jV-Carboxyalkyl-Auristatine und ihre Verwendung
Die vorliegende Anmeldung betrifft neue, am N-Terminus mit einer Carboxyalkyl-Gruppe substituierte Derivate von Monomethylauristatin E und Monomethylauristatin F, Verfahren zur Herstellung dieser Derivate, die Verwendung dieser Derivate zur Behandlung und/oder Prävention von Krank- heiten sowie die Verwendung dieser Derivate zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, insbesondere von hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen wie beispielsweise Krebserkrankungen. Solche Behandlungen können als Monotherapie oder auch in Kombination mit anderen Arzneimitteln oder weiteren therapeutischen Maßnahmen erfolgen.
Krebserkrankungen sind die Folge unkontrollierten Zellwachstums verschiedenster Gewebe. In vielen Fällen dringen die neuen Zellen in bestehende Gewebe ein (invasives Wachstum), oder sie metastasieren in entfernte Organe. Krebserkrankungen treten in verschiedensten Organen auf und haben oft gewebespezifische Krankheits Verläufe. Daher beschreibt die Bezeichnung Krebserkrankung als Oberbegriff eine große Gruppe definierter Erkrankungen verschiedener Organe, Gewebe und Zelltypen.
Tumore früher Stadien lassen sich gegebenenfalls durch chirurgische und radiotherapeutische Maßnahmen entfernen. Metastasierte Tumore können im Regelfall durch Chemotherapeutika nur palliativ therapiert werden. Ziel hierbei ist, die optimale Kombination aus einer Verbesserung der Lebensqualität und der Verlängerung der Lebenszeit zu erreichen.
Die meisten der heutzutage parenteral applizierten Chemotherapeutika sind oft nicht zielgerichtet auf das Tumorgewebe oder die Tumorzellen, sondern durch die systemische Gabe unspezifisch im Körper verteilt, d.h. auch an Orten, an denen eine Wirkstoffexposition unerwünscht ist, wie beispielsweise in gesunden Zellen, Geweben und Organen. Dies kann zu unerwünschten Nebenwirkungen bis hin zu gravierenden allgemein-toxischen Effekten führen, die dann den therapeutisch nutzbaren Dosisbereich des Wirkstoffs oftmals stark limitieren oder ein völliges Absetzen der Medikation erfordern.
Die verbesserte und selektive Verfügbarkeit dieser Chemotherapeutika in der Tumorzelle oder dem direkt umgebenden Gewebe und die damit verbundene Wirksteigerung einerseits und Minimierung toxischer Nebeneffekte andererseits steht daher seit mehreren Jahren im Fokus bei der Entwicklung neuer Chemotherapeutika. Viele Versuche wurden bislang unternommen, effiziente Methoden für die Wirkstoffeinbringung in die Zielzelle zu entwickeln. Die Optimierung der Assoziation zwischen Wirkstoff und intrazellulärem Ziel und die Minimierung der interzellulären Wirkstoffverteilung, beispielsweise zu Nachbarzellen, stellen jedoch nach wie vor eine schwierige Aufgabe dar.
Für die zielgerichtete Adressierung von Tumorgewebe und Tumorzellen sind beispielsweise monoklonale Antikörper geeignet. Die Bedeutung solcher Antikörper für die klinische Behandlung von Krebserkrankungen hat allgemein in den letzten Jahren erheblich zugenommen, basierend auf der Wirksamkeit solcher Agentien wie Trastuzumab (Herceptin), Rituximab (Rituxan), Cetuximab (Erbitux) und Bevacizumab (Avastin), welche inzwischen für die Therapie einzelner, spezifischer Tumorerkrankungen zugelassen sind [siehe z.B. G. P. Adams und L. M. Weiner, Nat. Biotechnol. 23. 1 147-1 157 (2005)] . In Folge hiervon ist auch das Interesse an so genannten Immunokonjugaten deutlich gestiegen, in welchen ein internalisierender, gegen ein Tumor-assoziiertes Antigen gerichteter Antikörper auf kovalente Weise über eine Verknüpfungseinheit ("linker") mit einem cytotoxisch wirkenden Agens verbunden ist, das nach Einschleusung und anschließender Spaltung des Konjugats innerhalb der Tumorzelle freigesetzt wird und dort seine Wirkung direkt und selektiv entfalten kann. Auf diesem Wege könnte die Schädigung von normalem Gewebe im Vergleich zu einer konventionellen Chemotherapie der Krebserkrankung in signifikant engeren Grenzen gehalten werden [siehe z.B. J. M. Lambert, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 543-549 (2005); A. M. Wu und P. D. Senter, Nat. Biotechnol. 23, 1 137-1 146 (2005); P. D. Senter, Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 235-244 (2009); L. Ducry und B. Stump, Bioconjugate Chem. 2J_, 5-13 (2010)] .
Statt Antikörpern können auch Liganden aus dem Wirkstoffbereich kleiner Moleküle verwendet werden, die selektiv an einen speziellen Zielort ("target"), wie beispielsweise an einen Rezeptor, binden [siehe z.B. E. Ruoslahti et at., Science 279, 377-380 (1998); D. Karkan et at., PLoS ONE 3 (6), e2469 (June 25, 2008)] . Bekannt sind auch Konjugate aus cytotoxischem Wirkstoff und adressierendem Ligand, die zwischen Ligand und Wirkstoff eine definierte Spaltstelle zur Freisetzung des Wirkstoffs aufweisen. Eine solche "Soll-Bruchstelle" kann beispielsweise in einer Peptid- kette bestehen, die an einer bestimmten Stelle selektiv durch ein spezielles Enzym am Wirkort gespalten werden kann [siehe z.B. R. A. Firestone und L. A. Telan, US Patent Application US 2002/0147138] .
Auristatin E (AE) und Monomethylauristatin E (MMAE) sind synthetische Analoga der Dolastatine, einer speziellen Gruppe von linearen Pseudopeptiden, welche ursprünglich aus marinen Quellen isoliert wurden und die zum Teil sehr potente cytotoxische Aktivität gegenüber Tumorzellen aufweisen [für eine Übersicht siehe z.B. G. R. Pettit, Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 70, 1-79 (1997); G. R. Pettit et al, Anti-Cancer Drug Design 10, 529-544 ( 1995); G. R. Pettit et al, Anti-Cancer Drug Design 13, 243-277 (1998)] .
Allerdings besitzt MMAE den Nachteil einer vergleichsweise hohen systemischen Toxizität. Zudem ist diese Verbindung bei einer Anwendung in Form von Antikö er-Wirkstoff-Konjugaten (Immuno- konjugaten) nicht kompatibel mit Verknüpfungseinheiten (Linkern) zwischen Antikörper und Wirkstoff, welche keine enzymatisch spaltbare Soll-Bruchstelle aufweisen [S. O. Doronina et al., Bioconjugate Chem. 17, 1 14-124 (2006)].
Monomethylauristatin F (MMAF) ist ein Auristatin-Derivat mit einer C-terminalen Phenylalanin- Einheit, das nur moderate anti-proliferative Wirkung im Vergleich zu MMAE aufweist. Dies ist sehr wahrscheinlich auf die freie Carboxylgruppe zurückzuführen, die aufgrund ihrer Polarität und Ladung die Zellgängigkeit dieser Verbindung negativ beeinflusst. In diesem Zusammenhang wurde der Methylester von MMAF (MMAF-OMe) als ein neutral geladenes, zellgängiges Prodrug-Derivat beschrieben, das im Vergleich zu MMAF eine um mehrere Größenordnungen erhöhte in v/Yro-Cyto- toxizität gegenüber verschiedenen Karzinoma-Zelllinien zeigt [S. O. Doronina et al., Bioconjugate Chem. 17, 114-124 (2006)]. Es ist anzunehmen, dass diese Wirkung durch MMAF selbst hervorgerufen wird, das nach Aufnahme des Prodrugs in die Zellen schnell durch intrazelluläre Ester-Hydrolyse freigesetzt wird.
Monomethylauristatin F (MMAF): R = H
Monomethylauristatin F-methylester (MMAF-OMe): R = CH
Wirkstoff- Verbindungen auf Basis von einfachen Ester-Derivaten können generell jedoch dem Risiko einer chemischen Instabilität infolge einer unspezifischen, vom vorgesehenen Wirkort unabhängigen Ester-Hydrolyse unterliegen, beispielsweise durch im Blutplasma vorhandene Esterasen; dies kann die Anwendbarkeit solcher Verbindungen in der Therapie deutlich einschränken. Darüber hinaus sind Auristatin-Derivate wie MMAE und MMAF auch Substrate für Transporterproteine, welche von vielen Tumorzellen exprimiert werden, was zu einer Resistenzentwicklung gegenüber diesen Wirkstoffen führen kann.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, neue Auristatin- Verbindungen zu identifizieren und für die Behandlung insbesondere von Krebserkrankungen bereitzustellen, die eine stärkere cyto- toxische Aktivität in Ganzzell-Assays gegenüber dem nur moderat wirksamen Monomethylauristatin F (MMAF) zeigen und/oder schwächer ausgeprägte Substrat-Eigenschaften für Transporterproteine aufweisen. Solche Substanzen könnten sich in besonderem Maße als Toxophore für die Verknüpfung mit Proteinen, wie beispielsweise Antikörpern, oder auch mit niedermolekularen Liganden zu antiproliferativ wirkenden (Immuno-)Konjugaten eignen. Monomethylauristatin F (MMAF) sowie verschiedene Ester- und Amid-Derivate hiervon wurden in WO 2005/08171 1-A2 offenbart. Weitere Auristatin- Analoga mit einer C-terminalen, amidisch substituierten Phenylalanin-Einheit sind in WO 01/18032-A2 beschrieben. In WO 02/088172-A2 und WO 2007/008603-A1 werden MMAF-Analoga beansprucht, welche Seitenketten-Modifikationen des Phenylalanins betreffen, und in WO 2007/008848-A2 solche, in denen die Carboxyl- gruppe des Phenylalanins modifiziert ist. Weitere über den N- oder C-Terminus verknüpfte Auri- statin-Konjugate sind unter anderem in WO 2004/010957-A2 und WO 2009/1 17531 -AI beschrieben [siehe auch S. O. Doronina et al., Bioconjugate Chem. 9, 1960-1963 (2008)] .
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind nun Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
L für geradkettiges (Ci-Ci2)-Alkandiyl steht, das bis zu vierfach mit Methyl substituiert sein kann und in dem (a) zwei Kohlenstoffatome in 1,2-, 1,3- oder 1,4-Relation zueinander unter
Einbezug der gegebenenfalls zwischen ihnen liegenden Kohlenstoffatome zu einem (C3-C6)- Cycloalkyl-Ring oder einem Phenyl-Ring verbrückt sein können oder (b) bis zu drei zueinander nicht benachbarte CFb-Gruppen gegen -O- ausgetauscht sein können, und T für eine Gruppe der Formel
steht, worin
die Verknüpfungsstelle mit dem Stickstoffatom kennzeichnet, Phenyl oder lH-Indol-3-yl bedeutet,
Wasserstoff oder eine Gruppe der Formel
bedeutet, worin
** die jeweilige Verknüpfungsstelle mit dem Rest der betreffenden Gruppe T kennzeichnet, A geradkettiges (Ci-C -Alkandiyl oder geradkettiges (C2-C4)-Alkendiyl darstellt,
R3 Phenyl, das mit (Ci-C -Alkoxycarbonyl oder Carboxyl substituiert sein kann, darstellt, n die Zahl 0, 1 oder 2 darstellt,
Phenyl, Benzyl oder 2-Phenylethyl, welche jeweils in der Phenylgruppe mit (Ci-C -Alkoxycarbonyl oder Carboxyl substituiert sein können, darstellt,
Het einen divalenten 5-gliedrigen Heteroaryl-Ring mit bis zu drei Ring-Hetero- atomen aus der Reihe N, O und/oder S darstellt, und
R5 (C3-Cö)-Cycloalkyl, Phenyl oder (Ci-C -Alkyl, das mit Phenyl substituiert sein kann, darstellt, wobei die genannten Phenylgruppen ihrerseits mit (Ci-C -Alkoxycarbonyl oder Carboxyl substituiert sein können, sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
Erfindungsgemäße Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, die von Formel (I) umfassten Verbindungen der nachfolgend genannten Formeln und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze sowie die von Formel (I) umfassten, nachfolgend als Ausführungsbeispiele genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, soweit es sich bei den von Formel (I) umfassten, nachfolgend genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate und Solvate der Salze handelt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Abhängigkeit von ihrer Struktur in unterschiedlichen stereoisomeren Formen existieren, d.h. in Gestalt von Konfigurationsisomeren oder gegebenenfalls auch als Konformationsisomere (Enantiomere und/oder Diastereomere, einschließlich solcher bei Atropisomeren). Die vorliegende Erfindung umfasst deshalb die Enantiomeren und Dia- stereomeren und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/ oder Diastereomeren lassen sich die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren; vorzugsweise werden hierfür chromatographische Verfahren verwendet, insbesondere die HPLC- Chromatographie an achiraler bzw. chiraler Phase.
Sofern die erfindungsgemäßen Verbindungen in tautomeren Formen vorkommen können, umfasst die vorliegende Erfindung sämtliche tautomere Formen. Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind, jedoch beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditions- salze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure,
Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure. Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, N,N-Diisopropylethylamin, Monoethanolamin, Diethanol- amin, Trisethanolamin, Dimethylaminoethanol, Diethylaminoethanol, Procain, Dicyclohexylamin, Dibenzylamin, N-Methylpiperidin, N-Methylmorpholin, Arginin, Lysin und 1,2-Ethylendiamin.
Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt. Als Solvate sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Hydrate bevorzugt.
Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch Prodrugs der erfindungsgemäßen Verbindungen. Der Begriff "Prodrugs" bezeichnet hierbei Verbindungen, welche selbst biologisch aktiv oder inaktiv sein können, jedoch während ihrer Verweilzeit im Körper zu erfindungsgemäßen Verbindungen umgesetzt werden (beispielsweise metabolisch oder hydrolytisch).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Substituenten, soweit nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:
(Ci-C4)-Alkyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methyl, Ethyl, «-Propyl, Isopropyl, «-Butyl, Isobutyl, sec.-Butyl und fert.-Butyl.
(Ci-Ci2)-Alkandiyl. (Ci-CsVAlkandiyl und (Ci-C6)-Alkandiyl stehen im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen, α,ω-divalenten Alkylrest mit 1 bis 12, 1 bis 8 bzw. 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt ist eine geradkettige Alkandiyl-Gruppe mit 1 bis 8, besonders bevorzugt mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methylen, Ethan-l,2-diyl (1,2- Ethylen), Propan-l,3-diyl ( 1 ,3-Propylen), Butan- 1,4-diyl ( 1 ,4-Butylen), Pentan-l,5-diyl (1,5- Pentylen), Hexan- 1,6-diyl (1,6-Hexylen), Heptan-l,7-diyl (1,7-Hexylen), Octan-l,8-diyl (1,8-
Octylen), Nonan- 1 ,9-diyl ( 1 ,9-Nonylen), Decan- 1 , 10-diyl (1, 10-Decylen), Undecan- 1, 11 -diyl (1, 11- Undecylen) und Dodecan-l, 12-diyl (1, 12-Dodecylen).
(Ci-C4)-Alkandiyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen, α,ω-divalenten Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methylen, Ethan-1,2- diyl (1,2-Ethylen), Propan- 1,3 -diyl (1,3-Propylen) und Butan- 1,4-diyl (1,4-Butylen).
(C2-C4)-Alkendiyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen, α,ω-divalenten Alkenyl- rest mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen und einer Doppelbindung. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Ethen-l,2-diyl, Propen- 1,3 -diyl, But-l-en- 1,4-diyl und But-2-en- 1,4-diyl. Die Doppelbindung kann hierbei in einer eis- oder einer trans -Konfiguration vorliegen. (Ci-C4)-Alkoxy steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxyrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methoxy, Ethoxy, n- Propoxy, Isopropoxy, «-Butoxy und fert.-Butoxy.
(Ci-C4)-Alkoxycarbonyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxyrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, der über eine an das Sauerstoffatom gebundene Carbonyl-Gruppe [-C(=0)-] verknüpft ist. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methoxy- carbonyl, Ethoxycarbonyl, «-Propoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, «-Butoxycarbonyl und tert - Butoxycarbonyl.
(C3-C6)-Cycloalkyl steht im Rahmen der Erfindung für eine monoeyclische, gesättigte Cycloalkyl- gruppe mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl.
5-gliedriges Heteroaryl in der Definition des Ringes Het steht für einen divalenten aromatischen Heterocyclus (Heteroaromaten) mit insgesamt 5 Ringatomen, der bis zu drei gleiche oder verschiedene Ring-Heteroatome aus der Reihe N, O und/oder S enthält und über zwei Ring-Kohlenstoffatome oder gegebenenfalls ein Ring-Stickstoffatom und ein Ring-Kohlenstoffatom verknüpft ist. Beispielhaft seien genannt: Furyl, Pyrrolyl, Thienyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, 1,2-Oxazolyl, 1,3- Oxazolyl, 1,2-Thiazolyl, 1,3-Thiazolyl, 1,2,3-Triazolyl, 1,2,4-Triazolyl, 1,2,4-Oxadiazolyl, 1,3,4- Oxadiazolyl, 1,2,4-Thiadiazolyl und 1,3,4-Thiadiazolyl. Bevorzugt ist 5-gliedriges Heteroaryl mit zwei oder drei gleichen oder verschiedenen Ring-Heteroatomen aus der Reihe N, O und/oder S, wie insbesondere Pyrazolyl, Imidazolyl, 1,3-Oxazolyl, 1,3-Thiazolyl, 1,2,4-Oxadiazolyl und 1,3,4- Oxadiazolyl.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung gilt, dass für alle Reste, die mehrfach auftreten, deren Bedeutung unabhängig voneinander ist. Wenn Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen substituiert sind, können die Reste, soweit nicht anders spezifiziert, ein- oder mehrfach substituiert sein. Eine Substitution mit einem oder mit zwei gleichen oder verschiedenen Substituenten ist bevorzugt. Besonders bevorzugt ist die Substitution mit einem Substituenten.
Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der Formel (I), in welcher
L für geradkettiges (Ci-Cs)-Alkandiyl steht, in dem (a) zwei Kohlenstoffatome in 1,3- oder
1,4-Relation zueinander unter Einbezug des einen beziehungsweise der beiden zwischen ihnen liegenden Kohlenstoffatome zu einem Phenyl-Ring verbrückt sein können oder (b) bis zu zwei zueinander nicht benachbarte CFb-Gruppen gegen -O- ausgetauscht sein können, und
T für eine Gruppe der Formel
* die Verknüpf ngsstelle mit dem Stickstoffatom kennzeichnet, R1 Phenyl oder lH-Indol-3-yl bedeutet, und
R2 Wasserstoff oder eine Gruppe der Formel
,A— R3 oder bedeutet, worin
** die Verknüpfüngsstelle mit dem Rest der betreffenden Gruppe T kenn- zeichnet,
A Ethen-l,2-diyl oder Propen- 1, 3 -diyl darstellt,
R3 Phenyl, das mit (Ci-C -Alkoxycarbonyl oder Carboxyl substituiert sein kann, darstellt,
Het einen divalenten 5-gliedrigen Heteroaryl-Ring ausgewählt aus der Reihe Pyrazolyl, Imidazolyl, 1,3-Oxazolyl, 1,3-Thiazolyl, 1,2,4-Oxadiazolyl und 1,3,4-Oxadiazolyl darstellt, und
R5 Phenyl, das mit (Ci-C -Alkoxycarbonyl oder Carboxyl substituiert sein kann, darstellt, sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
Besonders bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der Formel (I), in welcher
L für geradkettiges (Ci-Cö)-Alkandiyl steht, und eine Gruppe der Formel
* die Verknüpfüngsstelle mit dem Stickstoffatom kennzeichnet und
R2 Wasserstoff oder eine Gruppe der Formel
bedeutet, worin
die Verknüpfüngsstelle mit dem Rest der betreffenden Gruppe T kennzeichnet, A Ethen-l,2-diyl darstellt,
R
3 Phenyl, das mit Methoxycarbonyl oder Carboxyl substituiert sein kann, darstellt,
Het l,3,4-Oxadiazol-2,5-diyl darstellt, und R5 Phenyl, das mit Methoxycarbonyl oder Carboxyl substituiert sein kann, darstellt, sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
Von besonderer Bedeutung im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der Formel (I), in welcher L für Propan- 1,3 -diyl steht, sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
Von besonderer Bedeutung im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher
T für eine Gruppe der Formel
steht, worin
die Verknüpfüngsstelle mit dem Stickstoffatom kennzeichnet und
R2A die oben definierten Bedeutungen von R2 hat, jedoch nicht für Wasserstoff steht, sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
Die in den jeweiligen Kombinationen bzw. bevorzugten Kombinationen von Resten im einzelnen angegebenen Reste-Definitionen werden unabhängig von den jeweiligen angegebenen Kombinationen der Reste beliebig auch durch Reste-Definitionen anderer Kombinationen ersetzt. Ganz besonders bevorzugt sind Kombinationen von zweien oder mehreren der oben genannten Vorzugsbereiche.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I), dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel (II)
in welcher T die oben angegebenen Bedeutungen hat, in einem inerten Lösungsmittel entweder
[A] durch baseninduzierte Alkylierung mit einer Verbindung der Formel (III)
in welcher L die oben angegebene Bedeutung hat, E
1 für Wasserstoff, (Ci-C -Alkyl oder Benzyl steht, und
X für eine Fluchtgruppe wie beispielsweise Chlorid, Bromid, lodid, Mesylat, Triflat oder Tosylat steht, zu einer Verbindung der Formel (IV)
in welcher E
1, L und T die oben angegebenen Bedeutungen haben,
umsetzt und anschließend im Fall, dass E
1 für (Ci-C -Alkyl oder Benzyl steht, diesen Ester- Rest nach üblichen Methoden abspaltet, so dass ebenso wie im Fall, dass E
1 in (III) für Wasserstoff steht, die erfindungsgemäße Carbonsäure der Formel (I)
in welcher L und T die oben angegebenen Bedeutungen haben, erhalten wird,
durch Umsetzung mit einer Verbindung der Formel (V)
E1 für Wasserstoff, (Ci-C -Alkyl oder Benzyl steht, und
LA die oben definierte Bedeutung von L hat, jedoch in der Alkyl-Kettenlänge um eine CFb-Einheit verkürzt ist, in Gegenwart eines geeigneten Reduktionsmittels in eine Verbindung der Formel (VI)
in welcher E
1, L
A und T die oben angegebenen Bedeutungen haben, überführt und anschließend im Fall, dass E
1 für (Ci-C -Alkyl oder Benzyl steht, diesen Ester-Rest nach üblichen Methoden abspaltet, so dass ebenso wie im Fall, dass E
1 in (V) für Wasserstoff steht, die erfindungsgemäße Carbonsäure der Formel (I-A)
in welcher L
A und T die oben angegebenen Bedeutungen haben, erhalten wird, und die resultierenden Verbindungen der Formel (I) bzw. (I-A) gegebenenfalls in ihre Enantiomere und/oder Diastereomere trennt und/oder mit den entsprechenden (/
') Lösungsmitteln und/oder (/
'/
') Basen oder Säuren zu ihren Solvaten, Salzen und/oder Solvaten der Salze umsetzt.
Als inerte Lösungsmittel für die Umsetzung (II) + (III)— » (IV) eignen sich beispielsweise Ether wie Diethylether, Diisopropylether, Methyl-fert.-butylether, Tetrahydrofuran, 1,4-Dioxan, 1,2-Di- methoxyethan oder Bis-(2-methoxyethyl)-ether, Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol, Xylol, Pentan, Hexan, Heptan, Cyclohexan oder Erdölfraktionen, oder dipolar-aprotische Lösungsmittel wie Aceton, Methylethylketon, Acetonitril, Dimethylsulfoxid (DMSO), N,N-Dimethylformamid (DMF), NN-Dimethylacetamid (DMA), NN'-Dimethylpropylenhamstoff (DMPU), N-Methyl- pyrrolidinon (ΝΜΡ) oder Pyridin. Ebenso ist es möglich, Gemische solcher Lösungsmittel einzusetzen. Bevorzugt wird Aceton oder N,N-Dimethylformamid verwendet.
Geeignete Basen für diese Alkylierungsreaktion sind insbesondere Alkalihydroxide wie beispiels- weise Lithium-, Natrium- oder Kaliumhydroxid, Alkali- oder Erdalkalicarbonate wie Lithium-, Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Cäsiumcarbonat, oder übliche organische Amine wie Triethyl- amin, N-Methylmorpholin, N-Methylpiperidin, N,N-Diisopropylethylamin, Pyridin oder 4-NN- Dimethylaminopyridin. Bevorzugt wird Kalium- oder Cäsiumcarbonat verwendet. Gegebenenfalls ist der Zusatz eines Alkylierungskatalysators von Vorteil, wie beispielsweise Lithiumbromid oder -iodid, Natrium- oder Kaliumiodid, Tetra-«-butylammoniumbromid oder -iodid oder Benzyltriethyl- ammoniumbromid.
Die Reaktion (II) + (III)— > (IV) wird im Allgemeinen in einem Temperaturbereich von -20°C bis +100°C, bevorzugt bei 0°C bis +50°C durchgeführt. Die Umsetzung kann bei normalem, bei erhöhtem oder bei erniedrigtem Druck erfolgen (z.B. von 0.5 bis 5 bar); in der Regel arbeitet man bei Normaldruck. Die Umsetzung (II) + (V)— » (VI) erfolgt in den für eine reduktive Aminierung üblichen, unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmitteln, gegebenenfalls in Gegenwart einer Säure und/ oder eines wasserentziehenden Mittels als Katalysator. Zu solchen Lösungsmitteln gehören beispielsweise Alkohole wie Methanol, Ethanol, «-Propanol, Isopropanol, «-Butanol oder fert.-Butanol, Ether wie Tetrahydrofüran, 1,4-Dioxan, 1,2-Dimethoxyethan oder Bis-(2-methoxyethyl)-ether, oder andere Solventien wie Dichlormethan, 1,2-Dichlorethan, N,N-Dimethylformamid oder auch Wasser. Ebenso ist es möglich, Gemische dieser Lösungsmittel einzusetzen. Bevorzugt wird als Lösungsmittel ein 1,4-Dioxan Wasser-Gemisch verwendet unter Zusatz von Essigsäure oder verdünnter Salzsäure als Katalysator.
Als Reduktionsmittel eignen sich für diese Reaktion insbesondere komplexe Borhydride, wie bei- spielsweise Natriumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid, Natriumtriacetoxyborhydrid oder Tetra- «-butylammoniumborhydrid. Bevorzugt wird Natriumcyanoborhydrid eingesetzt.
Die Umsetzung (II) + (V)— > (VI) erfolgt im Allgemeinen in einem Temperaturbereich von 0°C bis +120°C, bevorzugt bei +50°C bis +100°C. Die Reaktion kann bei normalem, bei erhöhtem oder bei erniedrigtem Druck durchgeführt werden (z.B. von 0.5 bis 5 bar); in der Regel arbeitet man bei Normaldruck.
Die Abspaltung eines Ester-Restes E1 in den Verfahrensschritten (IV)— » (I) und (VI)— » (I-A) [E1 = (Ci-C -Alkyl oder Benzyl] wird nach üblichen Methoden durchgeführt, indem man den Ester in einem inerten Lösungsmittel mit einer Säure oder einer Base behandelt, wobei bei letzterer Variante das zunächst entstehende Carboxylat-Salz durch nachfolgende Zugabe einer Säure in die freie Carbonsäure überführt wird. Im Falle eines fert.-Butylesters geschieht die Spaltung bevorzugt mittels einer Säure. Bei einem Benzylester kann die Abspaltung auch durch Hydrogenolyse in Gegenwart eines geeigneten Palladium-Katalysators, wie beispielsweise Palladium auf Aktivkohle, erfolgen.
Der aus Verbindung (III) bzw. (V) stammende Ester-Rest E1 wird hierbei so gewählt, dass die Bedin- gungen seiner Abspaltung kompatibel mit der jeweiligen Gruppe T in Verbindung (IV) und (VI) sind.
Als Base für die Ester-Hydrolyse sind die üblichen anorganischen Basen geeignet. Hierzu gehören insbesondere Alkali- oder Erdalkalihydroxide wie beispielsweise Lithium-, Natrium-, Kalium- oder
Bariumhydroxid, oder Alkali- oder Erdalkalicarbonate wie Natrium-, Kalium- oder Calciumcarbonat. Bevorzugt sind Lithium-, Natrium- oder Kaliumhydroxid.
Als Säure eignen sich für die Esterspaltung im Allgemeinen Schwefelsäure, Chlorwasserstoff/ Salzsäure, Bromwasserstoff/Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure oder Trifluormethansulfonsäure oder deren Gemische gegebenenfalls unter Zusatz von Wasser. Bevorzugt sind Chlorwasserstoff oder Trifluoressigsäure im Falle eines fert.-Butylesters und Salzsäure bei einem Methylester.
Als inerte Lösungsmittel eignen sich für diese Reaktionen Wasser oder die für eine Esterspaltung üblichen organischen Lösungsmittel. Hierzu gehören bevorzugt niedere Alkohole wie Methanol, Ethanol, «-Propanol oder Isopropanol, Ether wie Diethylether, Tetrahydrofüran, 1,4-Dioxan oder 1,2-Dimethoxyethan, oder andere Lösungsmittel wie Dichlormethan, Aceton, Methylethylketon, N,N- Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid. Ebenso ist es möglich, Gemische dieser Lösungsmittel einzusetzen. Im Falle einer basischen Ester-Hydrolyse werden bevorzugt Gemische von Wasser mit 1,4-Dioxan, Tetrahydrofüran, Methanol, Ethanol und/oder Dimethylformamid verwendet. Im Falle der Umsetzung mit Trifluoressigsäure wird bevorzugt Dichlormethan und im Falle der Umsetzung mit Chlorwasserstoff bevorzugt Tetrahydrofüran, Diethylether, 1,4-Dioxan oder Wasser eingesetzt.
Die Esterspaltung erfolgt im Allgemeinen in einem Temperaturbereich von -20°C bis + 100°C, bevorzugt bei 0°C bis +50°C.
Die Verbindungen der Formel (II) können nach üblichen Methoden der Peptidchemie beispielsweise dadurch hergestellt werden, dass man eine Verbindung der Formel (VII)
PG für eine Amino-Schutzgruppe wie beispielsweise (9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl, tert - Butoxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl steht, in einem inerten Lösungsmittel unter Aktivierung der Carboxyl-Funktion in (VII) entweder
zunächst mit einer Verbindung der Formel (VIII)
E2 für Wasserstoff, (Ci-C -Alkyl oder Benzyl steht, oder einem Salz dieser Verbindung zu einer Verbindung der Formel (IX)
in welcher E
2 und PG die oben angegebenen Bedeutungen haben, kuppelt, anschließend im Fall, dass E
2 für (Ci-C -Alkyl oder Benzyl steht, diesen Ester-Rest nach üblichen Methoden abspaltet und die resultierende Carbonsäure der Formel (X)
in welcher PG die oben angegebene Bedeutung hat, dann in einem inerten Lösungsmittel unter Aktivierung der Carboxyl-Funktion mit Verbindung der Formel (XI)
H2N— T (XI), in welcher T die oben angegebenen Bedeutungen hat,
oder einem Salz dieser Verbindung zu einer Verbindung der Formel (XII)
in welcher PG und T die oben angegebenen Bedeutungen haben,
kuppelt
oder
mit einer Verbindung der Formel (XIII)
in welcher T die oben angegebenen Bedeutungen hat,
oder einem Salz dieser Verbindung gleichfalls zu der Verbindung der Formel (XII)
in welcher PG und T die oben angegebenen Bedeutungen haben,
kuppelt
und die Verbindung der Formel (XII) dann auf übliche Weise zu einer Verbindung der Formel (II)
in welcher T die oben angegebenen Bedeutungen hat, entschützt.
Die oben beschriebenen Kupplungsreaktionen (Amid-Bildung aus jeweiliger Amin- und Carbon- säure-Komponente) werden nach allgemein üblichen Methoden der Peptidchemie durchgeführt [siehe z.B. M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer- Verlag, Berlin, 1993; M. Bodanszky und A. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer- Verlag, Berlin, 1984; H.-D. Jakubke und H. Jeschkeit, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Verlag Chemie, Weinheim, 1982] .
Inerte Lösungsmittel für die Kupplungsreaktionen (VII) + (VIII) -> (IX), (X) + (XI) -> (XII) und (VII) + (XIII) — » (XII) sind beispielsweise Ether wie Diethylether, Diisopropylether, fert. -Butyl- methylether, Tetrahydrofüran, 1,4-Dioxan, 1,2-Dimethoxyethan oder Bis-(2-methoxyethyl)-ether, Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol, Xylol, Pentan, Hexan, Heptan, Cyclohexan oder Erdölfraktionen, Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan, Trichlormethan, Tetrachlormethan, 1,2- Dichlorethan, Trichlorethylen oder Chlorbenzol, oder dipolar-aprotische Lösungsmittel wie Aceton, Methylethylketon, Acetonitril, Ethylacetat, Pyridin, Dimethylsulfoxid (DMSO), N,N-Dimethylform- amid (DMF), NN-Dimethylacetamid (DMA), NN'-Dimethylpropylenharnstoff (DMPU) oder N- Methylpyrrolidinon (ΝΜΡ). Ebenso ist es möglich, Gemische solcher Lösungsmittel zu verwenden. Bevorzugt wird N,N-Dimethylformamid eingesetzt.
Als Aktivierungs-/Kondensationsmittel für diese Kupplungen eignen sich beispielsweise Carbodi- imide wie NN'-Diethyl-, NN'-Dipropyl-, NN'-Diisopropyl-, NN'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC), Phosgen-Derivate wie N,N'-Carbonyldiimidazol (CDI) oder Isobutylchlorformiat, 1,2-Oxazolium- Verbindungen wie 2-Ethyl-5 -phenyl- 1 ,2-oxazolium-3 -sulfat oder 2-tert. -Butyl-5 -methylisoxazolium-perchlorat, Acyl- amino-Verbindungen wie 2-Ethoxy-l-ethoxycarbonyl-l,2-dihydrochinolin, α-Chlorenamine wie l-Chlor-2-methyl-l-dimethylamino-l-propen, Phosphor- Verbindungen wie Propanphosphonsäurean- hydrid, Cyanophosphonsäurediethylester, Bis-(2-oxo-3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid, Benzotri- azol- 1 -yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorophosphat oder Benzotriazol- 1 -yloxy-tris-
(pyrrolidino)phosphonium-hexafluorophosphat (PyBOP), oder Uronium-Verbindungen wie
0- (Benzotriazol- 1 -yl)-N,N,N' N'-tetramethyluronium-tetrafluoroborat (TBTU), 0-(Benzotriazol- 1 - yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorophosphat (HBTU), 2-(2-Oxo-l-(2H)-pyridyl)-l, 1,3,3- tetramethyluronium-tetrafluoroborat (TPTU), 0-(7-Azabenzotriazol- 1 -yl)-N,N,N' N'-tetramethyl- uronium-hexafluorophosphat (HATU) oder 0-(lH-6-Chlorbenzotriazol-l-yl)-l, l,3,3-tetramethyl- uronium-tetrafluoroborat (TCTU), gegebenenfalls in Kombination mit weiteren Hilfsstoffen wie
1- Hydroxybenzotriazol (HOBt) oder N-Hydroxysuccinimid (HOSu), sowie als Basen Alkalicarbo- nate, z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder tertiäre Aminbasen wie Triethylamin, N-Methyl- mo holin, N-Methylpiperidin, N,N-Diisopropylethylamin, Pyridin oder 4-N,N-Dimethylamino- pyridin.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird als Aktivierungs-/Kondensationsmittel für solche Kupplungsreaktionen bevorzugt N-(3 -Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC) in Kombination mit 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und N,N-Diisopropylethylamin, oder O- (7-Azabenzotriazol-l-yl)-N,N,N' N'-tetramethyluronium-hexafluorophosphat (HATU) gleichfalls in Verbindung mit N,N-Diisopropylethylamin verwendet.
Die Kupplungsreaktionen (VII) + (VIII) -> (IX), (X) + (XI) -> (XII) und (VII) + (XIII) -> (XII) werden in der Regel in einem Temperaturbereich von -20°C bis +60°C, bevorzugt bei 0°C bis +40°C durchgeführt. Die Umsetzungen können bei normalem, bei erhöhtem oder bei erniedrigtem Druck erfolgen (z.B. von 0.5 bis 5 bar); im Allgemeinen arbeitet man bei Normaldruck. Gegebenenfalls vorhandene funktionelle Gruppen - wie insbesondere Amino-, Hydroxy- und Carboxylgruppen - können bei den zuvor beschriebenen Verfahrensschritten, falls zweckmäßig oder erforderlich, auch in temporär geschützter Form vorliegen. Die Einführung und Entfernung solcher Schutzgruppen erfolgt hierbei nach üblichen, aus der Peptidchemie bekannten Methoden [siehe z.B. T.W. Greene und P.G.M. Wuts, Protective Croups in Organic Synthesis, Wiley, New York, 1999; M. Bodanszky und A. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer- Verlag, Berlin, 1984] . Bei Vorhandensein mehrerer geschützter Gruppen kann deren Wiederfreisetzung gegebenenfalls simultan in einer Eintopf-Reaktion oder auch in separaten Reaktionsschritten vorgenommen werden.
Als Amino-Schutzgruppe wird bevorzugt fert.-Butoxycarbonyl (Boc), Benzyloxycarbonyl (Z) oder (9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl (Fmoc) verwendet; für eine Hydroxy- oder Carboxyl-Funktion wird vorzugsweise fert.-Butyl oder Benzyl als Schutzgruppe eingesetzt. Die Abspaltung einer tert - Butyl- oder fert.-Butoxycarbonyl-Gruppe geschieht üblicherweise durch Behandlung mit einer starken Säure, wie Chlorwasserstoff, Bromwasserstoff oder Trifluoressigsäure, in einem inerten
Lösungsmittel wie Diethylether, 1,4-Dioxan, Dichlormethan oder Essigsäure; gegebenenfalls kann diese Reaktion auch ohne Zusatz eines inerten Lösungsmittels durchgeführt werden. Im Falle von Benzyl oder Benzyloxycarbonyl als Schutzgruppe werden diese bevorzugt durch Hydrogenolyse in Gegenwart eines geeigneten Palladium-Katalysators, wie beispielsweise Palladium auf Aktivkohle, entfernt. Die (9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl-Gruppe wird im Allgemeinen mit Hilfe einer sekundären Aminbase wie Diethylamin oder Piperidin abgespalten.
Ein Ester-Rest E2 in Verbindung (VIII) [E2 = (Ci-C- -Alkyl oder Benzyl] wird hierbei so gewählt, dass die Bedingungen seiner Abspaltung kompatibel mit der jeweils eingesetzten Schutzgruppe PG aus Verbindung (VII) sind. Die Verbindungen der Formel (VII) können auf analoge Weise beispielsweise dadurch hergestellt werden, dass man zunächst N-(Benzyloxycarbonyl)-L-Valin der Formel (XIV)
in welcher Z für die Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe steht, mit Hilfe eines Kondensationsmittels mit einer Verbindung der Formel (XV)
in welcher E
3 für (Ci-C- -Alkyl steht, oder einem Salz dieser Verbindung zu einer Verbindung der Formel (XVI)
in welcher E
3 und Z die oben angegebenen Bedeutungen haben, kuppelt, diese nach hydrogenolytischer Entfernung der Z-Schutzgruppe dann in Gegenwart eines Kondensationsmittels mit N-geschütztem N-Methyl-L-valin der Formel (XVII)
PG für eine Amino-Schutzgruppe wie beispielsweise (9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl, tert - Butoxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl steht, zu einer Verbindung der Formel (XVIII)
(XVIII), in welcher E
3 und PG die oben angegebenen Bedeutungen haben, kuppelt und abschließend die Ester-Gruppierung -C(0)0-E
3 in (XVIII) nach üblichen Methoden in die freie Carbonsäure (VII) überführt.
Die Kupplungen (XIV) + (XV) -> (XVI) und Z-entschütztes (XVI) + (XVII) -> (XVIII) werden unter analogen Reaktionsbedingungen durchgeführt wie zuvor bei den in Verfahren [C] und [D] dargestellten Kupplungsschritten beschrieben.
Die Hydrolyse der Ester-Gruppe -C(0)0-E3 im Reaktionsschritt (XVIII)— » (VII) erfolgt auf analoge Weise wie zuvor im Rahmen der Verfahrenssequenzen [A] und [B] für den Ester-Rest E1 beschrieben. Die Alkylgruppe E3 in Verbindung (XV) wird hierbei so gewählt, dass die Bedingungen ihrer Abspaltung kompatibel mit der jeweils eingesetzten Schutzgruppe PG aus Verbindung (XVII) sind. Die Verbindungen der Formel (XIII) ihrerseits sind durch Kupplung der oben beschriebenen Verbindung (XI) mit der Verbindung (XIX)
in welcher Boc für die fert.-Butoxycarbonyl-Schutzgruppe steht, zu einer Verbindung der Formel (XX)
in welcher Boc und T die oben angegebenen Bedeutungen haben, und nachfolgende Abspaltung der Boc-Schutzgruppe zugänglich.
Die Kupplungsreaktion (XI) + (XIX)— » (XX) wird wiederum unter analogen Bedingungen durchgeführt wie zuvor bei den in Verfahren [C] und [D] dargestellten Kupplungsschritten beschrieben. Die Verbindungen der Formeln (III), (V), (VIII), (XI), (XIV), (XV), (XVII) und (XIX) einschließlich, wo zutreffend, chiraler oder diastereomerer Formen hiervon sind kommerziell erhältlich oder als solche in der Literatur beschrieben, oder sie können auf für den Fachmann offenkundigem Wege in Analogie zu in der Literatur publizierten Methoden hergestellt werden. Zahlreiche ausführliche Vorschriften sowie Literaturangaben zur Herstellung der Ausgangsmaterialien befinden sich auch im Experimentellen Teil im Abschnitt zur Herstellung der Ausgangsverbindungen und Intermediate.
Sollten entsprechende isomerenreine Ausgangsmaterialien nicht zur Verfügung stehen, so kann eine Trennung der erfindungsgemäßen Verbindungen in die korrespondierenden Enantiomere und/ oder
Diastereomere zweckmäßigerweise auch bereits auf der Stufe der Verbindungen (II), (IV), (VI), (XI), (XII), (XIII) und (XX) erfolgen, welche dann in separierter Form gemäß den zuvor beschriebenen Reaktionsschritten weiter umgesetzt werden. Eine solche Auftrennung der Stereoisomeren läßt sich nach üblichen, dem Fachmann bekannten Methoden durchführen. Bevorzugt werden chromato- graphische Verfahren an achiralen bzw. chiralen Trennphasen angewandt; im Falle von freien Carbonsäuren als Zwischenprodukten kann alternativ auch eine Trennung über diastereomere Salze mit Hilfe chiraler Basen erfolgen.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch die folgenden Reaktionsschemata beispielhaft veranschaulicht werden:
Schema 1
1. HATU, iPr2NEt
2. Piperidin
Fmoc-
Schema 3
Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen wertvolle pharmakologische Eigenschaften und können zur Vorbeugung und Behandlung von Erkrankungen bei Menschen und Tieren verwendet werden.
Im Vergleich zu anderen, aus dem Stand der Technik bekannten Auristatin-Derivaten hat die in den Verbindungen der vorliegenden Erfindung enthaltene N-terminale Carboxyalkyl-Gruppierung [HOOC-L- in Formel (I)] nicht die bloße Funktion eines Linkers für die potentielle Verknüpfung mit Antikörperproteinen oder anderen Liganden, sondern stellt vielmehr ein konstitutives Struk- turelement für das überraschend vorteilhafte Eigenschaftsprofil dieser Verbindungen dar.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen im Vergleich beispielsweise zu Monomethylauristatin F (MMAF) eine stärkere cytotoxische Aktivität oder weisen ein vermindertes Potential auf, gleichzeitig auch Substrate für zelluläre Transporterproteine zu sein.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind daher in besonderem Maße zur Behandlung von hyper- proliferativen Erkrankungen beim Menschen und bei Säugetieren allgemein geeignet. Die Verbindungen können einerseits die Zellproliferation und Zellteilung hemmen, blockieren, verringern oder senken und andererseits die Apoptose verstärken.
Zu den hyperproliferativen Erkrankungen, zu deren Behandlung die erfindungsgemäßen Verbindungen eingesetzt werden können, zählt insbesondere die Gruppe der Krebs- und Tumorerkrankungen. Hierunter werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere die folgenden Erkrankungen verstanden, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein: Brustkarzinome und Brusttumore (Mammakarzinome einschließlich ductaler und lobulärer Formen, auch in situ), Atemwegstumore (kleinzelliges und nicht-kleinzelliges Karzinom, Bronchialkarzinome), Hirntumore (z.B. des Hirnstamms und des Hypothalamus, Astrocytoma, Ependymoma, Glioblastoma, Gliome, Medullo- blastoma, Meningiome sowie neuro-ektodermale und pineale Tumore), Tumore der Verdauungsorgane (Speiseröhren-, Magen-, Gallenblasen-, Dünndarm-, Dickdarm-, Rektum- und Anal- karzinome), Lebertumore (u.a. hepatozelluläres Karzinom, Cholangiokarzinom und gemischt- hepatozelluläres Cholangiokarzinom), Tumore des Kopf- und Halsbereiches (Larynx-, Hypo- pharynx-, Nasopharynx-, Oropharynx-, Lippen- und Mundhöhlenkarzinome, orale Melanome), Hauttumore (Basaliome, Spinaliome, Plattenepithelkarzinome, Kaposi-Sarkom, maligne Melanome, nicht-melanomartiger Hautkrebs, Merkelzell-Hautkrebs, Mastzelltumore), Tumore des Stütz- und Bindegewebes (u.a. Weichteilsarkome, Osteosarkome, maligne fibröse Histiozytome, Chondrosarkome, Fibrosarkome, Hämangiosarkome, Leiomyosarkome, Liposarkome, Lymphosarkome und Rhabdomyosarkome), Tumore der Augen (u.a. intraokuläres Melanom und Retinoblastom), Tumore der endokrinen und exokrinen Drüsen (z.B. der thyroiden und parathyroiden Drüsen, Bauchspeicheldrüsen- und Speicheldrüsenkarzinome, Adenokarzinome), Tumore des Harntrakts (Blasen-, Penis-, Nieren-, Nierenbecken- und Harnleitertumore) sowie Tumore der reproduktiven Organe (Endometrium-, Zervix-, Ovarial-, Vaginal-, Vulva- und Uteruskarzinome der Frau sowie Prostata- und Hodenkarzinome des Mannes). Dazu gehören auch proliferative Erkrankungen des Blutes, des Lymphsystems und des Rückenmarks, in solider Form und als zirkulierende Zellen, wie Leukämien, Lymphome und myeloproliferative Erkrankungen, z.B. akute myeloide, akute lymphoblastische, chronisch-lymphozytische, chronisch-myelogene und Haarzell-Leukämie, sowie AIDS -korrelierte Lymphome, Hodgkin-Lymphome, Non-Hodgkin-Lymphome, kutane T-Zell-Lymphome, Burkitt- Lymphome und Lymphome im zentralen Nervensystem.
Diese gut charakterisierten Krankheiten des Menschen können mit vergleichbarer Ätiologie auch in anderen Säugetieren vorkommen und dort ebenfalls mit den Verbindungen der vorliegenden Erfin- dung behandelt werden.
Die Behandlung der zuvor genannten Krebserkrankungen mittels der erfindungsgemäßen Verbindungen umfasst sowohl eine Behandlung der soliden Tumore als auch eine Behandlung meta- stasierter oder zirkulierender Formen hiervon.
Der Begriff "Behandlung" oder "behandeln" wird im Rahmen dieser Erfindung konventionell verwendet und bedeutet die Versorgung, Pflege und Betreuung eines Patienten mit dem Ziel, eine Krankheit oder gesundheitliche Abweichung zu bekämpfen, zu verringern, abzuschwächen oder zu erleichtern und die Lebensbedingungen zu verbessern, die durch diese Krankheit beeinträchtigt wer- den, wie beispielsweise bei einer Krebserkrankung.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Ver- bindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in einem Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer wirksamen Menge von mindestens einer der erfindungsgemäßen Verbindungen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein oder bei Bedarf in Kombination mit einer oder mehreren anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, solange diese Kombination nicht zu unerwünschten und inakzeptablen Nebenwirkungen führt. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Arzneimittel, enthaltend mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder Prävention der zuvor genannten Erkrankungen.
Beispielsweise können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit bekannten anti-hyper- proliferativen, zytostatischen oder zytotoxischen Substanzen zur Behandlung von Krebserkrankungen kombiniert werden. Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft genannt:
Aldesleukin, Alendronsäure, Alfaferon, Alitretinoin, Allopurinol, Aloprim, Aloxi, Altretamin, Aminoglutethimid, Amifostin, Amrubicin, Amsacrin, Anastrozol, Anzmet, Aranesp, Arglabin, Arsentrioxid, Aromasin, 5-Azacytidin, Azathioprin, BCG oder tice-BCG, Bestatin, Betamethason- Acetat, Betamethason-Natriumphosphat, Bexaroten, Bleomycin-Sulfat, Broxuridin, Bortezomib, Busulfan, Calcitonin, Campath, Capecitabin, Carboplatin, Casodex, Cefeson, Celmoleukin, Cerubi-
din, Chlorambucil, Cisplatin, Cladribin, Clodronsäure, Cyclophosphamid, Cytarabin, Dacarbazin, Dactinomycin, DaunoXome, Decadron, Decadron-Phosphat, Delestrogen, Denileukin Diftitox, Depomedrol, Deslorelin, Dexrazoxan, Diethylstilbestrol, Diflucan, Docetaxel, Doxifluridin, Doxo- rubicin, Dronabinol, DW-166HC, Eligard, Elitek, Ellence, Emend, Epirubicin, Epoetin-alfa, Epogen, Eptaplatin, Ergamisol, Estrace, Estradiol, Estramustin-Natriumphosphat, Ethinylestradiol, Ethyol, Etidronsäure, Etopophos, Etoposid, Fadrozol, Farston, Filgrastim, Finasterid, Fligrastim, Floxuridin, Fluconazol, Fludarabin, 5-Fluordeoxyuridin-Monophosphat, 5-Fluoruracil (5-FU), Fluoxymesteron, Flutamid, Formestan, Fosteabin, Fotemustin, Fulvestrant, Gammagard, Gemcitabin, Gemtuzumab, Gleevec, Gliadel, Goserelin, Granisetron-Hydrochlorid, Histrelin, Hycamtin, Hydrocorton, erythro- Hydroxynonyladenin, Hydroxyharnstoff, Ibritumomab Tiuxetan, Idarubicin, Ifosfamid, Interferonalpha, Interferon-alpha-2, Interferon-alpha-2a, Interferon-alpha-2ß, Interferon-alpha-nl, Interferon- alpha-n3, Interferon-beta, Interferon-gamma-la, Interleukin-2, Intron A, Iressa, Irinotecan, Kytril, Lentinan-Sulfat, Letrozol, Leucovorin, Leuprolid, Leuprolid-Acetat, Levamisol, Levofolinsäure- Calciumsalz, Levothroid, Levoxyl, Lomustin, Lonidamin, Marinol, Mechlorethamin, Mecobalamin, Medroxyprogesteron-Acetat, Megestrol-Acetat, Melphalan, Menest, 6-Mercaptopurin, Mesna, Methotrexat, Metvix, Miltefosin, Minocyclin, Mitomycin C, Mitotan, Mitoxantron, Modrenal, Myocet, Nedaplatin, Neulasta, Neumega, Neupogen, Nilutamid, Nolvadex, NSC-631570, OCT-43, Octreotid, Ondansetron-Hydrochlorid, Orapred, Oxaliplatin, Paclitaxel, Pediapred, Pegaspargase, Pegasys, Pentostatin, Picibanil, Pilocarpin-Hydrochlorid, Pirarubicin, Plicamycin, Porfimer- Natrium, Prednimustin, Prednisolon, Prednison, Premarin, Procarbazin, Procrit, Raltitrexed, Rebif, Rhenium- 186-Etidronat, Rituximab, Roferon-A, Romurtid, Salagen, Sandostatin, Sargramostim, Semustin, Sizofiran, Sobuzoxan, Solu-Medrol, Streptozocin, Strontium-89-chlorid, Synthroid, Tamoxifen, Tamsulosin, Tasonermin, Tastolacton, Taxoter, Teceleukin, Temozolomid, Teniposid, Testosteron-Propionat, Testred, Thioguanin, Thiotepa, Thyrotropin, Tiludronsäure, Topotecan, Toremifen, Tositumomab, Tastuzumab, Teosulfan, Tretinoin, Trexall, Trimethylmelamin, Trimetrexat, Triptorelin-Acetat, Triptorelin-Pamoat, UFT, Uridin, Valrubicin, Vesnarinon, Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Vinorelbin, Virulizin, Zinecard, Zinostatin-Stimalamer, Zofiran; ABI-007, Acolbifen, Actimmun, Affinitak, Aminopterin, Arzoxifen, Asoprisnil, Atamestan, Atrasentan, Avastin, BAY 43-9006 (Sorafenib), CCI-779, CDC-501 , Celebrex, Cetuximab, Crisnatol, Cyproteron-Acetat, Decitabin, DN-101, Doxorubicin-MTC, dSLIM, Dutasterid, Edotecarin, Eflornithin, Exatecan, Fenretinid, Histamin-Dihydrochlorid, Histrelin-Hydrogel-Implant, Holmium- 166-DOTMP, Ibandronsäure, Interferon-gamma, Intron-PEG, Ixabepilon, Keyhole Limpet-Hemocyanin, L-651582, Lanreotid, Lasofoxifen, Libra, Lonafarnib, Miproxifen, Minodronat, MS-209, liposomales MTP-PE, MX-6, Nafarelin, Nemorubicin, Neovastat, Nolatrexed, Oblimersen, Onko-TCS, Osidem, Paclitaxel-Polyglutamat, Pamidronat-Dinatrium, PN- 401, QS-21, Quazepam, R-1549, Raloxifen, Ranpirnas, 13 -cz's -Retinsäure, Satraplatin, Seocalcitol,
T- 138067, Tarceva, Taxoprexin, Thymosin-alpha-1, Tiazofürin, Tipifarnib, Tirapazamin, TLK- 286, Toremifen, TransMID-107R, Valspodar, Vapreotid, Vatalanib, Verteporfin, Vinflunin, Z-100, Zoledronsäure, sowie Kombinationen hiervon.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit anti-hyperproliferativen Agentien kombiniert werden, welche beispielhaft - ohne dass diese Aufzählung abschließend wäre - sein können:
Aminoglutethimid, L-Asparaginase, Azathioprin, 5-Azacytidin, Bleomycin, Busulfan, Carboplatin, Carmustin, Chlorambucil, Cisplatin, Colaspase, Cyclophosphamid, Cytarabin, Dacarbazin, Dactinomycin, Daunorubicin, Diethylstilbestrol, 2',2'-Difluordeoxycytidin, Docetaxel, Doxorubicin (Adriamycin), Epirubicin, Epothilon und seine Derivate, erythro-Hydroxynonyladenin, Ethinylestradiol, Etoposid, Fludarabin-Phosphat, 5-Fluordeoxyuridin, 5-Fluordeoxyuridin-Monophosphat, 5-Fluoruracil, Fluoxymesteron, Flutamid, Hexamethylmelamin, Hydroxyharnstoff, Hydroxy- progesteron-Caproat, Idarubicin, Ifosfamid, Interferon, Irinotecan, Leucovorin, Lomustin, Mechlorethamin, Medroxyprogesteron-Acetat, Megestrol-Acetat, Melphalan, 6-Mercaptopurin, Mesna, Methotrexat, Mitomycin C, Mitotan, Mitoxantron, Paclitaxel, Pentostatin, N-Phosphono- acetyl-L-aspartat (PALA), Plicamycin, Prednisolon, Prednison, Procarbazin, Raloxifen, Semustin, Streptozocin, Tamoxifen, Teniposid, Testosteron-Propionat, Thioguanin, Thiotepa, Topotecan, Tri- methylmelamin, Uridin, Vinblastin, Vincristin, Vindesin und Vinorelbin.
In viel versprechender Weise lassen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen auch mit biologischen Therapeutika wie Antikörpern (z.B. Avastin, Rituxan, Erbitux, Herceptin) kombinieren. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in Kombination mit gegen die Angiogenese gerichteten Therapien positive Effekte erzielen, wie zum Beispiel mit Avastin, Axitinib, Recentin, Regora- fenib, Sorafenib oder Sunitinib. Kombinationen mit Inhibitoren des Proteasoms und von mTOR sowie Kombinationen mit Antihormonen und steroidalen metabolischen Enzyminhibitoren sind wegen ihres günstigen Nebenwirkungsprofiis ebenfalls besonders geeignet.
Generell können mit der Kombination von Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit anderen, zytostatisch oder zytotoxisch wirksamen Agentien folgende Ziele verfolgt werden: eine verbesserte Wirksamkeit bei der Verlangsamung des Wachstums eines Tumors, bei der Reduktion seiner Größe oder sogar bei seiner völligen Eliminierung im Vergleich zu einer Behandlung mit einem einzelnen Wirkstoff;
• die Möglichkeit, die verwendeten Chemotherapeutika in geringerer Dosierung als bei der Monotherapie einzusetzen;
• die Möglichkeit einer verträglicheren Therapie mit weniger Nebeneffekten im Vergleich zur Einzelgabe;
• die Möglichkeit zur Behandlung eines breiteren Spektrums von Tumorerkrankungen;
• das Erreichen einer höheren Ansprechrate auf die Therapie; · eine längere Überlebenszeit der Patienten im Vergleich zur heutigen Standardtherapie.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Kombination mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nicht- toxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie beispielsweise oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat bzw. Stent.
Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.
Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende, die erfindungsgemäßen Verbindungen schnell und/oder modifiziert abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nicht-überzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weich- gelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen.
Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die par-
enterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.
Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen oder -sprays, lingual, sublingual oder buccal zu appli- zierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wäßrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (z.B . Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.
Bevorzugt sind die orale oder parenterale Applikation, insbesondere die orale und die intravenöse Applikation.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Lactose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige Polyethylen- glycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdodecylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B . anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien. Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 0.001 bis 1 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.01 bis 0.5 mg/kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die Dosierung etwa 0.01 bis 100 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.01 bis 20 mg/kg und ganz besonders bevorzugt 0.1 bis 10 mg/kg Körpergewicht. Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung. Die Erfindung ist nicht auf die Beispiele beschränkt.
Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen.
A. Beispiele
Abkürzungen und Akronyme: abs. absolut
Ac Acetyl
aq. wässrig, wässrige Lösung
Boc fert.-Butoxycarbonyl
br. breit (bei NMR)
Bsp. Beispiel
ca. circa, ungefähr
CI chemische Ionisation (bei MS)
d Dublett (bei NMR)
d Tag(e)
DC Dünnschichtchromatographie
DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)
dd Dublett von Dublett (bei NMR)
DMAP 4-N,N-Dimethylaminopyridin
DME 1,2-Dimethoxyethan
DMF N,N-Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
DPBS Dulbecco's Phosphat-gepufferte Salz-Lösung
dt Dublett von Triplett (bei NMR)
d. Th. der Theorie (bei chemischer Ausbeute)
EDC N'-(3 -Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid
EI Elektronenstoß-Ionisation (bei MS)
eq. Äquivalent(e)
ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS)
FCS fötales Kälberserum
Fmoc (9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl
GC-MS Gaschromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie ges. gesättigt
GTP Guanosin-5'-triphosphat
h Stunde(n)
HATU 0-(7-Azabenzotriazol- 1 -yl)-N,N,N' N -tetramethyluronium- hexafluorophosphat
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin- 1 -ethansulfonsäure
HOAc Essigsäure
HOBt 1 -Hydroxy- lH-benzotriazol-Hydrat
HOSu N-Hydroxysuccinimid
HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
HR-MS hochaufgelöste Massenspektrometrie
konz. konzentriert
LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie m Multiple« (bei NMR)
min Minute(n)
MS Massenspektrometrie
MTBE Methyl-fert . -butylether
MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid
NMM N-Methylmorpholin
NMP N-Methyl-2-pyrrolidinon
NMR Kernresonanzspektrometrie
PBS Phosphat-gepufferte Salz-Lösung
Pd/C Palladium auf Aktivkohle
quant. quantitativ (bei Ausbeute)
quart Quartett (bei NMR)
quint Quintett (bei NMR)
Rf Retentionsindex (bei DC)
RT Raumtemperatur
R, Retentionszeit (bei HPLC)
s Singulett (bei NMR)
t Triplett (bei NMR)
tert. tertiär
TFA Trifluoressigsäure
THF Tetrahydrofuran
UV Ultraviolett-Spektrometrie
v/v Volumen zu Volumen- Verhältnis (einer Lösung)
Z Benzyloxycarbonyl
zus. zusammen
HPLC-, LC-MS- und GC-MS-Methoden:
Methode 1 (LC-MS):
Instrument: Waters Acquity SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ 50 mm x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 ml 99%-ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 ml 99%-ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A -> 1.2 min 5% A -> 2.0 min 5% A; Fluss: 0.40 ml/min; Ofen: 50°C; UV-Detektion: 210-400 nm.
Methode 2 (LC-MS):
Instrument: Micromass QuattroPremier mit Waters UPLC Acquity; Säule: Thermo Hypersil GOLD 1.9μ 50 mm x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A -> 0.1 min 90% A -> 1.5 min 10% A -> 2.2 min 10% A; Fluss: 0.33 ml/min; Ofen: 50°C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 3 (LC-MS):
Instrument: Micromass Quattro Micro MS mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule: Thermo Hypersil GOLD 3μ 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 100% A -> 3.0 min 10% A -> 4.0 min 10% A -> 4.01 min 100% A (Fluss 2.5 ml/min) -> 5.00 min 100% A; Ofen: 50°C; Fluss: 2 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 4 (LC-MS):
Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: HP 1 100 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex Gemini 3μ 30 mm x 3.00 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A -> 2.5 min 30% A -> 3.0 min 5% A -> 4.5 min 5% A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min -> 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 50°C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 5 (HPLC):
Gerät: HP 1090 Serie II; Säule: Merck Chromolith SpeedROD RP-18e, 50 mm x 4.6 mm; Vorsäule: Merck Chromolith Guard Cartridge Kit RP-18e, 5 mm x 4.6 mm; Injektionsvolumen: 5 μΐ; Eluent A: 70% HC104 in Wasser (4 ml/Liter), Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0.00 min 20% B -> 0.50 min 20% B -> 3.00 min 90% B -> 3.50 min 90% B -> 3.51 min 20% B -> 4.00 min 20% B; Fluss: 5 ml/min; Säulentemperatur: 40°C.
Methode 6 (HPLC):
Gerät: Waters 2695 mit DAD 996; Säule: Merck Chromolith SpeedROD RP-18e, 50 mm x 4.6 mm; Vorsäule: Merck Chromolith Guard Cartridge Kit RP-18e, 5 mm x 4.6 mm; Eluent A: 70% HCIO4 in Wasser (4 ml/Liter), Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0.00 min 5% B -» 0.50 min 5% B -» 3.00 min 95% B -> 4.00 min 95% B; Fluss: 5 ml/min.
Methode 7 (LC-MS):
Gerätetyp MS : Waters ZQ; Gerätetyp HPLC: Agilent 1 100 Series; UV DAD; Säule : Thermo Hypersil GOLD 3μ 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 100% A -> 3.0 min 10% A -> 4.0 min 10% A -> 4.1 min 100% A (Fluss 2.5 ml/min); Ofen: 55°C; Fluss: 2 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 8 (LC-MS):
Gerätetyp MS : Waters ZQ; Gerätetyp HPLC : Agilent 1 100 Series; UV DAD; Säule : Thermo Hypersil GOLD 3μ 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 100% A -> 2.0 min 60% A -> 2.3 min 40% A -> 3.0 min 20% A -> 4.0 min 10% A -> 4.2 min 100% A (Fluss 2.5 ml/min); Ofen: 55°C; Fluss: 2 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 9 (LC-MS):
Instrument: Waters Acquity SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 mm x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 ml 99%-ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 ml 99%-ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 95% A -> 6.0 min 5% A -> 7.5 min 5% A; Ofen: 50°C; Fluss: 0.35 ml/min; UV-Detektion: 210-400 nm.
Methode 10 (HPLC):
Gerät: Agilent 1200 Series; Säule: Agilent Eclipse XDB-C 18 5μ 4.6 mm x 150 mm; Vorsäule: Phenomenex KrudKatcher Disposable Pre-Column; Injektionsvolumen: 5 μΐ; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01% Trifluoressigsäure; Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.01% Trifluoressigsäure; Gradient: 0.00 min 10% B -> 1.00 min 10% B -> 1.50 min 90% B -> 5.5 min 10% B; Fluss: 2 ml/min; Säulentemperatur: 30°C.
Methode 11 (LC-MS):
Instrument: Waters Acquity SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ 30 mm x 2 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 ml 99%-ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 ml 99%-ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A -> 1.2 min 5% A -> 2.0 min 5% A; Fluss: 0.60 ml/min; Ofen: 50°C; UV-Detektion: 208-400 nm.
Methode 12 (GC-MS):
Instrument: Micromass GCT, GC 6890; Säule: Restek RTX-35, 15 m x 200 μιη x 0.33 μιη; konstanter Fluss mit Helium: 0.88 ml/min; Ofen: 70°C; Inlet: 250°C; Gradient: 70°C, 30°C/min -> 310°C (3 min halten). Methode 13 (HR-MS):
Instrument: Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL; FTMS ESI positiv.
Für alle Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden nicht explizit beschrieben ist, gilt, dass sie von allgemein zugänglichen Quellen kommerziell bezogen wurden. Für alle übrigen Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden ebenfalls nicht beschrieben ist und die nicht kommerziell erhältlich waren oder von Quellen bezogen wurden, die nicht allgemein zugänglich sind, ist ein Verweis auf die veröffentlichte Literatur angegeben, in der ihre Herstellung beschrieben ist.
Ausgangsverbindungen und Intermediate: Ausgangsverbindung 1
(2i?,3i?)-3-[(25)-l-(teri.-Butoxycarbonyl)pyrrolidin-2-yl]-3-methoxy-2-methylpropansäure
(Boc-Dolaproin) Dicyclohexylamin-Salz
Die Titelverbindung kann auf verschiedenen Wegen nach Literaturvorschriften hergestellt werden, siehe z.B. Pettit et al, Synthesis 1996, 719; Shioiri et al., Tetrahedron Lett. 1991, 32, 931; Shioiri et al., Tetrahedron 1993, 49, 1913; Koga et al, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 2395; Vidal et al, Tetrahedron 2004, 60, 9715; Poncet et al, Tetrahedron 1994, 50, 5345. Sie wurde hier entspre- chend der Vorschrift von Shioiri et al. {Tetrahedron Lett. 1991, 32, 931) synthetisiert.
Ausgangsverbindung 2 teri.-Butyl-(3i?,4^,5^-3-methoxy-5-methyl-4-(methylamino)heptanoat-Hydrochlorid
(Dolaisoleucin-OtBu x HCl)
Die Titelverbindung kann auf verschiedenen Wegen nach Literaturvorschriften hergestellt werden, siehe z.B. Pettit et al , J. Org. Chem. 1994, 59, 1796; Koga et al, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 2395; Shioiri et al, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 931; Shioiri et al, Tetrahedron 1993, 49, 1913. Sie wurde hier entsprechend der Vorschrift von Koga et al. {Tetrahedron Lett. 1991, 32, 2395) synthetisiert.
Intermediat 1 teri.-Butyl-(3i?,45',55)-4-[{N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-valyl}(methyl)amino]-3-methoxy-5-methyl- heptanoat
425 mg (1.7 mmol) N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valin wurden in 50 ml DMF gelöst und nacheinander mit 500 mg (1.7 mmol) teri.-Butyl-(3i?,45',55)-3-methoxy-5-methyl-4-(methylamino)- heptanoat-Hydrochlorid (Ausgangsverbindung 2), 356 mg (1.9 mmol) l-(3-Dimethylaminopropyl)- 3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid, 285 mg (1.9 mmol) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol-Hydrat sowie 655 mg (5.1 mmol) N,N-Diisopropylethylamin versetzt. Die Mischung wurde 20 h bei RT gerührt. Anschließend wurden nochmals 142 mg (0.5 mmol) N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valin, 1 19 mg (0.6 mmol) l-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid, 95 mg (0.6 mmol) 1- Hydroxy-lH-benzotriazol-Hydrat sowie 218 mg (1.7 mmol) N,N-Diisopropylethylamin zugesetzt und die Mischung 90 min lang mit Ultraschall behandelt. Der Ansatz wurde dann in eine Mischung aus halbgesättigter wässriger Ammoniumchlorid-Lösung und Ethylacetat gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt, nacheinander mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 329 mg (40% d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl erhalten.
HPLC (Methode 5): R, = 2.5 min; LC-MS (Methode 1): R, = 1.45 min; MS (ESIpos): m/z = 493 (M+H)+.
Intermediat 2 teri.-Butyl-(3i?,45',55)-3-methoxy-5-methyl-4-[methyl(L-valyl)amino]heptanoat
500 mg (1 mmol) ter/1.-Butyl-(3i?,45',55)-4-[{N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-valyl}(methyl)amino]-3- methoxy-5-methylheptanoat (Intermediat 1) wurden in 50 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 100 mg 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 1 h lang bei RT unter Normaldruck hydriert. Der Kata- lysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man erhielt 370 mg (quant.) der Titelverbindung als nahezu farbloses Öl.
HPLC (Methode 5): R, = 1.59 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 0.74 min; MS (ESIpos): m/z = 359 (M+H)+. Intermediat 3
396 mg (1.1 mmol) N-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-N-methyl-L-valin wurden in 20 ml DMF gelöst und nacheinander mit 365 mg (1 mmol) teri.-Butyl-(3i?,45*,55)-3-methoxy-5-methyl-4- [methyl(L-valyl)amino]heptanoat (Intermediat 2), 234 mg (1.2 mmol) l-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimid-Hydrochlorid sowie 187 mg (1.2 mmol) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol-Hydrat versetzt. Die Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Der Ansatz wurde danach in eine Mischung aus halbgesättigter wässriger Ammoniumchlorid-Lösung und Ethylacetat gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt, nacheinander mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde direkt, ohne weitere Reinigung, in der nächsten Stufe eingesetzt.
Ausbeute: 660 mg (68% d. Th.) HPLC (Methode 5): R, = 3.0 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 1.61 min; MS (ESIpos): m/z = 694 (M+H)+. Intermediat 4 N-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-N-methyl-L-valyl-N-[(2i?,35',45)-l-carboxy-2-methoxy-4- methylhexan-3 -yl] -N-methyl-L-valinamid
650 mg (0.94 mmol) N-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?,4,S',51S)-l- fert.-butoxy-3-methoxy-5-methyl-l-oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid (Intermediat 3) wurden in 5 ml Dichlormethan aufgenommen, mit 5 ml Trifluoressigsäure versetzt und über Nacht bei RT gerührt. Anschließend wurde im Vakuum eingeengt und der verbliebene Rückstand durch präpa- rative HPLC gereinigt. Es wurden 430 mg (72% d. Th.) der Titelverbindung als farbloser Schaum erhalten.
HPLC (Methode 5): R, = 2.4 min; LC-MS (Methode 2): R, = 1.51 min; MS (ESIpos): m/z = 638 (M+H)+.
Intermediat 5
N-(teri.-Butoxycarbonyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(2i?,35',45)-l-carboxy-2-methoxy-4-methylhexan-3- yl] -N-methyl-L-valinamid
51 mg (0.08 mmol) N-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-N-methyl-L-valyl-N-[(2i?,3,S',41S)-l-carb- oxy-2-methoxy-4-methylhexan-3-yl]-N-methyl-L-valinamid (Intermediat 4) wurden in 10 ml DMF gelöst und mit 0.5 ml Piperidin versetzt. Nach 10 min Rühren bei RT wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und der Rückstand mit Diethylether verrührt. Die unlöslichen Bestandteile wurden abfiltriert und mehrfach mit Diethylether gewaschen. Dann wurde der Filter-Rückstand in 5 ml Dioxan/Wasser (1 : 1) aufgenommen und die Lösung mit 1 N Natronlauge auf pH 11 eingestellt. Unter Ultraschallbehandlung wurden in mehreren Portionen insgesamt 349 mg (1.6 mmol) Oi-tert - butyldicarbonat zugegeben, wobei der pH-Wert der Lösung bei 11 gehalten wurde. Nach Be- endigung der Reaktion wurde das Dioxan abgedampft und die wässrige Lösung mit Zitronensäure auf einen pH-Wert von 2-3 eingestellt. Man extrahierte zweimal mit je 50 ml Ethylacetat. Die organischen Phasen wurden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Diethylether aufgenommen und das Produkt mit Pentan ausgefällt. Durch Dekantieren wurde das Lösungsmittel abgetrennt. Der Rückstand wurde noch mehrmals mit Pentan digeriert und schließlich im Hochvakuum getrocknet. Es wurden so 31 mg (93% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 6): R, = 2.2 min;
LC-MS (Methode 2): R, = 1.32 min; MS (ESIpos): m/z = 516 (M+H)+. Intermediat 6
Benzyl-(2i?,3i?)-3-methoxy-2-methyl-3-[(25)-pyrrolidin-2-yl]propanoat Trifluoressigsäure-
Zunächst wurde (2i?,3i?)-3-[(25)-l-(teri.-Butoxycarbonyl)pyrrolidin-2-yl]-3-methoxy-2-methylpro- pansäure aus 1.82 g (3.88 mmol) des Dicyclohexylamin-Salzes (Ausgangsverbindung 1) durch Auf-
nehmen in 150 ml Ethylacetat und Ausschütteln mit 100 ml 0.5%-iger wässriger Schwefelsäure freigesetzt. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde in 10 ml Dioxan und 10 ml Wasser aufgenommen, mit 15 17 mg (4.66 mmol) Cäsiumcarbonat versetzt und 5 min im Ultraschallbad behandelt. Anschließend wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand einmal mit DMF co-destilliert. Der Rückstand wurde dann in 15 ml DMF aufgenommen und mit 1990 mg (1 1.64 mmol) Benzylbromid versetzt. Die Mischung wurde 15 min im Ultraschallbad behandelt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde zwischen Ethylacetat und Wasser verteilt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen und danach eingeengt. Der Rückstand wurde schließlich durch präparative HPLC gereinigt. Man erhielt auf diese Weise 1 170 mg (80% d. Th.) des Boc- geschützten Intermediats tert. -Butyl-(2<S)-2-[( \R,2R)-3 -(benzyloxy)- 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopro- pyl]pyrrolidin- 1 -carboxylat.
Sofort anschließend wurden diese 1 170 mg des Intermediats in 15 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 5 ml Trifluoressigsäure versetzt. Nach 15 min Rühren bei RT wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus Dioxan lyophilisiert. Nach Trocknen im Hochvakuum verblieben 1333 mg (84% d. Th.) der Titelverbindung als gelbes Öl.
HPLC (Methode 5): R, = 1.5 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 0.59 min; MS (ESIpos): m/z = 278 (M+H)+. Intermediat 7 N-(tert.-Butoxycarbonyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?,4,S*,51S)-l-{(21S)-2-[(li?,2i?)-2-carboxy-l- methoxypropyl]pyrrolidin- 1 -yl}-3 -methoxy-5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid
1200 mg (2.33 mmol) N-(ter/1.-Butoxycarbonyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(2i?,35',45)-l-carboxy-2-meth- oxy-4-methylhexan-3-yl] -N-methyl-L-valinamid (Intermediat 5) wurden mit 910.8 mg (2.33 mmol) Benzyl-(2i?,3i?)-3-methoxy-2-methyl-3-[(25)-pyrrolidin-2-yl]propanoat Trifluoressigsäure-Salz
(Intermediat 6), 1327 mg (3.49 mmol) 0-(7-Azabenzotriazol-l-yl)-NNN' N'-tetramethyluronium- hexafluorophosphat und 2027 μΐ NN-Diisopropylethylamin in 50 ml DMF zusammengegeben und 5
min bei RT gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der verbliebene Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen und nacheinander mit 5%-iger wässriger Zitronensäure-Lösung und gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde abgetrennt und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Die Produktfraktionen wurden vereinigt, eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden so 1000 mg (55% d. Th.) des Benzylester-Intermediats N-(teri.-Butoxy- carbonyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?,4,S*,51S)-l-{(21S)-2-[(li?,2i?)-3-(benzyloxy)-l-methoxy-2-methyl- 3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl}-3 -methoxy-5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid als ein Harz erhalten. LC-MS (Methode 1): R, = 1.56 min; MS (ESIpos): m/z = 775 (M+H)+.
Die gesamte erhaltene Menge dieses Intermediats wurde in 25 ml einer Mischung aus Methanol und Dichlormethan (20: 1) aufgenommen und die Benzylester-Gruppe durch Hydrierung unter Normaldruck mit 10% Palladium auf Aktivkohle als Katalysator entfernt. Nach 30 min Rühren bei RT wurde der Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Man erhielt 803 mg (91% d. Th.) der Titelverbindung als weißen Feststoff.
HPLC (Methode 5): R, = 2.1 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 1.24 min; MS (ESIpos): m/z = 685 (M+H)+. Intermediat 8
^-(teri. -Butoxycarbony^-N-methoxy-N-methyl-L-phenylalaninamid
1000 mg (3.77 mmol) N-(fert. -Butoxycarbonyl)-L-phenylalanin wurden in 10 ml Dichlormethan vorgelegt und mit 733 mg (4.52 mmol) Ι, Γ-Carbonyldiimidazol versetzt. Der Ansatz wurde 15 min bis zur Beendigung der Gasentwicklung gerührt. Anschließend wurde das Gemisch mit 441 mg (4.52 mmol) N, 0-Dimethylhydroxylamin-Hydrochlorid sowie 657 μΐ (3.77 mmol) N,N-Diisopropyl- ethylamin versetzt und 1 h bei RT gerührt. Danach wurde der Ansatz mit Dichlormethan verdünnt
und nacheinander mit destilliertem Wasser, 0.5 N Salzsäure und gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt, und die vereinigten wässrigen Phasen wurden mit Ethylacetat rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Man erhielt 1090 mg (93% d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): R, = 1.02 min; MS (ESIpos): m/z = 309 (M+H)+.
Intermediat 9 fert. -Butyl-[(2<S)-l-oxo-3-phenylpropan-2-yl]carbamat
1090 mg (3.5 mmol) ^-(teri. -Butoxycarbony^-N-methoxy-N-methyl-L-phenylalaninamid wurden in 20 ml 2-Methyltetrahydrofuran gelöst und auf 0°C gekühlt. Dann wurden langsam 4.2 ml (4.2 mmol) einer 1 M Lithiumaluminiumhydrid-Lösung in THF zugegeben und die Reaktionsmischung 30 min bei 0°C gerührt. Anschließend wurde vorsichtig 5%-ige wässrige Kaliumhydrogensulfat- Lösung zugesetzt. Der Ansatz wurde mit Wasser verdünnt und mit MTBE extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Man erhielt so 820 mg (94% d. Th.) der Titelverbindung.
GC-MS (Methode 12): R, = 5.61 min; MS (ESIpos): m/z = 220 (M-29)+
Ή-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.15-1.42 (m, 9H), 7.1 1-7.39 (m, 5H), 9.52 (s, 1H) [weitere Signale unter Lösungsmittel-Peaks verborgen] .
Intermediat 10 (2S,3Z)-l,5-Diphenylpent-3-en-2-amin Trifluoressigsäure-Salz
Unter Argon wurden zu einer Suspension von 986 mg (2.2 mmol) Triphenyl(2-phenylethyl)phospho- niumbromid [herstellbar z.B. nach R.W. Hartmann, M. Reichert, Archiv der Pharmazie 333. 145 (2000); K.C. Nicolaou et al, European J. Chem. 1, 467 (1995)] in 125 ml THF bei -78°C 842 μΐ (2.1 mmol) 2.5 M «-Butyllithium-Lösung in Hexan gegeben und die Mischung anschließend 1 h bei 0°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde danach wieder auf -78°C abgekühlt, und eine Lösung von 500 mg (2.0 mmol) fert. -Butyl-[(2<S)-l-oxo-3-phenylpropan-2-yl]carbamat in 5 ml trockenem THF wurde hinzugegeben. Der Ansatz wurde auf 0°C erwärmt und 3 h bei dieser Temperatur nachgerührt. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von gesättigter wässriger Ammoniumchlorid- Lösung abgebrochen. Das Gemisch wurde mit MTBE verdünnt, die Phasen wurden getrennt, und die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde über eine Kieselgelsäule mit dem Laufmittel Cyclohexan/Ethylacetat 5 : 1 gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen wurden 173 mg (25.6% d. Th.) des Boc-geschützten Intermediats tert. -Butyl-[(25*, 3Z)-l,5-diphenylpent-3-en-2-yl]carbamat erhalten. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.16-1.46 (m, 9H), 2.62 (dd, J = 13.20 Hz, 7.34 Hz, 1H), 2.73-3.18 (m, 1H), 4.56 (t, J = 7.46 Hz, 1H), 5.27-5.57 (m, 1H), 6.98-7.32 (m, 10H) [weitere Signale unter Lösungsmittel-Peaks verborgen] .
173 mg (512 μιηοΐ) des Intermediats tert. -Butyl-[(25',3Z)-l,5-diphenylpent-3-en-2-yl]carbamat wurden in 16 ml Dichlormethan vorgelegt, mit 4 ml Trifluoressigsäure versetzt und 30 min bei RT stehen gelassen. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch eingeengt und der Rückstand im Vakuum getrocknet. Es wurden 180 mg (99% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, = 0.74 min; MS (ESIpos): m/z = 238 (M+H)+
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 2.64-2.83 (m, 1H), 2.88-3.02 (m, 1H), 3.05-3.22 (m, 2H), 4.00-4.55 (m, 1H), 5.16-5.46 (m, 1H), 5.48-5.78 (m, 1H), 6.60-6.89 (m, 2H), 7.14 (s, 3H), 7.22-7.36 (m, 5H), 7.89-8.27 (m, 2H).
Intermediat 11
(2S)- 1 -(Benzylsulfonyl)-3 -phenylpropan-2-amin
200 mg (1.13 mmol) (4<S)-4-Benzyl-l,3-oxazolidin-2-on wurden in 3 ml fert.-Butanol vorgelegt und mit 280 mg (2.26 mmol) Benzylmercaptan versetzt. Das Gemisch wurde anschließend 2 Tage unter Rückfluss erhitzt. Danach wurde der Ansatz am Rotationsverdampfer eingeengt und das erhaltene Intermediat (2<S)-l-(Benzylsulfanyl)-3-phenylpropan-2-amin ohne Aufarbeitung direkt weiter umgesetzt.
HPLC (Methode 10): R, = 2.63 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 0.67 min; MS (ESIpos): m/z = 258 (M+H)+.
Das oben erhaltene rohe Intermediat wurde in einer Lösung von 2 ml 30%-igem Wasserstoffperoxid und 5 ml Ameisensäure gelöst und 12 h bei RT gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch auf gesättigte wässrige Natriumsulfat-Lösung gegeben und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Das erhaltene Rohprodukt wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Es wurden so 343 mg (61 % d. Th.) der Titelverbindung erhalten. HPLC (Methode 10): R, = 2.40 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 0.65 min; MS (ESIpos): m/z = 290 (M+H)+.
Intermediat 12
(2S,3Z)- 1 ,4-Diphenylbut-3 -en-2-amin
552.7 mg (9.85 mmol) Kaliumhydroxid wurden in Methanol gelöst, auf 1.1 g neutrales Aluminiumoxid aufgezogen und dann im Hochvakuum getrocknet. Zu einer Lösung von 240 mg (0.82 mmol) (2<S)-l-(Benzylsulfonyl)-3-phenylpropan-2-amin und 1.56 g des so präparierten Kaliumhydroxid auf
Aluminiumoxid in 6.2 ml «-Butanol wurden bei 5-10°C 307 μΐ (3.3 mmol) Dibrom-difluormethan getropft. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei RT gerührt, dann über Celite filtriert und der Rückstand gut mit Dichlormethan nachgewaschen. Das Filtrat wurde eingeengt und der resultierende Rückstand im Vakuum getrocknet. Das so erhaltene Rohprodukt wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Es wurden 98 mg (35% d. Th.) der Titelverbindung mit einem E/Z- Diastereomerenverhältnis von 4: 1 erhalten.
HPLC (Methode 10): R, = 2.46 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 0.75 min; MS (ESIpos): m/z = 224 (M+H)+.
Das oben erhaltene £7Z-Diastereomerengemisch wurde in 2 ml Ethanol und 0.2 ml N,N-Diisopropyl- ethylamin gelöst und über HPLC an chiraler Phase aufgetrennt [Säule: Daicel Chiralpak AD-H, 5 μπι, 250 mm x 20 mm; Eluent: Hexan (Ethanol + 0.2% Diethylamin) 50:50 v/v; UV-Detektion: 220 nm; Temperatur: 30°C]. Die entsprechenden Fraktionen wurden am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand im Vakuum getrocknet. Es wurden 10 mg der Titelverbindung als reines Z- Isomer erhalten. Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 2.71 (d, J = 6.60 Hz, 2H), 3.73-3.95 (m, 1H), 5.42- 5.67 (m, 1H), 6.21-6.50 (m, 1H), 7.08-7.38 (m, 10H) [weitere Signale unter Lösungsmittel-Peaks verborgen] .
Intermediat 13
(2S,3E)- 1 ,4-Diphenylbut-3 -en-2-amin
Die Titelverbindung (reines E-Isomer) wurde im Zuge der bei Intermediat 12 beschriebenen chromatographischen Diastereomerentrennung an chiraler Phase in einer Ausbeute von 45 mg erhalten.
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 2.62-2.83 (m, 2H), 3.52-3.71 (m, 1H), 6.18-6.30 (m, 1H), 6.34-6.46 (m, 1H), 6.98-7.57 (m, 10H) [weitere Signale unter Lösungsmittel-Peaks verborgen].
Intermediat 14
( l<S)-2-Phenyl- 1 -(5 -phenyl- 1 ,3 ,4-oxadiazol-2-yl)ethanamin Trifluoressigsäure-Salz
200 mg (0.75 mmol) N-(fert. -Butoxycarbonyl)-L-phenylalanin wurden bei 0°C in 5.5 ml Dichlor- methan vorgelegt und mit 128 mg (0.79 mmol) Ι, Γ-Carbonyldiimidazol versetzt. Nach 30 min wurden 103 mg (0.75 mmol) Benzoylhydrazid zugegeben. Nach weiteren 45 min bei 0°C wurden schließlich 500 mg (1.5 mmol) Tetrabromkohlenstoff und 395 mg (1.5 mmol) Triphenylphosphin hinzugefügt. Der Ansatz wurde zunächst 2 h bei 0°C und dann über Nacht bei RT nachgerührt. Das Gemisch wurde anschließend am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand im Hochvaku- um getrocknet. Das so erhaltene Rohprodukt wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Es wurden 217 mg (78% d. Th.) des Boc-geschützten Intermediats fert. -Butyl-[(liS)-2-phenyl-l-(5-phenyl- l,3,4-oxadiazol-2-yl)ethyl]carbamat erhalten.
HPLC (Methode 10): R, = 3.01 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 1.15 min; MS (ESIpos): m/z = 366 (M+H)+. 217 mg (0.59 mmol) dieses Intermediats wurden in 3 ml Dichlormethan aufgenommen, mit 0.6 ml Trifluoressigsäure versetzt und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurde im Vakuum eingeengt. Der verbliebene Rückstand wurde im Vakuum weiter getrocknet und dann aus Dioxan lyophilisiert. Auf diese Weise wurden 214 mg (90% d. Th.) der Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten.
HPLC (Methode 10): R, = 2.43 min; LC-MS (Methode 1 1): R, = 0.62 min; MS (ESIpos): m/z = 266 (M+H)+.
Intermediat 15
( lR)-2 -Phenyl- 1 -(5 -phenyl- 1 ,3 ,4-oxadiazol-2-yl)ethanamin Trifluoressigsäure-Salz
200 mg (0.75 mmol) N-(fert. -Butoxycarbonyl)-D-phenylalanin wurden bei 0°C in 5.5 ml Dichlormethan vorgelegt und mit 128.3 mg (0.79 mmol) Ι, Γ-Carbonyldiimidazol versetzt. Nach 30 min wurden 103 mg (0.75 mmol) Benzoylhydrazid zugegeben. Nach weiteren 45 min bei 0°C wurden schließlich 500 mg (1.5 mmol) Tetrabromkohlenstoff und 395 mg (1.5 mmol) Triphenylphosphin hinzugefügt. Der Ansatz wurde zunächst 2 h bei 0°C und dann über Nacht bei RT nachgerührt. Das Gemisch wurde anschließend am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Das so erhaltene Rohprodukt wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Es wurden 219 mg (80% d. Th.) des Boc-geschützten Intermediats fert. -Butyl-[(li?)-2-phenyl-l-(5-phenyl- l,3,4-oxadiazol-2-yl)ethyl]carbamat erhalten.
HPLC (Methode 10): R, = 3.01 min;
LC-MS (Methode 2): R, = 1.36 min; MS (ESIpos): m/z = 366 (M+H)+.
219 mg (0.6 mmol) dieses Intermediats wurden in 3 ml Dichlormethan aufgenommen, mit 0.6 ml Trifluoressigsäure versetzt und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurde im Vakuum eingeengt. Der verbliebene Rückstand wurde im Vakuum weiter getrocknet und dann aus Dioxan lyophilisiert. Auf diese Weise wurden 196 mg (86% d. Th.) der Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten.
HPLC (Methode 10): R, = 2.41 min.
Intermediat 16
Methyl-4-[( lE,3<S)-3-amino-4-phenylbut- 1 -en- 1 -yl]benzoat Trifluoressigsäure-Salz
0.9 mg (4 μιηοΐ) Palladiumacetat wurden in 5 ml DMF vorgelegt und nacheinander mit 20.8 mg (97 μιηοΐ) Methyl-4-brombenzoat, 20 mg (81 μιηοΐ) (S)-tert. -Butyl l-phenylbut-3-en-2-ylcarbamat, 1.1 mg (8 μιηοΐ) Phenylharnstoff sowie 11.2 mg (81 μιηοΐ) Kaliumcarbonat versetzt. Die Reak- tionsmischung wurde anschließend 15 min bei 160°C in einer Mikrowellenapparatur (Emrys™ Opti- mizer) gerührt. Das Gemisch wurde danach filtriert und das Filtrat über präparative HPLC (Eluent: Methanol/Wasser-Gradient mit 0.1% TFA) in seine Komponenten aufgetrennt. Man erhielt so 21.3 mg (68% d. Th.) der Titelverbindung.
HPLC (Methode 10): R, = 3.23 min; LC-MS (Methode 11): R, = 1.32 min; MS (ESIpos): m/z = 382 (M+H)+.
Intermediat 17
N-Methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4S, 55) - 1 - { (25)-2-[( \R,2R)-3 - { [(2S, 3Z)- 1 ,5 -diphenylpent-3 -en-2-yl] - amino} - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl}-3 -methoxy-5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] - N-methyl-L-valinamid Trifluoressigsäure-Salz
15 mg (22 μιηοΐ) N-(tert. -Butoxycarbonyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?,4,S*, 51S)-l-{(21S)-2-[(li?,2i?)-2- carboxy- 1 -methoxypropyl]pyrrolidin- 1 -yl}-3 -methoxy-5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L- valinamid (Intermediat 7) wurden in 750 μΐ DMF vorgelegt und mit 11.44 μΐ (66 μιηοΐ) NN-Diiso-
propylethylamin sowie 10 mg (26 μιηοΐ) HATU versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 8.5 mg (24 μιηοΐ) (25, 3Z)-l,5-Diphenylpent-3-en-2-amin Trifluoressigsäure- Salz (Intermediat 10) zugegeben und der Ansatz über Nacht bei RT gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde danach direkt durch präparative HPLC in seine Komponenten aufgetrennt. Es wurden 18.1 mg (91% d. Th.) des Boc-geschützten Intermediats N-(fert. -Butoxycarbonyl)-N-methyl-L-valyl-N- [(3R, 4S, 55) - 1 - { (25)-2-[( \R,2R)-3 - { [(2S, 3Z)- 1 ,5 -diphenylpent-3 -en-2-yl]amino} - 1 -methoxy-2- methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl}-3 -methoxy-5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid in Form eines weißen Feststoffs erhalten.
HPLC (Methode 10): R, = 4.74 min; LC-MS (Methode 1 1): R, = 1.58 min; MS (ESIpos): m/z = 905 (M+H)+.
16 mg (18 μιηοΐ) dieses Intermediats wurden in 1 ml Dichlormethan aufgenommen, mit 0.2 ml Trifluoressigsäure versetzt und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurde im Vakuum eingeengt. Der verbliebene Rückstand wurde im Vakuum weiter getrocknet und dann aus Dioxan lyophilisiert. Auf diese Weise wurden 15.8 mg (97% d. Th.) der Titelverbindung erhalten. HPLC (Methode 10): R, = 2.66 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 1.03 min; MS (ESIpos): m/z = 805 (M+H)+.
Intermediat 18
N-Methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4S, 5S)- 1 - { (2S)-2-[( IR, 2R)-3 - { [(2S, 3Z)-\ ,4-diphenylbut-3 -en-2-yl]amino} - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl}-3 -methoxy-5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N- methyl-L-valinamid Trifluoressigsäure-Salz
x CF3COOH
Zunächst wurde N-(tert. -Butoxycarbonyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4,S*, 51S)-l-{(21S)-2-[(li?, 2i?)-3- { [(2S, 3Z)-\ ,4-diphenylbut-3 -en-2-yl]amino} - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl}-3 -
methoxy-5 -methyl- l-oxoheptan-4-yl]-N-methyl-L-valinamid in Analogie zur Synthese von Inter- mediat 17 durch Umsetzung von 20 mg (29 μιηοΐ) N-(fert.-Butoxycarbonyl)-N-methyl-L-valyl-N- [(3R, 4S, 5S)- 1 - { (2<S)-2-[( \R, 2i?)-2-carboxy- 1 -methoxypropyl]pyrrolidin- 1 -yl} -3 -methoxy-5 -methyl- l-oxoheptan-4-yl]-N-methyl-L-valinamid (Intermediat 7) mit 7.1 mg (32 μιηοΐ) (25*, 3Z)-1,4-Di- phenylbut-3-en-2-amin (Intermediat 12) hergestellt.
Ausbeute: 9.2 mg (35% d. Th.)
HPLC (Methode 10): R, = 4.52 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 1.54 min; MS (ESIpos): m/z = 891 (M+H)+.
Durch nachfolgende Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure erhielt man dann 9.5 mg (99% d. Th.) der Titelverbindung.
HPLC (Methode 10): R, = 2.58 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 0.97 min; MS (ESIpos): m/z = 791 (M+H)+. Intermediat 19
N-Methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4S, 5S)- 1 - { (2S)-2-[( \R,2R)-3 - { [(2S, 3E)- 1 ,4-diphenylbut-3 -en-2-yl] - amino} - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl} -3 -methoxy-5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] - N-methyl-L-valinamid Trifluoressigsäure-Salz
Zunächst wurde N-(tert. -Butoxycarbonyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?,4,S*, 51S)-l-{(21S)-2-[(li?,2i?)-3- { [(2S, 3E)- 1 ,4-diphenylbut-3 -en-2-yl]amino} - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl} -3 - methoxy-5 -methyl- l-oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid in Analogie zur Synthese von Intermediat 17 durch Umsetzung von 20 mg (29 μιηοΐ) N-(fert.-Butoxycarbonyl)-N-methyl-L-valyl-N- [(3R, 4S, 5S)- 1 - { (2<S)-2-[( \R, 2i?)-2-carboxy- 1 -methoxypropyl]pyrrolidin- 1 -yl} -3 -methoxy-5 -methyl-
l-oxoheptan-4-yl]-N-methyl-L-valinamid (Intermediat 7) mit 7.1 mg (32 μιηοΐ) (25*, 3£)-l,4-Di- phenylbut-3-en-2-amin (Intermediat 13) hergestellt.
Ausbeute: 15.1 mg (58% d. Th.)
HPLC (Methode 10): R, = 4.2 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 1.51 min; MS (ESIpos): m/z = 891 (M+H)+.
Durch nachfolgende Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure erhielt man dann 15.7 mg (99% d. Th.) der Titelverbindung.
HPLC (Methode 10): R, = 2.62 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 0.97 min; MS (ESIpos): m/z = 791 (M+H)+. Intermediat 20
N-Methyl-L-valyl-N-[(3i?, 45, 55)- 1 - { (25)-2-[( IR, 2R)-3 - { [(2S)- 1 -(benzylsulfonyl)-3 -phenylpropan-2- yljamino} - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl}-3 -methoxy-5 -methyl- 1 -oxoheptan-4- yl] -N-methyl-L-valinamid Trifluoressigsäure-Salz
Zunächst wurde N-(tert. -Butoxycarbonyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?,4,S*, 51S)-l-{(21S)-2-[(li?,2i?)-3- { [(2<S)- 1 -(benzylsulfonyl)-3 -phenylpropan-2 -yl]amino} - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- l-yl}-3-methoxy-5-methyl-l-oxoheptan-4-yl]-N-methyl-L-valinamid in Analogie zur Synthese von Intermediat 17 durch Umsetzung von 20 mg (29 μιηοΐ) N-(fert.-Butoxycarbonyl)-N-methyl-L-valyl- N-[(3R, 45, 55)- 1 - { (25)-2-[( IR, 2i?)-2-carboxy- 1 -methoxypropyl]pyrrolidin- 1 -yl}-3 -methoxy-5 - methyl- l-oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid (Intermediat 7) mit 9.3 mg (20 μιηοΐ) (25)- 1- (Benzylsulfonyl)-3 -phenylpropan-2 -amin (Intermediat 11) hergestellt.
Ausbeute: 19.2 mg (68% d. Th.)
HPLC (Methode 10): R, = 3.5 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 1.41 min; MS (ESIpos): m/z = 957 (M+H)+.
Durch nachfolgende Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure erhielt man dann 19.3 mg (99% d. Th.) der Titelverbindung. HPLC (Methode 10): R, = 2.52 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 857 (M+H)+.
Intermediat 21
N-Methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4S, 55)-3 -methoxy- 1 - { (2S)-2-[( 1R,2R) - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxo-3 - { [( l<S)-2-phenyl- 1 -(5-phenyl- 1 ,3,4-oxadiazol-2-yl)ethyl]amino}propyl]pyrrolidin- 1 -yl} -5-methyl- 1 - oxoheptan-4-yl]-N-methyl-L-valinamid Trifluoressigsäure-Salz
Zunächst wurde N-(tert. -Butoxycarbonyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4S, 5S)-3 -methoxy- 1 - { (2S)-2- [( \R, 2R)- 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxo-3 - { [( 15)-2-phenyl- 1 -(5 -phenyl- 1 ,3 ,4-oxadiazol-2-yl)ethyl] - amino}propyl]pyrrolidin-l-yl}-5-methyl-l-oxoheptan-4-yl]-N-methyl-L-valinamid in Analogie zur Synthese von Intermediat 17 durch Umsetzung von 20 mg (29 μιηοΐ) N-(tert. -Butoxycarbonyl)-N- methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4S, 55) - 1 - { (25)-2-[( IR, 2i?)-2-carboxy- 1 -methoxypropyl]pyrrolidin- 1 -yl} -3 - methoxy-5-methyl-l-oxoheptan-4-yl]-N-methyl-L-valinamid (Intermediat 7) mit 12.2 mg (32 μιηοΐ) (15)-2-Phenyl-l-(5-phenyl-l,3,4-oxadiazol-2-yl)ethanamin Trifluoressigsäure-Salz (Intermediat 14) hergestellt.
Ausbeute: 22 mg (81% d. Th.) HPLC (Methode 10): R, = 3.74 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 1.45 min; MS (ESIpos): m/z = 933 (M+H)
Durch nachfolgende Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure wurden dann 22.4 mg (98% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 10): R, = 2.52 min;
LC-MS (Methode 1 1): R, = 0.85 min; MS (ESIpos): m/z = 833 (M+H)+. Intermediat 22
N-Methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4S, 55)-3 -methoxy- 1 - { (2S)-2-[( IR, 2R)- 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxo-3 - { [( \R)-2 -phenyl- 1 -(5-phenyl- 1 ,3,4-oxadiazol-2-yl)ethyl]amino}propyl]pyrrolidin- 1 -yl} -5-methyl- 1 - oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid Trifluoressigsäure-Salz
x CF3COOH Zunächst wurde N-(teri. -Butoxycarbonyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?, 45', 55)-3-methoxy-l-{(25)-2- [( \R, 2R)- 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxo-3 - { [( li?)-2-phenyl- 1 -(5 -phenyl- 1 ,3 ,4-oxadiazol-2-yl)ethyl] - amino}propyl]pyrrolidin-l-yl}-5-methyl-l-oxoheptan-4-yl]-N-methyl-L-valinamid in Analogie zur Synthese von Intermediat 17 durch Umsetzung von 20 mg (29 μιηοΐ) N-(fert.-Butoxycarbonyl)-N- methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4S, 55) - 1 - { (25)-2-[( IR, 2i?)-2-carboxy- 1 -methoxypropyl]pyrrolidin- 1 -yl} -3 - methoxy-5-methyl-l-oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid (Intermediat 7) mit 12.2 mg (32 μιηοΐ) ( \R)-2 -Phenyl- 1 -(5 -phenyl- 1 ,3 ,4-oxadiazol-2-yl)ethanamin Trifluoressigsäure-Salz (Intermediat 15) hergestellt.
Ausbeute: 17 mg (64% d. Th.) HPLC (Methode 10): R, = 3.74 min; LC-MS (Methode 1): R, = 1.45 min; MS (ESIpos): m/z = 933 (M+H)+.
Durch nachfolgende Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure erhielt man dann 17.1 mg (99% d. Th.) der Titelverbindung.
HPLC (Methode 10): R, = 2.55 min;
LC-MS (Methode 1 1): R, = 0.85 min; MS (ESIpos): m/z = 833 (M+H)
Intermediat 23
N-Methyl-L-valyl-N-[(3i?, AS, 5S)-3 -methoxy- 1 - { (2S)-2-[( IR, 2R)- 1 -methoxy-3 -( { (2S, 3E)-A-[A- (methoxycarbonyl)phenyl] - 1 -phenylbut-3 -en-2-yl} amino)-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl} -5 - methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid Trifluoressigsäure-Salz
Zunächst wurde N-(tert. -Butoxycarbonyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?, AS, 5S)-3 -methoxy- 1 - { (2S)-2- [( \R, 2R)- 1 -methoxy-3 -( { (25*,3£)-4-[4-(methoxycarbonyl)phenyl] - 1 -phenylbut-3 -en-2-yl} amino)-2- methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl} -5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid in Analogie zur Synthese von Intermediat 17 durch Umsetzung von 20 mg (29 μιηοΐ) N-(fert.-Butoxycarbonyl)- N-methyl-L-valyl-N-[(3i?, AS, 5S)- \-{(2S)-2-[( \R, 2i?)-2-carboxy- 1 -methoxypropyl]pyrrolidin- 1 -yl} - 3 -methoxy-5 -methyl- l-oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid (Intermediat 7) mit 12.7 mg (32 μιηοΐ) Methyl-4-[(lii, 35)-3-amino-4-phenylbut-l-en-l-yl]benzoat Trifluoressigsäure-Salz (Intermediat 16) hergestellt. Ausbeute: 8.8 mg (32% d. Th.)
LC-MS (Methode 1): R, = 1.53 min; MS (ESIpos): m/z = 949 (M+H)+.
Durch nachfolgende Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure erhielt man dann 8 mg (90% d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, = 1.00 min; MS (ESIpos): m/z = 849 (M+H)
Intermediat 24
N-Me l-L-valyl-N-[(3R,4S^
2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl}-3 -methoxy-5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L- valinamid Trifluoressigsäure-Salz
Zu einer Lösung von 100 mg (146 μιηοΐ) N-(tert.-B toxycarbonyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3R, 4S, 5S)- 1 - { (2<S)-2-[( \R, 2i?)-2-carboxy- 1 -methoxypropyl]pyrrolidin- 1 -yl}-3 -methoxy-5 -methyl- 1 -oxoheptan- 4-yl]-N-methyl-L-valinamid (Intermediat 7) in 30 ml DMF wurden bei RT 76 μΐ (438 μιηοΐ) Ν,Ν- Diisopropylethylamin, 83 mg (219 μmol) HATU sowie 26 mg (161 μιηοΐ) 2-(lH-Indol-3- yl)ethanamin gegeben. Die Mischung wurde 15 min lang bei RT gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum eingeengt und der Rückstand über präparative HPLC in seine Komponenten aufgetrennt. Es wurden 101 mg (83% d. Th.) des Boc-geschützten Intermediats N- (tert. -Butoxycarb(myl)-N-melhyl-L-valyl-N-[(3R,4S,55) - 1 - { (25)-2-[( \R,2R)-3 - { [2-( lH-indol-3 -yl)- ethyl] amino } - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl } -3 -methoxy-5 -methyl- 1 -oxoheptan- 4-yl]-N-methyl-L-valinamid erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, = 1.32 min; m/z = 828 (M+H)+.
101 mg (122 μιηοΐ) dieses Intermediats wurden in 15 ml Dichlormethan aufgenommen, mit 1 ml Trifluoressigsäure versetzt und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurde im Vakuum eingeengt und der verbliebene Rückstand aus Wasser/Acetonitril lyophilisiert. Auf diese Weise wurden 108 mg der Titelverbindung in quantitativer Ausbeute als farbloser Schaum erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, = 0.84 min; MS (ESIpos): m/z = 728 (M+H)+.
Intermediat 25
N-Methyl-L-valyl-N- { (3R,4S,5S)-3 -methoxy- 1 - [(2S)-2 - { ( 1R,2R) - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxo-3 - [(2-phenylethyl)amino]propyl}pyrrolidin- 1 -yl] -5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl} -N-methyl-L-valinamid Trifluoressigsäure-Salz
Die Titelverbindung wurde in Analogie zur Synthese von Intermediat 24 über zwei Stufen ausgehend von 60 mg (88 μιηοΐ) des Intermediats 7 durch Kupplung mit 10 mg (88 μιηοΐ) 2-Phenylethanamin und anschließende Boc-Abspaltung mit Trifluoressigsäure hergestellt. Es wurden 34 mg (97% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 5): R, = 2.71 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 0.80 min; MS (ESIpos): m/z = 689 (M+H)
Ausführungsbeispiele:
Beispiel 1
N-(3 -Carboxypropyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4S, 5S)- 1 - { (2S)-2-[( \R, 2R)-3 - { [(2S, 3Z)- 1 ,5 - diphenylpent-3 -en-2-yl] amino } - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl } -3 -methoxy-5 - methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid
14.5 mg (16 μηιοΐ) N-Methyl-L-valyl-N-[(3i?,4,S*, 51S)-l-{(21S)-2-[(li?,2i?)-3-{[(21S*, 3Z)-l,5-diphenyl- pent-3 -en-2-yl] amino } - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl } -3 -methoxy-5 -methyl- 1 - oxoheptan-4-yl]-N-methyl-L-valinamid Trifluoressigsäure-Salz (Intermediat 17) wurden in 1 ml Dioxan/Wasser (1 : 1) gelöst und mit 20.4 μΐ (32 μιηοΐ) einer 15%-igen wässrigen Lösung von 4-Oxobutansäure versetzt. Der Ansatz wurde anschließend 1 h bei 100°C gerührt. Nach Abkühlen auf RT wurden 1.1 mg (17 μιηοΐ) Natriumcyanoborhydrid zugegeben und die Mischung durch Zugabe von etwa 150 μΐ 0.1 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt. Der Ansatz wurde danach weitere 2 h bei 100°C gerührt. Nach Abkühlen wurden erneut 21 μΐ (32 μιηοΐ) der 15%-igen 4-Oxobutansäure-Lösung zugesetzt und der Ansatz wiederum 1 h bei 100°C gerührt. Dann wurden weitere 1.1 mg (17 μιηοΐ) Natriumcyanoborhydrid zugegeben und anschließend mit etwa 300 μΐ 0.1 N Salzsäure der pH-Wert wieder auf 3 eingestellt. Der Ansatz wurde danach erneut 2 h bei 100°C gerührt. Bei immer noch nicht vollständiger Umsetzung wurde diese Prozedur noch ein weiteres Mal wiederholt. Der Ansatz wurde schließlich eingeengt und das Rohprodukt mittels präparativer HPLC gereinigt und aus Dioxan lyophilisiert. Es wurden so 13.1 mg (93% d. Th.) der Titelverbindung in Form eines weißen Feststoffs erhalten.
HPLC (Methode 10): R, = 2.63 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 1.01 min; MS (ESIpos): m/z = 891 (M+H)+.
Beispiel 2
N-(3 -Carboxypropyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4S, 5S)- 1 - { (2S)-2-[( IR, 2R)-3 - { [(2S, 3Z)- 1 ,4- diphenylbut-3 -en-2-yl] amino } - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl } -3 -methoxy-5 - methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid
9 mg (10 μιηοΐ) N-Methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4,S*, 51S)-l-{(21S)-2-[(li?, 2i?)-3-{ [(21S*, 3Z)-l,4-diphenylbut- 3 -en-2-yl] amino } - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl } -3 -methoxy-5 -methyl- 1 -oxo- heptan-4-yl]-N-methyl-L-valinamid Trifluoressigsäure-Salz (Intermediat 18) wurden in 0.6 ml DioxanAVasser (1 : 1) gelöst und analog zur Herstellung von Beispiel 1 mit 15%-iger wässriger Lösung von 4-Oxobutansäure in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid umgesetzt. Nach Lyophilisaten aus Dioxan wurden 5.6 mg (64% d. Th.) der Titelverbindung in Form eines weißen Feststoffs erhalten.
HPLC (Methode 10): R, = 2.61 min;
LC-MS (Methode 1 1): R, = 0.94 min; MS (ESIpos): m/z = 877 (M+H)+; HR-MS (Methode 13): m z = 876.5.
Beispiel 3
N-(3 -Carboxypropyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4S, 5S)- 1 - { (2S)-2-[( IR, 2R)-3 - { [(2S, 3E)- 1 ,4- diphenylbut-3 -en-2-yl] amino } - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl } -3 -methoxy-5 - methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid
15.5 mg (10 μιηοΐ) N-Methyl-L-valyl-N-[(3i?,4,S*, 51S)-l-{(21S)-2-[(li?,2i?)-3-{[(21S*, 3£)-l,4-diphenyl- but-3 -en-2-yl] amino } - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl } -3 -methoxy-5 -methyl- 1 -oxo- heptan-4-yl]-N-methyl-L-valinamid Trifluoressigsäure-Salz (Intermediat 19) wurden in 1.0 ml DioxanAVasser (1 : 1) gelöst und analog zur Herstellung von Beispiel 1 mit 15%-iger wässriger Lösung von 4-Oxobutansäure in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid umgesetzt. Nach Lyophi- lisation aus Dioxan wurden 10.3 mg (68% d. Th.) der Titelverbindung in Form eines weißen Feststoffs erhalten.
HPLC (Methode 10): R, = 2.59 min; LC-MS (Methode 11): R, = 0.94 min; MS (ESIpos): m/z = 877 (M+H)+; HR-MS (Methode 13): m z = 876.6; i-NMR ^OO MHz, Dichlormethan-d2): δ [ppm] = 0.72-1.21 (m, 18H), 1.23-1.47 (m, 3H), 1.51- 2.22 (m, 8H), 2.25-2.54 (m, 5H), 2.65-2.86 (m, 2H), 2.90-3.47 (m, 16H), 3.53-4.46 (m, 6H), 4.71- 5.27 (m, 4H), 5.46-5.72 (m, 1H), 6.10-6.36 (m, 1H), 6.44-6.67 (m, 2H), 7.03-7.67 (m, 10H), 9.13 (br. s, 1H).
Beispiel 4
N-(3 -Carboxypropyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4S, 55) - 1 - { (25)-2-[( IR, 2R)-3 - { [(2S)- 1 -(benzyl- sulfonyl)-3 -phenylpropan-2-yl]amino} - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl} -3 - methoxy-5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid
19.3 mg (20 μιηοΐ) N-Methyl-L-valyl-N-[(3i?,4,S*, 51S)-l-{(21S)-2-[(li?,2i?)-3-{[(21S)-l-(benzylsulfo- nyl)-3 -phenylpropan-2-yl]amino} - 1 -methoxy-2 -methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl}-3 -methoxy-5 - methyl-l-oxoheptan-4-yl]-N-methyl-L-valinamid Trifluoressigsäure-Salz (Intermediat 20) wurden in 1.2 ml DioxanAVasser (1 : 1) gelöst und analog zur Herstellung von Beispiel 1 mit 15%-iger wässriger Lösung von 4-Oxobutansäure in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid umgesetzt. Nach Lyophilisation aus Dioxan wurden 8.6 mg (45% d. Th.) der Titelverbindung in Form eines weißen Feststoffs erhalten.
LC-MS (Methode 11): R, = 0.85 min; MS (ESIpos): m/z = 943 (M+H)+; HR-MS (Methode 13): m z = 942.6; i-NMR ^OO MHZ, Dichlormethan-d2): δ [ppm] = 0.72-1.23 (m, 18H), 1.26-1.56 (m, 2H), 1.60- 1.94 (m, 4H), 1.95-2.17 (m, 3H), 2.22-2.54 (m, 5H), 2.69-2.87 (m, 2H), 2.90-3.27 (m, 11H), 3.31- 3.53 (m, 8H), 3.58-4.20 (m, 7H), 4.25-4.54 (m, 3H), 4.59-5.15 (m, 4H), 6.22 (br. s, 1H), 6.97-8.00 (m, 10H), 9.13 (br. s, 1H). Beispiel 5
N-(3 -Carboxypropyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4S, 55)-3 -methoxy- 1 - { (2S)-2-[( IR, 2R)- 1 -methoxy-2- methyl-3-oxo-3-{[(15)-2-phenyl-l-(5-phenyl-l,3,4-oxadiazol-2-yl)ethyl]amino}propyl]pyrrolidin-l- yl } -5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid
22.4 mg (24 μιηοΐ) N-Methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4,S
*, 5
1S)-3-methoxy-l-{(2
1S)-2-[(li?, 2i?)-l-methoxy-2- methyl-3-oxo-3-{ [(l^-2-phenyl-l-(5-phenyl-l,3,4-oxadiazol-2-yl)ethyl]amino}propyl]pyrrolidin-l- yl}-5-methyl-l-oxoheptan-4-yl]-N-methyl-L-valinamid Trifluoressigsäure-Salz (Intermediat 21 ) wurden in 1.4 ml DioxanAVasser (1 : 1) gelöst und analog zur Herstellung von Beispiel 1 mit 15%- iger wässriger Lösung von 4-Oxobutansäure in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid umgesetzt. Nach Lyophilisation aus Dioxan wurden 8.2 mg (38% d. Th.) der Titelverbindung in Form eines weißen Feststoffs erhalten.
HPLC (Methode 10): R, = 2.54 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 0.94 min; MS (ESIpos): m/z = 919 (M+H)+; HR-MS (Methode 13): m z = 918.6; i-NMR ^OO MHz, Dichlormethan-d2): δ [ppm] = 0.58-1.21 (m, 20H), 1.25-1.52 (m, 2H), 1.62- 2.19 (m, 8H), 2.28-2.50 (m, 5H), 2.64-2.84 (m, 2H), 2.89-3.16 (m, 6H), 3.19-3.52 (m, 10H), 3.59- 4.00 (m, 4H), 4.02-4.40 (m, 3H), 4.66-5.13 (m, 3H), 5.61 (d, 1H), 7.32 (d, 5H), 7.49-7.69 (m, 3H), 7.93-8.16 (m, 2H), 9.07 (br. s, 1 H). Beispiel 6
N-(3 -Carboxypropyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4S, 55)-3 -methoxy- 1 - { (2S)-2-[( IR, 2R)- 1 -methoxy-2- methyl-3 -oxo-3 - { [( li?)-2 -phenyl- 1 -(5 -phenyl- 1 ,3 ,4-oxadiazol-2-yl)ethyl]amino}propyl]pyrrolidin- 1 - yl } -5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid
17.1 mg (18 μιηοΐ) N-Methyl-L-valyl-N-[(3i?, 4,S
*,5
1S)-3-methoxy-l-{(2
1S)-2-[(li?,2i?)-l-methoxy-2- methyl-3 -oxo-3 - { [( \R)-2 -phenyl- 1 -(5 -phenyl- 1 ,3 ,4-oxadiazol-2-yl)ethyl]amino}propyl]pyrrolidin- 1 - yl}-5-methyl-l-oxoheptan-4-yl]-N-methyl-L-valinamid Trifluoressigsäure-Salz (Intermediat 22) wurden in 1.1 ml DioxanAVasser (1 : 1) gelöst und analog zur Herstellung von Beispiel 1 mit 15%- iger wässriger Lösung von 4-Oxobutansäure in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid umgesetzt. Nach Lyophilisation aus Dioxan wurden 14.8 mg (89% d. Th.) der Titelverbindung in Form eines weißen Feststoffs erhalten.
HPLC (Methode 10): R, = 2.54 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 0.92 min; MS (ESIpos): m/z = 919 (M+H)+. Beispiel 7
N-(3 -Carboxypropyl)-N-melhyl-L-valyl-N-[(3R,4S,55) - 1 - { (25)-2-[( \R,2R)-3 - { [2-( lH-indol-3 -yl)- ethyl] amino } - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl } -3 -methoxy-5 -methyl- 1 -oxoheptan- 4-yl] -N-methyl-L-valinamid
Die Titelverbindung wurde in Analogie zur Synthese von Beispiel 1 durch Umsetzung von 100 mg (119 μιηοΐ) N-Methyl-L-valyl-N-[(3i?,4,S*,51S)-l-{(21S)-2-[(li?,2i?)-3-{[2-(lH-indol-3-yl)ethyl]- amino} - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl} -3 -methoxy-5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] - N-methyl-L-valinamid Trifluoressigsäure-Salz (Intermediat 24) mit 15%-iger wässriger Lösung von 4-Oxobutansäure in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid hergestellt.
Ausbeute: 50 mg (49% d. Th.)
LC-MS (Methode 1): R, = 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 814 (M+H)+. Beispiel 8
N-(3 -Carboxypropyl)-N-methyl-L-valyl-N- { (3R,4S,5S)-3 -methoxy- 1 - [(2S)-2 - { ( 1R,2R) - 1 -methoxy-
2-methyl-3-oxo-3-[(2-phenylethyl)amino]propyl}pyrrolidin-l-yl]-5-methyl-l-oxoheptan-4-yl}-N- methyl-L-valinamid
Die Titelverbindung wurde in Analogie zur Synthese von Beispiel 1 durch Umsetzung von 57 mg (71 μιηοΐ) N-Methyl-L-valyl-N- { (3R,4S,5S)-3 -methoxy- \-[(2S)-2-{ (\R,2R)-\ -methoxy-2-methyl-3 -oxo- 3 - [(2-phenylethyl)amino]propyl } Pyrrolidin- 1 -yl] -5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl } -N-methyl-L-valinamid Trifluoressigsäure-Salz (Intermediat 25) mit 15%-iger wässriger Lösung von 4-Oxobutansäure in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid hergestellt.
Ausbeute: 10 mg (19% d. Th.)
LC-MS (Methode 1): R, = 0.85 min; MS (ESIpos): m/z = 775 (M+H)+. Beispiel 9
N-(3 -Carboxypropy -N-methyl-L-valyl-N-CiSÄ^.S'^.S)- 1 - { (2S)-2-[( \R,2R)-3 - { [( \S,2R)- 1 -hydroxy- 1 -phenylpropan-2-yl] amino } - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl } -3 -methoxy-5 - methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid
Die Titelverbindung wurde in Analogie zur Synthese von Beispiel 1 durch Umsetzung von 57 mg (71 μιηοΐ) N-Methyl-L-valyl-N-^i^S^- 1 - { (2S)-2-[( \R,2R)-3 - { [( \S,2R)- 1 -hydroxy- 1 -phenylpropan- 2-yl]amino} - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl} -3 -methoxy-5 -methyl- 1 -oxoheptan-4- yl] -N-methyl-L-valinamid Trifluoressigsäure-Salz [Herstellung analog zu Intermediat 17 durch Kupplung von Intermediat 7 mit (15*,2i?)-(+)-Norephedrin und anschließende Entschützung mit Trifluoressigsäure] mit 15%-iger wässriger Lösung von 4-Oxobutansäure in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid hergestellt. Ausbeute: 94 mg (84% d. Th.)
LC-MS (Methode 1): R, = 0.79 min; MS (ESIpos): m/z = 805 (M+H)+.
Beispiel 10
N-(3 -Carboxypropyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?,4S,5^-3 -methoxy- 1 - { (2S)-2-[( 1R,2R)- 1 -methoxy-3 - ( { (25*,3£)-4-[4-(methoxycarbonyl)phenyl] - 1 -phenylbut-3 -en-2-yl} amino)-2-methyl-3 -oxopropyl] - Pyrrolidin- 1 -yl } -5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid
Die Titelverbindung wurde in Analogie zur Synthese von Beispiel 1 durch Umsetzung von 45 mg (47 μmol) N-Methyl-L-valyl-N-[(3 ^,4^51S)-3-methoxy-l-{(21S)-2-[(l ^,2 ^)-l-methoxy-3-({(21S*,3£)-4-[4- (methoxycarbonyl)phenyl] - 1 -phenylbut-3 -en-2-yl} amino)-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl} -5 - methyl- l-oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid Trifluoressigsäuresalz (Intermediat 23) mit 15%- iger wässriger Lösung von 4-Oxobutansäure in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid hergestellt.
Ausbeute: 33.9 mg (78% d. Th.)
LC-MS (Methode 1): R, = 1.02 min; MS (ESIneg): m/z = 933 (M-H) . Beispiel 11
N-(3-Carboxypropyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?,4,S*,51S)-l-{(21S)-2-[(li?,2i?)-3-{[(21S*,3£)-4-(4- carboxyphenyl)- 1 -phenylbut-3 -en-2-yl]amino} - 1 -methoxy-2-methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl} -3 - methoxy-5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid
33.9 mg (36 μιηοΐ) N-(3-Carboxypropyl)-N-methyl-L-valyl-N-[(3i?,4,S*,51S)-3-methoxy-l-{(21S)-2- [( \R,2R)- 1 -methoxy-3 -( { (25*,3£)-4-[4-(methoxycarbonyl)phenyl] - 1 -phenylbut-3 -en-2-yl} amino)-2- methyl-3 -oxopropyl]pyrrolidin- 1 -yl}-5 -methyl- 1 -oxoheptan-4-yl] -N-methyl-L-valinamid (Beispiel 10) wurden in 1.1 ml THF/Wasser (1 : 1) vorgelegt und mit 3.5 mg (145 μιηοΐ) Lithiumhydroxid versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei RT gerührt, anschließend durch Zugabe von 1 N Salzsäure angesäuert und zweimal mit je 10 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Es wurden 18.3 mg (84% Reinheit, 46% d. Th.) der Titelverbindung erhalten. LC-MS (Methode 9): R, = 4.98 min; MS (ESIneg): m/z = 919 (M-H)
B. Bewertung der biologischen Wirksamkeit
Die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch in vitro- und in vivo- Untersuchungen, wie sie dem Fachmann bekannt sind, nachgewiesen werden. Beispielsweise können die pharmakologischen und pharmakokinetischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindun- gen mit Hilfe der nachstehend beschriebenen Assays bestimmt werden:
B-l . Bestimmung der antiproliferativen Wirkung an der HT29wt-Zelllinie:
Eine definierte Zellzahl der humanen Colonkarzinom-Zelllinie HT29wt (Wildtyp) wurde in einer 96- well-Mikrotiterplatte im Vollmedium (10% FCS-RPMI) ausgesät (2 500 Zellen/well) und über Nacht bei 37°C / 5% CO2 inkubiert. Nach 18 h wurde das Aussaatmedium durch frisches Medium mit 10% FCS ersetzt. Die Behandlung startete mit Zugabe der jeweiligen Testsubstanz. Von den zu untersuchenden Substanzen wurden Dosis-Wirkungskurven in einem Konzentrationsbereich von 10" 5 M bis 10"14 M ( 1 : 10-Verdünnungsreihe) bestimmt. Es wurden Inkubationszeiten von 48 h bis 96 h gewählt. Die Detektion der Proliferation erfolgte mit Hilfe des MTT-Assays (ATCC, Manassas, Virginia, USA, Katalog-Nr. 30-1010K). Nach Ablauf der gewählten Inkubationszeit wurde das MTT-Reagens für 4 h mit den Zellen inkubiert, bevor durch Zugabe des Detergens die Lyse der Zellen über Nacht erfolgte. Die Detektion des gebildeten Farbstoffs erfolgte bei 570 nm. Die Proliferation nicht mit Testsubstanz, aber ansonsten identisch behandelter Zellen wurde als 100%-Wert definiert. Die aus diesem Test gewonnenen Daten repräsentieren Dreifachbestimmungen, und es wurden mindestens zwei unabhängige Experimente durchgeführt. In der folgenden Tabelle 1 sind die ICso-Werte repräsentativer Ausführungsbeispiele aus diesem Assay aufgeführt:
Tabelle 1
Ausführungsbeispiel IC50 [nM]
1 15
2 3.3
3 0.3
4 1.1
5 0.1
Ausführungsbeispiel IC50 [nM]
6 0.1
8 0.5
9 6
11 4.5
Im Vergleich hierzu weist Monomethylauristatin F (MMAF) in diesem Test einen ICso-Wert von 10 nM auf.
B-2. Bestimmung des Einflusses auf die Tubulinpolymerisation: Krebszellen sind entartete Zellen, die häufig auch durch eine gesteigerte Zellteilung zu einer Tumorbildung führen. Microtubuli bilden die Spindelfasern des Spindelapparates und sind ein essentieller Bestandteil des Zellzyklus. Der geregelte Auf- und Abbau von Microtubuli ermöglicht die genaue Aufteilung der Chromosomen auf die Tochterzellen und stellt einen kontinuierlich dynamischen Prozess dar. Eine Störung dieser Dynamik führt zu einer fehlerhaften Zellteilung und letztlich zum Zelltod. Die gesteigerte Zellteilung von Krebszellen macht diese jedoch auch besonders empfänglich gegenüber Spindelfasergiften, die einen festen Bestandteil der Chemotherapie darstellen. Spindelfasergifte wie Paclitaxel oder Epothilon führen zu einer stark erhöhten Polymerisationsgeschwindigkeit der Microtubuli, während Vinca-Alkaloide oder auch Monomethylauristatin E (MMAE) zu einer stark reduzierten Polymerisationsgeschwindigkeit der Microtubuli führen. In beiden Fällen ist die notwendige Dynamik des Zellzyklus empfindlich gestört. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung untersuchten Verbindungen führen zu einer reduzierten Polymerisationsgeschwindigkeit der Microtubuli.
Zur Untersuchung der Tubulinpolymerisation wurde das "Fluorescence-based Microtubule Polymerisation Assay Kit" der Firma Cytoskeleton (Denver, Colorado, USA; Bestellnummer: BK011) verwendet. Bei diesem Assay wird unpolymerisiertem Tubulin GTP zugesetzt, womit die Polymerisation spontan stattfinden kann. Der Assay beruht auf der Bindung des Fluorophors 4',6-Diamidino- 2-phenylindol (DAPI) an Tubulin. Freies und gebundenes DAPI können aufgrund unterschiedlicher Emissionsspektra differenziert werden. Da DAPI eine deutlich höhere Affinität gegenüber polymerisiertem im Vergleich zu nicht-polymerisiertem Tubulin zeigt, läßt sich die Tubulin- polymerisation über die Zunahme der Fluoreszenz gebundener DAPI-Fluorophore verfolgen.
Zur Durchführung dieses Assays wurden die in DMSO gelösten Testsubstanzen von ihrer Ausgangskonzentration von 10 mM auf 1 μΜ in Wasser verdünnt. Neben der Puffer-Kontrolle wurde als Assay-Kontrolle auch polymerisationssteigemd Paclitaxel und andererseits polymerisationshemmend Vinblastin mitgeführt. Für die Messung wurden 96-well-Lochplatten mit halber Bodenfläche verwendet. Die Kinetik der Tubulinpolymerisation wurde 1 h lang bei 37°C in einem Fluorimeter verfolgt. Die Anregungswellenlänge betrug 355 nm, die Emission wurde bei 460 nm verfolgt. Für den Bereich des linearen Anstiegs innerhalb der ersten 10 Minuten wurde die Fluoreszenzänderung pro Minute (AF/min) berechnet, welche die Polymerisationsgeschwindigkeit der Microtubuli darstellt. Die Potenz der Testsubstanzen wurde anhand der jeweiligen Reduktion der Poly- merisationsgeschwindigkeit quantifiziert.
B-3. Bestimmung der Plasma-Stabilität in vitro: Methode A:
1 mg der jeweiligen Testsubstanz wurde in 0.5 ml Acetonitril/DMSO (9: 1) gelöst. Von dieser Lösung wurden 20 μΐ abgenommen und zu 1 ml 37°C warmen Ratten- bzw. Humanplasma gegeben (Plasma von männlichen Wistar-Ratten mit Li-Heparin, Fa. Harlan & Winkelmann bzw. humanes Leukozyten-depletiertes Frischplasma aus Vollblutentnahme). Aus dieser kräftig geschüttelten Plasmalösung wurden sofort nach Zugabe der Probe (Anfangswert als Bezugsgröße) und dann nach 5, 10, 30, 60, 120, 180 und 240 Minuten sowie gegebenenfalls nach 24 Stunden jeweils 100 μΙ-Ali- quote entnommen und in 300 μΐ Acetonitril gegeben. Die ausgefällten Plasmaproteine wurden für 10 Minuten bei 5000 U/min abzentrifügiert und 30 μΐ des Überstandes per HPLC auf seinen Gehalt an unveränderter Testsubstanz analysiert. Quantifiziert wurde über die Flächenprozente der entsprechenden Peaks.
HPLC-Methode bei Rattenplasma:
Instrument: Agilent 1200 mit DAD, binärer Pumpe, Autosampier, Säulenofen und Thermostat; Säule: Kromasil 100 C18, 250 mm x 4 mm, 5 μπι; Säulentemperatur: 45°C; Eluent A: 5 ml Perchlorsäure / L Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0-8 min 98% A, 2% B; 8-15 min 56% A, 44% B; 15-20 min 10% A, 90% B; 20-21 min 10% A, 90% B; 21-23 min 98% A, 2% B; 23-25 min 98% A, 2% B; Flussrate: 2 ml/min; UV-Detektion: 220 nm.
HPLC-Methode bei Humanplasma:
Instrument: Agilent 1100 mit DAD, binärer Pumpe, Autosampier, Säulenofen und Thermostat; Säule: Kromasil 100 C18, 250 mm x 4 mm, 5 μπι; Säulentemperatur: 45°C; Eluent A: 5 ml Perchlorsäure / L Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0-3 min 98% A, 2% B; 3-10 min 65% A,
35% B; 10-15 min 40% A, 60% B; 15-21 min 10% A, 90% B; 21-22 min 10% A, 90% B; 22-24 min 98% A, 2% B; 24-26 min 98% A, 2% B; Flussrate: 2 ml/min; UV-Detektion: 220 nm.
Methode B:
Die jeweilige Testsubstanz wurde in Ratten- bzw. Humanplasma bei 37°C über einen Zeitraum von 5 h unter leichtem Rühren inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 2, 5, 10, 20, 30, 60, 120, 180 und 300 Minuten) wurde jeweils ein 100 μΙ-Aliquot entnommen. Nach Zugabe von internem Standard (10 μΐ) wurden die Proteine durch Zugabe von 200 μΐ Acetonitril gefallt und das Gemisch in einer Eppendorf-Zentrifuge für 5 Minuten zentrif giert. Nach Zugabe von 150 μΐ Ammo- niumacetat-Puffer pH 3 zu 150 μΐ des Überstandes wurde der Gehalt an unveränderter Testsubstanz mittels LC/MSMS analysiert.
B-4. Bestimmung der Zell-Permeabilität:
Die Zell-Permeabilität einer Substanz kann mittels in v/Yro-Testung in einem Flux-Assay unter Verwendung von Caco-2 -Zellen untersucht werden [M.D. Troutman und D.R. Thakker, Pharm. Res. 20 (8), 1210-1224 (2003)]. Hierzu wurden die Zellen auf 24-Loch-Füterplatten für 15-16 Tage kultiviert. Zur Bestimmung der Permeation wurde die jeweilige Testsubstanz in einem HEPES- Puffer entweder apikal (A) oder basal (B) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach 2 h wurden Proben aus den Cis- und Transkompartimenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC (Agilent 1200, Böblingen, Deutschland) unter Verwendung von reverse phase-Säulen aufgetrennt. Das HPLC-System war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Quadropol- Massenspektrometer API 4000 (Applied Biosystems Applera, Darmstadt, Deutschland) gekoppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines Papp-Wertes bewertet, welcher mittels der von Schwab et al. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]. Eine Substanz wurde als aktiv transportiert klassifiziert, wenn das Verhältnis von Papp (B-A) zu Papp (A-B) >2 oder <0.5 war. Von entscheidender Bedeutung für Toxophore, die intrazellulär freigesetzt werden, ist die Permeabilität von B nach A [Papp (B-A)] : Je niedriger diese Permeabilität ist, desto länger ist die Verweilzeit der Substanz in der Zelle nach intrazellulärer Freisetzung und damit auch die Zeit, die für eine Interaktion mit dem biochemischen Target (hier: Tubulin) zur Verfügung steht.
In der folgenden Tabelle 2 sind Permeabilitätsdaten repräsentativer Ausführungsbeispiele aus diesem Assay aufgeführt:
Tabelle 2
Im Vergleich hierzu weisen Monomethylauristatin E (MMAE) und Monomethylauristatin F (MMAF) in diesem Test einen Papp (B-A)-Wert von 89 nm/s beziehungsweise 73 nm/s auf. B-5. Bestimmung der Substrateigenschaften für P-Glycoprotein (P-gp):
Viele Tumorzellen exprimieren Transporterproteine für Wirkstoffe, was häufig mit einer Resistenzentwicklung gegenüber Cytostatika einhergeht. Substanzen, die keine Substrate von solchen Transporterproteinen wie beispielsweise P-Glycoprotein (P-gp) oder BCRP sind, könnten somit ein verbessertes Wirkprofil aufzeigen. Die Substrateigenschaften einer Substanz für P-gp (ABCBl) wurden mittels eines Flux-Assays unter Verwendung von LLC-PK1 -Zellen, die P-gp überexprimieren (L-MDR1 -Zellen), bestimmt [A.H. Schinkel et al, J. Clin. luvest. 96, 1698-1705 (1995)]. Hierzu wurden die LLC-PK1- oder L-MDR1 -Zellen auf 96-Loch-Filterplatten für 3-4 Tage kultiviert. Zur Bestimmung der Permeation wurde die jeweilige Testsubstanz allein oder in Gegenwart eines Inhibitors (wie z.B. Ivermectin oder Verapamil) in einem HEPES-Puffer entweder apikal (A) oder basal (B) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach 2 h wurden Proben aus den Cis- und Transkompartimenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC unter Verwendung von reverse phase-Säulen
aufgetrennt. Das HPLC-System war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Quadropol- Massenspektrometer API 3000 (Applied Biosystems Applera, Darmstadt, Deutschland) gekoppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines Papp-Wertes bewertet, welcher mittels der von Schwab et al. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)] . Eine Substanz wurde als P-gp-Substrat klassifiziert, wenn das Efflux- Verhältnis Papp (B-A) zu Papp (A-B) >2 war.
Als weitere Kriterien zur Bewertung der P-gp-Substrateigenschaften können die Efflux- Verhältnisse in L-MDR1- und LLC-PK1 -Zellen oder das Efflux- Verhältnis in An- oder Abwesenheit eines Inhibitors miteinander verglichen werden. Wenn sich diese Werte um mehr als einen Faktor 2 unterscheiden, so handelt es sich bei der betreffenden Substanz um ein P-gp-Substrat.
C. Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überfuhrt werden:
Tablette: Zusammensetzung :
100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 50 mg Lactose (Monohydrat), 50 mg Maisstärke (nativ), 10 mg Polyvinylpyrrolidon (PVP 25) (Fa. BASF, Ludwigshafen, Deutschland) und 2 mg Magnesiumstearat.
Tablettengewicht 212 mg. Durchmesser 8 mm, Wölbungsradius 12 mm. Herstellung:
Die Mischung aus erfindungsgemäßer Verbindung, Lactose und Stärke wird mit einer 5%-igen Lösung (m/m) des PVPs in Wasser granuliert. Das Granulat wird nach dem Trocknen mit dem Magnesiumstearat 5 Minuten gemischt. Diese Mischung wird mit einer üblichen Tablettenpresse verpresst (Format der Tablette siehe oben). Als Richtwert für die Verpressung wird eine Presskraft von 15 kN verwendet.
Oral applizierbare Suspension:
Zusammensetzung :
1000 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 1000 mg Ethanol (96%), 400 mg Rhodigel® (Xanthan gum der Firma FMC, Pennsylvania, USA) und 99 g Wasser. Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 10 ml orale Suspension.
Herstellung:
Das Rhodigel wird in Ethanol suspendiert, die erfindungsgemäße Verbindung wird der Suspension zugefügt. Unter Rühren erfolgt die Zugabe des Wassers. Bis zum Abschluß der Quellung des Rhodi- gels wird ca. 6 h gerührt.
Oral applizierbare Lösung:
Zusammensetzung :
500 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 2.5 g Polysorbat und 97 g Polyethylenglycol 400. Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 20 g orale Lösung. Herstellung:
Die erfindungsgemäße Verbindung wird in der Mischung aus Polyethylenglycol und Polysorbat unter Rühren suspendiert. Der Rührvorgang wird bis zur vollständigen Auflösung der erfindungsgemäßen Verbindung fortgesetzt. i.v.-Lösung: Die erfindungsgemäße Verbindung wird in einer Konzentration unterhalb der Sättigungslöslichkeit in einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel (z.B. isotonische Kochsalzlösung, Glucoselösung 5% und/oder PEG 400-Lösung 30%) gelöst. Die Lösung wird steril filtriert und in sterile und pyrogenfreie Injektionsbehältnisse abgefüllt.