WO2012121423A1 - 한약추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Definitions

  • composition for preventing and treating diabetic complications containing
  • the present invention is directed to extracts of Homonoi ' a riparia Lour. Or fractions thereof.
  • It relates to a pharmaceutical composition for preventing and treating diabetic complications containing as an active ingredient.
  • Diabetes mellitus is one of the most important adult diseases in the world. In recent years, with the rapid economic growth in Korea, the prevalence of diabetes has reached 10%, and there are more than 240 million people with diabetes worldwide. It will increase to 380 million people worldwide in 2025, 60% of which will occur in Asia, according to the 2009 American Medical Association (JAMA). Especially
  • diabetes has been extended to middle age and prolonged life expectancy has led to complications. That is, usually 10 to 20 years after diabetes, almost all organs in the body are damaged, resulting in diabetic retinopathy, diabetic cataract, diabetic nephropathy, diabetic nerve Symptoms include diabetic neuropathy, heart disease, cancer or osteoporosis. Chronic diabetic nephropathy is the most important cause of hemodialysis treatment and end stage renal failure. Diabetic cataracts and retinopathy lead to blindness and eventually death. In the United States, the cause of blindness in the age of 25-74 is diabetes, and 60% of blindness occurs 15 to 20 years after the onset of diabetes. Therefore, delaying the onset of complications in diabetic patients by only 5 to 10 years will affect the quality of life of patients and their families and will have a major impact on national finances.
  • Nonenzymatic glycation of protein is a condensation reaction in which amino acids such as lysine residues of protein and reducing sugars are enzymatic reactions without enzyme action, that is, milliard reactions. (advanced glycation endproducts, AGEs) are produced.
  • Non-enzymatic glycosylation of proteins involves (1) lysine residues
  • the aldehyde or ketone of the amino acid group and the reducing sugar is subjected to nucleophilic addition without enzymatic action to form a Schiff base, which is an initial product.
  • the final glycation product which is an irreversible product, is produced by reversing the rearrangement of the reversible Amadori type of early glycosylated product and (2) the persistence of hyperglycaemia. Is produced, and the final glycation products thus produced are combined with proteins or lipids, or
  • Cross-linking can be divided into stages in which products such as irreversible glycosylated proteins or glycosylated lipids are produced. Unlike the reversible Amadori type of early glycosylated products, the final glycated products are irreversible reaction products, so once they are formed, they are not degraded even if blood sugar returns to normal, and they accumulate in the tissue during the survival of the protein or lipid to which the final glycated products are bound. Abnormal changes in tissue structure and function cause complications throughout the tissue (Vinson, JA et al., 1996, J. Nutritinal Biochemistry 7: 559-663; Smith, PR et al., 1992, Eur. J. Biochem., 210: 729-739).
  • glycated albumin one of the final glycosylated products produced by the reaction of glucose and several types of proteins, is an important factor causing chronic ' diabetic nephropathy.
  • Glycosylated albumin is more easily introduced into renal glomeruli cells than normal albumin without glycosylation, and high concentrations of glucose stimulate mesangium cells to increase extracellular matrix synthesis.
  • Excessly introduced glycated albumin and increased extracellular matrix result in fibrosis of the glomeruli. These mechanisms continue to damage the glomerulus, leading to extreme treatments such as hemodialysis or organ transplantation.
  • the polyol pathway is (1) reduced by aldose reductase (AR) action from aldose or ketose to form sorbbi, and (2) sorbetol is oxidized by sorbol dehydrogenase to release fructose. It is a process consisting of steps that are generated.
  • aldose reductase has a very low affinity for glucose, but the hyperglycemic state causes excessive activation of aldose reductase, the first enzyme in the polyol pathway, resulting in the conversion of excess hyperglycemia to fructose. Accumulation in tissues causes the osmotic pressure to be unbalanced, leading to complications.
  • the final glycosylation product is an aldose reductase enzyme, the main enzyme of the polyl pathway in human microvascular endothelial cells.
  • fructose is about 10 times faster than non-enzymatic glycosylation reaction of protein.
  • high concentrations of fructose bind to the protein and eventually accelerate the formation of the final glycated product.
  • non-enzymatic glycation reactions, polyol pathways and oxidative stress mechanisms of action are linked to each other to cause diabetic complications. It has been reported that lipid metabolism abnormalities occur during the production of the final glycated product in hyperglycemic state and oxidative stress is caused by a decrease in defense system function against harmful oxygen free radicals (Yokozawa, T., et al, 2001, J. of Trad. Med., 18: 107-1 12).
  • aminoguanidine a synthetic glycosylation inhibitor
  • N-terminal hydrazine a nucleophilic hydrazine. It is a complication by inhibiting the formation of the final glycosylated product by preventing cross-linking with proteins by binding to the Amadori product. Delay or prevent progression (Brownlee, M., et al., 1986, Sciences, 232, 1629-1632; Edelstein, D. et al., 1992, Diabetes, 41, 26-29). Amanoguanidine is the most promising synthetic drug for the prevention and treatment of diabetic complications.
  • the present inventors have found that, for diabetic complications, the drug, amphibian extract, or fractions thereof, which developed safe and effective natural medicines with little toxicity and side effects, inhibit the production of the final glycated product and aldose reductase
  • the present invention has been completed by demonstrating diabetic complication inhibitory activity and having anti-aging or anti-cancer effect.
  • An object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of diabetic complications containing a ram extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of diabetic complications containing the extract (Homono / ⁇ riparia Lour.) As an active ingredient.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing and treating diabetic complications, which contains a fraction prepared by further dividing the amphibian extract with an organic solvent as an active ingredient.
  • the present invention also provides a health functional food for preventing and improving diabetic complications, which contains a ram extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a functional feed additive for preventing and improving diabetic complications containing a ram extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for inhibiting the final glycation product containing an amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides an anti-aging and delaying pharmaceutical composition containing an amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides anti-aging and delayed health functional food containing the amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer, which contains the amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a functional food for the prevention and improvement of cancer containing the amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating diabetic complications comprising administering to a subject suffering from diabetic complications a composition containing a pharmaceutically effective amount of amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutically effective amount of amphibian extract or fractions thereof. Administering to the subject a composition containing the active ingredient
  • the present invention also provides a method for inhibiting aging, comprising administering to a subject a composition containing a pharmaceutically effective amount of amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering a composition containing a pharmaceutically effective amount of amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient to an individual suffering from cancer.
  • the present invention provides a use of the amphibian extract or fractions thereof in the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing and treating diabetic complications.
  • the present invention provides a use of the amphibian extract or fractions thereof for the production of dietary supplement for preventing and improving diabetic complications.
  • the present invention also provides a use of the amphibian extract or fractions thereof for the production of a functional feed additive for preventing and improving diabetic complications.
  • the present invention provides a use of the amphibian extract or fractions thereof in the preparation of the composition for inhibiting the final glycation product.
  • the present invention provides a use of the amphibian extract or fractions thereof for the manufacture of a pharmaceutical composition for anti-aging and delaying.
  • the present invention provides a use of the amphibian extract or fractions thereof in the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer.
  • the amphibian extract or fractions thereof of the present invention is an indicator of diabetic complications.
  • 1 is a diagram showing the extraction and phylogenetic separation of a ram.
  • SDT type 2 diabetes animal model
  • FIG. 4 is a diagram showing the effect of the retinal vessels (left) and retinal nerve cells (right) final glycation product accumulation of the amphibian extract in type 2 diabetes animal model (SDT).
  • FIG. 5 is a diagram showing the efficacy of preventing retinal blood vessels (left) and apoptosis (apoptosis) of neurons (right) of the amphibian extract in type 2 diabetes animal model (SDT).
  • FIG. 6 is a graph showing the proteinuria, albuminuria, and glomerular filtration rates of renal function indicators of the amphibian extract in type 2 diabetes animal model (SDT).
  • the figure shows the effect on the CML content change.
  • SDT 9 is an extracellular matrix of amphibian extract in a type 2 diabetes animal model (SDT).
  • PAS staining shows the effect of morphological changes on accumulation.
  • SDT type 2 diabetes animal model
  • FIG. 11 is a diagram showing the effect on the podocyte loss of the amphibian extract in the type 2 diabetes animal model (SDT).
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating diabetic complications, which comprises the extract of Homono / a riparia Lour. As an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating diabetic complications comprising a fraction prepared by further dividing the amphibian extract with an organic solvent as an active ingredient.
  • the present invention provides a use of the amphibian extract or fractions thereof in the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing and treating diabetic complications.
  • Diabetic complications include diabetic retinopathy, diabetic cataract, diabetic nephropathy and diabetic
  • Diabetes complications are symptoms caused by long-term diabetes mellitus, but differ from the onset criteria and judgment criteria of diabetes mellitus, and the treatment for diabetic complications can be used separately from the diabetes treatment.
  • the amphibian extract is preferably prepared by a manufacturing method including the following steps, but is not limited thereto. 1) extracting by adding an extraction solvent to the amphibian (Hom io / ⁇ riparia Lour.);
  • step 3 drying the filtered extract of step 2) under reduced pressure and then drying.
  • the amphibian of step 1) can be used without limitation, such as being grown or commercially available.
  • the amphibian can use the whole plant, preferably using leaves or branches, but is not limited thereto.
  • the extraction solvent it is preferable to use water, alcohol or a combination thereof.
  • the alcohol it is preferable to use C, an inner magnetic C 4 lower alcohol, and as the lower alcohol, it is preferable to use ethanol or methanol, and more preferably to use 80% ethanol, but not always limited thereto. Alcohols having a water content of 0.1% to 50% can also be used.
  • the extraction method conventional methods in the art, such as filtration, hot water extraction, immersion extraction, reflux cooling extraction, and ultrasonic extraction, can be used, and the extraction is preferably performed once to five times by hot water extraction, and repeated three times. More preferably, but is not limited thereto.
  • the extracting solvent may be added 1 to 10 times the weight of the dried weeping leaf and eggplant, preferably 1 to 5 times.
  • Extraction temperature is preferably 20 to 30 ° C , but is not limited thereto.
  • the extraction time is preferably 24 to 48 hours, but is not limited thereto.
  • the decompression concentration in step 3 is carried out using a vacuum decompression concentrate or
  • drying is preferably, but not limited to, vacuum drying, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying.
  • the amphibian leaves and branches were washed with water and dried in the shade.
  • the dried weeping leaf and eggplant were crushed and placed in an extraction container, and extracted repeatedly at room temperature with an extraction solvent.
  • the solids were removed using a filter paper and filtered.
  • the ram acids extract was concentrated under reduced pressure The extract "was prepared.
  • the fraction of the amphibian extract may contain an organic solvent in addition to the amphibian extract.
  • It is preferably prepared by a manufacturing method including the step of preparing an organic solvent fraction, but is not limited thereto.
  • the organic solvent is normal-nucleic acid, ethyl acetate or
  • the butanol is normal, but not limited thereto.
  • the fraction may be obtained by repeating the fractionation process from the amphibian extract 1 to 5 times, preferably 3 times, and preferably concentrated under reduced pressure after fractionation. I never do that.
  • the fraction is normal-nucleic acid after suspending the amphibian extract in water,
  • a normal-nucleic acid fraction preferably, but not limited to, any one of a normal-nucleic acid fraction, an ethyl acetate fraction, a normal-butanol fraction or a water fraction obtained by systematic fractionation with ethyl acetate, normal-butanol and water.
  • the solvent in the amphibian extract Water and normal-nucleic acid were added to the residue obtained by evaporation, and the normal-nucleic acid layer was separated to obtain a normal-nucleic acid fraction.
  • Ethyl acetate was mixed with the water layer except for the nucleic acid layer, and the ethyl acetate layer was separated to obtain an ethyl acetate fraction. Also, after removing the ethyl acetate layer, after mixing normal-butanol
  • the normal-butanol layer was separated to give a normal-butanol fraction. Finally, after removing the normal-butanol layer, a water fraction of the water layer was obtained (see FIG. 1).
  • Bovine serum albumin (BSA) was used as an indicator of the degree of binding to fructose and glucose.
  • BSA Bovine serum albumin
  • aminoguanidine (ol) which is known to have a very good inhibitory effect on the final glycated product, was used.
  • the test group treated with the amphibian extract or fractions thereof exhibited the effect of inhibiting the end glycated product far more effectively than the previously known aminoguanidine (see Table 1).
  • ALT-711 Alteon Inc., Ramsey, NJ
  • AGEs cross-linker breaker a drug known as an AGEs cross-linker breaker
  • the present inventors confirmed the prophylactic and therapeutic effects of amphibian extracts on retinopathy and nephropathy in Spontaneous diabetic torii (SDT) rats.
  • SDT Spontaneous diabetic torii
  • treatment of the amphibian extract significantly reduced blood retinal barrier damage, perivascular cell loss, and acellular capillary formation in diabetic groups (see FIGS. 2 and 3), and in retinal blood vessels and retinal nerve cells. Accumulation of final glycation end products was reduced (see FIG. 4), and apoptosis was inhibited (see FIG. 5), and it was confirmed that the amphibian extract had an effect of inhibiting diabetic retinopathy.
  • the treatment of amphibian extract showed a significant decrease in the renal function indicator and the amount of AGE and CML in urine or kidney (see Figs. 6, 7 and 8), thickening of glomerular basement membrane, mesangial matrix It was confirmed that the expansion of, glomerular hypertrophy, glomerulosclerosis, collagen infiltration and podocyte loss were significantly reduced (FIGS. 9, 10 and 11), effectively inhibiting diabetic nephropathy.
  • the amphibian extract of the present invention or a fraction thereof is the cause of diabetic complications, Inhibition of the production of the final glycation product, the inhibitory effect of aldose reductase activity, and the effect on the diabetic complications of the diabetic animal model, which is a measure of the efficacy of the treatment for diabetic complications, have been shown to be excellent. It was confirmed that it can be usefully used as an active ingredient of a pharmaceutical composition.
  • the fraction contains 0.1 to 99.9% by weight as an active ingredient, and may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • composition of the present invention may be various oral or parenteral formulations.
  • diluents or excipients such as fillers, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrating agents and surfactants are usually used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate,
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending solvent include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending solvent include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories.
  • Propylene glycol, propylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethanolate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin and the like can be used.
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally, upon parenteral administration
  • the dosage of the composition of the present invention is the weight, age, sex, health status, diet of the patient,
  • the range varies depending on the time of administration, the method of administration, the rate of excretion and the severity of the disease.
  • the daily dosage is 0.01 to 1000 mg / kg based on the amount of amphibian extract,
  • It is preferably 30 to 500 mg / kg, more preferably 50 to 300 mg / kg, and may be administered 1 to 6 times a day.
  • composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers.
  • the present invention provides a method for preventing diabetic complications comprising administering to a subject a composition containing a pharmaceutically effective amount of amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutically effective amount of amphibian extract or fractions thereof. It provides a method for treating diabetic complications comprising administering to a subject suffering from diabetes a composition containing the active ingredient.
  • the subject is a vertebrate and preferably a mammal, more preferably an experimental animal such as a rat, rabbit, guinea pig, hamster, dog or cat.
  • the method of administration may be administered orally or parenterally, upon parenteral administration.
  • the pharmaceutically effective amount is 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 10 mg / kg, but is not limited thereto. Dosage may vary depending on the weight, age, sex, health status, diet, duration of administration, administration method, elimination rate, and severity of the disease.
  • the diabetic complication is preferably any one selected from the group consisting of diabetic retinopathy, diabetic cataract, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, heart disease, cancer, osteoporosis, and atherosclerosis. I never do that.
  • the amphibian extract or fractions thereof of the present invention not only have the effect of inhibiting the production of the final glycation end product and the activity of aldose reductase and decomposing the crosslinking of the final glycation end product and the protein, but also of type 2 diabetes.
  • Inhibition of diabetic complications in vitro (/ «vitro) and in vivo ⁇ w) has been shown to have an inhibitory effect on diabetic cataracts, diabetic retinopathy and diabetic nephropathy in animal models. It can be usefully used for treatment.
  • the present invention provides a dietary supplement for the prevention and improvement of diabetic complications containing an amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a use of the amphibian extract or fractions thereof for the production of health functional food for preventing and improving diabetic complications.
  • the diabetic complication is preferably any one selected from the group consisting of diabetic retinopathy, diabetic cataract, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, heart disease, cancer, osteoporosis, and atherosclerosis. I never do that.
  • the amphibian extract or fractions thereof of the present invention not only have the effect of inhibiting the production of the final glycation end product and the activity of aldose reductase, and degrading the crosslinking of the final glycation end product with the protein, It has been shown that the animal model effectively inhibits diabetic complications in vitro (in iro) and in vivo (/ n) by showing inhibitory effects on diabetic cataracts, diabetic retinopathy and diabetic nephropathy. It can be usefully used for dietary supplements for improvement.
  • the functional food of the present invention may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients.
  • the above-mentioned natural carbohydrates include glucose, monosaccharides such as fructose, maltose, disaccharides such as sucrose, and dextrins, It is a sugar alcohol such as polysaccharides such as cyclotextine, xylol, sorbitol, and retree.
  • natural sweeteners such as taumartin, stevia extract, synthetic sweeteners such as saccharin, aspartame, and the like can be used.
  • the ratio of the natural carbohydrate is preferably selected from 0.01 to 0.04 parts by weight, preferably about 0.02 to 0.03 parts by weight per 100 parts by weight of the health food of the present invention.
  • the functional food of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, stabilizers and preservatives. Glycerol, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like.
  • the functional food of the present invention may contain a pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage and vegetable beverage. These components can be used independently or in combination. The ratio of such additives is not critical but is generally selected in the range of 0.01-0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the health food of the present invention.
  • the present invention provides a functional feed additive for preventing and improving diabetic complications containing a ram extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a use of the amphibian extract or fractions thereof for the production of a functional feed additive for preventing and improving diabetic complications.
  • the diabetic complications are diabetic retinopathy, diabetic cataract, diabetic nephropathy, diabetic
  • It is preferably, but not limited to, any one selected from the group consisting of neuropathy, heart disease, cancer, osteoporosis, and atherosclerosis.
  • the amphibian extract or fractions thereof of the present invention not only have the effect of inhibiting the production of the final glycated product and the activity of aldose reductase, and decomposing the crosslinking of the final glycated product with the protein, as well as type 2 diabetes. Inhibition of diabetic complications in ro) and in vivo (! ' n vi) was confirmed by showing inhibitory effects on diabetic cataracts, diabetic retinopathy and diabetic nephropathy in animal models. It can be useful for improving functional feed additives.
  • the feed additive is to make a steady intake to poultry, livestock, etc.
  • Diabetes complications can be prevented and diabetes complications that have already occurred can be treated.
  • the amount of the amphibian extract or fractions thereof is 0.1-20% by weight, lipase is 0.001-0.01% by weight, the third phosphate is 1-20% by weight, 0.01 to 0.1% by weight of vitamin E, 1 to 10% by weight of enzyme powder, 0.1 to 10% by weight of lactic acid bacteria, 0.01 to 10% by weight of Bacillus culture and 20 to 90% by weight of glucose. It is preferable that it is configured, but not particularly limited thereto, and if an amphibian extract or a fraction thereof is added in an effective amount, it can be used as a feed additive of the present invention.
  • the effective amount refers to an amount capable of preventing diabetes complications or treating already-complicated diabetes complications by continuously ingesting poultry, livestock, and the like. Also, The amount which does not produce the adverse effect beyond the profit by addition is preferable.
  • the feed additives are additionally acceptable carriers for poultry and livestock, etc.
  • the feed additive may be added as it is or a known carrier, stabilizer, etc., and various nutrients such as vitamins, amino acids, minerals, antioxidants, antibiotics, antibacterial agents, and other additives may be added as necessary.
  • the shape may be in a suitable state such as powder, granules, pellets, suspension and the like.
  • the present invention provides a composition for inhibiting the final glycation product containing the amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention comprises the step of administering to the subject a composition containing a pharmaceutically effective amount of amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention for inhibiting the most glycosylated product of the amphibian extract or fractions thereof
  • the amphibian extract or fractions thereof of the present invention not only have the effect of inhibiting the production of the final glycation end product and the activity of aldose reductase and decomposing the crosslinking of the final glycation end product and the protein, but also of type 2 diabetes.
  • In vitro and in vivo (zVz W) has been confirmed to effectively inhibit the diabetic complications, it is useful for the preparation of the active ingredient of the final glycosylated product inhibitory composition, which is an indicator of diabetic complications and the composition for inhibiting such a final glycoxide Can be.
  • a composition containing a pharmaceutically effective amount of these amphibian extract or fractions thereof as an active ingredient it can be usefully used as a method for inhibiting the final sugar oxide.
  • the present invention also provides an anti-aging and delaying pharmaceutical composition containing an amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a use of the amphibian extract or fractions thereof in the manufacture of a pharmaceutical composition for anti-aging and delaying.
  • the present invention provides an anti-aging and delayed health functional food containing the amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention is for anti-aging and delaying the amphibian extract or fractions thereof
  • the amphibian extract of the present invention or a fraction thereof can be usefully used in the preparation of the anti-aging and delayed pharmaceutical composition or health food.
  • a composition containing a pharmaceutically effective amount of the amphibian extract or fractions thereof of the present invention can be usefully used as a method of inhibiting aging of an individual by administering to the individual.
  • the present invention provides a method for inhibiting aging comprising administering to a subject a composition containing a pharmaceutically effective amount of amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the amphibian extract of the present invention or a fraction thereof shows the production of the final glycated product.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer, which contains the amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a use of the amphibian extract or a fraction thereof in the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer.
  • the present invention provides a health food for cancer prevention and improvement containing the amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention for the prevention and improvement of cancer of the amphibian extract or fractions thereof
  • the final glycated product causes cancer (Tokuda H. et al., 2005, Book of Abstract of 53rd GA Congress joint with SIF, P076), the amphibian extract of the present invention or a fraction thereof It effectively inhibits the production of the final glycation end products, and has the effect of decomposing the cross-linking of the final glycation end product and protein, and thus the pharmaceutical composition for the treatment and prevention of cancer or the dietary supplement for the treatment and improvement of cancer, and the treatment and prevention of such treatment. It can be usefully used for the preparation of pharmaceutical compositions and dietary supplements.
  • the present invention provides a method for preventing cancer, comprising administering to a subject suffering from cancer a composition containing a pharmaceutically effective amount of amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for treating cancer, comprising administering to a subject suffering from cancer a composition containing a pharmaceutically effective amount of amphibian extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the extract of the present invention or a derivative thereof effectively inhibits the final glycation product and has an effect of decomposing the crosslinking of the final glycation product and the glycoprotein, it contains a pharmaceutically effective amount of a amphibian extract and a fraction thereof.
  • Composition to the object By administering, it can be usefully used as a method of preventing cancer of an individual or administering to an individual suffering from cancer to treat cancer.
  • the leaves and branches of the ram (Hom zc ⁇ pan ' a Lour.) Stored in the specimen chamber of the Diabetes complications were used. After crushing the leaf and eggplant of fine weeping rams purchased from Gyeongdong market, add 80% ethanol, and extract repeatedly at room temperature in the extraction container, and after filtering the extract, to prevent decomposition and hydrolysis of the components Concentration under reduced pressure while maintaining the temperature at 40 ⁇ 45 ° C or less to give 190 g of the ethanol extract.
  • 170 g of the amphibian methanol extract was prepared according to the method of Example ⁇ 1-1>, wherein methanol was used instead of methanol.
  • 195 g of a amphibian water extract was prepared according to the method of Example ⁇ 1-1>, wherein water was used instead of ethanol.
  • Normal-nucleic acid 0.5 was added and mixed, and then the normal-nucleic acid layer was separated. The above method
  • Example ⁇ 2-1> Into the water layer obtained in Example ⁇ 2-1> was added 0.5 ml of ethyl acetate, the mixture was separated, and the ethyl acetate layer was separated. After repeating the method three times, the mixture was concentrated under reduced pressure at 40 ° C. to obtain 56.0 g of an ethyl acetate fraction.
  • Example ⁇ 2-2> In the water layer obtained in Example ⁇ 2-2>, 0.5-butanol 0.5 was added and mixed, followed by separating a normal-butanol layer. After repeating the method three times, the mixture was concentrated under reduced pressure at 40 ° C. to obtain 41.4 g of a normal-butanol fraction.
  • Example ⁇ 2-3> The water layer obtained in Example ⁇ 2-3> was concentrated under reduced pressure at 40 ° C. to obtain 88.6 g of a water fraction.
  • Bovine serum albumin (BSA, Sigma, USA) was selected as a protein source. BSA was prepared by adding 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) to a concentration of 10 mg / m £.
  • a solution containing 0.2 M fructose and 0.2 M glucose was used as a sugar source.
  • fructose and glucose mixtures were added.
  • Weeping Ethanol Extract 2.5 Prepared at 5 or 10 / g / mC concentration, the normal-nucleic acid fraction is 10 ug / m 25 g / mi or 50 / g / m, the ethyl acetate fraction is 1.25 g / ml, 2.5; ug / me or 5 g / m £, normal-butanol fractions were prepared at a concentration of 1.25 ⁇ gM, 2.5 ⁇ M or 5 ⁇ /.
  • aminoguanidine was used as a positive control group, which is an index to compare the superiority of efficacy. Specifically, aminoguanidine was dissolved in distilled water and incubated for 14 days at 37 ° C. at a concentration of 18.5 Ug / mi, 37 ugM or 55.5 zg / mg, respectively. All cultures were prepared 4 by 4 to avoid the maximum error. After 14 days of culture, the contents of the final glycated product produced in the culture solution were analyzed and the results are shown.
  • the final glycosylated product was fluorescent, brown, not only possessed physicochemical properties that could cross-link, but also had ligands recognized by cell membrane receptors. Microplates of the amount of the final glycated product with these properties
  • the final saccharification product of the amphibian ethanol extract, methanol extract, water extract, normal-nucleic acid fraction, ethyl acetate fraction, normal-butanol fraction and water fraction of the ethanol extract IC 50 values of production inhibitory potency were 5.67 ⁇ s Mg / m 6.59 ⁇ , 6.75 g / M, 50 ug / £ or more, 4.68 ugM, 4.53 ugM, and 8.49, respectively.
  • ALT-711 4,5-dimethyl-3-
  • AGEs cross-linking breaker 2-oxo-2-phenylethyl -thiazolium chloride
  • the percentage of breaking was calculated according to the following formula [2]:% cross-linking of AGE-BSA.
  • the protein source was quantified by the lowry method using BSA. 135 mM Na, K-phosphate buffer (pH 7.0), 100 mM lithium sulfate, 0.03 mM NADPH, 0.04 mM DL-glyceraldehyde (DL-glycealdehyde) and 100 g / nve of enzyme The mixture was dissolved in 0.1% DMSO and added to the sample 50 distilled at each concentration to a total volume of 1 rng, followed by reaction at 37 0 C for 10 minutes.
  • test group was prepared without the addition of 0.04 mM DL-glyceride (DL-glycealdehyde), STD was 135 mM Na, K-phosphate buffer (pH 7.0), 100 mM lithium sulfate
  • STD was 135 mM Na, K-phosphate buffer (pH 7.0), 100 mM lithium sulfate
  • the reaction was terminated by adding 0.3 N of 0.5 N HC1 of the sample, followed by reaction for 10 minutes at 60 ° C. with 6 M NaOH 1 mi added with 10 mM imidazole, and NADP as a fluorescent product. The degree of conversion was measured. Samples were run three times.
  • the degree of efficacy was determined by using a spectrofluorophotometric detector (Bio-TEK, Synergy HT, US A). 360 nm, Em. Measured at 460 ran, expressed as an IC 50 value.
  • the amphibian extract was prepared at concentrations of 1 ⁇ ⁇ /, 2.5 ⁇ ⁇ ⁇ or 5 ⁇ / ⁇ , and the normal-nucleic acid fractions were 2.5 ug / i, 5 ug / mi or 10
  • Glutaric acid (3,3-tetramethyleneglutaric acid) was prepared at a concentration of 3.72 ug / mi, 4.66 ug / mH or 5.59 zg /, and the aldose reductase activity inhibitory activity was measured.
  • the inhibitory effect of aldose reductase activity of the normal-nucleic acid fraction, ethyl acetate fraction, normal-butanol fraction or water fraction was IC 60 value of 2.60 ug / mi, 5.58 ⁇ & ⁇ ,
  • the ethyl acetate fraction and the normal-butanol fraction were 2.3, 4.5 and 1.6 times better, respectively (Table 3). Therefore, the inhibitory effect of the aldose reductase activity of the amphibian extract, the ethyl acetate fraction, and the normal-butanol fraction was remarkably superior to that of the synthetic product which is a single synthetic compound.
  • SDT spontaneous diabetic Torii
  • a type 2 diabetes model animal Animals were spontaneous diabetic Torii (SDT) mice, type 2 diabetes model animals. 10-week-old male SDT rats (CLEA Japan Inc., Tokyo, Japan) were bred for 1 week and then bred for 15 weeks until the induction of hyperglycemia of 300 mg / dl. Feed and drinking water were fed freely. After 15 weeks, 8 rats per group were divided into 5 groups, and the amphibian extract (HR) and the control drug metformin (MET) were once daily.
  • HR amphibian extract
  • MET control drug metformin
  • test group was normal (NOR), diabetic (DM), metformin 350 mg / kg administered to the diabetic group (MET), 100 mg / kg administered ram extract to the diabetic group (HR-100), and nursing to the diabetic group.
  • Anesthesia was performed by intraperitoneal injection of pentobarbital sodium (25 mg / kg body weight).
  • pentobarbital sodium 25 mg / kg body weight.
  • the abdominal and thoracic cavity of anesthetized rats were opened to secure the heart and injected into the left ventricle with 50 mg / m £ fluorescein-textran (2xl0 6 molecular weight) prepared by dissolving in 1 sterile PBS.
  • the eye was removed and for the left eye, the retina was detached from the eyecup.
  • the detached retina was placed on a slide and mounted with an aqueous mounting medium. After drying thoroughly
  • the DM group showed fluorescence leaking out of blood vessels (arrows) due to damage to the blood retinal barrier, and non-perfusion areas (arrows) caused by narrowing of some blood vessels. ) was also observed.
  • MET metformin-treated group
  • HR-100 or HR-250 amphibian extract-administered group
  • a representative early symptom of diabetic retinopathy is one of the constitutive cells of retinal blood vessels.
  • Pericyte loss and acellular capillary formation so the vessels of the retina were separated and confirmed the loss of perivascular cells and acellular capillary formation.
  • the retina was extracted from the right eye of the rat, washed with running water, and incubated at 37 ° C for 3 hours in 3% trypsin. The degraded retina was transferred to PBS and the internal membrane was removed. The vascular frame was separated from the retinal background using glass rods, placed on a slide and dried. Changes in cell walls and nuclei were observed through PAS staining and hematoxylin staining.
  • FIG. 3 acellular capillary formation, loss of vascular endothelial cells, and closed vessels in which blood vessels are narrowed are observed.
  • MET metformin
  • HR-100 or HR-250 amphibian extract
  • the accumulation of the final glycated product, which is a cause of diabetic complications, in the retinal blood vessels and retinal neurons was increased in the diabetic group (DM) compared to the normal group (NOR).
  • the end glycated product accumulation was significantly reduced in the group administered with the extracts, especially in the high concentration group (HR-250), which was significantly better than the MET group (MET) (FIG. 4) .
  • Tissue sections were deparaffinized, hydrated and washed with PBS at a concentration of 20 ⁇ ⁇ ⁇ .
  • the proteinase K solution was treated at 37 ° C for 15 minutes and then washed again with PBS-37 hours in a TUNEL reation mixture solution (In situ cell death detection kit, AP, Roche, Germany). After reaction at ° C, the loss of perivascular and retinal neurons in the retinal vessels was observed under fluorescence microscopy. In addition, TUNEL staining was performed to confirm whether this loss was caused by apoptosis.
  • TUNEL reation mixture solution In situ cell death detection kit, AP, Roche, Germany.
  • the number of TUNEL positive cells was significantly increased in the diabetic group compared to the normal group, and the amphibian extract administration group (HR-100 or
  • the indicators ⁇ proteinuria, albuminuria, glomerular filtration rate (Ccr) ⁇ and glycated products ⁇ AGEs and carboxymethyllysine (CML) ⁇ were quantitatively analyzed. Proteinuria, albuminuria, glomerular filtration rate, AGEs, CML, ELISA analysis was performed to determine the podocyte synaptopodin and WT-1. Urine was mixed in a 96 well plate with 50: 1 M carbonate buffer (pH 9.6) in a 1: 2 ratio. The final dose was 100 // £ and then left for 3 hours at 37 ° C. After washing three times with 0.05% PBST and blocked with 3% skim milk (skim milk).
  • the proteinuria and CCr changes were significantly increased in the diabetic group (DM) compared to the normal group (NOR).
  • DM diabetic group
  • NOR normal group
  • the MET group showed higher levels than the diabetic group
  • the administration group (HR-100 or HR-250) showed a significant reduction compared to the diabetic group (DM).
  • DM diabetic group
  • NOR normal group
  • MET MET group
  • the administration group (MET) did not show a significant difference from the diabetic group (DM). However, in the low or high dose group of HR extract (HR-100 or HR-250)
  • tablets were prepared by tableting according to a conventional method for preparing tablets.
  • a capsule was prepared by layering the gelatine capsula according to a conventional method for producing a capsula.
  • Example ⁇ 1-1> of the present invention 0.5-5.0 parts by weight of ethanol extract of Example ⁇ 1-1> of the present invention was added to wheat flour, and bread, cake, cookies, crackers, and noodles were prepared using this mixture.
  • Example ⁇ 1-1> of the present invention To 5 to 10 parts by weight of the ethanol extract of Example ⁇ 1-1> of the present invention is added to milk. Milk was used to make various dairy products, such as butter and ice cream.
  • Brown rice, barley, glutinous rice, and yulmu were roasted by alpha in a known manner, and then dried to prepare a powder having a particle size of 60 mesh.
  • Black beans, black sesame seeds, and sesame seeds are also steamed and dried in a known manner.
  • the mill was made of a powder having a particle size of 60 mesh.
  • Example ⁇ 1-1> of the present invention was concentrated under reduced pressure in a vacuum concentrator, dried by spraying and drying with a hot air dryer, and then pulverized with a particle size of 60 mesh to obtain a dry powder.
  • Example ⁇ 1-1> prepared above were prepared by combining the following ratios.
  • [278] such as liquid fructose (0.5%), ligo sugar (2%), sugar (2%), salt (0.5%), water (75%)
  • the subsidiary material was mixed with 5 g of the ethyl acetate fraction of Example ⁇ 2-2> of the present invention homogeneously, followed by instant sterilization, and then packaged in a small packaging container such as a glass bottle or a plastic bottle.
  • Tomato or carrot juice of 5 g of the ethyl acetate fraction of Example ⁇ 2-2> of the present invention Vegetable juice was prepared by adding 1,000 m £.
  • Fruit juice was prepared by adding 1 g of the ethyl acetate fraction of Example ⁇ 2-2> to 1,000 mi of apple or grape juice.
  • the present inventors prepared the feed additive with the following composition using the normal-butanol fraction of Example ⁇ 2-3> as an active ingredient.
  • Tricalcium phosphate 1-20% by weight
  • Vitamin E 0.01-0.1% by weight
  • Enzyme powder 1 to 10% by weight
  • lactic acid bacteria 0.1 to 10% by weight
  • Bacillus culture medium 0.01 to 10% by weight
  • the amphibian extract or fractions thereof of the present invention are effective in preventing and delaying diabetic complications, and are natural extracts effective in preventing aging, diabetic complications, anti-aging and delaying, and pharmaceutical compositions for preventing and treating cancer. It is not only pharmaceutically usable but also useful as a nutraceutical or functional feed additive.

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Abstract

..본 발명은 수양류(Homonia riparia Lour) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한것으로서, 더욱 구체적으로는, 수양류 추출물 또는 이의 분획물은 당뇨합병증의 지표인 최종당화산물의 생성 및 알도즈 환원요소의 활성을 억제하며, 항백내장, 항망막증 및 항신증 효과를 통한 강력한 당뇨합병증 억제활성을 나타내므로, 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로서 유용하게 이용될 수 있다..

Description

명세서
발명의 명칭 : 한약 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로
함유하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물 기술분야
[1] 본 발명은 수양류 (Homonoi'a riparia Lour.) 추출물 또는 이의 분획물을
유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
[2]
배경기술
[3] 당뇨병 (diabetes mellitus)은 전 세계적으로 중요한 성인병 중의 하나로서 , 최근 우리나라에서도 급속한 경제 성장과 더불어 당뇨병 유병률이 10%에 달하며 , 현재 전 세계적으로도 당뇨환자는 2억 4천만 명 이 넘었으며， 2025년에는 전 세계적으로 3억 8천만 명으로 증가할 것이며，이중 60%가 아시아 지 역에서 발병할 것이라고 2009년 미국의사협회 (JAMA)에서 발표하였다. 특히
당뇨발병시기가 중장년으로 당겨졌으며，수명 이 연장됨으로 인해서 합병증으로 진행되는 것은 피할 수 없는 상황이 되 었다. 즉，일반적으로 당뇨병에 걸린 후 10 ~ 20년이 지나면 체내 거의 모든 기관이 손상을 받아 당뇨성 망막병증 (diabetic retinopathy), 당뇨성 백내장 (diabetic cataract), 당뇨성 신증 (diabetic nephropathy), 당뇨성 신경 병증 (diabetic neuropathy)，심장병 , 암 또는 골다공증 등이 나타난다. 만성 당뇨성 신증은 혈액 투석 치료 및 말기 신부전의 가장 중요한 원인이 되고 있으며，당뇨성 백내장과 망막증은 실명을 초래하고 결국엔 죽음에 이르게 한다. 미국의 경우 25ᅳ 74세 연령대의 실명의 원인이 당뇨병 이며，당뇨 발병 후 15 ~ 20년이 지나면 60%가 실명으로 이어진다. 그러므로 당뇨환자에 게서 합병증이 발병하는 기간이 5 ~ 10년 정도 지연만 되더라도 환자와 그 가족의 삶의 질이 달라질 것이며 , 국가재정에도 커다란 영향을 끼 칠 것이다.
[4]
[5] 이 러한 당뇨합병증을 유발하는 기전으로는 크게 단백질의 비효소적
당화반웅 (nonenzymatic glycation of protein), 들리을 경로 (polyol pathway) 및 산화적 스트레스 (oxidative stress) 등으로 설명되 고 있다. 단백질의 비효소적 당화반응 (nonenzymatic glycation of protein)이 란，단백질의 리신 잔기 등의 아미노산 그룹과 환원당이 효소 작용 없는 축합반응，즉 밀리아드 반응에 의 한 것으로，이 반웅의 결과로 최종당화산물 (advanced glycation endproducts, AGEs)이 생성된다. 단백질의 비효소적 당화반응은 (1) 단백질의 리신 잔기 등의
아미노산기와 환원당의 알데히드 또는 케톤이 효소 작용 없이 친핵성 첨가 반웅을 하여 초기 단계 산물인 쉬프염기 (schiff base)를 형성하고, 상기
쉬프염기와 인접 한 케토아민 어닥트 (ketoamine adduct)가 서로 축합하여 가역적 인 아마도리 (Amadori)형의 조기당화산물이 생성되는 단계 및 (2) 고혈당 상태가 지속되어 가역적 인 아마도리 형의 조기당화산물이 분해되지 않고 재배열 (rearrangement)되어 비가역산물인 최종당화산물이 생성되고, 이 렇게 생성된 최종당화산물들이 단백질 또는 지 질 등과 결합 또는
교차결합 (cross-linking)하여 비가역적 인 당화단백질 또는 당화지질 등의 산물이 생성되는 단계로 나눌 수 있다. 가역적 인 아마도리형의 조기당화산물과 달리 최종당화산물은 비가역적 인 반웅 산물이므로，일단 생성되면 혈당이 정상으로 회복되어도 분해되지 않고，최종당화산물이 결합한 단백질 또는 지질의 생존기간 동안 조직에 축적되어 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시켜 조직 곳곳에서 합병증을 유발시킨다 (Vinson, J. A. et al., 1996, J. Nutritinal Biochemistry 7: 559-663; Smith, P. R. et al., 1992， Eur. J. Biochem., 210: 729-739). 예를 들면，포도당과 여 러 종류의 단백질이 반웅하여 생성된 최종당화산물 중 하나인 당화 알부민은 만성' 당뇨성 신증을 일으키는 중요한 요인으로 작용한다. 당화 알부민은 당화가 진행되지 않은 정상 알부민에 비해 더 용이하게 신사구체 세포 내로 유입되고，고농도의 포도당은 메산지움 세포를 자극하여 세포외 기질 (extracellular matrix)합성을 증가시킨다. 과도하게 유입된 당화 알부민과 증가된 세포외 기질로 인하여 신사구체의 섬유화가 야기된다. 이와 같은 기전으로 신사구체가 계속 손상 받게 되어 혈액투석 또는 장기 이식 등의 극단적 인 치료방법을 쓸 수밖에 없는 단계에 이르게 돠는 것이다. 또한，만성 당뇨로 인하여 동맥벽에서는 콜라겐이，신사구체에서는 기저막성 단백질이 최종당화산물과 결합되어 조직에 축적됨 이 보고된바 있다 (Brownlee, M., et al., 1986, Sciences, 232, 1629-1632). 이처 럼 비효소적 단백질 당화반웅에 의하여 기저막，혈장 알부민，수정체 단백질，피브린, 콜라겐 등의 단백질에서 당화가 일어나며，생성된 최종당화산물이 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시켜 당뇨성 망막병증 (diabetic retinopathy), 당뇨성 백내장 (diabetic cataract), 당뇨성 신증 (diabetic nephropathy), 당뇨성 신경 병증 (diabetic neuropathy) 등의 만성 당뇨합병증올 유발시킨다. 또한, 고혈당 상태에서 최종당화산물이 생성되는 과정에서 지질대사 이상이 일어나고 동시에 생성되는 유해한 산소 자유라디칼에 대한 방어시스템 기능어 저하되어 산화적 스트레스가 유발된다고 보고된바 있다 (Yokozawa, T., et al, 2001， J. of Trad. Med., 18: 107-112). 이처 럼 비효소적 당화반응과 산화적 스트레스 (oxidative stress) 작용 기 전이 서로 연관되어 있다.
폴리올 경로란 (1) 알도스 또는 케토스로부터 알도스 환원효소 (aldose reductase, AR)작용에 의해 환원되어 솔비를을 형성하는 단계 및 (2) 솔비틀이 솔비롤 탈수소효소에 의해 산화되어 과당을 생성하는 단계로 이루어지는 과정 이다. 정상상태에서는 알도스 환원효소가 포도당에 대하여 친화력 이 매우 낮지만， 고혈당 상태에 의하여 폴리올 경로의 첫 번째 효소인 알도스 환원효소가 과도하게 활성화되어，이로 인해 과도한 고혈당이 솔비를과 과당으로 전환되어 조직에 축적되어 삼투압의 균형 이 깨져 합병증이 유발된다. 즉，증가한 삼투압으로 인하여 수분이 인입되어 당뇨성 망막병증 (diabetic retinopathy), 당뇨성 백내장 (diabetic cataract), 당뇨성 신경 병증 (diabetic neuropathy) 등으로 진행된다 (김웅진 외 , 당뇨병학, 대한 당뇨병학회，고려의 학, 483쪽;
Soulis-Liparota, T., et al., 1995, Diabetologia, 38: 357-394). 최종당화산물이 사람의 미세혈관 내피세포에서 폴리을 경로의 주효소인 알도스 환원효소를
활성화시키는 것이 보고된바 있다 (Nakamura, N., et al., 2000, Free Radic Biol. Med
., 29: 17-25). 이때 과당은 포도당에 비하여 단백질의 비효소적 당화반웅의 속도가 약 10배 정도 빠르다. 따라서 고농도의 과당이 단백질과 결합하여 결국은 최종당화산물의 형성을 가속화시킨다. 이와 같이，비효소적 당화반웅, 폴리올 경로 및 산화적 스트레스 (oxidative stress) 작용 기전들이 서로 연관되어 당뇨합병증을 유발시킨다. 고혈당 상태에서 최종당화산물이 생성되는 과정에서 지질대사 이상이 일어나고 동시에 생성되는 유해한 산소 자유라디칼에 대한 방어시스템 기능이 저하되어 산화적 스트레스가 유발된다고 보고된바 있다 (Yokozawa, T., et al, 2001 , J. of Trad. Med., 18: 107-1 12). 따라서 비효소적 당화반웅과 산화적 스트레스 (oxidative stress) 작용 기전이 서로 연관되어 있다. 따라서，당뇨합병증의 발병을 지 연하거나 예방 또는 치료하기 위해서는 최종당화산물 형성의 억제가 매우 중요한 것으로 밝혀졌다 (Brownlee, M., et al.,
1988, N. Engl. Med. , 318 1315-1321).
[7]
[8] 현재, 단백질 당화 억제제로 합성제제인 아미노구아니딘 (aminoguanidine)은 친핵성 히드라진 (hydrazine)으로, 아마도리 산물과 결합하여 단백질과의 교차결합을 방지함으로써 최종당화산물의 생성을 억제하여 합병증으로 진전되는 것을 지연 또는 방지 한다 (Brownlee, M., et al., 1986, Sciences, 232, 1629-1632; Edelstein, D. et al., 1992, Diabetes, 41 , 26-29). 아마노구아니딘은 당뇨합병증의 예방 및 치료에 가장 유망한 합성 의 약품으로 제 3상
임상실험까지 진행되었으나，장기간 투여 시 독성 이 유발되는 문제점 이 나타나 중단되 었다. 그러므로 안전하고 효능이 우수한 천연약제의 개발이 요망되고 있는 실정 이다.
[9]
[10]
[11 ] 수양류 (Ho 'a riparia Lour.)는 E-uphorbiaceae (대극과)에 속하는
상록관목이고，높이는 0.5 ~ 3 m이며 , 꽃은 1 ~ 5월경에 핀다. 한국, 인도, 중국， 대만，뉴기나아 등지에 분포한다. 한의학적으로 맛은 고 (苦: bitter taste)하고 약재의 성 (性)은 한 (寒)하다. 청 열해독 (淸熱解毒: dissipating heat and detoxifying), 이뇨 효능이 알려졌다. 그러나 현대의학적 인 약리작용 및 계속적 인 성분연구가 아직 보고되지 않았고，당뇨병 또는 당뇨합병증에 관한 수양류의 효능은 밝혀진 바가 없다. [12]
[13] 이에 본 발명자들은 당뇨합병증을 위 한，독성 및 부작용이 거의 없어 안전하고 효과적 안 천연 약재를 개발하던 증，수양류 추출물 또는 이의 분획물이 최종당화산물 및 알도즈 환원효소 생성을 억제함으로써 강력한 당뇨합병증 억제 활성을 나타내고，노화방지 또는 항암 작용 효능이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다
[14]
발명의 상세한 설명
기술적 과제
[15] 본 발명의 목적은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
[16]
과제 해결 수단
[17] 상기 목적을 달성하기 위하여，본 발명은 수양류 (Homono/α riparia Lour.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[18] 또한, 본 발명은 수양류 추출물을 추가적으로 유기용매로 분획하여 제조한 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[19] 또한, 본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
[20] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 및 개선용 기능성 사료첨가제를 제공한다.
[21] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 최종당화산물 억제용 조성물을 제공한다ᅳ
[22] 또한, 본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 노화방지 및 지연용 약학적 조성물을 제공한다.
[23] 또한, 본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 노화방지 및 지 연용 건강기능식품을 제공한다.
[24] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[25] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
[26] 또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 당뇨합병증에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨합병증 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
[27] 또한，본 발명은 약학적으로 유효한 양의 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는
최종당화산물 억제 방법을 제공한다.
[28] 또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 노화 억제 방법을 제공한다.
[29] 또한，본 발명은 약학적으로 유효한 양의 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
[30] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
[31] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 당뇨합병증 예방 및 개선용 건강기능식품의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
[32] 또한, 본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 당뇨합병증 예방 및 개선용 기능성 사료첨가제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
[33] 또한, 본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 최종당화산물 억제용 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
[34] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 노화방지 및 지 연용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
[35] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 노화방지 및 지연용
건강기능식품의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
[36] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 암 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
[37] 아을러，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 암 예방 및 개선용
건강식품의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
[38]
발명의 효과
[39] 본 발명의 수양류 추출물 또는 이의 분획물은 당뇨합병증의 지표인
최종당화산물의 생성 및 알도즈 환원효소의 활성을 억제하며，항백내장, 항망막증 및 항신증 효과를 통한 강력한 당뇨합병증 억제 활성，및 항산화 활성을 나타내므로，당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물의
유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
[40]
도면의 간단한 설명
[41] 도 1은 수양류의 추출 및 계통분리를 나타낸 그림 이다.
[42] 도 2는 제 2형 당뇨동물모델 (SDT)에서 수양류 추출물의 신생혈관 생성에 미치는 영향을 나타낸 그림 이다.
[43] 도 3은 제 2형 당뇨동물모델 (SDT)에서 수양류 추출물의 혈관주위세포 소실 및 무세포성 모세혈관 형성에 마치는 영향을 나타낸 그림 이다.
[44] 도 4는 제 2형 당뇨동물모델 (SDT)에서 수양류 추출물의 망막혈관 (왼쪽) 및 망막신경세포 (오른쪽) 최종당화산물 축적에 미치는 영향을 나타낸 그림 이다.
[45] 도 5는 제 2형 당뇨동물모델 (SDT)에서 수양류 추출물의 망막혈관 (왼쪽) 및 신경세포 (오른쪽)의 세포사멸 (apoptosis) 예방 효능을 나타낸 그림 이다.
[46] 도 6은 제 2형 당뇨동물모델 (SDT)에서 수양류 추출물의 신기능지표인 단백뇨, 알부빈뇨，사구체 여과율을 나타낸 그림 이다.
[47] 도 7은 제 2형 당뇨동물모델 (SDT)에서 수양류 추출물의 뇨 중 최종당화산물 및
CML 함량 변화에 미치는 영향을 나타낸 그림이다.
[48] 도 80은 제 2형 당뇨동물모델 (SDT)에서 수양류 추출물의 신장 내
최종당화산물 (AGEs) 및 CML 함량변화에 미치는 영향을 나타낸 그림 이다.
[49] 도 9는 제 2형 당뇨동물모델 (SDT)에서 수양류 추출물의 세포외 기질물질
축적에 따른 형 태학적 변화에 미치는 영향을 PAS 염색을 통해 나타낸 그림이다.
[50] 도 10은 제 2형 당뇨동물모델 (SDT)에서 수양류 추출물의 세포외 기질물질
축적에 따른 형 태학적 변화에 미치는 영향을 Masson's Trichrome 염색을 통해 나타낸 그림 이다.
[51] 도 11은 제 2형 당뇨동물모델 (SDT)에서 수양류 추출물의 발세포 (podocyte) 소실에 미치는 영향을 나타낸 그림 이다.
[52]
발명의 실시를 위한 최선의 형 태
[53] 이하，본 발명을 상세히 설명한다.
[54]
[55] 본 발명은 수양류 (Homono/a riparia Lour.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[56] 또한，본 발명은 수양류 추출물을 추가적으로 유기용매로 분획하여 제조한 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[57] 또한, 본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
[58] 상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막병증，당뇨성 백내장，당뇨성 신증, 당뇨성
신경병증，심장병，암, 골다공증，및 아테롬성 동맥경화로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 당뇨합병증은 당뇨병 이 장기간 지속될 경우 유발되는 증상이지만, 당뇨병의 발병 기준 및 판단 기준과 상이하며 , 당뇨합병증 치료제는 당뇨병 치료제와는 별개로서 사용될 수 있다.
[59] 상기 수양류 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다: [60] 1) 수양류 (Hom io/α riparia Lour.)에 추출용매를 가하여 추출하는 단계；
[61] 2) 단계 1)의 추출물을 식힌 후 여과하는 단계；및
[62] 3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계 .
[63] 상기 방법에 있어서，단계 1)의 수양류는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 수양류는 식물 전체를 이용할 수 있고，잎 또는 가지를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
[64] 상기 추출용매는 물，알코을 또는 이들의 흔합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C, 내자 C4 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하고，상기 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하며， 80% 에탄올을 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 물의 함량이 0.1 % 내지 50%인 알코올도 사용가능하다. 추출 방법으로는 여과법，열수추출，침지추출, 환류냉각추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적 인 방법을 이용할 수 있으며, 열수추출 방법으로 1회 내지 5회 추출하는 것이 바람직하며， 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 추출용매는 건조된 수양류 잎 및 가지 중량에 1 내지 10배 첨가할 수 있으며, 1 내지 5배 첨가하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20 내지 30°C인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한，추출시간은 24 내지 48시간인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
[65] 상기 방법에 있어서，단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는
진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한， 건조는 감압건조，진공건조，비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
[66] 본 발명의 구체적 인 실시 태양에 있어서，수양류 잎 및 가지를 물로 세척 한 후， 그늘에서 건조시켰다. 건조된 수양류 잎 및 가지를 분쇄하여 추출용기에 넣고， 추출용매로 상온에서 반복 추출하였다. 수양류 추출물을 수득한 후，거름종이 등을 이용하여 고형분을 제거하고 여과하였다. 상기 추출액을 감압 농축하여 수양류 추출물을'제조하였다.
[67] 상기 수양류 추출물의 분획물은 수양류 추출물에 추가적으로 유기용매를
가하여 유기용매 분획물을 제조하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
[68] 상기 방법에 있어서 , 상기 유기용매는 노르말-핵산，에틸아세테이트 또는
노르말-부탄올인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다ᅳ 상기 분획물은 상기 수양류 추출물로부터 분획 과정을 1 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복하여 수득할 수 있고，분획 후 감압 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
[69] 상기 분획물은 수양류 추출물을 물에 현탁시 킨 후 노르말-핵산，
에틸아세테이트, 노르말-부탄올 및 물로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 노르말 -핵산 분획물，에틸아세테이트 분획물，노르말-부탄올 분획물 또는 물 분획물 중 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
[70] 본 발명의 구체적 인 실시 태양에 있어서，상기 수양류 추출물에서 용매를 증발시키고 수득한 잔사에 물과 노르말-핵산을 넣어 노르말-핵산층을 분리하여 노르말-핵산 분획물을 수득하였다. 핵산층을 제외 한 물층에 에틸아세테이트를 흔합한 후 에틸아세테 이트층을 분리하여 에틸아세테이트 분획물을 얻었다. 또한，에틸아세테이트층을 제거 한 후 노르말-부탄올을 흔합한 후
노르말 -부탄올층을 분리하여 노르말-부탄올 분획물을 수득하였다. 마지막으로 노르말 -부탄올층을 제거한 후 물층의 물 분획블을 수득하였다 (도 1 참조).
[71] 본 발명자들은 당뇨합병증의 지표 및 치료 효능 평가의 지표가 되는
최종당화산물의 생성 억제 효능을 분석하기 위하여，단백질로
우혈청알부민 (bovine serum albumin; BSA)을 이용하여 과당 및 글루코스와의 결합 정도를 지표로 이용하였다. 또한, 양성대조군으로는 최종당화산물에 대한 억제 효능이 매우 우수하다고 알려진 아미노구아니딘 (aminoguanidine)올 이용하였다. 그 결과，수양류 추출물 또는 이의 분획물을 처 리한 시험군이 기존에 알려진 아미노구아니딘에 비해 훨씬 효과적으로 최종당화산물 억제 효능을 나타냄을 확인하였다 (표 1 참조).
[72] 본 발명자들은 수양류 추출물 또는 이의 분획물의 기능을 보다 정확하게
확인하기 위하여，최종당화산물과 BSA의 가교에 대한 절단 효능을 확인하였다. AGEs 가교 절단제 (cross-linker breaker)로 알려진 약물인 ALT-711 (Alteon Inc., Ramsey, NJ)과 수양류의 추출물 또는 이의 분획물을 비교한 결과, 수양류 추출물 또는 이의 분획물 모두에서 AGEs 가교 절단 (cross-linker breaking) 효과가 우수함을 확인하였다 (표 2 참조).
[73] 본 발명자들은 수양류 추출물 또는 이의 분획물의 당뇨합병증의 또 다른
지표가 되는 알도즈 환원효소의 활성 억제를 측정하였다. 비교 대조군으로는 3,3-테트라메칠렌글루타르산을 이용하여 측정하였다. 그 결과，본 발명의 수양류 추출물 또는 이의 분획물은 기존에 알려진 알도즈 환원효소 억제제에 비하여 더 효과적으로 알도즈 환원효소 활성을 억제하는 것으로 나타났다 (표 3 참조).
[74] 본 발명자들은 제 2형 당뇨동물모델인 SDT(spontaneous diabetic torii) 쥐에서 망막증 및 신증에 대한 수양류 추출물의 예방 및 치료 효과를 확인하였다. 그 결과, 수양류 추출물을 처리할 경우，당뇨군에서 나타나는 혈액망막장벽 손상， 혈관주위세포 소실 및 무세포성 모세혈관 형성 이 현저히 감소하였고 (도 2 및 도 3 참조)，망막혈관 및 망막신경세포에서 최종당화산물 축적 이 감소하였으며 (도 4 참조)，세포사멸이 저해되었으므로 (도 5 참조), 수양류 추출물이 당뇨성 망막증을 억제하는 효과를 가짐을 확인하였다. 또한，수양류 추출물 처 리에 의해，신기능지표 및，뇨 또는 신장에서의 AGE 및 CML 양에 유의적 인 감소가 나타났으며 (도 6，도 7 및 도 8 참조)，사구체 기저 막의 비후， mesangial matrix의 확장，사구체의 비 대，사구체 경화증，콜라겐 침작 정도 및 발세포 (podocyte) 손실이 현저히 감소하였으므로 (도 9，도 10 및 도 11), 당뇨성 신증을 효과적으로 억제함을 확인하였다.
[75] 이로써 본 발명의 수양류 추출물 또는 이의 분획물은 당뇨합병증의 원인이며 , 당뇨합병증 치료제의 효능 평가의 척도가 되는 최종당화산물에 대한 생성 저해 효과, 알도즈 환원효소 활성 억제효과 및 당뇨동물모델에서 의 당뇨합병증에 대한 효능이 우수한 것으로 나타났으므로, 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
[76] 본 발명의 조성물 총 증량에 대하여 본 발명의 수양류 추출물 또는 이의
분획물을 0.1 내지 99.9 중량 %를 유효성분으로 함유하고，약제학적으로 허용가능한 담체，부형제 또는 회석제를 포함할 수 있다.
[77] 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여 러 가지 제형 일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제，증량제, 결합제, 습윤제，붕해제，계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위 한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립계, 캡슐제 등이 포함되며，이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면，전분，탄산칼슘，
수크로오스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위 한 액상제제로는 현탁제，내용액제，유제, 시 럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물，리퀴드 파라핀 이외에 여 러 가지 부형제，예를 들면 습윤제，감미계，방향제，보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액，비수성용제，현탁제，유제， 동결건조제제，좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는
프로필렌글리 ^(propylene glycol), 폴리에 틸렌 글리콜，올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에 틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위 텝솔 (witepsol), 마크로골，트윈 (tween) 61, 카카오지 , 라우린지，글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
[78] 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여 될 수 있으며，비경구 투여시
피부외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육，피하, 자궁내 경막 또는 뇌 혈관내 주사 방식올 선택하는 것이 바람직하며，가장 바람직하게는 피부외용으로 사용한다.
[79] 본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중，연령 , 성별, 건강상태, 식 이,
투여시간, 투여방법 , 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며，일일 투여량은 수양류 추출물의 양을 기준으로 0.01 내지 1000 mg/kg이고,
바람직하게는 30 내지 500 mg/kg이고, 더욱 바람직하게는 50 내지 300 mg/kg이며， 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.
[80] 본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술，방사선 치료，호르몬 치료，화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
[81]
[82] 또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨합병증 예방 방법을 제공한다.
[83] 또한，본 발명은 약학적으로 유효한 양의 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 당뇨병에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨합병증 치료 방법을 제공한다.
[84] 상기 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며，그보다 바람직하게는 쥐，토끼，기 니아피크, 햄스터 , 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장
바람직하게는 침 팬지，고릴라와 같은 유인원류 동물이다.
[85] 상기 투여방법은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며，비경구 투여시
복강내주사，직장내주사，피하주사，정맥주사，근육내 주사，자궁내 경막 주사， 뇌 혈관내 (intracerebroventricular) 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있다.
[86] 상기 약학적으로 유효한 양이 란 0.0001 내지 100 mg/kg이고，바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg이며，이에 한정하지 않는다. 투여량은 특정 환자의 체중, 연령，성별，건강상태，식 이，투여기간，투여방법，제거율，질환의 증증도 등에 따라 변화될 수 있다.
[87] 상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막병증，당뇨성 백내장，당뇨성 신증, 당뇨성 신경 병증，심장병，암，골다공증, 및 아테름성 동맥경화로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
[88] 본 발명의 수양류 추출물 또는 이의 분획물은 최종당화산물의 생성 및 알도즈 환원효소의 활성을 억제하고, 최종당화산물과 단백질과의 가교를 분해하는 효능을 가질 뿐만 아니라，제 2형 당뇨동물모델에서 당뇨성 백내장，당뇨성 망막증 및 당뇨성 신증에 대한 억제 효과를 나타냄으로써 시험관 내 (/« vitro) 및 생체 내^ w)에서 당뇨합병증을 효과적으로 억제함을 확인하였으므로， 당뇨합병증의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
[89] 、
[90] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
[91] 또한, 본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 당뇨합병증 예방 및 개선용 건강기능식품의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
[92] 상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막병증, 당뇨성 백내장, 당뇨성 신증，당뇨성 신경 병증，심장병，암，골다공증，및 아테름성 동맥경화로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
[93] 본 발명 의 수양류 추출물 또는 이의 분획물은 최종당화산물의 생성 및 알도즈 환원효소의 활성을 억제하고，최종당화산물과 단백질과의 가교를 분해하는 효능을 가질 뿐만 아니라，제 2형 당뇨동물모델에서 당뇨성 백내장，당뇨성 망막증 및 당뇨성 신증에 대한 억제 효과를 나타냄으로써 시험관 내 (in iro) 및 생체 내 (/n )에서 당뇨합병증을 효과적으로 억제함을 확인하였으므로， 당뇨합병증의 예방 및 개선용 건강기능식품에 유용하게 사용될 수 있다.
[94] 본 발명의 기능성 식품은 여 러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당，과당과 같은 모노사카라이드，말토스，슈크로스와 같은 디사카라이드，및 덱스트린， 사이클로텍스트린과 같은 폴리사카라이드，자일리롤，소르비를，에 리트리를 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나，사카린，아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강식품 100 중량부당 0.01-0.04 중량부， 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 중량부 범위에서 선택하는 것이 바람직하다.
[95] 상기 외에 본 발명의 기능성 식품은 여 러 가지 영양제, 비타민，전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염 , 알긴산 및 그의 염, 유기산，보호성 콜로이드 증점제， pH 조절제，안정화제ᅳ 방부제，글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 기능성 식품은 천연 과일쥬스，과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이 러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이 러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강식품 100 중량부당 0.01-0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
[96]
[97] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 및 개선용 기능성 사료첨가제를 제공한다.
[98] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 당뇨합병증 예방 및 개선용 기능성 사료첨가제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
[99] 상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막병증，당뇨성 백내장, 당뇨성 신증, 당뇨성
신경병증, 심장병 , 암，골다공증，및 아테름성 동맥경화로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
[100] 본 발명의 수양류 추출물 또는 이의 분획물은 최종당화산물의 생성 및 알도즈 환원효소의 활성을 억제하고，최종당화산물과 단백질과의 가교를 분해하는 효능을 가질 뿐만 아니라, 제 2형 당뇨동물모델에서 당뇨성 백내장，당뇨성 망막증 및 당뇨성 신증에 대한 억제 효과를 나타냄으로써 시험관 내 ro) 및 생체 내 (！ 'n vi )에서 당뇨합병증을 효과적으로 억제함을 확인하였으므로, 당뇨합병증의 예방 및 개선용 기능성 사료첨가제에 유용하게 사용될 수 있다.
[101] 상기 사료첨가제는 가금류，가축 등에 게 꾸준히 섭취하게 함으로써
당뇨합병증을 예방할 수 있고, 이미 발생한 당뇨합병증을 치료할 수 있다.
[102] 본 발명의 사료첨가제에는 상기 수양류 추출물 또는 이의 분획물이 0.1 ~ 20% 중량부, 지방분해효소 (lipase)가 0.001 - 0.01% 증량부，제 3 인산칼슴이 1 ~ 20% 중량부, 비타민 E가 0.01 - 0.1% 증량부，효소분말이 1 ~ 10% 증량부，유산균이 0.1 ~ 10% 중량부, 바실러스 (bacillus) 배양액이 0.01 ~ 10% 중량부 및 포도당은 20 ~ 90% 중량부로 구성되 어 있는 것이 바람직하나，특별히 이에 한정하지 않으며， 수양류 추출물 또는 이의 분획물이 유효량으로 첨가되어 있다면，본 발명의 사료첨가제로서 이용 가능하다.
[103] 상기 유효량이 란，가금류，가축 등이 꾸준히 섭 취하게 함으로써 당뇨합병증을 예방하거나，이미 발생한 당뇨합병증을 치료할 수 있는 양을 의미 한다. 또한， 첨가에 의한 이 익을 넘는 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다.
[104] 또한 상기 사료첨가제는 추가적으로 가금류 및 가축 등에 허용되는 담체를
함유할 수 있다. 본 발명에 있어서는 상기 사료첨가제를 그대로 또는 공지 의 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며 , 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체，과립，펠릿，현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우는 가금류 및 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 흔합하여 공급할 수 있다.
[105]
[106] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 최종당화산물 억제용 조성물을 제공한다.
[107] 또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는
최종당화산물 억제 방법을 제공한다.
[108] 또한, 본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 최증당화산물 억제용
조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
[109] 본 발명의 수양류 추출물 또는 이의 분획물은 최종당화산물의 생성 및 알도즈 환원효소의 활성을 억제하고, 최종당화산물과 단백질과의 가교를 분해하는 효능을 가질 뿐만 아니라, 제 2형 당뇨동물모델에서 당뇨성 백내장, 당뇨성 망막증 및 당뇨성 신증에 대한 억제 효과를 나타냄으로써 시험관 내 0>! vitro) 및 생체 내 (zVz W )에서 당뇨합병증을 효과적으로 억제함을 확인하였으므로， 당뇨합병증의 지표인 최종당화산물 억제용 조성물의 유효성분 및 이 러 한 최종당산화물 억제용 조성물의 제조에 유용하게 사용될 수 있다. 또한，이 러한 수양류 추출물 또는 이의 분획물의 약학적으로 유효한 양을 유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하여，최종당산화물을 억제하는 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
[110]
[111] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 노화방지 및 지연용 약학적 조성물을 제공한다.
[112] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 노화방지 및 지연용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
[113] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 노화방지 및 지연용 건강기능식품을 제공한다.
[114] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 노화방지 및 지 연용
건강기능식품의 제조에 이용하는 용도를 제공한다ᅳ
[115] 최종당화산물이 생성되는 과정에서 지질대사 이상이 일어나고 동시에
생성되는 유해한 산소 자유라디칼에 대한 방어시스템 기능이 저하되아산화적 스트레스가 유발된다고 보고된 바 (Yokozawa, T., et al, 2001， J. of Trad. Med., 18: 107-112), 본 발명의 수양류 추출물 또는 이의 분획물은 최종당화산물의 생성을 효과적으로 억제하므로, 노화방지 및 지 연용 약학적 조성물 또는
강기능식품에 유용하게 사용될 수 있으며 , 본 발명의 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 상기 노화방지 및 지 연용 약학적 조성물 또는 건강식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있다. 또한，본 발명의 수양류 추출물 또는 이의 분획물의 약학적으로 유효한 양을 함유하는 조성물을 개체에 투여하여，개체의 노화를 억제시키는 방법으로 유용하게 사용할 수 있다.
[116]
[117] 또한，본 발명은 약학적으로 유효한 양의 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 노화 억제 방법올 제공한다.
[118] 본 발명의 수양류 추출물 또는 이의 분획물은 최종당화산물의 생성을
효과적으로 억제하므로，노화방지 및 지연을 위해 유용하게 사용될 수 있다.
[119]
[120] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[121] 또한，본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 암 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
[122] 또한, 본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
[123] 또한, 본 발명은 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 암 예방 및 개선용
건강식품의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
[124] 최종당화산물이 암을 유발한다는 것이 이미 보고된 바 (Tokuda H. et al., 2005， Book of Abstract of 53rd GA Congress joint with SIF, P076), 본 발명의 수양류 추출물 또는 이의 분획물은 최종당화산물의 생성을 효과적으로 억제하고， 최종당화산물과 단백질의 가교를 분해하는 효능을 가지므로, 암 치료 및 예방용 약학적 조성물 또는 암 치료 및 개선용 건강기능식품 및 이 러 한 임 치료 및 예방용 약학적 조성물 및 건강기능식품의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
[125]
[126] 또한，본 발명은 약학적으로 유효한 양의 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 방법을 제공한다.
[127] 또한，본 발명은 약학적으로 유효한 양의 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법올 제공한다.
[128] 본 발명의 추출물 또는 이의 부획물이 최종당화산물을 효과적으로 억제하고， 최종당화산물과 당백질의 가교를 분해하는 효능을 가지므로，약학적으로 유효한 양의 수양류 추출물 및 이의 분획물을 함유하는 조성물을 개체에 투여하여，개체의 암을 예방하거나 또는 암에 걸린 개체에 투여하여 암을 치료하는 방법으로 유용하게 사용할 수 있다.
[129]
[130]
[131] 이하，본 발명을 실시 예, 실험 예 및 제조예에 의해 상세히 설명 한다.
[132] 단，하기 실시 예，실험 예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐，본 발명의 내용이 하기 실시 예, 실험 예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
[133]
[134] <실시 예 1> 수양류 추출물의 제조
[135] <1-1> 수양류 에탄올 추출물
[136] 증거표본 (no. TBRC-VN-118)이 한국한의학연구원 한의융합연구본부
당뇨합병증연구센터 표본실에 보관중인 수양류 (Hom zc^ pan'a Lour.)의 잎과 가지를 사용하였다. 경동시장에서 구입하여 세절한 수양류의 잎과 가지를 분쇄한 후 80% 에탄올을 넣고，추출용기에서 상온상태로 반복 추출하여 , 상기 추출액을 여과한 후, 구성성분의 분해 및 가수분해를 방지할 수 있도록 농축 시 온도를 40 ~ 45°C 이하로 유지하며 감압 농축시켜 에탄올 추출물을 190 g을 수득하였다.
[137]
[138] <1-2> 수양류 메탄올 추출물
[139] 상기 실시 예 <1-1>의 방법에 따라 수양류 메탄올 추출물 170 g을 제조하였고, 이때 에 탄올 대신 메탄올을 사용하였다.
[140]
[141] <1-3> 수양류 물 추출물
[142] 상기 실시 예 <1-1>의 방법에 따라 수양류 물 추출물 195 g을 제조하였고，이때 에탄올 대신 물을 사용하였다.
[143]
[144] <실시 예 2>수양류 분획물의 제조 '
[145] <2-1> 수양류 노르말 -핵산 분획물
[146] 상기 실시 예 <1-1>에서 수득한 수양류 에탄올 추출물 12 g에 물 0.5 와
노르말 -핵산 0.5 넣고 흔합한 후 노르말-핵산층을 분리하였다. 상기 방법을
3회 반복 수행한 후， 40oC에서 감압 농축시켜 노르말 -핵산 분획물 3.98 g을 수득하였다.
[147]
[148] <2-2> 수양류 에틸아세테이트 분획물
[149] 상기 실시 예 <2-1>에서 수득한 물층에 에틸아세테 이트 0.5 를 넣어 흔합한 후 에틸아세테이트층을 분리하였다. 상기 방법을 3회 반복 수행한 후， 40°C에서 감압 농축시켜 에 틸아세테이트 분획물 56.0 g을 수득하였다. [151] <2-3>수양류 노르말-부탄올 분획물
[152] 상기 실시 예 <2-2>에서 수득한 물층에 노르말-부탄올 0.5 를 넣어 흔합한 후 노르말 -부탄올층을 분리하였다. 상기 방법을 3회 반복 수행한 후， 40°C에서 감압 농축시켜 노르말-부탄올 분획물 41.4 g을 수득하였다.
[153]
[154] <2-4>수양류 물 분획물
[155] 상기 실시 예 <2-3〉에서 수득한 물층을 40°C에서 감압 농축시켜 물 분획물 88.6 g을 수득하였다.
[156]
[157] <실험 예 1> 최종당화산물 생성 억제 효능 분석
[158] 상기 <실시 예 1>에서 수득한 수양류 추출물과 상기 <실시 예 2>에서 수득한 노르말-핵산，에틸아세테이트, 노르말-부탄올 또는 물 분획물의 시험관 내 최종당화산물 생성 억제 효능을 분석하였다. 단백질원으로 소혈청알부민 (bovine serum albumin; BSA, 미국 시그마)을 택하였다. BSA를 10 mg/m£의 농도가 되도록 50 mM 인산완층용액 (phosphate buffer; pH 7.4)에 첨가하여 제조하였다.
당원으로는 0.2 M 과당 및 0.2 M 글루코스가 흔합된 용액을 사용하였다. 상기의 제조된 BSA 용액에 과당 및 글루코스 흔합액을 첨가하였다. 수양류 에탄올 추출물은 2.5
Figure imgf000017_0001
5 또는 10 /g/mC 농도로 제조하였고, 노르말 -핵산 분획물은 10 ug/m 25 g/mi 또는 50 / g/m , 에틸아세테이트 분획물은 1.25 g/ml, 2.5 ； ug/me 또는 5 g/m£, 노르말-부탄올 분획물은 1.25 μgM, 2.5 μ Μ 또는 5 ^/ 농도로 제조하였다. 물 분획물은 2.5 ug/m 5 gM 또는 lO g/i 의 농도로 각각 제조하였다. 상기 모든 화합물을 디 메틸설폭사이드 (Dimethylsulfoxide; DMSO)에 녹인 후 15% 트원 (tween) 80을 첨가하였고，총 DMSO의 함량은 0.2%»이었다. 상기 제조된 추출물 또는 이의 분획물을 상기 BSA 및 당의 흔합액에 첨가하여
37°C에서 14일간 배양하였다. 이 때, 0.02% 소디움아자이드 (sodium azide) 및 안티마이코틱스 (antimycotics)를 항박테리아제 및 항진균제로서 첨가하였다. BSA 및 당 흔합액올 배양한 것을 대조군으로서 사용하였고, 추출물 또는 이의 분획물을 제조하여，배양하지 않을 것을 시험군과 대조군의
공시 험군 (blank)으로서 사용하였다. 한편，효능의 우수함을 비교할 수 있는 지표인 양성대조군으로서 아미노구아니 딘을 사용하였다. 구체적으로는， 아미노구아니딘을 증류수에 용해하여 상기에 기재한 방법으로 37°C에서 18.5 Ug/mi, 37 ugM 또는 55.5 zg/mg의 농도로 14일 동안 각각 배양하였다. 모든 배양액은 4개씩 준비하여 최 대한 오차를 피하였다. 배양 14일 후 배양액에서 생성된 최종당화산물의 함량을 분석하여 그 결과를 나타내었다.
최종당화산물은 형광，갈색을 띠고 있으며 교차결합을 할 수 있는 물리화학적 인 특성을 지니고 있을 뿐 아니라 세포막 수용체가 인지할 수 있는 배위자를 지니고 있었다. 이 러 한 특성을 지 닌 최종당화산물의 양을 마이크로플레이트
검줄기 (Microplate reader; Excitation: 350 nrn, Emission: 450 ran)로 즉정하여 최종당화산물의 생성 억제 정도를 분석하였다 (Vinson, J.A. et al., J. Nutr.
Biochem., 1: 659-663, 1996). 최종당화산물의 생성 억제율은 하기의 [수학식 1]에 따라 계산하였다.
[159]
[160] 수학식 1
[161] 그 결과，하기 [표 1]에 나타낸 바와 같이 , 수양류 에탄올 추출물，메탄올 추출물， 물 추출물, 에탄올 추출물의 노르말 -핵산 분획물，에틸아세테이트 분획물， 노르말-부탄올 분획물 및 물 분획물의 최종당화산물 생성 억제 효능의 IC50값은 각각 5.67ᅳ Mg/m 6.59 μΜ, 6.75 g/M, 50 ug/ £ 이상， 4.68 ugM, 4.53 ugM, 및 8.49 으로 나타났다. 이는 양성 대조군인 아미노구아니딘 (IC50값: 52.96 / g/ )보다 각각 9.3배， 8.0배， 7.8배， 11.3배， 11.7배 및 6.2배로 효능이 현저하게 우수한 것으로 증명되었고，추출물 중에서는 에탄올 추출물의 효과가 가장 효과적 인 것으로 나타났다 (표 1). 이에，수양류 추출물 또는 이의 분획물은 단백질과 당의 결합을 억제하여 최종당화산물의 생성을 저해하는 것으로 확인되었고，최종당화산물 저해 효능이 가장 뛰어난 에탄올 추출물을 하기의 당뇨합병증 효능 분석에 사용하였다.
[162]
[163] 표 1
[Table 1]
Figure imgf000019_0001
[164]
[165] <실험 예 2> 최종당화산물 (AGE) 가교의 절단 효능 평가를 위한 시험관 내 (!n vitro) 분석
[166] 1.0；g AGE-BSA를 콜라겐 코팅된 96 웰 마이크로 플레이트 (microtitre plate)에 분주한 후 37°C에서 4시간 동안 배양하였다. PBS에 0.05%로 첨가된
트원 (Tween)으로 3회 세척하여 결합되지 않은 AGE-BSA를 제거 한 후, 수양류 추출물 또는 AGEs 가교 저해제 (AGEs cross-linking breaker)로 알려진 약물인 ALT-711 (4,5-dimethyl-3-(2-oxo-2-phenylethyl)-thiazolium chloride; Alteon Inc., Ramsey, NJ)을 1000 g/m 부터 2배식 연속 희석하여 1 //g/mfi까지 제조한 후, 각 웰에 3회 (triplicate) 분주하고 37°C에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 각 웰을 PBS에 0.05%로 첨가된 트원으로 3회 세척하고, 콜라겐과 가교되어 남아있는 AGE-BSA를 검출하기 위하여 토끼 폴리클로날 항 -AGE-BSA 항체 (rabbit polyclonal anti-AGE-BSA antibody; MBL international, Woburn, MA)를 1:250으로 희석하여 각 웰에 분주한 후， 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 배양한 뒤 1시간 후， PBS에 으05%로 첨가된 트원으로 3회 세척하고, 호스라디시 페록시다제가 결합된 염소 항 -토끼 항체 (horseradish peroxidase-linked goat anti-rabbit antibody; Sigma, US A)를 적용한 후，
3，3'，5，5'-테트라메틸벤지딘 (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB)을 기질로 사용하여 발색한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. AGE-BSA의
절단 (breaking) 퍼센트는 AGE-BSA의 가교 %(Cross-linking %)는 하기 [수학식 2]에 따라 계산하였다.
[167]
[168] 수학식 2
[169] 그 결과，하기 [표 2]에 나타낸 바와 같이, 수양류 추출물의 AGE-BSA 절단 효능은 대조군인 ALT-711보다 38배 이상 우수함올 확인하였다 (표 2).
[170]
[171] 표 2
[Table 2]
Figure imgf000020_0001
[172]
[173] <실험 예 3> 알도즈 환원효소 (aldose reductase, AR) 활성 억제 효능 분석
[174] 수양류 추출물，또는 이의 노르말-핵산, 에 틸아세테 이트, 노르말-부탄올 및 물 분획물의 시험관 내에서 알도즈 환원효소 활성 억제 효능을 분석하였다.
듀프란 (Dufrane; 1984) 방법에 따라 SD 랫트 (Sprague-Dawley rat, 250 ~ 280 g)의 안구로부터 천연상태의 알도즈 환원효소를 얻기 위하여， 135 mM Na, K-인산완충용액 (K-phosphate buffer; pH 7.0) 및 10 mM
2-머캡토에탄올 (2-mercaptoethanol)을, 적출한 수정체와 함께
균질기 (Homogenizer)와 초음파분쇄기 (Sonicater)를 이용해 분쇄하였다. 14,000 rpm에서 30분간 원심분리 한 다음 상층액을 0.2 의 필터에 여과한 후
사용하였다. 상기 과정은 모두 4°C에서 수행하였다. 효소 (Enzyme)의
단백질원으로 BSA을 이용하여 라우리 (lowry) 방법으로 정량하였다. 135 mM Na, K-인산완층용액 (K-phosphate buffer; pH 7.0)， 100 mM 리튬 설페이트 (Lithium sulfate), 0.03 mM NADPH, 0.04 mM DL-글리세알데하이드 (DL-glycealdehyde) 및 100 g/nve의 효소 흔합물 (mixture)을 0.1% DMSO에 녹인 후 각 농도로 회석한 시료 50 에 첨가하여 총 부피 1 rng가 되도록 한 뒤 370C에서 10분간 반응시 켰다. 이 때，공시험군은 0.04 mM DL-글리세알데하이드 (DL-glycealdehyde)를 첨가하지 않은 흔합물을， STD는 135 mM Na, K-인산완충용액 (K-phosphate buffer; pH 7.0), 100 mM 리튬 설페이트 (Lithium sulfate)에 50 μί NADP(0.2 ~ 5 μΜ)를 첨가한 시료를 사용하였다. 시료 0.3 ^의 0.5 N HC1을 첨가하여 반웅을 종료시킨 뒤， 10 mM 이미다졸 (imidazole)이 첨가된 6 M NaOH 1 mi을 가하여 60°C에서 10분간 반응시켜 NADP가 형광 산물 (fluorescent product)로 전환되는 정도를 측정하였다. 시료는 3회 (triplicate) 수행하였다. 효능 정도는 Spectrofluorophotometric detector(Bio-TEK, Synergy HT, US A)를 이용하여 Ex. 360 nm, Em. 460 ran에서 측정하여， IC50값으로 나타내었다. 수양류 추출물은 1 μ^/ , 2.5 μ§Μ 또는 5 β / Άί 농도로 제조하였고, 노르말 -핵산 분획물은 2.5 ug/ i, 5 ug/mi 또는 10
«g/m£의 농도로, 에틸아세테이트 분획물은 0.5 ug/rni, 1 μζΜ, 2.5 의 농도로， 노르말-부탄을 분획물은 1 fig/mi, 2.5 ug/ i 또는 5.0 //g/ ^의 농도로, 물 분획물은 2.5 μgM, 5 g/mt 또는 10 zg/m£의 농도로 각각 제조하였다. 비교대조군으로는 우수한 알도즈 환원효소 활성 억제제 중의 하나인 3,3-테트라메칠렌
글루타르산 (3,3-tetramethyleneglutaric acid)을 3.72 ug/mi, 4.66 ug/mH 또는 5.59 zg/ 의 농도로 제조한 후 알도즈 환원효소 활성 억제효능을 측정하였다.
[175] 그 결과，하기 [표 3]에서 나타낸 바와 같이，수양류 추출물，추출물의
노르말 -핵산 분획물，에틸아세테이트 분획물，노르말-부탄올 분획물 또는 물 분획물의 알도즈 환원효소 활성 억제 효능은 IC50값이 각각 2.60 ug/mi, 5.58 μ&Μ,
1.20 ug/mi, 3.35 ug/ i, 7.19 «g/m£였다. 양성대조군인
3,3-테트라메칠렌글루타르산 (IC5。값: 5.41 /g/m£)과 비교하여 추출물，
에틸아세테 이트 분획물 및 노르말-부탄올 분획물이 각각 2.3 배， 4.5배 및 1.6 배 더 우수하였다 (표 3). 이에，수양류 추출물 또는 에 틸아세테이트 분획물, 노르말-부탄올 분획물의 알도즈 환원효소 활성 억제 효능은 단일 합성 화합물인 합성품과 비교하여 현저 히 우수함을 확인하였다.
[176]
[177] 표 3 [Table 3]
Figure imgf000022_0001
[178]
[179] <실험 예 4> 제 2형 당뇨동물모델에서의 효능 확인
[180] <4-1> 제 2형 당뇨동물모델 사육 및 수양류 추출물의 투여
[181] 제 2형 당뇨 모델동물인 spontaneous diabetic Torii(SDT) 쥐에 수양류 추출물의 당뇨합병증 예방 및 치료 효능을 검증하기 위하여 16주간 경구투여하여 효능을 분석하였다. 동물은 제 2형 당뇨모델 동물인 spontaneous diabetic Torii(SDT) 쥐를 사용하였다. 생후 10주령 수컷 SDT 쥐 (CLEA Japan Inc., Tokyo, Japan)를 1주일 동안 적웅시 킨 후 300 mg/dl의 고혈당이 유도되기까지 15주 동안 사육하였다. 사료와 음용수는 자유 급식하였다. 15주 후 군당 8마리씩 5군으로 나누어， 수양류 추출물 (HR)과 대조약물 메트포르민 (MET)을 날마다 1회
경구투여하였다. 시 험군은，정상군 (NOR), 당뇨군 (DM), 당뇨군에 메트포르민 350 mg/kg 투여군 (MET), 당뇨군에 수양류 추출물 100 mg/kg 투여군 (HR-100), 당뇨군에 수양류 추출물 250 mg/kg 투여군 (HR-250)이 었다. 각각의 군별로 16주 동안 하루 1회 경구투여 하였다. 부검 하루 전에 24시간 동안 뇨를 채취하였으며， 부검 시 적출한 장기는 -80°C에 보관하였다.
[182]
[183] <4-2> 제 2형 당뇨동물모델에서의 당뇨병성 망막증 억제 확인
[184] <4-2-1> 혈액망막장벽 손상 (Blood-retinal barrier breakage)
[185] 고혈당이 지속되면，안구의 망막혈관의 기능이상으로 혈액망막장벽 이 손상을 입게 되므로, 수양류 추출물의 혈액망막장벽 손상 방지에 대한 효과를
확인하였다. 상기 실시 예 <4-1>의 쥐의 부검 시，펜토바르비탈
나트륨 (pentobarbital sodium; 25 mg/kg 몸무게)을 복강 주사하여 마취시켰다. 마취된 쥐의 복강 및 흉강을 열어 심장을 확보하고, 1 의 멸균 PBS에 녹여 준비한 50 mg/m£ 플루오로세인-텍스트란 (fluorescein-dextran; 2xl06 분자량)을 좌심실에 주사하였다. 10분 후 안구를 적출하고，좌측 안구의 경우 망막을 아이 컵 (eyecup)에서 분리하였다. 분리된 망막을 슬라이드 위에 올려놓고 aqueous mounting medium으로 마운팅 (mounting)하였다. 층분히 건조시 킨 후
형광현미경에서 관찰하였다.
[186] 그 결과, [도 2]에 나타낸 바와 같이 , 정상군 (NOR)에서는 형광의 유출이
관찰되지 않았으나，당뇨군 (DM)에서는 대다수 개체에서 혈액망막장벽 손상으로 형 광물질이 혈관 밖으로 유출되는 현상 (화살표)이 관찰되었으며 , 일부 혈관이 좁아져 생기는 비관류부위 (non-perfusion area) (화살표)도 관찰되었다. 메트포르민 투여군 (MET)에서는 경미한 정도이지만 형광물질 유출이 드물게 관찰된 반면에，수양류 추출물 투여군 (HR-100 또는 HR-250)에서는 이 러한 증상이 관찰되지 않았다.
[187]
[188] <4-2-2> 혈관주위세포 소실 (pericyte loss) 및 무세포성 모세혈관 형성 (acellular capillary formation) 예방 효능
[189] 당뇨병성 망막증의 대표적 인 초기 증상은 망막혈관의 구성세포의 하나인
혈관주위세포의 소실 (pericyte loss) 및 무세포성모세혈관형성 (acellular capillary formation)이므로, 망막의 혈관을 분리하여 혈관주위세포의 소실 및 무세포성 모세혈관 형성 유무를 확인하였다. 쥐의 우측 안구에서 망막을 적출하여 흐르는 물에 세척하고, 3% 트립신에 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 분해된 망막을 PBS에 옮긴 후 내막 (internal membrane)을 제거하였다. 혈관 프레임 (vascular frame)은 유리막대를 이용하여 망막 백그라운드 (background)로부터 분리하여 슬라이드에 올려놓고 건조시켰다. PAS염 색 및 헤마톡실린 (hematoxylin) 염색을 통해 세포벽과 핵의 변화를 관찰하였다.
[190] 그 결과， [도 3]에 나타낸 바와 같이，혈관주위세포 소실 및 혈관내피세포의 소실을 동반한 무세포성 모세관 형성 (acellular capillary formation), 혈관이 좁아지는폐쇄 혈관 (closed vessel) 등이 관찰되었다. 이러 한 혈관주위세포 소실， 무세포성 모세관 형성 (acellular capillary formation), 폐쇄 혈관 (closed vessels)이 당뇨군에서 확연히 증가 되 었으며，메트포르민 (MET) 또는 수양류 추출물 투여군 (HR-100 또는 HR-250)에서는 이 러 한 변화가 현저히 감소된 것으로 나타났다 (도 3).
[191]
[192] <4-2-3> 최종당화산물 (Advanced glycation end products, AGEs)의 망막혈관 및 망막신경세포 축적 예방 효능
[193] 탈파라핀 과정과 함수과정을 거친 슬라이드를 내인성 페록시다제 (peroxidase) 활성을 제거하기 위해 3% 과산화수소 용액에 10분간 반웅시킨 후， 0.05% 트원 (Tween) 20이 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 비특이적 반웅을 제거하기 위하여 5% 카세인 (casein)을 이용하여 블로킹 (blocking)한 후， 1차 항체인 항 -AGEs 항체 (Cosmo Bio), 항 -GFAP 항체 (Santacurz)를 1:200으로 희석하여 1시간 동안 처 리하였다. 1시간 동안 PBS로 세척 한 후 labeled streptoavidin biotin(LSAB) kit(Dako, USA) 또는 FITC-결합된 2차 항체를 처 리한 후 DAB로 발색하여 형광현미경과 광학현미경하에서 AGEs 변화를 관찰 분석하였다.
[194] 그 결과， [도 4]에 나타낸 바와 같이，망막혈관 및 망막 신경세포에 당뇨합병증 원인 물질인 최종당화산물의 축적은 정상군 (NOR)에 비해 당뇨군 (DM)에서 증가 되었으며，수양류 추출물을 투여한 군，특히 고농도 투여군 (HR-250)에서 최종당화산물 축적 이 현저히 감소되 었고，이는 MET 투여군 (MET)보다 효능이 현저히 우수하였다 (도 4).
[195]
[196] <4-2-4> 망막혈관 세포 및 망막신경세포의 세포사멸 (apoptosis) 예방 효능
[197] 조직 절편을 탈파라핀하여 수화시 킨 후 PBS로 세척한 20 μζΜ 농도의
프로테이나제 K(proteinase K) 용액에 15분간 37°C에서 처 리한 다음，다시 PBS로 세척하였다 - TUNEL reation mixture 용액 (In situ cell death detection kit, AP, Roche, Germany)으로 1시간 동안 37°C에서 반웅시킨 후 형광현미경하에서 망막혈관의 혈관주위 세포 및 망막 신경세포의 소실 유무를 관찰하였다. 또한 이 러 한 소실이 세포사멸에 의한 것인지 확인하기 위하여 TUNEL염색을 실시하였다.
[198] 그 결과, [도 5]에 나타낸 바와 같이，정상군에 비해 당뇨군에서 TUNEL 양성 세포의 숫자가 현저히 증가하였으며，수양류 추출물 투여군 (HR-100 또는
HR-250)에서는 이 러한 망막혈관 및 신경세포의 세포사멸이 유의적으로 감소하였다 (도 5).
[199]
[200] <4-3> 제 2형 당뇨 동물모델에서의 당뇨병성 신증 관련 분석
[201] <4-3-1> 신기능지표， AGEs 및 CML 양의 분석
[202] 수양류 추출물의 만성 당뇨로 인한 신장 기능에 미치는 효과를 알아보기
위하여 , 부검 마지막 주에 24시간 동안 채취 한 뇨에서 신장기능
지표 {단백뇨 (proteinuria), 알부민뇨 (albuminuria)，사구체 여과율 (Ccr)} 및 당화 생성물 {AGEs 및 카르복시 메틸리신 (CML)} 양을 정량분석 하였다. 단백뇨， 알부민뇨，사구체 여과율， AGEs, CML, 발세포 (podocyte) l토포딘 (synaptopodin) 및 WT-1)를 측정하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다 96 웰 플레이트에 뇨를 코팅 완충액 (50m M carbonate buffer, pH 9.6)과 1:2 비율로 흔합하여 최종 용량이 100 //£가 되도록 한 후 , 37°C에서 3시간 동안 방치하였다. 0.05% PBST로 3회 세척 한 후 3% 탈지유 (skim milk)로 블로킹 (blocking)하였다. 1시간 방치 후 세척한 뒤， AGEs(Transgenic, Japan), CML(Transgenic, Japan), 알부민 (albumin), 시냅토포딘 (synaptopodin), WT-1 (Santa cruz, USA) 항체를 각각 1:1000으로 회석한 후 웰 당 100 ^씩 로딩한 후, 37°C에서 2시간 동안 방치하였다. 0.05% PBST로 세척한 후 HRP-결합된 2차 항체로 희석 한 후 100 ^를 로딩하여 37°C에서 1시간 동안 방치하였다. 0.05% PBST로 100 ^의 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine; TMB)을 첨가하였다. 5분 동안 방치 후 반응 정지 용액 (1M H2S04)을 100≠ 첨가하여 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다.
[203] 또한，면역학적 인 염색 분석은 하기의 방법에 따라 시 행하였다. 탈파라핀
과정과 함수과정을 거친 슬라이드를 내인성 페록시다제 (peroxidase) 활성을 제거하기 위하여 3% H202 용액에 10분 동안 반웅시킨 후, 0.05% 트원 20이 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 비특이적 반응을 제거하기 위하여 5%
AFB(animal free bock)을 이용하여 블로킹한 후， 1차 항체 AGEs(Transgenic, Japan), CML(Transgenic, Japan)를 각각 1:100으로 희석하여 1시간 또는 밤새 처 리하였다. 1시간 동안 PBS로 세척한 후 labeled streptavidin biotin(LSAB) kit(Dako, USA)를 처 리한 후, DAB(Dako,USA) 발색하여 광학현미경하에서 각각 관찰하였다.
[204] 그 결과， [도 6]에 나타낸 바와 같이，단백뇨， CCr 변화가 정상군 (NOR)에 비하여 당뇨군 (DM)에서 모두 유의적 인 상승하는 것을 확인할 수 있었다. 단백뇨의 경우, MET 투여군은 당뇨군보다 높은 수치를 보였고, 수양류 추출물
투여군 (HR-100 또는 HR-250)에서는 당뇨군 (DM)에 비하여 유의적 인 감소를 보였다. 알부민뇨 (albuminuria)의 경우，정상군 (NOR)에 비하여 당뇨군 (DM)에서 현저 한 상승이 관찰되었으며 , MET 투여군 (MET) 또는 수양류 추출물
투여군 (HR-100 또는 HR-250)에서는 모두 당뇨군 (DM)과 비교하여 유의적 인 감소를 관찰할 수 있었다. 사구체 여과율의 지표 (Ccr)의 실험 결과와 유사한 효능을 관찰할 수 있었다 (도 6). 또한, [도 기에 나타낸 바와 같이，뇨 증에서의 최종당화산물 AGEs 및 CML을 뇨에서 측정 한 결과，각각 정상군에 비하여 당뇨군의 수치가 유의적으로 상승하였고， MET 투여군 (MET)에서 유의적 감소는 보이지 않았다. 한편, 수양류 추출물 투여군 (HR-100 또는 HR-250)에서는 현저한 감소를 보였다 (도 7). 또한，신장 사구체의 조직 학적 염색 및 블랏팅 (blotting) 결과에서도 정상군 (NOR)에 비하여 당뇨군 (DM)에서 AGEs 및 CML의 축적 정도가 유의적으로 증가되었으며，수양류 추출물 투여군 (HR-100 또는
HR-250)에서는 농도 의존적으로 유의적 인 감소를 관찰할 수 있었다 (도 8).
[205] [206] <4-3-2> 사구체의 병 리학적 인 변화 분석
[207] 쥐 부검 시 신장을 적출하여 10% 중성화 포르말린에 밤새 고정한 후 탈수
과정을 거쳐 자일렌 (xylene)으로 3회 치환한 후 파라핀으로 포매하였다. 포매된 조직 블록을 4 두께로 연속 절편을 제작하여 슬라이드에 올려 사용하였다. 형 태학적 변화를 관찰하기 위하여 PAS(periodic acid shiff)와 Masson's trichrome 염색을 실시하였다. 염색이 끝난 슬라이드는 광학 현미경하에서 관찰하였다.
[208] 그 결과， [도 9]에 나타낸 바와 같이, 정상군 (NOR)에 비하여 당뇨군 (DM)
사구체에서 세포외 기질물질 침착에 의한 사구체 기저막의 비후,
혈관간기질 (mesangial matrix)의 확장 및 사구체의 비대 및 사구체 경화증이 현저하게 나타났다. 그러나 수양류 추출물 투여군 (HR-100 또는 HR-250)에서는 농도 의존적으로 사구체의 비후와 혈관간기질의 확장이 현저히 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. MET 투여군 (MET)에서는 당뇨군 (DM)에 비하여 형 태학적 변화 양상은 감소되었으나 현저 한 감소는 보이지 않았다 (도 9). 또한, 신장의 피 질에 침윤한 콜라겐에 의한 섬유증 (fibrosis)을 평가하기 위해 Masson's trichrome을 실시 한 결과, 사구체 내에 파란색 부위의 콜라겐 염색 부위가 정상군에 비하여 당뇨군 (DM)에서 현저하게 발견되 었으며 , MET
투여군 (MET)에서도 당뇨군 (DM)과 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나 수양류 추출물의 저농도 또는 고농도 투여군 (HR-100 또는 HR-250)에서는
당뇨군 (DM)에 비하여 콜라겐 침작 정도가 상당하게 적은 것으로 나타났다 (도 10).
[209]
[210] <4-3-3> 발세포 손실 (Podocyte loss)에 대한 예방 효과
[211] 초기 당뇨 상태에서는 사구체 내 발세포 (podocyte)의 소실이 일어나게 되므로， 발세포 마커로 알려진 synaptopodin과 WT-1을 통하여 발세포 소실에 관한 수양류 추출물의 효능을 분석하기 위하여，면역조직학적 염색방법을 통하여 뇨에서의 발세포 배출양을 측정하였다.
[212] 그 결과，정상군 (NOR)에 비하여 당뇨군 (DM)에서 현저하게 증가되 었음을 관찰 하였고 수양류 추출물 저농도 또는 고농도 (HR-100 또는 HR-250)로 투여한 군에서는 유의적으로 발세포 배출양이 감소됨에 따라 발세포 소실을 예방하는 것을 확인하였다 (도 11).
[213]
[214] 하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 제시 한다.
[215]
[216] <제조예 1> 약학적 제제의 제조
[217] <1-1> 산제의 제조
[218] 본 발명의 실시 예 <1-1>의 에탄올 추출물 2 g
[219] 유당 1 g
[220] 상기의 성분을 흔합하고 기밀포에 층진하여 산제를 제조하였다. [221]
[222] <l-2> 정제의 제조
[223] 본 발명의 실시 예 <1-1〉의 에탄올 추출물 100 mg
[224] 옥수수전분 100 mg
[225] 유 당 100 mg
[226] 스테아린산 마그네슴 2 mg
[227] 상기의 성분을 흔합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
[228]
[229] <1-3> 캡술제의 제조
[230] 본 발명의 실시 예 <2-1>의 노르말 -핵산 분획물 100 mg
[231] 옥수수전분 100 mg
[232] 유 당 100 mg
[233] 스테아린산 마그네슘 2 mg
[234] 상기의 성분을 흔합한 후, 통상의 캡술제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡술에 층전하여 캡슐제를 제조하였다.
[235]
[236] <1-4> 환의 제조
[237] 본 발명의 실시 예 <2-1>의 노르말 -핵산 분획물 l g
[238] 유당 1.5 g
[239] 글리세린 l g
[240] 자일리를 0.5 g
[241] 상기의 성분을 흔합한 후，통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
[242]
[243] <1-5> 과립의 제조
[244] 본발명의 실시 예 <2-1>의 노르말 -핵산 분획물 150 mg
[245] 대두 추출물 50 mg
[246] 포도당 200 mg
[247] 전분 600 mg
[248] 상기의 성분을 흔합한 후, 30% 에탄올 100 mg을 첨가하여 섭씨 60°C에서
건조하여 과립을 형성 한 후 포에 층진하였다.
[249]
[250] <제조예 2> 식품의 제조
[251] 본 발명의 수양류 추출물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다. , [252]
[253] <2-1> 밀가루 식품의 제조
[254] 본 발명의 실시 예 <1-1>의 에탄올 추출물 0.5-5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 흔합물을 이용하여 빵，케이크, 쿠키，크래커 및 면류를 제조하였다. [255]
[256] <2-2> 스프 및 육즙 (gravies)의 제조
[257] 본 발명의 실시 예 <1-1>의 쎄탄올 추출물 0.1-5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
[258]
[259] <2-3> 그라운드 비프 (ground beef)의 제조
[260] 본 발명의 실시 예 <1-1>의 에탄올 추출물 10 중량부를 그라운드 비프에
첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
[261]
[262] <2-4> 유제품 (dairy products)의 제조
[263] 본 발명의 실시 예 <1-1>의 에탄올 추출물 5~10 증량부를 우유에 첨가하고，상기 . 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
[264]
[265] <2-5> 선식의 제조
[266] 현미，보리，찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
[267] 검정콩，검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시 킨 것을 배전한 후
분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
[268] 본 발명의 실시 예 <1-1>의 에탄올추출물을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
[269] 상기에서 제조한 곡물류，종실류 및 실시 예 <1-1>의 에탄올 추출물을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
[270] 곡물류 (현미 30 증량부，율무 15 중량부，보리 20 중량부),
[271] 종실류 (들깨 7 증량부, 검정콩 8 중량부，검정깨 Ί 중량부),
[272] 본 발명의 실시 예 <1-1>의 에탄올 추출물 (3 중량부)，
[273] 영지 (0.5 중량부)，
[274] 지황 (0.5 중량부)
[275]
[276] <제조예 3> 음료의 제조
[277] <3 > 건강음료의 제조
[278] 액상과당 (0.5%), 을리고당 (2%)，설탕 (2%), 식 염 (0.5%), 물 (75%)과 같은
부재료와 본 발명의 실시 예 <2-2>의 에 틸아세테이트 분획물 5 g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리 병 , 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조하였다.
[279]
[280] <3-2> 야채 주스의 제조
[281] 본 발명의 실시 예 <2-2〉의 에 틸아세테이트 분획물 5 g을 토마토 또는 당근 주스 1,000 m£에 가하여 야채 주스를 제조하였다.
[282]
[283] <3-3> 과일 주스의 제조
[284] 본 발명의 실시 예 <2-2〉의 에틸아세테이트 분획물 l g을 사과 또는 포도 주스 1,000 mi 에 가하여 과일 주스를 제조하였다.
[285]
[286] <제조예 4> 사료첨가제의 제조
[287] 본 발명자들을 실시 예 <2-3〉의 노르말-부탄올 분획물을 유효성분으로 하여 하기와 같은 조성으로 사료첨가제를 제조하였다.
[288] <사료첨가제의 조성 >
[289] 본 발명의 실시 예 <2-3>의 노르말-부탄올 분획물: 0.1 ~ 20% 중량부，
[290] 지방분해효소 (Lipase): 0.001 ~ 0.01 % 중량부，
[291] 제 3 인산칼슘: 1 ~ 20% 중량부,
[292] 비타민 E: 0.01 - 0.1% 중량부，
[293] 효소 분말: 1 ~ 10% 중량부，
[294] 유산균: 0.1 ~ 10% 중량부，
[295] 바실러스 (Bacillus) 배양액: 0.01 ~ 10% 증량부, 및
[296] 포도당: 20 ~ 90% 중량부.
[297]
산업상 이용가능성
[298] 본 발명의 수양류 추출물 또는 이의 분획물은 당뇨합병증의 예방 및 지 연에 효과적 이며，노화방지에 효과적 인 천연 추출물로서，당뇨합병증，노화방지 및 지 연용, 암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 약학적으로 이용가능할 뿐 아니라 건강기능식품 또는 기능성 사료첨가제로서도 유용하게 이용될 수 있다.
[299]
[300]

Claims

청구범위
[청구항 1 ] 수양류 (Homiwo!'fl riparia Lour.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
[청구항 2] 제 1항에 있어서，상기 수양류 추출물은 물, C, ~ 4의 저급 알코올 또는 이들의 흔합용매로 추출한 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
[청구항 3] 제 2항에 있어서，상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
[청구항 4] 제 2항에 있어서，상기 저급 알코올은 물의 함량이 0.1 % 내지
50%인 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
[청구항 5] 제 1항에 있어서，상기 수양류 추출물은 수양류의 잎 또는 가지를 이용하는 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
[청구항 6] 수양류 추출물을 추가적으로 유기용매로 분획하여 제조한
분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
[청구항 7] 제 6항에 있어서，상기 분획물은 수양류 추출물을 물에 현탁시킨 후 노르말-핵산，에틸아세테이트，노르말-부탄올 및 물로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 노르말-핵산 분획물， 에틸아세테이트 분획물, 노르말-부탄올 분획물 또는 물 분획물 증 어느 하나인 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
[청구항 8] 제 1항 또는 제 6항 중 어느 한 항에 있어서 , 상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막병증, 당뇨성 백내장, 당뇨성 신증，당뇨성 신경 병증, 심장병，암, 골다공증，및 아테롬성 동맥경화로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
[청구항 9] 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는
당뇨합병증 예방 및 개선용 건강기능식품.
[청구항 10] 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는
당뇨합병증 예방 및 개선용 기능성 사료첨가제.
[청구항 1 1] 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는
최종당화산물 억제용 조성물.
[청구항 12] 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는
노화방지 및 지 연용 약학적 조성물.
[청구항 13] 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 노화방지 및 지연용 건강기능식품.
[청구항 14] 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
[청구항 15] 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 개선용 건강기능식품.
[청구항 16] 약학적으로 유효한 양의 수양류 추출물 또는 이의 분획물을
유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨합병증 예방 또는 치료 방법 .
[청구항 17] 약학적으로 유효한 양의 수양류 추출물 또는 이의 분획물을
유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 최종당화산물 억제 방법 .
[청구항 18] 약학적으로 유효한 양의 수양류 추출물 또는 이의 분획물을
유효성분으로 함유하는 조성물올 개체에 투여하는 단계를 포함하는 노화 억제 방법 .
[청구항 19] 약학적으로 유효한 양의 수양류 추출물 또는 이의 분획물을
유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법 .
[청구항 20] 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 당뇨합병증 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도.
[청구항 21] 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 당뇨합병증 예방 및 개선용 건강기능식품의 제조에 이용하는 용도.
[청구항 22] 수양류 추출불 또는 이의 분획물을 당뇨합병증 예방 및 개선용 기능성 사료첨가제의 제조에 이용하는 용도.
[청구항 23] 수양류 추출물 또는 이의 분획물올 최종당화산물 억제용 조성물의 제조에 이용하는 용도.
[청구항 24] 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 노화방지 및 지 연용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도.
[청구항 25] 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 노화방지 및 지연용
건강기능식품의 제조에 이용하는 용도.
[청구항 26] 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 암 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도.
[청구항 27] 수양류 추출물 또는 이의 분획물을 암 예방 및 개선용 건강식품의 제조에 이용하는 용도.
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