WO2012128577A2 - 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 및 스크리닝 방법 - Google Patents

패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 및 스크리닝 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention analyzes the efficacy of LRR protein as a sepsis inhibitor protein therapeutic agent, which is composed of a repetitive combination of LRR (Leucine rich repeat) modules, and constructs an assay system for screening protein therapeutic agents showing excellent inhibitory effect from sequence mutation libraries. It is about.
  • the method for analyzing or screening the efficacy of the sepsis protein therapeutic agent comprising the step of adding the purified MD-2 protein to an assay system using a cell line expressing the LPS signal transducing receptor, purified to a THP-1 cell line
  • Efficacy analysis method or screening method for the treatment of sepsis protein comprising the step of adding the MD-2 protein, the cell line for assay or screening efficacy, the screening or efficacy assay for sepsis treatment comprising the cell line and purified MD-2 It is related to a kit.
  • LPS lipopolysaccharide
  • TLRs Toll-like receptors
  • LPS transmits signals through TLR4 and secretes cytokines among these TLRs to cause an immune response. This is a normal immune response of the human body, but in a person whose immunity is rapidly lowered due to a disease or extreme stress, an excessive immune response can lead to severe sepsis.
  • LPS is incapable of directly binding to TLR4, one of the innate immune receptors, and is known to initiate cellular signal transduction by binding to a complex of TLR4 and MD-2 via Myeloid differentiation protein-2 (MD-2). . Therefore, in recent years, many studies have been conducted on the development of therapeutic agents for sepsis that block LPS signal transduction targeting TLR4, MD-2, or TLR4 / MD-2 complexes.
  • LBP, CD14, MD-2, and soluble TLR4 which are important proteins for LPS signal transduction, are known to inhibit the signal transduction by LPS.
  • the complex of sTLR4 and MD-2 is known to have an excellent effect of inhibiting LPS signal transduction, which means that when present alone, MD-2, which forms a non-functional complex, binds to sTLR4.
  • Structurally stabilized and consequently, sTLR4 / MD-2 which is capable of binding LPS, inhibits LPS signaling on the basis of competing LPS binding with TLR4 / MD-2 complexes on the surface of immune cells (Mitsuzawa et al., J.
  • TV3 protein which was a fusion of a variable lymphocyte receptor (VLR) fragment with a MD-2 binding site of TLR4, to an experimental animal (mouse) alone (without MD-2).
  • VLR variable lymphocyte receptor
  • This TV3 fusion protein is a protein therapeutic made by hybrid LRR technology that combines proteins of leucine rich repeat (LRR) family in which leucine repeats in a regular pattern like TLR4. It is presenting a new blueprint.
  • sepsis is a result of immune hypersensitivity reactions that proceed from the signal transmission by innate immunity, and thus, therapeutic agents studied for the treatment of sepsis require a rapid efficacy analysis process based on immune cells.
  • protein therapeutics showing sepsis inhibitory effects require a cell-based assay system capable of LPS signal transduction, and in the present invention, firefly lucifer in which expression is initiated by activated NF- ⁇ B in HEK293 cell line capable of LPS signal transduction.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a sepsis therapeutic agent that provides MD-2 to a cell based assay system to block LPS signal transduction.
  • the cell-based assay system according to the present invention can be usefully used for analyzing and exploring the efficacy of protein therapeutics in combination with MD-2 to maintain structural stability, thereby enabling the capture of LPS.
  • A A method for analyzing the efficacy of cell-based protein therapeutics using Luciferase reporter
  • B A method for analyzing the efficacy of protein therapeutics using ELISA confirmation of immune cell-based TNF- ⁇ .
  • FIG. 2 is a view showing the X-ray crystal structure of the TV3 / MD-2 complex bound to LPS.
  • FIG. 3 is a diagram showing a cleavage map of a firefly luciferase reporter vector (Invivogen) that starts expression by NF- ⁇ B activated by LPS signaling and an internal standard vector (Promega company) expressing Renilla luciferase.
  • A A cleavage map of a firefly luciferase reporter vector
  • B A cleavage map of an internal standard vector expressing Renilla luciferase.
  • Figure 4 shows the validity of the cell-based assay method for confirming the signal transduction blocking effect by LPS inhibitors, antagonists, etc. by introducing luciferase vectors into HEK293 model cells expressing TLR4 / MD-2 / CD14 on the cell surface Drawing.
  • 5 is a cell-based assay for introducing luciferase vectors into HEK293 model cells expressing TLR4 / MD-2 / CD14 on the cell surface, analyzing the effect of MD-2 on the efficacy of protein therapeutics. to be.
  • FIG. 6 shows the feasibility of a cell-based assay method for confirming the reduction of the amount of TNF- ⁇ cytokine secreted into the medium by ELISA by treating LPS inhibitor polymyxin B with THP-1 cells differentiated by PMA.
  • the present invention (a) is a cell line expressed on the surface of the lipopolysaccharide (LPS) signal transduction receptor, the gene encoding the reporter protein to the promoter to which the NF- ⁇ B binding motif is coupled works Introducing a vector comprising a expression cassette operably linked and a vector comprising an expression cassette operably linked to a gene encoding a reporter protein to a promoter lacking an NF- ⁇ B binding motif; (b) preparing a mixture of Myeloid differentiation protein-2 (MD-2), LPS and sepsis protein therapeutics in advance; (c) contacting the cell solution of step (a) with the mixed solution prepared in step (b); And (d) when the experimental group in contact with the protein therapeutic agent has less expression of reporter protein than the control group which is not in contact with the protein therapeutic agent to be compared, the sepsis protein therapeutic agent of the experimental group is more effective than the sepsis protein therapeutic agent in the control group. It provides a method for analyzing the eff
  • the present invention provides a cell line expressing (a) an LPS signal transduction receptor, the expression cassette comprising an expression cassette operably linked to a gene encoding a reporter protein to a promoter to which an NF- ⁇ B binding motif is bound.
  • MD-2 Myeloid differentiation protein-2
  • the method of the present invention is preferably a method for analyzing or screening efficacy of a protein therapeutic agent based on firefly luciferase, and luciferase on HEK293 cells expressing LLR signal transduction receptors TLR4, MD-2, and CD14 on the surface.
  • a Renilla luciferase expression vector By introducing an expression vector and a Renilla luciferase expression vector at the same time, the activity level of firefly luciferase initiated expression by NF- ⁇ B activated by LPS signaling is compared with the activity of the constantly expressed Renilla luciferase. This is a method of comparative analysis of the increase in activity by NF- ⁇ B.
  • a schematic of the efficacy analysis or screening method of the present invention is shown in Figure 1A.
  • LPS signal transduction receptor refers to a protein expressed on the cell surface as a receptor required for signal transduction of LPS, and includes a receptor mediating LPS signal transduction, which is the cause of sepsis, without limitation. Examples may include CD14, MD-2, TLR4, and the like.
  • LPS lipopolysaccharide
  • lipid and carbohydrate polysaccharide
  • endotoxin is known to induce a strong immune response by acting on the animal's immune system, and binds to the TLR4 / MD-2 complex among TLRs (toll-like receptors) responsible for innate immunity in immune cells. It is reported to cause. In other words, if the LPS signal is excessively produced, sepsis is caused by an immune hypersensitivity reaction.
  • the sepsis protein therapeutic agent when the cell-based assay system of the present invention is used, the sepsis protein therapeutic agent effectively transmits LPS signal when MD-2 is added externally compared to a system without adding the purified MD-2.
  • the system for analyzing or screening the efficacy of the sepsis therapeutic agent is not purified by treating only the sepsis protein therapeutic agent or the candidate substance (LRR protein), but purified MD. It is based on the high accuracy when analyzing the external addition of -2.
  • the structure in which the complex of TV3 and MD-2, the protein therapeutic agent used in one embodiment of the present invention, binds to LPS is confirmed in FIG.
  • MD-2 has an increased affinity for LPS in the state of binding to TLR4 (Akashi et al. , J. Exp. Med., 198 (7): 1035-1042, 2003), therefore, it is desirable to provide purified protein MD-2 to analyze the efficacy of protein therapeutics or to screen for LRR family proteins, new protein therapeutics.
  • cluster of differentiation 14 is a protein secreted from immune cells or expressed on the cell surface and performs various functions in innate immunity, and serves to bind LPS to the TLR4 / MD-2 complex well. It is reported that
  • MD-2 Myeloid differentiation protein-2
  • lymphocyte antigen 96 shows affinity ( K d ) of LPS and 65 nM, a complex with TLR4 on the surface of immune cells It forms and mediates between LPS and TLR4, which bind to LPS to allow intracellular signal transduction.
  • TLR4 (Toll-like receptor 4) is one of the toll-like receptors (TLRs) that are expressed on the surface of immune cells and perform innate immune function, also called CD284 (cluster of differentiation 284).
  • TLR4 on the surface of the immune cell complexes with MD-2, and forms a complex with LPS via MD-2, and the complex of TLR4 / MD-2 / LPS thus formed forms a dimer.
  • Signal transduction of LPS phosphorylates the inhibitor of NF- ⁇ B binding to NF- ⁇ B, and NF- ⁇ B transcription factors released from I ⁇ B migrate to the nucleus and participate in the transcription of various cytokines.
  • the efficacy of the sepsis protein therapeutic agent is effectively achieved using a vector in which an NF- ⁇ B binding motif is coupled to a promoter. Can be analyzed or screened.
  • LPS receptors such as CD14, MD-2, and TLR4 are used to enable LPS signaling to HEK293 cell line. It can be a cell line (stable cell line) to be all expressed.
  • Cell lines suitable for the construction of the cell-based assay system of the present invention, which can be stably cultured while maintaining the LPS signaling function, and which facilitate the intracellular introduction of the firefly luciferase reporter vector, are included without limitation, and include LPS receptors.
  • HEK293 / hTLRA-MD2-CD14 (Invivogen, USA), a cell line expressing both CD14, MD-2, and TLR4 and capable of stable subculture, was used.
  • NF- ⁇ B binding motif refers to a motif that binds to an NF- ⁇ B transcription factor and enables a promoter linked to the motif to operate to allow expression of a gene present downstream.
  • a firefly luciferase vector (Invivogen, USA) comprising a "NF- ⁇ B binding motif" for a desired cell-based assay, and a constant level of the renilla luciferase vector (Promega, USA) ) was simultaneously introduced into the cell and used.
  • a vector comprising an expression cassette in which the gene encoding the reporter protein is operably linked to a promoter to which an NF- ⁇ B binding motif is introduced into the cell line expressing the LPS signal transduction receptor of each step (a) of the present invention.
  • ⁇ B transcription factors bind to allow expression of a operably linked reporter protein downstream
  • promoters without the NF- ⁇ B binding motif are associated with a variety of external factors, including LPS signal transduction (eg, NF- ⁇ B transcription factors, etc.). Regardless of the promoter that is expressed, it will express reporter proteins operably linked downstream.
  • the promoter without the NF- ⁇ B binding motif may use the HSV-TK promoter, but promoters used in the art may be used without limitation.
  • operably linked in the present invention means that when one nucleic acid fragment is combined with another nucleic acid fragment, its function or expression is affected by the other nucleic acid fragment, but each of the various possible combinations of these nucleic acid fragments It refers to a combination of states in which fragments have no detectable effect on their function. That is, the nucleic acid expression control sequence and the nucleic acid sequence encoding the protein of interest is functionally linked to perform a general function. Operable ligations can be made using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation can employ enzymes generally known in the art and the like.
  • the reporter protein of step (a) is a different protein, and may include a variety of distinguishable reporter proteins, but is not limited thereto.
  • green fluorescent protein (GFP) and CAT CM acetyl transferase
  • beta-galactosidase beta-secreted alk-phosphate
  • firefly luciferase or lenilla luciferase.
  • CAT CM acetyl transferase
  • beta-galactosidase beta-galactosidase
  • beta-secreted alk-phosphate e
  • firefly luciferase e
  • HSV-A vector operably linking a gene encoding Renilla luciferase to the TK promoter was used (FIG. 3B).
  • a vector operably linked to a gene encoding Renilla luciferase to the HSV-TK promoter is suitable as a control for firefly luciferase since expression is maintained by the HSV-TK promoter regardless of LPS signal transduction.
  • the term "introduction” refers to the introduction of foreign DNA into the cell by transformation or transduction. Transformation was performed by using a calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation method, a CaCl 2 method using a reducing agent called DMSO (dimethyl sulfoxide), which improved efficiency, electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, and protoplast fusion. Method, agitation with silicon carbide fibers, agro bacteria mediated transformation, transformation with polyethylene glycol (PEG), dextran sulfate, microinjection, lipofectamine and dry / inhibition mediated transformation It can be carried out by a variety of methods known in the art such as methods. Transduction refers to the transfer of genes into cells using viral or viral vector particles by means of infection.
  • the cell lines into which each vector was introduced in step (a) were observed to decrease the relative activity of luciferase by treatment with polymyxin B, an LPS inhibitor, and LPS-RS, an antagonist (FIGS. 4A and 4B). It was confirmed that the cell line of the present invention is a cell suitable for the analysis or screening of the efficacy of LPS inhibitors, namely sepsis therapeutics.
  • the term "protein therapeutic agent” is a protein provided for the purpose of preventing the progress of the immune response by binding the LPS to the TLR4 / MD-2 complex on the surface of the immune cell, when present alone insoluble complex It binds to well-formed MD-2 and helps the MD-2 maintain a structure capable of binding to LPS, and it is a soluble TLR4 (soluble TLR4, sTLR4) or hybrid LRR technology composed of the extracellular domain of TLR4. TVL protein, or a hybrid LRR protein in a fused form of TLR4-like LRR protein fragments, but is not limited thereto.
  • the In protein of the InlB-VLR family which is a phosphoprotein protein fused with the N-terminus of the repeat protein TV3 or the Internalin B protein, the modified repeat module of the Variable Lymphocyte Receptor (VLR) protein and the C-terminus of the VLR protein -VLR5-c (Korean Patent Application No. 10-2010-0086055).
  • VLR Variable Lymphocyte Receptor
  • Such protein therapeutics may be selected from LRR proteins or sequencing libraries constructed by repeated combinations of LRR modules, and candidates for sepsis therapeutics may be similarly selected.
  • the term "septic drug candidate” refers to a substance capable of treating sepsis by inhibiting LPS signal transmission, and may be used without limitation, compounds, enzymes, proteins or nucleic acids, preferably immune
  • the LPS may bind to the TLR4 / MD-2 complex on the cell surface, and may be a protein provided for the purpose of preventing an immune response from progressing.
  • step (b) MD-2, LPS and the sepsis protein therapeutic agent to be compared with each other are prepared in advance, and then the prepared mixture is contacted with the cell line of step (a), respectively.
  • the expression amount of the reporter protein of the experimental group is less than that of the control group which is not contacted with the protein therapeutic agent to be compared, the function of the sepsis protein therapeutic agent of the experimental group is judged to be better as a protein therapeutic agent than the sepsis protein therapeutic agent of the control group.
  • control group can be used as a control group in which the experimental group in contact with the mixed solution of the MD-2, LPS and the sepsis protein therapeutic agent to be compared with the mixed solution of the MD-2, LPS and the experimental group and the other sepsis protein therapeutic agent can be used as a control.
  • Such efficacy analysis methods may be used to analyze the function between sepsis proteins selected as sepsis protein therapeutics or to determine whether the known sepsis protein therapeutics actually block LPS signaling.
  • MD-2, LPS and sepsis treatment candidates together or sepsis treatment candidates or MD-2 alone are prepared by mixing the LPS in advance, and then the prepared mixture is prepared in the cell line of step (a), respectively.
  • the expression level of the reporter protein of the experimental group in which MD-2 contacted with the sepsis therapeutic agent and MD-2 simultaneously was less than the expression amount of the reporter protein of the control group contacted with the sepsis therapeutic agent alone, MD-2 alone and LPS.
  • the candidate for treating sepsis may be determined to be a sepsis treatment.
  • the experimental group in which the protein therapeutic agent of step (d) and MD-2 were contacted together compared to the control group which did not contact the protein therapeutic agent to be compared, the experimental group had an excellent function as a sepsis protein therapeutic agent when the expression amount of the reporter protein was low.
  • the step of determining or when the experimental group in contact with the protein candidate has less expression of the reporter protein than the control group not in contact with the candidate the step of determining the sepsis candidate as the sepsis therapeutic agent is preferably an NF- ⁇ B binding motif.
  • Luminescence value of the reporter protein operably linked to the promoter to which the nucleotide is bound is divided by the luminescence value of the reporter protein operably linked to the promoter without the NF- ⁇ B binding motif (ie, relative luminescence value). If low, sepsis protein treatment is considered good or, a candidate substance can be performed by a method for determining that treatment of sepsis.
  • the method of the present invention can analyze the efficacy of the superior sepsis protein therapeutics by comparing the expression amount of the relative reporter protein of the conventional sepsis protein therapeutics, and can also screen the therapeutic agents easily and rapidly among the sepsis therapeutic candidates.
  • the present invention provides a method of treating a THP-1 cell line with PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate); (b) preparing a mixture of Myeloid differentiation protein-2 (MD-2), LPS and sepsis protein therapeutics in advance; (c) contacting the cell solution of step (a) with the mixed solution prepared in step (b); And (d) when the experimental group in contact with the sepsis protein therapeutic agent has a lower amount of TNF- ⁇ than the control group without contact with the sepsis protein therapeutic agent to be compared, the experimental group functions as a sepsis protein therapeutic agent in the control group. It provides a method for analyzing the efficacy of a sepsis protein therapeutic, comprising the step of determining that the efficacy is higher than the therapeutic.
  • PMA phorbol 12-myristate 13-acetate
  • the present invention provides a method of treating a THP-1 cell line with PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate); (b) pre-mixing Myeloid differentiation protein-2 (MD-2), LPS and sepsis therapeutic candidates together with LPS either alone or as a sepsis therapeutic candidate and MD-2 alone; (c) contacting the cell solution of step (a) with the mixed solution prepared in step (b); And (d) the test group in contact with the mixed solution mixed with the MD-2 and the candidate at the same time secrete TNF- ⁇ as compared with the control group without contact with the candidate and the candidate and MD-2 alone with the LPS.
  • PMA phorbol 12-myristate 13-acetate
  • FIG. 1B A schematic diagram of the method using the THP-1 of the present invention is shown in FIG. 1B.
  • the TNF- ⁇ may be replaced with cytokines whose expression is increased by binding of NF- ⁇ B transcription factors that are increased by LPS signal transduction.
  • the term "THP-1" is a cell line widely used in immunocytochemical analysis, which has the properties of human monocyte-derived macrophages, and can be passaged for a long period of time and PMA (phorbol 12-myristate). 13-acetate) or vitamin D3 to easily differentiate into macrophages.
  • PMA phorbol 12-myristate
  • 13-acetate or vitamin D3 to easily differentiate into macrophages.
  • it is a cell line suitable for the construction of a cell-based assay system of the present invention, which is widely used as a cell model of monocytes in which LPS receptor proteins are expressed on the surface.
  • Protein therapeutics or candidates are as described above.
  • the secretion of TNF- ⁇ in the step (d) may be used without limitation the method of analyzing the expression amount of a protein known in the art, preferably the amount of TNF- ⁇ secreted in the medium ELISA (enzyme-linked) It can be carried out by measuring by immunosorbent assay method
  • TNF- ⁇ secretion is reduced when LPS inhibitor polymyxin B is added to THP-1 cells differentiated with PMA (FIG. 6).
  • the cells were found to be suitable for assaying or screening for efficacy of LPS inhibitors, ie sepsis treatments.
  • InlB-VLR (Korean patent application No. Korea) is a phosphorus airport protein in which MD-2 is fused to the N-terminus of an internal B protein, a modified repeat module of a VLR (Variable Lymphocyte Receptor) protein and a C-terminus of a VLR protein.
  • the present invention can provide a method for analyzing sepsis efficacy or a screening method for sepsis including the cell line and MD-2.
  • the present invention provides a cell line expressing the LPS signal transduction receptor, and a vector comprising an expression cassette and an NF comprising a expression cassette operably linked to a gene encoding a reporter protein to a promoter to which an NF- ⁇ B binding motif is bound.
  • a cell line for sepsis therapeutic efficacy analysis or screening wherein the vector is introduced with a vector comprising an expression cassette operably linked to a gene encoding a reporter protein to a promoter lacking a - ⁇ B binding motif.
  • the present invention provides a kit for analyzing the efficacy of sepsis treatment or screening for sepsis treatment comprising the cell line and MD-2.
  • the kit may include a medium for culturing the cell line, instructions for explaining the method of use.
  • the present invention provides a cell line expressing an LPS signal transduction receptor, a vector comprising an expression cassette comprising an expression cassette operably linked to a gene encoding a reporter protein to a promoter to which an NF- ⁇ B binding motif is bound.
  • a vector comprising an expression cassette operably linked to a gene encoding a reporter protein to a promoter to which an NF- ⁇ B binding motif is bound.
  • Efficacy analysis or screening method of protein therapeutic agents provided by the present invention quantitatively analyzes the emission value of firefly luciferase or the secretion amount of TNF- ⁇ cytokine by LPS signal transduction using cell lines expressed on the surface of LPS receptors. That's how.
  • the present inventors used pNiFty-Luc (Invivogen), a firefly luciferase reporter vector, and pRL-TK (Promega), a Renilla luciferase expression vector, as a control, activating the TLR4-MD-2 receptor by LPS as shown in FIG. 1A.
  • a system capable of confirming whether or not was constructed as follows.
  • the firefly luciferase expression vector (pNiFty-Luc) used in the present invention has an NF- ⁇ B binding site at the promoter site so that expression of the luciferase gene can be initiated by LPS signal transduction (FIG. 3A).
  • Renilla luciferase expression vector (pRL-TK) is maintained by the HSV-TK promoter, which is not influenced by various external factors including LPS signal transduction, thus making it suitable as a control for the firefly luciferase expression vector ( 3B).
  • the HEK293 / hTLR4A-MD2-CD14 model cell line (Invivogen) stably expresses TLR4, MD2, and CD14 expression genes are introduced into the HEK293 cell line to confirm the activation of the TLR4-MD-2 receptor by LPS.
  • HEK293 / hTLR4A-MD2-CD14 cell line is passaged in an incubator maintained at 37 ° C and 5% CO 2 using RPMI medium (Invitrogen) containing 10% serum (Fetal Bovine Serum, FBS) Prepared to be.
  • luciferase expression vectors used in the present invention were prepared in the state where endotoxin was removed from the vector-transformed DH5 ⁇ strain using Endofree Plasmid Maxi Kit (QIAGEN).
  • Polymyxin B (Invivogen), an LPS inhibitor, and LPS-RS (Invivogen), an antagonist, used in the present invention, were diluted at a concentration of 0.01-100 ⁇ g / ml in RPMI culture solution at 37 ° C. with LPS at a concentration of 10 ng / ml. Prepared by sufficient reaction for hours.
  • Protein therapies were prepared by simultaneously adding 5 ⁇ g / ml TV3, 100 ng / ml MD-2, and 10 ng / ml LPS to RPMI cultures, and 5 ⁇ g / ml TV3 and LPS, 100 ng / ml to RPMI cultures.
  • a control group to which ml of MD-2 and LPS was added were prepared together and sufficiently reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • Luciferase reporter vectors were introduced into HEK293 / hTLR4A-MD2-CD14 cells using Lipofectamin TM 2000 (Invitrogen) in the following manner.
  • the LPS receptor TLR4, MD-2, CD14 expressed on the surface of HEK293 cells, the luciferase expression vector and the control Renilla luciferase expression vector at the same time introduced by NF- ⁇ B activated by LPS signal transduction It is a relative analysis method of comparatively analyzing the luminescence of firefly luciferase in which expression is started by the luminescence of Renilla luciferase as a control (FIG. 1A).
  • the luminescence value of firefly luciferase was divided by the luminescence value of Renilla luciferase and used as an indicator of activation of TLR4 / MD-2 receptor by LPS.
  • LPS signal transduction was induced by increasing concentration of polymyxin B, an LPS inhibitor.
  • the decrease was confirmed by a decrease in the relative activity of firefly luciferase (FIG. 4A), and similarly, a decrease in LPS signal transduction with increasing concentrations of LPS antagonist LPS-RS could be confirmed by a decrease in the relative activity of firefly luciferase (FIG. 4B). .
  • THP-1 monocyte cell line from leukemia patients characterized by PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) or vitamin D 3 that is easily differentiated into macrophages.
  • PMA phorbol 12-myristate 13-acetate
  • vitamin D 3 vitamin D 3 that is easily differentiated into macrophages.
  • the mononuclear THP-1 (TIB-202TM, ATCC) cell line was incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 in RPMI medium containing 10% serum (Fetal Bovine Serum, FBS) and 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol. When the cell density reached 90%, the cells were washed with PBS buffer (pH 7.4), and then suspended in RPMI medium containing 200 nM of PMA (phorbol 12-myristate-13-acetate) to increase sensitivity to LPS. The well plates were aliquoted at 2.5 ⁇ 10 4 cells / well and fully differentiated at 37 ° C., 5% CO 2 conditions for 72 hours.
  • PMA phorbol 12-myristate-13-acetate
  • polymyxin B an inhibitor of LPS
  • RPMI culture medium containing 10 ⁇ g / ml InlB-VLR and MD-2 simultaneously added with LPS
  • 10 ⁇ g / ml InlB- RPMI culture medium to which VLR, TV3, MD-2 were added alone was prepared by reacting at 37 ° C for 1 hour.
  • the THP-1 cells differentiated into macrophages by PMA were then washed three times with PBS buffer (pH 7.4), and the RPMI culture containing protein therapeutics and controls, or the controls were treated with THP-1 with 20 ng / ml LPS. Treated at 37 ° C. and incubated at 5% CO 2 . After 6 hours, a certain amount of culture was taken from each well, diluted 4-8 times with PBS buffer (pH 7.4), and secreted TNF- ⁇ was analyzed by conventional ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays, ebioscience). The results were calculated from the TNF- ⁇ standard curve.

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Abstract

본 발명은 LRR(Leucine rich repeat) 모듈의 반복적 조합에 의하여 구성된, LRR 단백질의 패혈증 저해 단백질 치료제로서의 효능을 분석하고, 서열변이 라이브러리로부터 우수한 저해효능을 보이는 단백질 치료제를 스크리닝하는 어세이 시스템의 구축에 관한 것이다. 보다 구체적으로, LPS 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주를 이용한 어세이 시스템에 정제한 MD-2 단백질을 첨가하는 단계를 포함하는 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 방법 또는 스크리닝 방법, THP-1 세포주에 정제한 외래 MD-2 단백질을 첨가하는 단계를 포함하는 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 방법 또는 스크리닝 방법, 상기 효능 분석용 또는 스크리닝용 세포주, 상기 세포주 및 정제한 외래 MD-2를 포함하는 패혈증 치료제 스크리닝용 또는 효능 분석용 키트에 관한 것이다.

Description

패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 및 스크리닝 방법
본 발명은 LRR(Leucine rich repeat) 모듈의 반복적 조합에 의하여 구성된, LRR 단백질의 패혈증 저해 단백질 치료제로서의 효능을 분석하고, 서열변이 라이브러리로부터 우수한 저해효능을 보이는 단백질 치료제를 스크리닝하는 어세이 시스템의 구축에 관한 것이다. 보다 구체적으로, LPS 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주를 이용한 어세이 시스템에 정제된 MD-2 단백질을 첨가하는 단계를 포함하는 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 방법 또는 스크리닝 방법, THP-1 세포주에 정제된 MD-2 단백질을 첨가하는 단계를 포함하는 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 방법 또는 스크리닝 방법, 상기 효능 분석용 또는 스크리닝용 세포주, 상기 세포주 및 정제된 MD-2를 포함하는 패혈증 치료제 스크리닝용 또는 효능 분석용 키트에 관한 것이다.
중증패혈증 환자는 미국에서만 해마다 천만명 이상 발생하고 있으며 1979년부터 2000년까지 약 3배 이상 증가된 것으로 보고되고 있다. 패혈증은 세균의 감염에 의해 발생하는 면역 과민반응에 의해 야기되며, 혈전의 생성과 다발성 장기부전, 높은 치사율(60%)등을 특징으로 하는 생명에 매우 위협적인 질환이다. 패혈증의 가장 주요한 병인원은 그람음성 세균의 세포막을 구성하고 있는 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)이며, 혈액에 감염된 세균의 LPS를 면역세포가 인지하면서 면역반응이 시작되는 것으로 알려져 있다.
인체의 면역 세포 표면에는 선천성 면역(innate immunity)을 담당하는 TLR(toll-like receptor)들이 존재하며, LPS는 이러한 TLR들 중에서 TLR4를 통해서 신호를 전달하고 사이토카인을 분비하여 면역반응을 야기한다. 이는 인체의 정상적인 면역반응이지만, 질환이나 극심한 스트레스 등으로 면역력이 급격히 저하된 사람에서는 과다한 면역반응의 진행이 중증 패혈증으로 이어질 수 있다. 하지만 LPS는 선천성 면역 수용체 중의 하나인 TLR4에 직접 결합하는 능력이 없으며, MD-2(Myeloid differentiation protein-2)를 매개로 TLR4와 MD-2의 복합체에 결합하여 세포 신호 전달을 개시하는 것으로 알려져 있다. 따라서 최근에는 TLR4, MD-2, 또는 TLR4/MD-2 복합체를 타겟으로 하여 LPS 신호 전달을 차단하는 패혈증 치료제 개발에 많은 연구가 진행되고 있다.
현재까지 FDA의 승인을 받고 시판되고 있는 패혈증 치료제는 Eli Lilly사의 지그리스(Xygris) 한 종류뿐이며, 이는 혈전을 억제하는 자연 혈액물질인 재조합 APC(activated protein C)로 대략 15%의 중증 패혈증 환자의 목숨을 구할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한 일본의 Eisai사는 패혈증 치료를 목적으로 MD-2에 경쟁 결합하는, LPS와 유사한 구조의 에리토란(eritoran)을 개발하여 2009년 말 임상 3상에 돌입한 것으로 보고하고 있다. 물론 이외에도 수많은 제약회사들에서 항체를 포함하는 치료제들을 개발하여 임상시험에 돌입하였으나, 대부분 효과가 없거나 미약한 수준에 그치는 등 좋은 결실을 거두지 못하고 있다(Triantafilou et al., Expert Rev. Mol. Med. 24;6(4):1-18, 2004).
한편 LPS 신호 전달에 중요한 단백질들인 LBP와 CD14, MD-2, 그리고 가용성 TLR4(soluble TLR4, sTLR4)는 각각 LPS에 의한 신호 전달을 저해하는 효과가 있는 것으로 알려져 있어 이들을 이용한 패혈증 치료제의 개발이 기대되고 있다. 그 중 sTLR4와 MD-2의 복합체는 LPS 신호 전달을 저해하는 효과가 매우 우수한 것으로 알려져 있는데, 이는 단독으로 존재할 경우 비기능성 복합체(non-functional complex)를 잘 형성하는 MD-2가 sTLR4와 결합하면서 구조적으로 안정화되고, 결과적으로 LPS와 결합이 가능한 sTLR4/MD-2가 면역세포 표면의 TLR4/MD-2 복합체와 LPS 결합을 경쟁하는 원리로 LPS 신호를 저해하게 된다(Mitsuzawa et al., J. Immunolo., 177:8133-8139, 2006; Brandl et al., J. Endotoxin Res., 11:197-206, 2005). 또한 CD14과 MD-2, 그리고 TLR4/MD-2 복합체의 LPS에 대한 결합력(K d)은 각각 30 nM과 65 nM, 3 nM로 보고되고 있는데, 이러한 결합력의 차이로 인해 CD14 및 MD-2에 비해 sTLR4/MD-2 복합체가 우수한 LPS 제거효과를 보이는 것으로 보고되어 있다(Akashi et al., J. Exp. Med., 198(7):1035-1042, 2003).
하지만 sTLR4는 세포막 단백질이 가지는 불용성 발현의 특징 및 거대한 분자량으로 인해 생산이 쉽지 않은 단점이 있다. 이를 해결하기 위해 TLR4의 MD-2 결합부위 단편에 먹장어의 림프구 수용체 단백질(variable lymphocyte receptor, VLR)의 단편을 융합시킨 TV3 단백질을 단독으로(MD-2없이) 실험동물(마우스)에 처리하여 패혈증 저해 효능을 관찰한 예가 있다(PLoS ONE, 4:e7403, 2009). 이러한 TV3 융합 단백질은 TLR4와 같이 루이신이 일정한 패턴으로 반복되는 LRR(leucine rich repeat) 패밀리의 단백질들을 조합하는하이브리드 LRR 기술로 만들어진 단백질 치료제로, 패혈증 치료제 개발뿐만 아니라 항체를 대체할 새로운 단백질 골격 연구에 새로운 청사진을 제시하고 있다.
한편 패혈증은 선천성 면역에 의한 신호 전달로부터 개시하여 진행되는 면역 과민반응의 결과이므로, 패혈증의 치료를 목적으로 연구되는 치료제들은 면역세포 기반의 신속한 효능 분석과정이 요구된다. 즉 패혈증 저해효능을 보이는 단백질 치료제들은 LPS 신호 전달이 가능한 세포 기반의 어세이 시스템을 필요로 하는 바, 본 발명에서는 LPS 신호 전달이 가능한 HEK293 세포주에 활성화된 NF-κB에 의해 발현이 개시되는 반딧불이 루시퍼레이즈 유전자를 도입하여, LRR 단백질 치료제에 의해 LPS신호가 차단되는 효능을 확인할 수 있는 세포기반 어세이 시스템을 구축하고자 하였다. 또한 대식세포로 분화시킨 THP-1에 LPS를 처리하여 분비된 사이토카인을 확인하는 방법으로, 첨가한 단백질 치료제에 의해 LPS 신호가 차단되는 효과를 확인할 수 있는 세포기반 분석 시스템을 구축하고자 하였다. 그러나 위 두 세포모델의 경우 LPS 신호 전달에 필요한 TLR4 및 MD-2가 생산되는 균주임에도 불구하고, sTLR4나 TV3, 또는 하이브리드 LRR 기술로 만들어지는 단백질 치료제들을 단독으로(MD-2없이) 사용하는 경우에 LPS 신호를 차단하는 효과를 나타내지 않는 단점이 있었다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 LPS 신호 전달을 차단하는 단백질 치료제를 스크리닝 및 효과를 신속하게 분석할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 세포기반 어세이에 정제한 MD-2를 함께 제공하는 경우에만 MD-2가 sTLR4와 TV3, 또는 LRR단백질과 안정적인 복합체를 형성하여 LPS를 포획하고 신호 전달을 감소시키는 등, 정제한 MD-2를 외부에서 첨가하는 세포기반 어세이 방법이 단백질 치료제의 효능분석과 탐색에 효과적 방법임을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 세포 기반 어세이 시스템에 MD-2를 제공하여 LPS 신호 전달을 차단하는 패혈증 치료제의 효능 분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 세포 기반 어세이 시스템에 MD-2를 제공하여 LPS 신호 전달을 차단하는 패혈증 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 세포기반 어세이 시스템은 MD-2와 결합하여 구조적 안정성을 유지시켜주어, LPS의 포획이 가능하도록 하는 단백질 치료제의 효능 분석 및 탐색에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 LPS 신호 전달 과정 및 본 발명에 따른 세포기반 단백질 치료제의 효능 분석 방법에 관한 도면이다. A: 루시퍼레이즈 리포터를 이용한 세포기반 단백질 치료제의 효능 분석 방법, B: 면역세포 기반 TNF-α의 ELISA 확인을 이용한 단백질 치료제의 효능 분석 방법을 나타낸다.
도 2는 LPS와 결합하고 있는 TV3/MD-2 복합체의 X-ray 결정구조를 보여주는 도면이다.
도 3은 LPS 신호 전달로 활성화된 NF-κB에 의해 발현이 개시되는 반딧불이 루시퍼레이즈 리포터 벡터(Invivogen사)와, 레닐라 루시퍼레이즈를 발현하는 내부표준 벡터(Promega사)의 개열지도를 나타낸 도면이다. A: 반딧불이 루시퍼레이즈 리포터 벡터의 개열지도, B: 레닐라 루시퍼레이즈를 발현하는 내부표준 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 4는 TLR4/MD-2/CD14이 세포표면에 발현된 HEK293 모델세포에 루시퍼레이즈 벡터들을 도입하여, LPS 저해제, 또는 길항제 등에 의한 신호 전달 차단효과를 확인하는 세포기반 어세이 방법의 타당성을 보여주는 도면이다. A: Polymyxin B에 의한 LPS 신호 전달 저해효과, B: LPS-RS에 의한 LPS 신호 전달 저해효과를 나타낸다.
도 5는 TLR4/MD-2/CD14이 세포표면에 발현된 HEK293 모델세포에 루시퍼레이즈 벡터들을 도입하는 세포기반 어세이 방법에서, MD-2의 공급이 단백질 치료제의 효능에 미치는 영향을 분석한 도면이다.
도 6은 PMA를 처리하여 분화시킨 THP-1 세포에 LPS 저해제인 polymyxin B를 처리하여, 배지로 분비되는 TNF-α 사이토카인 양의 감소를 ELISA로 확인하는 세포기반 어세이 방법의 타당성을 보여주는 도면이다.
도 7은 분화시킨 THP-1 세포의 TNF-α 사이토카인 분비량을 ELISA로 확인하는 세포기반 어세이 방법에서, MD-2의 공급이 단백질 치료제의 효능에 미치는 영향을 분석한 도면이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) LPS(lipopolysaccharide) 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주로, NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터, 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터를 도입하는 단계; (b) MD-2(Myeloid differentiation protein-2), LPS 및 패혈증 단백질 치료제들을 미리 섞어서 준비하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 준비된 혼합액을 상기 (a) 단계의 세포주에 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 단백질 치료제와 접촉된 실험군이 비교하고자 하는 단백질 치료제와 접촉시키지 않은 대조군에 비해 리포터 단백질의 발현양이 적은 경우, 상기 실험군의 패혈증 단백질 치료제의 기능이 대조군의 패혈증 단백질 치료제보다 효능이 좋은 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 방법을 제공한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) LPS 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주로, NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터를 도입하는 단계; (b) MD-2(Myeloid differentiation protein-2), LPS 및 패혈증 치료제 후보물질을 함께 또는 패혈증 치료제 후보물질 없이 미리 섞는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 준비된 혼합액을 상기 (a) 단계의 세포주에 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 후보물질과 접촉시킨 실험군이 후보물질과 접촉시키지 않은 대조군에 비해 리포터 단백질의 발현양이 적은 경우, 상기 후보물질을 패혈증 치료제라고 판단하는 단계를 포함하는, 패혈증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 방법은 바람직하게는 반딧불이 루시퍼레이즈를 기반으로 하는 단백질 치료제의 효능 분석 또는 스크리닝을 하는 방법으로서, LPS 신호 전달 수용체인 TLR4와 MD-2, CD14이 표면에 발현된 HEK293세포에 루시퍼레이즈 발현벡터와 레닐라 루시퍼레이즈 발현벡터를 동시에 도입하여, LPS 신호전달로 활성화된 NF-κB에 의해서 발현이 개시되는 반딧불이 루시퍼레이즈의 활성수준을 일정수준으로 상시 발현되는 레닐라 루시퍼레이즈의 활성과 비교하여 NF-κB에 의한 활성 증가분을 비교 분석하는 방법이다. 이와 같은 본 발명의 효능 분석 또는 스크리닝 방법의 대략적인 모식도를 도 1A에 나타냈다.
본 발명에서 용어, "LPS 신호 전달 수용체"란 LPS의 신호 전달에 필요한 수용체로서 세포 표면에 발현되는 단백질로서, 패혈증 발생에 있어서 그 원인이 되는 LPS 신호 전달을 매개하는 수용체는 제한 없이 포함되나, 그 예로 CD14, MD-2, TLR4 등이 있을 수 있다.
본 발명에서 용어, "LPS(lipopolysaccharide)"란 지질(lipid)과 탄수화물(polysaccharide)의 공유결합 거대분자로, 그람음성 세균의 세포막을 구성하는 성분이다. 이는 endotoxin으로도 불리며 동물의 면역체계에 작용하여 강한 면역반응을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 면역세포에서 선천성 면역을 담당하는 TLR(toll-like receptor)들 중에서 TLR4/MD-2 복합체에 결합하여 면역반응을 유발하는 것으로 보고되어 있다. 즉 LPS 신호 전달이 과다하게 이루어진 경우, 면역과민 반응에 의해 패혈증을 일으키게 된다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명의 세포 기반 어세이 시스템을 사용할 경우, 정제된 MD-2를 추가하지 않은 시스템에 비해 MD-2를 외부에서 추가하였을 경우에 효과적으로 패혈증 단백질 치료제가 LPS 신호 전달을 유의미하게 저해하는 것을 확인하였으며(도 5 및 7), 이와 같이 패혈증 치료제의 효능 분석 또는 스크리닝을 하기 위한 시스템은 패혈증 단백질 치료제 또는 후보물질(LRR 단백질)만을 처리하여 확인하는 것이 아닌, 정제한 MD-2를 외부에서 첨가하여 분석하는 경우에 정확도가 높다는 것에 기초한 것이다. 본 발명의 일 실시예에서 사용된 단백질 치료제인 TV3와 MD-2의 복합체가 LPS와 결합한 구조는 도 2에서 확인되며, MD-2는 TLR4와 결합한 상태에서 LPS에 대한 친화력이 증가(Akashi et al., J. Exp. Med., 198(7):1035-1042, 2003)하므로 단백질 치료제의 효능 분석 또는 새로운 단백질 치료제인 LRR 패밀리 단백질을 스크리닝하기 위해서는 정제 단백질 MD-2의 제공이 바람직하다.
본 발명에서 용어, "CD14(cluster of differentiation 14)"란 면역세포에서 분비되거나, 세포표면에 발현된 단백질로 선천성 면역에서 다양한 기능을 수행하며, TLR4/MD-2 복합체에 LPS가 잘 결합하도록 역할을 하는 것으로 보고되어 있다.
본 발명에서 용어, "MD-2(Myeloid differentiation protein-2)"란 lymphocyte antigen 96으로도 불리며 LPS와 65 nM의 친화력(K d)을 보이는 당단백질로서, 면역세포의 표면에서 TLR4와 함께 복합체를 형성하며, LPS와 결합하여 세포내 신호 전달이 가능하도록 하는 LPS와 TLR4 사이를 매개하는 단백질이다.
본 발명에서 용어, "TLR4(Toll-like receptor 4)"란 면역세포 표면에 발현되어 선천성 면역 기능을 수행하는 TLR(toll-like receptor)들 중의 하나로 CD284(cluster of differentiation 284)로 불리기도 한다. 면역세포 표면의 TLR4는 MD-2와 복합체를 이룬 상태에서 MD-2를 매개로 LPS와 복합체를 형성하고, 이렇게 만들어진 TLR4/MD-2/LPS의 복합체는 다시 이량체(dimer)를 형성하며 세포 내부의 신호 전달을 개시한다. LPS의 신호 전달은 NF-κB와 결합하고 있는 IκB(inhibitor of NF-κB)를 인산화시키고, IκB로부터 해제된 NF-κB 전사인자는 핵으로 이동하여 다양한 사이토카인들의 전사에 관여하며, 최종적으로는 전염증성(proinflammatory) 사이토카인을 분비하는데 중요한 역할을 한다. 이와 같이, LPS 신호 전달은 NF-κB 전사인자를 핵으로 이동시키기 때문에 본 발명의 어세이 시스템의 일 실시예에서는 NF-κB 결합 모티프를 프로모터에 결합시킨 벡터를 이용하여 효율적으로 패혈증 단백질 치료제의 효능을 분석 또는 스크리닝할 수 있다.
상기 LPS 신호 전달 수용체가 표면에 발현되는 세포는 본 발명의 어세이 시스템에 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 HEK293 세포주에 LPS 신호전달이 가능하도록 CD14과, MD-2, TLR4 등의 LPS 수용체들이 모두 발현되도록 한 세포주(stable cell line)일 수 있다. LPS 신호전달 기능을 유지하면서 안정된 계대배양이 가능하고, 반딧불이 루시퍼레이즈 리포터 벡터의 세포내 도입이 용이한, 본 발명에서 목적하는 세포기반 어세이 시스템의 구축에 적합한 세포주는 제한 없이 포함되며, LPS 수용체들의 발현은 각 단백질들의 유전자 발현이 가능한 벡터들의 세포내 도입으로도 가능하나, 재현실험에 의한 안정된 결과를 얻기 위해서는 CD14과 MD-2, TLR4가 모두 발현된 지속 가능한 세포주를 선별하여 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는 CD14과 MD-2, TLR4가 모두 발현되며 안정된 계대배양이 가능한 세포주인 HEK293/hTLRA-MD2-CD14(Invivogen, USA)을 이용하였다.
본 발명에서 용어, "NF-κB 결합 모티프"란 NF-κB 전사인자와 결합하여 상기 모티프와 연결된 프로모터가 작동하여 다운스트림에 존재하는 유전자의 발현이 이루어질 수 있게 하는 모티프를 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서는 목적하는 세포기반 어세이를 위하여 "NF-κB 결합 모티프"를 포함하는 반딧불이 루시퍼레이즈 벡터(Invivogen, USA)와 일정수준으로 상시 발현되는 레닐라 루시퍼레이즈 벡터(Promega, USA)를 동시에 세포내로 도입하여 이용하였다.
본 발명의 상기 각 (a) 단계의 LPS 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주로 도입하는 NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터 중 NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터는 상기 LPS 신호 전달에 의해 IκB로부터 해제된 NF-κB 전사인자가 결합하여 다운스트림에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질을 발현하게 하며, NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터는 LPS 신호 전달을 포함한 다양한 외부 인자(예를 들어, NF-κB 전사인자 등)와 무관하게 발현되는 프로모터로서, 다운스트림에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질을 발현하게 된다. 바람직하게는 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터는 HSV-TK프로모터를 사용할 수 있으나, 당업계에 사용되는 프로모터는 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은, 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되면 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편의 영향을 받지만, 이들 핵산 단편의 여러 가능한 결합 조합 중에서 각 단편이 그 기능을 수행하는데 있어 검출할 만한 영향이 없는 상태의 결합을 의미한다. 즉, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 작동가능한 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
상기 (a) 단계의 리포터 단백질은 각각 서로 다른 단백질로, 구별할 수 있는 리포터 단백질은 다양하게 포함할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 그 예로 녹색 형광 단백질(GFP), CAT(CM acetyl transferase), β-갈락토시데이즈 (β-galactosidase), SEAP(secreted alk-phosphate), 반딧불이 루시퍼레이즈, 또는 레닐라 루시퍼레이즈일 수 있다. 바람직하게는 반딧불이 루시퍼레이즈 및 레닐라 루시퍼레이즈 일 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 반딧불이 루시퍼레이즈를 코딩하는 유전자를 작동가능하게 연결한 벡터(도 3A) 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터인 HSV-TK 프로모터에 레닐라 루시퍼레이즈를 코딩하는 유전자를 작동가능하게 연결한 벡터(도 3B)를 사용하였다. 상기 HSV-TK 프로모터에 레닐라 루시퍼레이즈를 코딩하는 유전자를 작동가능하게 연결한 벡터는 LPS 신호 전달과 무관하게 HSV-TK 프로모터에 의해 발현이 유지되므로 반딧불이 루시퍼레이즈의 대조군으로 적합하다.
본 발명에서 용어, "도입"이란 형질전환 또는 형질도입에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질전환은 염화칼슘(CaCl2) 침전법, CaCl2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 미세주입법(microinjection), 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등의 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 (a) 단계의 각 벡터가 도입된 세포주가 LPS 저해제인 polymyxin B 및 길항제인 LPS-RS 처리에 의해 루시퍼레이즈의 상대적 활성 감소를 관찰하여(도 4A 및 4B), 본 발명의 상기 세포주가 LPS 저해제, 즉 패혈증 치료제의 효능 분석 또는 스크리닝에 적합한 세포임을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "단백질 치료제"란, 면역세포 표면의 TLR4/MD-2 복합체에 LPS가 결합하여 면역반응이 진행되는 것을 방해할 목적으로 제공되는 단백질들로, 단독으로 존재하는 경우 불용성 복합체를 잘 형성하는 MD-2에 결합하여 MD-2가 LPS에 결합 가능한 구조를 유지하도록 도움을 주는 기능을 수행하며, TLR4의 세포외부 도메인으로 구성된 가용성 TLR4(soluble TLR4, sTLR4), 또는 하이브리드 LRR 기술로 만들어진 TV3 단백질, 또는 TLR4와 유사한 계열의 LRR 단백질 단편들이 융합된 형태의 하이브리드 LRR 단백질 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 반복단백질 TV3, 또는 인터날린 B 단백질의 N-말단, VLR(Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된, 인공항체단백질인 InlB-VLR 패밀리 중 In-VLR5-c일 수 있다(대한민국특허 출원번호 10-2010-0086055). 이와 같은 단백질 치료제는 LRR 모듈의 반복적 조합에 의하여 구성된, LRR 단백질 또는 서열변이 라이브러리로부터 선택될 수 있으며, 패혈증 치료제 후보물질도 유사하게 선별될 수 있다.
아울러, 본 발명에서 용어, "패혈증 치료제 후보물질"이란 LPS 신호 전달을 저해하여 패혈증을 치료할 수 있도록 하는 물질을 의미하며, 화합물, 효소, 단백질 또는 핵산 등을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 면역세포 표면의 TLR4/MD-2 복합체에 LPS가 결합하여 면역반응이 진행되는 것을 방해할 목적으로 제공되는 단백질일 수 있다.
본 발명의 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 방법은 (b) MD-2, LPS 및 효능을 비교하고자 하는 패혈증 단백질 치료제들을 각각 미리 섞어서 준비한 후, 준비된 혼합액을 각각 상기 (a) 단계의 세포주에 접촉시킨 후, 비교하고자 하는 단백질 치료제를 접촉시키지 않은 대조군에 비해 실험군의 리포터 단백질의 발현양이 적은 경우, 상기 실험군의 패혈증 단백질 치료제의 기능이 대조군의 패혈증 단백질 치료제보다 단백질 치료제로서의 효능이 좋은 것으로 판단하여 수행될 수 있다. 즉, MD-2, LPS 및 효능을 비교하고자 하는 패혈증 단백질 치료제를 혼합한 혼합액과 접촉시킨 실험군과 MD-2, LPS 및 실험군과 다른 패혈증 단백질 치료제를 혼합한 혼합액을 접촉시킨 세포군을 대조군으로 이용할 수 있다. 이와 같은 효능 분석 방법은 패혈증 단백질 치료제로 선별된 패혈증 단백질 간의 기능 분석 또는 이미 알려진 패혈증 단백질 치료제가 실제적으로 LPS 신호전달을 차단하는지 여부를 판단하는 데 이용될 수 있다.
본 발명의 패혈증 치료제의 스크리닝 방법은 MD-2, LPS 및 패혈증 치료제 후보물질을 함께 또는 패혈증 치료제 후보물질 또는 MD-2 단독으로, LPS와 미리 섞어서 준비한 후, 준비된 혼합액을 각각 (a) 단계의 세포주에 접촉시킨 후, 패혈증 치료제 후보물질과 MD-2를 동시에 접촉시킨 실험군의 리포터 단백질의 발현양이 패혈증 치료제 후보물질 단독, MD-2 단독 및 LPS만 접촉시킨 대조군의 리포터 단백질의 발현양 보다 적은 경우, 패혈증 치료제 후보물질이 패혈증 치료제라고 판단하여 수행될 수 있다.
상기 (d) 단계의 단백질 치료제와 MD-2를 함께 접촉시킨 실험군이 비교하고자 하는 단백질 치료제를 접촉시키지 않은 대조군에 비해 리포터 단백질의 발현양이 적은 경우, 상기 실험군이 패혈증 단백질 치료제로서의 기능이 우수한 것으로 판단하는 단계 또는 단백질 후보물질과 접촉시킨 실험군이 후보물질과 접촉시키지 않은 대조군에 비해 리포터 단백질의 발현양이 적은 경우, 패혈증 치료제 후보물질을 패혈증 치료제라고 판단하는 단계는 바람직하게는 NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질의 발광값을 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질의 발광값으로 나눈 값(즉, 상대적 발광값)을 비교하여, 대조군에 비해 낮은 경우, 패혈증 단백질 치료제의 효능이 좋은 것으로 판단하거나, 후보물질이 패혈증 치료제라고 판단하는 방법에 의해서 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 기존의 패혈증 단백질 치료제의 상대적 리포터 단백질의 발현양을 비교하여 보다 우수한 패혈증 단백질 치료제의 효능을 분석할 수 있으며, 또한 패혈증 치료제 후보물질 중에서 손쉽고 빠르게 치료제를 스크리닝할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) THP-1 세포주를 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)로 분화시키는 단계; (b) MD-2(Myeloid differentiation protein-2), LPS 및 패혈증 단백질 치료제들을 미리 섞어서 준비하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 준비된 혼합액을 상기 (a) 단계의 세포주에 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 패혈증 단백질 치료제와 접촉시킨 실험군이 비교하고자 하는 패혈증 단백질 치료제를 접촉시키지 않은 대조군에 비해 TNF-α를 분비하는 양이 적은 경우, 상기 실험군이 패혈증 단백질 치료제로서의 기능이 대조군의 패혈증 단백질 치료제보다 효능이 좋은 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 방법을 제공한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) THP-1 세포주를 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)로 분화시키는 단계; (b) MD-2(Myeloid differentiation protein-2), LPS 및 패혈증 치료제 후보물질을 함께 또는 패혈증 치료제 후보물질 및 MD-2 단독으로 LPS와 미리 섞는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 준비된 혼합액을 상기 (a) 단계의 세포주에 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 MD-2와 후보물질이 동시에 섞여 있는 혼합액과 접촉된 실험군이 후보물질과 접촉되지 않은 대조군 및 후보물질 및 MD-2 단독으로 LPS와 혼합된 대조군에 비해 TNF-α를 분비하는 양이 적은 경우, 상기 후보물질을 패혈증 치료제라고 판단하는 단계를 포함하는, 패혈증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 THP-1을 이용한 방법의 대략적인 모식도는 도 1B에 나타낸 바와 같다.
본 발명의 목적상 상기 TNF-α는 LPS 신호 전달에 의해 증가되는 NF-κB 전사인자의 결합에 의해 발현이 증가되는 사이토카인으로 교체될 수 있다.
본 발명에서 용어, "THP-1"은 인간의 단핵구 유래 대식세포의 속성을 가진, 면역세포화학 분석(immunocytochemical analysis)에 폭넓게 사용하는 세포주로, 장기간의 계대배양이 가능하며 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) 또는 비타민 D3에 의해 쉽게 대식세포로 분화되는 특징이 있다. 특히 LPS 수용체 단백질들이 표면에 발현되어 있는 단핵구의 세포모델로 많이 사용되는, 본 발명에서 목적하는 세포기반 어세이 시스템의 구축에 적합한 세포주이다.
단백질 치료제 또는 후보물질은 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 (d) 단계의 TNF-α의 분비는 당업계에 공지된 단백질의 발현양을 분석하는 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 배지에 분비된 TNF-α의 양을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법으로 측정하는 것에 의해 수행될 수 있다
본 발명의 일 실시예에 따르면, PMA로 분화시킨 THP-1 세포에 LPS 저해제인 polymyxin B를 첨가한 경우에 TNF-α 분비가 줄어드는 것을 확인하여(도 6), 본 발명의 THP-1 세포주가 LPS 저해제, 즉 패혈증 치료제의 효능 분석 또는 스크리닝에 적합한 세포임을 확인하였다. 또한, MD-2를 인터날린 B 단백질의 N-말단, VLR(Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된, 인공항체단백질인 InlB-VLR(대한민국특허 출원번호 10-2010-0086055)과 함께 처리한 경우에 단백질 치료제인 InlB-VLR이 TNF-α의 분비를 유의미하게 줄어들도록 하는 것을 확인하여(도 7), 본 발명의 상기 세포주 및 어세이 시스템이 패혈증 치료제의 효능 분석 또는 스크리닝에 사용될 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 상기 세포주 및 MD-2를 포함하는 패혈증 치료제 효능 분석 방법 또는 패혈증 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 LPS 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주로서, NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터가 도입된 패혈증 치료제 효능 분석용 또는 스크리닝용 세포주를 제공한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 세포주 및 MD-2를 포함하는 패혈증 치료제 효능 분석용 또는 패혈증 치료제 스크리닝용 키트를 제공한다.
본 발명의 목적상 상기 키트에는 세포주의 배양에 필요한 배지, 사용방법을 설명한 설명서가 포함될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 LPS 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주로, NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터가 도입된 세포주의 패혈증 치료제 효능 분석 또는 스크리닝에 사용되는 용도를 제공한다.
본 발명에서 제공하는 단백질 치료제들의 효능 분석 또는 스크리닝 방법은 LPS 수용체들이 표면에 발현된 세포주들을 이용하여 LPS 신호 전달에 의한 반딧불이 루시퍼레이즈의 발광값, 또는 TNF-α 사이토카인의 분비량 등을 정량적으로 분석하는 방법이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: TLR4와 MD-2, CD14이 세포표면에 발현된 HEK293 세포와 루시퍼레이즈 리포터들을 이용한 세포기반 어세이 방법의 구축
본 발명자들은 반딧불이 루시퍼레이즈 리포터 벡터인 pNiFty-Luc (Invivogen)와 대조군으로 레닐라 루시퍼레이즈 발현벡터인 pRL-TK(Promega)를 이용하여, 도 1A와 같이 LPS에 의한 TLR4-MD-2 수용체의 활성화 여부를 확인할 수 있는 시스템을 하기와 같이 구축하였다. 본 발명에 사용된 반딧불이 루시퍼레이즈 발현벡터(pNiFty-Luc)는 LPS 신호 전달에 의해 루시퍼레이즈 유전자의 발현이 개시될 수 있도록 NF-κB결합 부위가 프로모터 부위에 존재한다(도 3A). 또한 레닐라 루시퍼레이즈 발현벡터(pRL-TK)는 LPS 신호 전달을 포함한 다양한 외부 인자들에 의해 영향을 받지 않는 HSV-TK 프로모터에 의해 발현이 유지되므로, 반딧불이 루시퍼레이즈 발현벡터의 대조군으로 적합하다(도 3B).
<1-1> HEK293 모델세포와 발현벡터의 준비
본 발명에서는 LPS에 의한 TLR4-MD-2 수용체의 활성화 여부를 확인할 수 있도록, HEK293 세포주에 TLR4와 MD2, CD14 발현 유전자들이 도입되어 안정적으로 발현하는 HEK293/hTLR4A-MD2-CD14 모델 세포주(Invivogen)를 이용하였다. HEK293/hTLR4A-MD2-CD14 세포주는 10%의 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 포함된 RPMI 배지(Invitrogen)를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건을 유지하는 배양기에서 계대배양하며 실험에 사용할 수 있도록 준비하였다.
또한 본 발명에서 사용한 두 종류의 루시퍼레이즈 발현 벡터는 벡터가 형질 전환된 DH5α 균주로부터 Endofree Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)를 이용하여 endotoxin이 제거된 상태로 준비하였다.
<1-2> LPS 저해제와 길항제 및 단백질 치료제들의 준비
본 발명에서 사용된 LPS 저해제인 polymyxin B(Invivogen) 및 길항제인 LPS-RS(Invivogen)는 RPMI 배양액에 0.01 - 100 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 10 ng/㎖ 농도의 LPS와 함께 37℃에서 1시간 동안 충분히 반응시켜 준비하였다. 단백질 치료제들은 RPMI 배양액에 5 ㎍/㎖의 TV3와 100 ng/㎖의 MD-2, 10 ng/㎖의 LPS를 동시에 첨가하여 준비하였으며, RPMI 배양액에 5 ㎍/㎖의 TV3와 LPS, 100 ng/㎖의 MD-2와 LPS를 첨가한 대조군을 함께 준비하여 1시간 동안 37℃에서 충분히 반응시켰다.
<1-3> 루시퍼레이즈 리포터 어세이 분석
루시퍼레이즈 리포터 벡터들은 HEK293/hTLR4A-MD2-CD14 세포에 LipofectaminTM 2000(Invitrogen)을 이용하여 아래의 방법으로 도입시켰다.
먼저 T-25 flask의 바닥에 HEK293/hTLR4A-MD2-CD14 세포의 개수가 90% 정도 되도록 37℃, 5% CO2 조건에서 충분히 배양시킨 후, trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 flask의 바닥에서 분리하여 24-well plate에 2x105 cell/well의 개체수가 되도록 분주하고 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24 시간이 지난 후 LipofectaminTM 2000을 이용하여 pNifty-Luc 벡터와 pRL-TK 벡터를 동시에 세포에 도입시킨 후, 4시간 뒤에 10%의 혈청이 포함된 RPMI 배지로 교환하여 37℃, 5% CO2 조건에서 하루 동안 배양하였다. 다음 날 24-well plate에서 배양액을 제거한 뒤, 상기 실시예 <1-2>에서 준비한 LPS 저해제와 길항제, 또는 단백질 치료제 등이 LPS와 함께 포함된 RPMI 배양액을 세포에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 6시간이 경과한 후 LPS 신호 전달에 의한 반딧불이 루시퍼레이즈의 활성화 정도를 Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)을 이용하여 아래와 같이 확인하였다. 먼저 24-well plate에서 배지를 모두 제거하고 PBS 완충용액으로 2회 세척한 후, 각 well당 200 ㎕의 세포용해 완충액(passive lysis buffer, PLB)을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 약 30분이 경과한 후 세포 용출액을 20 ㎕씩 취하여 새로운 96 well 플레이트에 옮겨준 후, 반딧불이 루시퍼레이즈의 기질이 포함된 100 ㎕의 LAR II 시약을 첨가하여 발광되는 정도를 VICTOR X Multilabel Plate Reader(PerkinElmer)를 이용하여 0.5초간 측정하였다. 반딧불이 루시퍼레이즈의 발광도 측정 후에는, 레닐라 루시퍼레이즈 기질이 포함된 100 ㎕의 Stop&Glow 시약을 처리하여 레닐라 루시퍼레이즈의 발광도를 0.5초간 측정하였다. 즉, LPS 수용체인 TLR4와 MD-2, CD14이 표면에 발현된 HEK293 세포에, 루시퍼레이즈 발현벡터와 대조군인 레닐라 루시퍼레이즈 발현벡터를 동시에 도입하여, LPS 신호 전달로 활성화된 NF-κB에 의해서 발현이 개시되는 반딧불이 루시퍼레이즈의 발광정도를 대조군인 레닐라 루시퍼레이즈의 발광정도로 비교 분석하는 상대적 분석 방법이다(도 1A).
반딧불이 루시퍼레이즈의 발광값은 레닐라 루시퍼레이즈의 발광값으로 나누어 LPS에 의한 TLR4/MD-2 수용체의 활성화 지표로 이용하였으며, 이러한 방법에 의해 LPS 저해제인 polymyxin B의 농도 증가에 의한 LPS 신호 전달의 감소를 반딧불이 루시퍼레이즈의 상대적 활성 감소로 확인할 수 있었으며(도 4A), 마찬가지로 LPS 길항제인 LPS-RS의 농도 증가에 따른 LPS 신호 전달 감소를 반딧불이 루시퍼레이즈의 상대적 활성 감소로 확인할 수 있었다(도 4B).
이와 같은 결과는 본 발명의 어세이 시스템이 LPS 저해제, 또는 길항제 등에 의한 신호 전달 차단효과를 정확히 분석할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
또한 위와 동일한 조건에서 본 발명에서 제공하는 단백질 치료제의 LPS 신호 전달 저해효능을 확인한 결과, LPS와 함께 TV3, 혹은 MD-2를 단독으로 처리한 조건보다 TV3와 MD-2를 함께 처리한 조건에서 유의미한 저해 효능의 증가를 확인할 수 있었다(도 5).
이와 같은 결과는 MD-2를 제공하는 본 발명의 어세이 시스템이 안정적으로 패혈증 치료제의 효과를 분석할 수 있음을 뒷받침하는 결과이다.
실시예 2: 분화시킨 THP-1 세포의 TNF-α 사이토카인 분비량을 ELISA로 확인하는 세포기반 어세이 방법의 구축
본 발명자들은 또한 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) 또는 비타민 D3에 의해 쉽게 대식세포로 분화되는 특징이 있는 백혈병 환자 유래의 단핵구 세포주인 THP-1을 이용하여, LPS 신호 전달에 의한 사이토카인 TNF-α의 분비량을 ELISA로 측정하는 방법(도 1B)을 이용하여, 세포기반 어세이 방법을 하기와 같이 구축하였다.
<2-1> THP-1 세포의 배양 및 준비
단핵세포인 THP-1(TIB-202TM, ATCC)세포주를 10% 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)과 50 μM 2-mercaptoethanol이 첨가된 RPMI 배지로, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 세포의 밀도가 90%에 도달하면 PBS 완충액(pH 7.4)으로 세척한 후, LPS에 대한 감도를 높이기 위해 PMA(phorbol 12-myristate-13-acetate) 200 nM이 첨가된 RPMI배지에 부유시켜 96-well plate에 2.5×104세포/well로 분주하고, 72 시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 충분히 분화시켰다.
<2-2> THP-1 세포의 사이토카인 분비를 ELISA로 확인하는 방법의 구축
실험에 앞서 LPS의 저해제인 polymyxin B를 1 - 100 ㎍/㎖의 농도로 RPMI에 희석하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 준비하였다. 또한 10 ㎍/㎖의 TV3와 MD-2를 LPS와 동시에 첨가한 RPMI 배양액과, 10 ㎍/㎖의 InlB-VLR과 MD-2를 LPS와 동시에 첨가한 RPMI 배양액, 그리고 10 ㎍/㎖의 InlB-VLR, TV3, MD-2들을 단독 첨가한 RPMI 배양액을 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 준비하였다. 이후 PMA에 의해 대식세포로 분화된 THP-1세포들을 PBS 완충액(pH 7.4)으로 3회 세척하고, 단백질 치료제와 대조군들이 포함된 RPMI 배양액, 또는 대조군들을 20 ng/㎖의 LPS와 함께 THP-1에 처리하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 6시간이 경과한 후 각 well에서 일정량의 배양액을 취하여 PBS 완충액(pH 7.4)으로 4 - 8배 희석하고, 분비된 TNF-α를 통상의 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assays, ebioscience)방법으로 분석하였으며, TNF-α 표준 곡선으로부터 그 결과를 계산하였다.
그 결과, LPS 저해제인 polymyxin B의 농도에 따른 LPS 신호 전달의 감소를 확인할 수 있었으며(도 6), 동일한 조건에서 단백질 치료제들의 LPS 신호 전달 저해효능을 확인한 결과, LPS와 함께 TV3, 혹은 MD-2를 단독으로 처리한 조건보다 TV3와 MD-2, 또는 InlB-VLR과 MD-2를 함께 처리한 조건에서 유의미한 저해 효능의 증가를 확인할 수 있었다(도 7).
이와 같은 결과는, 본 발명의 어세이 시스템이 MD-2를 첨가한 조건에서 단백질 치료제의 효능을 보다 정확하게 분석할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

Claims (16)

  1. (a) LPS(lipopolysaccharide) 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주로, NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터, 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터를 도입하는 단계;
    (b) 정제 MD-2(Myeloid differentiation protein-2), LPS 및 패혈증 단백질 치료제들을 미리 섞어서 준비하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 준비된 혼합액을 상기 (a) 단계의 세포주에 접촉시키는 단계; 및
    (d) 상기 단백질 치료제와 접촉시킨 실험군이 비교하고자 하는 패혈증 단백질 치료제를 접촉시키지 않은 대조군에 비해 리포터 단백질의 발현양이 적은 경우, 상기 실험군의 패혈증 단백질 치료제의 기능이 대조군의 패혈증 단백질 치료제보다 효능이 좋은 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 리포터 단백질 각각은 서로 다른 리포터 단백질로서, 반딧불이 루시퍼레이즈 및 레닐라 루시퍼레이즈인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질의 발광값을 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질의 발광값으로 나눈 값을 비교하여, 대조군에 비해 낮은 경우, 패혈증 단백질 치료제의 효능이 좋은 것으로 판단하는 것인 방법.
  4. (a) THP-1 세포주를 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)로 분화시키는 단계;
    (b) MD-2(Myeloid differentiation protein-2), LPS 및 패혈증 단백질 치료제들을 미리 섞어서 준비하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 준비된 혼합액을 상기 (a) 단계의 세포주에 접촉시키는 단계; 및
    (d) 상기 패혈증 단백질 치료제와 접촉시킨 실험군이 비교하고자 하는 패혈증 단백질 치료제를 접촉시키지 않은 대조군에 비해 TNF-α를 분비하는 양이 적은 경우, 상기 실험군의 패혈증 단백질 치료제의 기능이 대조군의 패혈증 단백질 치료제보다 효능이 좋은 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 방법.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 패혈증 단백질 치료제는 LRR(Leucine rich repeat) 패밀리 단백질인 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 LRR 패밀리 단백질은 인터날린 B 단백질의 N-말단, VLR(Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된, In-VLR5-c인 것인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 TNF-α의 측정은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)방법에 의한 것인 방법.
  8. (a) LPS 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주로, NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터를 도입하는 단계;
    (b) MD-2(Myeloid differentiation protein-2), LPS 및 패혈증 치료제 후보물질을 함께 또는 패혈증 치료제 후보물질 없이 미리 섞는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 준비된 혼합액을 상기 (a) 단계의 세포주에 접촉시키는 단계; 및
    (d) 상기 후보물질과 접촉시킨 실험군이 후보물질과 접촉시키지 않은 대조군에 비해 리포터 단백질의 발현양이 적은 경우, 상기 후보물질을 패혈증 치료제라고 판단하는 단계를 포함하는, 패혈증 치료제의 스크리닝 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 (a) 단계의 리포터 단백질 각각은 서로 다른 리포터 단백질로서, 반딧불이 루시퍼레이즈 및 레닐라 루시퍼레이즈인 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 (d) 단계는 NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질의 발광값을 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질의 발광값으로 나눈 값을 비교하여, 대조군에 비해 낮은 경우, 패혈증 치료제라고 판단하는 것인 방법.
  11. (a) THP-1 세포주를 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)로 분화시키는 단계;
    (b) MD-2(Myeloid differentiation protein-2), LPS 및 패혈증 치료제 후보물질을 함께 또는 패혈증 치료제 후보물질 없이 미리 섞는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 준비된 혼합액을 상기 (a) 단계의 세포주에 접촉시키는 단계; 및
    (d) 상기 후보물질과 접촉시킨 실험군이 후보물질과 접촉시키지 않은 대조군에 비해 TNF-α를 분비하는 양이 적은 경우, 상기 후보물질을 패혈증 치료제라고 판단하는 단계를 포함하는, 패혈증 치료제의 스크리닝 방법.
  12. 제8항 또는 제11항에 있어서, 상기 패혈증 치료제 후보물질은 LRR(Leucine rich repeat) 패밀리 단백질인 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 LRR 패밀리 단백질은 반복단백질 TV3, 또는 인터날린 B 단백질의 N-말단, VLR(Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된 In-VLR5-c인 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 TNF-α의 측정은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법에 의한 것인 방법.
  15. LPS(lipopolysaccharide) 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주로, NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터, 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터가 도입된 패혈증 치료제 효능 분석용 또는 스크리닝용 세포주.
  16. 제15항의 세포주 및 MD-2를 포함하는 패혈증 치료제 효능 분석용 또는 패혈증 치료제 스크리닝용 키트.
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