WO2012133997A1 - 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체 및 이를 이용한 유전자 치료 - Google Patents

폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체 및 이를 이용한 유전자 치료 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a biodegradable polysorbitol-based osmotically active transporter (PSOAT) and gene therapy using the same as a gene carrier.
  • PSOAT biodegradable polysorbitol-based osmotically active transporter
  • the biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter of the present invention induces efficient cellular inflow by osmotic activity by sorbitol skeleton and proton sponge effect by polyethyleneimine (PEI) skeleton, thereby significantly improving transduction efficiency.
  • PEI polyethyleneimine
  • it exhibits high binding capacity to DNA, effectively protects DNA from nucleases, physicochemical properties and very low cytotoxicity suitable for use as gene carriers. Therefore, the biodegradable polysorbitol osmotic active transporter of the present invention can be usefully used as a safe and effective gene transporter for gene therapy.
  • Gene therapy is the treatment of diseases by delivering the genes to the desired organs in the body so that new proteins are expressed in the cells, and not by treating the symptoms of the disease, but by treating the cause of the disease and removing it. .
  • Gene therapy can have good selectivity over treatment with common drugs and can be applied over long periods of time to improve the rate and rate of treatment of diseases that are difficult to control with other therapies.
  • DNA is vulnerable to hydrolysis by enzymes in vivo and has a low efficiency of influx into cells.
  • a gene delivery vehicle that safely delivers a therapeutic gene to a desired target cell to achieve high expression efficiency ( Development of gene carriers is essential.
  • Gene carriers should be very low or non-toxic and capable of delivering genes to the cells of interest selectively and effectively. These gene carriers can be largely divided into viral and non-viral. Until recently, viral vectors with high transduction efficiency were used as gene carriers. However, viral vectors such as retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses are not only complicated in their manufacturing process, but can also be immunogenic, potentially infectious, prone to inflammation, and nonspecific DNA. Due to the safety issues such as the insertion of and the size of the acceptable DNA is limited to apply to the human body is a lot. As a result, non-viral vectors have been in the spotlight as a substitute for viral vectors.
  • Non-viral vectors have the advantages of repeat administration with minimal immune response, specific delivery to specific cells, good storage stability, and easy mass production.
  • Examples of such nonviral vectors include cationic liposomes, N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA), alkylammonium (alkylammonium), cationic cholesterol derivatives, gramicidin, and the like.
  • DOTMA N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride
  • alkylammonium alkylammonium
  • cationic cholesterol derivatives cationic cholesterol derivatives
  • gramicidin and the like.
  • cationic polymer in the non-viral vector has attracted a lot of attention because it can form a complex through the negatively charged DNA and ionic bonds.
  • cationic polymers include poly-L-lysine (PLL), poly (4-hydroxy-L-proline ester), polyethyleneimine (PEI), poly [ ⁇ - (4-aminobutyl) -L-glycolic acid], Polyamidoamine dendrimers, poly [N, N '-(dimethylamino) ethyl] methacrylate (PDMAEMA), and the like. They compress the DNA to form nanoparticles, protecting the DNA from enzymatic degradation and allowing it to quickly penetrate into the cell and escape from the endosome.
  • Most non-viral vectors have advantages such as biodegradability, low toxicity, non-immunogenicity, and ease of use, compared to viral vectors, but have problems such as relatively low transduction efficiency and limited particle size.
  • cationic polymers used as non-viral vectors show high transduction efficiency in vitro, where serum concentrations are low, but in vivo environments, cationic polymer / gene complexes are affected by various factors present in serum. There is a problem that the transduction efficiency of is severely inhibited and the influx of genes into the cell is not smooth. This is because excessive positive charges occur on the surface of the cationic polymer / gene complex in vivo, causing nonspecific interaction with plasma proteins and blood components.
  • the transduction efficiency of the cationic polymer is significantly reduced in vivo in which a large amount of serum is present, but not in an environment in which serum-free medium or serum is present in a very low concentration, and when applied in vivo, the lung Therapeutic application of the cationic polymer is inevitably limited because it can cause aggregation, accumulation in the liver and spleen, and further opsonization and removal by the reticuloendothelial system.
  • PEI Polyethyleneimine
  • which is the most widely studied non-viral vector also has a problem of low transduction efficiency in vivo, and low expression efficiency of gene due to high cytotoxicity and low blood compatibility.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter.
  • Still another object of the present invention is to provide a gene transfer complex in which a therapeutic gene is bound to the biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for gene therapy containing the gene delivery complex as an active ingredient.
  • the present invention provides a biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) which is a copolymer of polyethyleneimine (PEI) and sorbitol derivatives.
  • PSOAT biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter
  • Biodegradable polysorbitol osmotic active carriers can be prepared by Michael addition reaction of polyethyleneimine and sorbitol derivatives.
  • polyethylenimine is a cationic polymer having primary, secondary and tertiary amino groups and a molar mass of 1,000 to 100,000 g / mol.
  • Polyethyleneimine effectively compresses the plasmid DNA into colloidal particles, and has high transduction efficiency due to the buffering ability of pH reactivity to effectively transfer genes to various cells in vitro and in vivo.
  • polyethyleneimine may be linear represented by the following formula (1) or branched (branched) represented by the following formula (2), the molecular weight is low molecular weight, preferably 50 to 10,000 Da in consideration of cytotoxicity to be.
  • Polyethylenimine is soluble in water, alcohol, glycol, dimethylformamide, tetrahydrofuran, esters, and the like, and insoluble in high molecular weight hydrocarbons, oleic acid, and diethyl ether.
  • the polyethyleneimine acts as a Michael donor in the Michael addition reaction with the sorbitol derivative, and as a result, has a role of imparting high transduction efficiency, low cytotoxicity and proton sponge effect to the synthesized copolymer. In charge.
  • the term “sorbitol derivative” refers to any compound including a sorbitol sugar alcohol skeleton and having an acrylate group or a methacrylate group in the sugar alcohol skeleton, which is modified in polyethyleneimine and finally obtained. Any one capable of providing a sorbitol skeleton can be used without limitation.
  • the sorbitol derivative acts as a Michael acceptor in the Michael addition reaction with polyethyleneimine, and consequently imparts hydrophilicity, biodegradability and osmotic activity to the synthesized copolymer, and in serum and freeze-drying. It also plays a role in increasing post-stability.
  • Sorbitol-based derivatives suitable for the present invention include sorbitol diacrylate (SDA), sorbitol dimethacrylate (SDM), sorbitol triacrylate (STA), sorbitol trimethacrylate (sorbitol). trimethacrylate (STM), sorbitol tetracrylate (STE), sorbitol tetramethacrylate (STE), sorbitol pentacrylate (SPA), sorbitol pentamethacrylate (SPM) Etc. may be used, and sorbitol dimethacrylate (molecular weight 318 Da) represented by the following Chemical Formula 3 may be preferably used.
  • SDA sorbitol diacrylate
  • SDM sorbitol dimethacrylate
  • STA sorbitol triacrylate
  • trimethacrylate (STM) trimethacrylate
  • STE sorbitol tetrac
  • polysorbitol-based osmotic active transporter refers to a copolymer formed by Michael addition reaction between an amine group of polyethyleneimine and an acrylate group or methacrylate group of a sorbitol derivative.
  • the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention has a structure in which 0.9 to 0.1 molecules of polyethyleneimine are bonded to 0.1 to 0.9 molecules of sorbitol derivatives.
  • the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention exhibits significantly improved transduction efficiency due to efficient induction into cells due to the osmotic activity by the sorbitol skeleton and the proton sponge effect by the polyethyleneimine (PEI) skeleton, Very low cytotoxicity can be useful for gene therapy as a gene carrier.
  • the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention preferably has a molecular weight in the range of 1,000 to 100,000 Da for effective gene delivery.
  • polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention is preferred for effective gene delivery having a zeta potential in the range of 1 to 50 mV.
  • PSOAT polysorbitol-based osmotic active transporter
  • the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) according to the present invention may be represented by the following formula (4).
  • x is an integer between 1 and 200
  • n is an integer between 1 and 500.
  • the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of Formula 4 is a Michael between an amine group of a linear polyethyleneimine represented by Formula 1 and an acrylate group or methacrylate group of sorbitol dimethacrylate represented by Formula 3 Copolymers prepared by addition reactions.
  • the present invention provides a method for preparing a biodegradable polysorbitol osmotic active carrier (PSOAT) comprising the step of forming a copolymer by Michael addition reaction between polyethyleneimine and sorbitol derivatives. .
  • PSOAT biodegradable polysorbitol osmotic active carrier
  • step 1) is performed by dissolving each of polyethyleneimine and sorbitol derivatives in a reaction solvent for the Michael addition reaction between polyethyleneimine as a Michael donor and an acrylate or methacrylate-containing sorbitol derivative as the Michael acceptor. Preparing a solution.
  • Sorbitol derivatives suitable for the present invention can be used without limitation as long as they contain an acrylate group or a methacrylate group, and such sorbitol derivatives include sorbitol diacrylate (SDA), sorbitol dimethacrylate (SDM), and sorbitol triacrylate.
  • sorbitol dimethacrylate (molecular weight 318 Da) is used.
  • Polyethyleneimines suitable for the present invention may be used linear or branched having a low molecular weight of 50 to 10,000 Da.
  • any reaction solvent may be appropriately selected and employed as long as it can react with or dissolve polyethyleneimine and sorbitol derivatives. Examples of such a reaction solvent include dimethyl sulfoxide, anhydrous methyl alcohol, ethyl alcohol, dimethylformamide, dioxane and the like.
  • Step 2) is a step of performing a Michael addition reaction between the amine group of the polyethylenimine and the acrylate group of the sorbitol derivative by adding the sorbitol derivative reaction solution while stirring the polyethyleneimine reaction solution prepared in step 1).
  • the Michael addition reaction is preferably performed at 40 to 100 ° C. for 1 to 24 hours.
  • the reaction molar ratio (N / P ratio) of polyethyleneimine and sorbitol derivatives is in the range of 1: 0.1 to 1:10, preferably 1: 1.
  • 1M sorbitol dimethacrylate reaction solution is slowly added to 4M polyethyleneimine reaction solution under stirring for 2 hours at 4 ° C, followed by reaction at 80 ° C for 12 hours to add Michael. Do this.
  • the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) thus separated may be freeze-dried and stored at -25 ° C.
  • the freeze-drying may be performed using a freeze-drying method or a freeze-dryer which are commonly used.
  • PSOAT biodegradable polysorbitol osmotic active carrier
  • Polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) prepared according to the method of the present invention was analyzed by gel permeation chromatography.
  • the molecular weight of the PSOAT copolymer was 11,180 Da, and analyzed by 1 H NMR.
  • the chemical compositions of polyethyleneimine and sorbitol dimethacrylate were found to be 65.88 and 34.12 mol%, respectively (see Table 1).
  • the results indicate that the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) according to the present invention was effectively synthesized by the Michael addition reaction between polyethyleneimine and sorbitol dimethacrylate.
  • the present invention provides a gene delivery complex in which a therapeutic gene is bound to the biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT).
  • PSOAT biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter
  • the kind of therapeutic gene that can be bound to the biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention is not particularly limited, and any gene that can be delivered to a desired target and exerts a desired therapeutic effect according to the object of the present invention. Also included within the scope of the present invention.
  • genes that can be delivered in a complex form with the biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention include a normal gene of a therapeutic gene associated with a disease, a gene for inhibiting expression of a target protein, and an antisense polynucleotide. Genes in any RNA form, including large and small polynucleotides, ribozymes or siRNAs.
  • Therapeutic genes that can be bound to the biodegradable polysorbitol based osmotic active transporters (PSOAT) according to the present invention include DNA, single stranded RNA, double stranded RNA, ribozyme, DNA-RNA hybrids and antisense DNA (eg, antisense oligos). Nucleotides), among which siRNA is preferred.
  • the therapeutic gene it is preferable to react the therapeutic gene with the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) in a molar ratio of 1: 0.5 to 1: 100, preferably 1: 5 to 1:30. desirable.
  • PSOAT polysorbitol-based osmotic active transporter
  • the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) according to the present invention, the polysorbitol-based osmotic active transporter and DNA were reacted at various molar ratios.
  • 1: 0.5 or more the gene transfer complex (PSOAT / DNA) of the polysorbitol-based osmotic active transporter and DNA is most effectively formed (see FIG. 3A), and the DNA in the gene transfer complex is effectively prevented from attack by nuclease.
  • Protected see FIG. 3B
  • the gene delivery complex according to the present invention exhibits a relatively uniform particle size distribution (PDI: 2.5e-003) of an average of 150 to 250 nm (see FIG. 4B), as well as having a particle size suitable for use as a gene carrier. Rather, the surface charge exhibited a positive zeta potential of 15 to 35 mV (see FIG. 4C), confirming that it can effectively bind to the anion cell surface.
  • the gene delivery complex of the present invention showed a transduction efficiency several times to several hundred times higher than the polyethyleneimine (PEI 25K) treatment group used as a comparison group (see FIGS. 5A to 5C), and even in the presence of serum. It was confirmed that the transduction efficiency was maintained stably high transduction efficiency compared to the lipofectamine was sharply reduced (see Fig. 6).
  • PSOAT polysorbitol-based osmotic active transporter
  • This high transduction efficiency of the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) according to the invention is due to the buffering capacity of the copolymer.
  • the copolymer was used using an endosomal proton pump inhibitor (bafilomycin A1).
  • bafilomycin A1 an endosomal proton pump inhibitor
  • the transduction efficiency of the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) according to the present invention was drastically decreased after the treatment with batillomycin A1 (see FIG. 7A). This indicates that the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention can be effectively released from the endosome into the cytoplasm by the proton sponge effect.
  • the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) includes an osmotic active sorbitol backbone, impart an osmotic pressure to the cell membrane to purify the cell membrane, thereby promoting cell resorption by improving membrane permeability.
  • PCV packed cell volume
  • an osmotic inhibitor was treated to analyze the effect of osmotic activity on the transduction efficiency of the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) according to the present invention.
  • the transduction efficiency of the PSOAT / GL3 complex of the present invention significantly decreased as the treatment concentration of the osmotic inhibitor was increased (see FIGS. 8A to 8C). From the above results, it can be seen that the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) shows more improved transduction efficiency due to the osmotic activity by the sorbitol skeleton.
  • the molar ratio of PSOAT and green fluorescent protein (GFP) gene is 20: 1.
  • the gene delivery complex (PSOAT / GFP) was prepared, and then transfected into cells and analyzed by flow cytometry.
  • a significantly increased GFP signal was detected in the gene transfer complex (PSOAT / GFP) treatment group according to the present invention compared to the control group of the polyimine imine and GFP (PEI 25K / GFP) treatment group. It was confirmed that no cytotoxicity was observed (see FIG. 10).
  • the aerosol-administered gene delivery complex (PSOAT / GFP) prepared as described above was administered to the lungs of normal mice. After fluorescence microscopy of GFP signals in lungs extracted from mice, GFP signals were detected in all mice to which the gene delivery complex (PSOAT / GFP) of the present invention was administered, and in particular, a complex of polyethyleneimine and GFP (PEI). 25K / GFP), a higher GFP signal was detected (see FIG. 11).
  • the biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention exhibits high binding capacity to DNA, effectively protects DNA from nucleases, and is a spherical uniform particle size gene delivery complex suitable for use as a gene carrier. Not only can be formed, but also shows very low cytotoxicity in vitro and in vivo, and the transduction efficiency is very high, it can be usefully used as a gene carrier for gene therapy.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for gene therapy containing a gene transfer complex in which a therapeutic gene is bound to the biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) as an active ingredient.
  • PSOAT biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered together with a pharmaceutically acceptable carrier, and in the case of oral administration, in addition to the active ingredient, binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments , Fragrances and the like may be further included.
  • the pharmaceutical compositions of the invention may be used in combination with buffers, preservatives, analgesics, solubilizers, isotonic agents, stabilizers and the like.
  • the composition of the present invention may use a base, excipients, lubricants, preservatives and the like.
  • composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, in the case of oral administration, it may be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, they may be prepared in unit dosage ampules or in multiple dosage forms. It may be formulated into other solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, sustained release preparations and the like.
  • Suitable carriers, excipients, and diluents for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, Methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, preservatives and the like may be further included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • Routes of administration of the pharmaceutical compositions according to the invention are not limited to these, for example, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intestinal Sublingual, or topical administration is possible.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention can be formulated into suitable formulations using known techniques.
  • in oral administration it can be administered by mixing with an inert diluent or an edible carrier, sealed in hard or soft gelatin capsules, or pressed into tablets.
  • the active ingredient may be mixed with excipients and used in the form of intake tablets, buccal tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers and the like.
  • various formulations such as for injection and parenteral administration, can be prepared according to techniques known in the art or commonly used techniques.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment
  • an effective dose level means the type, severity, activity of the drug, Sensitivity to drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered in single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the invention provides an aerosol formulation of the pharmaceutical composition formulated to deliver a gene delivery complex in which a therapeutic gene is bound to a polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) to a target site via aerosol delivery.
  • PSOAT polysorbitol-based osmotic active transporter
  • Drug delivery via inhalation is one of the non-invasive methods, in particular gene delivery via aerosol delivery may be advantageously used for a wide range of treatment of lung disease. This is because the anatomical structure and location of the lung allows for an immediate and non-invasive approach and can be subject to topical application of the gene delivery system without affecting other organs. Therefore, when the gene delivery complex in which the biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention is bound to a lung disease, particularly a gene associated with lung cancer, is delivered to the lung in an aerosol manner, the disease may be prevented or prevented. You can expect a therapeutic effect.
  • PSOAT biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter
  • Methods of delivery of the pharmaceutical compositions according to the present invention may include oral and nasal inhalation methods, methods of facial masks or oral tubes, and methods of oxygen hoods for children that have been used to administer oxygen.
  • small particle aerosols are created by a nebulization process, which is carried out by a jet nebulizer.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared for aerosol delivery of the aqueous dispersant to the airways of an individual or animal.
  • aqueous dispersant to the airways of an individual or animal.
  • One of ordinary skill in the art will be able to readily determine appropriate dosages of aerosol formulations without undue experimentation.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention are administered to a patient or animal in a therapeutically effective amount, ie in an amount that eliminates or alleviates the disease by efficiently expressing the therapeutic gene. Dosage and dosage regimen will depend on the type of disease, the characteristics of the particular polysorbitol based copolymer / DNA complex, for example its therapeutic index, the patient, the patient's history and other factors.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the invention will typically be from about 0.01 to about 0.1 g / kg body weight.
  • the compositions and formulations may contain minor amounts of additives, such as substances that enhance isotonicity and chemical stability (eg, buffers, preservatives, and the like).
  • the present invention provides a gene transfer complex in which a therapeutic gene is bound to a biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT), and a disease or condition that can be prevented or treated by delivery of the therapeutic gene.
  • PSOAT biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter
  • a disease or condition that can be prevented or treated by delivery of the therapeutic gene.
  • a method of preventing or treating a disease or condition associated with a therapeutic gene comprising administering to a subject having a therapeutically effective amount.
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of the desired disease or condition by administration of the gene delivery complex according to the present invention.
  • treatment refers to any action by which administration of the gene delivery complex according to the present invention improves or advantageously alters the symptoms of the desired disease or condition.
  • administration means introducing a certain active ingredient into a patient in any suitable way, and the route of administration may be administered via any general route as long as the active ingredient can reach the target tissue.
  • Intraperitoneal administration intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, pulmonary administration, rectal administration and the like, but is not limited thereto.
  • subject means an animal including, but not limited to, humans, monkeys, cattle, horses, sheep, pigs, chickens, turkeys, quails, cats, dogs, mice, rats, rabbits, or guinea pigs. In the examples, it refers to a mammal, and in another embodiment, a human.
  • terapéuticaally effective amount as used in combination with an active ingredient in the present invention means an amount of a sustained glucagon conjugate effective to treat or prevent a subject disease or condition.
  • the biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention includes an osmotic active sorbitol backbone, thereby imparting osmotic pressure to the cell membrane, thereby promoting cell resorption through enhancement of membrane permeability, thereby exhibiting significantly improved transduction efficiency.
  • the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention exhibits high binding capacity to DNA, effectively protects DNA from nucleases, and exhibits physicochemical properties suitable for use as a gene transporter. Since it shows very low cytotoxicity in vivo, it can be usefully used as a gene carrier for gene therapy.
  • FIG 1 schematically shows a method for producing a biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) according to the present invention.
  • PSOAT biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter
  • PSOAT polysorbitol-based osmotic active transporter
  • Figure 3a is a result of analysis of the mobility of the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) and the gene transfer complex (PSOAT / DNA) prepared by reacting the DNA in various molar ratios by agarose gel electrophoresis.
  • PSOAT polysorbitol-based osmotic active transporter
  • PSOAT / DNA gene transfer complex
  • 3b is a result showing that the gene transfer complex (PSOAT / DNA) prepared by reacting the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) and DNA of various molar ratios of the present invention can effectively protect DNA from nucleases.
  • lane 1 is a DNA marker
  • lane 2 is a DNase I untreated plasmid DNA (pGL3-control)
  • lane 3 is a DNase I treated plasmid DNA (pGL3-control)
  • lane 4 is a DNase I untreated PSOAT / pGL3 complex
  • lane 5 shows DNase I treated PSOAT / pGL3 complex.
  • Figure 4a is a transmission electron microscope (Transmission Electron Microscopy, TEM) of the morphology of the gene delivery complex (PSOAT / DNA) prepared by reacting the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention in various molar ratios Result (the bar represents 200 nm).
  • TEM Transmission Electron Microscopy
  • Figure 4b is a result of analyzing the particle size of the gene delivery complex (PSOAT / DNA) prepared by reacting the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention in various molar ratios according to the presence or absence of serum.
  • PSOAT polysorbitol-based osmotic active transporter
  • Figure 4c is the result of measuring the zeta potential of the gene transfer complex (PSOAT- / DNA) prepared by reacting the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) and DNA of various molar ratios of the present invention.
  • 5A is an A549 cell line; 5B is a HeLa cell line;
  • FIG. 5C is a result for H322 cell line, in which RLU stands for 'relative light unit' and indicates the degree of luminescence.
  • Figure 7a shows the buffering capacity (bafilomycin) A1 of the gene delivery complex (PSOAT / DNA) prepared by reacting the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) and DNA in various molar ratios. It is the result of investigation through processing.
  • FIG. 7B shows the packed cell volume of the osmotic activity of the gene delivery complex (PSOAT / DNA) prepared by reacting the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) and DNA in a molar ratio of 20: 1.
  • FIG. PCV is measured and confirmed.
  • FIG. 8a to 8c is a result of examining the effect of the osmotic pressure on the transduction efficiency of the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention
  • Figure 8a is one hour after the osmotic inhibitor treatment
  • Figure 8b is two hours
  • FIG. 8C shows the result after 4 hours.
  • FIG. 9A to 9C show the cytotoxicity of the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention in various cells at various concentrations, and FIG. 9A shows an A549 cell line; 9B is a HeLa cell line; And FIG. 9C is the result for H322 cell line.
  • PSOAT polysorbitol-based osmotic active transporter
  • Figure 11 shows the expression of GFP in vivo after aerosol administration to the lungs of a gene delivery complex (PSOAT / GFP) prepared by reacting the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) and GFP in a molar ratio of 20: 1. Is the result of analysis (magnification: 200 *, scale bar shows 50 micrometers).
  • PSOAT polysorbitol-based osmotic active transporter
  • the biodegradable polysorbitol based osmotic active transporter (PSOAT) according to the present invention is Michael, a slight modification of the method reported in Arote RB, et al., Bioconjug. Chem. 2009, 20 (12): 2231-41. It was synthesized according to the addition reaction (Fig. 1).
  • LMW-PEI low molecular weight polyethyleneimine
  • SDM sorbitol dimethacrylate
  • PSOAT polysorbitol-based osmotic active transporter
  • the mobility of the DNA was completely delayed when the molar ratio of the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention to the plasmid DNA is 1: 0.5 or more, which is the polysorbitol of the present invention.
  • PSOAT polysorbitol-based osmotic active transporter
  • Systemic osmotic active transporter effectively condensed the plasmid DNA to form a gene transfer complex (PSOAT / DNA).
  • the control unreacted plasmid DNA moved through the gel without any delay.
  • the gene delivery complex (PSOAT / DNA) solution prepared by reacting polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) and DNA in a molar ratio of 10: 1 in Example ⁇ 2-1> 4 ⁇ l or 4 ⁇ l of unreacted plasmid DNA solution 1 ⁇ l of DNase I (2 units) or 1 ⁇ l of DNase / Mg 2+ digestion buffer (50 mM TrisCl, pH 7.6 and 10 mM MgCl 2 ) containing PBS (phosphate-buffered saline) was added and incubated with stirring at 100 rpm for 30 minutes at 37 ° C.
  • PSOAT polysorbitol-based osmotic active transporter
  • Example ⁇ 2-1> a transmission electron microscope (TEM) of the form of a gene delivery complex (PSOAT / DNA) prepared by reacting a polysorbitol-based osmotic active transporter with DNA at a molar ratio of 20: 1 was used. (LIBRA 120, Carl Zeiss, Germany). In addition, the gene transfer complex (PSOAT / DNA) prepared above was freeze-dried and its form was observed by TEM.
  • TEM transmission electron microscope
  • the gene delivery complex (PSOAT / DNA) according to the present invention is more effective than the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) and plasmid DNA compared to the PEI 25K / DNA complex used as a comparison group It was condensed and found to have a uniform spherical compressed structure (top panel).
  • the PSOAT / DNA complex of the present invention maintained its structural integrity and stability even after freeze-drying. (Bottom panel of FIG. 4A), which is due to the cryoprotective function by the sorbitol backbone in the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) according to the present invention.
  • Particle size of the gene delivery complex is an important factor for the complex to access and pass through the target site and is essential for the cellular influx of the complex. Since most gene transfer complexes are introduced into cells by endocytosis or pinocytosis, the size of the complex is required to be below a certain level for optimal intracellular entry. Therefore, using a dynamic light scattering spectrophotometer (ELS8000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan) at a molar ratio of 20: 1 in the presence of various concentrations of the gene delivery complex prepared in various molar ratios in serum-free conditions and various concentrations of serum The particle size of the prepared gene delivery complexes was measured. At this time, the scattering angle (scattering angle) was set to 90 ° and 20 °.
  • ELS8000 dynamic light scattering spectrophotometer
  • the gene delivery complex (PSOAT / DNA) of the present invention was averaged between 150 and 250 nm with or without serum.
  • the positive surface charge of the gene delivery complex is essential for binding to the anion cell surface, which facilitates the influx of the complex into the cell.
  • the zeta potential of the gene transfer complex (PSOAT / DNA) prepared by reacting the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) and plasmid DNA in various molar ratios according to the present invention is a dynamic light scattering spectrophotometer (ELS8000, Otsuka). Electronics, Osaka, Japan).
  • the gene delivery complex prepared by reacting the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) with plasmid DNA at a molar ratio of 5: 1 showed the highest positive zeta potential.
  • This positive charge means that the negatively charged DNA is completely enclosed within the gene transfer complex, and the positive surface charge not only facilitates the entry of the gene transfer complex into the cell, but also between the particles. It causes the electrostatic repulsive force has the advantage of reducing the aggregation phenomenon between the particles.
  • Example 3 Transduction efficiency of polysorbitol osmotic active transporter
  • PSOAT polysorbitol-based osmotic activity transporter
  • RPMI 1640 (Gibco BRL) medium containing 10% FBS (HyClone), 100 ⁇ g / ml streptomycin and 100 U / ml penicillin medium was added to a 24-well plate and 1.5 ⁇ A549 cells, HeLA cells and H322 cells were added. Inoculation at a density of 10 5 / well was incubated for 18 hours in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • a pGL3 expression vector (5.3 kb, Promega) containing a luciferase gene induced by the SV40 promoter and an enhancer in the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) solution of the present invention is 5, 10, 20 and 30 After mixing in a molar ratio of light vortexing and incubated at room temperature for 30 minutes to prepare a gene delivery complex (PSOAT / GL3). The medium of the well plate was replaced with a serum-free medium or a medium containing 1 ⁇ g of the prepared gene transfer complex (PSOAT / GL3) and incubated in 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 4 hours.
  • PSOAT polysorbitol-based osmotic active transporter
  • a cell culture solution treated with PEI 25K (25 kDa, Sigma-Aldrich) and Lipofectamine (Lipofectamine) at the same concentration was used as a comparison group.
  • the medium of the well plate was replaced with fresh 10% FBS containing DMEM medium and again incubated in 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 48 hours.
  • 100 ⁇ l of cell lysis buffer was added to each well and left at ⁇ 20 ° C. for 24 hours, after which the medium was transferred to an e-tube and contained at 10,000 rpm. Centrifugation was performed for 15 minutes to obtain a supernatant. Luciferase activity of the obtained supernatant was measured by luciferase assay kit (Promega), and the transduction efficiency was expressed as the relative light unit (RLU) of 1 mg protein.
  • RLU relative light unit
  • the transduction efficiency of the formed gene transfer complex decreases as the reaction molar ratio of DNA and PEI 25K increases, whereas the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention is DNA It was confirmed that even if the reaction molar ratio with was higher than PEI 25K, the transduction efficiency was similar to that of lipofectamine.
  • the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention has excellent binding ability to DNA to effectively form nanoscale gene transfer complexes, thereby exhibiting high transduction efficiency.
  • This high transduction efficiency of the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) according to the invention is due to the buffering capacity of the copolymer.
  • the PSOAT / GL3 complex according to the present invention is a high level of transduction efficiency regardless of serum concentration Maintained.
  • these gene transfer complexes bind to serum proteins present in the blood due to cationicity, so that the gene transfer complex that is larger in size results in blockage of blood vessels or genes. It causes problems such as a decrease in expression efficiency.
  • the PSOAT / GL3 complex according to the present invention does not form aggregates even in the presence of serum and thus does not cause blockage of blood vessels or reduction of gene expression efficiency.
  • the buffering capacity of the copolymer was investigated. After incubation for 10 minutes with the addition of bafilomycin A1 (specific inhibitor of vacuolar type H + ATPase, 200 nM) diluted in DMSO to A549 cells cultured in a well plate as in Example ⁇ 3-1> Transduction efficiency was measured in the same manner as above.
  • the gene delivery complex according to the present invention was prepared using a molar ratio of 1:20 and 1:30 DNA and PSOAT, and compared to the gene delivery complex prepared with a molar ratio of 1: 5 DNA and PEI 25K. Used.
  • the transduction efficiency of the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) according to the present invention was drastically decreased after the treatment of bacillomycin A1, which is a high buffering capacity of the PSOAT of the present invention Therefore, it can be released from the endosome quickly by the proton sponge effect and can be introduced into the cytoplasm.
  • PSOAT polysorbitol-based osmotic active transporter
  • the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention is a biodegradable gene transporter containing an osmotic active sorbitol backbone.
  • PSOAT polysorbitol-based osmotic active transporter
  • PCV packed cell volume
  • 293T cells were suspended in DMEM medium containing 10% FBS, and then various sorbitol contents (0.01, 0.03 and 0.05% by weight) were added to different concentrations (0.01, 0.03, 0.05, 1 and 5% by weight) of sorbitol or polymer backbone. PSOAT / DNA complexes were added. After incubating the culture mixture at 37 ° C. for 5 minutes, the cells were centrifuged in a mini-PCV tube for 1 minute to determine the volume change of the cells.
  • SC58236 COX-2 inhibitor, Sigma-Aldrich
  • SC58236 COX-2 inhibitor, Sigma-Aldrich
  • A549 cells were cultured as in Example ⁇ 3-1> and aliquoted at a concentration of 10 ⁇ 10 4 cells / well in 24-well plates.
  • the medium of the well plate was replaced with serum-free medium containing PSOAT / GL3 (1:20) and PEI 25K / GL3 (1: 5) complex at a concentration of 100 ⁇ g / ml, and then again at 37 ° C., 5 for 24 hours. Incubated in a% CO 2 incubator.
  • SC58236 initially dissolved in DMSO and then diluted in serum-free medium and prepared at various concentrations (0, 5, 10 and 30 ⁇ / l), was treated in the well plate and then treated for 37 hours for 1, 2 and 4 hours. C was incubated in a 5% CO 2 incubator. After removing the medium, 100 ⁇ l of cell lysis buffer was added to each well, and left at ⁇ 20 ° C. for 24 hours, and then the culture solution was transferred to an e-tube and 15 minutes at 10,000 rpm. Centrifugation was performed to obtain supernatant. Luciferase activity of the obtained supernatant was measured by luciferase assay kit (Promega), and the transduction efficiency was expressed as the relative luminescence (RLU) of 1 mg protein.
  • RLU relative luminescence
  • the transduction efficiency of the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention significantly decreased.
  • the transduction efficiency of the PSOAT / GL3 complex according to the present invention did not show any difference from the transduction efficiency of plasmid pGL3 at all analysis time points (1, 2 and 4 hours). This indicates that the transduction efficiency of PSOAT according to the present invention is completely lost by treatment with a high osmotic inhibitor.
  • the transduction efficiency of PEI 25K was found to be not significantly affected at all analysis time despite the high concentration of osmotic inhibitor.
  • the transduction efficiency of the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention is due to the high osmotic activity due to the presence of the osmotic active sorbitol.
  • the gene delivery complex prepared at various molar ratios of DNA and PSOAT was treated to various cells.
  • Cell viability was examined by cell proliferation assay (Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay).
  • A549 (human lung adenocarcinoma cell (ATCC) and H322 (human lung cancer cell, ATCC) cells are in RPMI 1640 (Gibco BRL, Paris, France) medium
  • HeLa (human cervical carcinoma cell (ATCC) cells are DMEM (Dulbecco's) Inoculated in modified Eagle medium, Gibco BRL) medium and incubated in 37 °C, 5% CO 2 incubator.
  • 10% fetal calf serum FBS, HyClone, Logan, UT, USA
  • 100 ⁇ g / ml streptomycin and 100 U / ml penicillin were added to all the medium.
  • the medium of the well plate was then replaced with a growth medium containing 20 ⁇ l of cell titer reagent (Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent). After incubation for 3 hours, the metabolic activity of the cells was examined by measuring the absorbance of the well plate at 590 nm using an ELISA plate reader (GLR 1000, Genelabs Diagnostics, Singapore).
  • cell titer reagent Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent
  • PSOAT polysorbitol-based osmotic active transporter
  • the plasmid pcDNA3.1 / CT-GFP (6.1 kb, Invitrogen) expressing the PSOAT of the present invention and the green fluorescent protein (GFP) were mixed in a molar ratio of 20: 1 to express a gene delivery complex (PSOAT / GFP).
  • PSOAT / GFP a gene delivery complex
  • the gene transfer complex (PEI 25K / GFP) prepared by mixing PEI 25K (25 kDa, Sigma-Aldrich) and the pcDNA3.1 / CT-GFP plasmid in the same molar ratio was used as a comparative group.
  • A549 cells were transfected with PSOAT / GFP and PEI 25K / GFP complexes, respectively, and then washed with PBS and treated with trypsin. Transduction efficiency was assessed by recording the percentage (%) of GFP expressed from the cells using a FACS Calibur System (Becton-Dickinson, San Joes, Calif.). The experiment was repeated three times and 20 cells were counted in each experiment.
  • the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) and the plasmid pcDNA3.1 / CT-GFP (6.1 kb, Invitrogen) expressing GFP were mixed in a molar ratio of 20: 1 as in Example ⁇ 6-1>.
  • Gene transfer complexes (PSOAT / GFP) were prepared.
  • mice Six-week-old male C57BL / 6 mice (Breeding and Research Center) were stored in laboratory animal facilities maintaining a 12 hour night / day cycle at a temperature of 23 ⁇ 2 ° C. and a relative humidity of 50 ⁇ 20%. All experimental procedures in this study were approved by the Animal Care and Use Committee at Seoul National University (SNU-101211-2). In order to confirm the efficiency of gene transfer through the aerosol, a chamber (NOEC; Dusturbo, Seoul, Korea) exposing only the nasal area of the mouse was used, and four mice were randomly divided into two groups (two in each group) as follows. Divided into: PEI 25K / GFP complex treatment group; And PSOAT / GFP complex treatment group. The mice in each group were exposed to aerosols based on the method used in the literature to deliver 1 mg of DNA (HL Jiang et al., Biomaterials 30: 5844-5852, 2009).
  • mice in each group were sacrificed and lungs removed.
  • the extracted lungs were soaked in 4% paraformaldehyde and fixed for 12 hours, and then immersed in 30% sucrose solution and stored at 4 ° C. for 48 hours.
  • the immobilized lung was embedded with an OCT compound (Tissue-Tek OCT, Sakura) at a temperature of -20 ° C. or lower, and cut into a microtome to prepare 10 ⁇ m thick lung tissue sections.
  • OCT compound tissue-Tek OCT, Sakura
  • the prepared lung tissue sections were stained with hematoxylin and eosin (H & E) and then observed GFP signals with a confocal microscope (Zeiss LSM510, Carl Zeiss).
  • the biodegradable polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention includes an osmotic active sorbitol backbone, thereby imparting osmotic pressure to the cell membrane, thereby promoting cell resorption through enhancement of membrane permeability, thereby exhibiting significantly improved transduction efficiency.
  • the polysorbitol-based osmotic active transporter (PSOAT) of the present invention exhibits high binding capacity to DNA, effectively protects DNA from nucleases, and exhibits physicochemical properties suitable for use as a gene transporter. Since it shows very low cytotoxicity in vivo, it can be usefully used as a gene carrier for gene therapy.

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Abstract

본 발명은 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체 및 이를 유전자 전달체로 이용하는 유전자 치료에 관한 것이다. 본 발명의 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체는 소르비톨 골격을 포함하고 있어 세포막에 삼투압을 부여함으로써 막 투과도의 증가를 통해 현저히 향상된 형질도입 효율을 나타낸다. 또한 본 발명의 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체는 DNA에 높은 결합능을 나타내고 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호하며 유전자 전달체로 사용하기에 적합한 물리화학적 특성을 나타낼 뿐만 아니라, 시험관 내 및 생체 내에서 세포독성이 매우 낮아 유전자 치료를 위한 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체 및 이를 이용한 유전자 치료
본 발명은 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(polysorbitol-based osmotically active transporter, PSOAT) 및 이를 유전자 전달체로 이용하는 유전자 치료에 관한 것이다. 본 발명의 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체는 소르비톨 골격에 의한 삼투압 활성 및 폴리에틸렌이민(PEI) 골격에 의한 양성자 스폰지 효과(proton sponge effect)에 의해 효율적인 세포 내 유입을 유도하여 현저히 향상된 형질도입 효율을 나타낼 뿐만 아니라, DNA에 높은 결합능을 나타내고 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호하며, 유전자 전달체로 사용하기에 적합한 물리화학적 특성 및 매우 낮은 세포독성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체는 유전자 치료를 위한 안전하고 효과적인 유전자 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.
유전자 치료(gene therapy)는 치료 유전자를 체내의 원하는 장기로 전달하여 세포 내에서 새로운 단백질이 발현되도록 하여 질병을 치료하는 것으로, 질병의 증상을 치료하는 것이 아니고 질병의 원인을 치료하여 제거하는 방식이다. 유전자 치료는 일반적인 약물에 의한 치료에 비해서 우수한 선택성을 가질 수 있고 다른 치료법으로는 조절하기 힘든 질병의 치료율 및 치료 속도를 개선하여 오랜 기간 동안 적용할 수 있다. 치료 유전자로서 DNA는 생체 내 효소에 의한 가수분해에 취약하고 세포 내로 유입되는 효율이 낮기 때문에, 효과적인 유전자 치료를 위해서는 치료 유전자를 원하는 표적세포로 안전하게 전달하여 높은 발현효율의 달성을 가능케 하는 유전자 전달체(gene carrier)의 개발이 필수적이다.
유전자 전달체는 매우 독성이 낮거나 없어야 하며, 유전자를 선택적이고 효과적으로 원하는 세포에 전달할 수 있어야 한다. 이러한 유전자 전달체는 크게 바이러스성과 비바이러스성으로 나눌 수 있다. 최근까지 임상 실험에는 유전자 전달체로 형질도입 효율이 높은 바이러스성 벡터(viral vector)가 사용되었다. 그러나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노바이러스와의 복합체(adeno-associated virus)와 같은 바이러스성 벡터는 제조과정이 복잡할 뿐만 아니라, 면역원성, 감염 가능성, 염증 유발, 비특이적 DNA의 삽입 등의 안전성 문제와 수용할 수 있는 DNA의 크기가 제한적이라는 문제로 인해 인체에 적용하기엔 한계가 많다. 이에 현재는 비바이러스성 벡터(non-viral vector)가 바이러스성 벡터의 대용으로 각광을 받고 있다.
비바이러스성 벡터는 최소한의 면역반응으로 반복 투여할 수 있고, 특정 세포로의 특이적 전달이 가능하며, 저장 안정성이 우수하고, 대량 생산이 용이하다는 장점을 가지고 있다. 이러한 비바이러스성 벡터의 예로는 양이온성 리포좀(liposome) 계열로서 N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 알킬암모늄(alkylammonium), 양이온성 콜레스테롤 유도체(cationic cholesterol derivatives), 그라미시딘(gramicidin) 등이 있다.
최근 비바이러스성 벡터 중 양이온성 고분자가 음전하를 띠는 DNA와 이온결합을 통한 복합체를 형성할 수 있기 때문에 많은 관심을 불러일으키고 있다. 이러한 양이온성 고분자에는 폴리-L-라이신(PLL), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스테르), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산], 폴리아미도아민 덴드리머, 폴리[N,N'-(다이메틸아미노)에틸]메타크릴레이트(PDMAEMA) 등이 포함된다. 이들은 DNA를 압축하여 나노입자를 형성함으로써 효소분해로부터 DNA를 보호하고, 빠르게 세포 내로 침투하여 엔도좀(endosome)에서 빠져나올 수 있도록 도와준다. 대부분의 비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터에 비해 생분해성, 낮은 독성, 비면역원성, 사용상의 간편함 등의 장점을 가지나, 상대적으로 낮은 형질도입 효율, 제한적인 입자 크기 등의 문제점을 가지고 있다.
특히, 비바이러스성 벡터로 사용되는 대부분의 양이온성 고분자는 혈청 농도가 낮은 환경인 시험관 내에서는 높은 형질도입 효율을 나타내지만, 생체 내 환경에서는 혈청에 존재하는 각종 인자에 의하여 양이온성 고분자/유전자 복합체의 형질도입 효율이 심각하게 저해되어 유전자의 세포 내 유입이 원활하지 않다는 문제점이 있다. 이는 생체 내에서는 양이온성 고분자/유전자 복합체의 표면에 과도한 양전하가 발생하여 혈장 단백질 및 혈액 구성성분과의 비특이적 상호작용이 유발되기 때문이다. 따라서, 시험관 내의 무혈청 배지 또는 혈청이 매우 낮은 농도로 존재하는 환경이 아닌, 다량의 혈청이 존재하는 생체 내에서는 양이온성 고분자의 형질도입 효율이 현저히 저하되며, 이를 생체 내에 그대로 적용하는 경우에는 폐, 간 및 비장에서의 응집, 축적과, 나아가 망상내피계에 의한 옵소닌화(opsonization) 및 제거를 유발할 수 있기 때문에, 상기 양이온성 고분자의 치료적 적용은 크게 제한되지 않을 수 없다. 비바이러스성 벡터로서 가장 광범위하게 연구되고 있는 폴리에틸렌이민(PEI) 역시 생체 내 형질도입 효율이 현저히 떨어지며, 높은 세포독성 및 낮은 혈액 적합성으로 인한 유전자의 낮은 발현효율 등의 문제점을 갖고 있다.
따라서, 기존의 비바이러스성 벡터의 장점은 그대로 유지하면서 형질도입 효율을 증강시킨 유전자 전달체의 개발이 절실히 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 세포독성은 낮으면서 높은 형질도입 효율을 나타내는 유전자 전달체를 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)과 소르비톨계 유도체(sorbitol-based derivative)의 마이클 부가반응(Michael addition)에 의해 제조한 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(polysorbitol-based osmotically active transporter, PSOAT)가 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성을 나타내면서 소르비톨 골격에 의한 삼투압 활성 및 폴리에틸렌이민 골격에 의한 양성자 스폰지 효과에 의해 현저히 향상된 형질도입 효율을 나타냄을 발견하고, 상기 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체가 유전자 치료를 위한 유전자 전달체로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 유전자 전달체로서 세포독성을 나타내지 않으면서 형질도입 효율이 현저히 향상된 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체에 치료 유전자를 결합시킨 유전자 전달 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 전달 복합체를 유효성분으로 함유하는 유전자 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서, 본 발명은 폴리에틸렌이민(PEI)과 소르비톨계 유도체의 공중합체인 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)를 제공한다.
본 발명에 따른 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 폴리에틸렌이민과 소르비톨계 유도체의 마이클 부가반응에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에서 용어, "폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)"은 일차, 이차 및 삼차 아미노기를 갖고, 1,000 내지 100,000 g/mol의 몰 질량을 갖는 양이온성 고분자이다. 폴리에틸렌이민은 플라스미드 DNA를 효과적으로 압축하여 콜로이드 입자로 만들며, pH 반응성의 완충능력으로 인한 높은 형질도입 효율을 가져 시험관 내 및 생체 내에서 유전자를 다양한 세포에 효과적으로 전달할 수 있다. 본 발명에서 폴리에틸렌이민은 하기 화학식 1로 표시되는 선형(linear) 또는 하기 화학식 2로 표시되는 분지형(branched)일 수 있으며, 그 분자량은 세포독성을 고려하여 저분자량, 바람직하게는 50 내지 10,000 Da이다. 폴리에틸렌이민은 물, 알코올, 글리콜, 다이메틸포름아마이드, 테트라하이드로퓨란, 에스테르류 등에 용해되고, 고분자량의 탄화수소류, 올레산(oleic acid), 다이에틸에테르에는 용해되지 않는다.
화학식 1
Figure PCTKR2011005955-appb-C000001
화학식 2
Figure PCTKR2011005955-appb-C000002
본 발명에서 폴리에틸렌이민은 소르비톨계 유도체와의 마이클 부가반응에서 마이클 공여체(Micheal donor)로 작용하고, 그 결과로서 합성된 공중합체에 높은 형질도입 효율, 낮은 세포독성 및 양성자 스폰지 효과를 부여하는 역할을 담당한다.
본 발명에서 용어, "소르비톨계 유도체"는 소르비톨 당알코올 골격을 포함하고 상기 당알코올 골격에 아크릴레이트기 또는 메타크릴레이트기를 갖는 임의의 모든 화합물로서, 폴리에틸렌이민에 수식되어 최종적으로 수득되는 공중합체에 소르비톨 골격을 부여할 수 있는 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명에서 소르비톨계 유도체는 폴리에틸렌이민과의 마이클 부가반응에서 마이클 수용체(Micheal acceptor)로 작용하고, 그 결과로서 합성된 공중합체에 친수성, 생분해성 및 삼투압 활성을 부여하고, 혈청 내 및 동결-건조 후 안정성을 증가시키는 역할을 담당한다.
본 발명에 적합한 소르비톨계 유도체로는 소르비톨 다이아크릴레이트(sorbitol diacrylate, SDA), 소르비톨 다이메타크릴레이트(sorbitol dimethacrylate, SDM), 소르비톨 트라이아크릴레이트(sorbitol triacrylate, STA), 소르비톨 트라이메타크릴레이트(sorbitol trimethacrylate, STM), 소르비톨 테트라아크릴레이트(sorbitol tetracrylate, STEA), 소르비톨 테트라메타크릴레이트(sorbitol tetramethacrylate, STEM), 소르비톨 펜타아크릴레이트(sorbitol pentacrylate, SPA), 소르비톨 펜타메타크릴레이트(sorbitol pentamethacrylate, SPM) 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 하기 화학식 3으로 표시되는 소르비톨 다이메타크릴레이트(분자량 318 Da)가 사용될 수 있다.
화학식 3
Figure PCTKR2011005955-appb-C000003
본 발명에서 용어, "폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)"는 폴리에틸렌이민의 아민기와 소르비톨계 유도체의 아크릴레이트기 또는 메타크릴레이트기 사이의 마이클 부가반응에 의해 형성된 공중합체를 지칭한다. 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 0.1 내지 0.9분자의 소르비톨계 유도체에 0.9 내지 0.1분자의 폴리에틸렌이민이 결합된 형태가 반복된 구조를 갖는다. 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 소르비톨 골격에 의한 삼투압 활성 및 폴리에틸렌이민(PEI) 골격에 의한 양성자 스폰지 효과로 인해 세포 내 유입이 효율적으로 유도되어 현저히 향상된 형질도입 효율을 나타내고, 세포독성이 매우 낮아 유전자 전달체로서 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 효과적인 유전자 전달을 위해 1,000 내지 100,000 Da 범위의 분자량을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 1 내지 50 mV 범위의 제타 전위(zeta potential)를 갖는 것이 효과적인 유전자 전달을 위해 바람직하다. 상기 범위의 물리화학적 특성을 나타낼 때, 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 유전자 전달체로서 세포의 엔도좀(endosome) 내에 효과적으로 유입될 수 있다.
발명의 구체적인 실시양태로서, 본 발명에 따른 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 하기 화학식 4로 표시될 수 있다.
화학식 4
Figure PCTKR2011005955-appb-C000004
상기 화학식 4에서, x는 1 내지 200 사이의 정수이고, n은 1 내지 500 사이의 정수이다.
상기 화학식 4의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 상기 화학식 1로 표시되는 선형의 폴리에틸렌이민의 아민기와 화학식 3으로 표시되는 소르비톨 다이메타크릴레이트의 아크릴레이트기 또는 메타크릴레이트기 사이의 마이클 부가반응에 의해 제조된 공중합체이다.
발명의 다른 양태로서, 본 발명은 폴리에틸렌이민과 소르비톨계 유도체 사이의 마이클 부가반응에 의해 공중합체를 형성하는 단계를 포함하는, 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법은,
1) 폴리에틸렌이민과 소르비톨계 유도체 각각을 반응용매에 용해시키는 단계;
2) 소르비톨계 유도체 용액을 폴리에틸렌이민 용액에 첨가하여 마이클 부가반응을 수행하는 단계; 및
3) 반응물로부터 형성된 공중합체를 분리하여 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
구체적으로, 단계 1)은 마이클 공여체로서 폴리에틸렌이민과 마이클 수용체로서 아크릴레이트기 또는 메타크릴레이트기 함유 소르비톨계 유도체 사이의 마이클 부가반응을 위해, 폴리에틸렌이민과 소르비톨계 유도체 각각을 반응용매에 용해시켜 반응용액을 제조하는 단계이다. 본 발명에 적합한 소르비톨계 유도체로는 아크릴레이트기 또는 메타크릴레이트기를 함유하는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 이러한 소르비톨계 유도체에는 소르비톨 다이아크릴레이트(SDA), 소르비톨 다이메타크릴레이트(SDM), 소르비톨 트라이아크릴레이트(STA), 소르비톨 트라이메타크릴레이트(STM), 소르비톨 테트라아크릴레이트(STEA), 소르비톨 테트라메타크릴레이트(STEM), 소르비톨 펜타아크릴레이트(SPA), 소르비톨 펜타메타크릴레이트(SPM) 등이 포함된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 소르비톨 다이메타크릴레이트(분자량 318 Da)를 사용한다. 본 발명에 적합한 폴리에틸렌이민은 50 내지 10,000 Da의 저분자량을 갖는 선형 또는 분지형인 것이 사용될 수 있다. 본 발명에 사용가능한 반응용매는 폴리에틸렌이민과 소르비톨계 유도체와 반응하거나 이들을 분해하지 않으면서 이들을 용해시킬 수 있는 것이라면 임의의 반응용매를 적절히 선택하여 채용할 수 있다. 이러한 반응용매의 예로는 다이메틸설폭사이드, 무수 메틸알코올, 에틸알코올, 다이메틸포름아마이드, 다이옥산 등을 들 수 있다.
단계 2)는 단계 1)에서 제조된 폴리에틸렌이민 반응용액을 교반하면서 소르비톨계 유도체 반응용액을 첨가하여 폴리에틸렌이민의 아민기와 소르비톨계 유도체의 아크릴레이트기 사이의 마이클 부가반응을 수행하는 단계이다. 이 단계에서 마이클 부가반응은 40 내지 100℃에서 1 내지 24시간 동안 수행하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 마이클 부가반응에서 폴리에틸렌이민과 소르비톨계 유도체의 반응 몰비(N/P ratio)는 1:0.1 내지 1:10의 범위, 바람직하게는 1:1이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 4℃에서 2시간 동안 교반 하에 4 M의 폴리에틸렌이민 반응용액에 1 M의 소르비톨 다이메타크릴레이트 반응용액을 서서히 첨가한 후 80℃에서 12시간 동안 반응시켜 마이클 부가반응을 수행한다.
단계 3)은 단계 2)의 마이클 부가반응에 의해 형성된 공중합체를 분리하는 단계로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 수득된 반응물을 4℃에서 24시간 동안 증류수에 대해 투석(MWCO = 3500)을 수행하여 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)를 분리한다. 이렇게 분리된 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 동결-건조되어 -25℃에 보관될 수 있는데, 동결-건조는 통상적으로 사용되는 동결-건조 방법 또는 동결-건조기를 사용하여 수행될 수 있고, 그 결과 부산물이 제거된 점성을 갖는 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)를 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)를 겔 투과 크로마토그래피로 분석한 결과, PSOAT 공중합체의 분자량은 11,180 Da이고, 1H NMR로 분석한 결과, 상기 공중합체 내 폴리에틸렌이민 및 소르비톨 다이메타크릴레이트의 화학적 조성은 각각 65.88 및 34.12 mol%인 것으로 나타났다(표 1 참고). 또한, 수득된 공중합체 내 폴리에틸렌이민의 양성자에 대한 피크는 δ=2.22-2.55 ppm에서, 소르비톨 다이메타크릴레이트의 양성자에 대한 피크는 δ=5.8-6.8 ppm에서 검출되었다(도 2 참고). 상기 결과는 폴리에틸렌이민과 소르비톨 다이메타크릴레이트 사이의 마이클 부가반응에 의해 본 발명에 따른 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)가 효과적으로 합성되었음을 나타내는 것이다.
발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)에 치료 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체를 제공한다. 본 발명의 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)에 결합될 수 있는 치료 유전자의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 본 발명의 목적에 따라 원하는 표적에 전달되어 원하는 치료효과를 발휘할 수 있는 어떠한 유전자도 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와의 복합체 형태로 전달이 가능한 유전자로는 질병과 관련된 치료 유전자의 정상 유전자, 표적 단백질의 발현 억제 유전자, 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 크고 작은 폴리뉴클레오티드, 라이보자임이나 siRNA를 포함하는 임의의 RNA 형태의 유전자가 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)에 결합될 수 있는 치료 유전자는 DNA, 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 RNA, 리보자임, DNA-RNA 혼성체 및 안티센스 DNA(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드)일 수 있으며, 그 중에서도 siRNA가 바람직하다.
본 발명에 따른 유전자 전달 복합체의 효과적인 형성을 위해 치료 유전자와 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)를 1:0.5 내지 1:100, 바람직하게는 1:5 내지 1:30의 몰비로 반응시키는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 치료 유전자에 대한 응축능(condensation capability)을 조사하기 위해 다양한 몰비로 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체와 DNA를 반응시킨 결과, 이들의 몰비가 1:0.5 이상인 경우에 상기 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체와 DNA의 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA)가 가장 효과적으로 형성되고(도 3a 참고), 핵산분해효소에 의한 공격으로부터 유전자 전달 복합체 내 DNA가 효과적으로 보호되며(도 3b 참고), 형성된 유전자 전달 복합체가 구형 모양의 압축된 구조를 가짐을 확인하였다(도 4a 참고). 또한, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체는 평균 150 내지 250 nm의 상대적으로 균일한 입자 크기 분포(PDI:2.5e-003)를 나타내어(도 4b 참고) 유전자 전달체로 사용되기에 적합한 입자 크기를 가질 뿐만 아니라, 표면 전하가 15 내지 35 mV의 양성 제타 전위(zeta potential)를 나타내어(도 4c 참고) 음이온 세포 표면에 효과적으로 결합할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명에 따른 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 형질도입 효율을 조사하기 위해 다양한 몰비로 DNA와 반응시켜 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA)를 형성한 후 루시퍼라제(luciferase) 활성 분석을 통해 형질도입 효율을 조사하였다. 그 결과, DNA와 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 몰비가 1:5 내지 1:20까지는 몰비의 증가에 따라 유전자 전달 복합체의 형질도입 효율이 증가하고, 1:30 이상의 몰비에서는 비슷한 수준의 높은 형질도입 효율을 나타내었다. 특히, 본 발명의 유전자 전달 복합체는 비교군으로 사용된 폴리에틸렌이민(PEI 25K) 처리군에 비해 수 배 내지 수백 배 이상 높은 형질도입 효율을 나타내었고(도 5a 내지 5c 참고), 혈청의 존재 하에서도 형질도입 효율이 급격히 감소한 리포펙타민에 비해 안정적으로 높은 형질도입 효율을 유지함을 확인하였다(도 6 참고). 상기 결과는 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)가 DNA에 대한 결합능이 우수하여 효과적으로 나노 크기의 유전자 전달 복합체를 형성하고, 그로 인해 높은 형질도입 효율을 나타낼 뿐만 아니라, 이러한 형질도입 효율이 혈청의 존재 하에서도 안정적으로 높게 유지되어 생체 내 적용에 유리하게 사용될 수 있음을 의미하는 것이다. 본 발명에 따른 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 이렇게 높은 형질도입 효율은 공중합체의 완충능(buffering capacity)에 기인한 것이다.
이에 본 발명에 따른 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 형질도입 기작을 규명하기 위해, 엔도솜 양자 펌프 억제제(endosome proton pump inhibitor)인 바필로마이신 A1(bafilomycin A1)을 이용하여 상기 공중합체의 완충능을 조사한 결과, 본 발명에 따른 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 형질도입 효율은 바필로마이신 A1 처리 후 급격하게 감소하였다(도 7a 참고). 이는 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)가 양성자 스폰지 효과에 의해 엔도솜으로부터 세포질 내로 효과적으로 방출될 수 있음을 나타내는 것이다.
한편, 본 발명에 따른 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 삼투압적 활성 소르비톨 골격을 포함하고 있어 세포막에 삼투압을 부여하여 세포막을 순화시킴으로써 막 투과도의 개선에 의한 세포 재흡수를 촉진시킬 수 있다. 이를 확인하기 위하여, 본 발명의 PSOAT 공중합체 처리에 의한 압축 세포 용적(packed cell volume, PCV) 변화를 측정한 결과, 소르비톨 골격을 갖는 PSOAT/DNA 복합체가 순수 소르비톨 처리에 의해 야기된 것과 동일한 방식으로 PCV를 감소시킴을 확인하였다(도 7b 참고). 또한, 본 발명에 따른 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 형질도입 효율에 미치는 삼투압 활성의 효과를 분석하기 위해 삼투압 억제제를 처리하였다. 그 결과, 삼투압 억제제의 처리 농도가 증가할수록 본 발명의 PSOAT/GL3 복합체의 형질도입 효율이 현저히 감소하였다(도 8a 내지 8c 참고). 상기 결과로부터 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)가 소르비톨 골격에 의한 삼투압 활성으로 인해 더욱 향상된 형질도입 효율을 나타내는 것임을 알 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 세포독성을 다양한 세포주를 대상으로 조사한 결과, 비교군으로 사용된 폴리에틸렌이민(PEI 25K)보다 현저히 낮은 세포독성을 나타내었다(도 9a 내지 9c 참고).
또한, 본 발명에 따른 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 생체 외(in vitro) 형질도입 효율을 확인하기 위하여, PSOAT와 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 유전자를 20:1의 몰비로 혼합하여 유전자 전달 복합체(PSOAT/GFP)를 제조한 후 이를 세포에 형질감염시키고 유세포측정(flow cytometry)으로 분석하였다. 그 결과, 비교군인 폴리에틸렌이민과 GFP의 복합체(PEI 25K/GFP) 처리군에 비해 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체(PSOAT/GFP) 처리군에서 현저히 증가된 GFP 신호가 검출되었고, 모든 처리군에서 어떠한 세포독성도 나타나지 않음을 확인하였다(도 10 참고).
본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 생체 내(in vivo) 형질도입 효율을 조사하기 위하여, 상기와 같이 제조된 유전자 전달 복합체(PSOAT/GFP)를 정상 마우스의 폐에 에어로졸 투여한 후, 마우스로부터 적출된 폐에서 GFP 신호를 형광현미경으로 관찰한 결과, 본 발명의 유전자 전달 복합체(PSOAT/GFP)가 투여된 모든 마우스에서 GFP 신호가 검출되었고, 특히 폴리에틸렌이민과 GFP의 복합체(PEI 25K/GFP)에 비해 높은 GFP 신호가 검출되었다(도 11 참고).
따라서, 본 발명의 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 DNA에 높은 결합능을 나타내고 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호하며 유전자 전달체로 사용하기에 적합한 구형의 균일한 입자 크기의 유전자 전달 복합체를 형성할 수 있을 뿐만 아니라, 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성을 나타내고 형질도입 효율이 매우 높아 유전자 치료를 위한 유전자 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.
이에 본 발명은, 발명의 다른 양태로서, 상기 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)에 치료 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체를 유효성분으로 함유하는 유전자 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여 시에는 상기 유효성분 이외에 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 추가로 포함할 수 있다. 주사제의 경우에, 본 발명의 약학적 조성물은 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 또한 국소 투여 시에 본 발명의 조성물은 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같이 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약앰플 또는 다중 투약형태로 제조할 수 있다. 기타 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 유효성분은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야의 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
발명의 구체적인 실시양태로서, 본 발명은 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)에 치료 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체를 에어로졸 전달을 통해 표적 부위에 전달하도록 제제화된 상기 약학적 조성물의 에어로졸 제형을 제공한다.
흡입(inhalation)을 통한 약물 전달은 비침습적(non-invasive) 방법 중 하나로, 특히 폐 질환의 광범위한 치료에 에어로졸 전달을 통한 유전자 전달이 유리하게 이용될 수 있다. 이는 폐의 해부학적 구조 및 위치가 즉각적이고 비침습적인 접근을 가능케 하고, 다른 기관에는 영향을 미치지 않으면서 유전자 전달 시스템의 국소 적용을 받을 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)에 치료 유전자로서 폐 질환, 특히 폐암과 관련된 유전자를 결합시킨 유전자 전달 복합체를 에어로졸 방식으로 폐에 전달하면, 상기 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 기대할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 전달 방법에는 경구 흡입 및 비내 흡입 방법, 안면 마스크 또는 경구용 튜브에 의한 방법 및 산소를 투여하기 위해 사용되어 온 어린이용 산소 후드에 의한 방법이 포함될 수 있다. 일반적으로, 소립자 에어로졸은 분무화 공정에 의해서 창출되고, 이러한 분무화 공정은 제트 분무기에 의해 수행된다.
본 발명의 약학적 조성물은 수성 분산제를 개인 또는 동물의 기도에 에어로졸 전달하도록 제조할 수 있다는 것을 특별히 고려해야 한다. 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 과도한 실험 없이 에어로졸 제형의 적당한 투여량을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 표적화된 유전자 치료요법을 위해 생체 내에서 사용된 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 치료학적 유효량, 즉 치료 유전자를 효율적으로 발현시킴으로써 해당 질환을 없애거나 완화시키는 양으로 환자 또는 동물에게 투여된다. 용량 및 투여량 섭생은 질환의 종류, 특정한 폴리소르비톨계 공중합체/DNA 복합체의 특징, 예를 들면, 이의 치료학적 지수, 환자, 환자의 병력 및 기타 요인들에 좌우될 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 전형적으로 약 0.01 내지 약 0.1 g/체중 kg일 것이다. 당해 조성물 및 제형은 미량의 첨가제, 예를 들면, 등장성 및 화학적 안정성을 증진시키는 물질(예: 완충제, 방부제 등)을 함유할 수 있다.
발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)에 치료 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체를, 상기 치료 유전자의 전달에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 치료학적 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 치료 유전자 관련 질환 또는 증상을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체의 투여로 목적하는 질환 또는 증상의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "치료"란 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체의 투여로 목적하는 질환 또는 증상의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 활성성분을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 활성성분이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 소정의 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 에어로졸 형태로 투여될 수 있다.
본 발명에서 "대상"은 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니픽을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 동물을 의미하고, 일 실시예에서는 포유류를, 또 다른 실시예에서는 인간을 의미한다.
본 발명에서 활성성분과 결합하여 사용된 "치료학적으로 유효한 양"이란 용어는 대상 질환 또는 증상을 치료 또는 예방하는데 유효한 지속형 글루키곤 결합체의 양을 의미한다.
본 발명의 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 삼투압적 활성 소르비톨 골격을 포함하고 있어 세포막에 삼투압을 부여함으로써 막 투과도의 증강을 통해 세포 재흡수를 촉진시켜 현저히 향상된 형질도입 효율을 나타낸다. 또한 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 DNA에 높은 결합능을 나타내고, 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호하며, 유전자 전달체로 사용하기에 적합한 물리화학적 특성을 나타낼 뿐만 아니라, 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성을 나타내므로, 유전자 치료를 위한 유전자 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 제조방법을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 조성을 1H-NMR로 분석한 결과이다.
도 3a는 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와 DNA를 다양한 몰비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA)의 이동성을 아가로스 겔 전기영동으로 분석한 결과이다.
도 3b는 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와 DNA를 다양한 몰비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA)가 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호할 수 있음을 나타내는 결과이다. 도 3b에서 레인 1은 DNA 마커, 레인 2는 DNase I 무처리 플라스미드 DNA(pGL3-대조군), 레인 3은 DNase I 처리 플라스미드 DNA(pGL3-대조군), 레인 4는 DNase I 무처리 PSOAT/pGL3 복합체, 및 레인 5는 DNase I 처리 PSOAT/pGL3 복합체를 나타낸다.
도 4a는 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와 DNA를 다양한 몰비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA)의 형태를 투과 전자현미경(Transmission Electron Microscopy, TEM)으로 분석한 결과이다(막대는 200 nm를 나타냄).
도 4b는 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와 DNA를 다양한 몰비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA)의 입자 크기를 혈청의 존재 유무에 따라 분석한 결과이다.
도 4c는 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와 DNA를 다양한 몰비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(PSOAT-/DNA)의 제타 전위를 측정한 결과이다.
도 5a 내지 5c는 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와 DNA를 다양한 몰비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA)의 형질도입 효율을 무혈청 배지에서 다양한 세포주를 대상으로 조사한 결과이다(n=3, 오차막대는 표준편차를 나타냄). 도 5a는 A549 세포주; 도 5b는 HeLa 세포주; 및 도 5c는 H322 세포주에 대한 결과이고, 도면에서 RLU는 'relative light unit'의 약자로 발광 정도를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와 DNA를 20:1의 몰비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA)의 형질도입 효율을 혈청 존재 하에서 HepG2 세포주를 대상으로 조사한 결과이다(n=3, 오차 막대는 표준편차를 나타냄).
도 7a는 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와 DNA를 다양한 몰비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA)의 완충능(buffering capacity)을 바필로마이신(bafilomycin) A1의 처리를 통해 조사한 결과이다.
도 7b는 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와 DNA를 20:1의 몰비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA)의 삼투압적 활성을 압축 세포 용적(packed cell volume, PCV) 변화를 측정하여 확인한 결과이다.
도 8a 내지 8c는 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 형질도입 효율에 미치는 삼투압 활성의 효과를 조사한 결과로, 도 8a는 삼투압 억제제 처리 1시간 경과 후, 도 8b는 2시간 경과 후, 및 도 8c는 4시간 경과 후의 결과이다.
도 9a 내지 9c는 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 세포독성을 다양한 농도에서 다양한 세포를 대상으로 조사한 결과로, 도 9a는 A549 세포주; 도 9b는 HeLa 세포주; 및 도 9c는 H322 세포주에 대한 결과이다.
도 10은 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와 GFP(green fluorescent protein)를 20:1의 몰비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(PSOAT/GFP)를 A549 세포에 형질감염시킨 후 상기 세포에서의 GFP 발현을 유세포측정으로 분석한 결과이다(n=3, 오차 막대는 표준편차를 나타냄).
도 11은 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와 GFP를 20:1의 몰비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(PSOAT/GFP)를 마우스의 폐에 에어로졸 투여한 후 생체 내 GFP 발현을 분석한 결과이다(배율: 200×, 스케일 바는 50 ㎛를 나타냄).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1: 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체의 제조
본 발명에 따른 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 문헌(Arote RB, et al., Bioconjug. Chem. 2009, 20(12): 2231-41)에 보고된 방법을 약간 변형한 마이클 부가반응에 따라 합성하였다(도 1).
간략히 설명하면, 0.01 M의 저분자량 폴리에틸렌이민(LMW-PEI)(MW: 423 Da, Sigma-Aldrich)과 0.01 M 소르비톨 다이메타크릴레이트(SDM)(MW: 318.32 Da, Monomer-Polymer & Dajac Labs, Inc.)를 각각 4℃에서 무수 다이메틸설폭사이드에 용해시킨 후, 제조된 PEI 용액을 4℃에서 2시간 동안 교반하면서 제조된 SDM 용액에 서서히 첨가하고 80℃에서 12시간 반응시켰다. 이로부터 수득된 공중합체를 투석막(Spectra/Por, MWCO = 3500)을 사용하여 4℃에서 24시간 동안 증류수에 대해 5회 투석을 수행하여 미반응물을 제거하였고, 분리된 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)를 -20℃에서 동결-건조하였다.
동결-건조된 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 조성을 1H-핵자기 공명(1H-nuclear magnetic resonance, 1H-NMR)(Avance 600, Bruker, Germany)으로 분석하였다. 1H-NMR 분석을 위해 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)를 증류수에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 소르비톨 다이메타크릴레이트의 양성자에 대한 피크가 δ=5.8-6.8 ppm에서, 폴리에틸렌이민의 양성자에 대한 피크가 δ=2.22-2.55 ppm에서 검출되어 폴리에틸렌이민과 소르비톨 다이메타크릴레이트의 공중합체가 효과적으로 합성되었음을 확인하였다.
상기와 같이 합성된 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 특성을 하기 표 1에 정리하였다.
표 1
구분 반응물(중량%) 몰비 SDM:PEI(mol/mol) PEI 조성(mol-%)a SDM 조성(mol-%)a 분자량(Da)b
SDM PEI
SDM/PEI423 318.32 423 1:1 65.88 34.12 11,180
a1H NMR 측정값
b겔 투과 크로마토그래피(GPC) 측정값
실시예 2: 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체/DNA 복합체의 특성 분석
<2-1> 폴리에틸렌이민 공중합체의 DNA 응축능
유전자 전달체의 가장 중요한 특징 중 하나는 플라스미드 DNA와 상호작용하여 이를 응축시킬 수 있는 능력이다. 이에 상기 실시예 1에서 제조된 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 DNA 응축능을 아가로스 겔 전기영동 분석으로 확인하였다. 먼저, PSOAT 용액에 pGL3 플라스미드(5.3 kb, Promega)를 0.5, 1, 3, 5 및 10의 다양한 몰비(N/P ratio)로 혼합한 후 가볍게 볼텍싱(vortexing)해주고 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 각 반응용액을 1% 아가로스 겔에 전기영동을 수행하고 자외선 하에서 DNA 이동성을 관찰하였다. 이때, 대조군으로는 본 발명의 PSOAT와 반응시키지 않은 pGL3 플라스미드 단독을 사용하였다.
그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, 플라스미드 DNA에 대한 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 몰비가 1:0.5 이상인 경우에 DNA의 이동성이 완전히 지연되었는데, 이는 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체가 플라스미드 DNA를 효과적으로 응축시켜 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA)를 형성하였음을 나타내는 것이다. 대조군인 비반응 플라스미드 DNA는 아무런 지연 없이 겔을 통과하여 이동하였다. 상기 결과로부터 유전자 전달 복합체의 효과적인 형성을 위해서는 플라스미드 DNA와 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)를 1:0.5 이상의 몰비로 혼합하는 것이 바람직함을 알 수 있다.
<2-2> 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체/DNA 복합체의 DNA 보호효과
효과적인 유전자 발현을 위해서는 핵산분해효소와 같은 생체 내 효소 공격으로부터 유전자 전달 복합체 내의 DNA가 적절히 보호되어야 한다. 이러한 DNA 보호효과를 확인하기 위해, 상기 실시예 <2-1>에서 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와 DNA를 10:1의 몰비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA) 용액 4 ㎕ 또는 비반응 플라스미드 DNA 용액 4 ㎕에 DNase I 1 ㎕(2 유닛) 또는 PBS(phosphate-buffered saline) 함유 DNase/Mg2+ 분해 완충액(50 mM TrisCl, pH 7.6 및 10 mM MgCl2) 1 ㎕를 첨가하고 37℃에서 30분간 100 rpm으로 교반하면서 인큐베이션하였다. 효소 반응을 중지시키기 위해, 모든 반응용액에 4 ㎕의 EDTA(250 mM)를 10분간 처리한 후, 1% 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, pH 7.2)를 혼합하여 최종 부피를 15 ㎕로 맞추고 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 반응용액을 트리스-아세테이트-EDTA 완충액(running buffer)을 이용해 1% 아가로스 겔에서 1시간 동안 50 V로 전기영동을 수행하였다.
그 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이, 대조군인 비반응 플라스미드 DNA는 DNase I에 의해 완전히 분해된 반면(레인 3), 본 발명의 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA) 내의 DNA는 DNase I의 분해로부터 효과적으로 보호되었음을 알 수 있다(레인 6). 이러한 결과는 본 발명의 유전자 전달 복합체가 핵산분해효소의 공격으로부터 DNA를 보호하면서 효과적으로 세포 내로 전달할 수 있음을 나타내는 것이다.
<2-3> 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체/DNA 복합체의 형태학적 분석
상기 실시예 <2-1>에서 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체와 DNA를 20:1의 몰비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA)의 형태를 투과전자현미경(transmission electron microscope, TEM)(LIBRA 120, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였다. 또한, 상기에서 제조한 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA)를 동결-건조한 후 이의 형태를 TEM으로 관찰하였다.
그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA)는 비교군으로 사용된 PEI 25K/DNA 복합체에 비해 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와 플라스미드 DNA가 효과적으로 응축되어 균일한 구형의 압축된 구조를 가지고 있음을 확인하였다(상부 패널). 또한, 동결-건조 후 비교군으로 사용된 PEI 25K/DNA 복합체는 입자들의 응집 현상이 야기되는 것과는 달리, 본 발명의 PSOAT/DNA 복합체는 동결-건조 후에도 구조적 완전성(integrity) 및 안정성을 그대로 유지하였는데(도 4a의 하부 패널), 이는 본 발명에 따른 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT) 내 소르비톨 골격에 의한 동결방지(cryoprotective) 기능에 의한 것이다.
유전자 전달 복합체의 입자 크기는 복합체가 표적 부위에 접근하고 이를 통과하는 데 중요한 요소로 복합체의 세포 내 유입에 필수적이다. 대부분의 유전자 전달 복합체는 세포 내 이입(endocytosis) 또는 포액작용(pinocytosis)에 의해 세포 내로 유입되기 때문에, 최적의 세포 내 유입을 위해서는 복합체의 크기가 일정 수준 이하인 것이 요구된다. 이에 동적 광 산란 분광 광도계(dynamic light scattering spectrophotometer, ELS8000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 이용하여 무혈청 조건에서 다양한 몰비로 제조된 유전자 전달 복합체와, 다양한 농도의 혈청 존재 하에서 20:1의 몰비로 제조된 유전자 전달 복합체의 입자 크기를 측정하였다. 이때, 산란각도(scattering angle)는 90° 및 20°로 설정하였다.
그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, 몰비 1:1, 10:1, 20:1 및 30:1에서 본 발명의 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA)는 혈청의 유무에 상관없이 평균 150 내지 250 nm의 상대적으로 균일한 입자 크기 분포(PDI: 2.5e-003)를 나타내어, 유전자 전달체로 사용하기에 적합한 입자 크기를 가짐을 확인하였다.
<2-4> 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체/DNA 복합체의 표면 전하 측정
또한, 유전자 전달 복합체의 양성 표면 전하는 음이온 세포 표면에 결합하는데 필수적이고, 이는 복합체의 세포 내 유입을 용이하게 한다. 이에 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와 플라스미드 DNA를 다양한 몰비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(PSOAT/DNA)의 제타 전위(zeta potential)를 동적 광 산란 분광 광도계(ELS8000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 4c에 나타난 바와 같이, 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와 플라스미드 DNA를 5:1의 몰비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체가 가장 높은 양성의 제타 전위를 나타내었고, 그 값은 몰비가 증가할수록 감소하였으나 모두 양성값을 나타내었다. 이처럼 표면 전하가 양전하를 띤다는 것은 음전하를 띠는 DNA가 유전자 전달 복합체 내부에 완전히 둘러싸여 있음을 의미하고, 양성의 표면 전하는 유전자 전달 복합체의 세포 내로의 유입을 용이하게 할 뿐만 아니라, 입자들 사이에 정전기적 반발력을 일으켜 입자들끼리의 응집현상을 감소시키는 장점이 있다.
실시예 3: 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체의 형질도입 효율
<3-1> 무혈청 조건 하의 형질도입 효율 분석
본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 형질도입 효율을 조사하기 위하여, 무혈청 조건에서 시험관 내 루시퍼라제 활성 분석(in vitro luciferase activity assay)을 수행하였다.
먼저, 24-웰 플레이트에 10% FBS(HyClone), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100 U/㎖ 페니실린이 함유된 RPMI 1640(Gibco BRL) 배지를 첨가하고 A549 세포, HeLA 세포 및 H322 세포를 1.5×105 개/웰의 밀도로 접종하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 18시간 동안 배양하였다. 아울러, 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT) 용액에 SV40 프로모터 및 인핸서에 의해 발현이 유도되는 루시퍼라제 유전자를 포함하는 pGL3 발현벡터(5.3 kb, Promega)를 5, 10, 20 및 30의 몰비로 혼합한 후 가볍게 볼텍싱 해주고 실온에서 30분간 인큐베이션하여 유전자 전달 복합체(PSOAT/GL3)를 제조하였다. 상기 웰 플레이트의 배지를 무혈청 배지 또는 제조된 유전자 전달 복합체(PSOAT/GL3) 1 ㎍를 함유하는 배지로 교체하고 4시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 이때, PEI 25K(25 kDa, Sigma-Aldrich) 및 리포펙타민(Lipofectamine)을 동일한 농도로 처리한 세포 배양액을 비교군으로 사용하였다. 그 후, 웰 플레이트의 배지를 신선한 10% FBS 함유 DMEM 배지로 교체하고 다시 48시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 이어서, 배지를 제거한 후, 각 웰에 세포 용해 완충액(cell lysis buffer)을 100 ㎕씩 첨가하고 -20℃에서 24시간 동안 방치한 후 배양액을 이-튜브(e-tube)로 옮겨 담고 10,000 rpm에서 15분간 원심분리를 수행하여 상층액을 수득하였다. 수득된 상층액의 루시퍼라제 활성을 루시퍼라제 분석 키트(luciferase assay kit, Promega)로 측정하여 형질도입 효율을 1 ㎎ 단백질의 상대적 발광도(relative light unit, RLU)로 나타내었다.
그 결과, 도 5a 내지 5c에 나타난 바와 같이, DNA와 PEI 25K의 반응 몰비가 증가할수록 형성된 유전자 전달 복합체의 형질도입 효율이 감소하는 반면, 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 DNA와의 반응 몰비가 증가하여도 PEI 25K보다는 높고, 리포펙타민과는 유사한 수준의 형질도입 효율을 나타남을 확인하였다. 이는 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)가 DNA에 대한 결합능이 우수하여 효과적으로 나노 크기의 유전자 전달 복합체를 형성하고, 그로 인해 높은 형질도입 효율을 나타냄을 의미하는 것이다. 본 발명에 따른 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 이렇게 높은 형질도입 효율은 공중합체의 완충능(buffering capacity)에 기인한 것이다.
<3-2> 혈청 존재 하의 형질도입 효율 분석
본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와 pGL3 발현벡터의 반응 몰비를 1:20으로 하고 배지 내 혈청 농도를 0, 10, 20 및 30%로 달리하는 것을 제외하고는 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 PSOAT/GL3 복합체를 제조한 후, 이의 루시퍼라제 활성을 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 혈청 존재 하에서 PEI 및 리포펙타민의 형질도입 효율이 현저히 감소하는 것과는 달리, 본 발명에 따른 PSOAT/GL3 복합체는 혈청 농도와 상관없이 높은 수준의 형질도입 효율을 유지하였다. 일반적으로 양이온성 고분자를 이용해 생체 내에 유전자를 전달하는 경우, 이들의 유전자 전달 복합체는 양이온성으로 인해 혈액 중에 존재하는 혈청단백질과 결합하게 되고, 그로 인해 크기가 커진 유전자 전달 복합체는 혈관의 막힘 또는 유전자 발현효율의 저하와 같은 문제점을 야기한다. 그러나, 본 발명에 따른 PSOAT/GL3 복합체는 혈청 존재 하에서도 응집체를 형성하지 않으므로 혈관의 막힘 또는 유전자 발현효율의 감소를 유발하지 않는 것으로 확인되었다.
실시예 4: 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체의 형질도입 기작 분석
<4-1> 완충능 분석
본 발명에 따른 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 형질도입 기작을 규명하기 위해, 상기 공중합체의 완충능을 조사하였다. 상기 실시예 <3-1>에서와 같이 웰 플레이트에서 배양된 A549 세포에 DMSO에 희석된 바필로마이신 A1(bafilomycin A1, specific inhibitor of vacuolar type H+ ATPase, 200 nM)을 첨가하여 10분간 배양한 후, 상기와 동일한 방법으로 형질도입 효율을 측정하였다. 이때, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체는 DNA와 PSOAT가 1:20 및 1:30의 몰비로 제조된 것을 사용하였고, 비교군으로 DNA와 PEI 25K가 1:5의 몰비로 제조된 유전자 전달 복합체를 사용하였다.
그 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 형질도입 효율은 바필로마이신 A1 처리 후 급격하게 감소하였는데, 이는 본 발명의 PSOAT가 높은 완충능을 가지고 있으며, 따라서 양성자 스폰지 효과에 의해 엔도솜으로부터 신속하게 방출되어 세포질 내로 유입될 수 있음을 나타내는 것이다.
<4-2> 삼투압 활성 측정
본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 삼투압 활성 소르비톨 골격을 함유하는 생분해성 유전자 전달체이다. 이에 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)가 높은 삼투압에 대한 반응으로 형질도입 효율에 미치는 영향을 조사하기 위하여 압축 세포 용적(packed cell volume, PCV) 변화를 측정하였다.
먼저, 293T 세포를 10% FBS 함유 DMEM 배지에 현탁한 후, 상이한 농도(0.01, 0.03, 0.05, 1 및 5 중량%)의 소르비톨 또는 중합체 골격에 다양한 소르비톨 함량(0.01, 0.03 및 0.05 중량%)을 갖는 PSOAT/DNA 복합체를 첨가하였다. 상기 배양 혼합물을 37℃에서 5분간 인큐베이션한 후, 세포를 1분간 미니-PCV 튜브에서 원심분리하여 세포의 용적 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 7b에 나타난 바와 같이, DMEM 중 1 중량% 소르비톨에 노출된 세포에서 PCV의 20% 감소가 관찰되었고, 0.01, 0.03 및 0.05 중량%의 소르비톨을 함유한 PSOAT/DNA 복합체 역시 순수 소르비톨 처리에 의해 야기된 것과 동일한 양상으로 PCV를 감소시켰다. 본 발명에 따른 PSOAT/DNA 복합체 존재 하의 PCV 감소는 PSOAT 중의 소르비톨 골격이 세포막에 삼투압을 부여하여 세포막을 순화시킴으로써 막 투과도를 개선시키고, 그로 인해 세포 재흡수가 촉진된다는 가설에 의해 설명될 수 있다.
<4-3> 삼투압 활성 의존적 형질도입 효율 확인
삼투압 활성이 본 발명에 따른 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 형질도입 효율에 미치는 영향을 조사하기 위해, PSOAT에 삼투압 억제제를 처리하여 형질도입 효율의 변화를 조사하였다.
이를 위한 삼투압 억제제로 배양 세포 내 유기 삼투질(osmolyte)의 축적을 방지하는 SC58236(COX-2 억제제, Sigma-Aldrich)을 사용하였다. 먼저, 실시예 <3-1>에서와 같이 A549 세포를 배양하여 24-웰 플레이트에 10×104 세포/웰의 농도로 분주하였다. 상기 웰 플레이트의 배지를 PSOAT/GL3(1:20) 및 PEI 25K/GL3(1:5) 복합체를 100 ㎍/㎖의 농도로 함유하는 무혈청 배지로 교체한 후 다시 24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 이어서, 처음에는 DMSO에 용해시키고 나중에는 무혈청 배지에 희석하여 다양한 농도(0, 5, 10 및 30 μM/ℓ)로 준비한 SC58236를 상기 웰 플레이트에 처리한 후 이를 1, 2 및 4시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배지를 제거한 후, 각 웰에 세포 용해 완충액(cell lysis buffer)을 100 ㎕씩 첨가하고 -20℃에서 24시간 동안 방치한 후 배양액을 이-튜브(e-tube)로 옮겨 담고 10,000 rpm에서 15분간 원심분리를 수행하여 상층액을 수득하였다. 수득된 상층액의 루시퍼라제 활성을 루시퍼라제 분석 키트(luciferase assay kit, Promega)로 측정하여 형질도입 효율을 1 ㎎ 단백질의 상대적 발광도(RLU)로 나타내었다.
그 결과, 도 8a 내지 8c에 나타난 바와 같이, 삼투압 억제제인 SC58236의 처리 농도가 증가할수록 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 형질도입 효율이 현저히 감소하였다. 30 μM/ℓ의 SC58236 처리 시, 모든 분석 시점(1, 2 및 4시간 경과)에서 본 발명에 따른 PSOAT/GL3 복합체의 형질도입 효율은 플라스미드 pGL3의 형질도입 효율과 별다른 차이를 나타내지 않았다. 이는 고농도 삼투압 억제제의 처리에 의해 본 발명에 따른 PSOAT의 형질도입 효율이 완전히 소실됨을 나타내는 것이다. 한편, PEI 25K의 형질도입 효율은 삼투압 억제제의 고농도 처리에도 불구하고 모든 분석 시점에서 별다른 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다.
상기 결과로부터, 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 형질도입 효율이 삼투압적 활성 소르비톨의 존재로 인한 높은 삼투압 활성에 기인한 것임을 확인하였다.
실시예 5: 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체의 세포독성
본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 세포독성을 조사하기 위해, 실시예 <3-1>에서와 같이 DNA와 PSOAT의 다양한 몰비로 제조된 유전자 전달 복합체를 다양한 세포에 처리한 후 세포 증식 분석(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay)을 수행하여 세포 생존능을 조사하였다.
먼저, A549(human lung adenocarcinoma cell, ATCC) 및 H322(human lung cancer cell, ATCC) 세포는 RPMI 1640(Gibco BRL, Paris, France) 배지에, HeLa(human cervical carcinoma cell, ATCC) 세포는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium, Gibco BRL) 배지에 접종하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 이때, 모든 배지에는 10%의 우태아혈청(FBS, HyClone, Logan, UT, USA), 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 100 U/㎖의 페니실린을 첨가하였다.
배양된 A549, 및 HeLa 및 H322 세포를 1×104 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하고 18시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 상기 웰 플레이트의 배지를 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)를 각각 5, 10, 20, 50 및 100 ㎍/㎖의 농도로 함유하는 무혈청 배지로 교체한 후 다시 24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 이때, PEI 25K(25 kDa, Sigma-Aldrich)를 동일한 농도로 처리한 세포 배양액을 비교군으로 사용하였다. 그 후, 웰 플레이트의 배지를 20 ㎕의 세포 역가 측정 시약(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent)을 포함하는 성장 배지(growth medium)로 교체하였다. 3시간 동안 배양 후, ELISA 플레이트 판독기(GLR 1000, Genelabs Diagnostics, Singapore)를 사용하여 590 nm에서 웰 플레이트의 흡광도를 측정하여 세포의 대사 활성도(metabolic activity)를 조사하였다.
그 결과, 도 9a 내지 9c에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 본 발명의 PSOAT/DNA 복합체를 처리한 세포에서는 PSOAT의 몰비가 증가하여도(최대 30:1) 모든 세포에서 60% 이상의 세포 생존율이 나타난 반면, PEI 25K를 처리한 세포의 세포 생존율은 PEI의 몰비가 증가함에 따라 급격하게 감소하였다. 상기 결과로부터 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 세포독성이 매우 낮아 생체적합성이 우수함을 확인하였다.
실시예 6: 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체의 시험관 내 및 생체 내 형질도입 효율 분석
<6-1> 유세포측정에 의한 시험관 내 형질도입 분석
본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 시험관 내 형질도입 효율을 조사하기 위해, 293T 세포에서 PSOAT의 GFP 발현을 유세포측정(flow cytometry)으로 분석하였다.
먼저, 본 발명의 PSOAT와 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)을 발현하는 플라스미드 pcDNA3.1/CT-GFP(6.1 kb, Invitrogen)를 20:1의 몰비로 혼합하여 유전자 전달 복합체(PSOAT/GFP)를 제조하였다. 이때, PEI 25K(25 kDa, Sigma-Aldrich)와 상기 pcDNA3.1/CT-GFP 플라스미드를 동일한 몰비로 혼합하여 제조한 유전자 전달 복합체(PEI 25K/GFP)를 비교군으로 사용하였다. A549 세포를 PSOAT/GFP 및 PEI 25K/GFP 복합체로 각각 형질감염시킨 후 PBS로 세척하고 트립신을 처리하였다. FACS 캘리버 시스템(Calibur System)(Becton-Dickinson, San Joes, CA)을 이용하여 상기 세포로부터 발현된 GFP의 비율(%)을 기록하여 형질도입 효율을 평가하였다. 상기 실험을 3회 반복 수행하였고, 20개의 세포를 각 실험에서 계수하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, PEI 25K/GFP 복합체 처리군에서는 형광 세포가 약 15%에 불과한 반면, 본 발명의 PSOAT/GFP 복합체 처리군에서는 약 30% 이상의 형광 세포가 검출되어 PEI 25K보다 본 발명의 PSOAT가 더욱 우수한 형질도입 효율을 나타냄을 확인하였다.
<6-2> 에어로졸 전달에 의한 생체 내 형질도입 효율 분석
본 발명에 따른 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)의 에어로졸에 의한 생체 내 유전자전달 효율을 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
먼저, 상기 실시예 <6-1>과 같이 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)와 GFP를 발현하는 플라스미드 pcDNA3.1/CT-GFP(6.1 kb, Invitrogen)를 20:1의 몰비로 혼합하여 유전자 전달 복합체(PSOAT/GFP)를 제조하였다.
6주령의 수컷 C57BL/6 마우스(Breeding and Research Center)를 온도 23±2℃ 및 상대습도 50±20%에서 12시간 밤/낮 주기를 유지하여 실험실 동물시설에 보관하였다. 본 연구의 모든 실험 절차는 서울대학교의 동물보호 및 사용위원회(Animal Care and Use Committee at Seoul National University, SNU-101211-2)에 의해 승인되었다. 에어로졸을 통한 유전자 전달 효율성을 확인하기 위해 마우스의 코 부위만 노출시키는 챔버(NOEC; Dusturbo, Seoul, Korea)를 사용하였고, 4마리의 마우스를 다음과 같이 무작위로 2개 군(각 군당 2마리)으로 나누었다: PEI 25K/GFP 복합체 처리군; 및 PSOAT/GFP 복합체 처리군. 상기 각 군의 마우스에 1 mg의 DNA가 전달되도록 문헌에 사용된 방법에 근거하여 에어로졸에 노출시켰다(H.L. Jiang 등, Biomaterials 30: 5844-5852, 2009).
에어로졸 노출 2일 후, 각 군의 마우스를 희생시키고 폐를 적출하였다. 적출된 폐를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에 담가 12시간 동안 고정한 후 30% 수크로스 용액에 담가 4℃에서 48시간 동안 보관하였다. 고정된 폐를 -20℃ 이하의 온도에서 OCT 화합물(Tissue-Tek OCT, Sakura)로 포매(embedding)한 후 마이크로톰(microtome)으로 절단하여 10 ㎛ 두께의 폐 조직 절편을 제조하였다. 조직병리학적 분석을 위해, 준비된 폐 조직 절편을 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색한 후 공초점 현미경(confocal microscope, Zeiss LSM510, Carl Zeiss)으로 GFP 신호를 관찰하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, PEI 25K/GFP 복합체 처리군에 비해 본 발명의 PSOAT/GFP의 복합체 처리군에서 강한 GFP 신호가 검출되어 에어로졸 전달 효율이 매우 우수함을 알 수 있다.
본 발명의 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 삼투압적 활성 소르비톨 골격을 포함하고 있어 세포막에 삼투압을 부여함으로써 막 투과도의 증강을 통해 세포 재흡수를 촉진시켜 현저히 향상된 형질도입 효율을 나타낸다. 또한 본 발명의 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)는 DNA에 높은 결합능을 나타내고, 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호하며, 유전자 전달체로 사용하기에 적합한 물리화학적 특성을 나타낼 뿐만 아니라, 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성을 나타내므로, 유전자 치료를 위한 유전자 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (22)

  1. 폴리에틸렌이민(PEI)과 소르비톨계 유도체의 공중합체인 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT).
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민(PEI)이 50 내지 10,000 Da 범위의 분자량을 갖는 선형 또는 분지형인 것인 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT).
  3. 제1항에 있어서, 상기 소르비톨계 유도체가 소르비톨 당알코올 골격을 포함하고 상기 당알코올 골격에 아크릴레이트기 또는 메타크릴레이트기를 갖는 것인 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT).
  4. 제3항에 있어서, 상기 소르비톨계 유도체가 소르비톨 다이아크릴레이트(sorbitol diacrylate, SDA), 소르비톨 다이메타크릴레이트(sorbitol dimethacrylate, SDM), 소르비톨 트리아크릴레이트(sorbitol triacrylate, STA), 소르비톨 트리메타크릴레이트(sorbitol trimethacrylate, STM), 소르비톨 테트라아크릴레이트(sorbitol tetracrylate, STEA), 소르비톨 테트라메타크릴레이트(sorbitol tetramethacrylate, STEM), 소르비톨 펜타아크릴레이트(sorbitol pentacrylate, SPA) 및 소르비톨 펜타메타크릴레이트(sorbitol petamethacrylate, SPM)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT).
  5. 제4항에 있어서, 상기 소르비톨계 유도체가 하기 화학식 3으로 표시되는 소르비톨 다이메타크릴레이트(SDM)인 것인 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT):
    <화학식 3>
    Figure PCTKR2011005955-appb-I000001
  6. 제1항에 있어서, 상기 전달체가 하기 화학식 4로 표시되는 것인 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT):
    <화학식 4>
    Figure PCTKR2011005955-appb-I000002
    상기 식에서, x는 1 내지 200 사이의 정수이고, n은 1 내지 500 사이의 정수임.
  7. 제1항에 있어서, 상기 전달체가 1,000 내지 100,000 Da 범위의 분자량을 갖는 것인 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT).
  8. 1) 소르비톨계 유도체와 폴리에틸렌이민(PEI) 각각을 반응용매에 용해시키는 단계;
    2) 폴리에틸렌이민(PEI) 용액을 소르비톨계 유도체 용액에 첨가하여 마이클 부가반응을 수행하는 단계; 및
    3) 반응물로부터 형성된 공중합체를 분리하는 단계를 포함하는,
    제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)를 제조하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 단계 1)에서 반응용매가 다이메틸설폭사이드, 무수 메틸알코올, 에틸알코올, 다이메틸포름아마이드 및 다이옥산으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 단계 2)에서 마이클 부가반응이 40 내지 100℃에서 1 내지 24시간 동안 수행되는 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 단계 2)에서 소르비톨계 유도체와 폴리에틸렌이민(PEI)의 반응 몰비(N/P ratio)가 1:0.1 내지 1:10인 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)에 치료 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 치료 유전자와 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)가 1:0.5 내지 1:100의 몰비로 결합되는 것인 유전자 전달 복합체.
  14. 제12항에 있어서, 치료 유전자가 DNA, 단일가닥 RNA, 이중가닥 RNA, 라이보자임(ribozyme), DNA-RNA 혼성체(hybrid) 및 안티센스 DNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 유전자 전달 복합체.
  15. 제14항에 있어서, 치료 유전자가 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것인 유전자 전달 복합체.
  16. 제12항에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체가 150 내지 250 nm의 평균 입자 크기를 갖는 것인 유전자 전달 복합체.
  17. 제12항에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체가 1 내지 50 mV 범위의 제타 전위를 나타내는 것인 유전자 전달 복합체.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항의 유전자 전달 복합체를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체가 에어로졸 전달에 의해 표적 부위에 전달되도록 제형화된 약학적 조성물.
  20. 생분해성 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체(PSOAT)에 치료 유전자가 결합된 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항의 유전자 전달 복합체를, 상기 치료 유전자의 전달에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 치료학적 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 치료 유전자 관련 질환 또는 증상을 예방 또는 치료하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 투여가 에어로졸 전달에 의한 것인 방법.
  22. 하기 화학식 4로 표시되는 폴리에틸렌이민(PEI)과 소르비톨계 유도체의 공중합체:
    <화학식 4>
    Figure PCTKR2011005955-appb-I000003
    상기 식에서, x는 1 내지 200 사이의 정수이고, n은 1 내지 500 사이의 정수임.
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