WO2012136871A1 - Método de diagnóstico de la enfermedad de alzheimer que emplea sfrp1 como biomarcador - Google Patents

Método de diagnóstico de la enfermedad de alzheimer que emplea sfrp1 como biomarcador Download PDF

Info

Publication number
WO2012136871A1
WO2012136871A1 PCT/ES2012/070226 ES2012070226W WO2012136871A1 WO 2012136871 A1 WO2012136871 A1 WO 2012136871A1 ES 2012070226 W ES2012070226 W ES 2012070226W WO 2012136871 A1 WO2012136871 A1 WO 2012136871A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
alzheimer
disease
suffering
determination
risk
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2012/070226
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Paola BOVOLENTA NICOLAO
Pilar ESTEVE PASTOR
Africa SANDONIS CONSUEGRA
Inmaculada CRESPO GALAN
Mª Isabel GUERRERO VEGA
Carmen IBÁÑEZ PÉREZ
Jordi MALAPEIRA ARGUILAGA
Joaquin ARRIBAS
Akihiko SHIMONO
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA
Fundacio Privada Institut dInvestigacio Oncologica Vall dHebron
Fundacio Institut de Recerca Hospital Universitari Vall dHebron
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA
Fundacio Privada Institut dInvestigacio Oncologica Vall dHebron
Fundacio Institut de Recerca Hospital Universitari Vall dHebron
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC, Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA, Fundacio Privada Institut dInvestigacio Oncologica Vall dHebron, Fundacio Institut de Recerca Hospital Universitari Vall dHebron filed Critical Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Publication of WO2012136871A1 publication Critical patent/WO2012136871A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity

Definitions

  • the present invention belongs to the field of Molecular Biology and refers to sfrpl as a biomarker for Alzheimer's disease at its earliest stage and its use for the early diagnosis of said disease.
  • AD Alzheimer's disease
  • NMR Nuclear Magnetic Resonance
  • PET Positron Emission Tomography
  • the Clinical diagnosis can be made with only 65-90% accuracy.
  • the definitive diagnosis of AD is only made post mortem, when the autopsy reveals the senile plaques and neurofibrillary tangles in the brain tissue. Plaques are the result of aggregation of ⁇ peptides and are believed to be involved in the pathology of AD. (Hardy, J, Selkoe, DJ. 2002. Science, 297: 353-356).
  • biomarker of AD for the early diagnosis of AD is a critical first step in the development of methodologies for early disease intervention, and would have several advantages. It would be able to identify AD at a very early stage of the disease, before cognitive symptoms can be detected in neuropsychological tests, and before brain NMR or PET imaging can show signs of degeneration. Differential diagnosis of AD is difficult, and a biomarker that reflects neuropathological changes at the molecular level in the brain could make it possible to distinguish Alzheimer's patients not only from people with mild cognitive impairment who do not develop AD, but also from patients with depression. A biomarker would also contribute greatly to the detection of new therapies, especially those aimed at preventing neuropathological changes.
  • AD cannot be diagnosed by a valid clinical method or by a biomarker before the disease has progressed so much that dementia is evident.
  • AD Alzheimer's disease
  • APP is an integral membrane protein that is present in many types of tissues, but is particularly abundant in neuronal synapses. APP may suffer two alternative types of processing that are mutually exclusive.
  • the non-amyloidogenic processing of the APP protein is carried out by ADAM10, a metalloprotease with ⁇ -secretase activity, which cuts APP within the ⁇ peptide, more specifically in amino acid 16 of APP, causing the release of the soluble extracellular domain of APP (sAPPa) and preventing the generation of the toxic peptide ⁇ .
  • sAPPa soluble extracellular domain of APP
  • APP may undergo an amyloidogenic processing, performed by a ⁇ -secretase that cuts at one end of the ⁇ peptide. This peptide is again processed by ⁇ -secretase and gives rise to toxic ⁇ peptides. (Lichtenthaler, SF. 201 1. J Neurochem. 1 16: 10-21).
  • SFRPs proteins secreted by Frizzled related proteins
  • Wnt signaling pathway name derived from the "Wingless” and “int” genes
  • ADAM ADAM
  • the present invention relates to the use of SFRP as a biomarker for Alzheimer's disease (AD).
  • AD Alzheimer's disease
  • the present invention is a new biomarker for the early detection of AD.
  • the levels of the SFRP1 protein are altered in Alzheimer patients with respect to control subjects. In this way, the detection and / or quantification of this protein allows the early diagnosis of Alzheimer's disease.
  • the present invention relates to a method of diagnosis of AD or for the determination of the risk of suffering from AD or for the determination of the evolution of an AD in a subject susceptible to suffering from AD comprising the following steps: a) detect and / or quantify the expression product of a nucleotide sequence of an sfrpl gene in an isolated sample;
  • step (b) compare the quantity detected and / or quantified in step (a) with a reference quantity
  • step (c) attribute the significant deviation identified in step (c) to the presence of AD or to the risk of suffering from AD.
  • determination of evolution refers to the monitoring of disease development, such as, but not limited to, the evaluation of the response to a particular treatment.
  • expression product refers to the product resulting from transcription (RNA synthesis) or translation (protein synthesis) of a gene or nucleotide sequence of DNA, or any form resulting from the processing of product resulting from the transcription or expression of a gene or a nucleotide sequence of DNA.
  • the sfrpl gene is the "secreted Frizzled related protein 1" gene.
  • step (a) is not intended to be correct in 100% of the samples analyzed. However, it requires that a statistically significant amount of the analyzed samples be classified correctly.
  • the amount that is statistically significant can be established by a person skilled in the art by using different statistical tools, for example, but not limited, by determining confidence intervals, determining the p-value, Student's test or discriminant functions of Fisher
  • the confidence intervals are at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98% or at least 99%.
  • the value of p is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001.
  • the present invention allows the disease to be correctly detected in at least 60%, in at least 70%, in at least 80%, or in at least 90% of the subjects of a certain group or population analyzed.
  • the appropriate reference amount can be determined from a reference sample that can be analyzed, for example, simultaneously or consecutively, by the method of the first aspect of the invention, together with the isolated sample from a subject susceptible to AD. . More preferably, the reference amount may be derived from the normal distribution limits of a physiological amount found in a population of control subjects. Said physiological amount can be determined by several techniques well known to the person skilled in the art.
  • the nucleotide sequence of the sfrpl gene encodes an amino acid sequence having at least eighty percent, at least eighty-five percent, at least Ninety percent, at least ninety-five percent, at least ninety-nine percent identity with SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequence of the sfrpl gene encodes for the amino acid sequence SEQ ID NO: 1.
  • both percent identity or “percent identity” as used herein, refers to either percent or percent identity between two amino acid sequences.
  • the percentage or percentage of identity is the result of counting the number of positions along the alignment of two sequences where all amino acids in the same position are identical.
  • the percentage of identity existing between two sequences can be easily identified by a person skilled in the art, for example, with the help of an appropriate computer program to compare sequences.
  • Table 1 Percentage of sequence identity for the human SRFP1 gene and protein of different species.
  • SEQ ID NO: 1 is the sequence of the human SFRP1 protein found in the NCBI database (National Center for Biotechnology Information) with the reference number: NP_003003.3.
  • the sample isolated from step (a) is a biological fluid.
  • the biological fluid is cerebrospinal fluid (CSF), blood, serum or blood plasma. More preferably, the biological fluid is blood serum. More preferably, the biological fluid is CSF.
  • the isolated sample comprises cells.
  • the isolated sample comprises a tissue.
  • the expression product of a nucleotide sequence of a sfrpl gene is an amino acid sequence with at least 90% identity with SEQ ID NO: 1.
  • the expression product of a nucleotide sequence of a sfrpl gene is the amino acid sequence SEQ ID NO: 1.
  • the expression product is detected by PCR.
  • the expression product is detected by electrophoresis, immunoassay, chromatography, microarray technology and / or mass spectrometry.
  • the expression product is detected by immunoassay.
  • the immunoassay is an ELISA.
  • the expression product is detected by mass spectrometry.
  • step (a) of the method of the invention can be carried out by any combination of any of the techniques mentioned. Detection can be performed by evaluating the presence or absence of the expression product or a fragment thereof.
  • An immunoassay is a biochemical assay that measures the concentration of a substance in a sample using a reaction of an antibody or antibodies against its antigen.
  • the assay is based on the specific binding of an antibody with its antigen.
  • the detection and / or quantification of the antibody and / or the antigen can be carried out with various methods.
  • One of the most common is the antigen or antibody mapping.
  • This marking may consist, but is not limited to, an enzyme, a radioisotope (radioimmunoassay), a magnetic marker (magnetic immunoassay) or a fluorophore.
  • radioisotope radioisotope
  • magnetic marker magnetic immunoassay
  • fluorophore fluorophore
  • Heterogeneous immunoassays can be competitive or non-competitive.
  • a competitive immunoassay the response is inversely proportional to the antigen concentration of the sample.
  • a non-competitive assay also called a sandwich assay, the results are directly proportional to the antigen concentration.
  • An immunoassay technique that can be used in the present invention is the enzyme-linked immunoadsorbent assay or ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ').
  • the immunoassay is an immunohistochemistry (IHQ).
  • IHQ immunohistochemistry
  • Immunohistochemical techniques allow the identification, on tissue or cytological samples of characteristic antigenic determinants. Immunohistochemical analysis is performed on tissue cuts, either frozen or included in paraffin, from an isolated sample of a subject. These sections hybridize with a specific antibody or primary antibody that recognizes the SFRP1 protein, its variants or fragments thereof. The sections are then hybridized with a secondary antibody capable of specifically recognizing the primary antibody and which is conjugated or bound with a marker compound. In an alternative embodiment, it is the primary antibody that recognizes the SFRP1 protein, its variant or a fragment thereof, that is conjugated or bound to a marker compound, and the use of a secondary antibody is not necessary.
  • the molecules can be separated according to their load, their size or their molecular weight, their polarity or their redox potential, among others.
  • the chromatographic technique can be, but not limited to, liquid chromatography (partition, absorption, exclusion, ion exchange), gas chromatography or supercritical fluid chromatography.
  • Microarray technology refers, for example, but not limited to the fixation on a solid support of a molecule that recognizes the expression product of the present invention.
  • the antibody microarray is one of the most common protein microarrays. In this case the antibodies are placed in small points, fixed on the solid support (called a protein chip) and used to capture molecules and thus detect the proteins in an isolated sample, such as a cell lysate, a conditioned medium, serum, urine or CSF.
  • solid support refers to a wide variety of materials, for example, but not limited to, ion exchange resin or adsorption, glass, plastic, latex, nylon, gel, esters or Cellulose, paramagnetic spheres or a combination of some of them.
  • the present invention relates to the use of the expression product of a nucleotide sequence of a sfrpl gene as a marker for the determination of the risk of suffering from AD, to determine the presence of AD and / or to predict progression. of an EA in a subject susceptible to AD.
  • the present invention relates to the use of a kit comprising primers and / or probes that hybridize with the nucleotide sequence of an sfrpl gene encoding an amino acid sequence that has at least 90% identity with SEQ ID NO: 1, or coding for the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, to determine the risk of suffering from AD or to determine the presence of an AD or to predict the progression of an AD in a subject susceptible to AD, in An isolated sample.
  • primers refers to oligonucleotides with identical or complementary reverse nucleotide sequences that allow amplification of any fragment of the gene in question by, for example, polymerase chain reaction (PCR).
  • primer refers to sequences of between 15-30 nucleotides that hybridize with one of the template nucleic acid chains and allow amplification of a DNA sequence by a PCR reaction.
  • probe refers to an RNA or DNA sequence that may or may not be labeled with any marker compound known in the state of the art.
  • the present invention relates to the use of a kit comprising antibodies that specifically bind to an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence of a sfrpl gene where said amino acid sequence has at least 90% identity with SEQ ID. NO: 1, or where said amino acid sequence is SEQ ID NO: 1, to determine the risk of suffering from AD or to determine the presence of an AD or to predict the progression of an AD in a subject susceptible to AD, in a isolated sample.
  • Figure 1 It shows that the levels of SFRP1 in the blood serum of Alzheimer's patients (AD) are significantly different from the levels in healthy subjects (control).
  • Figure 2. It shows that in the absence of sfrpl (TgAPP; PS1; Sfrp1) less deposits of ⁇ are formed in the cerebral cortex in a murine model for AD (TgAPP; PS1). The data were analyzed using the Student test. *** indicates p ⁇ 0.001 vs. control.
  • FIG. 3 It shows that in a murine model for AD (TgAPP; PS1), episodic memory is very deficient compared to that observed in wild animals (WT), while in the same EA model it also lacks sfrpl (TgAPP ; PS1; Sfrp1 " ' " ), episodic memory is comparable to that of wild animals.
  • FIG. 4 It shows that, in a murine model for AD (TgAPP; PS1), the level of spatial memory acquisition is lower than in wild animals (WT) while in the same EA model it also lacks sfrpl ( TgAPP; PS1; Sfrp1 " ' " ), the spatial memory is closer to that of wild animals.
  • FIG. 5 It shows that in a murine model for AD (TgAPP; PS1), the level of spatial information retrieval from the Morris test is lower than in wild animals (WT) while in the same EA model that It also lacks sfrpl (TgAPP; PS1; Sfrp1 " ' " ), this recovery is closer to that of wild animals.
  • EXAMPLE 1 Analysis of serum SFRP1 levels in patients with Alzheimer's disease. SFRP1 protein levels were analyzed in blood serum samples from 10 Alzheimer's patients and in 5 non-dementia subjects aged between 76 and 81 years, which were considered control subjects.
  • EXAMPLE 2 Analysis of SFRP1 levels in cerebrospinal fluid of Alzheimer's patients. SFRP1 protein levels were quantified in cerebrospinal fluid samples from Alzheimer's patients and control subjects.
  • TgAPP animals male PS1 were used as EA model and TgAPP animals; PS1 without sfrpl (TgAPP; PS1; Sfrp1 ⁇ ) male.
  • the cerebral cortex of both groups was studied histologically in 5-month-old animals. The animals were sacrificed with anesthetic / eutanase, fixed by perfusion with 4% paraformaldehyde (PFA), the brain was extracted, cryoprotected and frozen at -80 ° C. Cryostat sections of 10 ⁇ were obtained and immunostained with the antibody specific against ⁇ _4 ⁇ -42 (Millipore) and were marked with DAPI and Congo network. Deposits of ⁇ were observed by anti- ⁇ marking and by staining with Congo red.
  • EXAMPLE 4 The absence of sfrpl in an EA model decreases reactive astrogliosis, the accumulation of active microglia and phosphorylation of Tau.
  • AD is associated with chronic inflammation in the brain, reflected with elevated microgliosis and with the presence of reactive astrocytes.
  • Deletion of the sfrpl gene in a mouse EA model prevents the formation of microgliosis, reactive astrocytosis, and phosphorylation of Tau, all of them pathological signs observed in AD, indicating that in the absence of sfrpl brain histology is preserves
  • EXAMPLE 5 The absence of the sfrpl gene prevents memory deficits present in a murine model of AD.
  • ORT object recognition test
  • TgAPP; PS1 mice show significantly worse performance than wild animals when recognizing objects.
  • TgAPP; PS1; Sfrp1 ⁇ _ mice show a performance similar to that observed in wild animals ( Figure 3).
  • ANOVA p 0.012; post hoc comparisons with Tukey p ⁇ 0.001 WT and TgAPP; PS1; Sfrp1 "" vs.. TgAPP; PS1.
  • the Morris Test was used, which consisted of three phases: habituation, acquisition and recovery.
  • the animals were introduced for 60 seconds in a pool with water at 22 ⁇ 1 o C without the escape platform (PE), 24 hours later the acquisition phase began, in which the pool contained a PE in one of the quadrants (always the same).
  • This phase lasted 4 days, with 4 trials per day in which the animals were introduced by each of the quadrants.
  • the maximum test time was 60 seconds.
  • the recording time (escape latency) was stopped and allowed to be on it for 20 seconds.
  • the recovery phase the pool lacked PE. The animal was introduced in the center of the pool and swam for 60 seconds, recording the time the mouse spent in the quadrant that the PE had in the previous days.
  • EXAMPLE 6 SFRP1 soluble protein accumulates in the cerebral cortex in amyloid plaques in both a murine model of AS and in patients with AD increasingly as the disease progresses.
  • EXAMPLE 7 SFRP1 soluble protein is secreted by the reactive astrocytes and activated microglia surrounding the plaque.
  • TgAPP mice PS1 were sacrificed with anesthetic / eutanasic, fixed by perfusion with 4% PFA, the brain was removed, cryoprotected and frozen at -80 ° C. Cryostat sections of 10 ⁇ were obtained that were immunostained with the specific antibody against SFRP1 and with specific antibodies that recognize neurons (NeuN), GFAP (astrocytes) or tomato lectin (microglia). Colocalization of SFRP1 was observed with GFAP or with tomato lectin in cells located in the vicinity of the plaques present in this mouse. These results indicate that the SFRP1 protein is synthesized by reactive astrocytes and activated microglia found around senile plaques.
  • sfrpl The expression of sfrpl is increased in patients with AD (Blalock et al. 2004 Proc Nati Acad Sci 101, 2173-8). In that study, they compared the expression levels of different mRNAs in hippocampus samples of control individuals and individuals with incipient AD by "microarray" analysis. The sfrpl gene is among the list of genes whose mRNA levels are increased in individuals with incipient AD.
  • sfrpl mRNA correlates with an increase in protein levels in samples of patients with AD.
  • Samples of human cerebral cortex from control individuals or patients with early stage (Braak lll-IV) and late stage (Braak V-VI) were homogenized in lysis buffer and 1% Triton X-100. The samples were re-suspended in loading buffer and analyzed by electrophoresis in 12% acrylamide gels, followed by Western blot analysis. This analysis showed that the SFRP1 protein is more abundant in samples of AD patients than in control individuals. In addition, SFRP1 protein levels increase the more severe the disease is (Figure 6). In brain cortex samples of AD patients, very clear accumulations of SFRP1 are detected by immunocytochemistry when other plaque markers are not yet visible, indicating that their load precedes plaque formation and is therefore an earlier marker than other plate markers described to date.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a un método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer que comprende (a) detectar y/o cuantificar el producto de expresión de una secuencia nucleotídica de un gen sfrp1 en una muestra aislada; (b) comparar la cantidad detectada y/o cuantificada con una cantidad de referencia; (c) identificar cualquier desviación significativa en la comparación de datos de la etapa (b); y, (d) atribuir la desviación significativa identificada a la presencia de la enfermedad de Alzheimer. Así mismo, la presente invención se refiere al uso de un kit que comprende cebadores y/o sondas que hibridan con la secuencia nucleotídica de un gen sfrp1 o anticuerpos que se unen específicamente a una secuencia aminoacídica codificada por la secuencia nucleotídica de un gen sfrp1 para determinar la presencia de una enfermedad de Alzheimer.

Description

Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer que emplea sfrpl como biomarcador
La presente invención pertenece al campo de la Biología Molecular y se refiere a sfrpl como biomarcador para la enfermedad de Alzheimer en su etapa más temprana y a su uso para el diagnóstico precoz de dicha enfermedad.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa que se manifiesta con un deterioro cognitivo y trastornos conductuales. Se caracteriza por una pérdida progresiva de la memoria y de otras capacidades mentales asociadas a la muerte neuronal en distintas zonas del cerebro. La EA es incurable y terminal. Su diagnostico se realiza mediante evaluaciones de conducta y cognitivas, mediante análisis por Resonancia Magnética Nuclear (RMN) o Tomografía por Emisión de Positrones (PET). Las causas de la EA son en gran medida desconocidas. La enfermedad se caracteriza por la aparición de placas seniles que contienen acumulaciones anómalas de, entre otros, él péptido conocido como beta amiloide (Αβ), que se genera por el procesamiento de la proteína precursora del amiloide (APP) (Tanzi, RE, Bertram, L. 2005 Cell, 120: 545-555).
Actualmente, los únicos marcadores descritos son el péptido Αβ, la proteína tau total y la proteína tau fosforilada en la posición 181. Sin embargo, supone un gran reto encontrar nuevos biomarcadores en líquido cefalorraquídeo o sangre (Humpel, C. 2011 . Trends Biotechnol. 29(1 ): 26-32), ya que no existen marcadores capaces de predecir la susceptibilidad de un individuo de padecer EA, con la excepción en los casos de EA familiar, ni tampoco marcadores para determinar qué pacientes con un deterioro cognitivo leve van a desarrollar EA. Por lo tanto, es urgente desarrollar nuevos biomarcadores para el diagnóstico precoz de la EA. La EA a menudo pasa desapercibida o se diagnostica incorrectamente en sus primeras etapas, a menudo porque sus síntomas se confunden con las inevitables consecuencias del envejecimiento. Cuando la enfermedad progresa, el diagnóstico clínico puede hacerse con sólo el 65-90 % de precisión. El diagnóstico definitivo de la EA solo se hace post mortem, cuando la autopsia revela las placas seniles y los ovillos neurofibrilares en el tejido cerebral. Las placas son el resultado de la agregación de péptidos Αβ y se cree que participan en la patología de la EA. (Hardy, J, Selkoe, DJ. 2002. Science, 297: 353-356).
La identificación de un biomarcador de la EA para el diagnóstico temprano de la EA es un primer paso crítico en el desarrollo de metodologías para la intervención temprana de la enfermedad, y tendría varias ventajas. Sería capaz de identificar la EA en una etapa muy temprana de la enfermedad, antes de que los síntomas cognitivos puedan detectarse en pruebas neuropsicológicas, y antes de que los análisis de las imágenes cerebrales de RMN o PET puedan mostrar signos de degeneración. El diagnóstico diferencial de la EA es difícil, y un biomarcador que refleje cambios neuropatológicos a nivel molecular en el cerebro podría permitir distinguir los pacientes de Alzheimer no sólo de las personas con leve deterioro cognitivo que no desarrollan EA, sino también de pacientes con depresión. Un biomarcador también contribuiría en gran medida a la detección de nuevas terapias, especialmente las dirigidas a prevenir cambios neuropatológicos. Hasta ahora, la EA no se puede diagnosticar por un método clínico válido o por un biomarcador antes de que la enfermedad haya progresado tanto que la demencia sea evidente. Además, no hay un método válido para determinar qué pacientes con un deterioro cognitivo leve desarrollarán EA. Por lo tanto, un correcto diagnóstico en la fase precoz de la EA no solo es de gran importancia porque el tratamiento temprano es más eficaz, sino también porque la carga psicológica de los pacientes y familiares puede aliviarse antes.
Se han investigado muchos marcadores bioquímicos ante mortem para la EA, tanto en plasma como en orina, pelo, piel y otros, pero aún no se ha encontrado ninguno que permita monitorizar la eficacia de nuevos medicamentos o estrategias terapéuticas en ensayos clínicos.
Debido a que la EA queda a menudo sin diagnosticar o se diagnostica mal, es muy importante identificar un marcador biológico robusto y fácil de medir, especialmente uno que permita la detección temprana de la enfermedad. Esto podría permitir la intervención temprana y el tratamiento terapéutico para restaurar potencialmente la memoria y detener la deposición del péptido Αβ para así prevenir la neurodegeneración (Ward, M. 2007. Expert Rev Mol Diagn 7: 635- 646).
APP es una proteína integral de membrana que está presente en muchos tipos de tejidos, pero que es particularmente abundante en las sinapsis neuronales. APP puede sufrir dos tipos alternativos de procesamiento que son excluyentes entre sí. El procesamiento no amiloidogénico de la proteína APP lo realiza ADAM10, una metaloproteasa con actividad α-secretasa, que corta APP dentro del péptido Αβ, más concretamente en el aminoácido 16 de APP, provocando la liberación del dominio extracelular soluble de APP (sAPPa) e impidiendo la generación del péptido tóxico Αβ. Posteriormente, APP es procesada por una γ-secretasa, generándose unos péptidos llamados p3. Alternativamente, APP puede sufrir un procesamiento amiloidogénico, realizado por una β-secretasa que corta en un extremo del péptido Αβ. Este péptido es de nuevo procesado por la γ-secretasa y da lugar a los péptidos tóxicos Αβ. (Lichtenthaler, SF. 201 1 . J Neurochem. 1 16:10-21 ).
Las proteínas SFRPs (del inglés "secreteó Frizzled related proteins") son proteínas secretables conocidas por su actividad como moduladores de la vía de señalización de Wnt (nombre derivado de los genes "Wingless" e "int"), y también por su capacidad para regular la actividad de metaloproteasas de tipo "Tolloid" (Bovolenta, P et al. 2008 J Cell Science 121 (6):737-46 ), y tipo "ADAM" (Esteve et al. 2011 . Nature Neuroscience 14 (5): 564-569)
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de SFRP como biomarcador para la enfermedad de Alzheimer (EA).
Los autores de la presente invención han demostrado que algunas proteínas de la familia SFRP presentan niveles alterados en muestras de fluidos biológicos procedentes de enfermos de Alzheimer respecto de personas sanas. Por tanto, la presente invención supone un nuevo biomarcador para la detección precoz de la EA.
Como muestran los ejemplos de la presente invención, los niveles de la proteína SFRP1 están alterados en sujetos enfermos de Alzheimer con respecto a sujetos control. De esta forma, la detección y/o cuantificación de esta proteína permite el diagnóstico temprano de la enfermedad de Alzheimer.
Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método de diagnóstico de la EA o para la determinación del riesgo de padecer EA o para la determinación de la evolución de una EA en un sujeto susceptible de padecer EA que comprende las siguientes etapas: a) detectar y/o cuantificar el producto de expresión de una secuencia nucleotídica de un gen sfrpl en una muestra aislada;
b) comparar la cantidad detectada y/o cuantificada en la etapa (a) con una cantidad de referencia;
c) identificar cualquier desviación significativa en la comparación de datos de la etapa (b); y,
d) atribuir la desviación significativa identificada en la etapa (c) a la presencia de la EA o al riesgo de padecer EA. El término "determinación de la evolución", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere, a la supervisión del desarrollo de la enfermedad, como por ejemplo, pero sin limitarse, la evaluación de la respuesta a un determinado tratamiento. El término "producto de expresión", tal y como se utiliza en la presente descripción, hace referencia al producto resultante de la transcripción (síntesis de ARN) o de la traducción (síntesis de la proteína) de un gen o de una secuencia nucleotídica de ADN, o a cualquier forma resultante del procesamiento del producto resultante de la transcripción o de la expresión de un gen o de una secuencia nucleotídica de ADN.
El gen sfrpl es el gen de la "secreteó Frizzled related protein 1".
La detección de la etapa (a), tal y como es entendida por un experto en la materia, no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente.
La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student o funciones discriminantes de Fisher. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1 , de 0,05, de 0,01 , de 0,005 o de 0,0001 . Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80%, o en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.
La cantidad de referencia adecuada puede ser determinada a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, mediante el método del primer aspecto de la invención, junto con la muestra aislada procedente de un sujeto susceptible de padecer EA. Más preferiblemente, la cantidad de referencia puede derivarse de los límites de distribución normal de una cantidad fisiológica encontrada en una población de sujetos control. Dicha cantidad fisiológica puede ser determinada por varias técnicas bien conocidas por el experto en la materia.
En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la secuencia nucleotídica del gen sfrpl codifica para una secuencia aminoacídica que tiene al menos un ochenta por ciento, al menos un ochenta y cinco por ciento, al menos un noventa por ciento, al menos un noventa y cinco por ciento, al menos un noventa y nueve por ciento de identidad con SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la secuencia nucleotídica del gen sfrpl codifica para la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 .
El término "tanto por ciento de identidad" o "porcentaje de identidad" tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere al tanto por ciento o al porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos. El tanto por ciento o el porcentaje de identidad es el resultado de contar el número de posiciones a lo largo del alineamiento de dos secuencias donde todos los aminoácidos en la misma posición son idénticos. El tanto por ciento de identidad existente entre dos secuencias puede ser identificado fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias.
Tabla 1. Porcentaje de identidad de secuencia para el gen y la proteína SRFP1 de humano con distintas especies.
Figure imgf000008_0001
SEQ ID NO: 1 es la secuencia de la proteína SFRP1 humana que se encuentra en la base de datos NCBI (National Center for Biotechnology Information) con el número de referencia: NP_003003.3.
Las secuencias de aminoácidos de SFRP1 de chimpancé, vaca, ratón, rata y gallo presentan una alta homología con la secuencia de humano, como muestra la tabla 1.
En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la muestra aislada de la etapa (a) es un fluido biológico. Preferiblemente, el fluido biológico es líquido cefalorraquídeo (LCR), sangre, suero o plasma sanguíneo. Más preferiblemente, el fluido biológico es suero sanguíneo. Más preferiblemente, el fluido biológico es LCR. En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la muestra aislada comprende células.
En una realización preferida del primer aspecto de la invención, donde la muestra aislada comprende un tejido.
En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el producto de expresión de una secuencia nucleotídica de un gen sfrpl es una secuencia aminoacídica con al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO: 1 . Preferiblemente, el producto de expresión de una secuencia nucleotídica de un gen sfrpl es la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 .
En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el producto de expresión es detectado por PCR. En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el producto de expresión es detectado por electroforesis, inmunoensayo, cromatografía, tecnología de microarrays y/o espectrometría de masas. Preferiblemente, el producto de expresión es detectado por inmunoensayo. Preferiblemente, el inmunoensayo es un ELISA. Preferiblemente, el producto de expresión es detectado por espectrometría de masas.
La detección y/o cuantificación del paso (a) del método de la invención puede llevarse a cabo mediante cualquier combinación de cualquiera de las técnicas mencionadas. La detección puede realizarse evaluando la presencia o la ausencia del producto de expresión o de un fragmento del mismo.
Un inmunoensayo es un ensayo bioquímico que mide la concentración de una sustancia en una muestra usando una reacción de un anticuerpo o anticuerpos contra su antígeno. El ensayo se basa en la unión específica de un anticuerpo con su antígeno. La detección y/o cuantificación del anticuerpo y/o del antígeno puede realizarse con diversos métodos. Uno de los más comunes es el mareaje del antígeno o el anticuerpo. Este mareaje puede consistir, aunque sin limitarse, en una enzima, un radioisótopo (radioinmunoensayo), un marcador magnético (inmunoensayo magnético) o un fluoróforo. Además hay otras técnicas como la aglutinación, la nefelometría, la turbidimetría o el inmunoblot. Los inmunoensayos heterogéneos pueden ser competitivos o no competitivos. En un inmunoensayo competitivo la respuesta es inversamente proporcional a la concentración de antígeno de la muestra. En un ensayo no competitivo, también llamado ensayo en sándwich, los resultados son directamente proporcionales a la concentración de antígeno. Una técnica de inmuno ensayo que puede usarse en la presente invención es el ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas o ELISA (del inglés "Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay').
En otra realización preferida, el inmunoensayo es una inmunohistoquímica (IHQ). Las técnicas de inmunohistoquímica permiten la identificación, sobre muestras tisulares o citológicas de determinantes antigénicos característicos. El análisis mediante inmunohistoquímica se realiza sobre cortes de tejido, ya sea congelado o incluido en parafina, procedente de una muestra aislada de un sujeto. Estos cortes se hibridan con un anticuerpo específico o anticuerpo primario que reconoce a la proteína SFRP1 , sus variantes o fragmentos de las mismas. A continuación, los cortes se hibridan con un anticuerpo secundario capaz de reconocer de manera específica el anticuerpo primario y que se encuentra conjugado o unido con un compuesto marcador. En una realización alternativa, es el anticuerpo primario que reconoce la proteína SFRP1 , su variante o un fragmento de las mismas, el que está conjugado o unido a un compuesto marcador, y no es necesario el uso de un anticuerpo secundario. Por medio de técnicas cromatográficas se puede separar las moléculas según su carga, su tamaño o su peso molecular, por su polaridad o por su potencial redox, entre otros. La técnica cromatográfica puede ser, aunque sin limitarse, cromatografía líquida (de partición, de absorción, de exclusión, de intercambio iónico), cromatografía gaseosa o cromatografía de fluidos supercríticos.
La tecnología de microarrays se refiere, por ejemplo, pero sin limitarse, a la fijación en un soporte sólido de una molécula que reconoce el producto de expresión de la presente invención. El microarray de anticuerpos es uno de los más comunes microarrays de proteínas. En este caso los anticuerpos se colocan en pequeños puntos, se fijan en el soporte sólido (llamado chip de proteínas) y se usan para capturar moléculas y así detectar las proteínas en una muestra aislada, como pueden ser un lisado celular, un medio condicionado, suero, orina o LCR.
El término "soporte sólido" tal y como se emplea en la presente descripción se refiere a una gran variedad de materiales, por ejemplo, pero sin limitarse, resina de intercambio iónico o adsorción, vidrio, plástico, látex, nylon, gel, ésteres o celulosa, esferas paramagnéticas o una combinación de algunos de ellos.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere al uso del producto de expresión de una secuencia nucleotídica de un gen sfrpl como marcador para la determinación del riesgo de padecer la EA, para determinar la presencia de la EA y/o para predecir la progresión de una EA en un sujeto susceptible de padecer EA.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere al uso de un kit que comprende cebadores y/o sondas que hibridan con la secuencia nucleotídica de un gen sfrpl que codifica para una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO: 1 , o que codifica para la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 , para determinar el riesgo de padecer la EA o para determinar la presencia de una EA o para predecir la progresión de una EA en un sujeto susceptible de padecer EA, en una muestra aislada. El término "cebadores" se refiere a los oligonucleótidos con secuencias nucleotídicas idénticas o complementarias reversas que permitan la amplificación de algún fragmento del gen en cuestión mediante, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El término "cebador" se refiere a secuencias de entre 15-30 nucleótidos que hibridan con una de las cadenas del ácido nucleico molde y permiten la amplificación de una secuencia de ADN mediante una reacción de PCR. El término "sonda" se refiere a una secuencia de ARN o ADN que puede estar marcada o no con cualquier compuesto marcador conocido en el estado de la técnica.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere al uso de un kit que comprende anticuerpos que se unen específicamente a una secuencia aminoacídica codificada por la secuencia nucleotídica de un gen sfrpl donde dicha secuencia aminoacídica tiene al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO: 1 , o donde dicha secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 1 , para determinar el riesgo de padecer la EA o para determinar la presencia de una EA o para predecir la progresión de una EA en un sujeto susceptible de padecer EA, en una muestra aislada.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Muestra que los niveles de SFRP1 en el suero sanguíneo de sujetos enfermos de Alzheimer (EA) son significativamente diferentes de los niveles en sujetos sanos (control). Figura 2. Muestra que en ausencia de sfrpl (TgAPP;PS1 ;Sfrp1 ) se forman menos depósitos de Αβ en la corteza cerebral en un modelo murino para la EA (TgAPP;PS1 ). Los datos fueron analizados mediante el test de Student. *** indica p < 0,001 vs. control.
Figura 3. Muestra que en un modelo murino para la EA (TgAPP;PS1 ), la memoria episódica es muy deficitaria respecto a la observada en animales salvajes (WT), mientras que en el mismo modelo de EA que además carece de sfrpl (TgAPP;PS1 ;Sfrp1"'"), la memoria episódica es comparable a la de los animales salvajes. La memoria episódica se evaluó mediante el test de reconocimiento de objetos (ORT) y la significancia de los resultados se determinó mediante el test de ANOVA p=0,012. Comparaciones post hoc Tukey *** indica p ≤ 0,001 vs. APP/PS1 .
Figura 4. Muestra que, en un modelo murino para la EA (TgAPP;PS1 ), el nivel de adquisición de memoria espacial es menor que en los animales salvajes (WT) mientras que en el mismo modelo de EA que además carece de sfrpl (TgAPP;PS1 ;Sfrp1"'"), la memoria espacial es mas próxima a la de los animales salvajes. La memoria espacial se evaluó mediante el test de Morris y la significancia de los resultados se determinó mediante el test de ANOVA p=0,012 en adquisición 3 (ACQ3), comparaciones post hoc con Tukey p=0.01 1 TgAPP;PS1 vs. WT y p=0,065 TgAPP;PS1 vs. TgAPP;PS1 ; Sfrpl"'". ANOVA p=0,043 en adquisición 4 (ACQ4), comparaciones post hoc con Tukey p=0,040 TgAPP,PS1 vs. WT y p=0,151 TgAPP;PS1 vs. TgAPP;PS1 ; Sfrpl"'".
Figura 5. Muestra que en un modelo murino para la EA (TgAPP;PS1 ), el nivel de recuperación de información espacial a partir del test de Morris es menor que en los animales salvajes (WT) mientras que en el mismo modelo de EA que además carece de sfrpl (TgAPP;PS1 ;Sfrp1"'"), esta recuperación es mas próxima a la de los animales salvajes. La significancia de los resultados se determinó mediante el test de ANOVA: p=0,012 y comparaciones post hoc con Tukey p= 0,033 para TgAPP;PS1 vs. WT y p=0,1 12 para TgAPP;PS1 vs. TgAPP;PS1 ; Sfrpl"'" Figura 6. Muestra que en especímenes de corteza procedente de pacientes con EA los niveles de la proteína SFRP1 aumentan, siendo más abundantes en estadios más avanzados de la enfermedad. Los niveles de determinaron por Western Blot con anticuerpos específicos frente a SFRP1 y los datos se normalizaron frente a la carga determinada mediante los niveles de α-tubulina. El grupo control (C) corresponde a sujetos sanos, mientras que los grupos Sll-lll y SVI corresponden a pacientes de EA clasificados en dichos estadios según la escala Braak. Valores de Densidad Óptica (VDO).
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la eficacia del método de diagnóstico de la invención.
EJEMPLO 1 : Análisis de los niveles de SFRP1 en suero de sujetos enfermos de Alzheimer. Se analizaron los niveles de la proteína SFRP1 en muestras de suero sanguíneo de 10 sujetos enfermos de Alzheimer y en 5 sujetos sin demencia con edades comprendidas entre los 76 y los 81 años, que se consideraron sujetos control.
Entre los sujetos enfermos de Alzheimer, algunos presentan el alelo 4 del gen ApoE en homozigosis y otros son heterozigotos para el alelo 3 y el alelo 4.
Las muestras de suero sanguíneo se conservaron a - 20° C.
Para la cuantificación de los niveles en suero de estos sujetos se empleó un kit comercial de ELISA para detectar la proteína SFRP1 humana ("kit for Secreted Frizzled Related Proteinf de Usen Life Science Inc.). La detección se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante. Se empleó un lector de microplaca para leer la absorbancia a 450 nm. Los resultados de la cantidad de SFRP1 en suero sanguíneo se analizaron estadísticamente mediante una t de Student. Como muestra la figura 1 , se encontraron diferencias significativas (P=0,014) entre el grupo de sujetos enfermos de Alzheimer y el grupo de sujetos control.
EJEMPLO 2: Análisis de los niveles de SFRP1 en líquido cefalorraquídeo de sujetos enfermos de Alzheimer. Se cuantificaron los niveles de proteína SFRP1 en muestras de líquido cefalorraquídeo de sujetos enfermos de Alzheimer y sujetos control.
Los datos de los niveles de SFRP1 detectados por ELISA se analizaron estadísticamente y se encontraron diferencias significativas entre el grupo de sujetos enfermos de Alzheimer y el grupo de sujetos control.
Estos resultados demuestran que SFRP1 es un marcador útil para el diagnóstico de la EA, tanto en sangre como en líquido cefalorraquídeo. EJEMPLO 3: La ausencia de sfrpl disminuye la acumulación de depósitos de Αβ.
Se emplearon animales TgAPP;PS1 machos como modelo de EA y animales TgAPP;PS1 sin sfrpl (TgAPP;PS1 ;Sfrp1_ ~) machos. La corteza cerebral de ambos grupos se estudió histológicamente en animales de 5 meses de edad. Los animales se sacrificaron con anestésico/eutanásico, se fijaron mediante perfusión con paraformaldehído 4% (PFA), se extrajo el cerebro, se crioprotegió y congeló a -80° C. Se obtuvieron secciones de criostato de 10 μηι que se inmunotiñeron con el anticuerpo específico contra Αβι_4ο-42 (Millipore) y se marcaron con DAPI y Congo red. Los depósitos de Αβ se observaron mediante el mareaje anti-Αβ y mediante la tinción con Congo red. Como puede observarse en la figura 2, los animales sin sfrpl presentan un número significativamente menor de depósitos de Αβ, cuantificados tanto por tinción con anticuerpos Αβ como con Congo Red. EJEMPLO 4: La ausencia de sfrpl en un modelo de EA disminuye la astrogliosis reactiva, la acumulación de microglía activa y la fosforilación de Tau.
En los mismos grupos de animales del ejemplo anterior se analizó la presencia de depósitos de Αβ mediante tinción con Congo Red, la astrogliosis reactiva mediante inmunotinción contra GFAP, la acumulación de microglía activa mediante la inmunotinción contra CD1 1 b y la presencia de fosfo-Tau mediante inmunotinción contra la forma fosforilada de Tau en Ser 396/Ser404 (anticuerpo PHF-1 , cedido por el Prof. Jesús Ávila, CBMSO, CSIC-UAM).
La EA está asociada con una inflamación crónica en el cerebro, reflejada con una elevada microgliosis y con la presencia de astrocitos reactivos. La deleción del gen sfrpl en un modelo de EA en ratón previene la formación de la microgliosis, de la astrocitosis reactiva, y de la fosforilación de Tau, todos ellos signos patológicos observados en la EA, indicando que en ausencia de sfrpl la histología cerebral se preserva. EJEMPLO 5: La ausencia del gen sfrpl previene los déficits de memoria presentes en un modelo murino de EA.
Para estudiar los efectos sobre la memoria episódica se usó el test de reconocimiento de objetos (ORT), el cual constó de tres fases: habituación, adquisición y recuperación. En la primera fase los animales fueron habituados a un campo abierto durante 20 minutos. La segunda fase se realizó 24 horas después y duró 10 minutos. En ésta los animales fueron introducidos en el campo abierto ante la presencia de dos objetos iguales (objeto familiar) que exploraron libremente. Finalmente, 3 horas después los animales volvieron a entrar en el campo abierto que contenía esta vez un objeto familiar y un objeto nuevo y se les permitió explorar libremente durante 10 minutos. En esta última fase se registró el tiempo que el animal estuvo explorando el objeto familiar (TOF) y el tiempo que dedicó al objeto nuevo (TON). Para el análisis se partió del índice de reconocimiento (TON/(TOF+TON)) que posteriormente fue analizado por ANOVA. Tras un valor significativo de este análisis se pasó a realizar las comparaciones por pares para lo cual se usó el análisis post hoc de Tukey. Se consideraron significativos aquellos valores de p<0,05. Cada grupo estuvo formado por un n<6.
Los ratones TgAPP;PS1 presentan una performance significativamente peor que los animales salvajes a la hora de reconocer objetos. Los ratones TgAPP;PS1 ;Sfrp1~ _ muestran una performance similar a la observada en animales salvajes (Figura 3). ANOVA p=0,012; comparaciones post hoc con Tukey p<0,001 WT y TgAPP;PS1 ;Sfrp1" " vs. TgAPP;PS1 .
Para la evaluación de la memoria espacial se usó el Test de Morris el cual consistió en tres fases: habituación, adquisición y recuperación. En la primera fase los animales fueron introducidos durante 60 segundos en una piscina con agua a 22 ± 1o C sin la plataforma de escape (PE), 24 horas después comenzó la fase de adquisición, en la cual la piscina contenía una PE en uno de los cuadrantes (siempre el mismo). Esta fase duró 4 días, con 4 ensayos por día en los cuales los animales fueron introducidos por cada uno de los cuadrantes. El tiempo máximo del ensayo fueron 60 segundos. Cuando el animal encontraba la PE se detenía el tiempo de registro (latencia de escape) y se le permitía estar subido en la misma durante 20 segundos. Finalmente, en la fase de recuperación la piscina carecía de la PE. El animal era introducido en el centro de la piscina y nadaba durante 60 segundos, registrándose el tiempo que el ratón pasaba en el cuadrante que en los días previos tuvo la PE.
La latencia de escape en cada uno de los días de adquisición y la duración total en el cuadrante de la plataforma de la fase de recuperación se analizaron a través de ANOVA, tras un valor significativo de este análisis se pasó a realizar las comparaciones por pares para lo cual se usó el análisis post hoc de Tukey. Se consideraron significativos aquellos valores de p<0,05. Cada grupo estuvo formado por un n<6. A partir de los datos puede observarse que los ratones TgAPP;PS1 presentan un nivel de adquisición en memoria espacial menor que los animales salvajes (WT), mientras que los animales TgAPP/PS1 /Sfrpl muestran un comportamiento que se aproxima a los de los animales salvajes (Figura 4). ANOVA p=0,012 en adquisición 3, comparaciones post hoc con Tukey p=0,01 1 TgAPP;PS1 vs. WT y p=0,065 TgAPP;PS1 vs. TgAPPjPSI jSfrpI"'". ANOVA p=0,043 en adquisición 4, comparaciones post hoc con Tukey p=0,040 TgAPP;PS1 vs. WT y p=0,151 TgAPP;PS1 vs. TgAPP;PS1 ;Sfrp1" "). La recuperación de la memoria espacial también es deficitaria en los animales TgAPP;PS1 en comparación a la de los animales salvajes mientras que la recuperación de la memoria espacial en animales TgAPP;PS1 ;Sfrp1~ _ es similar a la de los animales salvajes (Figura 5). ANOVA: p=0,012, comparaciones post hoc con Tukey p= 0,033 para TgAPP;PS1 vs. WT y p=0,1 12 para TgAPP;PS1 vs. TgAPP;PS1 ;Sfrp1"'").
EJEMPLO 6: La proteína soluble SFRP1 se acumula en la corteza cerebral en las placas amiloides tanto en un modelo murino de EA como en enfermos de EA de manera creciente según avanza la enfermedad.
Ratones modelos de EA con (TgAPP;PS1 ) y sin Sfrpl (TgAPP;PS1 ;Sfrp1" ") se sacrificaron con anestésico/eutanásico, se fijaron mediante perfusión con 4% PFA, se extrajo el cerebro, se crioprotegió y congeló a -80° C. Se obtuvieron secciones de criostato de 10 μηι que se co-inmunotiñeron con anticuerpos específicos contra Sfrpl y contra Αβι-40-42 (Millipore). Se observó co-localización de SFRP1 y Αβ en las placas amiloides.
Muestras de corteza procedentes de individuos controles (alrededor de 80 años) y de pacientes con EA en estadio de Braak ll-lll (cedidas por el Prof. Isidro Ferrer) se inmunotiñeron con el anticuerpo específico contra SFRP1 y con Tio-flavina S (marcador de placas en su estado fibrilar). Se observó que en enfermos de EA, SFRP1 co-localiza con Αβ Tio-flavina S en las placas amiloides. SFRP1 además se localiza alrededor de las placas. En sujetos control, SFRP1 presenta niveles de expresión bajos y difusos.
EJEMPLO 7: La proteína soluble SFRP1 es secretada por los astrocitos reactivos y la microglía activada que rodean la placa.
Ratones TgAPP;PS1 se sacrificaron con anestésico/eutanásico, se fijaron mediante perfusión con 4% PFA, se extrajo el cerebro, se crioprotegió y congeló a -80° C. Se obtuvieron secciones de criostato de 10 μηι que se inmunotiñeron con el anticuerpo específico contra SFRP1 y con anticuerpos específicos que reconocen neuronas (NeuN), GFAP (astrocitos) o lectina de tomate (microglía). Se observó colocalización de SFRP1 con GFAP o con lectina de tomate en células localizadas en la proximidad de las placas presentes en este ratón. Estos resultados indican que la proteína SFRP1 es sintetizada por astrocitos reactivos y microglía activada que se encuentra alrededor de las placas seniles.
La expresión de sfrpl está aumentada en enfermos con EA (Blalock et al. 2004 Proc Nati Acad Sci 101 , 2173-8). En ese estudio compararon los niveles de expresión de distintos ARNm en muestras de hipocampo de individuos controles y individuos con EA incipientes mediante análisis por "microarray". El gen sfrpl se encuentra entre la lista de genes cuyos niveles de ARNm están aumentados en individuos con EA incipiente.
El aumento en el ARNm de sfrpl se correlaciona con un aumento de los niveles de proteína en muestras de enfermos de EA. Muestras de corteza cerebral humana procedentes de individuos controles o pacientes con EA en estadio temprano (Braak lll-IV) y tardío (Braak V-VI) se homogeneizaron en tampón de lisis y Tritón X-100 al 1 %. La muestras se re-suspendieron en tampón de carga y se analizaron mediante electroforesis en geles de acrilamida al 12%, seguido de análisis mediante Western blot. Este análisis demostró que la proteína SFRP1 es más abundante en muestras de pacientes de EA que en individuos controles. Además, los niveles de proteína SFRP1 aumentan cuanto más severa es la enfermedad (Figura 6). En muestras de corteza cerebral de pacientes de EA se detectan, por inmunocitoquímica, acumulaciones muy claras de SFRP1 cuando otros marcadores de placas todavía no son visibles, lo que indica que su carga precede la formación de placas y por lo tanto es un marcador más temprano que otros marcadores de placas descritos hasta la fecha.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer que comprende las siguientes etapas: a) detectar y/o cuantificar el producto de expresión de una secuencia nucleotídica de un gen sfrpl en una muestra aislada;
b) comparar la cantidad detectada y/o cuantificada en la etapa (a) con una cantidad de referencia;
c) identificar cualquier desviación significativa en la comparación de datos de la etapa (b); y,
d) atribuir la desviación significativa identificada en la etapa (c) a la presencia de la enfermedad de Alzheimer o al riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer.
2. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según la reivindicación anterior donde la secuencia nucleotídica del gen sfrpl codifica para una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO: 1 .
3. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores donde la secuencia nucleotídica del gen sfrpl codifica para la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 .
4. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores donde la muestra aislada de la etapa (a) es un fluido biológico.
5. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según la reivindicación anterior donde el fluido biológico es líquido cefalorraquídeo, sangre, suero o plasma sanguíneo.
6. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según la reivindicación anterior donde el fluido biológico es suero sanguíneo.
7. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según la reivindicación 5 donde el fluido biológico es líquido cefalorraquídeo.
8. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según las reivindicaciones 1 a 3, donde la muestra aislada comprende células.
9. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según las reivindicaciones 1 a 3, donde la muestra aislada comprende un tejido.
10. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde el producto de expresión de una secuencia nucleotídica de un gen sfrpl es una secuencia aminoacídica con al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO: 1 .
1 1 . Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según la reivindicación 10 donde el producto de expresión de una secuencia nucleotídica de un gen sfrpl es la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 .
12. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde el producto de expresión es detectado por PCR.
13. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 donde el producto de expresión es detectado por electroforesis, inmunoensayo, cromatografía, tecnología de microarrays y/o espectrometría de masas.
14. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según la reivindicación 13 donde el producto de expresión es detectado por inmunoensayo.
15. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según la reivindicación 14 donde el inmunoensayo es un ELISA.
16. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según la reivindicación 13 donde el producto de expresión es detectado por espectrometría de masas.
17. Uso del producto de expresión de una secuencia nucleotídica de un gen sfrpl como marcador para la determinación del riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer, para determinar la presencia de la enfermedad de Alzheimer y/o para predecir la progresión de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer.
18. Uso de un kit que comprende cebadores y/o sondas que hibridan con la secuencia nucleotídica de un gen sfrpl que codifica para una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO: 1 , o que codifica para la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 , para determinar el riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer o para determinar la presencia de una enfermedad de Alzheimer o para predecir la progresión de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer, en una muestra aislada.
19. Uso de un kit que comprende anticuerpos que se unen específicamente a una secuencia aminoacídica codificada por la secuencia nucleotídica de un gen sfrpl donde dicha secuencia aminoacídica tiene al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO: 1 , o donde dicha secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 1 , para determinar el riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer o para determinar la presencia de una enfermedad de Alzheimer o para predecir la progresión de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer, en una muestra aislada.
PCT/ES2012/070226 2011-04-08 2012-04-03 Método de diagnóstico de la enfermedad de alzheimer que emplea sfrp1 como biomarcador Ceased WO2012136871A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201130560A ES2389199B1 (es) 2011-04-08 2011-04-08 Método de diagnóstico de la enfermedad de alzheimer que emplea sfrp1 como biomarcador.
ESP201130560 2011-04-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012136871A1 true WO2012136871A1 (es) 2012-10-11

Family

ID=46968437

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2012/070226 Ceased WO2012136871A1 (es) 2011-04-08 2012-04-03 Método de diagnóstico de la enfermedad de alzheimer que emplea sfrp1 como biomarcador

Country Status (2)

Country Link
ES (1) ES2389199B1 (es)
WO (1) WO2012136871A1 (es)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103951743A (zh) * 2014-04-25 2014-07-30 陈秀定 人sfrp1变体及其应用
EP3696192A1 (en) * 2019-02-15 2020-08-19 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Therapeutic target and monoclonal antibodies against it for the diagnosis and treatment of alzheimer´s disease

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003028543A2 (en) * 2001-10-03 2003-04-10 Pfizer Products Inc. Nucleic acid molecules, polypeptides and uses therefor, including diagnosis and treatment of alzheimer's disease
US20070082350A1 (en) * 2005-02-09 2007-04-12 Philip Landfield Assay and method for diagnosing and treating alzheimer's disease

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003028543A2 (en) * 2001-10-03 2003-04-10 Pfizer Products Inc. Nucleic acid molecules, polypeptides and uses therefor, including diagnosis and treatment of alzheimer's disease
US20070082350A1 (en) * 2005-02-09 2007-04-12 Philip Landfield Assay and method for diagnosing and treating alzheimer's disease

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOVOLENTA, P. ET AL.: "Beyond WNT inhibition: new functions of secreted frizzled-related proteins in development and disease", JOURNAL OF CELL SCIENCE., vol. 121, no. 6, 15 March 2008 (2008-03-15), pages 737 - 746, XP002501144, DOI: doi:10.1242/JCS.026096 *
HUMPEL, C. ET AL.: "Identifying and validating biomarkers for Alzheimer's disease", TRENDS IN BIOTECHNOLOGY., vol. 29, no. 1, 1 January 2011 (2011-01-01), pages 26 - 32, XP027571104 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103951743A (zh) * 2014-04-25 2014-07-30 陈秀定 人sfrp1变体及其应用
EP3696192A1 (en) * 2019-02-15 2020-08-19 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Therapeutic target and monoclonal antibodies against it for the diagnosis and treatment of alzheimer´s disease
WO2020165453A1 (en) * 2019-02-15 2020-08-20 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Therapeutic target and monoclonal antibodies against it for the diagnosis and treatment of alzheimer´s disease

Also Published As

Publication number Publication date
ES2389199B1 (es) 2013-09-17
ES2389199A1 (es) 2012-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Koutsodendris et al. Neuronal APOE4 removal protects against tau-mediated gliosis, neurodegeneration and myelin deficits
Covell et al. Novel conformation‐selective alpha‐synuclein antibodies raised against different in vitro fibril forms show distinct patterns of Lewy pathology in Parkinson's disease
Gompers et al. Germline Chd8 haploinsufficiency alters brain development in mouse
US20210325409A1 (en) Biomarkers and uses thereof for diagnosing the silent phase of alzheimer&#39;s disease
US10358677B2 (en) Method for treating kidney disease with a SLIT2-binding extracellular domain of ROBO2
ES2674526T3 (es) Métodos y composiciones para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer
US20220057409A1 (en) Combinatorial temporal biomarkers and precision medicines with detection and treatment methods for use in neuro injury, neuro disease, and neuro repair
ES2955992T3 (es) Método para evaluar una sinucleinopatía
US20190367623A1 (en) Methods of treating neurodegenerative diseases by inducing disease-associated microglia (dam) cells
KR102604430B1 (ko) 각막 내피 세포의 기능 부전 진단용 바이오마커
ES2689753T3 (es) Fármaco de diagnóstico y método de diagnóstico para la enfermedad de Alzheimer
BR112019024138A2 (pt) Método para determinar uma presença ou ausência em uma amostra de um primeiro agregado de proteínas mal enoveladas
ES2873509T3 (es) Biomarcadores de neurotraumatismo y traumatoma de astrocitos
Medina et al. Neurotransmission-related gene expression in the frontal pole is altered in subjects with bipolar disorder and schizophrenia
ES2975228T3 (es) Derivados de GFAP para el diagnóstico de accidente cerebrovascular
He et al. Serum β-amyloid peptide levels spike in the early stage of Alzheimer-like plaque pathology in an APP/PS1 double transgenic mouse model
ES2389199B1 (es) Método de diagnóstico de la enfermedad de alzheimer que emplea sfrp1 como biomarcador.
ES3060495T3 (en) Circulating mirnas as biomarkers for diagnosis of mild cognitive impairment and alzheimer¿s disease
Kawai et al. Heterogeneity of microglial proton channel in different brain regions and its relationship with aging
US20140255927A1 (en) Rna splicing alterations and u1 small nuclear ribonucleoproteins in neurodegenerative diseases
Combi et al. Genetic architecture and molecular, imaging and prodromic markers in dementia with Lewy bodies: state of the art, opportunities and challenges
Aslam et al. Segregation and potential functional impact of a rare stop-gain PABPC4L variant in familial atypical Parkinsonism
US20260063642A1 (en) Methods for Assaying a Bodily Sample of a Subject
Xiong et al. The mtDNA-derived lncMtDloop promotes mitochondrial homeostasis maintenance and implications in AD
WO2025125705A1 (es) Biomarcadores nucleares de la enfermedad de alzheimer, sus usos y métodos

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12767254

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12767254

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1