WO2012133994A1 - Pauf 및 그의 결합 파트너를 상호작용을 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법 - Google Patents

Pauf 및 그의 결합 파트너를 상호작용을 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법 Download PDF

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    • G01N2333/4706—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a cancer therapeutic agent using the interaction of PAUF and its binding partner, and a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • Pancreatic cancer is a fatal cancer with a 5-year survival rate of 1-4% and a median survival of 5 months. It has the worst prognosis among human cancers. About 90% of patients with pancreatic cancer are already found to be incapable of undergoing radical surgery, so the prognosis is the poorest among human cancers, and treatment is a disease that can only rely on chemotherapy with only 20% response. , The development of early diagnostic methods is most urgently needed than any cancer occurring in the human body.
  • pancreatic adenocarcinoma up-regulated factor is a novel gene involved in the development of pancreatic cancer, as a preclinical candidate target gene derived from the human pancreatic cancer and gastric cancer specific DNA group DNA chip database (ancer Science, 100 ( 5): 826-836 (2009)), and a patent application (Korean Patent No. 0954322).
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer.
  • the present invention provides a method for screening a cancer therapeutic agent comprising the following steps:
  • PAUF Pancreatic Adenocarcinoma Up-regulated Factor
  • PALR and GLRX3 as a binding partner thereof
  • PAUF protein originally named by the inventor (Korean Patent No. 0954322).
  • the protein is expressed differently in pancreatic cancer tissue compared to normal pancreatic tissue.
  • the sequence of protein and nucleic acid molecules of PAUF is registered in GeneBank (Access ion number: EF067313). More preferably, the sequence of the protein and nucleic acid molecules of the PAUF is PAUF comprising the first sequence of the sequence listing.
  • GLRX3 is one of a group of glutaredoxin families, and glutaredoxin is a redox enzyme that uses glutathione as a cofactor to reduce various substrates. More preferably the GLRX3 is GLRX3 comprising the sequence listing second sequence.
  • the encoded protein inhibits apoptosis and plays a role in cell growth, and the expression of the nucleic acid molecule of this protein serves as a cancer marker.
  • the term "SNAPIN” is one of the components of the Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (SNSF) Attachment Protein Receptor (SNARE) complex, which is a protein required for binding and fusion of synaptic vesicles. More preferably, the SNAPIN is a SNAPIN comprising a sequence listing third sequence. The phosphorylation state of the protein is known to affect the interaction between extracellular proteins and the exocytosis of cells of synaptic vesicles.
  • the term "UBL4A” is a protein encoded by the human gene UBL4A.
  • the UBL4A is UBL4A including a sequence specific fourth sequence.
  • PAIF is found in the state of binding to GLRX3, SNAPIN or UBL4A in cells, in particular in cancer cells. Therefore, a test substance that binds to PAUF, GLRX3, SNAPIN or UBL4A, and is determined to compete in the binding of PAUF with GLRX3, SNAPIN or UBL4A has a feature that can inhibit the binding of PAIF to GLRX3, SNAPIN or UBL4A.
  • Test substances analyzed by the screening methods of the present invention are single compounds, mixtures of compounds (eg, natural extracts or cell or tissue cultures), antibodies or peptides.
  • Test substances can be obtained from libraries of synthetic or natural compounds. Methods of obtaining libraries of such compounds are known in the art. Synthetic compound libraries are described in Maybridge Chemical Co. (UK), Comgenex (USA), Brandon Associates (USA), Microsource (USA), and Sigma-Aldrich (USA) commercially available. Libraries of natural compounds are commercially available from Pan Laboratories (USA) and MycoSearch (USA). Available for purchase.
  • Test materials can be obtained by a variety of combinatorial library methods known in the art, for example, biological libraries, spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries, deconvolution This required synthetic library method, the "1-bead 1-compound” library method, and the synthetic library method using affinity chromatography screening can be obtained.
  • Methods for the synthesis of molecular libraries are described in DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909 (1993); Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422 (1994); Zuckermann et al. , J. Med. Chem. 37: 2678 (1994); Cho et al.
  • peptide refers to a linear molecule formed by binding amino acid residues to each other by peptide bonds, and typically includes 4-40 amino acid residues.
  • Peptides as binding inhibitors between PAUFs of the present invention and their binding partners are prepared by sol id-phase synthesis methods commonly used in the art (Merrifield, RB, J. Am. Chem. Soc., 85). : 2149-2154 (1963), Kaiser, E., Colescot, RL, Bossinger, CD, Cook, P. I, Anal.Bioche., 34: 595-598 (1970)). That is, after the ⁇ -amino and side chain functional groups are bonded to the resin, the a-amino protecting group is removed and the remaining a-amino and side chain functional groups are protected in a step-by-step manner in order to intermediate the intermediate.
  • natural extract means obtained by extracting from various organs or parts of natural products (eg, leaves, flowers, roots, stems, branches, husks, fruits, etc.), wherein the natural extracts are (a) water, (b) anhydrous or hydrous lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms (methane, ethanol, propane, butanol, normal-propanol, iso-propane and normal-butanol, etc.), and (c) a mixture of the lower alcohols with water.
  • a solvent, (d) acetone, (e) ethyl acetate, (f) chloroform, (g) 1,3- butylene glycol, (h) nucleic acid U) diethyl ether can be obtained as an extraction solvent.
  • an antibody may be used as a test substance.
  • the antibody is
  • Antibodies used as test substances in the present invention include bispecific antibodies.
  • antibodies having dual specificity to PAUF and GLRX3 can be used.
  • the antibody is a polyclonal or monoclonal antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • Antibodies can be prepared by methods conventionally practiced in the art, such as fusion methods (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6: 511—519 (1976)), recombinant DNA methods (US Pat. No. 4,816,56). Or phage antibody library methods (Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 (1991)). .
  • General procedures for antibody preparation are described in Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies- A Manual of Techniques, CRC Press, Inc.
  • hybridoma cells producing monoclonal antibodies is accomplished by fusing immortalized cell lines with antibody-producing lymphocytes, and the techniques required for this process are well known to those skilled in the art and can be readily implemented.
  • Polyclonal antibodies can be obtained by injecting an antigen into a suitable animal, collecting antisera from the animal, and then isolating the antibody from the antisera using known affinity techniques.
  • GLRX3, SNAPIN or UBL4A is contained in one extracellular solution. That is, the method of the present invention can be carried out with one semi-aqueous solution in the in ⁇ -.
  • the assay of the present invention can be performed using a semi-aqueous solution containing purified PAUF and GLRX3 proteins and test substances.
  • GLRX3, SNAPIN UBL4A or is contained within (/ vivo) 0] ⁇ cells. That is, the method of the present invention can be carried out using reaction in the cell. For example, cells expressing PAUF and GLRX3 proteins are treated with test substances to assay whether the binding of PAUF and GLRX3 is inhibited in the cells. According to a preferred embodiment of the present invention, in the present invention The cells used are cancer cells. Cancer cells are highly expressed with PAUF to provide an environment that facilitates analysis of the present invention.
  • the cancer cells used are gastric cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, colon cancer, cervical cancer, brain cancer, prostate cancer, bone cancer, head and neck cancer, skin cancer, thyroid cancer. , Parathyroid cancer and ureter cancer cells, but is not limited thereto. Most preferably, the cancer cells used in the present invention are pancreatic cancer cells.
  • Proteins identified as binding partners of PAUF in the present invention are GLRX3, SNAPIN or UBL4A.
  • the binding partner of PAIF used in the method of the present invention is GLRX3.
  • the binding partner of PAUF used in the method of the present invention is a thioredoxin domain of GLRX3.
  • GLRX3 is largely composed of the N-terminal thioredoxin domain and the C-terminal two glutaredoxins.
  • the PAUF, its binding partner and the test substance are contacted and then analyzed whether the test substance inhibits the binding between the PAUF and its binding partner.
  • step (b) is a two-hybrid method, a co-immunoprecipitation method (( ⁇ ⁇ 11110 ⁇ 6 ( ⁇ 1); 31 ⁇ 011 assay), co-localization analysis assays, scinti 1 lation proximity assays (SPAs), UV or chemical crosslinking methods, bimolecular interaction analysis (BIA), mass spectrometry (MS), nuclear magnetic resonance (NR) ) Or by fluorescence polarization assays (FPA).
  • a co-immunoprecipitation method ( ⁇ ⁇ 11110 ⁇ 6 ( ⁇ 1); 31 ⁇ 011 assay), co-localization analysis assays, scinti 1 lation proximity assays (SPAs), UV or chemical crosslinking methods, bimolecular interaction analysis (BIA), mass spectrometry (MS), nuclear magnetic resonance (NR) ) Or by fluorescence polarization assays (FPA).
  • to-hybrid method is based on the modal nature of the transcription factors composed of cleavable DNA-binding and activation domains.
  • GLRX3, SNAPIN or UBL4A can be used as bait and PAUF can be used as prey. You can also create a construction in reverse. According to this method, a substance which inhibits the interaction of PAUF with GLRX3, SNAPIN or UBL4A can be screened.
  • the two-hybrid system simply uses two DNA constructs.
  • GLRX3, SNAPIN or UBL4A-encoding polynucleotides are fused to DNA binding domain-encoding polynucleotides of known transcription factors (eg, GAL-4).
  • a DNA sequence encoding a PAUS protein is fused to a polynucleotide encoding an activation domain of such known transcription factors. If bait and prey interact at phosphorus to form a complex, the DNA-binding and activation domains of the transcription factors are contiguous, which triggers transcription of the reporter gene (eg, LacZ).
  • test substance inhibits the interaction of PAUF with GLRX3, SNAPIN or UBL4A, it will interfere with the expression of the reporter gene, indicating that it can be used as a cancer inhibitor.
  • a three-hybrid method may be used (US Pat. No. 5,283,317; Zervos et al., Cell 72, 223-232, 1993; Madura et al., J. Biol. Chem. 268, 12046-12054, 1993; Bartel et al., BioTechniques 14, 920-924, 1993; Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693-1696, 1993; and TO 94/10300).
  • Co-IP co-immunoprecipitation assay
  • 3 ⁇ 4-lysine or the like is added to the culture to label the target material and take the culture supernatant.
  • supernatant is added to the supernatant by adding the same concentration of non-labeled target substance that can form a specific antibody and an antigen-antibody complex
  • micro-labeled target substance in the culture also co-sediments reaction to the sediment. Activity can be used to determine the target material.
  • Antibodies are selected that target a known protein known as a member of a large complex of proteins, and the total protein complex is identified by targeting the known complex with the antibody. Precipitate in solution to identify unknown proteins of the complex. This is impossible to measure directly when there is a small amount of unknown substance, so that the supernatant is labeled with a target substance to take the culture supernatant, and the supernatant is added with the same concentration of non-labeled target substance that can form a specific antibody and protein complex. By causing the sedimentation reaction, the co-sedimentation reaction occurs with the microlabeled target. It is referred to as pull-down because of the concept that the protein complex comes out of solution. Co-immunoprecipitation is widely used to analyze protein-protein interactions.
  • co-localization assay using fluorescence staining, observes spatial overlap between two or more different respective differentiated emission wavelengths under fluorescence microscopy, so that cells
  • Confocal microscopy of the other two fluorescently stained proteins can be performed to determine the location of the two proteins in one location by measuring the color at a specific location, indicating that they are interacting. In other words, it is functionally bound (Manders et al, Journal of Microscopy 169: 375-382 (1993); Paw ley JB, Handbook of Biological Confocal Microscopy, 2006)).
  • the scintillation proximity assay refers to the attachment of antibodies to polyvinyl-luene plastic scintillator beads that fluoresce by energetic electrons, and readily Radionuclides that emit low-energy electrons that lose or dissipate energy are labeled with antigens that selectively bind to antibodies attached to beads to observe the degree of antigen-antibody binding through fluorescence measurements generated. (Alouani, Methods Mo J. Biol. 138: 135-41 (2000)).
  • chemical cross-linking forms a chemical covalent bond to a biopolymer such as a protein or a nucleic acid using a cross-linking reagent, so that the protein subunit structure, protein-nucleic acid interaction
  • a biopolymer such as a protein or a nucleic acid using a cross-linking reagent
  • cross-linking reagent so that the protein subunit structure, protein-nucleic acid interaction
  • Crosslinking reagents generally react specifically with functional groups such as amine groups (-NH 2 ), thiol groups (-SH), and carboxylic acid groups (-C00H) in the same molecule, or both functional groups capable of activation by light irradiation
  • the divalent crosslinking reagent which has at is used.
  • the binding force is too weak or temporary to observe the interaction between proteins, the chemical crosslinking method has the advantage of easy to capture and analyze the interaction between proteins.
  • bimolecular interaction analysis is a technique for analyzing specific interactions in real time, and refers to a method that can be performed without labeling of interactants (eg, BIAcore).
  • TM TM
  • Sjolander & Urbaniczky Anal. Chem. 63: 2338-2345 (1991)
  • Szabo et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705 (1995)
  • SPR surface plasmon resonance
  • fluorescence polarization assay is a combination of an antibody that binds specifically to CRP and a tracer that combines fluorescent dye fluorescein to C reactive protein (CRP).
  • a method of adding a body fluid (particularly blood) containing CRP as an object to be measured to a solution is a method of measuring CRP based on the contention of the tracer and CRP against the antibody in the mixed solution (Degterev, et. al., Nature Cell Biology 2>: Y1>-ld> 2 (2001).
  • the cancer therapeutic agents screened by the present invention can be used for the treatment of various cancers.
  • the cancer treatment screened by the present invention is gastric cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, colon cancer, cervical cancer, brain cancer, prostate cancer, bone cancer It may be used for the treatment of head and neck cancer, skin cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer or ureter cancer, most preferably for the treatment of pancreatic cancer.
  • PAUF is a cell that is highly expressed in pancreatic cancer cells, and therefore, the amount of binding thereof is high when binding to GLRX3, SNAP IN or UBL4A as its binding partner. Therefore, the test substance was used as PAUF and its binding partner.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, which comprises a substance which inhibits binding of GLRX3, SNAPIN or UBL4A as PAUF and a binding partner thereof as an active ingredient.
  • the present invention requires a pharmaceutical composition comprising a substance that inhibits the binding of GLRX3, SNAPIN or UBL4A as PAUF (Pancreatic Adenocarcinoma Up-regulated Factor) and its binding partner as an active ingredient. It provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering to a subject.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains a substance which inhibits the binding of GLRX3, SNAPIN or UBL4A as PAUF and its binding partner as an active ingredient, the common content between the two is to avoid excessive complexity of the present specification. Omit the description.
  • composition of the present invention is a pharmaceutical composition
  • composition of the present invention is a pharmaceutical composition
  • Pancreatic Adenocarcinoma Up-regulated Factor (PAUF) of the present invention An effective amount of a binding inhibitor with GLRX3, SNAPIN or UBL4A as its binding partner; And (ii) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • PAUF Pancreatic Adenocarcinoma Up-regulated Factor
  • an effective amount of a binding inhibitor with GLRX3, SNAPIN or UBL4A as its binding partner and (ii) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the term "effective amount” means an amount sufficient to achieve the therapeutic efficacy of the present invention described above.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are conventionally used in the preparation of carbohydrate compounds (e.g., lactose, amylose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, cellulose). , Acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, salt solution, alcohol, gum arabic, vegetable oil (e.g. Corn oil, cotton seed oil, soy milk, olive oil, coconut oil), polyethylene glycol, methyl cellulose, methyl hydroxy benzoate, propyl hydroxy benzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, including but not limited to no.
  • carbohydrate compounds e.g., lactose, amylose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, cellulose.
  • Acacia rubber e.g., calcium phosphate
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like, in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, or the like.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may be determined by factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and reaction response. Various, usually skilled, physicians can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment or prophylaxis. According to a preferred embodiment of the invention, a suitable daily dosage is 0.0001-100 mg / kg body weight. Administration may be once a day or may be divided several times.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of axes, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • the binding inhibitor between the PAUF and the binding partner used as the active ingredient may be various substances.
  • the active ingredient includes a single compound, a combination of compounds (eg, a natural extract or a cell or tissue culture), an antibody or a peptide.
  • the active ingredient used in the present invention can treat various cancers (especially pancreatic cancer) by inhibiting the binding between PAIF and the binding partner and effectively blocking the signaling of PAIF associated with the onset of cancer.
  • cancer drug is screened by analyzing whether the test substance inhibits the binding of GLRX3, SNAP IN or UBL4A as PAUF and its binding partner.
  • composition of the present invention comprising a binding inhibitor between PAUF and binding partner as an effective ingredient can effectively treat various cancers (especially pancreatic cancer) by effectively blocking the signaling of PAIF associated with the onset of cancer.
  • FIG. 1 is a diagram showing PAUF binding protein candidates grown in a medium containing adenine, histidine, leucine, tryptophan, and X-gal as a PAUF protein obtained as a result of yeast to hybrid in HeLa cell cDNA library.
  • FIG. 2 shows the results of pulldown of GLRX3 and UBL4A in pancreatic cancer cell line Cfpac-1 cell extract using His-PAUF protein as a prey, followed by fixation of His-PAUF to Ni-NTA resin, followed by reaction with Cfpac-1 protein extract.
  • Gel photograph showing the results of Western blot analysis with anti-His, anti-GLRX3 and anti-UBL4A antibodies after extraction of immunoprecipitated protein with Ni-NTA resin and separation by SDS-PAGE.
  • Figure 3 shows a plasmid and His- expressing H13, H14 and H32-FLAG, respectively.
  • Figure 5 shows the expression of GLRX3 raRNA and protein panel (a) shows the expression of GLRX3 mRNA in human pancreatic cancer cell line, panel (b) is a gel photograph showing the expression of GLRX3 protein in human pancreatic cancer cell line.
  • FIG. 6 is a photograph confirming the expression of GLRX3 mRNA and protein in the tissue of pancreatic cancer patient by immunohistochemical method, the upper photo is a normal pancreatic tissue photo, the lower photo is a photomicrograph showing a pancreatic cancer tissue.
  • FIG. 7 is a diagram showing UBL4A protein and UBQL4 protein peptide sequences using PAUF protein. [Specific contents to carry out invention]
  • pancreatic cancer cell lines (AsPC-l, BxPC-3, Capan-1, Capan-2, CFPAC-1, HPAC, MIAPaCa-2 and PANC-l), cervical cancer cell line (HeLa) and Chinese hamster ovary cell line (Chinese hamster ovary: CH0) was purchased from the American Type Culture Collection, Manassas, VA. CH0 / PAUF cell line pcDNA3. l (+)-3 ⁇ 4 ⁇ -Myc / His plasmid was constructed by importing into the CHO cell line (Sun A. Kim, et al. Cancer Cancer Sci. 100 (5): 828-836 (2009)). All cells were incubated at 5% C02, 37 ° C. Plasmid Composition
  • the PGBKT7-PAUF plasmid was established by inserting the PAIF expression sequence into the pGBKT7 vector (Clontech) using Nco ⁇ and oRI restriction enzymes as a "feed" protein.
  • the pcDNA3.1 (+)-Myc / His vector Invitrogen
  • pcDNA3.1 (+)-/ 3 ⁇ 4i-Myc / His plasmid with the PAUF gene inserted (Sun A. Kim, et al. , Cancer Sci. 100 (5): 828-836 (2009)).
  • GLRX3 H14
  • deletion mutations GLRX3N and GLRX3C
  • the H13 (SNAPIN) and H32 JBL4A) protein coding sequences were amplified using the primers in Table 1 (pGADT7Rec-H13 and pGADT7 Rec-H32 as templates), followed by restriction enzymes Hind i and Ba to the 3xFLAG-CMV14 vector. Put in. All constructed plasmids were confirmed by sequencing.
  • East-to-hybrid screening was performed using a MATCHMAKER two-hybrid system (Clontech).
  • the feed plasmid pGBKT7-PAUF was transformed into yeast strain AH109, and the transformed AH109 was crossed with the linearized HeLa cell cDNA library (Clontech).
  • Crossed yeast cells were selected first from cells grown in minimal selection medium (QDO paltes) excluding adenine, histidine, leucine and tryptophan, and the potential positive clones showed LacZ activity in the ⁇ -galactosidase test. Selected.
  • plasmids were extracted from the 41 selected positive clones, transferred to bacteria, and cultured. The plasmids extracted from the bacteria were sequenced to find a matching sequence in the BLAST program.
  • plasmid combinations were introduced into HeLa cells using Lipofectamine Plus (Invitrogen). 48 hours after transfection, cell lysis buffer (10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 1 mM PMSF and Protease Inhibitor Cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)) It was dissolved in to give a total protein. To prepare secretory proteins, the cultures were replaced with serum-free cultures 24 hours after plasmid incorporation, and the cultures were collected after 24 hours of incubation. The collected culture was centrifuged to separate cell byproducts.
  • Cell total protein is cytolysis buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 25 mM ⁇ -glycerophosphate, 25 mM NaF, 0.5 M EDTA, 1% NP-40, 0.1 mM PMSF, and 1% protease inhibitor cocktail (Roche) Extracted).
  • cytolysis buffer 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 25 mM ⁇ -glycerophosphate, 25 mM NaF, 0.5 M EDTA, 1% NP-40, 0.1 mM PMSF, and 1% protease inhibitor cocktail (Roche) Extracted).
  • the cell culture medium cultured in serum-free conditions was centrifuged to remove cell by-products, and microcon centrifugal filters (10 kDa cutoff;
  • Reverse transcriptase polymerase chain reaction was performed to confirm the expression of GLRX3 mRNA in the pancreatic cancer cell line.
  • the conditions of the polymerase chain reaction were carried out for a total of 28 cycles of 95 ° C 30 seconds-55 ° C 30 seconds-72 ° C 30 seconds.
  • Primers for polymerase chain reaction are as follows; Forward, 5'-GGGCGGCTGAGGCAGCT-3 '; GLRX3 Reverse, 5' -GCAGGGGGCAGCATGAGTC-3 '; ACTB Forward, 5'-ggcatcctcaccctgaagta-3 '; and ACTB Reverse, 5'-ggggt gt t gaaggt ct caaa-3 '.
  • Non-cancerous tissue adjacent to pancreatic cancer tissue was obtained by surgical resection. Paraffin embedded tissue sections fixed with paraformaldehyde were removed via xylene and stepwise ethane. Endogenous peroxidase activity
  • PAUF binding protein derivation Selection of Three PAUF Binding Protein Candidates by HeLa Cell Library Screening
  • H13 (SNAPIN), H14 (GLRX3) and H32 (UBL4A) proteins with high x-gal activity were tested for additional PAIF binding.
  • the pull-down assay shows the binding between proteins derived from different cells, and thus may differ from in vivo binding.
  • genes encoding the proteins of PAUF, GLRX3 and UBL4A were introduced into the vector and introduced into HeLa cells, followed by co-immunoprecipitation to confirm the binding between proteins in the context of expressing each protein intracellularly. It was.
  • PAUF and BAPCBacterial Alkaline Phasphatase was confirmed (FIG. 3).
  • PAUF and BAPCBacterial Alkaline Phasphatase) cells as a control did not show binding between PAUF and BAP.
  • N-terminal domain of GLRX3 is involved in binding to PAUF.
  • GLRX3 protein is composed of an N-terminal thioredoxin domain and a C-terminal 2X glutaredoxin domain (Panel a of FIG. 4).
  • GLRX3N and GLRX3C GLRX3 mutant structures
  • GLRX3 mRNA The expression level of GLRX3 mRNA was detected in pancreatic cancer cell line, normal pancreatic duct cell line (HPDE) and cervical cancer cell line (HeLa). This was negligible (panel a in FIG. 5). It was confirmed that the GLRX3 protein was expressed in almost all pancreatic cancer and normal pancreatic duct cells, and the expressed GLRX3 protein was secreted extracellularly (Panel b of FIG. 5). In addition, through immunostaining in patient tissues, GLRX3 protein is While it was expressed more in the cytoplasm of pancreatic cancer tissue, it was confirmed that it is not expressed in normal pancreatic duct cells and acinar cells (FIG. 6). Discussion
  • GLRX3 is known to be involved in immune-related signal transduction, it is expected to act functionally by a protein that binds to it because it is an enzyme without the need for activity.
  • GLRX3 expression has been reported to be elevated in human colon and lung cancer tissues (Cancer Epidemiology 2009, Proteomics 2008) .Inhibition of GLRX3 expression in breast cancer cell lines results in increased levels of semi-active oxygen species (R0S) and inhibition of NF-kB activity. Has been reported to inhibit the proliferation of cells. It has also been reported to be closely related to the metastasis and survival of breast cancer patients (Journal of clinical investigation, 2010). However, the exact mechanism by which GLRX3 inhibits R0S is not known.
  • Intracellular products either oxygen molecules or R0S, form disulfide bonds between intracellular proteins and these structures affect the stability of the proteins.
  • Two major pathways for reducing such disulfide bonds in cells are the thioredoxin and glutaredoxin pathways.
  • GLRX3 has recently been reported as a detoxifying enzyme. Cancer cells have higher metabolic activity than normal cells, resulting in increased R0S levels. In addition, many cancer cells have a relatively enhanced antioxidant defense mechanism in order to maintain a redox state and inhibit atoptosis. This will help cancer cells develop more malignant behavior and drug resistance.
  • PAUF and GLRX3 which have increased expression in cancer cells, are expected to be involved in eliminating R0S by binding to each other.
  • the UBL4A protein is not known for its function and is simply known as a housekeeping gene, but recently it has been found to be a member of the Bat3 complex, which is required for the transitional state of synthesized proteins to the ER (endoplasmic reticulum) membrane.
  • RhoA, RhoB and RhoC RhoC proteins are found in pancreatic cancer tissues, especially tumors rather than non-malignant, metastatic lesions rather than primary tumors. ), And has been reported to be closely associated with RhoC expression and metastasis and poor prognosis of patients (r J Cancer, 77: 147-152 (1998)).
  • Pancreatic cancer cell lines show increased or inhibitory effects on cell metastasis and invasion following PAUF overexpression or inhibition. Dial proteins are expected to be involved in this process.
  • SNAPIN protein has been reported to be a protein involved in synaptic vesicle exocytosis in neurons (ZH Sheng et al., Nat. Neurosci., 2 (2): 119-124 (1999)) and SNARE (soluble N) in non-neural mammalian cells. -ethymaleimi de-sensitive fusion protein attachemant protein receptors) was identified (W. Antonin et al., EMBO J., 19: 6453-6464 (2000)).
  • M0DY3 maturity-onse1: diabetes of the young 3
  • HNF nepatocute nuclear factor
  • Collectin has been reported to regulate insulin extracellular flux through the mechanism of SNARE complex by interacting with SNAPIN (K. Fukui and K. Yamagat et al., Cell metabolism, 2: 373-384 (2005)).
  • G-CSF granulocyte colony- It has been reported that stimulating factor receptors (GCSF-R) and SNAPIN interact with each other (Cytokine® 33: 219-255 (2006)) and that they bind to Exo70 and SNAPIN to regulate GLUT4 vesicle trafficking ( JBC, 283 (1). ), 324- 331 (2008)).
  • GCSF-R stimulating factor receptors
  • SNAPIN bind to Exo70 and SNAPIN to regulate GLUT4 vesicle trafficking
  • PAIF secretion was detected in pancreatic cancer cell lines (preliminary studies). PAUF secretion was different in each cell line. mRNA sequence analysis showed no difference between cell lines on the signal sequence encoding the secretion of PAUF protein. Therefore, it is expected that proteins involved in the process of transporting secretory proteins to extracellular cells contribute to the secretion of PAIF, and SNAPIN is likely to act as the protein.

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Abstract

본 발명은 PAUF와 (Pancreatic Adenocarcinoma Up-regulated Factor)와 그의 결합파트너로서의 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A에 시험물질을 접촉시켜, 상기 시험물질이 상기 PAUF와 그의 결합파트너로서의 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A의 결합을 억제하는지 여부를 분석하여 상기 시험물질이 상기 결합을 억제하면 암 치료제로서 판단하는 암 치료제의 스크리닝 방법 및 상기 시험물질을 유효성분으로 포함하는 암의 억제 및 치료의 약제학적 조성물에 관한 것이다. PAUF와 결합파트너 사이의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 암의 발병과 관련된 PAUF의 시그널링을 효과적으로 차단함으로써, 다양한 암(특히, 췌장암)을 치료할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
PAUF 및 그의 결합 파트너를 상호작용을 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법
【기술분야】
본 발명은 PAUF 와 그의 결합 파트너의 상호작용을 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법， 그리고 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
췌장암은 5 년 생존율이 1-4%， 중앙 생존기간이 5 개월에 이르는 치명적인 암으로 인체 암 중에서 가장 불량한 예후를 가진다. 췌장암 환자의 90% 정도는 이미 근치적 수술을 시행할 수 없는 상태에서 발견되기 때문에 예후가 인체 암 중에서 가장 불량하고 치료는 반웅율이 20% 내외에 불과한 항암약물 요법에 의존할 수 밖에 없는 질환으로， 인체에서 발생하는 그 어떤 암 보다도 조기 진단법 개발이 가장 절실히 요망된다.
본 연구진은 인간 췌장암 및 위암 특이 유전자군 DNA 칩 데이타베이스로부터 유도된 전임상 후보 표적 유전자로 PAUF(Pancreatic Adenocarcinoma Up-regulated Factor)를 췌장암의 발암에 관련된 신규 유전자임을 학술지에 보고하였으며 ( ancer Science, 100(5) :826-836 (2009)), 이를 특허출원하였다 (대한민국 특허 제 0954322호).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】 PAUF 유전자의 유도와 저해에 따라 췌장암 세포주의 발암성이 증가 흑은 감소됨을 확인하였으나， PAIF 단백질의 신호 전달 체계에 대해서는 아직까지 알려진 것이 없다. 세포내외의 신호전달은 여러 단백질 간의 상호결합에 의해 조절된다. 따라서, 본 발명자들은 PAIF 와 결합하는 단백질을 찾아 PAUF 단백질의 신호전달 체계를 연구함으로써 PAUF 를 타겟으로 하는 항암 기전에 대한 이해를 넓히고자 연구하였다. 그 결과， 본 발명자들은 PAUF 의 결합 파트너로서 3 개의 단백질을 스크리닝 하였고， PAUF 와 이들 단백질 사이의 상호작용을 억제하는 경우에는 암 (특히， 췌장암) 치료에 대한 새로운 접근 방식을 제공할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또는 다른 목적은 암 예방 또는 치료 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. 【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) PAUF(Pancreatic Adenocarcinoma Up-regulated Factor)와 그의 결합파트너로서의 GLRX3(Ghitaredoxin-3), SNAPINCSNAP-associated protein) 또는 UBL4A(ubiquitin-l ike 4A)에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시험물질이 상기 PAUF 와 그의 결합파트너로서의 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 의 결합을 억제하는지 여부를 분석하는 단계, 상기 시험물질이 상기 결합을 억제하면 암 치료제로서 판단하는 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. PAUF 유전자의 유도와 저해에 따라 췌장암 세포주의 발암성이 증가 혹은 감소됨을 확인하였으나， PAUF 단백질의 신호 전달 체계에 대해서는 아직까지 알려진 것이 없다. 세포내외의 신호전달은 여러 단백질 간의 상호결합에 의해 조절된다. 따라서， 본 발명자들은 PAUF 와 결합하는 단백질을 찾아 PAUF 단백질의 신호전달 체계를 연구함으로써 PAIF 를 타겟으로 하는 항암 기전에 대한 이해를 넓히고자 연구하였다. 그 결과， 본 발명자들은 PAUF 의 결합 파트너로서 3 개의 단백질을 스크리닝 하였고， PAUF 와 이들 단백질 사이의 상호작용을 억제하는 경우에는 암 (특히， 췌장암) 치료에 대한 새로운 접근 방식을 제공할 수 있음을 규명하였다. 본 발명의 방법에 따르면 PAUF 와 그의 결합파트너로서의 GLRX3,
SNAP IN또는 UBL4A에 시험물질을 접촉시킨다.
본 명세서에서 용어 "PAUF" 는 본 발명자에 의해 처음으로 명명된 단백질이다 (대한민국 특허 제 0954322호). 상기 단백질은 정상 췌장조직과 비교하여 췌장암 조직 내에 다르게 발현된다. 상기 PAUF 의 단백질 및 핵산분자의 서열은 GeneBank에 등록되어 있다 (Ac cess ion number: EF067313). 보다 바람직하게는 상기 PAUF 의 단백질 및 핵산분자의 서열은 서열목록 제 1서열을 포함하는 PAUF이다.
본 명세서에서 용어 "GLRX3" 은 글루타레독신 (ghitaredoxin) 패밀리 군의 하나이며， 글루타레독신은 산화환원효소로 글루타티온을 보조인자 (cof actor)로 사용하여 다양한 기질들을 환원시킨다. 보다 바람직하게는 상기 GLRX3 은 서열목록 제 2 서열을 포함하는 GLRX3 이다. 인코딩된 단백질은 아품토시스를 억제하고 세포 성장에 역할을 담당하며， 이 단백질의 핵산분자의 발현은 암 마커로서의 역할을 담당한다.
본 명세서의 용어 "SNAPIN" 은 SNARE( Soluble NSF(N-ethylmaleimide sensitive fusion protein) Attachment Protein REceptor) 콤플렉스의 구성요소의 하나로 시냅스 소포 (synaptic vesicle)의 결합과 융합에 필요한 단백질이다. 보다 바람직하게는 상기 SNAPIN 은 서열목록 제 3 서열을 포함하는 SNAPIN 이다. 상기 단백질의 인산화 상태는 세포외 단백질 간의 상호 작용 및 시냅스 소포의 세포의 외포작용 (exocytosis)에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 본 명세서의 용어 "UBL4A" 는 인간 유전자 UBL4A 에서 인코딩되는 단백질로 그 기능이 밝혀지지 않고 하우스키핑 유전자 정도로 알려졌으나， 최근 ER(endoplamic reticulum)막으로 이동하기 위한 과도기적 상태에 필요한 Bat3 콤플렉스의 한 구성원으로 밝혀졌다 OVa re, 466(26) :1120- 1124 (2010)). 보다 바람직하게는 상기 UBL4A 는 서열목특 제 4 서열을 포함하는 UBL4A이다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, PAIF 는 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A와 세포 내에서 , 특히 암 세포 내에서 결합을 한 상태로 발견된다. 이에， PAUF, GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 에 결합을 하예 PAUF 와 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 와의 결합에서 경쟁관계에 있는 것으로 판정된 시험물질은 PAIF 와 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 과의 결합을 억제시킬 수 있는 특징을 갖는다.
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 시험 물질은 단일 화합물， 화합물들의 흔합물 (예컨대， 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)， 항체 또는 펩타이드이다. 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co. (UK) , Comgenex(USA) , Brandon Associates(USA) , Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며， 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories (USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다.
시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며， 예를 들어, 생물학적 라이브러리， 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리 (spatial ly addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법， "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법， 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은， DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90： 6909 (1993)； Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91： 11422 (1994)； Zuckermann et al. , J. Med. Chem. 37： 2678 (1994)； Cho et al . , Science 261： 1303 (1993)； Carel 1 et al . , Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33： 2059 (1994)； Carell et al., Angew. Chew. Int. Ed. Engl. 33， 2061； Gallop et al., J. Med. Chem. 37： 1233 (1994) 등에 개시되어 있다.
본 명세서에서， 용어 "펩타이드" 는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미하며， 통상적으로 아미노산 잔기 4-40개를 포함한다.
본 발명의 PAUF 와 그의 결합 파트너 사이의 결합 억제제로서의 펩타이드는 당업계에서 통상적으로 사용하는 고체상 (sol id-phase) 합성 방법에 의해 제조된다 (Merrifield, R. B.， J. Am. Chem. Soc. ， 85:2149- 2154 (1963), Kaiser, E. , Colescot, R. L. , Bossinger, C. D. , Cook, P. I,, Anal. Bioche . , 34:595-598 (1970)). 즉， α-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 레진에 결합시킨 후, a-아미노 보호기를 제거하고 남은 a-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 원하는 순서로 단계적으로 커플링하여 중간체를 얻는다. 상기 본 발명의 PAUF 억제제 펩타이드를 제조하기 위한 아미노산 서열은 종래의 방법을 참조하였다 (Chen L, Hahn H, Wu G, Chen CH, Liron T, Schechtman D, Caval laro G, Banci L, Guo Y, Bolli R, Dorn GW, Mochly-Rosen D.， Proc. Natl. Acad. Sci . , 98, 11114-9 (2001); Phillipson A, Peterman EE, Taormina P Jr, Harvey M, Brue RJ, Atkinson N, Omiyi D, Chukwu U, Young LH. , Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. ,289, 898-907 (2005)； 및 Wang J, Bright R, Mochly- Rosen D, Giffard RG.， Neuropharmacology. ,47, 136-145 (2004)).
본 명세서에서， 용어 "천연 추출물" 은 천연물의 다양한 기관 또는 부분 (예: 잎， 꽃， 뿌리， 줄기， 가지， 껍질 및 과실 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하며， 천연 추출물은 (a) 물， (b) 탄소수 1-4 의 무수 또는 함수 저급 알코을 (메탄을， 에탄올, 프로판을， 부탄올， 노말 -프로판올, 이소-프로판을 및 노말-부탄올 등)， (c) 상기 저급 알코을과 물과의 흔합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트， (f) 클로로포름， (g) 1,3- 부틸렌글리콜， (h) 핵산 U) 디에틸에테르를 추출 용매로 하여 얻을 수 있다.
본 발명에서 시험물질로서 항체가 이용될 수도 있다. 상기 항체는
PAUF, GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 와 특이적으로 결합하는 항체이다. 또는, 본 발명에서 시험물질로서 이용되는 항체는 이중특이성 항체 (bispecific antibody)를 포함한다. 예컨대, PAUF와 GLRX3에 이중적으로 특이성을 갖는 항체가 이용될 수 있다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며， 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들， 예를 들어, 융합 방법 (Kohler and Mi lstein, European Journal of Immunology, 6:511—519 (1976)), 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제 4,816,56 호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법 (Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol. , 222:58， 1-597 (1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999； Zola, H. , Monoclonal Antibodies- A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. , Boca Raton, Florida, 1984； 및 Coligan ， CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991 에 상세하게 기재되어 있으며， 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체 -생산 림프구와 융합시켜 이루어지며， 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 항원을 적합한 동물에게 주사하고， 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성 (affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 는 세포 외 (/? vitro) 하나의 용액에 포함되어 있다. 즉， 본 발명의 방법은 인 ^-트 ^에서 하나의 반웅용액으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 정제된 PAUF 및 GLRX3 단백질과 시험물질을 포함하는 반웅용액을 이용하여 본 발명의 분석을 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 는 세포 내 (/ vivo)0]} 포함되어 있다. 즉， 본 발명의 방법은 세포내에서의 반웅을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, PAUF 및 GLRX3 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하여 세포 내에서 PAUF와 GLRX3 의 결합이 억제되는 지 분석한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명에서 이용되는 세포는 암 세포이다. 암 세포의 경우 PAUF와 고발현 되어 있어 본 발명의 분석을 용이하게 하는 환경을 제공한다. 상기 사용되는 암 세포는 위암， 폐암， 유방암， 난소암， 간암， 기관지암, 비인두암， 후두암， 췌장암, 방광암， 대장암， 결장암， 자궁경부암, 뇌암， 전립선암, 골암， 두경부암, 피부암， 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암의 세포를 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는， 본 발명에서 사용되는 암 세포는 췌장암 세포이다.
본 발명에서 PAUF 의 결합파트너로서 규명된 단백질은 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 이다. 바람직하게는， 본 발명의 방법에서 이용되는 PAIF 의 결합파트너는 GLRX3이다. 보다 바람직하게는， 본 발명의 방법에서 이용되는 PAUF 의 결합파트너는 GLRX3 의 티오레독신 도메인인 것을 특징으로 한다. GLRX3 은 크게 N-말단의 티오레독신 도메인과 C-말단의 2 개의 글루타레독신으로 이루어져 있다. 하기 실시예에서 입증된 바와 같이， 상기 각각의 티오레독신 도메인을 제거한 돌연변이 (GLRX3C) 및 2 개의 글루타레독신 도메인을 제거한 돌연변이 (GLRX3N)을 구축하여 인 비보 공동면역침강을 하는 경우, 티오레독신 도메인만으로 구성된 구조 (GLRX3N)에서 PAIF와 공동면역침강 된다. 반면에， 티오레독신 도메인이 제거된 돌연변이에서는 PAIF와 공동면역침강 되지 않는다.
PAUF, 그의 결합파트너 및 시험물질을 접촉시킨 다음, 상기 시험물질이 PAUF 와 그의 결합파트너 사이의 결합을 억제하는지 여부를 분석한다.
이러한 결합 분석은， 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 단계 (b)는 투 -하이브리드 방법， 공동면역침강 방법((:위瞧11110^6(^1) ；31^011 assay) , 공동-국소화 분석 (co-localization assay) , 섬광 근접 즉정법 (scinti 1 lation proximity assay: SPA), UV 또는 화학적 가교 결합 방법， 이분자 상호작용 분석 (bimolecular interaction analysis: BIA) , 질량 분석법 (mass spectrometry: MS) , N R(nuclear magnetic resonance) 또는 형광 편광 분석법 (fluorescence polarization assays, FPA)에 의해 실시된다.
본 명세서에서의 용어 , "투 -하이브리드 방법" 은 분할 가능한 DNA- 결합 및 활성화 도메인으로 구성된 전사인자의 모들 특성에 기초한다. 이 경우, 베이트 (bait)로서 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 가 이용되고 프레이 (prey)로서 PAUF가 이용될 수 있다. 또한, 이와 반대로 컨스트럭션을 만들 수도 있다. 이 방법에 따르면， PAUF 와 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 의 상호작용을 억제하는 물질을 스크리닝 할 수 있다. 투 -하이브리드 시스템은 간단하게는， 이 분석 방법은 두 가지 DNA 컨스트럭트를 이용한다. 예컨대, 하나의 컨스트럭트에서， GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A-코딩 폴리뉴클레오타이드를 공지의 전사 인자 (예컨대， GAL-4)의 DNA 결합 도메인 -코딩 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 다른 컨스트력트에서， PAUS 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 상기 공지의 전사인자의 활성화 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 만일， 베이트 및 프레이가 인 ^^에서 상호작용하여 복합체를 형성하면， 전사인자의 DNA-결합 및 활성화 도메인이 인접하게 되며, 이는 리포터 유전자 (예컨대, LacZ)의 전사를 촉발하게 된다. 시험물질이 PAUF 와 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 의 상호작용을 억제한다면， 리포터 유전자의 발현을 방해할 것이며， 결론적으로 암 억제제로 이용될 수 있음을 나타내는 것이다. 상기 투- 하이브리드 방법 외에 쓰리 -하이브리드 방법을 따라서도 실시할 수 있다 (U.S. Pat. No. 5,283,317； Zervos et al., Cell 72, 223-232, 1993； Madura et al . , J. Biol. Chem. 268, 12046-12054, 1993； Bartel et al . , BioTechniques 14， 920-924, 1993； Iwabuchi et al. , Oncogene 8， 1693- 1696, 1993； 및 TO 94/10300).
본 명세서에서의 용어, "공동면역침강 방법 (co-immunoprecipitation assay, Co-IP)" (Harlow and Lane, Eds. , Antibodies-' A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))에 따르면, 배양세포가 생산하는 항원성 물질을 측정할 때， 미량이라 직접 측정이 불가능하면, 우선 배양액에 ¾-라이신 등을 첨가하여 표적물질을 표지하여 배양 상층액을 취한다. 이 상층액에 특이항체와 항원항체복합물이 형성될 수 있는 동일한 농도의 비표지표적물질을 첨가하여 침강반웅을 일으키면， 배양액 내의 미량 표지된 표적물질도 침강물에 함께 공동침강반웅이 일어나기 때문에 침강물의 방사활성으로 표적물질을 측정할 수 있다. 단백질의 큰 복합체의 일원으로 알려진 공지의 단백질을 표적으로 하는 항체를 선별하고， 상기 항체를 가지고 알려진 복합체를 표적으로 하여 총 단백질 콤플렉스를 용액에 침전시켜 상기 복합체의 알려지지 않은 단백질을 동정한다. 이는 알려지지 않은 물질이 미량인 경우에 직접 측정이 불가능하므로 배양액에 표적물질로 표지하여 배양상층액을 취하고， 상기 상층액에 특이 항체와 단백질복합체가 형성될 수 있는 동일 농도의 비표지표적물질을 첨가하여 침강반웅을 일으키도록 하면， 미량 표지된 표적물도 같이 공동 침강 반웅이 일어나게 된다. 용액 밖으로 단백질복합체가 빠져 나온다는 개념 때문에 풀다운 (pull-down)이라고 언급된다. 공동면역 침강법은 단백질-단백질 상호작용을 분석하기 위해 널리 이용된다.
본 명세서에서의 용어， 공동-국소화 분석 (co-localization assay)은 형광염색법을 이용하여， 형광 현미경에서 두 개 그 이상의 다른 각각의 차별화된 방출 파장을 가지는 형광 라벨 사이에 공간적 오버랩을 관찰하여， 세포의 같은 공간에 위치하거나 다른 세포와 매우 근접한 위치에 있는 다른 표적을 관찰하는데 이용되는 분석법이다. 다른 2 가지의 형광으로 염색한 단백질들을 컨포컬 현미경으로 스캐닝하고， 특정 위치에 나타난 색깔을 측정하여 2 가지 단백질의 위치가 한 곳에 위치하고 있음을 규명할 수 있으며， 이 단백질들이 상호작용을 하고 있음을， 즉 기능적으로도 결합하고 있다는 점도 유추할 수 있는 장점을 가진다 (Manders et al , Journal of Microscopy 169:375-382 (1993)； Paw ley JB, Handbook of Biological Confocal Microscopy, 2006)) .
본 명세서에서의 용어， 섬광 근접 측정법 (scintillation proximity assay: SPA)은 에너지를 가지는 전자에 의해 형광작용을 일으키는 폴리비닐-를루엔 플라스틱 신딜레이터 비드 (scintillator beads)에 항체를 부착하고， 수용액 상에서 쉽게 에너지를 잃거나 소멸되는 낮은 에너지의 전자를 방출하는 방사성 핵종을 비드 (beads)에 부착된 항체에 선택적으로 결합하는 항원에 표지하여 항원 -항체 결합의 정도를 발생되는 형광 측정을 통해 관찰하는 방식을 말한다 (Alouani, Methods Mo J. Biol. 138： 135-41 (2000)) . 이 방식을 이용하면 일반적으로 방사 면역측정법이 가지는 단점인 결합분획과 유리분획의 분리과정이 필요하여 보편적인 시스템의 구축이 어려운 점을 극복가능하고， 민감도가 높고 분리 과정이 필요 없다는 특징을 가진다. 방사성 핵종이 표지된 항원과 비드상에 부착된 항체간의 결합이 이투어지면， 항원에 표지된 방사성 핵종이 방출하는 낮은 에너지의 전자가 비드에 도달하여 에너지를 전달하고， 에너지를 받은 비드는 형광을 방출하게 된다. 이 방출된 형광은 액체섬광계수기로 항체-항원의 결합 양에 따른 비례를 보이며 증가되는 것을 측정할 수 있다.
본 명세서에서의 용어， 화학적 가교 결합 방법 (chemical cross- linking)은 단백질이나 핵산 등의 생체 고분자에 대하여 가교 시약을 이용하여 화학적인 공유결합을 형성시켜, 단백질의 소유닛 구조, 단백질- 핵산의 상호작용， 단백질-단백질 상호작용의 해석 등 분자 간 반웅에 의해 기능을 발휘되는 특성을 분석하는데 이용되는 방식을 말한다 (Fancy, Curr. Opin. Chew. Bio J. 4:28-33 (2000)) . 또한 단백질 분자의 고정화， 항체의 효소 표식과 같은 공유결합에 의한 단백질 접합체 구조의 안정화에 이용된다. 가교 시약은 일반적으로 동일 분자내 아민기 (-NH2), 티올기 (-SH) 및 카복시산기 (-C00H) 등의 작용기에 특이적을 반웅하거나， 광조사에 의한 활성화가 일어날 수 있는 작용기를 양단에 갖는 2가성 가교시약을 이용한다. 단백질 간의 상호 작용을 관찰하기에는 너무 그 결합력이 매우 약하거나 일시적이지만 화학적 가교결합 방식을 이용하면 단백질 간의 상호결합을 캡처시켜 분석하는데 용이하다는 장점을 가진다.
본 명세서에서의 용어， 이분자 상호작용 분석 (bimolecular interaction analysis: BIA)은 실시간으로 특이적 상호작용을 분석하는 기술로서， 상호작용물 (interactants)의 레이블링 없이 실시할 수 있는 방식을 말한다 (예컨대， BIAcoreTM)(Sjolander & Urbaniczky, Anal. Chem. 63:2338-2345(1991), and Szabo et al. , Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699- 705(1995)). 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에서의 변화는 분자들 사이의 실시간 반웅에 대한 지시자 (indicator)로 이용될 수 있다.
본 명세서에서의 용어， 형광 편광 분석법 (fluorescence polarization assays, FPA)은 C 반웅성 단백질 (C reactive protein, CRP)에 형광색소인 플루오레세인을 결합시킨 트레서와 CRP 에 특이적으로 결합하는 항체를 혼합한 용액에， 측정 대상물로서의 CRP 를 포함하는 체액 (특히， 혈액)을 첨가하는 방법으로, 흔합 용액 중의 항체에 대한 트레서와 CRP 의 경합에 근거하여, CRP 를 측정하는 방식을 말한다 (Degterev, et al., Nature Cell Biology 2>:Y1>-ld>2 (2001)). 질량 분석법에 의한 방식 (McLafferty et al., Science 284:1289-1290 (1999) and Degterev, et al . , Nature Cell Biology 3： 173-182 (2001)), 또는 핵 자기 공명법에 의한 방식 (Shuker etal., Science 274:1531-1534 (1996), Hajduk et al . , J. Med. Chem. 42:2315-2317 (1999), and Chen and Shapiro, Anal. Chem. 71:669A-675A (1999))을 이용하여 미지의 시료의 구조를 분석하는데 이용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 다르면， 본 발명에 의해 스크리닝된 암 치료제는 다앙한 암의 치료에 이용될 수 있다. 바람직하게는， 본 발명에 의해 스크리닝된 암 치료제는 위암, 폐암， 유방암, 난소암， 간암， 기관지암， 비인두암， 후두암， 췌장암， 방광암， 대장암， 결장암, 자궁경부암， 뇌암， 전립선암， 골암， 두경부암， 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암의 치료, 가장 바람직하게는 췌장암의 치료에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 특히 PAUF는 췌장암 세포에서 고발현되는 세포이므로， 그의 결합파트너로서의 GLRX3, SNAP IN 또는 UBL4A 과의 결합시킬 때 그에 의한 결합량이 높다. 이에 상기 시험물질이 PAUF 와 그의 결합파트너로서의
GLRX3, SNAP IN또는 UBL4A 의 결합을 억제하게 되면， 암 치료제로서 판단할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 PAUF 와 그의 결합파트너로서의 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 의 결합을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 예방또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 PAUF(Pancreatic Adenocarcinoma Up-regulated Factor)와 그의 결합파트너로서의 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 의 결합을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암 예방또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 PAUF 와 그의 결합파트너로서의 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 의 결합을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여， 그 기재를 생략한다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물인 경우， 본 발명의 조성물은
(i) 본 발명의 PAUF(Pancreatic Adenocarcinoma Up-regulated Factor)와 그의 결합파트너로서의 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 와의 결합 억제제의 유효량; 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 명세서에서 용어 "유효량" 은 상술한 본 발명의 치료 효능을 발휘하는 데 층분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 탄수화물류 화합물 (예: 락토스， 아밀로스， 덱스트로스， 수크로스， 솔비톨， 만니를， 전분， 셀를로스， 등)， 아카시아 고무, 인산 칼슘， 알기네이트， 젤라틴， 규산 칼슘， 미세결정성 셀를로스, 폴리비닐피를리돈， 샐를로스， 물， 시럽, 염 용액， 알코올， 아라비아 고무， 식물성 기름 (예: 옥수수 기름， 목화 종자유, 두유， 올리브유， 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜， 메틸 셀를로스， 메틸히드록시 벤조에이트， 프로필히드록시 벤조에이트， 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제， 감미제， 향미제， 유화제, 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed. , 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입， 피하 주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식， 환자의 연령， 체중， 성， 병적 상태， 음식， 투여 시간, 투여 경.로， 배설 속도 및 반웅 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하며， 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 적합한 1 일 투여량은， 0.0001-100 mg/kg (체중)이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고， 수회 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액 또는 유화액 형태이거나 액스제， 분말제, 과립제， 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며， 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에서, 유효성분으로 이용되는 PAUF 와 결합파트너 사이의 결합 억제제는 다양한 물질일 수 있다. 예를 들어， 상기 유효성분은 단일 화합물， 화합물들의 흔합물 (예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 항체 또는 펩타이드를 포함한다.
본 발명에서 이용되는 유효성분은 PAIF 와 결합파트너 사이의 결합을 억제하여， 암의 발병과 관련된 PAIF의 시그널링을 효과적으로 차단함으로써， 다양한 암 (특히， 췌장암)을 치료할 수 있다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명에 따르면， 시험 물질이 PAUF 와 그의 결합파트너로서의 GLRX3, SNAP IN 또는 UBL4A 의 결합을 억제하는지 여부를 분석하여 암 치료제를 스크리닝 한다.
(b) PAUF와 결합파트너 사이의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 암의 발병과 관련된 PAIF 의 시그널링을 효과적으로 차단함으로써， 다양한 암 (특히， 췌장암)을 치료할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1 은 HeLa 세포 cDNA 라이브러리에서 이스트 투 하이브리드 결과 얻어진 PAUF 단백질로 아데닌， 히스티딘， 류신， 트립토판이 배제되고， X- gal 이 포함된 배지에서 자란 PAUF 결합 단백질 후보들을 보여주는 그림이다. 도 2 는 His-PAUF 단백질을 프레이로 이용한 췌장암 세포주 Cfpac-1 세포 추출물에서의 GLRX3 및 UBL4A 의 풀다운 결과로 His-PAUF 를 Ni-NTA 레진에 고정시킨 후， Cfpac-1 단백질 추출물과 반웅시킴. Ni-NTA 레진과 함께 면역침강된 단백질 추출 후 SDS-PAGE 로 분리 후 항 -His, 항 -GLRX3 및 항 -UBL4A항체로 웨스턴 블렛 분석을 수행시킨 결과를 나타낸 겔 사진이다. 도 3은 H13, H14 및 H32-FLAG을 각각 발현시키는 플라스미드와 His-
PAUF 를 발현시키는 플라스미드를 HeLa 세포주에서 공동 발현시킨 후， 세포 단백질 추출물을 Ni-NTA 레진과 반웅시켜 결합 침전물을 분리하고, 분리된 결합 침전물에 대한 웨스턴 블럿 수해을 나타낸 인 비보 실험 겔 사진이다. 도 4 는 패널 (a)는 GLRX3 의 PAUF 결합 도메인 중 구축된 GLRX3 의 돌연변이 구조를 보여주며， 패널 (b)는 돌연변이 GLRX3 구조 및 PAUF 간의 인 비보 결합 시험이다.
도 5 는 GLRX3 raRNA 와 단백질의 발현을 보여주는 것으로 패널 (a)는 인체췌장암 세포주에서의 GLRX3 mRNA 발현을 보여주며， 패널 (b)는 인체 췌장암 세포주에서의 GLRX3 단백질의 발현을 보여주는 겔 사진이다.
도 6은 췌장암 환자 조직에서의 GLRX3 mRNA와 단백질의 발현을 면역 조직화학 방법으로 확인 하는 사진으로 상단 사진은 정상 췌장 조직 사진이며, 하단 사진은 췌장암 조직 사진을 보여준 현미경 사진이다.
도 7 은 PAUF 단백질을 이용하여 UBL4A 단백질 및 UBQL4 단백질 펩타이드 서열을 보여주는 그림이다. 【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로ᅳ 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실험 재료 및 실험 방법
세포배양
8 종의 췌장암 세포주 (AsPC-l, BxPC-3, Capan-1, Capan-2, CFPAC-1, HPAC, MIAPaCa-2 및 PANC-l), 자궁경부암 세포주 (HeLa)와 중국 햄스터 난소 세포주 (Chinese hamster ovary: CH0)는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA)으로부터 구입하였다. CH0/PAUF 세포주는 pcDNA3. l(+)- ¾^ -Myc/Hi s plasmid 를 CHO 세포주에 이입하여 구축하였다 (Sun A. Kim, et al .ᅳ Cancer Sci. 100(5) :828-836(2009)) . 모든 세포는 5% C02, 37 °C 조건에서 배양하였다. 플라스미드 구성
이스트 투 하이브리드 분석을 위해, "먹이" 단백질로 PAIF 발현 서열을 Nco\ 과 oRI 제한효소를 이용하여 pGBKT7 백터 (Clontech)에 넣어 PGBKT7-PAUF 플라스미드를 확립하였다. 포유류에서의 발현을 위해， PAUF 유전자가 삽입된 pcDNA3.1(+)-Myc/His 백터 (Invitrogen) , pcDNA3.1(+)- /¾i -Myc/His 플라스미드 (Sun A. Kim, et al., Cancer Sci. 100(5) :828- 836(2009))를 사용하였다. GLRX3(H14)와 결손 돌연변이 (GLRX3N 및 GLRX3C) 발현을 위해， H14 가 들어가 있는 이스트 플라스미드 pGADT7Rec- H14( clontech)를 주형으로 하여 각각의 프라이머 (표 1)를 이용해 단백질 코딩 서열을 증폭하고， 제한효소 Not\ 와 Ba/ l 를 이용하여 3xFLAG-CMV14 백터 (Sigma)에 넣었다. H13(SNAPIN) 과 H32 JBL4A) 단백질 코딩 서열은 표 1 의 프라이머를 이용해 증폭시킨 후 (pGADT7Rec-H13 및 pGADT7 Rec-H32 를 주형으로 사용함)， 제한효소 Hind i 와 Ba 을 이용하여 3xFLAG-CMV14 백터에 넣었다. 구성된 모든 플라스미드는 시뭔싱으로 확인하였다.
【표 11
Figure imgf000017_0001
이스트 투 하이브리드 스크리닝
이스트 투 하이브리드 스크리닝은 MATCHMAKER two-hybrid system(Clontech) 을 이용하여 수행하였다. 먹이 플라스미드 pGBKT7-PAUF를 이스트 균주 AH109 에 형질전환시켰고, 형질전환된 AH109 는 선형질전환된 HeLa 세포 cDNA 라이브러리 (Clontech)와 교배하였다. 교배된 이스트 세포들은 아데닌, 히스티딘， 루이신 및 트립토판이 배제된 최소 선택배지 (QDO paltes)에서 자란 세포들에서 1차 선택하였고, 잠정적인 양성 클론들은 β-갈락토시다아제 시험에서 LacZ 활성을 보이는 것으로 선택하였다. 최종적으로 선택된 41 개의 양성 클론에서 플라스미드를 추출하여 박테리아로 이입시킨 후 증식배양 하였다. 박테리아에서 뽑은 플라스미드를 시뭔싱하여 BLAST 프로그램에서 일치하는 시뭔스를 찾아내었다.
In vitro결합시험 (His Pull-down)
His 풀다운 실험을 위해, 농축한 CHO/PAUF-His 세포배양액을 Ni-NTA 레진 (Novagen, Madison, WI)과 10 mM 이미다졸이 함유된 Ni-NTA 결합 완층액 하에서 4°C에서 반웅시켰다. 밤새 배양시킨 Ni-NTA 레진을 20 mM 이미다졸이 포함된 Ni-NTA 결합버퍼로 3 회 세척 후， Cfpac-1 800 fig 전단백질과 4 시간 동안 반웅 시킨다. 4 시간이 지난 후 레진을 Ni-NTA 결합버퍼로 5 회 세척하고， 레진에 결합되어 있는 단백질들을 SDS 샘플 버퍼에 녹여내서 SDS-PAGE분석을 하고 웨스턴 블럿을 수행하였다.
In vivo결합시험
적절한 플라스미드 조합을 Lipofectamine Plus(Invitrogen)를 이용하여 HeLa 세포에 이입하였다. 이입 후 48 시간이 지나서 , 세포 용해 버퍼 (10 mM Tris, pH 7.5， 10 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 1 mM PMSF 및 프로테아제 억제자 칵테일 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany))로 용해시켜 총단백질을 얻었다. 분비단백질 준비를 위해, 플라스미드 이입 후 24 시간 되었을 때 배양액을 혈청이 없는 배양액으로 교체시키고， 다시 24 시간 배양 후 배양액을 모았다. 모인 배양액은 원심분리 하여 세포 부산물들을 분리하였다. His-태그된 단백질에 대한 면역침강을 위해， 300 j«g의 총단백질과 배양액을 Ni-NTA 레진과 함께 4°C에서 5시간 동안 반웅시켰다. 5시간후 세척 버퍼 (50 mM Tris, H 7.5， 150 mM NaCl 및 0·5¾> Triton X-100)로 5 회 세척 후 레진에 붙어있는 단백질들을 SDS 샘플 버퍼에 녹여내서 SDS-PAGE 와 웨스턴 블럿을 수행하였다. 단백질 추출 및 웨스턴 블럿 분석
세포 총단백질은 세포 용해 버퍼 (50 mM Tris, 150 mM NaCl , 25 mM β -glycerophosphate, 25 mM NaF, 0.5 M EDTA, 1% NP-40, 0.1 mM PMSF, and 1% 프로테아제 억제자 칵테일 (Roche))를 이용하여 추출하였다. 분비단백질 준비를 위해， 혈청이 없는 조건에서 배양한 세포배양액을 원심분리하여 세포 부산물들을 제거하고, microcon centrifugal filters(10 kDa cutoff;
Ami con, Houston, TX)를 이용하여 농축하였다. 세포 총단백질 및 배양액은
SDS-PAGE 로 분리하고 PVDF 막 (Millipore, Bill erica, MA)으로 옮긴다. 단백질이 블로팅 된 막은 5%(w/v) 저지방 우유로 비특이적 반웅을 막은 후
His 에 대한 항체 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 혹은
PAUF 에 대한 항체 (C cer Science, ， 100(5) :826-836(2009))를 반웅시켰다. 면역반웅이 있는 단백질은 West Pico Chemi luminescent Substrate (Thermo
Scientici, Rockford, IL)로 가시화 하였다. 역전사 중합효소 연쇄반웅 (RT-PCR)
췌장암 세포주의 GLRX3 mRNA 발현을 확인하기 위해 역전사 중합효소 연쇄반웅을 수행하였다. 중합효소 연쇄 반웅의 조건은 95°C 30 초- 55 °C 30 초- 72 °C 30 초로 총 28 주기를 수행하였다. 중합효소 연쇄반웅을 위한 프라이머는 다음과 같다; 정방향, 5' -GGGCGGCTGAGGCAGCT-3' ； GLRX3 역방향, 5' -GCAGGGGGCAGCATGAGTC-3' ； ACTB 정방향， 5' - ggcatcctcaccctgaagta-3' ； 그리고 ACTB 역방향， 5' - ggggt gt t gaaggt c t caaa-3 ' . 면역화학염색 췌장암 조직과 인접한 비암성 조직은 수술적 절제 방법으로 얻었다. 파라포름알데하이드로 고정시킨 파라핀 포매 조직 섹션을 자일렌과 단계별 에탄을을 거쳐 파라핀을 제거하였다. 내생적인 퍼옥시다아제 활성은
0.3%(v/v) 과산화수소로 막고, 시트레이트 완층액 (0.01 , pH 6.0)하에 전자레인지에서 3분간 끓여 항원을 끌어내었다. 비특이적 반웅을 막기 위해 10% 정상 당나귀 혈청을 처리해 준 후， GLRX3에 대한 단일클론 항체 (1:500， Abnova, Taipai, Taiwan)과 반웅 시켰다. 바이오틴화 링크 유니버설 & 스트렙타비딘 -HRP 컨쥬게이트 (DakoCytomation, Ft. Collins, CO)로 반웅 후 크로모젠으로 발색하였고， Harris 헤마토자일린 용액 (Sigma)으로 상대염색 하였다. 실험결과
PAUF결합 단백질도출; HeLa 세포 라이브러리스크리닝을 통해 3개의 PAUF 결합단백질후보자 선정
인간 HeLa 세포 cDNA 라이브러리에서의 이스트 투 하이브리드 방법을 통해 PAUF 단백질과 결합하는 41 개 클론들을 찾아내었고 (도 1)， 각 클론에 대해 DNA스뭔싱 방법을 통해 동정하였다 (표 2 및 표 3).
이들 중， x-gal 활성이 높은 H13(SNAPIN), H14(GLRX3) 와 H32(UBL4A) 단백질을 대상으로 추가적인 PAIF 결합에 대한 실험을 진행하였다.
2]
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000021_0002
【표 3】
Clone* Identffiedpr n
Human RNA for HLA-B 72 antigen
30 Horao sapiens (clone p F18) HC class I HLA-B 62
27 HLA-C major histocon Ubility complex, class I， C
Figure imgf000022_0001
In vitro결합시험
PAUF를 과발현 하는 CH0/PAUF 세포주로부터 PAUF-His 단백질만을 Ni- NTA 레진에 결합시킨 후 (PAUF-His/Ni-NTA)를 췌장암 세포주 Cfpac-1 총단백질과 결합을 유도하였다. PAUF 가 결합되어 있는 Ni-NTA 레진에는 GLRX3 단백질과 UBL4A 단백질이 각각 결합하는 것을 확인한 반면， PAUF 가 결합되어 있지 않은 Ni-NTA 레진 자체에는 GLRX3 와 UBL4A가 결합하지 않는 것을 확인하였다 (도 2). 이는 GLRX3 혹은 UBL4A 단백질와 PAUF 와의 결합이 특이적인 결과임을 보여주는 것이다. In vivo 결합시험; 공동 -면역침강법
Pull -down 어세이 방법은 서로 다른 세포에서 유래시킨 단백질간의 결합을 보여주는 것이므로， 생체내 결합과는 차이를 보일 수 있다. 이러한 단점을 극복하고자， PAUF, GLRX3 및 UBL4A 각 단백질을 코딩하는 유전자를 백터에 넣어 HeLa 세포에 이입시킨 후 공동 -면역침강을 수행하여 각 단백질을 세포내에서 발현시킨 상황에서 단백질 간의 결합을 확인하고자 하였다. 그 결과 PAUF 와 GLRX3, PAUF 와 UBL4A 를 발현시킨 세포에서는 두 단백질간의 결합을 확인할 수 있었다 (도 3). 이에 비해 대조군으로 PAUF 와 BAPCBacterial Alkaline Phasphatase)를 이입시킨 세포에서는 PAUF 와 BAP간의 결합을 나타내지 않았다.
GLRX3의 N-말단도메인이 PAUF와의 결합에포함됨.
PAUF 결합 단백질 중 하나인 GLRX3 단백질은 N-말단의 티오레독신 도메인과 C-말단의 2 X 글루타레독신 도메인으로 구성되어 있다 (도 4 의 패널 a). 두 개의 도메인 중 어느 것이 PAUF와 결합하는 부분인지 규명하기 위해 아래 그림과 같이 두 가지 형태의 GLRX3 돌연변이 구조 (GLRX3N 과 GLRX3C)를 만들어서 인 비보 공동면역침강 실험을 수행하였다. 그 결과 GLRX3 와 GLRX3 의 티오레독신 도메인만으로 구성된 구조 (GLRX3N)는 PAUF는 공동면역침강 되지만, GLRX3의 C-말단 도메인만으로 구성된 구조 (GLRX3C)는 PAUF 와 공동면역침강 되지 않았다. 이 결과는 GLRX3 의 N-말단의 티오레독신 도메인이 PAUF와 결합하는 부분임을 보여준다 (도 4의 패널 b). 췌장암세포주와환자조직에서의 GLRX3 발현 분포
GLRX3 mRNA 발현 정도를 췌장암 세포주와 정상 췌관 세포주 (HPDE), 자궁경부암 세포주 (HeLa)에서 확인한 결과， 모든 췌장암 세포주와 HeLa에서 GLRX3 mRNA 가 발현하는 것을 확인한 반면， 정상 췌관 세포주 HPDE 세포주에서는 GLRX3 의 mRNA 발현이 미미하였다 (도 5 의 패널 a). GLRX3 단백질은 거의 모든 췌장암 및 정상 췌관 세포에서 발현함을 확인하였고， 발현된 GLRX3 단백질은 세포외로 분비되는 것을 확인하였다 (도 5의 패널 b). 또한 환자 조직에서의 면역 염색을 통해, GLRX3 단백질이 정상 조직 보다 췌장암 조직의 세포질에서 더 많이 발현하는 반면 정상 췌관 세포와 세엽 (acinar) 세포에서는 발현되지 않음을 확인하였다 (도 6). 토의 사항
GLRX3 는 면역 관련 신호 전달에 관여할 것으로 알려지고 있으나， 활성에 필요한 시원스가 없는 효소이기에 이에 결합하는 단백질에 의해 기능적으로 작용을 할 것으로 예측되고 있다. GLRX3 의 발현은 인체 결장암과 폐암 조직에서 증가되어 있음이 보고된바 있고 (Cancer Epidemiology 2009, Proteomics 2008) , 유방암 세포주에서 GLRX3 발현을 저해하면 반웅성 산소종 (R0S) 레벨 증가와 NF-kB 활성 저해를 유발시켜 그 결과 세포의 증식을 억제한다는 보고가 있다. 또한 유방암 환자의 전이 및 생존률과도 밀접한 관계가 있다고 보고되었다 (Journal of clinical investigation, 2010). 그러나 GLRX3가 R0S를 저해하는 정확한 메커니즘에 대해서는 밝혀지지 않았다.
세포내 산물인 산소 분자나 R0S는 세포내 단백질 간의 이황화 결합를 형성하고 이러한 구조는 단백질의 안정성에 영향을 준다. 세포내에서 이와 같은 이황화 결합을 환원시키는 두 가지 주된 경로로 티오레독신과 글루타레독신 경로가 있다. GLRX3는 해독 관련 효소로 최근 보고되고 있다. 암세포의 경우 정상 세포에 비해 대사활성 높아 그 결과 R0S 수준이 증가되어 있다. 또한, 많은 암세포들은 산화 환원 상태를 유지하고 아톱토시스를 억제하기 위해 상대적으로 강화된 항산화 방어 메카니즘을 가지고 있다. 이러한 현상은 암세포가 더 많은 악성 행동과 약제 내성을 가지게 하는데 일조할 것이다.
이를 종합해 볼 때， 암세포에서 발현이 증가되어 있는 PAUF 와 GLRX3는 서로 결합함으로써 R0S를 제거하는데 관여할 것으로 예측된다.
UBL4A 단백질은 그 기능이 밝혀지지 않고 단순히 하우스키핑 유전자 정도로 알려졌으나 최근， 합성된 단백질들이 ER(endoplasmic reticulum)막으로 정확히 이동하기 위한 과도기적 상태에 필요한 Bat3 컴플렉스의 한 구성원으로 밝혀졌다 GVa e, 466(26) :1120-1124(2010)).
PAUF 의 기능이 밝혀지기 전, PAIF 의 다른 이름 중 하나인
ZG16B( zymogen granule protein 16 mono log B)와 UBQLN4(Ubiqui 1 in—4)라는 단백질이 상호작용 하는 것으로 보고된바 있다 (( //, 125(4) :801-14(2006)). 이 보고에서는 UBQLN4 와 PAUF;ZB16B 와의 결합사이트를 UBQLN4 전체 염기서열로 보고하였으나， 본 연구에서 PAUF 결합 단백질로 찾아진 UBL4A 단백질과 UBQL4 의 단백질의 펩타이드 서열과 비교한 결과 두 단백질은 ubiquitin-유사도메인을 공유하는 것으로 나타났다 (도 7). 따라서 UBL4A 의 ubi qui tin-유사도메인이 PAUF 와 결합하는 도메인이라는 것을 예측할 수 있다.
Dial 단백질은 Rho 신호 전달계의 하위 단계로 종양 세포의 이동 (migration)시 역할을 한다고 밝혀졌다 (CW/ metastasis review, 28:65-76 (2009)). Rho 신호 전달계는 종양 세포의 전이와 침윤에 역할이 있고， 3 가지 Rho 단백질 (RhoA, RhoB 및 RhoC) 중 RhoC 단백질은 췌장암 환자 조직， 특히 비 -악성보다는 종양에서， 일차 종양보다는 전이조직 (metastatic lesions)에서 과발현되어 있으며， RhoC 발현과 환자의 전이 및 나쁜 예후와 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되었다 ( r J Cancer ,77： 147-152 (1998)). 췌장암 세포주는 PAUF 과발현 혹은 저해에 따라 세포의 전이와 침윤의 증가 혹은 억제효과를 보이는데， Dial 단백질이 이 과정에 관련되어 있을 것으로 예측된다.
SNAPIN 단백질은 신경세포에서 시냅스 소포 exocytosis 에 관여하는 단백질로 보고되었고 (Z.H. Sheng et al . , Nat. Neurosci. , 2(2)： 119-124 (1999)) 비신경 포유동물 세포에서도 SNARE(soluble N-ethymaleimi de- sensitive fusion protein attachemant protein receptors)컴플렉스가 규명되었다 (W. Antonin et al . , EMBO J., 19:6453-6464 (2000)).
SNAPIN 결합 단백질로 여러 단백질들이 보고된 바 있다. 비신경세포에서 SNAP23 단백질과 결합한다고 보고되었다 (P.Buxton et al., Biochem. J. ,375:433-440 (2003)). 제 2 형 당뇨 중 M0DY3(maturity-onse1: diabetes of the young 3)는 nepatocute nuclear factor (HNF)-la 의 돌연변이 결과에 기인하는데， HNF-la 와 상호작용 하는 단백질로 신장특이 유전자 컬렉트린이라는 것이 밝혀졌고, 컬렉트린은 SNAPIN과 상호작용 하여 SNARE 컴플렉스의 기전을 통해 인슐린 세포외유출을 조절한다고 보고되었다 (K.Fukui 및 K. Yamagat et al . , Cell metabolism ,2:373-384 (2005)). X.Yuan 및 Y. Cong et al.은 G-CSF( granulocyte colony- stimulating factor) 수용체 (GCSF-R)와 SNAPIN 이 상호착용 한다고 보고하였고 (Cytokineᅳ 33:219-255 (2006)), Exo70 과 SNAPIN 과 결합하여 GLUT4 vesicle trafficking 을 조절한다고 보고되었다 (JBC, 283(1), 324- 331 (2008)).
췌장암 세포주에서 PAIF 의 분비 여부를 조사한 결과 (선행 연구)， 세포주마다 PAUF 분비 여부가 다르게 나타나고 있었다. mRNA 시원스 분석 결과 PAUF 단백질의 분비를 코딩하는 시그널 시퀀스 상에는 세포주간에 차이를 보이지 않았다. 따라서 분비단백질을 세포외로 이동시키는 과정에 관여하는 단백질이 PAIF 의 분비 여부에 기여할 것으로 예측되고， 그 해당 단백질로 SNAPIN이 작용할 가능성이 크다고 여겨진다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
다음 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법:
(a) PAUF(Pancreatic Adenocarcinoma Up-regulated Factor)와 그의 결합파트너로서의 GLRX3(Glutaredoxin-3), SNAPINCSNAP-associated protein) 또는 UBL4A(ubiquit in-like 4A)에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시험물질이 상기 PAUF 와 그의 결합파트너로서의 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 의 결합을 억제하는지 여부를 분석하는 단계, 상기 시험물질이 상기 결합을 억제하면 암 치료제로서 판단한다.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서, 상기 PAUF 와 그의 결합파트너로서의 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 는 세포 외에 하나의 용액에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 3】
제 1 항에 있어서， 상기 PAUF 와 그의 결합파트너로서의 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 는 하나의 세포 내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 4】
제 3 항에 있어세 상기 세포는 암 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 5]
제 1 항에 있어서, 상기 PAUF 의 결합파트너는 GLRX3 인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 6】 제 5 항에 있어서, 상기 PAUF 의 결합파트너는 GLRX3 의 티오레독신 도메인인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 7]
제 1 항에 있어서， 상기 단계 (b)는 투 -하이브리드 방법， 공동면역침강 방법 (co-immunoprecipitation assay) , 공동一국소화 분석 (co- localization assay) , 섬광 근접 측정법 (scinti 1 lation proximity assay: SPA), UV 또는 화학적 가교 결합 방법， 이분자 상호작용 분석 (bimolecular interaction analysis: BIA) , 질량 분석법 (mass spectrometry: MS), NMRCnuclear magnetic resonance) 또는 형광 편광 분석법 (fluorescence polarization assays, FPA)에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 8]
제 1 항에 있어서， 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 9]
PAUF(Pancreatic Adenocarcinoma Up-regulated Factor)와 그의 결합파트너로서의 GLRX3, SNAP IN 또는 UBL4A 의 결합을 억제하는 물질을 유효성분으로포함하는 암 예방또는 치료용 약제학적 조성물.
【청구항 10】
제 9 항에 있어서, 상기 PAUF 의 결합파트너는 GLRX3 인 것을 특징으로 하는조성물.
【청구항 11】
제 9 항에 있어서， 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는조성물.
【청구항 12】
PAUF(Pancreatic Adenocarcinoma Up-regulated Factor)와 그의 결합파트너로서의 GLRX3, SNAPIN 또는 UBL4A 의 결합을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상에 게 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법 .
【청구항 13]
제 12 항에 있어서， 상기 PAIF 의 결합파트너는 GLRX3 인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 14】
제 12 항에 있어서 , 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는
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