WO2012131117A1 - Utilización de antifúngicos naturales para prevenir la infección de lesiones, injertos y heridas de poda en plantas leñosas por hongos fitopatógenos - Google Patents

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Rebeca COBOS ROMÁN
Penélope GARCÍA ANGULO
Alberto Alonso Monroy
Maria Luisa ÁLVAREZ RODRíGUEZ
Silvia SEVILLANO NISTAL
José Manuel ÁLAVARE PÉREZ
José Luis ACEBES ARRANZ
Enrrique GARZÓN JIMENO
Juan José RUBIO COQUE
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    • A01N65/42—Aloeaceae [Aloe family] or Liliaceae [Lily family], e.g. aloe, veratrum, onion, garlic or chives

Definitions

  • the object of the invention relates to the use of natural antifungals, applied alone or in combination, to prevent infection by phytopathogenic fungal lesions, pruning wounds and grafts in woody plants.
  • the present invention relates to the use, alone or in combination, of three natural compounds / extracts that have separate antifungal properties and that when combined show very high effectiveness to prevent infection through lesions, pruning wounds and grafts of Vine plants by phytopathogenic fungi responsible for diseases of vine wood, preventing the death of the plant due to this type of pathogen.
  • Botryosphaeria dothidea Cylindrocarpon macrodidymum ( Neonectria macrodidyma), Diplodia seriata, Eutypa lata, Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophyium and viticultural Phomopsis.
  • the different compounds / extracts and their mixture have shown in field tests not to have a negative effect on the development of the plant, in addition to inhibiting the infection of the plant by the fungi mentioned above through pruning wounds.
  • the artificially infected and treated plants showed, after two years of testing, a mortality rate of 0-12%, compared to untreated and artificially infected vine plants that showed a 52% mortality rate.
  • grapevine diseases (grapevine trunk diseases) or vine decay (grapevine decline) encompasses a set of pathologies produced as a result of the infection of the plant by a series of phytopathogenic fungi. Plant infection is an unsolved problem that usually starts through the root or more frequently through pruning wounds or other injuries caused during vineyard tillage or insect attack.
  • Petri disease It mainly affects young plants. It causes serious economic losses in new plantations, sometimes causing the death of up to 90% of the plants.
  • the causative agents would be Phaeocremonium aleophylum and Phaeomoniella chlamydospora [Bertelly et al., (1998), Phytopathol. Mediterr. 37: 79-82]. Plants have weak growth and a reduction in root mass that causes premature exhaustion. In the case of this disease, a clear relationship has been established between the appearance of symptoms in the vineyard and the presence of infected plants in the nursery [Giménez-Jaime et al., (2006), J. Phytopathol. 154: 598-602]. Tinder (stroke).
  • Eutipiosis It is a disease of worldwide distribution produced by the fungus Eutypa lata. The plants have weak branches with short internodes and small, deformed and chlorotic leaves [Lecomte et al., (2000), Appl. Environ. Microbiol 66: 4475-4480].
  • Dead Arm Syndrome The most characteristic symptom is the appearance of superficial necrosis in branches and trunk that are observed when lifting the cortex. In cross section the tissue shows a black sector discoloration, the pathogen developing in the vascular bundles.
  • the main fungi associated are family members Botryosphaeriaceae as Diplodia seriata and Diplodia mutila, [van Niekerk et al., (2006), Phytopathol. Mediterr. 45: (Supplement): 43-54].
  • Vine wood diseases are a serious problem for the world wine sector.
  • the wine sector is very important for the European Union. It represents 47% of the world's viticultural area and 60% of the world's wine production.
  • the main producers worldwide are France, Italy, Spain, covering between the three more than 50% of world production and monopolizing 53.8% of world exports.
  • the Spanish wine sector is of great importance for the economic value that it generates, for the extension it occupies, as well as for the role it plays in environmental conservation and the good image it brings from Spain internationally. Spain dedicates 1, 2 million hectares to the cultivation of grapes (of which 97.4% is used for winemaking, 2% for table grapes, 0.3% for the production of raisins and 0.3 % remaining to nurseries). It is the country with the largest vineyard in the world. In addition the vine occupies the third place in extension of the Spanish crops, behind the cereals and the olive grove.
  • Grapevine wood diseases are probably the greatest threat facing grape growers and nurseries worldwide today for several reasons:
  • the object of the invention relates to the use of chitosan oligosaccharide, garlic extract (Allium sativum L.) and vanillin (4-hydroxy-3 methoxybenzaldehyde), used alone or in combination for the treatment of vine pruning wounds. These compounds / extracts have been selected after testing numerous natural compounds / extracts with antifungal properties.
  • Chitosan is obtained from the shellfish exoskeleton (shrimp, shrimp, etc.) and its consumption is allowed in humans as a dietary supplement.
  • Hydroalcoholic garlic extract is obtained from garlic of any variety suitable for human consumption.
  • Vanillin is the main component of the vanilla pod and is used as a flavoring in the food sector and also as a food preservative.
  • Test 1 To determine the inhibitory effect of chitosan, hydroalcoholic extract of garlic and vanillin on the growth of phytopathogenic fungi responsible for diseases of vine wood determined by plaque tests.
  • Botryosphaeria dothidea Cylindrocarpon macrodidymum (Neonectria macrodidyma), Diplodia seriata, Eutypa lata, Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophylum and Viticultural phomopsis.
  • the tests consisted of inoculating said fungi in the center of PDA culture medium plates (potato dextrose agar) containing the antifungal compound / extract. The plates were incubated at 25 ° C for 5-30 days depending on the species of fungus and measuring the radial growth of the colony every 24 hours. The radial growth values obtained were compared with radial growth data of the same fungus growing on PDA medium plates that did not contain the antifungal.
  • Vanillin inhibitory effect on plaque Vanillin was initially prepared at a concentration of 300 mg / ml in 50% methanol and diluted in water to the working concentration. In this case the antifungal effect of vanillin was tested in a concentration range of 0.5-10 mg / ml. Vanillin at a concentration of 4 mg / ml inhibited 100% plaque growth of B. dothidea, C. macrodidimum, D. seriata and P. vit ⁇ cola fungi. The growth of E. lata, P. chlamydospora and P. aleophylum was 100% inhibited at a concentration of 8 mg / ml.
  • Vanillin at a concentration of 10 mg / ml showed fungistatic effect against all the fungi tested, except for B. dothidea, C. macrodidimum and P. chlamydospora which showed fungicidal effect.
  • Test 2 To determine the inhibitory effect of chitosan, hydroalcoholic extract of garlic and vanillin on the growth of phytopathogenic fungi responsible for diseases of grape wood determined by tests on vine shoots.
  • the tests were carried out with vine shoots of 7-10 cm in length.
  • the branches are autoclaved to eliminate any fungus or bacteria that may interfere with the test.
  • the test consists of making a small cavity in the branch of about 4 mm in diameter and depth using a scalpel. Then we add 100 microliters of the antifungal (or mixture) and let it be adsorbed for 1-2 hours. An agar fragment of about 3 mm in diameter carrying the phytopathogenic fungus is then introduced into the cavity. Then the hole is sealed with plastic paper and the branch is inserted into a sterile plastic tube at the bottom of which we introduce sterile cotton soaked in water to conserve humidity conditions inside the tube that favor the development of the fungus.
  • the tube is then incubated at 25 ° C for 7-30 days depending on the fungus used. Then we proceed to the analysis of the branches by cutting 2 slices of wood 1 cm above and below the inoculation point. From each slice, 7 wood chips are removed and placed on PDA medium plates. After incubation at 25 ° C, to allow the growth of the fungus, the results of growth inhibition of the pathogen by the antifungal are calculated, which are expressed as the ratio (percentage) of splinters from which pathogen develops in the case of branches treated with antifungal, compared to the number of splinters that develop growth of the pathogen in the case of infected shoots but not treated with the antifungal. Each trial was performed in triplicate using lots of 3 control shoots and 3 shoots treated with antifungal.
  • Botryosphaeria dothidea Cylindrocarpon macrodidymum (Neonectria macrodidyma)
  • Diplodia would be, Eutypa lata, Phaeomoniella chlamydospora, and viticultural Phomopsis.
  • Vanillin inhibitory effect on vine shoots The vanillin concentration used in the trials was 4 mg / ml. Under these conditions the antifungal inhibited 100% the growth of P. chlamydospora and P. vit ⁇ cola, 78% the growth of C. macrodidymum, 67% the growth of D. seriata and B. dothidea and 50% the growth of E. can.
  • Test 3 To determine the protective effect of chitosan, hydroalcoholic extract of garlic and vanillin on vine plants artificially infected with phytopathogenic fungi.
  • Each plant was grown independently in a 800 liter pot containing a commercial substrate specially adapted for vine plants.
  • the plants 500 in total) were organized in 20 lines of 25 plants per line.
  • the results of this analysis confirmed the presence of phytopathogenic fungi responsible for wood in 50-90% of the analyzed samples corresponding to artificially infected plants (line 2).
  • the detection levels of phytopathogenic fungi in line 1 or control plants ranged between 5-8% of the analyzed samples and between 0-2% (line 3; chitosan), 0-3% (line 4; hydroalcoholic extract of garlic), 1 -3% (line 5; vanillin) and 0-1% (line 6; mixture QAV). Similar levels were detected in the case of artificially infected lines and treated with antifungals: 0-4% (line 7), 1 -2.5% (line 8), 0-6% (line 9) and 0-1% (line 10).
  • Chitosan oligosaccharide is prepared by dissolving in distilled water at an initial concentration of 100 mg / ml. It is applied to pruning wounds at a concentration of 10-25 mg / ml.
  • the hydroalcoholic garlic extract is prepared by homogenizing peeled garlic cloves at an initial concentration of 30% (w / v) in 10% ethanol. Homogenization is achieved by crushing with a blender or similar until a homogeneous and fine suspension is obtained. The suspension is then incubated for 2 hours at 4 ° C with stirring for maximum extraction of the active ingredients. The suspension can be filtered in order to remove solid materials. The application on pruning wounds is carried out at a concentration of 7-10% (w / v) by dissolving the initial suspension in distilled water.
  • Vanillin is prepared by dissolving in methanol at an initial concentration of 200 mg / ml.
  • the application on pruning wounds is carried out at a concentration of 3-5 mg / ml, by dissolving the initial solution in 10% ethanol (v / v) or water.
  • chitosan oligosaccharide hydroalcoholic extract of garlic and vanillin is prepared from the concentrated solutions or suspensions of the products separately and applied to pruning wounds with a chitosan composition (20-25 mg / ml) -extract garlic hydroalcoholic (8-10%) - vanillin (3-4 mg / ml).

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Abstract

Utilización de antifúngicos naturales para prevenir la infección de lesiones, injertos y heridas de poda en plantas leñosas por hongos fitopatógenos, que comprende quitosán oligosacárido, extracto hidroalcohólico de ajo y/o vainillina, solos o en cualquier combinación. Aplicación de quitosán oligosacárido, extracto hidroalcohólico de ajo y/o vainillina, solos o en cualquier combinación, sobre heridas de poda, injertos u otro tipo de lesiones de plantas leñosas, preferentemente vid para evitar la infección por especies de hongos fitopatógenos descritos como causantes de enfermedades de madera.

Description

UTILIZACIÓN DE ANTIFÚNGICOS NATURALES PARA PREVENIR LA INFECCIÓN DE LESIONES, INJERTOS Y HERIDAS DE PODA EN PLANTAS LEÑOSAS POR HONGOS FITOPATÓGENOS
DESCRIPCIÓN
El objeto del invento se refiere a la utilización de antifúngicos naturales, aplicados solos o en combinación, para prevenir la infección por hongos fitopatógenos de lesiones, heridas de poda e injertos en plantas leñosas.
Campo técnico de la invención.
La presente invención se refiere a la utilización, solos o en combinación, de tres compuestos/extractos naturales que tienen propiedades antifúngicas por separado y que al combinarse muestran una efectividad muy alta para evitar la infección a través de lesiones, heridas de poda e injertos de plantas de vid por hongos fitopatógenos responsables de enfermedades de madera de vid, evitando la muerte de la planta debida a este tipo de patógenos.
Los distintos compuestos/extractos y su mezcla han mostrado en ensayos realizados en laboratorio sobre placas de medio de cultivo una gran capacidad de inhibir el crecimiento de los siguientes hongos fitopatógenos implicados en el desarrollo de enfermedades de madera de vid: Botryosphaeria dothidea, Cylindrocarpon macrodidymum (Neonectria macrodidyma), Diplodia seriata, Eutypa lata, Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophyium y Phomopsis vitícola.
Los distintos compuestos/extractos y su mezcla han mostrado en ensayos realizados en laboratorio con sarmientos de vid de 7-10 cm de longitud una gran capacidad para inhibir el desarrollo y colonización de los hongos citados anteriormente del interior de los sarmientos, evitando su desplazamiento por el interior de los mismos.
Los distintos compuestos/extractos y su mezcla han mostrado en ensayos realizados en campo no tener un efecto negativo sobre el desarrollo de la planta, además de inhibir la infección de la planta por los hongos citados anteriormente a través de las heridas de poda. Las plantas sometidas a tratamiento e infectadas artificialmente mostraron, tras dos años de ensayo una tasa de mortalidad del 0- 12%, frente a plantas de vid no tratadas e infectadas artificialmente que mostraron una tasa de mortalidad del 52%. Estos datos confirman la eficacia en campo del tratamiento realizado a fin de evitar la infección de hongos fitopatógenos a través de heridas de poda.
Aunque estos compuestos/extractos podrían ser usados individualmente, o en distintas combinaciones, es especialmente recomendable su uso conjunto como antifúngicos para evitar la infección de plantas de vida a través de heridas de poda, injertos u otro tipo de lesiones.
Antecedentes de la invención
En el actual estado de la técnica, el solicitante desconoce precedentes de invenciones referidas a la utilización de antifúngicos naturales, aplicados solos o en combinación, para prevenir la infección de lesiones, injertos y heridas de poda en plantas leñosas por hongos fitopatógenos.
El término enfermedades de madera de vid (grapevine trunk diseases) o decaimiento de la vid (grapevine decline) engloba un conjunto de patologías producidas como consecuencia de la infección de la planta por una serie de hongos fitopatógenos. La infección de las plantas es un problema sin resolver que generalmente se inicia a través de la raíz o más frecuentemente a través de las heridas de poda u otro tipo de lesiones producidas durante el laboreo del viñedo o el ataque de insectos.
Tradicionalmente, estos problemas a resolver se han distinguido entre varias patologías. En función de los síntomas y los hongos más frecuentemente aislados en el caso de plantas enfermas, las enfermedades o patologías mas importantes son las que indicamos a continuación:
• Enfermedad de Petri. Afecta principalmente a plantas jóvenes. Causa graves pérdidas económicas en nuevas plantaciones, provocando a veces la muerte de hasta el 90% de las plantas. Los agentes causales serían Phaeocremonium aleophylum y Phaeomoniella chlamydospora [Bertelly et al., (1998), Phytopathol. Mediterr. 37: 79-82]. Las plantas presentan un crecimiento débil y una reducción de la masa radicular que produce un agotamiento prematuro. En el caso de esta enfermedad se ha establecido una clara relación entre la aparición de síntomas en viñedo y la presencia de plantas infectadas en vivero [Giménez-Jaime et al., (2006), J. Phytopathol. 154: 598-602]. Yesca (apoplejía). Una de las enfermedades de vid más antiguas que se conocen considerada como endémica de todas las zonas vitivinícolas mundiales. Afecta principalmente a cepas de más de 25 años y los principales hongos asociados son (como en el caso de la enfermedad de Petri) P aleophylum y P. chlamydospora, aunque con cierta frecuencia se pueden aislar los patógenos Stereum hirsutum y Fomitiporia mediterránea [Surico et al., (2006), Phytopathol. Mediterr. 45: 68-86]. Las plantas presentan decoloraciones y necrosis foliares muy evidentes. La producción se reduce y los racimos llegan a pasificarse. Con cierta frecuencia la enfermedad produce una apoplejía o muerte repentina de la planta sobre todo en climas cálidos [Cobos, (2008), Tesis Doctoral. Departamento de Microbiología y Genética. Universidad de Salamanca].
Eutipiosis. Se trata de una enfermedad de distribución mundial producida por el hongo Eutypa lata. Las plantas presentan pámpanos débiles con entrenudos cortos y hojas pequeñas, deformadas y cloróticas [Lecomte et al., (2000), Appl. Environ. Microbiol. 66: 4475-4480].
Pie negro. Enfermedad de distribución mundial que afecta preferentemente a plantas jóvenes (2-10 años). El nombre de la enfermedad hace referencia a la presencia de raíces necrosadas con oscurecimiento de los vasos xilemáticos [Hallen et al., (2004), Stud. Mycol. 50: 431 -455]. Se trata de una patología asociada a distintas especies del género Cylindrocarpon [Alaniz y col., (2007), Plant Disease 91 : 1 187-1 193].
Excoriosis. Patología de distribución mundial producida por Phomopsis vitícola. Afecta a todos los órganos de la planta y los daños ocasionados son variados [Dubos, (2002), Maladies cryptogamiques de la vigne. Ed. Feret. Bordeaux].
Síndrome del brazo muerto. El síntoma más característico es la aparición de necrosis superficiales en ramas y tronco que se observan al levantar la corteza. En sección transversal el tejido muestra una decoloración sectorial de color negro, desarrollándose el patógeno en los haces vasculares. Los principales hongos asociados son miembros de la familia Botryosphaeriaceae como Diplodia seriata y Diplodia mutila, [van Niekerk et al., (2006), Phytopathol. Mediterr. 45: (Supplement): 43-54].
El límite que existe entre estas enfermedades es muy tenue y de hecho ocasionalmente las plantas pueden presentar síntomas que se podrían atribuir a 2 ó más enfermedades. Además, a partir de plantas afectadas es muy frecuente poder aislar una mezcla de diferentes hongos fitopatógenos. Por ello la tendencia actual es la de considerar que todas estas enfermedades son una misma patología (enfermedad de madera o decaimiento de la vid), pudiendo variar la sintomatología en función de los hongos patógenos implicados en el proceso infectivo y de las condiciones ambientales, o diferencias atribuibles a las diferentes variedades de vid [Cobos, (2008), Tesis Doctoral. Departamento de Microbiología y Genética. Universidad de Salamanca].
Las enfermedades de madera de vid son un grave problema para el sector vitivinícola mundial. A nivel europeo el sector vitivinícola es importantísimo para la Unión Europea. Representa el 47% de la superficie vitícola mundial y el 60% de la producción mundial de vino. Los principales productores a nivel mundial son Francia, Italia, España, abarcando entre los tres más del 50% de la producción mundial y acaparando el 53,8% de las exportaciones mundiales.
El sector vitivinícola español es de gran importancia por el valor económico que genera, por la extensión que ocupa, así como por el papel que desempeña en la conservación medioambiental y la buena imagen que aporta de España a nivel internacional. España dedica 1 ,2 millones de hectáreas al cultivo de la uva (de la que el 97,4 % se destina a vinificación, el 2% a uva de mesa, el 0,3 % a la elaboración de pasas y el 0,3 % restante a viveros). Se trata del país con mayor extensión de viñedo del mundo. Además la vid ocupa el tercer lugar en extensión de los cultivos españoles, detrás de los cereales y el olivar.
Las enfermedades de madera de vid son probablemente en la actualidad la mayor amenaza a la que tienen que enfrentarse los viticultores y viveros de vid en todo el mundo por varios motivos:
I).- La ausencia de métodos de control efectivos. De hecho en la actualidad los viticultores únicamente pueden recurrir al empleo de medidas preventivas para limitar o minimizar la transmisión de los hongos responsables entre las que podemos citar métodos culturales (como la eliminación lo más rápida posible de la madera enferma, quema de residuos de poda, desinfección de las herramientas de poda, etc) y métodos físicos como tratar los plantones con calor (baños de agua a 50°C durante 15-30 minutos) antes de su plantación en suelo [Cobos, (2008), Tesis Doctoral. Departamento de Microbiología y Genética. Universidad de Salamanca]. No obstante se han realizado algunos estudios que plantean el uso de agentes de control biológico para tratar estas enfermedades. Así, Di Marco y Osti [(2007), Phytopathol. Mediterr. 46: 73-83] comprobaron la efectividad de un preparado comercial del BCA Trichoderma harzianum para controlar la infección por P. chlamydospora en viveros. El BCA mostró cierta eficacia promoviendo el desarrollo del sistema radicular e incrementando el porcentaje de plantas que sobrevivían a la infección con el patógeno. Sin embargo, también como efecto adverso se observó un incremento en la mortalidad de las plantas tratadas con el BCA, posiblemente debido a la ausencia de adaptación BCA-vid. Otros autores [Munkvold y Marois, (1993), Phytopathol. 83: 624-629] aislaron a partir de heridas de poda de vid una cepa del hongo Fusaríum lateritium que se comporta como BCA frente a Eutypa lata (el principal fitopatógeno responsable de la eutipiosis) y del que se han aislado incluso mutantes resistentes al antifúngico benomilo a fin de incrementar la eficacia del tratamiento [McMahan et al., (2001 ), J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 26: 151 -155]. También se ha descrito el aislamiento de BCAs bacterianos antagonista contra Eutypa lata [Schmidt et al., (2001 ), J. Phytopathol. 149: 427-435] aunque no se ha probado su eficacia en plantas vivas.
II) .- Las enfermedades de madera de vid generan graves pérdidas económicas debido a disminución de los rendimientos de la planta, pérdida de calidad de la uva, muerte de plantas, gastos de arrancamiento y replantación, etc. Aunque cuantificar dichas pérdidas es muy difícil algunos análisis indican que sólo en el estado de California (USA) la enfermedad de madera conocida como eutipiosis suponía en el año 2001 unas pérdidas económicas estimadas en 260 millones de dólares [Siever, (2001 ), Wines & Vines (April): 50-56]. Más recientemente y sólo en el caso de la enfermedad de madera conocida como yesca las pérdidas para los viticultores se han estimado entre 213-788 dólares por acre (o lo que es lo mismo unos 532-1970 dólares por hectárea [Vasquez et al., (2007), Phytopathol. Mediterr. 46: 1 18].
III) .- La incidencia del problema es elevada. En efecto, desde la prohibición del uso del arsenito sódico en 2003 para su tratamiento se observa un lento pero continuado aumento del número de plantas afectadas. Así en un estudio realizado en viñedos de Castilla y León correspondientes a las denominaciones de origen Cigales, Toro, Ribera de Duero, y Tierra de León se ha pasado de un grado de afectación del 1 .8% en el año 2001 a un grado de afectación del 10.5% en el año 2007 [Martín y Cobos, (2007), Phytopathol. Mediterr. 46: 18-25]. Este efecto tiene un carácter global detectándose en otros países europeos [Michelon et al., (2006), Phytopathol. Mediterr. 46: 105].
IV).- El problema no sólo afecta a los viticultores de todo el mundo sino que es también un grave problema para los viveros de planta de vid, ya que varios estudios indican que en una elevada proporción las plantas se infectan en el vivero y cuando llegan al viticultor para ser cultivadas en campo ya están infectadas, desarrollando la patología en momentos diferentes dependiendo de variados factores como características del suelo, condiciones climáticas, situaciones de estrés, variedad de vid, etc [Giménez-Jaime et al., (2006), J. Phytopathol. 154: 598-602; Aroca y Raposo, (2005), Phytoma 167: 56-59].
Objeto de la invención.
El objeto de la invención se relaciona con el uso de quitosán oligosacárido, extracto de ajo (Allium sativum L.) y vainillina (4-hidroxi-3 metoxibenzaldehído), utilizados solos o en combinación para el tratamiento de heridas de poda de vid. Estos compuestos/extractos se han seleccionado tras ensayar numerosos compuestos/extractos naturales con propiedades antifúngicas.
Todos ellos son productos naturales:
• El quitosán se obtiene a partir del exoesqueleto de crustáceos (gambas, langostino, etc) y su consumo está permitido en humanos como suplemento dietético.
· El extracto hidroalcohólico de ajo se obtiene a partir de ajos de cualquier variedad aptos para el consumo humano.
• La vainillina es el principal componente de la vaina de la vainilla y se emplea como saborizante en el sector alimentario y también como preservante alimentario.
Estos compuestos/extractos, solos o en combinación, se aplican sobre la herida de poda inmediatamente después de producirse ésta mediante aplicación con brocha, pulverización o mediante tijeras de poda especiales que aplican el producto simultáneamente a la realización del corte.
Ensayo 1 : Para determinar el efecto inhibitorio del quitosán, extracto hidroalcohólico de ajo y vainillina sobre el crecimiento de hongos fitopatógenos responsables de enfermedades de madera de vid determinado mediante ensayos en placa.
Todos los ensayos (a menos que se indique lo contrario) se realizaron frente a los siguientes patógenos: Botryosphaeria dothidea, Cylindrocarpon macrodidymum (Neonectria macrodidyma), Diplodia seriata, Eutypa lata, Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophylum y Phomopsis vitícola.
Los ensayos consistieron en inocular dichos hongos en el centro de placas de medio de cultivo PDA (agar dextrosa de patata) conteniendo el compuesto/extracto antifúngico. Las placas se incubaron a 25°C durante 5-30 días dependiendo de la especie de hongo y midiendo el crecimiento radial de la colonia cada 24 horas. Los valores de crecimiento radial obtenidos se compararon con datos de crecimiento radial del mismo hongo creciendo sobre placas de medio PDA que no contenían el antifúngico.
* Efecto inhibitorio del quitosán en placa. Los resultados obtenidos en placa para la actividad antifúngica del quitosán oligosacárido (ensayado en el rango 0,05 - 4 mg/ml preparado por disolución en agua) revelaban que 4 mg/ml de quitosán oligosacárido inhibía al 100% el crecimiento del micelio de todos los hongos analizados. No obstante, la MIC (concentración mínima de inhibición) varía entre algunos tipos de hongos siendo de 0.5 mg/ml para E. lata, de 0.75 mg/ml para C. macrodidyma, P. chlamydospora, P. aleophilum y P. vitícola y de 1 mg/ml para los hongos D. seriata y B. dothidea. El efecto del quitosán a una concentración de 2 mg/ml fue fungistático para todos los hongos ensayados, excepto para C. macrodidymum y P. aleophylum que exhibió un carácter fungicida.
* Efecto inhibitorio del extracto hidroalcohólico de ajo en placa. En este caso se trataba de un extracto hidroalcohólico de ajo al 30% (p/v) preparado en etanol al 10%. El extracto hidroalcohólico de ajo se ensayó en el rango de concentración 2- 20%. El extracto hidroalcohólico de ajo al 6% inhibía al 100% el crecimiento de todos los hongos patógenos con la excepción de C. macrodidimum (inhibición del 95%) y de E. lata (inhibición del 82%). El extracto hidroalcohólico de ajo al 10% mostró un efecto fungistático frente a todos los hongos ensayados.
* Efecto inhibitorio de la vainillina en placa. La vainillina se preparó inicialmente a una concentración de 300 mg/ml en metanol al 50% y se diluyó en agua hasta la concentración de trabajo. En este caso el efecto antifúngico de la vainillina se ensayó en un rango de concentración de 0.5-10 mg/ml. La vainillina a una concentración de 4 mg/ml inhibió al 100% el crecimiento en placa de los hongos B. dothidea, C. macrodidimum, D. seriata y P. vitícola. El crecimiento de E. lata, P. chlamydospora y P. aleophylum fue inhibido al 100% a una concentración de 8 mg/ml. La vainillina a una concentración de 10 mg/ml mostró efecto fungistático frente a todos los hongos ensayados, excepto frente a B. dothidea, C. macrodidimum y P. chlamydospora que mostró efecto fungicida.
* Efecto inhibitorio de la mezcla quitosán-extracto hidroalcohólico de ajo-vainillina (mezcla QAV) en placa. La mezcla se preparó conteniendo quitosán (2 mg/ml), extracto hidroalcohólico de ajo (4%) y vainillina (2 mg/ml). Con esta composición la mezcla mostró un claro efecto sinérgico de sus componentes ya que inhibía al 100% el crecimiento de todos los patógenos ensayados, mientras que ninguno de sus componentes por separado mostró esa capacidad. El efecto sinérgico y las propiedades mejoradas de la mezcla se pusieron también de manifiesto porque la mezcla tenía carácter fungicida frente a todos los patógenos, provocando su muerte tras una incubación en su presencia de 1-6 horas de duración.
Ensayo 2: Para determinar el efecto inhibitorio del quitosán, extracto hidroalcohólico de ajo y vainillina sobre el crecimiento de hongos fitopatógenos responsables de enfermedades de madera de vid determinado mediante ensayos realizados sobre sarmientos de vid.
Los ensayos se realizaron con sarmientos de vid de 7-10 cm de longitud. Los sarmientos se esterilizan en autoclave para eliminar cualquier hongo o bacteria que pueda interferir en el ensayo. El ensayo consiste en realizar una pequeña cavidad en el sarmiento de unos 4 mm de diámetro y profundidad utilizando un bisturí. A continuación añadimos 100 microlitros del antifúngico (o de la mezcla) y dejamos que sea adsorbido durante 1-2 horas. A continuación se introduce en la cavidad un fragmento de agar de unos 3 mm de diámetro portador del hongo fitopatógeno. Seguidamente el orificio se sella con papel plástico y el sarmiento se introduce en un tubo de plástico estéril en cuyo fondo introducimos algodón estéril empapado en agua para conservar condiciones de humedad en el interior del tubo que favorezcan el desarrollo del hongo. Seguidamente el tubo se incuba a 25°C durante 7-30 días dependiendo del hongo utilizado. Seguidamente procedemos al análisis de los sarmientos cortando 2 rodajas de madera 1 cm por encima y por debajo del punto de inoculación. De cada rodaja se extraen 7 astillas de madera que se depositan sobre placas de medio PDA. Tras una incubación a 25°C, para permitir el crecimiento del hongo, se calculan los resultados de inhibición de crecimiento del patógeno por el antifúngico, que se expresan como la relación (porcentaje) de astillas desde las que se desarrolla patógeno en el caso de sarmientos tratados con antifúngico, frente al número de astillas que desarrollan crecimiento del patógeno en el caso de sarmientos infectados pero no tratados con el antifúngico. Cada ensayo se realizó por triplicado utilizando lotes de 3 sarmientos control y 3 sarmientos tratados con antifúngico.
En este caso los ensayos se realizaron frente a los siguientes hongos: Botryosphaeria dothidea, Cylindrocarpon macrodidymum (Neonectria macrodidyma), Diplodia seríate, Eutypa lata, Phaeomoniella chlamydospora, y Phomopsis vitícola.
* Efecto inhibitorio del quitosán en sarmientos de vid. En este ensayo se utilizó una concentración de quitosán de 10 mg/ml. A esta concentración el quitosán inhibía al 100% la capacidad de propagarse a través del sarmiento de todos los hongos, excepto C. macrodidymun (inhición del 90%) y E. lata (inhibición del 75%).
* Efecto inhibitorio del extracto hidroalcohólico de ajo en sarmientos de vid. En estos ensayos se utilizó extracto hidroalcohólico de ajo al 10%. A esta concentración se produjo una inhibición del 100% del crecimiento para todos los hongos excepto para C. macrodidymum (en que la inhibición fue del 40%).
* Efecto inhibitorio de la vainillina en sarmientos de vid. La concentración de vainillina utilizada en los ensayos fue de 4 mg/ml. En estas condiciones el antifúngico inhibía al 100% el crecimiento de P. chlamydospora y P. vitícola, al 78% el crecimiento de C. macrodidymum, al 67% el crecimiento de D. seriata y B. dothidea y al 50% el crecimiento de E. lata.
* Efecto inhibitorio de la mezcla quitosán-extracto hidroalcohólico de ajo-vainillina (mezcla QAV) en sarmientos de vid. La mezcla utilizada en este caso contenía: quitosán (10 mg/ml) - Extracto hidroalcohólico de ajo (10%)- Vainillina 4 mg/ml. La mezcla de los 3 componentes mostró un claro efecto slnérgico frente al empleo por separado de cada uno de ellos ya que el crecimiento de todos los hongos fue inhibido con una eficacia del 100%.
Ensayo 3: Para determinar el efecto protector de quitosán, extracto hidroalcohólico de ajo y vainillina sobre plantas de vid infectadas artificialmente con hongos fitopatógenos.
Los ensayos se realizaron con plantas de la variedad de uva Tempranillo en un viñedo experimental.
La metodología del ensayo se indica a continuación:
Cada planta se cultivó independientemente en una maceta de 800 litros de capacidad que contenía un sustrato comercial adaptado especialmente para plantas de vid. Las plantas (500 en total) se organizaron en 20 líneos de 25 plantas por lineo.
En total en este estudio se sembraron 10 líneos que se describen a continuación: · Lineo 1. Lineo control de plantas sin tratar.
• Lineo 2. Plantas infectadas artificialmente sobre las heridas de poda con los hongos D. seríate (10.000 unidades formadoras de colonias), P. chlamydospora (10.000 unidades formadoras de colonia ) y C. macrodidymun (2000 unidades formadoras de colonia).
· Lineo 3. Plantas tratadas con quitosán (25 mg/ml)
• Lineo 4. Plantas tratadas con extracto hidroalcohólico de ajo (10%)
• Lineo 5. Plantas tratadas con vainillina (5 mg/ml)
• Lineo 6. Plantas tratadas con la mezcla QAV (cada compuesto individual a la concentración indicada anteriormente)
· Lineo 7. Plantas tratadas con quitosán (como en lineo 3) e infectadas con los patógenos.
• Lineo 8. Plantas tratadas con extracto hidroalcohólico de ajo (como en lineo 4) e infectadas con los patógenos
• Lineo 9. Plantas tratadas con vainillina (como en lineo 5) e infectadas con los patógenos • Lineo 10. Plantas tratadas con la mezcla QAV (cómo en lineo 6) e infectadas con los patógenos.
En todos los casos los antifúngicos se aplicaron con brocha sobre las heridas de poda.
La relación de plantas vivas y muertas en cada uno de los líneos del viñedo experimental tras 2 años de poda, aplicación del antifúngico e infección artificial con hongos fitopatógenos, se ha representado en la figura 1.
Las plantas se sembraron en la primavera del año 2008. En noviembre de 2008 las plantas fueron podadas y una vez podadas se les aplicó a los líneos correspondientes el tratamiento a base de antifúngicos (líneos 3 a 10). A continuación 24 horas más tarde se procedió a la infección artificial de las plantas mediante adición de suspensiones acuosas que contenían los hongos fitopatógenos y en las cantidades anteriormente citados.
Esta metodología se repitió sucesivamente (poda en noviembre de 2009 y aplicación de antifúngicos y hongos; análisis de plantas en junio 2010; y finalmente poda en noviembre de 2010 y aplicación de antifúngicos y hongos).
Transcurridos 2 años desde el inicio del estudio se analizaron dos tipos de parámetros:
a).- Indice de mortalidad de plantas en cada lineo (ver figura 1 ).
Como podemos apreciar en la figura 1 a los dos años de iniciarse el estudio y proceder a la infección artificial del viñedo experimental pudimos comprobar como en el caso del lineo 2 (plantas infectadas y no tratadas con antifúngicos) el nivel de mortalidad fue del 52%, mostrando las restantes plantas vivas en algunos casos síntomas foliares evidentes (lesiones) atribuibles a hongos patógenos responsables de enfermedades de madera. Este dato indica que la inoculación realizada sobre heridas de poda fue efectiva provocando la infección de las plantas de vid.
La mortalidad natural en el lineo control (lineo 1 ) fue del 12.0%, mientras que en el caso de los líneos correspondientes a plantas no infectadas y tratadas con antifúngico los niveles de mortalidad fueron respectivamente del 8% (quitosán; lineo 3), 4% (extracto hidroalcohólico de ajo; lineo 4), 8% (vainillina; lineo 5) y 0% (mezcla QAV; lineo 6). Por el contrario en el caso de los líneos tratados con antifúngicos e infectados artificialmente observamos una tasa de mortalidad del 12% (lineo 7), 8% (lineo 8), 12% (lineo 9) y 0% (lineo 10). Estos resultados permiten concluir que la aplicación individual de los antifúngicos sobre heridas de poda tiene un claro efecto protector sobre las plantas de vid ya que los niveles de mortalidad se redujeron considerablemente frente a la tasa de mortalidad del 52% observada en el lineo 2 (plantas infectadas y no tratadas con antifúngicos). La mayor protección era ejercida por el extracto hidroalcohólico de ajo (mortalidad del 8%), seguida del quitosan y la vainillina (mortalidad del 12%). La mezcla QAV mostró unas propiedades mejoradas respecto a la aplicación individual de sus componentes ya que no se produjo la muerte de ninguna de las plantas tratadas con la mezcla, por lo que de su aplicación conjunta podemos deducir un claro efecto sinergístico.
b).- Análisis de 6 plantas por lineo a fin de determinar la presencia en plantas de hongos responsables de enfermedades de madera de vid. Para ello las plantas se arrancaron y se analizó la presencia de hongos en rodajas de madera 2, 5 y 10 cm por encima y por debajo del lugar de inoculación de los hongos.
Los resultados de este análisis confirmaron la presencia de hongos fitopatógenos responsables de madera en el 50-90% de las muestras analizadas correspondientes a plantas infectadas artificialmente (lineo 2). Los niveles de detección de hongos fitopatógenos en plantas del lineo 1 o control oscilaron entre el 5-8% de las muestras analizadas y entre el 0-2%(líneo 3; quitosán), 0-3% (lineo 4; extracto hidroalcohólico de ajo), 1 -3% (lineo 5; vainillina) y 0-1 % (lineo 6; mezcla QAV). Niveles similares fueron detectados en el caso de los líneos infectados artificialmente y tratados con antifúngicos: 0-4% (lineo 7), 1 -2.5% (lineo 8), 0-6% (lineo 9) y 0-1 % (lineo 10). Estos datos claramente confirman que la aplicación de los antifúngicos seleccionados, y en especial de la mezcla, son capaces de disminuir los niveles de infección de hongos fitopatógenos de enfermedades de madera a través de heridas de poda, tanto en el caso de infecciones naturales como en el caso de infecciones artificiales en las que los patógenos se aplicaban directamente sobre las heridas de poda.
En junio de 2009 y de 2010 se procedió al análisis de una serie de parámetros incluyendo longitud del décimo entrenudo, longitud total y número de hojas cloróticas. Además se tomaron muestras de hojas de plantas de cada lineo a partir de los que se obtuvieron extractos en los que se analizaron parámetros tales como concentración de proteínas, peroxidación lipídica, actividad catalasa, actividad guayacol peroxidasa (GPX), glutatión S transferasa (GST) y superóxido dismutasa (SOD) utilizando protocolos estándar. El objetivo de estos estudios era por un lado confirmar que la aplicación de los antifúngicos no tenía efecto negativo o estresante sobre las plantas y por otro determinar un posible efecto estimulador de los mecanismos de defensa sistémicos de la planta. Los resultados obtenidos indican que en ningún caso la aplicación de antifúgicos tuvo un efecto nocivo para la planta ya que no se incrementaron los niveles de los marcadores de estrés utilizados.
Preparación de los antifúngicos y su aplicación sobre las heridas de poda. El quitosán oligosacárido se prepara mediante disolución en agua destilada a una concentración inicial de 100 mg/ml. Se aplica sobre las heridas de poda a una concentración de 10-25 mg/ml.
El extracto hidroalcohólico de ajo se prepara mediante homogeneización de dientes de ajo pelados a una concentración inicial del 30% (p/v) en etanol al 10%. La homogeneización se consigue mediante trituración con batidora o similar hasta obtener una suspensión homogénea y fina. La suspensión se incuba a continuación durante 2 horas a 4°C con agitación para una máxima extracción de los principios activos. La suspensión se puede filtrar a fin de eliminar materiales sólidos. La aplicación sobre las heridas de poda se realiza a una concentración del 7-10% (p/v) mediante la disolución de la suspensión inicial en agua destilada.
La vainillina se prepara mediante disolución en metanol a una concentración inicial de 200 mg/ml. La aplicación sobre las heridas de poda se realiza a una concentración 3-5 mg/ml, mediante disolución de disolución inicial en etanol al 10% (v/v) o agua.
La combinación de quitosán oligosacárido, extracto hidroalcohólico de ajo y vainillina se prepara a partir de las disoluciones o suspensiones concentradas de los productos por separado y se aplica sobre las heridas de poda con una composición del quitosán (20-25 mg/ml)-extracto hidroalcohólico de ajo (8-10%)- vainillina (3-4 mg/ml).

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Utilización de antifúngicos naturales para prevenir la infección de lesiones, injertos y heridas de poda en plantas leñosas por hongos fitopatógenos, caracterizada porque comprende, solos o en combinación, quitosán oligosacárido, extracto hidroalcohólico de ajo y/o vainillina.
2. - Procedimiento para preparar la combinación de antifúngicos de la reivindicación 1 , caracterizado porque consta de las etapas de:
a) preparar el quitosán oligosacárido mediante disolución en agua destilada a una concentración inicial de 100 mg/ml; y se aplica sobre las heridas de poda a una concentración de entre 10 y 25 mg/ml;
b) preparar el extracto hidroalcohólico de ajo mediante homogeneización de dientes de ajo pelados a una concentración inicial del 30% (p/v) en etanol al 10%; y la aplicación sobre las heridas de poda se realiza a una concentración de entre 7% y 10% (p/v) mediante la disolución de la suspensión inicial en agua destilada.
c) preparar la vainillina mediante disolución en metanol a una concentración inicial de 200 mg/ml; y la aplicación sobre las heridas de poda se realiza a una concentración de entre 3 y 5 mg/ml (por disolución de la disolución inicial en etanol al 10% (v/v) o agua);
d) preparar la combinación de quitosán oligosacárido, extracto hidroalcohólico de ajo y vainillina a partir de las disoluciones o suspensiones concentradas de los productos por separado y se aplica sobre las heridas de poda con una composición del quitosán (entre 20 y 25 mg/ml )-extracto hidroalcohólico de ajo (entre 8 y 10%)- vainillina (entre 3 y 4 mg/ml).
3. - Utilización según las reivindicaciones 1 y 2, para lo cual se aplica quitosán oligosacárido a una concentración de entre 10 y 25 mg/ml, sobre heridas de poda, injertos u otro tipo de lesiones de plantas leñosas, preferentemente vid, para evitar la infección por especies de hongos fitopatógenos descritos como causantes de enfermedades de madera.
4. - Utilización según las reivindicaciones 1 y 2, para lo cual se aplica un extracto hidroalcohólico de ajo a una concentración de entre 7 y 10% (p/v) preparado en etanol (10%), sobre heridas de poda, injertos u otro tipo de lesiones de plantas leñosas, preferentemente vid, para evitar la infección por especies de hongos fitopatógenos descritos como causantes de enfermedades de madera.
5. -Utilización según las reivindicaciones 1 y 2, para lo cual se aplica vainillina a una concentración de entre 3 y 5 mg/ml, preparada por disolución en agua o etanol 10% sobre heridas de poda, injertos u otro tipo de lesiones de plantas leñosas, preferentemente vid para evitar la infección por especies de hongos fitopatógenos descritos como causantes de enfermedades de madera.
6. - Utilización según las reivindicaciones 1 y 2, para lo cual se aplica quitosán oligosacárido y extracto hidroalcohólico de ajo, en cualquier combinación, sobre heridas de poda, injertos u otro tipo de lesiones de plantas leñosas, preferentemente vid, para evitar la infección por especies de hongos fitopatógenos descritos como causantes de enfermedades de madera.
7. - Utilización según las reivindicaciones 1 y 2, para lo cual se aplica quitosán oligosacárido y vainillina, en cualquier combinación, sobre heridas de poda, injertos u otro tipo de lesiones de plantas leñosas, preferentemente vid, para evitar la infección por especies de hongos fitopatógenos descritos como causantes de enfermedades de madera.
8. - Utilización según las reivindicaciones 1 y 2, para lo cual se aplica extracto hidroalcohólico de ajo y vainillina, en cualquier combinación, sobre heridas de poda, injertos u otro tipo de lesiones de plantas leñosas, preferentemente vid, para evitar la infección por especies de hongos fitopatógenos descritos como causantes de enfermedades de madera.
9. - Utilización según las reivindicaciones 1 y 2, para lo cual se aplica quitosán oligosacárido, extracto hidroalcohólico de ajo y vainillina, combinados en cualquier proporción, sobre heridas de poda, injertos u otro tipo de lesiones de plantas leñosas, preferentemente vid para evitar la infección por especies de hongos fitopatógenos descritos como causantes de enfermedades de madera.
10. - Utilización según la reivindicación 3, para lo cual se aplica quitosán oligosacárido a una concentración de 25 mg/ml, sobre heridas de poda, injertos u otro tipo de lesiones de plantas leñosas, preferentemente vid, para evitar la infección por especies de hongos fitopatógenos descritos como causantes de enfermedades de madera.
11.-Utilización según la reivindicación 4, para lo cual se aplica extracto hidroalcoholico de ajo a una concentración del 10%, sobre heridas de poda, injertos u otro tipo de lesiones de plantas leñosas, preferentemente vid para evitar la infección por especies de hongos fitopatógenos descritos como causantes de enfermedades de madera.
12.- Utilización según la reivindicación 5, para lo cual se aplica vainillina a una concentración de 5 mg/ml, sobre heridas de poda, injertos u otro tipo de lesiones de plantas leñosas, preferentemente vid para evitar la infección por especies de hongos fitopatógenos descritos como causantes de enfermedades de madera.
13.- Utilización según la reivindicación 9, para lo cual se aplica la combinación de quitosán oligosacárido, extracto hidroalcoholico de ajo y vainillina, en una proporción de quitosán oligosacáhdo (25 mg/ml), extracto hidroalcoholico de ajo (10%) y vainillina (4 mg/ml).
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