WO2012119558A1

WO2012119558A1 - 糖蛋白中去除/灭活朊病毒的方法

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Publication number: WO2012119558A1
Application number: PCT/CN2012/072089
Authority: WO
Inventors: 高霄梁; 季斌; 洪云海; 郭照晔; 季晓铭
Original assignee: 上海天伟生物制药有限公司
Priority date: 2011-03-08
Filing date: 2012-03-08
Publication date: 2012-09-13
Also published as: CN102675414A

Description

糖蛋白中去除 /灭活朊病毒的方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及治疗不孕症的糖基化蛋白质中的朊病毒去除 /灭活的方法。背景技术

阮病毒 ( proteinaceous infectious particle;缩写为 prion) 是 ^■禾中蛋白质，不含核酸，分子量 33KD— 35KD, 抗蛋白酶的 PrP^se是其唯一（或主要）成分；它是宿主 PrP基因编码的蛋白 PrP 翻译后修饰构象改变形成，在朊病毒病理发生中起主导作用，其复制和分离物（或毒株）的不同特性都由其自身和宿主 PrP^g互作用决定，而不依赖于任何核酸。在病毒分类上，近年来已将与卫星因子和类病毒一同纳入亚病毒因子（subviral agents) ，以与真病毒相区分。即正常生长的细胞膜糖蛋白 PrP^e (Cellular prion protein) 仅通过构象改变错误折叠成非正常蛋白 PrP^se (Scrapie form of prion protein) ，从而引起 PrP^se的积聚，最终导致神经元的 β -淀粉样变性，是一系列神经退化性疾病如：人类的库鲁病（Kuru disease) ，致死性家族失眠症，人和动物的克-雅氏症（Creutzfel-Jacob diseases, CJD) ，人和动物的传染性海绵状脑病 (Transmissible Spongiform encephalopathies ， TSE) ，牛海绵状脑病 (Bovine Spongiform encephalopathies ， BSE, 俗称疯牛病），以及羊、猫或其他动物的瘙痒症等的主因。

朊病毒具有和一切已知传统病原体不同的特性。它对物理化学因素有非常强的抵抗力，常规的烹饪甚至高压蒸汽消毒 134— 138°C 18分钟也不能使之完全失活；对 UV254nm抵抗力比常规病毒高 40— 200倍；对离子辐射和超声抵抗力也很强；在 37°C的 20%的福尔马林处理 18小时， 0.35%福尔马林处理 3个月也不能使之完全失去活性，室温下 10%-20%福尔马林溶液中可存活 18个月。朊病毒不被多种核酸酶灭活，在电子显微镜下看不到病毒颗粒。朊病毒不形成包涵体，不含非宿主蛋白；不诱生干扰素，对干扰素亦不敏感。免疫抑制剂和免疫增强剂不能改变朊病毒病的发生和发展过程。因此，使用现有的手段很难将其除去。

朊病毒的传播途径包括：食用动物肉骨粉饲料、牛骨粉汤；医源性感染，如使用脑垂体生长激素、促性腺激素和硬脑膜移植、角膜移植、输血等。朊病毒存在变异和跨种族感染，具有大量的潜在感染来源，主要为牛、羊等反刍动物，未知的潜在宿主可能很广，传播的潜在危险性不明，很难预测和推断。朊病毒可感染多个器官，已知的主要为脑髓，但在潜伏期内除中枢神经系统外，各种组织器官均有感染，且感染多途径，除消化道外，神经系统、血液均可感染，预防难度大，人畜一旦发病， 6个月至 1年全部死亡， 100% 的死亡率。

治疗不孕症的糖蛋白是一类结构接近的物质，包括绒毛膜促性腺激素

( HCG ) 、绝经期促性腺素（HMG ) 、卵泡剌激素（FSH ) 、黄体生成素（LH ) ，其中绝经期促性腺素是含有卵泡剌激素和黄体生成素且两者成一定比例（1 :

0. 1 - 1 ) 的混合物。临床上 HCG、 HMG、 FSH、 LH主要用于治疗不育症以及体外辅助生殖。它们可以从特定妇女（孕期或绝经期）的尿液中提取出来，也可通过 DNA重组技术而制备。

由于这类治疗不孕症的糖蛋白药物可以从特定妇女（孕期或绝经期）的尿液中提取出来，很可能存在包括朊病毒在内的大量各种类型的病毒，如果不能有效去除这些病毒就无法保证药品的安全性。

目前血制品药物的工艺过程中所使用的针对性的病毒去除 /灭活的多个步骤的组合，比如热处理、低 pH 处理、表面活性剂处理等，对上述糖基化蛋白质药物不完全适合，因为此类糖基化蛋白质药物对热和低 pH 的耐受性很差，容易失去活性。

按照 ICH Q5A生物制品病毒安全性评估的规程，要求工艺过程中应有 2 步或 2步以上的步骤的组合，并且至少有一步的病毒去除 /灭活率大于 10⁴，才能被认为是安全有效的病毒去除 /灭活方法。

因此，本领域迫切需要开发出适合治疗不孕症的糖基化蛋白质的去除 / 灭活朊病毒的工艺，以获得安全有效的药物。发明内容

本发明旨在提供一种去除和 /或灭活糖蛋白中的朊病毒的方法。在本发明的第一方面，提供了一种去除和 /或灭活糖蛋白中的朊病毒的方法，所述的方法由下述步骤构成： (a) 将含糖蛋白的溶液进行微孔膜过滤；

(b) 将含糖蛋白的溶液进行纳滤膜过滤或超滤膜过滤；和

(c) 将含糖蛋白的溶液进行阴离子交换层析；

所述步骤顺序为（a) 至（b) 至（c) 或（c) 至（a) 至（b) 。

在上述方法中，所述的糖蛋白选自绒毛膜促性腺激素、卵泡剌激素、黄体生成素、绝经期促性腺素、或其混合；所述绒毛膜促性腺激素是人绒毛膜促性腺激素或其变体，选自人尿来源的和 /或重组的人绒毛膜促性腺激素或其变体；所述绝经期促性腺素是人绝经期促性腺素或其变体，选自人尿来源的和 / 或重组的人绝经期促性腺素或其变体；所述卵泡剌激素是人卵泡剌激素或其变体，选自人尿来源的和 /或重组的人卵泡剌激素或其变体；所述黄体生成素是人黄体生成素或其变体，选自人尿来源的和 /或重组的人黄体生成素或其变体。

在上述方法中，步骤（a) 中所述微孔膜选自孔径为 0.1 Ι μ ηι的过滤膜；更佳地为 0.1— 0.45μ ηι的过滤膜。

在上述方法汇总，步骤（b)中所述纳滤膜选自孔径为 1 lOOnm的纳滤膜；更佳地为 10— 50nm的纳滤膜。

在上述方法中，步骤（b) 中所述超滤膜选自孔径为 1000道尔顿以上的超滤膜；更佳地为 100000道尔顿以上的超滤膜。

在上述方法中，步骤（c) 中所述阴离子交换层析在 pH5— 10的条件下进行；更佳地，步骤（c) 中所述阴离子交换层析在 pH6— 8的条件下进行。

在上述方法中，步骤（c) 中所述阴离子交换层析的树脂的骨架介质包括琼脂糖，葡聚糖，纤维素，苯乙烯和二乙烯基苯的交联物，丙烯酸和 /或其衍生物的交联物；步骤（C ) 中所述阴离子交换层析的树脂的活性基团选自二乙基季胺、或二乙基氨基乙基；更佳地，步骤（C ) 中所述阴离子交换层析的树月旨选自 DEAE Sephadex A50、 Q Sepharose FF或 DEAE Sepharose FF。在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括由上述的方法获得的糖蛋白以及药学上可接受的载体。

据此，本发明提供了一种适合治疗不孕症的糖基化蛋白质的去除 /灭活朊病毒的工艺，从而能够获得安全有效的药物。具体实施方式

虽然现有技术中已存在一些去除和 /或灭活蛋白质中病毒的方法，但是同样的方法对于不同的病毒，会产生无法预料的结果，有时甚至会适得其反。鉴于此，发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现可通过微孔膜过滤、纳滤膜或超滤膜技术以及阴离子交换层析这 3个步骤的适当组合，来达到去除 /灭活糖基化蛋白质中的朊病毒的目的，从而在温和条件下去除 /灭活朊病毒，并且保留了目标物一糖基化蛋白质的活性。在此基础上，发明人完成了本发明。

在探索过程中，发明人注意到，采用合适的微孔膜过滤技术，以及纳滤膜或超滤膜技术，不但可以截留朊病毒颗粒，而且可以让目标物从膜上滤过，可以达到将目标物和病毒分离的目的。另外，发明人在试验过程中意外发现，只要控制好适当的条件，可以通过阴离子层析将朊病毒和目标物分离，从而达到将目标物中的病毒去除的目的。

通过上述 3个步骤的组合，可以有效地去除 /灭活朊病毒，从而获得安全可靠的产品。定义

如本文所用， "糖蛋白" 和 "糖基化蛋白质" 可以互换使用，都是选自下述的一种或多种混合：绒毛膜促性腺激素（chorionic gonadotropin, CG) 、卵泡朿 Ij激素 ( follicule-stimulating hormone, FSH )、黄体生成素 (luteotropic hormone, LH ) 、绝经期促性腺素（human menopausal gonadotropin, HMG) 。

术语 "卵泡剌激素" 和 " FSH " 可互换使用，都是指一类用于促进精子或卵泡产生、促进卵巢发育的激素或其变体。在天然情况下由垂体前叶分泌，也可从绝经期妇女的尿液中提取或可通过重组技术获得的。本发明中的 FSH 可采用本领域常用的任何方式获得，例如天然产生、通过重组技术获得或合成，其中的杂质包括 LH或 CG。在本发明的一个实施方式中，所述卵泡剌激素是人卵泡剌激素或其变体，优选人尿来源的卵泡剌激素或是重组的人卵泡剌激素。

可用于本发明中的含有 FSH且包含作为杂质的 LH和 /或 CG的原料可为：未经任何预纯化步骤的原料、经预纯化步骤去除了部分杂质的原料、或经预纯化步骤而基本上只含 FSH和杂质 LH和 /或 CG的原料。优选在采用本发明的方法纯化 FSH前，采用本领域常规方法对原料 FSH 进行初步纯化，以分离除 LH或 CG以外的其它杂质。

如本文所用，术语 "黄体生成激素" 和 " LH " 可互换使用，指在含有 FSH的原料制备或获取过程中掺杂于其中的与天然 LH具有相同或相似结构和功能的激素。

如本文所用， "绝经期促性腺素" 、 "尿促性素"和 " HMG "可以互换使用，都是指一类由垂体产生的糖蛋白激素或其变体，含有 FSH和 LH两种活性成分。 HMG 可以是重组的绝经期促性腺素或其变体、或是人尿来源的绝经期促性腺素或其变体。其中 FSH和 LH的生物效价比例在 1 : 0. 1 - 3范围，更佳的在 1 : 0. 3- 1范围。

类似地，术语"绒毛膜促性腺激素"和 " CG "可互换使用，指在含有 FSH 的原料制备或获取过程中掺杂于其中的与天然 CG具有相同或相似结构和功能的激素。本发明提供的去除和 /或灭活蛋白质中的朊病毒的方法除了用于糖蛋白，也可用于糖蛋白组合物，所述的糖蛋白组合物包括糖蛋白和药学上 /食品学上可接受的载体。

如本文所用，术语 "药学上可接受的" 或 "食品学上可接受的" 的成分是适用于人和 /或动物而无过度不良副反应 (；如毒性、剌激和变态反应；)的，即有合理的效益 /风险比的物质。

如本文所用，术语 "药学上可接受的载体" 指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》（Remington ' s Pharmaceutical Sciences , Mack Pub. Co. , N.J. 1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

所述的 "药学上可接受的载体"可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、 pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中 pH 通常约为 5-8，较佳地， pH约为 6-8。方法

本发明提供的去除和 /或灭活糖蛋白中的朊病毒的方法由微孔膜处理、纳滤膜或超滤膜处理和阴离子交换层析处理步骤组成，其顺序是微孔膜处理、纳滤膜或超滤膜处理和阴离子交换层析处理；或是阴离子交换层析处理、微孔膜处理、和纳滤膜或超滤膜处理。

所述的步骤是微孔膜处理、纳滤膜或超滤膜处理和阴离子交换层析处理。

所述的微孔膜处理是将糖蛋白浓度为 10— 100毫克 /毫升（较佳地为 15 一 40毫克 /毫升，更佳地为 20— 30毫克 /毫升）的溶液通过微孔膜，去除和 / 或灭活朊病毒。所述微孔膜选自孔径为 0. 1— Ι μ ηι的细菌过滤膜；较佳地所述微孔膜选自孔径为 0. 1— 0. 45 μ ηι的细菌过滤膜。所述溶液 ρΗ5- 10，较佳地为 ρΗ6-8，所用缓冲液可以是磷酸盐、醋酸盐或 Tri s缓冲液等。

所述的纳滤膜或超滤膜处理是将糖蛋白浓度为 10— 100 毫克 /毫升（较佳地为 15— 40毫克 /毫升，更佳地为 20— 30毫克 /毫升）的溶液通过纳滤膜或超滤膜，去除和 /或灭活朊病毒。所述纳滤膜选自孔径为 1 一 l OOnm的纳滤膜；较佳地所述纳滤膜选自孔径为 10— 50nm 的纳滤膜。所述超滤膜选自孔径在 1000道尔顿以上的超滤膜；较佳地所述超滤膜选自孔径在 100000道尔顿以上的超滤膜。所述溶液 pH5-10，较佳地为 pH6-8，所用缓冲液可以是磷酸盐、醋酸盐或 Tri s缓冲液等。

所述的阴离子交换层析处理是将糖蛋白浓度为 15— 60毫克 /毫升（较佳地为 20— 40毫克 /毫升，更佳地为 25— 35毫克 /毫升）的溶液通过阴离子交换树脂，使得朊病毒被吸附在树脂上，而糖蛋白随着洗脱液流出，从而去除和 /或灭活朊病毒。所述溶液 pH5-10，较佳地为 pH6-8，所用缓冲液可以是磷酸盐、醋酸盐或 Tri s缓冲液等。可以使用本领域常规的阴离子交换树脂，例如但不限于， DEAE Sephadex A50， Q Sepharose FF或 DEAE Sepharose FF。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明的主要优点在于：

1、本发明提供的方法安全、高效。

2、本发明提供的方法条件温和，适合于工业化生产。下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手 M (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。朊病毒原溶液的制备

将受到朊病毒感染的动物的脑组织用高速匀浆器混匀 1分钟，然后在含 0.5%十二烷基肌酸钠的磷酸缓冲液中进行六次超声波混匀，每次 15 秒，得到均匀的脑组织匀浆。将脑组织匀浆在 0°C培养 30分钟，然后再次进行超声波混匀（共三次，每次 15秒）。

将匀浆在 4°C， 4500Xg条件下离心 30分钟，弃去颗粒物，取上清液，用含 0.5%十二烷基肌酸钠的磷酸缓冲液稀释到最终浓度为 10% (w/v) ，即为朊病毒原溶液，保存在 -80°C±15°C待用。实施例 1

将 50ml pH7.8±0.1 的磷酸缓冲液冷却到 12°C±2°C，然后加入到 0.6g DEAE Sephadex A-50中。将溶液在 12°C±2°C保持至少 15小时以使树脂充分溶胀。将溶胀好的树脂悬浊液装在 XK16柱中，使最终床层体积为 15ml。将蠕动泵的管中充满 pH7.0±0.1 的醋酸钠缓冲液，然后接在柱上。用上述缓冲液平衡至少 5个柱体积（75ml) ，控制流速在 0.17-0.18ml/min。如果需要可在柱的流出口测定流速，调整泵速以控制流速。收集并测量流出液的 pH，直到确定其与进口缓冲液 pH 值相同。关闭蠕动泵和柱出口，直到上柱样品准备完毕。

在 12°C±2°C 25ml平衡缓冲液（醋酸钠缓冲液， pH7.0±0.1) 中，边搅拌边加入 750mg HCG粗制品（上海天伟生物制药有限公司提供，免疫效价 4855 IU/mg) 。样品在 12°C±2°C持续搅拌适当时间，以确保 HCG充分溶解。然后测量溶解液的 pH，如果与平衡缓冲液不符，可用醋酸或氢氧化钠溶液调节，作为样品溶液，保持在 12°C±2°C。

将朊病毒原溶液用超声波混匀 3次，每次 15秒，然后在 4°C， 4500Xg 条件下离心 30分钟，弃去颗粒物，取上清液，依次用孔径为 0.45μ ηι， 0.2μ ηι 和 0. Ι μ ηι的滤膜进行预过滤，作为朊病毒溶液。

将 25ml样品溶液边搅拌边加入朊病毒溶液 2.5ml，混匀后，取样 lml，测定初始病毒加入量以及 HCG免疫效价。

将 20mL加入病毒的样品溶液以 0.17-0.18ml/min 的流速通过层析柱，同时开始收集流出液。当上样结束后，用平衡缓冲液洗柱，流速控制在 0.10-0. llml/min。收集到 50ml流出液时停止收集，作为收集液。混匀后取样 lml，测定病毒残留量以及 HCG免疫效价。

上述实验平行做 2份，分别为实验 A、实验 B。

病毒去除率的计算：病毒去除率 = lo_gl。病毒加入量 X上样体积 - lo_gl。病毒残留量 X收集体积

效价收率的计算：效价收率％ = (上样体积 X上样溶液的免疫效价） ÷ (收集体积 X收集溶液的免疫效价） X100%

病毒去除结果

结果表明，对朊病毒而言，病毒去除率大于 10²，可以认为这一步骤对提高 HCG药物安全性、去除朊病毒有一定的作用，但是尚未到达 ICH要求的大于 10⁴的安全有效的标准；另外从 HCG的效价收率可以看出整个过程对 HCG 的活性没有任何影响，说明此步骤不会使 HCG失活。实施例 2

除样品为 750mg HMG粗制品（上海天伟生物制药有限公司提供）夕卜，其它步骤与实施例 1一致。

病毒去除结果

结果表明，对朊病毒而言，病毒去除率大于 10²，可以认为这一步骤对提高 HMG药物安全性、去除朊病毒有一定的作用，但是尚未到达 ICH要求的大于 10⁴的安全有效的标准；另外从 HMG的效价收率可以看出整个过程对 HMG 的活性没有任何影响，说明此步骤不会使 HMG失活。对照例 1

除平衡液为 PH4. 0 ± 0. 1 的醋酸钠缓冲液之外，样品及步骤都与实施例 1 致。

病毒去除结果

结果表明，对朊病毒而言，病毒降低量低于 1 logl O , 因此可以认为在 pH为 4. 0 ± 0. 1 的平衡液条件下，这一步骤对提高 HCG生产安全、去除朊病毒几乎没有贡献。对照例 2

除平衡液为 pH11.0±0.1 的磷酸盐缓冲液之外，样品及步骤都与实施例

2一致。

实验结果

结果表明，这一步骤在 pH11.0±0.1条件下对 HMG的活性有影响，会导致效价损失，不适合产业化。实施例 3

将朊病毒原溶液用超声波混匀 3次，每次 15秒，然后在 4°C， 4500Xg 条件下离心 30分钟，弃去颗粒物，取上清液，依次用孔径为 0.45 μ m， 0.2 μ m 和 0.1 μ m的滤膜进行预过滤，作为朊病毒溶液。

在 40ml pH7.0±0.1 的醋酸铵溶液中，边搅拌边溶解 1200mg HCG粗制品 (上海天伟生物制药有限公司提供），保持在 12°C±2°C。将上述溶液边搅拌边加入朊病毒溶液 0.4ml，混匀后，取样 lml，测定初始病毒加入量以及 HCG免疫效价。

取 20ml加入病毒后的样品，使用 0.2μ ηι的滤膜进行过滤，将滤过液收集在另一个容器中。在最高压力不超过 30psi 条件下，用 5ml pH7.0±0.1 的醋酸铵缓冲液洗涤滤器。测量过滤液体积，并取样测定病毒残留量以及 HCG 免疫效价。

上述实验平行做 2份，分别为实验 A、实验 B。

效价收率的计算：效价收率％ = (上样体积 X上样溶液的免疫效价） ÷ (收集体积 X收集溶液的免疫效价） X100% 病毒去除结果

结果表明，朊病毒去除率在 1 loglO左右或低于 1 loglO, 可以认为这一步骤对提高 HCG药物安全性、去除朊病毒几乎没有贡献。实施例 4

除样品为 800mg HMG粗制品（上海天伟生物制药有限公司提供）夕卜，其它步骤与实施例 3—致。

病毒去除结果

结果表明，朊病毒去除率在 1 loglO左右，可以认为这一步骤对提高 HMG 药物安全性、去除朊病毒几乎没有贡献。实施例 5

准备 Pall Ultipor VF DV20 (20nm纳滤膜）滤器。用 20ml无菌超纯水在最大压力 30psi条件下充分湿润滤器。

将朊病毒原溶液用超声波混匀 3次，每次 15秒，然后在 4°C， 4500Xg 条件下离心 30分钟，弃去颗粒物，取上清液，依次用孔径为 0.45μ ηι， 0.2μ ηι 和 0.1 μ m的滤膜进行预过滤，作为朊病毒溶液。

取 20ml加入病毒后的样品，在最高压力 30psi(2070mba)条件下经过已湿润的 Pall VF DV 20 滤器过滤。将滤过液收集在另一个容器中。在最高压力 30psi条件下，用 5ml pH7.0±0.1 的醋酸铵缓冲液洗涤滤器。测量过滤液体积，并取样测定病毒残留量以及 HCG免疫效价。

上述实验平行做 2份，分别为实验 A、实验 B。

效价收率的计算：效价收率％ = (上样体积 X上样溶液的免疫效价） ÷ (收集体积 X收集溶液的免疫效价） Χ100%

病毒去除结果

结果表明，朊病毒去除率在 1 loglO左右或低于 1 loglO, 可以认为这一步骤对提高 HCG药物安全性、去除朊病毒几乎没有贡献。实施例 6

除样品为 800mg HMG粗制品（上海天伟生物制药有限公司提供）夕卜，它步骤与实施例 3—致。

病毒去除结果

结果表明，朊病毒去除率在 1 loglO左右或低于 1 loglO, 可以认为这一步骤对提高 HMG药物安全性、去除朊病毒几乎没有贡献。实施例 7

将 50ml pH7.8±0.1 的磷酸缓冲液冷却到 12°C±2°C，然后加入到 0.6g

DEAE Sephadex A-50中。将溶液在 12°C±2°C保持至少 15小时以使树脂充分溶胀。将溶胀好的树脂悬浊液装在 XK16柱中，使最终床层体积为 15ml。将蠕动泵的管中充满 pH7.0±0.1 的醋酸钠缓冲液，然后接在柱上。用上述缓冲液平衡至少 5个柱体积（75ml) ，控制流速在 0.17-0.18ml/min。如果需要可在柱的流出口测定流速，调整泵速以控制流速。收集并测量流出液的 pH，直到确定其与进口缓冲液 pH 值相同。关闭蠕动泵和柱出口，直到上柱样品准备完毕。

在 12°C±2°C 25ml平衡缓冲液（醋酸钠缓冲液， pH7.0±0.1) 中，边搅拌边加入 750mgHCG粗制品（上海天伟生物制药有限公司提供）。样品在 12 °C±2°C持续搅拌适当时间，以确保 HCG充分溶解。然后测量这一溶解样品的 ra和电导，如果与平衡缓冲液不符，可用醋酸或氢氧化钠溶液调节，作为样品溶液，保持在 12°C±2°C。

将 20mL加入病毒的样品溶液以 0.17-0.18ml/min 的流速通过层析柱，同时开始收集流出液。当上样结束后，用平衡缓冲液洗柱，流速控制在 0.10-0. llml/min。收集到 50ml流出液时停止收集，作为收集液。加入 5倍体积的无水乙醇沉淀，离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得 HCG中间品 1。准备 Pall Ultipor VF DV20滤器。用 20ml无菌超纯水在最大压力 30psi 条件下充分湿润滤器。

在 20ml pH7.0±0.1 的醋酸铵溶液中，边搅拌边溶解上述 HCG中间品 1，保持在 12°C±2°C。将此溶液用 0.2μηι的过滤膜进行过滤，收集滤过液。

然后在最高压力 30psi(2070mba)条件下将上述滤过液经过已湿润的

Pall VF DV 20滤器过滤。将滤过液收集在另一个容器中。在最高压力 30psi 条件下，用 5ml pH7.0±0.1 的醋酸铵缓冲液洗涤滤器。测量过滤液体积，并取样测定病毒残留量以及 HCG免疫效价。

上述实验平行做 2份，分别为实验 A、实验 B。

病毒去除率的计算：病毒去除率 = lo_gl。病毒加入量 X上样体积 - log_1Q 病毒残留量 X收集体积效价收率的计算：效价收率％ = (上样体积 X上样溶液的免疫效价） ÷ (收集体积 X收集溶液的免疫效价） Χ100%

病毒去除结果

结果表明，使用三步组合步骤对朊病毒去除率结果非常好，大于 10⁸ 完全超过了 ICH要求的大于 10⁴的安全有效的标准，效果明显好于单个步骤的结果以及对照例的结果。因此可以认为使用三步组合步骤对提高 HCG药物安全性、去除朊病毒有着显著的效果，而且 HCG的效价收率也很高，完全适合于工业化规模的生产。实施例 8

准备 Pall Ultipor VF DV20滤器。用 20ml无菌超纯水在最大压力 30psi 条件下充分湿润滤器。

将朊病毒原溶液用超声波混匀 3次，每次 15秒，然后在 4°C 4500Xg 条件下离心 30分钟，弃去颗粒物，取上清液，依次用孔径为 0.45μ ηι 0.2μ ηι 和 0. Ι μ ηι的滤膜进行预过滤，作为朊病毒溶液。

在 40ml pH7.0±0.1 的醋酸铵溶液中，边搅拌边溶解 800mg HMG粗制品 (上海天伟生物制药有限公司提供），保持在 12°C±2°C。将上述溶液边搅拌边加入朊病毒溶液 0.4ml，混匀后，取样 lml，测定初始病毒加入量以及 HMG免疫效价。

取 20ml加入病毒后的样品，保持在 12°C±2°C。将此溶液用 0.2 μ m的过滤膜进行过滤，收集滤过液。

Pall VF DV 20滤器过滤。将滤过液收集在另一个容器中。在最高压力 30psi 条件下，用 5ml pH7.0±0.1 的醋酸铵缓冲液洗涤滤器。合并滤过液和洗涤液，加入 4倍体积的无水乙醇沉淀，离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得 HMG中间品 1 将 50ml pH7.8±0.1 的磷酸缓冲液冷却到 12°C±2°C，然后加入到 0.6g DEAE Sephadex A-50中。将溶液在 12°C±2°C保持至少 15小时以使树脂充分溶胀。将溶胀好的树脂悬浊液装在 XK16柱中，使最终床层体积为 15ml。将蠕动泵的管中充满 pH7.0±0.1 的醋酸钠缓冲液，然后接在柱上。用上述缓冲液平衡至少 5个柱体积（75ml) ，控制流速在 0.17-0.18ml/min。如果需要可在柱的流出口测定流速，调整泵速以控制流速。收集并测量流出液的 pH，直到确定其与进口缓冲液 pH 值相同。关闭蠕动泵和柱出口，直到上柱样品准备完毕。

在 12°C±2°C 20ml平衡缓冲液（醋酸钠缓冲液， pH7.0±0.1) 中，边搅拌边加入上述 HMG 中间品 1，样品在 12°C±2°C持续搅拌适当时间，以确保 HMG充分溶解。然后测量这一溶解样品的 ra和电导，如果与平衡缓冲液不符，可用醋酸或氢氧化钠溶液调节，然后以 0.17-0.18ml/min 的流速通过 DEAE Sephadex A-50 层析柱，同时开始收集流出液。当上样结束后，用平衡缓冲液洗柱，流速控制在 0.10-0. llml/min。收集到 50ml流出液时停止收集，作为收集液。取样测定病毒残留量以及 HMG免疫效价。

上述实验平行做 2份，分别为实验 A、实验 B。

病毒去除结果

结果表明，使用三步组合步骤对朊病毒去除率结果非常好，大于 10⁸，完全超过了 ICH要求的大于 10⁴的安全有效的标准。因此可以认为使用三步组合步骤对提高 HMG药物安全性、去除朊病毒有着显著的效果，而且 HMG的效价收率也很高，完全适合于工业化规模的生产。实施例 9

除起始样品为 2000mg LH粗制品（上海天伟生物制药有限公司提供）以及用 100000道尔顿的超滤膜替代 Pall Ultipor VF DV20 (20nm纳滤膜）夕卜，其它步骤与实施例 7—致。

结果表明，使用三步组合步骤对朊病毒去除率结果非常好，大于 10⁸，完全超过了 ICH要求的大于 10⁴的安全有效的标准。因此可以认为使用三步组合步骤对提高 LH药物安全性、去除朊病毒有着显著的效果，而且 LH的效价收率也很高，完全适合于工业化规模的生产。实施例 10

HCG冻干针剂的制备

用于制造 10000瓶 HCG冻干针剂，且每瓶含 1000 IU HCG的生产的典型例子如下：

经过如实施例 7的三个步骤处理的 HCG精品，但请注意此处的每个步骤都不加入额外的病毒，计算出的一定量（以生物效价为单位）然后溶解于 100 mL注射用无热原水中，如果需要的话，用 HC1或 NaOH调节 pH7.0±0.2，然后用 0.22 μηι过滤器进行无菌过滤。

将 300 g甘露醇和 10.9 g Na¾P0₄ · 2¾0溶解于 3 L注射用无热原水中，用 NaOH调节 pH 7.0±0.2，用 0.22 μ ηι过滤器进行无菌过滤。然后加入到上述 HCG溶液中，用注射用无热原水定容至 7.0 L，混匀。

将上述溶液分装入西林瓶中，每瓶 0.70 mL，进行冷冻干燥。

所得到的西林瓶中，每瓶含 1000 IU HCG和 30 mg甘露醇。实施例 11

HMG冻干针剂的制备

用于制造 10000瓶 HMG冻干针剂，且每瓶含 75 IU FSH和 75IU LH的生产的典型例子如下：

经过如实施例 8的三个步骤处理的 HMG精品，但请注意此处的每个步骤都不加入额外的病毒，计算出的一定量（以生物效价为单位）然后溶解于 100 mL注射用无热原水中，如果需要的话，用 HC1或 NaOH调节 pH 6. 5 ± 0. 2，然后用 0. 22 μ ηι过滤器进行无菌过滤。

将 100 g乳糖溶解于 2 L注射用无热原水中，如果需要的话，用 HC1或 NaOH调节 pH 6. 5 ± 0. 2，用 0. 22 μ m过滤器进行无菌过滤。然后加入到上述 HMG溶液中，用注射用无热原水定容至 7. 5 L，混匀。

将上述溶液分装入西林瓶中，每瓶 0. 75 mL，进行冷冻干燥。

所得到的西林瓶中，每瓶含 75 IU FSH、 75 IU LH和 10 mg乳糖。实施例 12

FSH冻干针剂的制备

用于制造 10000瓶 FSH冻干针剂，且每瓶含 75 IU FSH的生产的典型例子如下：

经过如实施例 8的三个步骤处理的 FSH精品，但请注意此处的每个步骤都不加入额外的病毒，计算出的一定量（以生物效价为单位）的 FSH精品溶解于 50 mL注射用无热原水中，如果需要的话，用 HC1或 NaOH调节 pH 6. 5士 0. 2，然后用 0. 22 μ ηι过滤器进行无菌过滤。

将 100 g乳糖溶解于 2 L注射用无热原水中，如果需要的话，用 HC1或

NaOH调节 pH 6. 5 ± 0. 2，用 0. 22 μ m过滤器进行无菌过滤。然后加入到上述 FSH溶液中，用注射用无热原水定容至 7. 5 L，混匀。

将上述溶液分装入安瓿瓶中，每瓶 0. 75 mL，进行冷冻干燥。

所得到的安瓿瓶中，每瓶含 75 IU FSH和 10 mg乳糖。实施例 13

LH冻干针剂的制备

用于制造 10000瓶 LH冻干针剂，且每瓶含 75 IU LH的生产的典型例子如下：

经过如实施例 9 的三个步骤处理的 LH精品，但请注意此处的每个步骤都不加入额外的病毒，计算出的一定量（以生物效价为单位）的 LH 精品溶解于 50 mL注射用无热原水中，如果需要的话，用 HC1或 NaOH调节 pH 6. 5士

0. 2，然后用 0. 22 μ ηι过滤器进行无菌过滤。

NaOH调节 pH 6. 5 ± 0. 2，用 0. 22 μ m过滤器进行无菌过滤。然后加入到上述

LH溶液中，用注射用无热原水定容至 7. 5 L，混匀。

将上述溶液分装入安瓿瓶中，每瓶 0. 75 mL，进行冷冻干燥。

所得到的安瓿瓶中，每瓶含 75 IU LH和 10 mg乳糖。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims

权利要求

1. 一种去除和 /或灭活糖蛋白中的朊病毒的方法，其特征在于，所述的方法由下述步骤构成：

(a) 将含糖蛋白的溶液进行微孔膜过滤；

(b) 将含糖蛋白的溶液进行纳滤膜过滤或超滤膜过滤；

(c) 将含糖蛋白的溶液进行阴离子交换层析；

所述步骤顺序为（a) 、 (b) 、和（c) 或（c) 、 (a) 、和（b) 。

2.如权利要求 1 所述的方法，其特征在于，所述的糖蛋白选自绒毛膜促性腺激素、卵泡剌激素、黄体生成素、绝经期促性腺素、或其混合。

3.如权利要求 2所述的方法，其特征在于，所述绒毛膜促性腺激素是人绒毛膜促性腺激素或其变体，选自人尿来源的和 /或重组的人绒毛膜促性腺激素或其变体；所述绝经期促性腺素是人绝经期促性腺素或其变体，选自人尿来源的和 /或重组的人绝经期促性腺素或其变体；所述卵泡剌激素是人卵泡剌激素或其变体，选自人尿来源的和 /或重组的人卵泡剌激素或其变体；所述黄体生成素是人黄体生成素或其变体，选自人尿来源的和 /或重组的人黄体生成素或其变体。

4.如权利要求 1所述的方法，其特征在于，步骤（a) 中所述微孔膜选自孔径为 0. l-l um的过滤膜；更佳地为 0. l-0.45um的过滤膜。

5.如权利要求 1所述的方法，其特征在于，步骤（b) 中所述纳滤膜选自孔径为 1一 lOOnm的纳滤膜；更佳地为 10— 50nm的纳滤膜。

6.如权利要求 1所述的方法，其特征在于，步骤（b) 中所述超滤膜选自孔径为 1000道尔顿以上的超滤膜；更佳地为 100000道尔顿以上的超滤膜。

7.如权利要求 1所述的方法，其特征在于，步骤（c) 中所述阴离子交换层析在 pH5— 10的条件下进行。

8.如权利要求 1所述的方法，其特征在于，步骤（c ) 中所述阴离子交换层析在 PH6— 8的条件下进行。

9.如权利要求 1所述的方法，其特征在于，步骤（c ) 中所述阴离子交换层析的树脂的骨架介质包括琼脂糖，葡聚糖，纤维素，苯乙烯和二乙烯基苯的交联物，丙烯酸和 /或其衍生物的交联物。

10.如权利要求 1所述的方法，其特征在于，步骤（c ) 中所述阴离子交换层析的树脂的活性基团选自二乙基季胺、或二乙基氨基乙基。

1 1.如权利要求 1所述的方法，其特征在于，步骤（c ) 中所述阴离子交换层析的树月旨选自 DEAE Sephadex A50、 Q Sepharose FF或 DEAE Sepharose FF。

12 . 一种药物组合物，其特征在于，它包括权利要求 1 一 1 1任一所述的方法获得的糖蛋白以及药学上可接受的载体。