WO2012127716A1 - セレン酸還元活性を示すタンパク質 - Google Patents

セレン酸還元活性を示すタンパク質 Download PDF

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nucleic acid
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光雄 山下
道彦 池
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学校法人 芝浦工業大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)

Definitions

  • the present invention relates to a protein exhibiting selenate reducing activity, a gene encoding the same, and a method for reducing selenate using the same.
  • Selenium a kind of trace metal (rare metal), is an essential element for living organisms, but water-soluble selenium compounds (selenic acid, selenious acid, etc.) are toxic to living organisms. Since selenium is used in a wide range of applications such as copying machines and glass coloring, it is important to secure its source. In addition, the effects on human health and ecosystems of selenium compounds in wastewater and wastes are a problem. As methods for detoxifying and removing selenic acid, resin adsorption, electrochemical methods, and the like have been studied, but they have not been put into practical use because of problems such as efficiency and cost. Moreover, selenium could not be recovered and reused by such a method.
  • the present inventors have isolated Pseudomonas stutzeri NT-I strain with the aim of developing a biological treatment method for selenium compounds (Patent Document 1).
  • the Pseudomonas stutzeri I NT-I strain has the ability to efficiently reduce selenate to selenite and further reduce selenite to elemental selenium. Since elemental selenium is insoluble in water and non-toxic, the use of Pseudomonas stutzeri NT-I makes wastewater containing selenium compounds non-toxic and recovers selenium from it at a relatively low cost. May be available.
  • Patent Document 2 describes a protein having the ability to enhance selenate reducing activity derived from the Gram-positive bacterium Bacillus selenatarsenatis SF-1 strain, a gene encoding the same, and a method for reducing selenate using the same. ing.
  • Pseudomonas stutzeri NT-I reduces selenate under both aerobic and anaerobic conditions, produces selenium outside the cell, and has a large ability to reduce selenite, whereas Bacillus selenatarsenatis SF-1 strain is anaerobic There is a difference in that selenate is reduced under the conditions, selenium accumulates in the cells, and the reducing ability of selenite is small.
  • JP 2010-142166 A International Publication No. WO2010 / 070968
  • An object of the present invention is to provide a protein exhibiting selenate reducing activity, a gene encoding the same, and a method for reducing selenate using the same.
  • the present inventor succeeded in identifying a gene encoding a protein exhibiting selenate reducing activity from the Pseudomonas stutzeri NT-I strain, and completed the present invention.
  • a protein selected from the group consisting of: (A) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (B) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 And a protein that exhibits selenate reducing activity when combined with a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; and (c) an amino acid sequence having 98% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and A protein exhibiting selenate reducing activity when combined with a protein consisting of the amino acid sequence of No.
  • the nucleic acid according to [5] which is selected from the group consisting of: (A) a nucleic acid comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1; (B) a protein that hybridizes with a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a protein that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8
  • nucleic acid according to [7] which is selected from the group consisting of: (A) a nucleic acid comprising the base sequence of SEQ ID NO: 3; (B) a protein that hybridizes with a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 under stringent conditions and comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8
  • a nucleic acid encoding a protein exhibiting selenate reducing activity when combined with a protein comprising [9] A nucleic acid encoding the protein according to [3].
  • nucleic acid according to [9] which is selected from the group consisting of: (A) a nucleic acid comprising the base sequence of SEQ ID NO: 5; (B) a protein that hybridizes with a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 under stringent conditions and comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8
  • a nucleic acid encoding a protein exhibiting selenate reducing activity when combined with a protein comprising [11] A nucleic acid encoding the protein according to [4].
  • nucleic acid according to [11] selected from the group consisting of: (A) a nucleic acid comprising the base sequence of SEQ ID NO: 7; (B) a protein that hybridizes with a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 under stringent conditions and comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
  • a recombinant vector comprising the nucleic acid according to [5] or [6].
  • a recombinant vector comprising the nucleic acid according to [7] or [8].
  • a recombinant vector comprising the nucleic acid according to [9] or [10].
  • a recombinant vector comprising the nucleic acid according to [11] or [12].
  • [20] A transformant obtained by introducing the nucleic acid according to [11] or [12] into a host cell.
  • [21] A method for reducing selenate, comprising expressing the protein according to [1], the protein according to [2], the protein according to [3], and the protein according to [4] in a host cell.
  • [22] A nucleic acid according to [5] or [6], a nucleic acid according to [7] or [8], a nucleic acid according to [9] or [10], and a nucleic acid according to [11] or [12]
  • the method according to [13] wherein the protein according to [1], the protein according to [2], the protein according to [3], and the protein according to [4] are expressed in a host cell.
  • the present invention provides a protein exhibiting selenate reducing activity, a gene encoding the same, and a method for reducing selenate using the same.
  • FIG. 1 shows transposon mutation and inverse PCR.
  • FIG. 2 shows selenate reduction by mutants on TSB plates containing 0.5 mM selenate.
  • FIG. 3 shows selenate reduction when wild-type and mutant strains of Pseudomonas stutzeri NT-I were cultured for 24 hours in a liquid medium containing 1 mM selenate or selenite.
  • FIG. 4 shows the flanking region of the mini-Tn5 insertion site in the NT-IAM2 and NT-IAM4 genomes.
  • FIG. 5 shows the flanking region of the mini-Tn5 insertion site in the NT-IAM3 genome.
  • FIG. 6 shows a schematic diagram of SerABDC assembly and transport.
  • FIG. 7 shows a comparison of the constitution of selenate reductase gene operons of T. selenatis, P. stutzeri NT-I, and B. selenatarsenatis SF-1.
  • FIG. 8 shows a photograph of a transformant in which a pGEM-Teasy vector containing serABDC gene (left side) or only a pGEM-Teasy vector (right side) is introduced into Escherichia coli DH5 ⁇ strain.
  • the term “selenium compound” refers to a compound containing selenium. Examples of selenium compounds include selenic acid and selenious acid. As used herein, the term “elemental selenium” refers to selenium in the form of an element that does not form a compound with other elements.
  • the term “selenate reducing activity” refers to the activity of reducing selenate to selenite.
  • the term “selenate reductase” refers to a protein that catalyzes the reduction of selenium to selenite.
  • the term “selenite reduction activity” refers to the activity of reducing selenite to elemental selenium.
  • the term “selenite reductase” refers to a protein that catalyzes the reduction of selenite to elemental selenium.
  • Pseudomonas stutzeri NT-I strain is known to have selenate reducing activity and selenite reducing activity (Patent Document 1).
  • the selenate reducing activity can be measured by quantifying selenite generated from selenate.
  • the selenite reduction activity can be measured by quantifying elemental selenium produced from selenious acid.
  • the selenate reducing activity of a protein encoded by a nucleic acid is obtained by, for example, converting this gene into Escherichia coli (Bebien, M. et al., Microbiology, 148: 3865- It can be confirmed that elemental selenium is produced when introduced in 3872 (2002)) by observing red coloration by colonies on the selenate-containing medium.
  • the protein of the present invention is SerA, SerB, SerD, and SerC derived from NT-I strain.
  • the base sequence and amino acid sequence of serA are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2
  • the base sequence and amino acid sequence of serB Are shown in SEQ ID NO: 3 and 4 in the sequence listing
  • the base sequence and amino acid sequence of serD are shown in SEQ ID NO: 5 and 6 in the sequence listing
  • the base sequence and amino acid sequence of serC are shown in SEQ ID NO: 7 and 8 in the sequence listing.
  • SerA is a catalytic subunit containing molybdenum
  • SerB is a four-cluster protein subunit containing an iron-sulfur cluster
  • SerD is a chaperone protein involved in the assembly of molybdenum enzymes
  • SerC is a water-soluble protein containing heme It was done. This structure is very similar to the selenate reductase gene serABDC of Thauera selenatis.
  • the selenate reductase gene srdBCA of Bacillus selenatarsenatis encodes four Cluster protein subunit with srdB containing an iron-sulfur cluster, membrane anchor protein subunit with srdC transmembrane region, and catalytic subunit with srdA containing molybdenum. It differs from the serABDC operon in the ORF order, and the srdBCA operon differs in that there is no ORF encoding a chaperone protein (FIG. 7).
  • SerA is presumed to be a catalytic subunit containing molybdenum with an estimated molecular weight of 103 kDa. This subunit is widely found in bacterial molybdenum enzymes and is thought to directly catalyze the reaction of donating electrons to electron acceptors such as selenate and reducing them. This subunit is generally known to have [4Fe-4S] cluster, which is a kind of iron-sulfur cluster, in addition to molybdenum. As for SerA of NT-I strain, four cysteine residues of Cys77, Cys81, Cys115, and Cys122, which are presumed to constitute a [4Fe-4S] cluster binding motif, were found on the amino acid sequence. It is presumed to function as a catalytic subunit that catalyzes selenate reduction.
  • SerB is presumed to be a four-cluster protein-subunit containing an iron-sulfur cluster with an estimated molecular weight of 37-kDa.
  • This subunit is widely found in bacterial molybdenum enzymes, and is thought to have a role of delivering electrons received from electron donors to catalytic subunits.
  • This subunit is generally known to contain four iron-sulfur clusters (FS1-FS4).
  • FS1 ⁇ ⁇ ⁇ : CLGCHTCTMACK (amino acids 15-26), FS2: CNHCSNPACLAACP (amino acids 134-147), FS3: CKGYRYCVKACP (amino acids 134-147) Amino acids 167 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ -178) and FS4: CIGCYPRVEKGEAPACVKQCS (amino acids 194-214) were found, so it is assumed that they have four iron-sulfur clusters.
  • FS1, FS2, and FS4 contain four cysteine residues, but FS3 contains three cysteine residues, so three of the four iron-sulfur clusters remain [4Fe-4S] clusters.
  • SerD is presumed to be a chaperone protein involved in the assembly of molybdenum enzymes with an estimated molecular weight of 22 kDa.
  • Such proteins do not participate in the final molybdenum enzyme complex, but by associating with the twin arginine translocation ⁇ ⁇ signal peptide of the catalytic subunit, the immature catalytic subunit is prevented from the cytoplasm from the cytoplasm, and the molybdenum cofactor It is normally inserted into the catalytic subunit and allowed to transport the catalytic subunit out of the cell membrane.
  • B. selenatarsenatis SF-1 no protein having such a function has been found.
  • SerC has an estimated molecular weight of 26 kDa and is presumed to be a water-soluble protein containing heme. Molybdenum enzymes are often bound to the cell membrane by subunits containing a transmembrane region, and B. selenatarsenatis SF-1 SrdBCA is also presumed to be of this type, but SerC is a water-soluble protein, The NT-I strain SerABC is presumed to be a water-soluble enzyme present in the periplasmic region.
  • the serABDC structural gene of the NT-I strain and the deduced amino acid sequence show a high homology of 83 to 95% with that of Thauera selenatis (Table 3).
  • the BLAST program http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) was used for calculation of amino acid sequence identity.
  • “1 or several amino acids” means, for example, 1 to 10 amino acids, preferably 1 to 8 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acids, still more preferably 1 to 3 amino acids. means.
  • It consists of an amino acid sequence that has 98% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and consists of a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • a protein that exhibits selenate reducing activity when combined with a protein It consists of an amino acid sequence that has 98% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and consists of a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • a protein that exhibits selenate reducing activity when combined with a protein It consists of an amino acid sequence having 98% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and consisting of a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • a protein exhibiting selenate reducing activity when combined with a protein and a protein comprising an amino acid sequence having 98% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4
  • nucleic acid encoding a protein exhibiting selenate reducing activity as described above is used.
  • the nucleic acid is a nucleic acid consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7.
  • nucleic acid of the present invention hybridizes with a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 under stringent conditions, and each selenate when combined with a predetermined protein. It is a nucleic acid that encodes a protein that exhibits reducing activity.
  • stringent conditions refers to stringent hybridization conditions. Such conditions are described in, for example, Sambrook, J. et al.
  • Examples of stringent conditions when using a long probe of 100 nucleotides or more include 6 ⁇ SSC, 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS), 5 ⁇ Denhardt's reagent, 100 ⁇ g / mL denatured fragmented salmon sperm Incubation at 68 ° C. in DNA, washing at room temperature in 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS (reducing SSC concentration to 0.1 and / or increasing temperature to 68 ° C.).
  • a protein exhibiting selenate reduction activity is expressed in a host cell. Any cell can be used as the host cell, but bacteria that can survive in the presence of a selenium compound are preferred.
  • the expression of a protein exhibiting selenate reducing activity is performed by introducing a nucleic acid encoding the protein into a host cell.
  • a bacterium for which recombinant DNA technology is established as a host. Examples of such bacteria include, but are not limited to, Escherichia coli, Bacillus subtilis, and the like.
  • a vector which can replicate in the selected host cell is used.
  • a vector derived from a plasmid, bacteriophage, virus or the like can be used.
  • a vector containing a nucleic acid includes a sequence (promoter, terminator, etc.) responsible for initiation and termination of transcription of a target gene, and a sequence (ribosome binding site, etc.) required for translation initiation.
  • a sequence promoter, terminator, etc.
  • ribosome binding site, etc. ribosome binding site, etc.
  • One skilled in the art can select these sequences appropriate for the host cell. For example, when a promoter originally present upstream of a sequence encoding a protein exhibiting selenate reducing activity functions in the host cell, the promoter can be used, or under the control of another promoter that functions in the host cell.
  • the gene of interest can also be placed and expressed.
  • Example 1 Acquisition of Selenate-Reducing Mutant Strains Transposon Mini-Tn5 (Biomedal, SL) was introduced into Pseudomonas stutzeri NT-I strain by conjugation transfer (FIG. 1) to produce a mutant library. Specifically, the procedure was as follows. The recipient strain Pseudomonas stutzeri NT-I is inoculated in TSB medium and cultured overnight at 28 degrees. Escherichia coli S17-1 strain, a donor bacterium containing transposon Mini-Tn5, is inoculated in LB medium and cultured overnight at 37 degrees. Mix the same amount of recipient culture and donor culture, centrifuge and discard the supernatant.
  • LB medium containing 10 mM magnesium sulfate
  • the mixed cells grown on the agar medium are suspended in 5 mL of 10 mM magnesium sulfate solution.
  • the suspension is appropriately diluted, seeded on a TSB agar medium containing tetracycline at a final concentration of 10-30 mg / mL, and cultured overnight at 28 degrees.
  • a mutant library was prepared in which the tetracycline gene derived from the transposon Mini-Tn5 was randomly inserted into the genomic DNA of the recipient strain Pseudomonas stutzeri NT-I.
  • a non-red-colored strain showing elemental selenium production was obtained as a selenate-reducing ability mutant strain on an agar medium containing selenate.
  • Mini-Tn5 selenate-reducing ability mutants of 3 strains (NT-IAM2, NT-IAM3, NT-IAM4) were obtained.
  • NT-IAM2 and NT-IAM4 were completely white, and NT-IAM3 was partly red but mostly white (Fig. 2).
  • all the strains formed red colonies. From the above results, it was suggested that these mutant strains cannot reduce selenate.
  • Example 2 Measurement of reduction rate of selenate and selenite in selenate-reducing mutant strains
  • a lactic acid inorganic salt medium supplemented with TSB 3 g / L each of the wild strain and each mutant strain was aerobic at 28 ° C for 24 hours.
  • a vial with silicosene was aerobic, and a gas phase was purged with nitrogen and a butyl rubber stopper was anaerobic. Sampling was performed over time, and selenate and selenite concentrations were measured by ion chromatography. The ratio of the selenate or selenite reduced to the initial concentration of selenate or selenite was shown as the selenate or selenite reduction rate.
  • the measurement results are shown in FIG.
  • the wild strain reduced selenate by 96 to 97% under both aerobic and anaerobic conditions, and reduced selenite by 95% under aerobic conditions.
  • the selenate reduction rate was greatly reduced under both aerobic and anaerobic conditions, and NT-IAM2 and NT-IAM4 were not reduced at all, particularly under aerobic conditions.
  • NT-IAM3 showed slight reduction (11-13%) under both aerobic and anaerobic conditions.
  • the reduction rate of all mutants was reduced, but the reduction ability was not completely lost.
  • the gene in which Mini-Tn5 is disrupted has a partial effect on selenite reduction, but is mainly involved in selenate reduction, and is either aerobic or anaerobic. It was speculated that it worked even under conditions.
  • Example 3 Isolation of selenate-reduction-related genes For mutant NT-IAM2, NT-IAM3, NT-IAM4 (after cutting the genomic DNA of the mutant with a restriction enzyme such as SphI and preparing appropriate primers ), The sequence near Mini-Tn5 in the genome was amplified and cloned by Inverse PCR method (FIG. 1). A region containing the determined sequence was obtained from whole genome sequence data. The gene region was estimated and annotated by Blastx, and the homology with the base sequence of a known gene was examined by Blastn.
  • serABDC forms an operon from the continuity of its ORF (FIG. 4).
  • the base sequence and amino acid sequence of serA are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2
  • the base sequence and amino acid sequence of serB are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4
  • the base sequence and amino acid sequence of serD are shown in the sequence listing.
  • the base sequence and amino acid sequence of serC are shown in SEQ ID NOS: 7 and 8 in the Sequence Listing.
  • nucleotide sequence of the serABDC locus (including promoter region, serABDC ORF, and terminator region) in the NT-I strain is shown in SEQ ID NO: 9 in the Sequence Listing.
  • NT-IAM3 was found to have the molybdopterin biosynthetic enzyme gene moaE destroyed by Mini-Tn5. It was strongly suggested that moaCDE forms an operon from the continuity of its ORF (FIG. 5).
  • serABDC encodes the selenate reductase of NT-I strain.
  • Selenate reductase SerABDC has been studied in detail in Thauera selenatis, a bacterium that reduces selenate under anaerobic conditions.
  • SerA has Mo-bis-MGD and [4Fe -4S] cluster
  • SerB has been found to contain three [4Fe-4S] clusters and one [3Fe-4S] cluster
  • SerC contains heme-b. It has also been suggested that SerD is a system-specific chaperon that controls the incorporation of molybdopterin into SerA.
  • the serABDC structural gene of the NT-I strain and the deduced amino acid sequence are 83-95% highly homologous with those of Thauera selenatis (Table 3), and have the same structure as SerABDC of Thauera selenatis. I guess that. In addition, Thauera selenatis ⁇ ⁇ reduces selenate only under anaerobic conditions, whereas NT-I strain is greatly different in that it reduces selenate under both aerobic and anaerobic conditions. It was speculated that the low homology (48%) was the cause of the difference in expression control of selenate reducing ability.
  • SerA and SerB are incorporated in Mo-bis-MGD and iron / sulfur clusters in the cytoplasm.
  • a TAT signal peptide exists in the N-terminal region of SerA, and SerAB is transported to the periplasmic region by the TAT pathway that transports the folded enzyme out of the cell membrane.
  • SerD prevents SerAB from being transported with incomplete cofactor insertion by binding to the TAT signal peptide until Mo-bis-MGD is inserted into SerA.
  • SerC also has a Sec signal peptide in the N-terminal region, and after being transported to the periplasm by the Sec pathway, it is folded and heme-b is inserted. SerABC eventually associates in the periplasm and catalyzes selenate.
  • Mo-bis-MGD inserted into SerA is synthesized by a series of synthase groups including MoaA, MoaC, and MoaDE from two molecules of GPT and molybdate.
  • MoaA and MoaC are known to catalyze the cyclization reaction of GTP, and MoaDE catalyzes the introduction of a thiol group.
  • Example 4 Expression of a gene encoding selenate reductase DNA was amplified by PCR so as to include the serABDC gene shown in Example 3 above.
  • the amplified product was ligated with pGEM-T Easy vector (Promega), and Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed.
  • a photograph of the transformant is shown in FIG.
  • the right side of FIG. 8 shows Escherichia coli as a negative control having only the vector pGEM-T Easy, and the left side of FIG. 8 shows E. coli as a positive control having the vector pGEMserABDC.
  • Both E. coli were grown on LB agar medium supplemented with 0.5 mM selenate, and it was observed that E. coli carrying the vector pGEMserABDC on the left side was red.

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Abstract

　本発明の課題は、セレン酸還元活性を示すタンパク質、それをコードする遺伝子、それらを使用するセレン酸の還元方法を提供することである。本発明によれば、以下からなる群より選択されるタンパク質が提供される。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質； （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質；および （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質。

Description

セレン酸還元活性を示すタンパク質
　本発明は、セレン酸還元活性を示すタンパク質、それをコードする遺伝子、それらを使用するセレン酸の還元方法に関する。
　微量金属（レアメタル）の一種であるセレンは、生物にとって必須元素であるが、水溶性のセレン化合物（セレン酸、亜セレン酸など）は生物に対する毒性を有する。セレンは、コピー機、ガラスの着色など幅広い用途に使用されているので、その供給源の確保は重要である。また、廃水、廃棄物中のセレン化合物の人の健康および生態系への影響が問題となっている。セレン酸の無毒化および除去の方法としては、樹脂吸着、電気化学的方法などが従来より検討されているが、効率、コストなどの問題から実用には至っていなかった。また、このような方法によってセレンを回収して再利用することはできなかった。
　本発明者らは、セレン化合物の生物学的処理方法の開発を目指して、Pseudomonas stutzeri NT-I株を単離した（特許文献１）。Pseudomonas stutzeri NT-I株は、セレン酸を亜セレン酸に効率的に還元し、さらに亜セレン酸を元素態セレンへ還元する能力を有する。元素態セレンは水に不溶性であり、無毒であるので、Pseudomonas stutzeri NT-I株を使用すれば、比較的安価に、セレン化合物を含有する廃水などを無毒化し、そこからセレンを回収して再利用できる可能性がある。微生物を利用したセレン化合物の処理およびセレンの回収をより効率的に行うためには、処理条件の検討や設備の開発に加えて、セレン化合物の還元に関与する分子機構を明らかにする必要がある。しかし、Pseudomonas stutzeri NT-I株については、セレン化合物の還元に関与する分子機構は明らかになっていない。
　一方、特許文献２には、グラム陽性細菌Bacillus selenatarsenatis SF-1株に由来するセレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質、それをコードする遺伝子、それらを使用するセレン酸の還元方法が記載されている。Pseudomonas stutzeri NT-I株では好気・嫌気両条件下でセレン酸を還元し、菌体外にセレンを生成し、亜セレン酸の還元能力が大きいのに対し、Bacillus selenatarsenatis SF-1株は嫌気条件下でセレン酸を還元し、菌体内にセレンが蓄積し、亜セレン酸の還元能力が小さいという、相違点がある。
特開２０１０－１４２１６６号公報 国際公開ＷＯ２０１０／０７０９６８号公報
　本発明の課題は、セレン酸還元活性を示すタンパク質、それをコードする遺伝子、それらを使用するセレン酸の還元方法を提供することである。
　本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Pseudomonas stutzeri NT-I株からセレン酸還元活性を示すタンパク質をコードする遺伝子を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明の態様は以下に関する。
［１］　　以下からなる群より選択されるタンパク質：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質；および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質。
［２］　　以下からなる群より選択されるタンパク質：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質；および
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質。
［３］　以下からなる群より選択されるタンパク質：
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質；および
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列と９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質。
［４］　以下からなる群より選択されるタンパク質：
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質；および
（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列と９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質。
［５］　［１］記載のタンパク質をコードする核酸。
［６］　以下からなる群より選択される、［５］記載の核酸。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなる核酸；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質をコードする核酸。
［７］　［２］記載のタンパク質をコードする核酸。
［８］　以下からなる群より選択される、［７］記載の核酸。
（ａ）配列番号３の塩基配列からなる核酸；
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質をコードする核酸。
［９］　［３］記載のタンパク質をコードする核酸。
［１０］　以下からなる群より選択される、［９］記載の核酸。
（ａ）配列番号５の塩基配列からなる核酸；
（ｂ）配列番号５のヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質をコードする核酸。
［１１］　［４］記載のタンパク質をコードする核酸。
［１２］　以下からなる群より選択される、［１１］記載の核酸。
（ａ）配列番号７の塩基配列からなる核酸；
（ｂ）配列番号７のヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質をコードする核酸。
［１３］　［５］又は［６］に記載の核酸を含む組み換えベクター。
［１４］　［７］又は［８］に記載の核酸を含む組み換えベクター。
［１５］　［９］又は［１０］に記載の核酸を含む組み換えベクター。
［１６］　［１１］又は［１２］に記載の核酸を含む組み換えベクター。
［１７］　［５］又は［６］に記載の核酸を宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
［１８］　［７］又は［８］に記載の核酸を宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
［１９］　［９］又は［１０］に記載の核酸を宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
［２０］　［１１］又は［１２］に記載の核酸を宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
［２１］　［１］記載のタンパク質、［２］記載のタンパク質、［３］記載のタンパク質、及び［４］記載のタンパク質を宿主細胞において発現させることを含む、セレン酸の還元方法。
［２２］　［５］又は［６］記載の核酸、［７］又は［８］記載の核酸、［９］又は［１０］記載の核酸、及び［１１］又は［１２］記載の核酸を宿主細胞に導入することによって、［１］記載のタンパク質、［２］記載のタンパク質、［３］記載のタンパク質、及び［４］記載のタンパク質を宿主細胞において発現させる、［１３］に記載の方法。
　本発明によって、セレン酸還元活性を示すタンパク質、それをコードする遺伝子、それらを使用するセレン酸の還元方法が提供される。
図１は、トランスポゾン変異とinverse PCRを示す。 図２は、０．５ｍＭのセレン酸を含むＴＳＢプレート上での変異株によるセレン酸還元を示す。 図３は、１ｍＭのセレン酸または亜セレン酸を含む液体培地におけるPseudomonas stutzeri ＮＴ－Ｉ株の野生株及び変異株を24時間培養したときのセレン酸還元を示す。 図４は、NT-IAM2及びNT-IAM4ゲノムにおけるmini-Tn5挿入部位の隣接領域を示す。 図５は、NT-IAM3ゲノムにおけるmini-Tn5挿入部位の隣接領域を示す。 図６は、SerABDCの組み立てと輸送の模式図を示す。 図７は、T. selenatis、P. stutzeri NT-I、B. selenatarsenatis SF-1のセレン酸還元酵素遺伝子オペロンの構成の比較を示す。 図８は、serABDC遺伝子を含むpGEM-Teasyベクター（左側）又はpGEM-Teasyベクターのみ（右側）を大腸菌Escherichia coli DH5α株に導入した形質転換体の写真を示す。
　以下、本発明の実施の形態について説明する。
　本明細書において使用する「セレン化合物」なる用語は、セレンを含有する化合物を指す。セレン化合物の例としてはセレン酸、亜セレン酸などが挙げられる。本明細書において使用する「元素態セレン」なる用語は、他の元素と化合物を形成していない元素の形態のセレンを指す。
　本明細書において使用する「セレン酸還元活性」なる用語は、セレン酸を亜セレン酸に還元する活性を指す。本明細書において使用する「セレン酸還元酵素」なる用語は、セレンの亜セレン酸への還元を触媒するタンパク質を指す。本明細書において使用する「亜セレン酸還元活性」なる用語は、亜セレン酸を元素態セレンに還元する活性を指す。本明細書において使用する「亜セレン酸還元酵素」なる用語は、亜セレン酸の元素態セレンへの還元を触媒するタンパク質を指す。
　Pseudomonas stutzeri NT-I株は、セレン酸還元活性、および亜セレン酸還元活性を有することが知られている（特許文献１）。セレン酸還元活性は、セレン酸から生成される亜セレン酸を定量することによって測定することができる。亜セレン酸還元活性は、亜セレン酸から生成される元素態セレンを定量することによって測定することができる。核酸にコードされるタンパク質が有するセレン酸還元活性は、例えば、この遺伝子を、亜セレン酸還元活性を有することが知られているEscherichia coli（Bebien, M. et al., Microbiology, 148:3865-3872 (2002)）に導入した際に元素態セレンが生成することを、セレン酸含有培地上でのコロニーによる赤色の呈色を観察することによって確認することができる。
　本発明のタンパク質は、NT-I株由来のSerA、SerB、SerD、及びSerCであるが、serAの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１及び２に示し、serBの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号３及び４に示し、serDの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号５及び６に示し、serCの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号７及び８に示す。
　ＮT-I株のserABDCはORFの連続性からオペロンであることが推測される。Blastx解析により、SerAはモリブデンを含むcatalytic subunit、SerBは鉄-硫黄クラスターを含むfour cluster protein subunit、SerDはモリブデン酵素の組み立てに関与するシャペロンたんぱく質、SerCはヘムを含む水溶性タンパク質であることが示唆された。この構成はThauera selenatisのセレン酸還元酵素遺伝子serABDCと酷似している。一方で、Bacillus selenatarsenatisのセレン酸還元酵素遺伝子srdBCAは、srdBが鉄-硫黄クラスターを含むfour Cluster protein subunit、srdCが膜貫通領域を持つmembrane anchor protein subunit、srdAがモリブデンを含むcatalytic subunitをそれぞれコードしており、serABDCオペロンとはORFの順序が異なり、また、srdBCAオペロンにはシャペロンたんぱく質をコードするORFがない点が異なっている（図７）。
　SerAは推定分子量103 kDaで、モリブデンを含むcatalytic subunitであると推測される。このサブユニットは細菌のモリブデン酵素に広く見出されるもので、セレン酸のような電子受容体に電子を与え、還元する反応を直接的に触媒していると考えられている。このサブユニットは、一般的にモリブデンの他に鉄-硫黄クラスターの一種である[4Fe-4S]クラスターを持っていることが知られている。NT-I株のSerAについても、そのアミノ酸配列上に[4Fe-4S]クラスター結合モチーフを構成すると推測されるCys77、Cys81、Cys115、Cys122、の４つのシステイン残基が見出されたことから、セレン酸還元を触媒するcatalytic subunitとして機能していると推測される。
　SerBは推定分子量37 kDaで、鉄-硫黄クラスターを含むfour cluster protein subunitであると推測される。このサブユニットは細菌のモリブデン酵素に広く見出されるもので、電子供与体から受け取った電子をcatalytic subunitに受け渡す役割を持つと考えられている。このサブユニットは一般的に４つの鉄-硫黄クラスター（FS1 - FS4）を含むことが知られている。NT-I株のSerBについても、そのアミノ酸配列上に鉄-硫黄クラスター結合モチーフを構成すると推測されるFS1 : CLGCHTCTMACK（アミノ酸15 - 26）、FS2 : CNHCSNPACLAACP（アミノ酸134 - 147）、FS3 : CKGYRYCVKACP（アミノ酸167 - 178）、FS4 : CIGCYPRVEKGEAPACVKQCS（アミノ酸194 - 214）の４つのモチーフが見出されたことから、４つの鉄-硫黄クラスターを持つと推測される。また、FS1、FS2、FS4は４つのシステイン残基を含んでいるが、FS3は３つのシステイン残基を含むことから、４つの鉄-硫黄クラスターのうち３つは[4Fe-4S]クラスター、残る１つは[3Fe-4S]クラスターであることが推測される。これは、B. selenatarsenatis SF-1のSrdBが４つの[4Fe-4S]クラスターを含んでいることと異なっている。
　SerDは推定分子量22 kDaで、モリブデン酵素の組み立てに関わるシャペロンたんぱく質であると推測される。このようなたんぱく質は最終的なモリブデン酵素の複合体には加わらないが、catalytic subunitの持つtwin arginine translocation signal peptideに会合することにより未成熟のcatalytic subunitが細胞質から細胞膜外に防ぎ、モリブデン補因子が正常にcatalytic subunitに挿入されるとともに脱会合することによりcatalytic subunitの細胞膜外への輸送を許可するという働きを持つ。B. selenatarsenatis SF-1においてはこのような働きを持つたんぱく質は見出されていない。
　SerCは推定分子量26 kDaで、ヘムを含む水溶性タンパク質であると推測される。モリブデン酵素は膜貫通領域を含むサブユニットによって細胞膜に結合されているものが多く、B. selenatarsenatis SF-1のSrdBCAもこのタイプであると推定されるが、SerCは水溶性タンパク質であることから、NT-I株のSerABCはペリプラズム領域に存在する水溶性酵素であることが推測される。
　以下の実施例の表３に示す通り、ＮＴ－Ｉ株のserABDC構造遺伝子、及び推測されるアミノ酸配列はThauera selenatisのものと８３～９５％の高い相同性を示す（表３）。なお、アミノ酸配列の同一性の算出にはBLAST program（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）を使用した。
　本発明によれば、
　配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質；
　配列番号４のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質；
　配列番号６のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質；および
　配列番号８のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質：
も有用である。
　上記における「１もしくは数個のアミノ酸」とは、例えば１から１０個のアミノ酸、好ましくは１から８個のアミノ酸、より好ましくは１から５個のアミノ酸、さらに好ましくは１から３個のアミノ酸を意味する。
　さらに本発明によれば、
　配列番号２のアミノ酸配列と９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質；
　配列番号４のアミノ酸配列と９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質；
　配列番号６のアミノ酸配列と９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質；及び
　配列番号８のアミノ酸配列と９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質；
も有用である。
　本発明においては、上記のようなセレン酸還元活性を示すタンパク質をコードする核酸が使用される。１つの実施態様において、この核酸は配列番号１、３、５または７の塩基配列からなる核酸である。別の実施態様において、本発明の核酸は、配列番号１、３、５または７の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつそれぞれ所定のタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質をコードする核酸である。本明細書において使用する「ストリンジェントな条件」なる用語は、緊縮なハイブリダイゼーションの条件をさす。このような条件は、例えばSambrook, J. et al. (eds), Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)などに記載されている。１００ヌクレオチド以上の長いプローブを使用する場合のストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ'ｓ試薬、１００μｇ／ｍＬ変性断片化サケ精子ＤＮＡ中６８℃でのインキュベーション、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中室温での洗浄（ＳＳＣ濃度を０．１まで下げる、および／または温度を６８℃まで上げる）が挙げられる。
　本発明のセレン酸の還元方法において、セレン酸還元活性を示すタンパク質を宿主細胞において発現させる。宿主細胞としては、任意の細胞を使用することができるが、セレン化合物の存在下で生存できる細菌が好ましい。１つの実施態様において、セレン酸還元活性を示すタンパク質の発現は、このタンパク質をコードする核酸を宿主細胞に導入することによって行われる。この目的のためには、組換えＤＮＡ技術が確立されている細菌を宿主として使用することが好ましい。そのような細菌の例としては、限定するものではないが、Escherichia coli、Bacillus subtilisなどが挙げられる。核酸の導入には、選択された宿主細胞において複製可能なベクターが使用される。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルスなどに由来するものが使用できる。核酸を含むベクターには目的の遺伝子の転写の開始および終結を担う配列（プロモーター、ターミネーターなど）、翻訳の開始に必要とされる配列（リボソーム結合部位など）が含まれる。当業者は、宿主細胞に適切なこれらの配列を選択することができる。例えば、セレン酸還元活性を示すタンパク質をコードする配列の上流に本来存在するプロモーターが宿主細胞中で機能する場合はそのプロモーターを利用することができ、あるいは宿主細胞において機能する別のプロモーターの制御下に目的の遺伝子を配置して発現させることもできる。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
実施例１：セレン酸還元変異株の取得
　接合伝達によってPseudomonas stutzeri ＮＴ－Ｉ株にトランスポゾンMini-Tn5(Biomedal, S.L.)を導入し（図１）、変異株ライブラリーを作製した。
　具体的には以下の様に行った。受容菌Pseudomonas stutzeri NT-I 株をTSB培地に植菌し、28度で終夜培養する。トランスポゾンMini-Tn5を含有する供与菌である大腸菌Escherichia coli S17-1株をLB培地に植菌し、37度で終夜培養する。同量の受容菌培養液と供与菌培養液を混合し、遠心分離後、上清を捨てる。10mM硫酸マグネシウムを含む極少量のLB培地に懸濁後、懸濁液をLB寒天培地上におき、28-37度で8-18時間培養する。寒天培地上で増殖した混合菌体を10mM硫酸マグネシウム溶液5mLに懸濁する。その懸濁液を適宜希釈し、最終濃度10-30 mg/mLのテトラサイクリンを含むTSB寒天培地に播種し、28度で終夜培養する。この様にして、トランスポゾンMini-Tn5由来のテトラサイクリン遺伝子が、受容菌Pseudomonas stutzeri NT-I 株のゲノムDNAにランダムに挿入された変異株ライブラリーを作製した。
　ライブラリーより、セレン酸を含む寒天培地上で、元素態セレン生成を示す赤色を呈色しない株を、セレン酸還元能変異株として取得した。Mini-Tn5の導入の結果、3株（NT-IAM2, NT-IAM3, NT-IAM4）のセレン酸還元能変異株が得られた。NT-IAM2及びNT-IAM4は完全に白く、またNT-IAM3は一部赤いもののほとんどの部分が白かった（図２）。また、亜セレン酸を含む培地では、全ての株が赤色のコロニーを形成した。上記の結果から、これらの変異株は、セレン酸を還元できないことが示唆された。
実施例２：セレン酸還元変異株のセレン酸、亜セレン酸の還元率の測定
　ＴＳＢ３ｇ／Ｌを添加した乳酸無機塩培地で、野生株と各変異株をそれぞれ、２８℃で２４時間好気的に前々培養した。同培地に、前々培養液をＯＤ＝０．０２になるよう植菌し、２８℃１２時間好気的に前培養した。１ｍＭのセレン酸または亜セレン酸を含む同培地に、前培養液をＯＤ＝０．０２になるよう植菌し、本培養を開始した。バイアルにシリコセンをしたものを好気条件、気相部を窒素置換しブチルゴム栓をしたものを嫌気条件とした。経時的にサンプリングし、セレン酸、亜セレン酸濃度をイオンクロマトグラフィーで測定した。セレン酸または亜セレン酸の初期添加濃度に対する、培養24時間後までに還元されたものの割合をセレン酸または亜セレン酸還元率として示した。
　測定の結果を図３に示す。
　野生株は好気条件下、嫌気条件下のいずれにおいてもセレン酸を９６～９７％還元し、また好気条件下において亜セレン酸を９５％還元した。
　一方で、いずれの変異株も、好気、嫌気両条件ともにセレン酸還元率が大きく低下し、特に好気条件下においてはNT-IAM2及びNT-IAM4はまったく還元しなかった。NT-IAM3は、好気、嫌気両条件下においてわずかな還元（１１～１３％）を示した。
　亜セレン酸については、いずれの変異株も還元率が低下しているが、完全に還元能が失われることはなかった。
　従って、3株の変異株において、Mini-Tn5が破壊されている遺伝子は、亜セレン酸還元に部分的な影響を持つものの、主にセレン酸還元に関わるものであり、好気、嫌気いずれの条件下でも働いているものと推測された。
実施例３：セレン酸還元関連遺伝子群の単離
　変異株NT-IAM2, NT-IAM3, NT-IAM4について、（SphI等の制限酵素で変異株のゲノムDNAを切断し、適当なプライマーを作製後）、InversePCR法により、ゲノム中の Mini-Tn5近傍の配列を増幅し、クローニングした（図１）。決定した配列を含む領域を、全ゲノム配列データより取得した。Blastxによって、遺伝子領域の推定とアノーテションを行い、Blastnによって既知遺伝子との塩基配列との相同性を調べた。
　NT-IAM2及びNT-IAM4はともに、Mini-Tn5によって、セレン酸還元関連酵素遺伝子serAが破壊されていることが分かった。serABDCは、そのＯＲＦの連続性からオペロンを形成していることが強く示唆された（図４）。serABDCの周辺には、モリブデン補因子生合成酵素遺伝子moaAや、oxyanionセンサーをコードすると推測されるオペロンの存在が示唆された。serAの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１及び２に示し、serBの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号３及び４に示し、serDの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号５及び６に示し、serCの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号７及び８に示す。また、NT-I株におけるserABDC遺伝子座（プロモーター領域、serABDCのＯＲＦ、ターミネーター領域を含む）の塩基配列を配列表の配列番号９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　NT-IAM3は、Mini-Tn5によって、モリブドプテリン生合成酵素遺伝子moaEが破壊されていることがわかった。moaCDEは、そのＯＲＦの連続性からオペロンを形成していることが強く示唆された（図５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　serABDCが、ＮＴ－Ｉ株のセレン酸還元酵素をコードしていることが示唆された。セレン酸還元酵素SerABDCは、嫌気条件下でセレン酸を還元する細菌であるThauera selenatisにおいて詳細な生化学的研究が行われており、SerAにはモリブデン補因子であるMo-bis-MGDと[4Fe-4S]クラスター、SerBには３つの[4Fe-4S]クラスターと１つの[3Fe-4S]クラスター、SerCにはheme-bが含まれていることが明らかとなっている。また、SerDはSerAへのモリブドプテリンの組み込みを制御するsystem specific chaperonであることが示唆されている。
　ＮＴ－Ｉ株のserABDC構造遺伝子、及び推測されるアミノ酸配列はThauera selenatisのものと８３～９５％の高い相同性を示し（表３）、Thauera selenatisのSerABDCと同様の構成をもった酵素であることが推測される。また、Thauera selenatis が嫌気条件下のみでセレン酸を還元するのに対し、ＮＴ－Ｉ株は好気・嫌気両条件下でセレン酸を還元するという点が大きく異なるが、プロモーター領域の塩基配列の相同性が低いこと（４８％）が、セレン酸還元能の発現制御の差異の要因であることが推測された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＮＴ－Ｉ株のセレン酸還元酵素SerABDCの組み立てと輸送は、図６のように推測される。SerAおよびSerBは細胞質でMo-bis-MGDや、鉄・硫黄クラスターに組み込まれる。SerAのＮ末端領域にはTATシグナルペプチドが存在しており、折りたたまれた酵素を細胞膜外に輸送するTAT経路によって、SerABはペリプラズム領域に輸送される。SerDはSerAにMo-bis-MGDが挿入されるまではTATシグナルペプチドに結合していることにより、補因子挿入が不完全のままにSerABが輸送されることを防ぐ。また、SerCはＮ末端領域にSecシグナルペプチドが存在しており、Sec経路によってペリプラズムに輸送された後、折りたたまれ、heme-bが挿入される。SerABCは最終的にペリプラズムで会合し、セレン酸を触媒する。
　また、SerAに挿入されるMo-bis-MGDは2分子のＧＰＴとモリブデン酸よりMoaA, MoaC, MoaDEを含む一連の合成酵素群によって合成される。MoaA及びMoaCは、ＧＴＰの環状化反応、MoaDEはチオール基の導入を触媒することが知られている。
実施例４：セレン酸還元酵素をコードする遺伝子の発現
　上記の実施例３で示したserABDC遺伝子を含むようにPCRにてDNAを増幅した。増幅産物をpGEM-T Easyベクター（Promega社）と結合し、大腸菌Escherichia coli DH5α株を形質転換した。形質転換体の写真を図８に示す。図８の右側は、pGEM-T Easyというベクターだけを保有するネガティブコンコントロールとなる大腸菌を示し、図８の左側は、pGEMserABDC というベクターを保有するポジティブコントロールとなる大腸菌を示す。これは、pGEM-T Easyベクターにlacプロモーターと逆方向にserABDCオペロンが挿入されたプラスミドDNAを保有した大腸菌である。即ち、serABDCオペロン由来のプロモーターから転写されていることが示唆される。どちらの大腸菌も0.5ｍＭのセレン酸を加えたＬＢ寒天培地で増殖し、左側のベクターpGEMserABDCを保有する大腸菌の方が赤色になっていることが観察された。

Claims (22)

  1. 以下からなる群より選択されるタンパク質：
    （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質；および
    （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質。
  2. 以下からなる群より選択されるタンパク質：
    （ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質；および
    （ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質。
  3. 以下からなる群より選択されるタンパク質：
    （ａ）配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質；および
    （ｃ）配列番号６のアミノ酸配列と９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質。
  4. 以下からなる群より選択されるタンパク質：
    （ａ）配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質；および
    （ｃ）配列番号８のアミノ酸配列と９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質。
  5. 請求項１記載のタンパク質をコードする核酸。
  6. 以下からなる群より選択される、請求項５記載の核酸。
    （ａ）配列番号１の塩基配列からなる核酸；
    （ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質をコードする核酸。
  7. 請求項２記載のタンパク質をコードする核酸。
  8. 以下からなる群より選択される、請求項７記載の核酸。
    （ａ）配列番号３の塩基配列からなる核酸；
    （ｂ）配列番号３のヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質をコードする核酸。
  9. 請求項３記載のタンパク質をコードする核酸。
  10. 以下からなる群より選択される、請求項９記載の核酸。
    （ａ）配列番号５の塩基配列からなる核酸；
    （ｂ）配列番号５のヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質をコードする核酸。
  11. 請求項４記載のタンパク質をコードする核酸。
  12. 以下からなる群より選択される、請求項１１記載の核酸。
    （ａ）配列番号７の塩基配列からなる核酸；
    （ｂ）配列番号７のヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を示すタンパク質をコードする核酸。
  13. 請求項５又は６に記載の核酸を含む組み換えベクター。
  14. 請求項７又は８に記載の核酸を含む組み換えベクター。
  15. 請求項９又は１０に記載の核酸を含む組み換えベクター。
  16. 請求項１１又は１２に記載の核酸を含む組み換えベクター。
  17. 請求項５又は６に記載の核酸を宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
  18. 請求項７又は８に記載の核酸を宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
  19. 請求項９又は１０に記載の核酸を宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
  20. 請求項１１又は１２に記載の核酸を宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
  21. 請求項１記載のタンパク質、請求項２記載のタンパク質、請求項３記載のタンパク質、及び請求項４記載のタンパク質を宿主細胞において発現させることを含む、セレン酸の還元方法。
  22. 請求項５又は６記載の核酸、請求項７又は８記載の核酸、請求項９又は１０記載の核酸、及び請求項１１又は１２記載の核酸を宿主細胞に導入することによって、請求項１記載のタンパク質、請求項２記載のタンパク質、請求項３記載のタンパク質、及び請求項４記載のタンパク質を宿主細胞において発現させる、請求項１３に記載の方法。
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