH 7.60 1.0 SBF was prepared according to Reference Example 1. After each component was dissolved to the concentration shown in Table 1, trishydroxymethylaminomethane (Tris buffer) was gradually added to the solution, and the pH was adjusted to 7.60 at 36.5 ° C.
  • Tris buffer trishydroxymethylaminomethane
  • the collected microcapsules were observed using a scanning electron microscope (SEM) (SU6600, Hitachi High-Technologies) and an energy dispersive X-ray analyzer (EDX) (Xflash 5010, BRUKER).
  • SEM scanning electron microscope
  • EDX energy dispersive X-ray analyzer
  • FIG. 14 (i) Scanning electron microscope observation after 1.0SBF immersion at pH 7.60, and energy dispersive X-ray analysis
  • Figure 14 shows the DNA-containing calcium phosphates microcapsules obtained after 1.0SBF immersion at pH 7.60. SEM photographs and EDX analysis results are shown.
  • FIG. 14 (a) is an SEM photograph.
  • 14 (b) and 14 (c) are high-magnification SEM photographs of the sample, and
  • FIG. 14 (d) shows the EDX measurement results.
  • Example 1 Compared with Example 1, by increasing the pH of SBF, the precipitation rate of calcium phosphates was increased, and in order to form capsules, Example 1 required 7 days of immersion, whereas in Example 8, Only one day of immersion was required.
  • DNA-containing calcium phosphate microcapsules were washed twice with PBS (1,000 ⁇ g, 10 min) using a centrifuge. Finally, DNA-containing calcium phosphate microcapsules were suspended in 10 ml of PBS.
  • HEK293 cells were seeded in a 4-well plate. When the cells became confluent about 80%, the medium was replaced with a medium in which the DNA-containing calcium phosphate microcapsules of the present invention were suspended.
  • FIG. 15 shows an image (24 hours later) after a gene introduction experiment into HEK293 cells using a DNA-containing calcium phosphate microcapsule. Green fluorescence was seen in the cells that had incorporated the DNA-containing calcium phosphate microcapsules, indicating that EGFP was expressed.
  • Example 9 (1) Preparation of calcium phosphates nanoparticles 10 mg of phthalic acid particles were added to 100 ml of 1.0SBF obtained in Reference Example 1 and dispersed by applying ultrasonic vibration. Trishydroxymethylaminomethane was added to adjust the pH to 8.60 at 25.0 ° C., and calcium phosphate nanoparticles were deposited on the surface of the phthalic acid particles. The phthalic acid particles on which calcium phosphates nanoparticles were precipitated were collected by suction filtration using a filter paper made of cellulose mixed ester having a pore size of 50 nm (MF-Millipore, Millipore, USA). After washing with ultrapure water, the filter paper was dried with a dryer for 1 day, and then the calcium phosphate nanoparticles were recovered.
  • Trishydroxymethylaminomethane was added to adjust the pH to 8.60 at 25.0 ° C.
  • calcium phosphate nanoparticles were deposited on the surface of the phthalic acid particles.
  • the recovered calcium phosphate nanoparticles were observed using a scanning electron microscope (SEM) (SU6600, Hitachi High-Technologies) and an energy dispersive X-ray analyzer (EDX) (Xflash 5010, BRUKER).
  • SEM scanning electron microscope
  • EDX energy dispersive X-ray analyzer
  • FIG. 16 shows SEM photographs and EDX analysis results of the obtained calcium phosphates nanoparticles.
  • FIG. 16 (a) is an SEM photograph.
  • FIG. 16 (b) shows the EDX measurement result.
  • FIG. 16 (a) shows that calcium phosphate nanoparticles having a particle size of about 50 nm were obtained.
  • FIG. 16 (b) Ca and P peaks were detected in the EDX results of the calcium phosphate nanoparticles. Fine calcium phosphates nanoparticles were obtained by heterogeneous nucleation on the surface of phthalic acid particles. Phthalic acid was removed by sublimation. Since phthalic acid never became liquid, the calcium phosphate nanoparticles did not aggregate.
  • Example 10 (A) Preparation of calcium phosphate nanoparticles (1) Preparation method of calcium phosphate nanoparticles 100 mg of naphthalene particles were added to 1000 ml of 1.0SBF obtained in Reference Example 1, and dispersed by applying ultrasonic vibration. Trishydroxymethylaminomethane was added to adjust the pH to 8.60 at 25.0 ° C., and calcium phosphate nanoparticles were deposited on the naphthalene particles. Naphthalene particles on which calcium phosphate nanoparticles were deposited were collected by suction filtration using a filter paper made of cellulose mixed ester having a pore size of 50 nm (MF-Millipore, Millipore, USA). After washing with ultra pure water, the filter paper was dried with a dryer for 4 days, and then the calcium phosphate nanoparticles were recovered.
  • Trishydroxymethylaminomethane was added to adjust the pH to 8.60 at 25.0 ° C.
  • calcium phosphate nanoparticles were deposited on
  • the recovered calcium phosphate nanoparticles were observed using a scanning electron microscope (SEM) (SU6600, Hitachi High-Technologies) and an energy dispersive X-ray analyzer (EDX) (Xflash 5010, BRUKER).
  • SEM scanning electron microscope
  • EDX energy dispersive X-ray analyzer
  • FIG. 17 shows SEM photographs and EDX analysis results of the obtained calcium phosphates nanoparticles.
  • FIG. 17 (a) is an SEM photograph.
  • FIG. 17 (b) shows the EDX measurement result.
  • FIG. 18 is a TEM photograph.
  • 50 ml of 1.0SBF having a pH of 7.60 prepared in Example 8 (1) was added and dispersed by adding ultrasonic vibration for 30 minutes to produce small phosphatidylcholine particles containing calcium phosphates nanoparticles. Small phosphatidylcholine particles containing calcium phosphates nanoparticles form the core of a microcapsule.
  • the collected microcapsules were observed using a scanning electron microscope (SEM) (SU6600, Hitachi High-Technologies) and an energy dispersive X-ray analyzer (EDX) (Xflash 5010, BRUKER).
  • SEM scanning electron microscope
  • EDX energy dispersive X-ray analyzer
  • FIG. 19 shows SEM photographs and EDX analysis of calcium phosphates microcapsules obtained after 1.0SBF immersion at pH 7.60. Results are shown.
  • FIG. 19 (a) is an SEM photograph
  • FIG. 19 (b) is the EDX measurement result.
  • FIG. 19 (a) shows that the surface of small phosphatidylcholine particles containing calcium phosphate nanoparticles immersed in 1.0SBF at pH 7.60 for 1 day is covered with a thin film composed of needle-like crystals.
  • FIG. 19 (a) shows that calcium phosphates microcapsules having a diameter smaller than 1 ⁇ m were obtained. This is probably due to the use of calcium phosphates nanoparticles.
  • FIG. 19 (b) Ca and P peaks were detected in the EDX results on the surface of the calcium phosphates microcapsules.
  • Example 11 Calcium Phosphate Microcapsules Containing Fluorescent Protein (Ovalbumin Fluorescein Conjugate) (1) Preparation of SBF of pH7.60 1.0SBF was prepared in the same manner as in Reference Example 1. After each component was dissolved to the concentration shown in Table 1, trishydroxymethylaminomethane (Tris buffer) was gradually added to the solution, and the pH was adjusted to 7.60 at 36.5 ° C.
  • Tris buffer trishydroxymethylaminomethane
  • the collected microcapsules were observed using a scanning electron microscope (SEM) (SU6600, Hitachi High-Technologies) and an energy dispersive X-ray analyzer (EDX) (Xflash 5010, BRUKER).
  • SEM scanning electron microscope
  • EDX energy dispersive X-ray analyzer
  • FIG. 20 shows SEM photographs and EDX analysis results of fluorescent protein-containing calcium phosphate microcapsules obtained after immersion in 1.0SBF at pH 7.60.
  • FIG. 20 (a) is an SEM photograph.
  • FIG. 20 (b) is a high-magnification SEM photograph of the sample, and
  • FIG. 20 (c) is the EDX measurement result.
  • Figures 20 (a) and (b) show that the surface of small phosphatidylcholine particles containing fluorescent protein-containing calcium phosphates fine particles immersed in 1.0SBF at pH 7.60 for 1 day is covered with a thin film composed of needle-like crystals. all right. Further, in FIG. 20 (c), Ca and P peaks were detected in the EDX results on the surface of the fluorescent protein-containing calcium phosphates microcapsules.
  • HEK293 cells were seeded in a 4-well plate. When the cells became confluent about 80%, the medium was replaced with a medium in which the fluorescent protein-containing calcium phosphate microcapsules of the present invention were suspended.
  • Fluorescent protein-containing calcium phosphates microcapsules were added 24 hours and 72 hours later and observed using a fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200).
  • Example 12 Calcium phosphate microcapsules containing three types of DNA (1) Preparation of calcium phosphates microparticles and small phosphatidylcholine particles containing three types of DNA Add trishydroxymethylaminomethane to 1.0SBF, adjust to pH 8.60 at 25.0 ° C, and calcium phosphate Similar fine particles were precipitated. The precipitated calcium phosphates fine particles were collected by suction filtration using a filter paper made of cellulose mixed ester having a pore size of 50 nm (MF-Millipore, Millipore, USA). After washing with ultra pure water, the filter paper was dried with a dryer for one day, and then calcium phosphates fine particles were collected.
  • a filter paper made of cellulose mixed ester having a pore size of 50 nm (MF-Millipore, Millipore, USA). After washing with ultra pure water, the filter paper was dried with a dryer for one day, and then calcium phosphates fine particles were collected.
  • the collected microcapsules were observed using a scanning electron microscope (SEM) (SU6600, Hitachi High-Technologies) and an energy dispersive X-ray analyzer (EDX) (Xflash 5010, BRUKER).
  • SEM scanning electron microscope
  • EDX energy dispersive X-ray analyzer
  • FIG. 21 shows SEM photographs and EDX of calcium phosphates microcapsules containing three types of DNA obtained after 1.0SBF immersion at pH 7.60. The analysis results are shown.
  • FIG. 21 (a) is an SEM photograph.
  • FIG. 21 (b) and FIG. 21 (c) are high-magnification SEM photographs of the sample, and
  • FIG. 21 (d) shows the EDX measurement results.
  • Fig. 21 ⁇ (a), (b), and (c) are thin films composed of needle-like crystals on the surface of calcium phosphates fine particles immersed in 1.0SBF at pH 7.60 for 1 day and phosphatidylcholine small particles containing three types of DNA. It was found to be coated.
  • FIG. 21 (d) Ca and P peaks were detected in the EDX results of the surface of the calcium phosphates microcapsule containing three types of DNA. From these results, by immersing small particles containing calcium phosphates fine particles, p-ECFP-N1, pmCherry-Ncre and phChRWR-Ve in 1.0SBF having a pH of 7.60, the calcium phosphates are transferred from the fine particles into the surface and inside.
  • HEK293 cells were seeded in a 4-well plate, and when they became about 80% confluent, they were replaced with a medium in which calcium phosphate microcapsules containing three types of DNA were suspended.

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Abstract

コア－シェル構造を有するマイクロカプセルであって、コアが油性物質であり、シェルがリン酸カルシウム類から構成される、マイクロカプセル。

Description

リン酸カルシウム類マイクロカプセル
　本発明は、リン酸カルシウム類マイクロカプセルに関し、詳しくは内部に油性物質を封入したリン酸カルシウム類マイクロカプセルに関する。
　細胞への遺伝子導入は遺伝子発現の解析、遺伝子治療等様々な用途があり重要であることは言うまでもないが、安全で効率的なものが依然確立されていないのが現状である。これまでの細胞への遺伝子導入は、ウイルス法、ジーンガン、エレクトロポレーション、リポソーム法、リン酸カルシウム法など種々の方法がある。高効率を誇るウイルス法は、感染症や癌化の危険性が避けられず、依然大きな問題を抱えている状態である。一方、次に効率が良いとされるジーンガンによる遺伝子導入方法は、細胞生存効率が悪く、さらに高価な装置が必要であるなどコスト面において問題があることが大きな欠点であり、手軽に遺伝子導入実験を行えるほどの汎用性はないのが現状である。エレクトロポレーション法は、細胞膜に高電圧の電場をかけることにより、一時的に細胞膜を不安定な状態にし、細胞膜上の発生した穴から遺伝子を導入するものであり、浮遊、付着細胞ともに利用可能であり、再現性は非常に高いシステムであるが、細胞へのダメージが大きく、また、大がかりな装置を使用するため汎用性の問題がある。リポソーム法は、リポソームにリポフェクチンなどのカチオン性合成脂質を混合し、得られたリポソーム表面に負電荷を有する遺伝子を結合させ、その後、細胞と相互作用させることで細胞への遺伝子導入を図るものである。この方法は比較的簡便に遺伝子導入を行うことが可能であるが、エンドサイトーシスによって取り込まれる際に起こる分解が激しく、遺伝子導入効率が低くなってしまう。リン酸カルシウム法は、リン酸とカルシウムの錯形成により形成される粒子に遺伝子を結合させ、エンドサイトーシスにより細胞への効果的な送達を行うものである。通常エンドサイトーシスでは、遺伝子が破壊されがちであるが、リン酸カルシウム法では、キャリアーであるリン酸カルシウム自身がエンドソーム内での酸性化で優先的に分解されることにより、遺伝子の分解が起こりにくくなりリン酸カルシウムから離れた遺伝子が細胞内に移行しやすい特徴を有するが、これまで十分実用性のあるものが開発せされていなかった。
　リン酸カルシウム類又はヒドロキシアパタイト類でポリマー等を被覆した粒子は知られている(特許文献１，２)。
ＷＯ２００７－０２０９２８ 特許第４５０６０６７
　本発明は、やわらかい物質を封入ないし内包したリン酸カルシウム類マイクロカプセルを提供することを目的とする。
　本発明は、以下のマイクロカプセルを提供するものである。
項１．　コア－シェル構造を有するマイクロカプセルであって、コアが油性物質を含み、シェルがリン酸カルシウム類から構成される、マイクロカプセル。
項２．　コアに核酸物質、タンパク質又は薬物をさらに含む、項１に記載のマイクロカプセル。
項３．　核酸物質が、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチジーン、アンチセンス、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リポザイム、遺伝子、プラスミド、デコイオリゴヌクレオチド、DNAザイムからなる群から選ばれる、項２に記載のマイクロカプセル。
項４．　油性物質が油又はロウ様の物質である、項２に記載のマイクロカプセル。
項５．　前記油性物質が植物油もしくはリン脂質である項１～４のいずれかに記載のマイクロカプセル。
項６．　コア－シェル構造を有し、コアが核酸物質、タンパク質及び薬物からなる群から選ばれる少なくとも１種の物質並びに油性物質を含み、シェルがリン酸カルシウム類から構成されるマイクロカプセル、細胞への物質の導入剤。
項７．　油性物質と種晶を混合し、この混合物をリン酸カルシウム類形成溶液に分散してリン酸カルシウム類から構成されるシェルを成長させることを特徴とする、項１～５のいずれかに記載のマイクロカプセルの製造方法。
項８．　種晶がリン酸カルシウム類微粒子である、項７に記載のマイクロカプセルの製造方法。
　本発明によれば、植物油、リン脂質などの液状又はロウ様のようなやわらかい物質をリン酸カルシウム類マイクロカプセルに封入することができる。金属粒子或いはポリマー粒子などの固体をリン酸カルシウム類で被覆することは容易であるが、リン脂質或いは植物油などの油状(液状)もしくはやわらかい性状の油性物質を被覆することは、油性物質の形状が定まっていないために困難であった。
　本発明では、微小な種晶 (結晶の種)を油性物質と混合し、得られた混合物をリン酸とカルシウムを含む溶液中で分散させてリン酸カルシウム類を析出させることで、リン酸カルシウム類を含む殻（シェル）で油性物質(コア)を被覆することができる。リン酸カルシウム類微粒子を、種晶として用いることができる。
　本発明のマイクロカプセルは、細胞の中にコアの物質を導入するのに好適である。例えばＤＮＡは、本発明のマイクロカプセルで細胞内に導入されると、細胞への毒性を発現することなく、非常に高いＤＮＡの発現効率を示す。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの分解されやすいオリゴヌクレオチドを封入した場合には、細胞内に導入しやすいだけでなく、細胞に到達する前の血液中などでの分解を抑制することができる。
ＤＮＡを含むホスファチジルコリン小粒子をリン酸カルシウム類で封入した本発明のマイクロカプセル（DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセル）を作製するときの模式図である。上段は、リン酸カルシウム類微粒子とＤＮＡが油性物質（例えばホスファチジルコリン）と混合された状態を示す。中段は、この混合物を超音波などで処理して粒子としたときの図である。下段は、擬似体液中でリン酸カルシウム類を成長させて作製した本発明のDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルの模式図である。 （ａ）ＤＮＡを封入した本発明のマイクロカプセル（DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセル）を示す。（ｂ）(ａ)の１つのマイクロカプセルの拡大図である。（ｃ）（ｂ）のマイクロカプセルのＥＤＸ分析の結果を示すチャートである。 本発明のマイクロカプセル（DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセル）によりＥＧＦＰ遺伝子を含むプラスミドを導入したＨＥＫ２９３細胞の導入２４時間後の蛍光顕微鏡写真である。 本発明のマイクロカプセル（DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセル）によりＥＧＦＰ遺伝子を含むプラスミドを導入したＨＥＫ２９３細胞の導入７２時間後の蛍光顕微鏡写真である。 ＵＶ吸収剤（メトキシケイヒ酸エチルヘキシル）を封入したリン酸カルシウム類マイクロカプセルのＳＥＭ画像（１５０００倍）とＥＤＸのデータを示す。 大豆油を封入したリン酸カルシウム類コートサンプルのＳＥＭ画像（８０００倍）とＥＤＸのデータを示す。 ヒマシ油を封入したリン酸カルシウム類コートサンプルのＳＥＭ画像（２００００倍）とＥＤＸのデータを示す。 リン酸カルシウム類マイクロカプセルの(a)SEM写真と(b)EDX分析結果 大豆油をヒドロキシアパタイト類でコートしたヒドロキシアパタイト類マイクロカプセルの(a)SEM写真と(b)EDX分析結果 (a)2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルのSEM写真。(b)(a)のマイクロカプセルの拡大図。(c)(b)のマイクロカプセルの拡大図。(d)(c)のマイクロカプセルのEDX分析の結果を示すチャート。 2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルによりpEGFP及びpmCherryを導入したHEK293細胞の導入24時間後の(a)光学顕微鏡写真。 (b)(a)と同じ箇所の蛍光顕微鏡写真。 リン酸カルシウム類マイクロカプセルの(a)SEM写真と(b)EDX分析結果 徐放試験結果 (a)DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルのSEM写真。(b)(a)のマイクロカプセルの拡大図。(c)(b)のマイクロカプセルの拡大図。(d)(c)のマイクロカプセルのEDX分析の結果を示すチャート。 DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルによりEGFP遺伝子を含むプラスミドを導入したHEK293細胞の導入24時間後の(a)光学顕微鏡写真。 (b)(a)と同じ箇所の蛍光顕微鏡写真。 (a) リン酸カルシウム類ナノ粒子のSEM写真。(b)(a)のナノ粒子のEDX分析結果。 (a) リン酸カルシウム類ナノ粒子のSEM写真。(b)(a)のナノ粒子のEDX分析結果。 (a)、(b)リン酸カルシウム類ナノ粒子のTEM写真。 (a)リン酸カルシウム類マイクロカプセルのSEM写真。(b)(a)のマイクロカプセルのEDX分析の結果を示すチャート。 (a)蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルのSEM写真。(b)マイクロカプセルの高倍率のSEM写真。(c)(b)のマイクロカプセルのEDX分析の結果を示すチャート。 (a)3種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルのSEM写真。(b)(a)のマイクロカプセルの拡大図。(c)(b)のマイクロカプセルの拡大図。(d)(c)のマイクロカプセルのEDX分析の結果を示すチャート。
　本明細書において、種晶であるリン酸カルシウム類微粒子は、アパタイト核ということもあり、リン酸カルシウム類の成長を促進する機能を有する。
　リン酸カルシウム類微粒子は、公知の方法により調製することができ、例えばWO2007/020928、特許第4506067に記載される方法に従って製造することができる。
　１つの実施形態において、本発明のリン酸カルシウム類マイクロカプセルは、コアに封入した物質を細胞内に導入する機能を有する。
　別の実施形態において、本発明のリン酸カルシウム類マイクロカプセルは、コアの物質の徐放作用を有し、薬物のＤＤＳなどに応用可能である。徐放作用に関しては、実施例４に示されるように、油性物質がリン脂質などの両親媒性物質であり、油性物質に徐放される物質（例えば薬物）を混合した後、カプセル化してコアを形成するのが好ましい。
　コアの油性物質が液体であっても、その液体はリン酸カルシウム類のシェルに覆われるため、固体粉末として扱うことができる、具体的には、皮膚外用剤に本発明のリン酸カルシウム類マイクロカプセルを配合することで、皮膚上に液体を固体粉末として担持することができる。コアに保持される液体としては、油性物質、紫外線吸収剤、保湿剤、精油などが挙げられる。本発明のリン酸カルシウム類マイクロカプセルは、細胞への物質導入のような医薬用途だけでなく、化粧料としても好ましいものである。
　本発明のマイクロカプセルは、コア－シェル構造を有するものであり、コア(芯)は油性物質を含み、シェル(殻)はリン酸カルシウム類から構成される。コア部分にはリン酸カルシウム類微粒子をさらに含んでいてもよい。シェルを構成するリン酸カルシウム類としては、ヒドロキシアパタイト類が好ましい。
　（リン酸カルシウム類）
　リン酸カルシウム類としては、第一リン酸カルシウム（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２）、第二リン酸カルシウム（ＣａＨＰＯ４）、第三リン酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、リン酸四カルシウム（Ｃａ４（ＰＯ４）２Ｏ）、リン酸八カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６）、ヒドロキシアパタイト類を含むアパタイト類、アモルファスリン酸カルシウムなどがあり、いずれも結晶水をもつものも含む。リン酸カルシウム類は、ヒドロキシアパタイト類を包含する。
　（ヒドロキシアパタイト類）
　ヒドロキシアパタイトは、化学式Ｃａ１０(ＰＯ４)６(ＯＨ)２で表される化合物をいう。ヒドロキシアパタイト類とは、ヒドロキシアパタイト、または、その構成元素が置換および／または欠損しているものをいう。ヒドロキシアパタイト類は、例えば、ヒドロキシアパタイトを構成する元素または基の一部が、Ｎａ、Ｋなどの周期律表第Ｉ族の元素、Ｍｇ、Ｚｎなどの周期律表第II族の元素、Ｆ、Ｃｌなどの周期律表第VII族の元素；ＣＯ３ ２－、ＨＰＯ４ ２－、ＳＯ４ ２－などの基で置換されていてよい。更に、希土類により置換されていてもよい。このようなヒドロキシアパタイト類は、リン酸カルシウム類を形成するための溶液「リン酸カルシウム類形成溶液」中に含まれる種々の元素あるいは基に由来する。
　本発明のリン酸カルシウム類を含むシェル構造は、油性物質と種晶を混合し、この混合物を小さな粒子（小粒子）としてリン酸カルシウム類の成長が可能な水溶液中に分散し、種晶が成長することで形成可能である。小粒子は、液体あるいはコロイドあるいはロウ様物質であってもよく、ミセル粒子を含む。種晶は、リン酸カルシウム類の析出を促進するものであり、より具体的にはリン酸カルシウム類の成長を誘起および促進する微粒子である。種晶としてリン酸カルシウム類微粒子を用いることができ、特にＷＯ２００７／０２０９２８に記載される方法に従って製造するものを含み、これをアパタイト核と言うことがある。
　種晶は、例えばウォラストナイトのように、リン酸カルシウム類以外の物質でも、リン酸カルシウム類の成長の核となることができるものであればよい。種晶であるリン酸カルシウム類微粒子は、ヒドロキシアパタイト類以外のリン酸カルシウム類を含んでいてもよく、リン酸カルシウム類の成長の核となることができるものであればよい。種晶の大きさおよび形状等も特に限定されない。
　種晶の平均粒径は、リン酸カルシウム類の成長を促進するという観点から、０．５ｎｍ～１ｍｍ、好ましくは１ｎｍ～１００μｍ、より好ましくは５ｎｍ～１０μｍ、特に１０ｎｍ～０．５μｍである。種晶の平均粒径の測定法としては、レーザー散乱式粒度分布測定法、あるいはSEM、あるいはTEMが挙げられる。
　リン酸カルシウム類の成長が可能な水溶液は、例えば、リン酸カルシウム類に対して過飽和な水溶液を調製し、そのｐＨを調整することによって、調製することができる。
　リン酸カルシウム類の成長とリン酸カルシウム類微粒子の形成には、同じ溶液を用いることができる。
　リン酸カルシウム類微粒子は、リン酸カルシウム類に対して過飽和な水溶液を調製し、そのｐＨをアルカリ性に調整し、析出した微粒子をろ過等により収集することにより得ることができる。あるいは、リン酸カルシウム類に対して過飽和な水溶液を調製し、そのｐＨをアルカリ性に調整し、同時に溶液の温度を上昇させることにより、析出した微粒子をろ過により収集することにより得ることができる。
　本明細書において、リン酸カルシウム類微粒子の形成及び／又はリン酸カルシウム類の成長が可能な溶液を「リン酸カルシウム類形成溶液」ということがある。
　リン酸カルシウム類形成溶液におけるリン酸カルシウム類微粒子の形成／シェルにおけるリン酸カルシウム類の成長に関しては、リン酸カルシウム類微粒子を形成／リン酸カルシウム類を成長するには、リン酸カルシウム類形成溶液中のイオンの濃度、特にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）およびリン酸水素イオン濃度、さらにはｐＨが適切に設定されていることが重要である。ｐＨが高くなると（より塩基性側になると）、溶液中のリン酸カルシウム類微粒子は大きくなり、凝集沈殿が起きやすくなる／リン酸カルシウム類の成長が速くなる。一方、ｐＨが低くなると（より酸性側になると）リン酸カルシウム類微粒子が小さく／リン酸カルシウム類の成長が遅くなり、さらにｐＨが低くなるとリン酸カルシウム類微粒子は形成されない／リン酸カルシウム類が成長しないか、形成したリン酸カルシウム類微粒子は溶解する／形成したリン酸カルシウム類は溶解する。このように、ｐＨでリン酸カルシウム類微粒子の生成およびサイズ／リン酸カルシウム類の成長速度が調節される。つまり、リン酸カルシウム類微粒子の調製／リン酸カルシウム類マイクロカプセルのシェルの成長は、溶液のｐＨを調整することにより実施できる。
　リン酸カルシウム類形成溶液は、具体的には、カルシウムイオンを０．０２～２５ｍＭ、リン酸水素イオンを０．０１～１０ｍＭ含有し、ｐＨが４～９であることが好ましい。より好ましくはカルシウムイオンを０．２～２０ｍＭ、リン酸水素イオンを０．１～８ｍＭ含み、ｐＨは６．２～８．０である。さらに好ましくは、カルシウムイオンを１．２～５ｍＭ、リン酸水素イオンを０．５～２ｍＭ含み、ｐＨは７．２～７．９である。ｐＨは約７．４～７．８の間で調整されることが特に好ましい。
　リン酸カルシウム類形成溶液の調製には、リン酸水素二カリウム・三水和物及び塩化カルシウムを用いることが好ましい。リン酸カルシウム類形成溶液のｐＨは、適切な緩衝液、例えばＮＨ２Ｃ（ＣＨ２ＯＨ）３を用い、更に塩酸のような酸を加えて調整することが好ましい。
　生体適合性に優れたリン酸カルシウム類微粒子の形成及びリン酸カルシウム類微粒子からリン酸カルシウム類の成長のための溶液としては、カルシウムイオンとリン酸水素イオンに加えて、例えば、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム・六水和物、硫酸ナトリウムなどをさらに含む溶液であって、その組成が人体の血漿中の無機イオン濃度に類似する、いわゆる擬似体液（ＳＢＦ）とすることが好ましい。擬似体液を調製する場合、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）を１．４～１４２０ｍＭ、カリウムイオン（Ｋ＋）を０．０５～５０ｍＭ、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を０．０１～１５ｍＭ、塩化物イオン（Ｃｌ－）を１．４～１５００ｍＭ、炭酸水素イオン（ＨＣＯ３ －）を０．０４～４５ｍＭ、硫酸イオン（ＳＯ４ ２－）を５．０×１０－３～５ｍＭ含有していてもよい。好ましくは、ナトリウムイオンを１４～１１４０ｍＭ、カリウムイオンを０．５～４０ｍＭ、マグネシウムイオンを０．１～１２ｍＭ、塩化物イオンを１４．５～１２００ｍＭ、炭酸水素イオンを０．４～３６ｍＭ、硫酸イオンを０．０５～４ｍＭ含む。より好ましくは、ナトリウムイオンを７０～２９０ｍＭ、カリウムイオンを２．５～１０ｍＭ、マグネシウムイオンを０．７～３．０ｍＭ、塩化物イオンを７０～３００ｍＭ、炭酸水素イオンを２．０～９．０ｍＭ、硫酸イオンを０．２～１．０ｍＭ含有していてもよい。
　なお、特に無機イオン濃度が体液と近いＳＢＦを、１．０ＳＢＦと呼ぶ。１．０ＳＢＦは、無機成分の組成が、ナトリウムイオンを１４２．０ｍＭ、カリウムイオンを５．０ｍＭ、マグネシウムイオンを１．５ｍＭ、カルシウムイオンを２．５ｍＭ、塩化物イオンを１４７．８ｍＭ、炭酸水素イオンを４．２ｍＭ、リン酸水素イオンを１．０ｍＭ、硫酸イオンを０．５ｍＭ含む。SBFの無機イオン濃度のx倍の無機イオン濃度を有する水溶液を、xSBFと記述する。
　リン酸カルシウム類微粒子を形成するための溶液としては、リン酸カルシウム類に対して過飽和な溶液であれば、溶液を調製するだけで、特に他の処理を施すことなくリン酸カルシウム類微粒子を形成することができる。なお、本発明における過飽和とは、ｐＨの影響を鑑みた状態である。すなわち、同濃度、同温度でも、ｐＨによって溶媒に対するリン酸カルシウム類の溶解度は異なってくる。ここでいう過飽和とは、単に溶質の濃度のみを規定する文言ではなく、このようにｐＨを含めた条件が、リン酸カルシウム類微粒子を形成するのに十分な条件を満たしていることを示す。
　溶液の温度を上昇させることにより、リン酸カルシウム類微粒子の析出、成長を促進することもできる。例えば、そのままではリン酸カルシウム類微粒子が形成されない程度にｐＨの低いリン酸カルシウム類形成溶液を加熱することによって、リン酸カルシウム類微粒子を形成／リン酸カルシウム類微粒子を成長することもできる。
　リン酸カルシウム類微粒子と油性物質を含む混合物を分散させてリン酸カルシウム類微粒子を成長させてリン酸カルシウム類のシェル構造を得るための溶液として、上記の擬似体液などのリン酸カルシウム類形成溶液を用いることができる。
　種晶と油性物質を含む混合物の分散は、例えば該混合物を溶媒に溶解ないし分散させた溶液から溶媒を蒸発させて容器内壁にフィルム状に形成し、リン酸カルシウム類形成溶液を該容器に加えて超音波処理するなどの方法に従い、調製することができる。超音波処理により、フィルム状に形成した種晶と油性物質を含む混合物が、リン酸カルシウム類成長溶液中に小粒子となって分散する。種晶と該油状物質を含む混合物を含む容器にリン酸カルシウム類形成溶液を加え、ホモジナイザー、超音波粉砕機、ホモミキサー、ディスパーコロイドミルおよびマイクロブレイダイザーなどのエマルジョンの形成に使用される装置を用い、常法に従い、該混合物が小粒子として分散した液を得ることができる。また、種晶と油性物質を含む混合物を、リン酸カルシウム類形成溶液中に加えながら、該溶液を撹拌し、あるいは該溶液に超音波振動を与え、該混合物を小粒子として、該溶液中に分散することができる。
　リン酸カルシウム類を成長させる方法としては、特にバイオミメティック法が好ましい。バイオミメティック法は、体内の環境に近い状態でリン酸カルシウム類を成長させる方法である。体内の環境に近い状態とは、上述の擬似体液を用いると共に、温度条件を体温である３６～３７℃程度とすることを意味する。ただし、本発明ではこれに限定されるものではない。本発明のリン酸カルシウム類を成長させる方法では、擬似体液を用いることが特に好ましいが、温度は特に限定されない。
　バイオミメティック法によって成長したリン酸カルシウム類は、生体アパタイトと呼ばれ、リン酸基の部分が一部炭酸イオンに置き換わっている等の特性をもつ。そのため、バイオミメティック法は、生体親和性および生体活性の高いリン酸カルシウム類を形成することができるので、生体に用いるマイクロカプセルの製造に適している。
　種晶と油性物質を含む混合物の小粒子において、リン酸カルシウム類形成溶液中で、種晶からリン酸カルシウム類が成長し、リン酸カルシウム類から構成されるシェル(殻)を形成し、油性物質を含むコア(芯)をもつ、リン酸カルシウム類マイクロカプセルが形成される。
　本発明における油性物質は、油脂類並びに両親媒性物質を含み、これらは、水溶液に加えたときに水溶液と境界を持つ。例えば、脂溶性ビタミン類、リン脂質等の両親媒性物質、紫外線吸収剤、薬剤（例えば抗炎症剤、抗腫瘍剤）、植物油、動物油、香料、精油などが挙げられる。該油性物質は、一種類単独で、あるいは2種類以上混合して用いることができる。
　油性物質がリン脂質（例えばホスファチジルコリン）のように両親媒性の物質である場合には、油性物質に水溶性の物質（例えば薬物などの生理活性物質、タンパク質）を溶かし込んでカプセルを形成してもよく、このような実施形態も本発明に包含される。
　本明細書において使用する「リン酸カルシウム類微粒子」は、リン酸カルシウム類の成長を促進するものであり、「種晶」の機能を有するものである。
　脂溶性ビタミン類としては、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫなどの脂溶性ビタミン、脂溶性ビタミンＣ誘導体（例えば、テトラヘキシルデカン酸アスコルビル）、コエンザイムＱ１０（ユビキノン又はビタミンＱともいう。）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、共役リノール酸（ＣＬＡ）トリグリセライド、ＣＬＡ、スクワレン、セラミド、γ－リノレン酸、α－リノレン酸又は中鎖脂肪酸トリグリセライド（ＭＣＴ）などが挙げられる。
　リン脂質等の両親媒性物質としては、レシチン（大豆、卵黄）、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、界面活性剤などがあげられ、これらはミセルを形成可能である。
　紫外線吸収剤としては、パラ－アミノ安息香酸誘導体、サリチル酸誘導体、ケイ皮酸誘導体、β，β－ジフェニルアクリラート誘導体、ベンゾフェノン誘導体、ベンジリデンショウノウ誘導体、フェニルベンゾイミダゾール誘導体、トリアジン誘導体、フェニルベンゾトリアゾール誘導体、アントラニル誘導体、イミダゾリン誘導体、ベンザルマロナート誘導体、４，４－ジアリールブタジエン誘導体等が例示され、例えばフェニルベンズイミダゾールスルホン酸、２－ヒドロキシ４－メトキシベンゾフェノンスルホン酸、メトキシケイヒ酸エチルヘキシル、オクトクリレンなどが挙げられる。
　抗炎症剤としては、パラメタゾン脂肪酸エステルなどのステロイド系抗炎症剤、インドメタシン、もしくはその誘導体等の非ステロイド系抗炎症剤が挙げられる。
　抗腫瘍剤としては、アルキル化剤、各種代謝拮抗剤、抗腫瘍性植物成分、ＢＲＭ（生物学的応答性制御物質）、血管新生阻害剤、細胞接着阻害剤、マトリックス・メタロプロテアーゼ阻害剤またはホルモンなどが挙げられる
　植物油としては、例えば、なたね油、大豆油、サフラワー油、向日葵油、米糠油、コーン油、綿実油、ごま油、小麦胚芽油、月見草油又は紫蘇油等が挙げられる。
　動物油としては、例えば、バター、ラード、乳脂肪等が挙げられる。
　香料としては、例えば医薬品添加物又は食品添加物として許容されている天然の花、樹木、果実等の精油等が好ましい。
　精油としては、リモネン及びその類縁物質、ニーム油、ハッカ油、レモングラス油、クローブ油、オレガノ油、ティートリー油、ゼラニウム油、シソ油、ラベンダー油、さらにオレガノ、ガーリック、フェンネル、クミン、オールスパイス、ナツメグ、ジンジャー、パプリカ、タイム、ローズマリー、マジョラム、バジル、ローズヒップス、キャラウェイ、コリアンダー、ペッパー、スターアニス、レモンピール、ガムマサラ、セイジ、ローレル、シナモン、ターメリック、カルダモン、レモンバーム、ミント、ベルガモットなどが挙げられる。
　これらの油性物質は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。例えば水難溶性の脂溶性薬物は植物油などの液体の油性物質に溶解して、リン酸カルシウム類から構成される、マイクロカプセルに封入することができる。
　油性物質は他の材料を分散、溶解などにより共存させることができる。油性物質と共存できる材料としては、薬剤（例えば、制癌剤、抗癌剤など）、放射性物質、抗体、抗酸化剤、治療目的のための磁性体、骨形成促進剤などの他、タンパク質、核酸物質、酵素、栄養素、磁性体、金属、半導体、ガラス、セラミックス、カーボン材料（例えば、アモルファスカーボン）、ダイヤモンド、セッコウなどの塩、有機高分子、天然物、毒物、劇物、細胞、微生物などが挙げられる。これらの材料は、リン酸カルシウム類を使用することで、生体内への吸収が促進される。
　本発明の好ましい実施形態において、核酸物質は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびＤＮＡプラスミドなど核酸系薬物が挙げられ、具体的には、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチジーン、アンチセンス、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リポザイム、遺伝子、プラスミド、デコイオリゴヌクレオチド、DNAザイム、などが挙げられる。これらの薬物は、タンパク質、ポリペプチド、またはＲＮＡのための１種または複数の特定配列をコードする核酸、ならびにタンパク質発現レベルを特異的に制御し、またはとりわけスプライシングおよび人為的切断との干渉によってタンパク質構造に影響を及ぼすことができるオリゴヌクレオチドに分類される。
　核酸物質は、脊椎動物細胞において１種または複数のＲＮＡへと転写されることが可能な核酸を含んでもよく、これらのＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはリボザイムとすることができ、このようなｍＲＮＡは１種または複数のタンパク質またはポリペプチドをコードする。このような核酸治療薬は、環状ＤＮＡプラスミド、WO 98/21322もしくはDE 19753182に開示されるＭＩＤＧＥベクター（Ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）のような直鎖ＤＮＡ構築物、または翻訳の準備ができているｍＲＮＡ（例えば、EP 1392341）とすることができる。
　本発明の別の実施形態において、細胞内核酸またはタンパク質を標的にすることができるオリゴヌクレオチドを使用してもよい。前記核酸は、前記オリゴヌクレオチドが、転写を減衰もしくは調節し、転写物のプロセシングを改変し、またはその他の方法でタンパク質の発現に干渉するように適合されるように、特定の遺伝子をコードすることができる。「標的核酸」という用語は、特定の遺伝子をコードするＤＮＡ、およびこのようなＤＮＡに由来するすべてのＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡである）を包含する。標的核酸と、このような配列に向けられた１種または複数のオリゴヌクレオチドとの特定のハイブリッド形成によって、タンパク質発現の抑制または調節をもたらすことができる。このような特定の標的化を実現するために、オリゴヌクレオチドは、好適には標的核酸の配列に実質的に相補である一続きのヌクレオチドを含むべきである。
　上記の基準を満たすオリゴヌクレオチドは、いくつかの異なる化学的性質および立体的配置で構築される可能性がある。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックト核酸（ＬＮＡ）、２’Ｏ－メチルＲＮＡ（２’Ｏｍｅ）、２’Ｏ－メトキシエチルＲＮＡ（２’ＭＯＥ）（それらのホスフェートもしくはホスホチオエートの形）、またはモルホリノもしくはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む（ただし、これらに限定されるものではない）天然または修飾ヌクレオシドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、一本鎖でも、二本鎖でもよい。
　オリゴヌクレオチドは、８～６０個の電荷を有するポリアニオン性構造である。大部分の場合、これらの構造は、ヌクレオチドを含むポリマーである。本発明は、オリゴヌクレオチドの特定の作用機序に限定されず、機序の理解は本発明を実施するのに必要ではない。
　オリゴヌクレオチドの作用機序は異なってもよく、とりわけスプライシング、転写、核－細胞質輸送、および翻訳に及ぼす効果を含む可能性がある。
　本発明の好ましい実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドを使用することができ、これには、一般的にアンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ばれるＤＮＡ系オリゴヌクレオチド、ロックト核酸、２’－修飾オリゴヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。主鎖または塩基または糖修飾としては、ホスホチオエートＤＮＡ（ＰＴＯ）、２’Ｏ－メチルＲＮＡ（２’Ｏｍｅ）、２’フルオロＲＮＡ（２’Ｆ）、２’Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、Ｎ３’－Ｐ５’ホスホアミデート（ＮＰ）、２’フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、モルホリンホスホアミデート（モルホリノ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トリシクロ－ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）などを挙げることができるが、これらに限定されない。さらに、混成した化学的性質は当技術分野で知られており、コポリマー、ブロックコポリマー、もしくはギャップマーとして、または他の配置で２種以上のヌクレオチド種から構築される。
　上記のオリゴヌクレオチドに加えて、相補的配列モチーフを含む二本鎖ＲＮＡ分子を使用して、タンパク質発現を抑制することもできる。このようなＲＮＡ分子は、当技術分野でｓｉＲＮＡ分子と呼ばれる（例えば、WO 99/32619またはWO 02/055693）。他のｓｉＲＮＡは、一本鎖ｓｉＲＮＡ、または１本の非連続鎖を有する二本鎖ｓｉＲＮＡを含む。この場合も、様々な化学的性質をこのクラスのオリゴヌクレオチドに適合させた。また、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド系が当技術分野で知られている。
　本発明の別の実施形態において、デコイオリゴヌクレオチドを使用することができる。これらの二本鎖ＤＮＡ分子およびその化学修飾体は、核酸ではなく転写因子を標的にする。これは、デコイオリゴヌクレオチドが、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質と結合し、転写に干渉する（例えば、Cho-Chung, et al. in Curr. Opin. Mol. Ther., 1999）。
　本発明の別の実施形態において、遺伝子のプロモーター領域と生理的条件下でハイブリッド形成することによって転写に影響を及ぼすことができるオリゴヌクレオチドを使用してもよい。この場合も、様々な化学的性質をこのクラスのオリゴヌクレオチドに適合させることができる。
　本発明のさらに別の代替形態において、ＤＮＡザイムを使用してもよい。ＤＮＡザイムは、一本鎖オリゴヌクレオチド、および酵素活性によるその化学修飾体である。「１０－２３」モデルと呼ばれる典型的なＤＮＡザイムは、生理的条件下で一本鎖ＲＮＡを特定部位で切断することができる。ＤＮＡザイムの１０－２３モデルは、ＲＮＡ上の標的配列に相補的な２個の基質認識ドメインで両側を挟まれた、１５個の高度に保存されたデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。標的ｍＲＮＡの切断は、その破壊をもたらす可能性があり、ＤＮＡザイムは複数の基質を再生利用および切断する。
　さらに本発明の別の実施形態において、リボザイムを使用することができる。リボザイムは、一本鎖オリゴリボヌクレオチド、および酵素活性によるその化学修飾体である。これらは、触媒コアを形成する保存されたステムループ構造と、および所与のＲＮＡ転写物の標的部位を取り囲む配列に逆相補であるフランキング配列の２つの成分に分けることができる。フランキング配列は、特異性を付与することができ、一般に、選択される標的部位の両側に伸びる合計で１４～１６ｎｔを構成する。
　本発明のさらに別の実施形態において、タンパク質を標的にするために、アプタマーを使用してもよい。アプタマーは、ＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸、および特定の分子標的に密接に結合するその化学修飾体から構成された巨大分子であり、典型的には１５～６０ｎｔの長さである。ヌクレオチド鎖は、分子を複雑な三次元形状に折り畳む分子内相互作用を形成することができる。アプタマーの形状によって、酸性タンパク質、塩基性タンパク質、膜タンパク質、転写因子、および酵素が挙げられるが、これらに限定されるものではない標的分子の表面への密接な結合が可能になる。アプタマー分子の結合は、標的分子の機能に影響を及ぼすことができる。
　上記のオリゴヌクレオチドはすべて、１本の鎖当たりのヌクレオチド長がわずか５、好ましくは８～５０の間で異なってもよい。より具体的には、オリゴヌクレオチドは、その標的配列のＲＮＡｓｅＨ媒介分解を触媒し、または翻訳を阻止し、またはスプライシングを再指示し、またはアントゴｍｉｒ（ａｎｔｏｇｏｍｉｒ）として作用する、８～５０のヌクレオチド長を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドとすることができる。これらは、１５～３０の塩基対長を有するｓｉＲＮＡとすることができる。これらは、さらに１５～３０の塩基対長を有するデコイオリゴヌクレオチドを表すことができ、１５～３０のヌクレオチド長を有するゲノムＤＮＡの転写に影響を及ぼす相補的オリゴヌクレオチドとすることができる。これらは、さらに２５～５０のヌクレオチド長さを有するＤＮＡザイム、または２５～５０のヌクレオチド長を有するリボザイム、または１５～６０のヌクレオチド長を有するアプタマーを表すことができる。オリゴヌクレオチドのこのような下位クラスは、機能的に定義されることが多く、同一でも、異なってもよく、あるいは本発明の教示に実質的に影響を及ぼすことなく、それらの化学的性質または構造の一部ではあるが全部ではない特性を共有することができる。オリゴヌクレオチドと標的配列との適合は、一続きの上記のいくつかのオリゴヌクレオチド全体にわたって標的核酸上のその相補的塩基と塩基対を形成するオリゴヌクレオチドの各塩基では、完全であることが好ましい。あまり好ましくはないが、配列の対には、前記一続きの塩基対内に１個または複数のミスマッチが含まれている可能性がある。一般に、このような核酸のタイプおよび化学組成は、インビボであろうとインビトロであろうと、ビヒクルとしての本発明のリポソームの性能にほとんど影響を及ぼさず、当業者は、本発明の脂質集合体との組合せに適した他のタイプのオリゴヌクレオチドまたは核酸を見出すことができる。
　さらに本発明の別の実施形態において、タンパク質を使用することができる。タンパク質としては、プロテアーゼ、リパーゼ、オキシゲナーゼ、カタラーゼ、ATP合成酵素、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、制限酵素、キナーゼ、フォスファターゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、DNAメチラーゼなどの酵素、IgM、IgD、IgG、IgA、IgEなどの抗体又はその断片、花粉アレルギー、食物アレルギー、病原菌、ウイルスなどの抗原、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなどの標識タンパク質、成長ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、成長ホルモン放出ホルモン、プロラクチン（PRL）、メラトニン、オキシトシン、バソプレッシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモンなどのホルモン類、インターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、EGF、FGF、PDGF、HGF、TGF、TNF-α、TNF-β、アディポカイン、NGFなどのサイトカインなどが挙げられる。タンパク質にはペプチドホルモンなどの生理活性ペプチドが含まれる。
　薬物としては、例えば、抗高血圧剤、抗低血圧剤、抗精神病剤、鎮痛剤、抗鬱剤、抗躁剤、抗不安剤、鎮静剤、催眠剤、抗癲癇剤、オピオイドアゴニスト、喘息治療剤、麻酔剤、抗不整脈剤、関節炎治療剤、鎮痙剤、ＡＣＥインヒビター、鬱血除去剤、抗生物質、抗狭心症剤、利尿剤、抗パーキンソン病剤、気管支拡張剤、分娩促進剤、抗利尿剤、抗高脂血症剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、制吐剤、抗感染症剤、抗新生物剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗糖尿病剤、抗アレルギー剤、解熱剤、抗腫瘍剤、抗痛風剤、抗ヒスタミン剤、止痒剤、骨調節剤、心血管剤、コレステロール低下剤、抗マラリア剤、喫煙を中止するための薬剤、鎮咳剤、去痰剤、粘液溶解剤、鼻詰り用薬剤、ドパミン作動剤、消化管用薬剤、筋弛緩剤、神経筋遮断剤、副交感神経作動剤、プロスタグランジン、興奮薬、食欲抑制剤、甲状腺剤又は抗甲状腺剤、ホルモン、抗偏頭痛剤、抗肥満剤、抗炎症剤などが挙げられる。
　本発明のリン酸カルシウム類マイクロカプセルの平均粒子径は0.01～20μｍ、好ましくは0.05～1μｍである。リン酸カルシウム類マイクロカプセルは細胞に導入されるのに十分小さいサイズであるのがよい。
　リン酸カルシウム類マイクロカプセルのうち、リン酸カルシウム類がヒドロキシアパタイト類であるものを、ヒドロキシアパタイト類マイクロカプセルと称することがある。
　以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
　参考例1：擬似体液（ＳＢＦ）の調製
　1.0SBFを以下の手順で調製した。超純水に、NaCl（和光特級　純度99.5 %）、NaHCO3林純薬特級　純度99.5 ％～）、KCl（林純薬特級　純度99.5 %）、K2HPO4・3H2O（ナカライテスク特級　純度99.0 ％）、MgCl2・6H2O（林純薬特級　純度98.0 ％）、1 M-HCl（林純薬）、CaCl2（林純薬特級　純度95.0 %）、Na2SO4（林純薬特級　純度　99.0 ％）の順に表1に示した濃度になるように溶解した後、 トリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリスバッファー）を溶液中に徐々に加え、36.5 ℃でpHを7.40に調整した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例1
　（１）DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルの作製
　(1-1)リン酸カルシウム類微粒子及びDNAを含むホスファチジルコリン小粒子の作製
　1.0SBFにトリスヒドロキシメチルアミノメタンを加えて25.0℃でpH 8.60に調整し、リン酸カルシウム類微粒子を析出した。析出したリン酸カルシウム類微粒子を、孔径50 nmのセルロース混合エステル製の濾紙(MF-ミリポア、Millipore,USA)を用いた吸引濾過によって回収した。超純水で洗浄後、濾紙を乾燥機で１日乾燥させたのちリン酸カルシウム類微粒子を回収した。100mlのエタノールにホスファチジルコリン20mg、リン酸カルシウム類微粒子0.2mg、DNAとしてpEGFP （ＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）遺伝子のプラスミド）20μgを加え、超音波振動を加えて分散させた。これをナスフラスコに移しロータリーエバポレーターを用いて減圧蒸留した。フラスコの底に薄膜層が生成した。この薄膜層にはリン酸カルシウム類微粒子、pEGFPが含まれている。これに1.0SBFを50ml加え超音波振動を加え分散させることにより、リン酸カルシウム類微粒子及びpEGFPを含むホスファチジルコリン小粒子を生成した。リン酸カルシウム類微粒子及びpEGFPを含むホスファチジルコリン小粒子は、本発明のマイクロカプセルのコア(芯)を形成するものである。
　(1-2)  1.0SBF浸漬によるDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルの形成
　リン酸カルシウム類微粒子及びpEGFPを含むホスファチジルコリン小粒子が分散された1.0SBF溶液をポリ瓶に移し、36.5℃のインキュベータ内で7日間振盪攪拌した。リン酸カルシウム類が微粒子表面及び内部へと成長し、これにより、リン酸カルシウム類微粒子及びpEGFPを含むホスファチジルコリン小粒子の表面を被覆した。この結果、DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルが作製された。その後インキュベータ内から溶液を取り出し、超遠心分離器を用いてDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを回収し超純水を用いて洗浄を行った（5000rpm,5min）。この洗浄操作を3回繰り返し行った。
　収集したマイクロカプセルについて、走査型電子顕微鏡(SEM)（SU6600, 日立ハイテクノロジーズ）、エネルギー分散型X線分析装置 (EDX) （Xflash 5010，BRUKER）を用いて観察した。
　(1-3)　結果と考察
　(i)1.0SBF浸漬後の走査型電子顕微鏡観察、及びエネルギー分散型X線分析
　図2に1.0SBF浸漬後に得られたDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルのSEM写真とEDX分析結果を示す。図2(a)はSEM写真である。図2(c)は同試料の高倍率のSEM写真であり、図2(b)はそのEDX測定結果である。
　図2(a), (b)より1.0SBFに7日間浸漬したリン酸カルシウム類微粒子及びDNAを含むホスファチジルコリン小粒子の表面が針状結晶で構成される薄膜で被覆されていることがわかった。また、図2(c)において、DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルの表面のEDX結果においてCaとPのピークが検出された。これらの結果から、リン酸カルシウム類微粒子及びDNAを含む小粒子を1.0SBFに浸漬することにより、リン酸カルシウム類微粒子からリン酸カルシウム類が表面及び内部へと成長し、リン酸カルシウム類微粒子及びDNAを含むホスファチジルコリン小粒子を被覆したと考えられる。また、図2(a)において、観察した全てのリン酸カルシウム類微粒子及びDNAを含むホスファチジルコリン小粒子がリン酸カルシウム類で被覆されており、高い生産性が示された。再現実験においても同様の結果が得られたことから、今回の方法は再現性が高いと考えられる。
　（２）HEK293細胞を用いた遺伝子導入実験
　作製したDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを用い、HEK293細胞を用いた遺伝子導入実験を行った。以下に実験手順を記す。
　DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを約1.5ｘ10４個/mlの濃度で含む溶液 20 mlを遠心分離機を用いて遠心分離し（1,000 × g 、10 min）（gは重力加速度）、沈殿したDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを10 mlのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁し再び遠心分離を行った（1,000 × g 、10 min）。
　上清を取り除き、10mlの70%エタノール溶液を加え30分間静置し滅菌した。遠心分離機を用いてDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを分離した（1,000 × g 、10 min）。その後DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルをPBSで2回洗浄した。最終的に，10 mlのPBSにDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを懸濁した。
　続いて、この溶液200μlを遠心分離し（8,000 × g 、1 min）、500 μlの培地に再懸濁した。4穴プレートにHEK293細胞を撒き、80%程度コンフルエントになったところで、本発明のDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを懸濁した培地に交換した。
　DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセル添加24時間後、72時間後に蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 200)を用いて観察し，EGFPの発現を調べた。
　以上の実験を2回実施した。
　図3にDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを用いた、HEK293細胞への1回目の遺伝子導入実験後の画像（24時間後の例）を示す。72時間後においても蛍光顕微鏡により、緑色の蛍光が観察された。
　図3より、DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセル添加後24時間後の観察において、DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを取り込んだ細胞において緑色蛍光が見られ、EGFPが発現していることがわかった。
　図4において、DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセル添加72時間後のHEK293細胞の蛍光顕微鏡像を示す。図4より、72時間後においてもDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを取り込んだ細胞において緑色蛍光が見られ、EGFPが発現しているのが確認された。
　これらの結果より、DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを用いた遺伝子導入に成功、高い割合で遺伝子を発現させ得ることが明らかになった。
　実施例２：メトキシケイヒ酸エチルヘキシル(UV吸収剤)へのリン酸カルシウム類コート
　1.0SBFにトリスヒドロキシメチルアミノメタンを加えて25.0℃でpH 8.60に調整し、リン酸カルシウム類微粒子を析出した。析出したリン酸カルシウム類微粒子を、孔径50 nmの濾紙を用いた吸引濾過によって回収し、超純水で洗浄後、乾燥した。リン酸カルシウム類微粒子50mgにUV吸収剤（メトキシケイヒ酸エチルヘキシル）を1ml滴下しよく振り混ぜた。これを1.0SBF100mlに100μl入れ、スポイトで攪拌した後超音波分散を5分かけ、36.5℃のインキュベータ内の振蘯機で7日間保管した。7日後、この溶液を孔径0.1μmのろ紙を用いてろ過し、得られたろ紙上の物をインキュベータ内で一晩乾燥させた。また、ろ紙上のものをSEMとEDXで観察した。図５に回収した後のろ紙上のSEM/EDXを示す。大量にリン酸カルシウム類マイクロカプセルができている様子が確認できた。作製したリン酸カルシウム類マイクロカプセルは、メトキシケイヒ酸エチルヘキシルを保持しながら、触感は乾燥した粉体状態であった。
　実施例３：植物油（大豆油、ヒマシ油、コーン油、オリーブ油）へのリン酸カルシウム類コート
　リン酸カルシウム類微粒子の作製：1.0SBFにトリスバッファーを加えて25.0℃でpH 9.00に調整した後、高周波出力500 Wで1分間のマイクロ波加熱を行い、リン酸カルシウム類微粒子を析出した。孔径50 nmのろ紙でろ過した。超純水で洗浄後、このろ紙を一日36.5℃のインキュベータ内で乾燥させた後薬さじでかき集め保管した。
　ヨウ素入り油の調製：大豆油、ヒマシ油それぞれ10mlに0.5mol/Lのヨウ素液0.5mlを入れてよくまぜ、0.025mol/Lのヨウ素入り大豆油およびヨウ素入りヒマシ油を調製した。　　　　
　植物油へのリン酸カルシウム類コート：リン酸カルシウム類微粒子50mgにヨウ素入り大豆油、ヨウ素入りヒマシ油をそれぞれ0.25ml、0.05ml滴下しよくかき混ぜた試料を作製した。これを1.0SBF100mlに全て入れ、スポイトで攪拌した後超音波を5分かけ、36.5℃のインキュベータ内の振蘯機で7日間保持した。7日後、この溶液を孔径0.1μmのろ紙を用いてろ過し、得られたろ紙上の物をインキュベータ内で一晩乾燥させた後かき集め保管した。
　大豆油を封入したリン酸カルシウム類マイクロカプセルのＳＥＭ画像およびＥＤＸデータを図6に示す。
　ヒマシ油を封入したリン酸カルシウム類マイクロカプセルのＳＥＭ画像およびＥＤＸデータを図7に示す。作製したリン酸カルシウム類マイクロカプセルは、植物油（大豆油、ヒマシ油、コーン油、オリーブ油）を保持しながら、触感は乾燥した粉体状態であった。
　実施例４：インスリン水溶液へのリン酸カルシウム類コート
リン酸カルシウム類微粒子の作製：1.0SBFにトリスバッファーを加えて25.0℃でpH 9.00に調整した後、高周波出力500 Wで1分間のマイクロ波加熱を行い、リン酸カルシウム類微粒子を析出した。孔径50 nmのろ紙でろ過した。超純水で洗浄後、このろ紙を一日36.5℃のインキュベータ内で乾燥させた後薬さじでかき集め保管した。
インスリン水溶液のリン酸カルシウム類コート：超純水100mlにトリスバッファーを加えて36.5℃、pH10.7の溶液を調製した。これに35.4mgのインスリン（0.5wt%のZnを含む）を溶かし、インスリン水溶液を調製した。エタノール50mlにホスファチジルコリン500mgを溶かし、ホスファチジルコリン溶液を調製した。ホスファチジルコリン溶液1mlに、インスリン水溶液1mlを滴下し、超音波をかけてよく混合した。その後リン酸カルシウム類微粒子50mgを混合した。
　1.0SBFに、354mg/lの濃度になるようにインスリンを溶解し、インスリン含有SBFを調製した。上記の混合物をインスリン含有SBF 100ml中に浸漬し、再び超音波をかけて溶液中をよく分散し、36.5℃のインキュベータ内の回転培養器で７日間保持し、リン酸カルシウム類を成長させ、リン酸カルシウム類マイクロカプセルを作製した。これを孔径100 nmのろ紙を用いてろ過し、超純水で洗浄後、空気中、36.5℃のインキュベータ内で乾燥した。
　リン酸カルシウム類マイクロカプセルのSEM写真とEDX分析結果を図８に示す。
　徐放実験：生理食塩水（0.01 mol/l リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.2-7.4, 36.5℃、和光純薬）にトリスヒドロキシメチルアミノメタンを溶解し、36.5℃でpH 10.7に調整した。カプセル500mgをpH10.7に調整した生理食塩水50ml中に浸漬し、10分後、20分後、30分後、60分後、90分後、120分後にICP発光分光分析装置を用いて、Zn濃度を測定した。
測定結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ICPによる測定の結果、インスリンに含まれるZnの生理食塩水中での濃度が徐々に上昇し、インスリンを徐放していることが分かった。
　実施例５：植物油へのヒドロキシアパタイト類コート
アパタイト核の作製：1.0SBFにトリスバッファーを加えて25.0℃でpH 9.00に調整した後、高周波出力500 Wで1分間のマイクロ波加熱を行い、アパタイト核を析出した。孔径50 nmのろ紙でろ過した。超純水で洗浄後、このろ紙を一日36.5℃のインキュベータ内で乾燥させた後薬さじでかき集め保管した。
　ステアリン酸アルミニウム含有大豆油の調製：大豆油10mlにステアリン酸アルミニウム50mgを入れてよくまぜ、ステアリン酸アルミニウム含有大豆油を調製した。
　植物油へのヒドロキシアパタイト類コートの実施：アパタイト核50mgに上記のステアリン酸アルミニウム含有油を0.5ml滴下し、よくかき混ぜた。これを1.0SBF100mlに全て入れ、スポイトで攪拌した後、5分間超音波をかけてよく混合した後、36.5℃のインキュベータ内の回転培養機で7日間保持し、ヒドロキシアパタイト類を成長させ、ヒドロキシアパタイト類マイクロカプセルを作製した。孔径100 nmのろ紙を用いてろ過し、ろ紙上のヒドロキシアパタイト類マイクロカプセルを空気中、36.5℃のインキュベータ内で乾燥した。
　ヒドロキシアパタイト類マイクロカプセルのSEM写真およびEDX分析結果を図９に示す。EDX分析の結果、ヒドロキシアパタイト類の成分であるCa、Pのピークが見られることから、ヒドロキシアパタイト類で大豆油をコートしたマイクロカプセルを作製できたことが分かった。
　実施例６：2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセル
　(1)リン酸カルシウム類微粒子及び2種類のDNAを含むホスファチジルコリン小粒子の作製
　1.0SBFにトリスヒドロキシメチルアミノメタンを加えて25.0℃でpH 8.60に調整し、リン酸カルシウム類微粒子を析出した。析出したリン酸カルシウム類微粒子を、孔径50 nmのセルロース混合エステル製の濾紙(MF-ミリポア、Millipore, USA)を用いた吸引濾過によって回収した。超純水で洗浄後、濾紙を乾燥機で１日乾燥させたのちリン酸カルシウム類微粒子を回収した。100 mlのエタノールにホスファチジルコリン20 mg、リン酸カルシウム類微粒子0.2mg、DNAとしてpEGFP 20 μgとpmCherry 20 μgを加え、超音波振動を加えて分散させた。これをナスフラスコに移しロータリーエバポレーターを用いて減圧蒸留した。フラスコの底に薄膜層が生成した。この薄膜層にはリン酸カルシウム類微粒子、pEGFP及びpmCherryが含まれている。これに1.0SBFを50 ml加え超音波振動を加え分散させることにより、リン酸カルシウム類微粒子、pEGFP及びpmCherryを含むホスファチジルコリン小粒子を生成した。リン酸カルシウム類微粒子、pEGFP及びpmCherryを含むホスファチジルコリン小粒子は、マイクロカプセルのコア(芯)を形成するものである。
　 (2)  1.0SBF浸漬による2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルの形成
　リン酸カルシウム類微粒子、pEGFPおよびpmCherryを含むホスファチジルコリン小粒子が分散された1.0SBF溶液をポリ瓶に移し、36.5℃のインキュベータ内で7日間振盪攪拌した。リン酸カルシウム類が微粒子表面及び内部へと成長し、これにより、リン酸カルシウム類微粒子、pEGFP及びpmCherryを含むホスファチジルコリン小粒子の表面を被覆した。この結果、2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルが作製された。その後インキュベータ内から溶液を取り出し、超遠心分離器を用いて2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルを回収し超純水を用いて洗浄を行った（5000 rpm,5 min）。この洗浄操作を3回繰り返し行った。
　収集したマイクロカプセルについて、走査型電子顕微鏡(SEM)（SU6600, 日立ハイテクノロジーズ）、エネルギー分散型X線分析装置 (EDX) （Xflash 5010，BRUKER）を用いて観察した。
　 (3)　結果と考察
　(i)  1.0SBF浸漬後の走査型電子顕微鏡観察、及びエネルギー分散型X線分析
　図10に1.0SBF浸漬後に得られた2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルのSEM写真とEDX分析結果を示す。図10(a)はSEM写真である。図10(b)および図10(c)は同試料の高倍率のSEM写真であり、図10(d)はそのEDX測定結果である。
　図10(a), (b), (c)より1.0SBFに7日間浸漬したリン酸カルシウム類微粒子及び2種類のDNAを含むホスファチジルコリン小粒子の表面が針状結晶で構成される薄膜で被覆されていることがわかった。また、図10(c)において、2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルの表面のEDX結果においてCaとPのピークが検出された。これらの結果から、リン酸カルシウム類微粒子及び2種類のDNAを含む小粒子を1.0SBFに浸漬することにより、リン酸カルシウム類微粒子からリン酸カルシウム類が表面及び内部へと成長し、リン酸カルシウム類微粒子及びDNAを含むホスファチジルコリン小粒子を被覆したと考えられる。また、図10(a)および図10(b)において、観察した全てのリン酸カルシウム類微粒子及び2種類のDNAを含むホスファチジルコリン小粒子がリン酸カルシウム類で被覆されており、高い生産性が示された。再現実験においても同様の結果が得られたことから、今回の方法は再現性が高いと考えられる。
　(4)HEK293細胞を用いた遺伝子導入実験
　作製した2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルを用い、HEK293細胞を用いた遺伝子導入実験を行った。以下に実験手順を記す。
　2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルを約1.5×10４ 個/mlの濃度で含む溶液 20 mlを遠心分離機を用いて遠心分離し（1,000 × g 、10 min）（gは重力加速度）、沈殿したDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを10 mlのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁し再び遠心分離を行った（1,000 × g 、10 min）。上清を取り除き、10mlの70%エタノール溶液を加え30分間静置し滅菌した。その後遠心分離機を用いて2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルをPBSで2回洗浄した（1,000 × g 、10 min）。最終的に，10 mlのPBSに2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルを懸濁した。
　続いて、この溶液200 μlを遠心分離し（8,000 × g 、1 min）、500 μlの培地に再懸濁した。4穴プレートにHEK293細胞を撒き、80%程度コンフルエントになったところで、2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルを懸濁した培地に交換した。
　2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセル添加24時間後、72時間後に蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 200)を用いて観察し，EGFP及びmCherryの発現を調べた。
　図11に2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルを用いた、HEK293細胞へ遺伝子導入実験後の画像（24時間後の例）を示す。単一の細胞において、EGFP の緑色蛍光とmCherryの赤色蛍光が同時に発現していた。黄色蛍光は、緑色蛍光と赤色蛍光が重なったところである。EGFP及びmCherryの2種類が細胞に取り込まれ、同時に発現していることが分かった。
　この結果より、2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルを用いた2種類の遺伝子の同時導入に成功、高い割合で2種類の遺伝子を同時に発現させ得ることが明らかになった。
　実施例７：インスリン含有リン酸カルシウムカプセル
　(1)　インスリン含有リン酸カルシウムカプセルの作成
　超純水1 Lにトリスバッファーを加えて36.5℃、pH 10.7の溶液を調製した。これに354 mgのインスリン（0.5 wt%のZnを含む）を溶かし、インスリン水溶液を調製した。エタノール200 mlにホスファチジルコリン40 mgを溶かし、ホスファチジルコリン溶液を調製した。ホスファチジルコリン溶液200 mlに、リン酸カルシウム類微粒子0.5mgを混合した。これをナスフラスコに移しロータリーエバポレーターを用いて減圧蒸留した。フラスコの底に薄膜層が生成した。この薄膜層にはリン酸カルシウム類微粒子が含まれている。これにインスリン水溶液を加え超音波振動を加え分散し、リン酸カルシウム類微粒子及びインスリンを含むホスファチジルコリン小粒子を生成した。小粒子を遠心分離（25000 rpm,4 min）により回収した。
　1.0SBFに、354 mg/lの濃度になるようにインスリンを溶解し、インスリン含有SBFを調製した。上記の小粒子をインスリン含有SBF 2 L中に浸漬し、再び超音波をかけて溶液中をよく分散し、36.5℃のインキュベータ内の回転培養器で７日間保持し、リン酸カルシウム類を成長させ、リン酸カルシウム類マイクロカプセルを作製した。これを孔径1.0 μmのろ紙を用いてろ過し、超純水で洗浄した。
　リン酸カルシウム類マイクロカプセルのSEM写真とEDX分析結果を図12に示す。
　(2)　徐放実験
　カプセルを生理食塩水50ml中に浸漬し、6時間後、12時間後、24時間後、48時間後にICP発光分光分析装置を用いて、Zn濃度を測定した。また、カプセルを1N塩酸に2日間浸漬してZnの全含有量を測定した。徐放試験結果を表３及び図13に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　放出したインスリンの割合は、カプセルから放出したZnの量を、カプセルに入っている全Zn含有量で割って求めた。インスリン放出量が徐々に上昇し、インスリンを徐放していることが分かった。
　実施例８：短期間でのリン酸カルシウム類マイクロカプセルの形成
　(1)pH7.60のSBFの調製
　1.0SBFを参考例１に従い調製した。各成分を表1に示した濃度になるように溶解した後、 トリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリスバッファー）を溶液中に徐々に加え、36.5 ℃でpHを7.60に調整した。
　(2)リン酸カルシウム類微粒子及びpEGFPを含むホスファチジルコリン小粒子の作製
　1.0SBFにトリスヒドロキシメチルアミノメタンを加えて25.0℃でpH 8.60に調整し、リン酸カルシウム類微粒子を析出した。析出したリン酸カルシウム類微粒子を、孔径50 nmのセルロース混合エステル製の濾紙(MF-ミリポア、Millipore, USA)を用いた吸引濾過によって回収した。超純水で洗浄後、濾紙を乾燥機で1日乾燥させたのちリン酸カルシウム類微粒子を回収した。100 mlのエタノールにホスファチジルコリン20 mg、リン酸カルシウム類微粒子0.2mg、DNAとしてpEGFP 20 μgを加え、超音波振動を加えて分散させた。これをナスフラスコに移しロータリーエバポレーターを用いて減圧蒸留した。フラスコの底に薄膜層が生成した。この薄膜層にはリン酸カルシウム類微粒子およびpEGFPが含まれている。これに(1)で調製したpH 7.60の1.0SBFを50 ml加え超音波振動を加え分散させることにより、リン酸カルシウム類微粒子及びpEGFPを含むホスファチジルコリン小粒子を生成した。リン酸カルシウム類微粒子およびpEGFPを含むホスファチジルコリン小粒子は、マイクロカプセルのコア(芯)を形成するものである。
　 (3)pH 7.60の1.0SBF浸漬によるDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルの形成
　リン酸カルシウム類微粒子及びpEGFPを含むホスファチジルコリン小粒子が分散された1.0SBF溶液をポリ瓶に移し、36.5 ℃のインキュベータ内で1日間振盪攪拌した。リン酸カルシウム類が微粒子表面及び内部へと成長し、これにより、リン酸カルシウム類微粒子及びpEGFPを含むホスファチジルコリン小粒子の表面を被覆した。この結果、DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルが作製された。その後インキュベータ内から溶液を取り出し、超遠心分離器を用いてDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを回収し超純水を用いて洗浄を行った（5000 rpm,5 min）。この洗浄操作を3回繰り返し行った。
　収集したマイクロカプセルについて、走査型電子顕微鏡(SEM)（SU6600, 日立ハイテクノロジーズ）、エネルギー分散型X線分析装置 (EDX) （Xflash 5010，BRUKER）を用いて観察した。
　 (4)　結果と考察
　(i)pH 7.60の1.0SBF浸漬後の走査型電子顕微鏡観察、及びエネルギー分散型X線分析
　図14にpH 7.60の1.0SBF浸漬後に得られたDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルのSEM写真とEDX分析結果を示す。図14(a)はSEM写真である。図14(b)及び図14(c)は同試料の高倍率のSEM写真であり、図14(d)はそのEDX測定結果である。
　図14(a), (b), (c)よりpH7.60の1.0SBFに1日間浸漬したDNA含有リン酸カルシウム類微粒子を含むホスファチジルコリン小粒子の表面が針状結晶で構成される薄膜で被覆されていることがわかった。また、図14(d)において、DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルの表面のEDX結果においてCaとPのピークが検出された。これらの結果から、リン酸カルシウム類微粒子及びpEGFPを含む小粒子をpH 7.60の1.0SBFに浸漬することにより、リン酸カルシウム類微粒子からリン酸カルシウム類が表面及び内部へと成長し、リン酸カルシウム類微粒子及びpEGFPを含むホスファチジルコリン小粒子を被覆したと考えられる。また、図14(a)および図14(b)において、観察した全てのリン酸カルシウム類微粒子及びpEGFPを含むホスファチジルコリン小粒子がリン酸カルシウム類で被覆されており、高い生産性が示された。再現実験においても同様の結果が得られたことから、今回の方法は再現性が高いと考えられる。
　実施例1と比べ、SBFのpHを高くすることにより、リン酸カルシウム類の析出速度が速まり、カプセルを形成するのに、実施例1では7日の浸漬を要したのに対し、実施例8では1日の浸漬を要するのみであった。
　(5) HEK293細胞を用いた遺伝子導入実験
　作製したDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを用い、HEK293細胞を用いた遺伝子導入実験を行った。以下に実験手順を記す。
　DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを約1.5 ｘ 10４ 個/mlの濃度で含む溶液 20 mlを遠心分離機を用いて遠心分離し（1,000 × g 、10 min）（gは重力加速度）、沈殿したDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを10 mlのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁し再び遠心分離を行った（1,000 × g 、10 min）。上清を取り除き、10mlの70%エタノール溶液を加え30分間静置し滅菌した。その後遠心分離機を用いてDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルをPBSで2回洗浄した（1,000 × g 、10 min）。最終的に，10 mlのPBSにDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを懸濁した。
　続いて、この溶液200 μlを遠心分離し（8,000 × g 、1 min）、500 μlの培地に再懸濁した。4穴プレートにHEK293細胞を撒き、80%程度コンフルエントになったところで、本発明のDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを懸濁した培地に交換した。
　DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセル添加24時間後に蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 200)を用いて観察し，EGFPの発現を調べた。
　以上の実験を2回実施した。
　図15にDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを用いた、HEK293細胞への遺伝子導入実験後の画像（24時間後）を示す。DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを取り込んだ細胞において緑色蛍光が見られ、EGFPが発現していることがわかった。
　これらの結果より、DNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを用いた遺伝子導入に成功、高い割合で遺伝子を発現させ得ることが明らかになった。
　実施例９
　 (１) リン酸カルシウム類ナノ粒子の作製
　参考例１で得られた1.0SBF 100 mlにフタル酸粒子10 mgを加え、超音波振動を加えて分散した。トリスヒドロキシメチルアミノメタンを加えて25.0℃でpH 8.60に調整し、リン酸カルシウム類ナノ粒子をフタル酸粒子表面に析出した。リン酸カルシウム類ナノ粒子が析出したフタル酸粒子を、孔径50 nmのセルロース混合エステル製の濾紙(MF-ミリポア、Millipore, USA)を用いた吸引濾過によって回収した。超純水で洗浄後、濾紙を乾燥機で1日間乾燥させたのちリン酸カルシウム類ナノ粒子を回収した。
　回収したリン酸カルシウム類ナノ粒子について、走査型電子顕微鏡(SEM)（SU6600, 日立ハイテクノロジーズ）、エネルギー分散型X線分析装置 (EDX) （Xflash 5010，BRUKER）を用いて観察した。
　 (2)　結果
　リン酸カルシウム類ナノ粒子の走査型電子顕微鏡観察、及びエネルギー分散型X線分析
　図16に得られたリン酸カルシウム類ナノ粒子のSEM写真とEDX分析結果を示す。図16(a)はSEM写真である。図16(b)はそのEDX測定結果である。
　図16(a)より粒径約50 nmのリン酸カルシウム類ナノ粒子が得られたことがわかった。また、図16(b)において、リン酸カルシウム類ナノ粒子のEDX結果においてCaとPのピークが検出された。フタル酸粒子表面での不均一核形成により、微細なリン酸カルシウム類ナノ粒子を得ることができた。フタル酸は昇華により、取り除かれた。フタル酸が液体になることがなかったため、リン酸カルシウム類ナノ粒子は凝集することがなかった。
　実施例１０
　（Ａ）リン酸カルシウム類ナノ粒子の作製
　 (1)　リン酸カルシウム類ナノ粒子の作製方法
　参考例1で得られた1.0SBF 1000 mlにナフタレン粒子100 mgを加え、超音波振動を加えて分散した。トリスヒドロキシメチルアミノメタンを加えて25.0℃でpH 8.60に調整し、リン酸カルシウム類ナノ粒子をナフタレン粒子上に析出した。リン酸カルシウム類ナノ粒子が析出したナフタレン粒子を、孔径50 nmのセルロース混合エステル製の濾紙(MF-ミリポア、Millipore, USA)を用いた吸引濾過によって回収した。超純水で洗浄後、濾紙を乾燥機で4日間乾燥させたのちリン酸カルシウム類ナノ粒子を回収した。
　回収したリン酸カルシウム類ナノ粒子について、走査型電子顕微鏡(SEM)（SU6600, 日立ハイテクノロジーズ）、エネルギー分散型X線分析装置 (EDX) （Xflash 5010，BRUKER）を用いて観察した。
　 (2)　結果
　リン酸カルシウム類ナノ粒子の走査型電子顕微鏡観察、及びエネルギー分散型X線分析
　図17に得られたリン酸カルシウム類ナノ粒子のSEM写真とEDX分析結果を示す。図17 (a)はSEM写真である。図17 (b)はそのEDX測定結果である。図18はTEM写真である。
　図17 (a)および図18より粒径約50 nm以下のリン酸カルシウム類ナノ粒子が得られたことがわかった。また、図17 (b)において、リン酸カルシウム類ナノ粒子のEDX結果においてCaとPのピークが検出された。ナフタレン粒子表面での不均一核形成により、微細なリン酸カルシウム類ナノ粒子を得ることができた。
ナフタレンは昇華により、取り除かれた。ナフタレンが液体になることがなかったため、リン酸カルシウム類ナノ粒子は凝集することがなかった。
　（B）リン酸カルシウム類マイクロカプセルの作製
　 (1) リン酸カルシウム類ナノ粒子含むホスファチジルコリン小粒子の作製
　リン酸カルシウム類ナノ粒子の作成 (1)で析出したリン酸カルシウム類ナノ粒子を、孔径50 nmのセルロース混合エステル製の濾紙(MF-ミリポア、Millipore, USA)を用いた吸引濾過によって回収した。超純水で洗浄後、濾紙を乾燥機で1日乾燥させたのちリン酸カルシウム類ナノ粒子を回収した。100 mlのエタノールにホスファチジルコリン20 mg、リン酸カルシウム類ナノ粒子0.2mgを加え、超音波振動を加えて分散させた。これをナスフラスコに移しロータリーエバポレーターを用いて減圧蒸留した。フラスコの底に薄膜層が生成した。この薄膜層にはリン酸カルシウム類ナノ粒子が含まれている。これに実施例8(1)で調製したpH 7.60の1.0SBFを50 ml加え超音波振動を30分間加え分散させることにより、リン酸カルシウム類ナノ粒子を含むホスファチジルコリン小粒子を生成した。リン酸カルシウム類ナノ粒子を含むホスファチジルコリン小粒子は、マイクロカプセルのコア(芯)を形成するものである。
　(2)  pH 7.60の1.0SBF浸漬によるリン酸カルシウム類マイクロカプセルの形成
　リン酸カルシウム類ナノ粒子を含むホスファチジルコリン小粒子が分散された1.0SBF溶液をポリ瓶に移し、36.5 ℃のインキュベータ内で1日間振盪攪拌した。リン酸カルシウム類が微粒子表面及び内部へと成長し、これにより、リン酸カルシウム類ナノ粒子を含むホスファチジルコリン小粒子の表面を被覆した。この結果、リン酸カルシウム類マイクロカプセルが作製された。その後インキュベータ内から溶液を取り出し、超遠心分離器を用いてリン酸カルシウム類マイクロカプセルを回収し超純水を用いて洗浄を行った（5000 rpm,5 min）。この洗浄操作を3回繰り返し行った。
　収集したマイクロカプセルについて、走査型電子顕微鏡(SEM)（SU6600, 日立ハイテクノロジーズ）、エネルギー分散型X線分析装置 (EDX) （Xflash 5010，BRUKER）を用いて観察した。
　 (3)　結果と考察
　pH 7.60の1.0SBF浸漬後の走査型電子顕微鏡観察、及びエネルギー分散型X線分析
　図19にpH 7.60の1.0SBF浸漬後に得られたリン酸カルシウム類マイクロカプセルのSEM写真とEDX分析結果を示す。図19 (a)はSEM写真であり、図19 (b)はそのEDX測定結果である。
　図19 (a)よりpH7.60の1.0SBFに1日間浸漬したリン酸カルシウム類ナノ粒子を含むホスファチジルコリン小粒子の表面が針状結晶で構成される薄膜で被覆されていることがわかった。図19 (a)より、直径が1μmよりも小さいリン酸カルシウム類マイクロカプセルが得られたことが分かる。リン酸カルシウム類ナノ粒子を使用したことによる効果と考えられる。また、図19 (b)において、リン酸カルシウム類マイクロカプセルの表面のEDX結果においてCaとPのピークが検出された。これらの結果から、リン酸カルシウム類ナノ粒子を含む小粒子をpH 7.60の1.0SBFに浸漬することにより、リン酸カルシウム類ナノ粒子からリン酸カルシウム類が表面及び内部へと成長し、リン酸カルシウム類ナノ粒子を含むホスファチジルコリン小粒子を被覆したと考えられる。また、観察した全てのリン酸カルシウム類ナノ粒子を含むホスファチジルコリン小粒子がリン酸カルシウム類で被覆されており、高い生産性が示された。再現実験においても同様の結果が得られたことから、今回の方法は再現性が高いと考えられる。
　実施例１１：蛍光タンパク(オボアルブミンのフルオレセイン結合体)含有リン酸カルシウム類マイクロカプセル
　(1)pH7.60のSBFの調製
　参考例1と同様にして1.0SBFを調製した。表1に示した濃度になるように各成分を溶解した後、 トリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリスバッファー）を溶液中に徐々に加え、36.5 ℃でpHを7.60に調整した。
　(2) リン酸カルシウム類微粒子及びオボアルブミンのフルオレセイン結合体を含むホスファチジルコリン小粒子の作製
　1.0SBFにトリスヒドロキシメチルアミノメタンを加えて25.0℃でpH 8.60に調整し、リン酸カルシウム類微粒子を析出した。析出したリン酸カルシウム類微粒子を、孔径50 nmのセルロース混合エステル製の濾紙(MF-ミリポア、Millipore, USA)を用いた吸引濾過によって回収した。超純水で洗浄後、濾紙を乾燥機で1日乾燥させたのちリン酸カルシウム類微粒子を回収した。500 mlビーカーに20 mlの超純水を入れ、これに蛍光タンパクとしてオボアルブミンのフルオレセイン結合体を2 mg溶解した。この溶液にホスファチジルコリン20 mg、リン酸カルシウム類微粒子1 mgを加え、超音波振動を10分間加えて分散させた。36.5℃のインキュベータ内で超純水を蒸発させた。ビーカーの底に薄膜層が生成した。この薄膜層にはリン酸カルシウム類微粒子およびオボアルブミンのフルオレセイン結合体が含まれている。これに(1-1)で調製したpH 7.60の1.0SBFを50 ml加え超音波振動を10分間加え分散させることにより、リン酸カルシウム類微粒子及びオボアルブミンのフルオレセイン結合体を含むホスファチジルコリン小粒子を生成した。リン酸カルシウム類微粒子およびオボアルブミンのフルオレセイン結合体を含むホスファチジルコリン小粒子は、マイクロカプセルのコア(芯)を形成するものである。
　(3)  蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルの形成
　リン酸カルシウム類微粒子及びオボアルブミンのフルオレセイン結合体を含むホスファチジルコリン小粒子が分散されたpH7.60の1.0SBF溶液をポリ瓶に移し、36.5 ℃のインキュベータ内で1日間振盪攪拌した。リン酸カルシウム類が微粒子表面及び内部へと成長し、これにより、リン酸カルシウム類微粒子及びオボアルブミンのフルオレセイン結合体を含むホスファチジルコリン小粒子の表面を被覆した。この結果、蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルが作製された。その後インキュベータ内から溶液を取り出し、超遠心分離器を用いて蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを回収し超純水を用いて洗浄を行った（5000 rpm, 5 min）。この洗浄操作を3回繰り返し行った。
　収集したマイクロカプセルについて、走査型電子顕微鏡(SEM)（SU6600, 日立ハイテクノロジーズ）、エネルギー分散型X線分析装置 (EDX) （Xflash 5010，BRUKER）を用いて観察した。
　 (4)　結果と考察
　図20にpH 7.60の1.0SBF浸漬後に得られた蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルのSEM写真とEDX分析結果を示す。図20 (a)はSEM写真である。図20 (b)は同試料の高倍率のSEM写真であり、図20 (c)はそのEDX測定結果である。
　図20 (a), (b)よりpH7.60の1.0SBFに1日間浸漬した蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類微粒子を含むホスファチジルコリン小粒子の表面が針状結晶で構成される薄膜で被覆されていることがわかった。また、図20 (c)において、蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルの表面のEDX結果においてCaとPのピークが検出された。これらの結果から、リン酸カルシウム類微粒子及びオボアルブミンのフルオレセイン結合体を含む小粒子をpH 7.60の1.0SBFに浸漬することにより、リン酸カルシウム類微粒子からリン酸カルシウム類が表面及び内部へと成長し、リン酸カルシウム類微粒子及びオボアルブミンのフルオレセイン結合体を含むホスファチジルコリン小粒子を被覆したと考えられる。また、図20 (a)において、観察した全てのリン酸カルシウム類微粒子及びオボアルブミンのフルオレセイン結合体を含むホスファチジルコリン小粒子がリン酸カルシウム類で被覆されており、高い生産性が示された。再現実験においても同様の結果が得られたことから、今回の方法は再現性が高いと考えられる。
　(５)　HEK293細胞を用いたタンパク導入実験
　上記で作製した蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを用い、HEK293細胞を用いたタンパク導入実験を行った。以下に実験手順を記す。
　蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを約1.5ｘ10４個/mlの濃度で含む溶液 20 mlを遠心分離機を用いて遠心分離し（1,000 × g 、10 min）（gは重力加速度）、沈殿した蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを10 mlのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁し再び遠心分離を行った（1,000 × g 、10 min）。上清を取り除き、10mlの70%エタノール溶液を加え30分間静置し滅菌した。遠心分離機を用いて蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを分離した（1,000 × g 、10 min）。その後蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルをPBSで2回洗浄した。最終的に，10 mlのPBSに蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを懸濁した。
　続いて、この溶液200μlを遠心分離し（8,000 × g 、1 min）、500 μlの培地に再懸濁した。4穴プレートにHEK293細胞を撒き、80%程度コンフルエントになったところで、本発明の蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを懸濁した培地に交換した。
　蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセル添加24時間後、72時間後に蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 200)を用いて観察した。
　蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセル添加後24時間後の観察において、蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを取り込んだ細胞において緑色蛍光が見られた。72時間後においても蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを取り込んだ細胞において緑色蛍光が見られた。
　これらの結果より、蛍光タンパク含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを用いたタンパク導入に成功した。
　実施例１２
　3種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセル
　 (1) リン酸カルシウム類微粒子及び3種類のDNAを含むホスファチジルコリン小粒子の作製
　1.0SBFにトリスヒドロキシメチルアミノメタンを加えて25.0℃でpH 8.60に調整し、リン酸カルシウム類微粒子を析出した。析出したリン酸カルシウム類微粒子を、孔径50 nmのセルロース混合エステル製の濾紙(MF-ミリポア、Millipore, USA)を用いた吸引濾過によって回収した。超純水で洗浄後、濾紙を乾燥機で1日乾燥させたのちリン酸カルシウム類微粒子を回収した。100 mlのエタノールにホスファチジルコリン20 mg、リン酸カルシウム類微粒子0.2mg、DNAとしてp-ECFP-N1 10 μg、pmCherry-NCre 10 μg、phChRWR-Ve 10 μgを加え、超音波振動を加えて分散させた。これをナスフラスコに移しロータリーエバポレーターを用いて減圧蒸留した。フラスコの底に薄膜層が生成した。この薄膜層にはリン酸カルシウム類微粒子、p-ECFP-N1、pmCherry-Ncre及びphChRWR-Veが含まれている。これに(1)で調製したpH 7.60の1.0SBFを50 ml加え超音波振動を加え分散させることにより、リン酸カルシウム類微粒子、p-ECFP-N1、pmCherry-Ncre及びphChRWR-Veを含むホスファチジルコリン小粒子を生成した。リン酸カルシウム類微粒子、p-ECFP-N1、pmCherry-Ncre及びphChRWR-Veを含むホスファチジルコリン小粒子は、マイクロカプセルのコア(芯)を形成するものである。
　 (2) pH 7.60の1.0SBF浸漬による3種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルの形成
　リン酸カルシウム類微粒子、p-ECFP-N1、pmCherry-Ncre及びphChRWR-Veを含むホスファチジルコリン小粒子が分散された1.0SBF溶液をポリ瓶に移し、36.5 ℃のインキュベータ内で1日間振盪攪拌した。リン酸カルシウム類が微粒子表面及び内部へと成長し、これにより、リン酸カルシウム類微粒子、p-ECFP-N1、pmCherry-Ncre及びphChRWR-Veを含むホスファチジルコリン小粒子の表面を被覆した。この結果、3種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルが作製された。その後インキュベータ内から溶液を取り出し、超遠心分離器を用いて3種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルを回収し超純水を用いて洗浄を行った（5000 rpm,5 min）。この洗浄操作を3回繰り返し行った。
　収集したマイクロカプセルについて、走査型電子顕微鏡(SEM)（SU6600, 日立ハイテクノロジーズ）、エネルギー分散型X線分析装置 (EDX) （Xflash 5010，BRUKER）を用いて観察した。
　(3)　結果と考察
pH 7.60の1.0SBF浸漬後の走査型電子顕微鏡観察、及びエネルギー分散型X線分析
　図21にpH 7.60の1.0SBF浸漬後に得られた3種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルのSEM写真とEDX分析結果を示す。図21 (a)はSEM写真である。図21 (b)及び図21 (c)は同試料の高倍率のSEM写真であり、図21 (d)はそのEDX測定結果である。
　図21 (a), (b), (c)よりpH7.60の1.0SBFに1日間浸漬したリン酸カルシウム類微粒子および3種類のDNAを含むホスファチジルコリン小粒子の表面が針状結晶で構成される薄膜で被覆されていることがわかった。また、図21 (d)において、3種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルの表面のEDX結果においてCaとPのピークが検出された。これらの結果から、リン酸カルシウム類微粒子、p-ECFP-N1、pmCherry-Ncre及びphChRWR-Veを含む小粒子をpH 7.60の1.0SBFに浸漬することにより、リン酸カルシウム類微粒子からリン酸カルシウム類が表面及び内部へと成長し、リン酸カルシウム類微粒子、p-ECFP-N1、pmCherry-Ncre及びphChRWR-Veを含むホスファチジルコリン小粒子を被覆したと考えられる。また、図21 (a)および図21 (b)において、観察した全てのリン酸カルシウム類微粒子、p-ECFP-N1、pmCherry-Ncre及びphChRWR-Veを含むホスファチジルコリン小粒子がリン酸カルシウム類で被覆されており、高い生産性が示された。再現実験においても同様の結果が得られたことから、今回の方法は再現性が高いと考えられる。
　(4) HEK293細胞を用いた遺伝子導入実験
　作製した3種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルを用い、HEK293細胞を用いた遺伝子導入実験を行った。以下に実験手順を記す。
　3種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルを約1.5×10４ 個/mlの濃度で含む溶液 20 mlを遠心分離機を用いて遠心分離し（1,000 × g 、10 min）（gは重力加速度）、沈殿したDNA含有リン酸カルシウム類マイクロカプセルを10 mlのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁し再び遠心分離を行った（1,000 × g 、10 min）。上清を取り除き、10mlの70%エタノール溶液を加え30分間静置し滅菌した。その後遠心分離機を用いて2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルをPBSで2回洗浄した（1,000 × g 、10 min）。最終的に，10 mlのPBSに2種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルを懸濁した。
　続いて、この溶液200 μlを遠心分離し（8,000 × g 、1 min）、500 μlの培地に再懸濁した。4穴プレートにHEK293細胞を撒き、80%程度コンフルエントになったところで、3種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルを懸濁した培地に交換した。
　3種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセル添加24時間後、72時間後に蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 200)を用いて観察し，ECFP、mCherry及びhChRWR-Veの発現を調べた。
　単一の細胞において、ECFP の青色蛍光、mCherryの赤色蛍光、及びhChRWR-Veの緑色蛍光の3種類が同時に発現していた。EGFP、mCherry及びhChRWR-Veの3種類が同時に細胞に取り込まれ、同時に発現していることが分かった。
　この結果より、3種類のDNAを含有するリン酸カルシウム類マイクロカプセルを用いた3種類の遺伝子の同時導入に成功、高い割合で3種類の遺伝子を同時に発現させ得ることが明らかになった。

Claims (8)

  1. コア－シェル構造を有するマイクロカプセルであって、コアが油性物質を含み、シェルがリン酸カルシウム類から構成される、マイクロカプセル。
  2. コアに核酸物質、タンパク質又は薬物をさらに含む、請求項１に記載のマイクロカプセル。
  3. 核酸物質が、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチジーン、アンチセンス、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リポザイム、遺伝子、プラスミド、デコイオリゴヌクレオチド、DNAザイムからなる群から選ばれる、請求項２に記載のマイクロカプセル。
  4. 油性物質が油又はロウ様の物質である、請求項２に記載のマイクロカプセル。
  5. 前記油性物質が植物油もしくはリン脂質である請求項１～４のいずれかに記載のマイクロカプセル。
  6. コア－シェル構造を有し、コアが核酸物質、タンパク質及び薬物からなる群から選ばれる少なくとも１種の物質並びに油性物質を含み、シェルがリン酸カルシウム類から構成されるマイクロカプセル、細胞への物質の導入剤。
  7. 油性物質と種晶を混合し、この混合物をリン酸カルシウム類形成溶液に分散してリン酸カルシウム類から構成されるシェルを成長させることを特徴とする、請求項１～５のいずれかに記載のマイクロカプセルの製造方法。
  8. 種晶がリン酸カルシウム類微粒子である、請求項７に記載のマイクロカプセルの製造方法。
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