WO2012108195A1 - 遺伝子導入用ウイルスベクターの製造方法 - Google Patents

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康宏 保富
光雄 河野
哲哉 野阪
順平 大塚
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a viral vector for gene transfer.
  • human parainfluenza type 2 virus hPIV2
  • hPIV2 human parainfluenza type 2 virus
  • the viral vector has the ability to infect human cells and that it does not produce a spread virus in the human body after infection (denoted as a non-proliferative vector).
  • a cell / tissue is infected only once, but a system that does not produce a transmitted virus in the infected cell / tissue and does not cause multiple infections is required.
  • a part of the gene on the viral genome is deleted, a cell expressing the defective gene product is constructed, and the defective gene product is supplied to the defective virus in trans in the cell,
  • a system for producing a non-propagating vector is usually employed.
  • the system is introduced into adenoviruses (for example, WO94 / 28152) for DNA viruses and retroviruses (for example, WO2006 / 084746) for RNA viruses.
  • a Sendai virus vector lacking the F gene has been proposed for the Paramyxoviridae virus to which the human parainfluenza type 2 virus belongs (WO2000 / 070070).
  • tuberculosis-causing prevention vaccine using a non-proliferative genetically recombinant vector of human pareline fenza type 2 virus incorporating an ⁇ antigen (Ag85B) gene derived from a typical acid-fast bacterium Mycobacterium kansasii or Mycobacterium bovis BCG It has been reported that a strong growth inhibitory effect was observed (PCT / JP2010 / 069435).
  • the F gene-deficient human parainfluenza type 2 virus alone is a human that is required when a virus nucleocapsid is introduced into a host by fusing a virus envelope and a cell membrane in the replication / transcription process of the virus after entering the host cell. Since there is no Fusion protein of parainfluenza type 2 virus (hereinafter referred to as “F protein”), it is not possible to construct virus particles having the ability to grow independently.
  • F protein Fusion protein of parainfluenza type 2 virus
  • a cell that expresses the F protein of the virus is constructed, By culturing the defective virus in the cells, virus particles having infectivity are constructed by retaining the F protein on the virus envelope in the presence of the F protein supplied to the trans from the cell.
  • the genome of human parainfluenza type 2 virus particles recovered from the culture supernatant prepared by the propagation system lacks the F gene.
  • a cell line capable of expressing a gene encoding a membrane protein or the like that is deficient in a virus and allowing the deficient virus vector to be propagated is required to be a cell line that can always stably express the protein. Furthermore, there is a need for host cell systems that have robustness that does not change properties when passaged.
  • the present invention provides a cell line capable of always stably expressing the F protein of the human pareline fenza type 2 virus as a cell for proliferating a virus lacking the F gene of the human parein fenza type 2 virus, and so on. It is an object of the present invention to provide a method for producing an F gene-deficient human pareline fenza type 2 viral vector using various cells.
  • Vero cells have excellent properties as packaging cells capable of producing virus particles by infecting human pareline fenza type 2 virus F gene-deficient virus.
  • Vero cells are particularly highly tolerant to human pareline fenza type 2 virus F protein, have no interferon expression, and are stable even when the F gene of human parainfluenza type 2 virus is always expressed. It has been found that they can proliferate and can produce virus particles efficiently.
  • the present invention provides a method for producing a non-proliferating human parainfluenza 2 virus vector.
  • This method co-cultures a human parainfluenza type 2 virus deficient in the F gene with Vero cells having a mode in which the F gene of the human parainfluenza type 2 virus is non-inducibly expressed, and from the culture supernatant Each step of isolating the particles.
  • a vaccine or therapeutic gene is incorporated into the gene of human parainfluenza type 2 virus lacking the F gene.
  • the present invention provides a Vero cell having a non-inducible expression of the F gene of human parainfluenza type 2 virus.
  • a non-proliferating human parainfluenza type 2 virus vector can be stably and efficiently produced.
  • FIG. 1 shows the particle structure and genome of human parainfluenza type 2 virus.
  • FIG. 2 shows that F gene expression in F gene-expressing Vero cells after long-term culture (about 1 year) was confirmed by RT-PCR, and shows that F gene expression is maintained.
  • FIG. 3 shows Western blotting for confirming that F protein is expressed in F gene-introduced Vero cells.
  • FIG. 4 shows a part of the structure of a plasmid containing the antisense genomic cDNA of the human parainfluenza type 2 virus lacking the F gene and the GFP gene.
  • FIG. 5 shows Western blotting to confirm that hPIV2 lacking the M2 gene-bearing F gene expresses the M2 protein.
  • the present invention provides a method for growing a human parainfluenza type 2 virus deficient in the F gene using Vero cells having a non-inducible expression of the F gene of the human parainfluenza type 2 virus.
  • the human parainfluenza type 2 virus is a virus belonging to the Paramyxoviridae family, and its genome is a monocistronic single-stranded minus RNA of about 15,000 bases.
  • FIG. 1 shows the basic particle structure of human parainfluenza type 2 virus (hPIV2).
  • Nucleocapsid protein (NP) is bound to this nucleic acid to form a helically symmetric ribonucleoside protein complex (nucleocapsid, RNP).
  • NP protein, P (phospho) protein and L (large) protein are necessary for the formation of RNP.
  • F (fusion) protein and HN (hemagglutinin neuraminidase) protein are envelope proteins and are important for infection of cells.
  • M (matrix) protein is a membrane protein that supports the envelope structure.
  • human parainfluenza type 2 virus is an RNA virus that grows in the cytoplasm of infected cells, no gene is integrated into the chromosome of the host cell.
  • this virus is known to infect human respiratory tract mucosa and induce mucosal immunity by inducible expression of IgA, and since there have been no serious reports on adults, It is considered to be extremely useful as a virus vector.
  • human parainfluenza type 2 virus When human parainfluenza type 2 virus is modified so that it expresses NP protein, P protein and L protein and does not express F protein, it can infect a cell once, but infectivity in the cell Some virus particles cannot be produced. Therefore, it has an advantage of high safety as a viral vector for treatment / vaccine.
  • the F protein-expressing Vero cell of the human parainfluenza type 2 virus of the present invention is a host cell useful for producing such virus particles deficient in the F gene by propagating such F gene-deficient virus of the virus genome. is there.
  • Vero cells are cultured cells derived from the kidney epithelium of African green monkeys, and do not produce interferon, and are widely used in virus infection experiments and vaccine production throughout the world. It is. In the present invention, any of commercially available Vero cells may be used.
  • the “F gene” is a gene encoding the F protein of human parainfluenza type 2 virus.
  • this term refers not only to the genomic RNA of the viral gene, but also to a DNA having a corresponding sequence or a complementary sequence thereof. And RNA are used to mean both.
  • Non-inducible expression means that the expression is not an inductive expression system but is expressed without any induction operation.
  • the inducible expression system is a host / designed to be expressed only when an induction operation is not performed or when a suppression operation is performed, and only when an induction operation is performed or when the suppression operation is released.
  • a system comprising a combination of a vector and culture conditions. Many inducible expression systems are known in the art.
  • Non-inducible expression means expression without canceling the induction operation or suppression operation.
  • non-inducible expression is always expressed, but if expression may be suppressed in certain phases of cell division or cell cycle, or culture conditions such as culture temperature, medium composition, and cell density In the case where the expression may be suppressed by the expression, it is also included in the “non-inducible” expression in the present invention.
  • a recombinant plasmid vector having the F gene and a marker for example, drug resistance
  • a marker for example, drug resistance
  • the sequence of the F gene is already known, and a recombinant plasmid vector can be easily produced by incorporating the F gene into an appropriate commercially available plasmid vector.
  • Transfection can be performed according to a conventional method using various commercially available transfection reagents or by electroporation.
  • a transformant is identified using a marker, isolated, and expanded.
  • F protein in transformed Vero cells can be achieved by immunostaining with antibodies, by examining protein level expression by Western blotting, as shown in the examples described later, or by RNA level expression by RT-PCR or the like. Can be analyzed. Alternatively, the expression of F protein may be confirmed by observing the formation of polynuclear bodies in cell fusion of infected cells. Polynuclear body formation means that F-protein and receptor-binding protein HN, which is another membrane protein of virus, are expressed together in the same cell, so that adjacent cells fuse and form a huge cell with many cell nuclei gathered. That means.
  • Vero cells assumed to have been able to introduce the F gene are transfected with a plasmid containing the HN gene and polynuclear body formation is observed, it can be confirmed that the cell is functionally expressing the F gene. In this way, the desired recombinant Vero cells expressing the F gene can be cloned.
  • a method for producing a non-proliferating human parainfluenza type 2 virus vector lacking the F gene comprises co-culturing a human parainfluenza type 2 virus deficient in the F gene with the Vero cells of the invention having a non-inducible expression of the F gene of the human parainfluenza type 2 virus, and the culture supernatant Each step of isolating virus particles from
  • “Viral vector” means a viral particle in which a gene to be expressed in an infected cell is packaged together with a viral genome gene.
  • the viral genomic gene lacking the F gene can be obtained by deleting all or part of the F gene from a plasmid containing an antisense cDNA corresponding to the entire hPIV2 genomic gene using conventional gene recombination techniques. , And can be constructed by introducing a stop codon mutation into a part of the F gene. In order to avoid that the viral vector administered to the subject regains the function of the F gene due to mutation, it is preferable to delete the entire F gene. Also preferably, the non-propagating viral vector according to the present invention is designed to include a cloning site for incorporating various therapeutic genes.
  • a plasmid constructed so that the viral genome gene deficient in the F gene is expressed under the control of the T7 promoter, and the F protein and polymerase of hPIV2
  • the hPIV2 polymerase unit (NP protein, P protein and L protein) is expressed in F cells expressing T7 RNA polymerase together with four types of vectors expressing the unit (NP protein, P protein and L protein), or a plasmid expressing T7 polymerase.
  • Transfect Vero expressing the gene. After culturing the infected cells for 3 to 6 days, F gene-deficient virus particles can be recovered from the culture supernatant.
  • the virus particle When the F gene-deficient virus particle thus obtained is infected with a Vero cell expressing the F gene of the present invention, the virus particle grows in the cell and is itself an F gene-deficient virus particle. Produces infectious virus particles with F protein on the viral envelope.
  • a therapeutic / vaccine gene is incorporated into a viral vector based on a human parainfluenza type 2 virus lacking the F gene, and is obtained by the method of the present invention.
  • a therapeutic gene By infecting a target cell with a viral vector, a therapeutic gene can be introduced into the target cell.
  • a therapeutic gene is a gene to be expressed in an infected cell. Examples include a gene encoding a protein derived from mammals including humans or a part thereof, a gene encoding a cancer antigen or a part thereof, Examples include genes derived from bacteria and viruses, genes encoding therapeutic antibodies or parts thereof, fragments of these genes, and genes in which mutations have been introduced into these genes.
  • Viral vectors containing genes derived from bacteria or viruses or fragments thereof are useful as vaccines. Incorporation of a therapeutic gene into the gene of human parainfluenza type 2 virus can be performed by a conventional method using conventional recombinant DNA technology and reverse genetic technology.
  • the viral vector produced according to the present invention can typically be administered as a spray to mammalian cells including humans.
  • the propellant can be prepared by a conventional method.
  • the culture supernatant containing the virus vector is concentrated if necessary, suspended in a buffer solution such as PBS or physiological saline together with an appropriate carrier or excipient, and then sterilized by filtration with a filter or the like as necessary. It can then be prepared by filling aseptic containers. You may add a stabilizer, a preservative, etc. to a propellant as needed.
  • the expression vector thus obtained can be administered by inhalation to a subject.
  • an aspect represented by the expression “comprising” is an aspect represented by the expression “essentially consistent of”. And an aspect represented by the expression “consisting of”.
  • Example 1 Production of F gene-expressing Vero cells
  • the F gene excised from the genomic gene of hPIV2 was introduced into a plasmid carrying the neomycin resistance gene (Neo) and carrying the avian ⁇ -actin promoter sequence and the rabbit ⁇ -globin polyA sequence.
  • Plasmid pCXN2-F was constructed.
  • plasmid pCAL-F constructed so that F gene can be expressed by the Cre-loxP induction system was used. These plasmids were transfected into Vero cells using amaxa nucleofector.
  • Transfected cells were cultured in a medium containing neomycin (1 mg / ml) and screened for drug resistance by neomycin. Twenty strains of drug-resistant colonies were isolated from cells into which pCXN2-F had been introduced and 27 strains were isolated from cells into which pCAL-F had been introduced, and the expression of F gene was examined. At that time, when pCAL-F was used as a plasmid, Cre gene-carrying adenovirus was infected, and unnecessary gene fragments were removed with the loxP sequence to induce F gene expression.
  • a plasmid SR ⁇ -HN carrying the HN gene was prepared, and the obtained neomycin-resistant Vero cells were transfected using a nucleofector. One or two days later, the formation of polynuclear bodies was observed under a microscope, and secondary selection was performed using the cells forming the polynuclear bodies as F gene-expressing cells. Of the 20 clones isolated from cells transfected with pCXN2-F, 12 clones showed multinucleating ability. *
  • F gene expression was measured at the RNA level by RT-PCR.
  • 12 clones showed multinucleating ability, and 9 clones were positive in RT-PCR.
  • 9 clones showed multinucleating ability, and 7 clones were positive in RT-PCR.
  • 2 ⁇ 10 6 Vero cells introduced with the F gene by pCXN2-F and cultured for one year were subjected to One-Step RT-PCR (QIAGEN).
  • PCR was performed by setting primers so that a PCR amplification product was obtained at around 550 bp when an F gene-deficient virus genome was present.
  • a PCR amplification product band was confirmed around 550 bp in each of the three different clones. It was confirmed that the F gene was still expressed (FIG. 2). That is, Vero cells that always express the F gene could be obtained with efficiency comparable to Vero cells that induced and expressed the F gene, and could continue to be stably expressed for a long time. This indicates that Vero cells are highly tolerant to F protein and can stably proliferate even when the F gene is always expressed for a long period of time.
  • F protein expression in F gene-expressing Vero cells was confirmed. 9.5 ⁇ 10 5 F gene-expressing Vero cells were biotinylated on all proteins on the cell membrane using 1 ml of 0.03% Sulfo-NHS-LC-Biotin solution. A cell lysate was prepared. Next, 300 ⁇ l of cell lysate was selectively collected by concentrating F protein-specific antibody with 80 ⁇ l of F protein-specific antibody by immunoprecipitation method. The entire sample was subjected to SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane. At this point, the F protein has already been biotinylated, and an avidin-biotin complex was formed by the avidin-biotin complex method. Since avidin is labeled with horseradish peroxidase (HRP), it was reacted with ECL reagent to detect biotinylated F protein by HRP emission (FIG. 3).
  • HRP emission HRP emission
  • Example 2 Construction of F gene-deficient antisense hPIV2 genome A sequence containing the entire F gene coding region was completely deleted from a plasmid containing an antisense cDNA corresponding to the entire genomic gene of hPIV2 downstream of the T7 promoter, and NotI restriction was performed. A plasmid (hPIV2- ⁇ F-GFP) in which a GFP (green fluorescent protein) gene was incorporated at the site was constructed (FIG. 4). Construction is a multistep process using primers designed based on the sequences of the upstream and downstream regions of the F gene and a GFP gene fragment excised from a commercially available GFP-containing vector as a template containing the hPIV2 genomic gene. Performed by PCR.
  • Example 3 Recovery of F gene-deficient virus particles using F-expressing Vero cells Cells expressing T7 RNA polymerase using the plasmid (hPIV2- ⁇ F-GFP) prepared in Example 2 using lipofectamine or FUGENE6 as a transfection reagent Transfected. At this time, a total of four types of vectors expressing hPIV2 F protein and polymerase unit (NP protein, P protein and L protein) were transfected together.
  • the supernatant was collected and infected with F gene-expressing Vero cells or normal Vero cells not expressing the F gene, and GFP fluorescence was observed 6 days after the infection.
  • F gene-expressing Vero cells GFP fluorescence was observed throughout the cells.
  • normal Vero cells the number of cells exhibiting GFP fluorescence was much smaller than that in F gene-expressing Vero cells.
  • the culture supernatant of F gene-expressing Vero cells exhibiting GFP fluorescence was collected, infected with another F gene-expressing Vero cell on a petri dish, and the culture supernatant was collected. After repeating this operation three times, 1.5 ml of the culture supernatant was taken and centrifuged at 1000 ⁇ g for 1 minute to remove the residue. The supernatant was centrifuged at 20,000 ⁇ g for 30 minutes, the supernatant was removed, and the precipitate was suspended in 20 ⁇ l of RNAase-free water. 0.5 ⁇ l was taken and subjected to One-Step RT-PCR (QIAGEN).
  • primers were set so that about 400 bp existed when the F gene-deficient virus genome was present and about 500 bp existed when the GFP gene was inserted.
  • PCR amplification product bands were confirmed at around 400 bp and around 500 bp in each PCR. From this, it was considered that the F gene-deficient PIV2 virus could be recovered.
  • the residue was removed from the culture supernatant of the GFP-expressing F gene-expressing Vero cells obtained as described above through a 0.45 ⁇ m-diameter filter.
  • the culture supernatant was sequentially diluted 10 times to infect Vero cells not expressing the F gene. After 3 days, cells exhibiting GFP fluorescence were confirmed. As a result, cells exhibiting GFP fluorescence were observed, and the number of GFP positive cells decreased in proportion to the dilution. From this, it was confirmed that the F gene-deficient hPIV2 virus was present in the culture supernatant of F gene-expressing Vero cells, and this virus infected Vero cells not expressing the F gene. Infectious virus particles were not obtained from the culture supernatant of Vero cells not expressing the F gene.
  • Example 4 Production of F gene-deficient PIV2 virus expressing influenza M virus protein M2
  • a plasmid (hPIV2- ⁇ F-M2) in which the M2 protein (M2 ion channel) gene present in FIG.
  • This plasmid (hPIV2- ⁇ F-M2) was transfected into cells expressing T7 RNA polymerase using Lipofectamine or FUGENE6 as the transfection reagent in the same manner as in Example 3.
  • hPIV2 F protein and polymerase unit a total of four types of vectors expressing hPIV2 F protein and polymerase unit (NP protein, P protein and L protein) were transfected together.
  • the virus was recovered in the same manner as in Example 3, and hPIV2 lacking the M2 gene-carrying F gene was infected with Vero cells (2 ⁇ 10 6 cells) expressing the F gene, and the cells were recovered after 2 days. And subjected to Western blotting using M2 antibody. As a result, the expression of M2 could be confirmed (FIG. 5). That is, it was confirmed that F gene-deficient PIV2 virus could be recovered for genes other than GFP.
  • the present invention is useful for the production of viral vectors for gene therapy.

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Abstract

　Ｆ遺伝子欠損ウイルスを感染させる宿主細胞として、Ｆ蛋白を常時安定して発現しうる細胞系、およびそのような細胞を利用してＦ遺伝子欠損ウイルスを製造する方法が開示される。非増殖型ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターは、Ｆ遺伝子を欠損したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスを、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ遺伝子を非誘導的に発現する様式で有するＶｅｒｏ細胞と共培養し、そして培養上清からウイルス粒子を単離することにより製造される。

Description

遺伝子導入用ウイルスベクターの製造方法
関連する出願
　本出願は，日本特許出願２０１１－０２５２３４（２０１１年２月８日出願）に基づく優先権を主張しており，この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
技術分野
　本発明は、遺伝子導入用ウイルスベクターの製造方法に関する。
　ヒトパラインフルエンザ２型ウイルス（ｈＰＩＶ２）は、ヒト気道粘膜に感染し、粘膜免疫誘導が可能であることから、ワクチン用ベクターとしての応用が期待されている。このベクターを医薬品として実用化するためには、ウイルスベクターがヒト細胞に感染する能力をもち、かつ、感染後にヒト体内で伝播性ウイルスを生じないこと（非増殖性ベクターと表記）が必要である。つまり、細胞・組織には単回では感染するが、感染細胞・組織で伝播性ウイルスを産生せず、複数回の感染を引き起こさないシステムが必要である。当該システム系を構築するためには、ウイルスゲノム上の遺伝子を一部欠損させ、当該欠損遺伝子産物を発現する細胞を造成し、当該細胞中で欠損型ウイルスにトランスに欠損遺伝子産物を供給し、非増殖型ベクターを作製するシステムが通常採用されている。DNAウイルスではアデノウイルス（例えばWO94/28152）、RNAウイルスではレトロウイルス（例えばWO2006/084746）に当該システムが導入されている。また、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスの属するパラミクソウイルス科ウイルスでは、Ｆ遺伝子等を欠損したセンダイウイルスベクターが提案されている（WO2000/070070）。また、定型抗酸菌のMycobacterium　kansasiiまたはMycobacterium　bovis　BCG由来のα抗原（Ａｇ８５Ｂ）遺伝子を組み込んだヒトパラインフエンザ２型ウイルスの非増殖性遺伝子組換え型ベクターを用いた結核発症予防ワクチンが、結核菌の強い増殖抑制効果が認められたことが報告されている（PCT/JP2010/069435）。
　Ｆ遺伝子欠損ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、単独で、宿主細胞侵入後における当該ウイルスの複製・転写工程で、ウイルスエンベロープと細胞膜を融合させウイルスヌクレオカプシドを宿主内に導入する際に必要とされるヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのFusion　protein（以下「F蛋白」と記載）が存在しないため、自立増殖能をもつウイルス粒子を構成することができない。従って、ゲノム上にＦ遺伝子は欠損するがベクターエンベロープ上にはF蛋白を含有する非増殖型ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターを調製するには、当該ウイルスのＦ蛋白を発現する細胞を造成し、当該細胞で当該欠損ウイルスを培養することにより、当該細胞からトランスに供給されるＦ蛋白の存在下で、ウイルスエンベロープ上にF蛋白を保持させることにより、感染能を有するウイルス粒子が構築される。当該増殖システムにより調製された培養上清から回収されるヒトパラインフルエンザ２型ウイルス粒子のゲノムは、Ｆ遺伝子を欠失している。当該Ｆ遺伝子欠損ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターに予め治療用遺伝子や、ワクチン抗原をコードする遺伝子を組み込んでおけば、医薬品として有用なウイルス粒子を得ることができる。
　一般にウイルスの膜蛋白質は細胞毒性を有するため、従来は、ウイルスＦ遺伝子等が誘導型プロモーターの制御下に発現されるように設計されたベクター導入による細胞株を樹立し、平常時はＦ遺伝子等の発現を抑制しておき、ウイルスがＦ遺伝子等を発現するヘルパー細胞に感染して再構成されるときにのみＦ遺伝子等を誘導発現させる必要があった。例えば、上記のセンダイウイルスベクターに係る従来技術文献（WO2000/070070）では、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ誘導系を用いて、宿主細胞を増殖させるときにはセンダイウイルスのＦ遺伝子が発現されず、ウイルスを細胞に感染させる際にアデノウイルスを添加することにより、発現を誘導させる系が用いられている。
　しかしながら、ウイルスベクターの商業的製造においては、アデノウイルスを用意して添加する工程が必要となるため操作が煩雑となり、また、アデノウイルスによる遺伝子導入効率が一定ではないため、医薬品製造管理工程が複雑になるという問題点があった。さらに、実際に膜蛋白質の発現誘導システムを用いてウイルスベクターを製造する工程においては、細胞を培養してウイルス粒子を増殖させる場合、発現膜蛋白質の毒性のため宿主細胞を継代するにつれてウイルスの増殖能が低下し、約５代の継代でウイルスの産生能がほとんどなくなるという問題点があった。
　このため、ウイルスで欠損している膜蛋白質等をコードする遺伝子を発現し、欠損型ウイルスベクター増殖させることのできる細胞として、当該蛋白を常時安定して発現しうる細胞系が求められている。さらに、継代したときに性質が変わらない堅牢性をもつ宿主細胞系が求められている。
　本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書に参照として取り込まれる。これらの文献のいずれかが、本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
WO94/28152 WO2006/084746 WO2000/070070 PCT/JP2010/069435
　本発明は、ヒトパラインフエンザ2型ウイルスのＦ遺伝子を欠損したウイルスを増殖させる細胞として、ヒトパラインフエンザ２型ウイルスのF蛋白を常時安定して発現しうる細胞系を提供すること、ならびにそのような細胞を利用してＦ遺伝子欠損ヒトパラインフエンザ２型ウイルスベクターを製造する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ヒトパラインフエンザ２型ウイルスＦ遺伝子欠損ウイルスに感染しウイルス粒子を産生することができるパッケージング細胞として、Ｖｅｒｏ細胞が優れた性質を有していることを見いだした。驚くべきことに、Ｖｅｒｏ細胞は、ヒトパラインフエンザ2型ウイルスＦ蛋白に対する許容性がとりわけ高く、またインターフェロンの発現がなく、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ遺伝子を常時発現させた場合でも安定して増殖することができ、かつウイルス粒子を効率よく産生することができることが判明した。　
　すなわち、本発明は、非増殖型ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターの製造方法を提供する。この方法は、Ｆ遺伝子を欠損したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスを、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ遺伝子を非誘導的に発現する様式を有するＶｅｒｏ細胞と共培養し、そして、培養上清からウイルス粒子を単離する、の各工程を含む。　
　本発明の方法の好ましい態様においては、Ｆ遺伝子を欠損したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスの遺伝子中にはワクチン用または治療用遺伝子が組み込まれている。
　別の観点においては、本発明は、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ遺伝子を非誘導的に発現する様式で有するＶｅｒｏ細胞を提供する。
　本発明の方法を用いることにより、非増殖型のヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターを安定して効率よく製造することができる。
図１はヒトパラインフルエンザ２型ウイルスの粒子構造およびゲノムを示す。 図２は、長期培養後（１年程度）のＦ遺伝子発現Ｖｅｒo細胞でのＦ遺伝子の発現をＲＴ―ＰＣＲ法により確認し、Ｆ遺伝子の発現が維持されていることを示す。 図３は、Ｆ遺伝子導入Ｖｅｒo細胞でＦ蛋白が発現していることを確認するウエスタンブロッティングを示す。 図４は、Ｆ遺伝子を欠失したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのアンチセンスゲノムｃＤＮＡおよびＧＦＰ遺伝子を含むプラスミドの構造の一部を示す。 図５は、Ｍ２遺伝子保持Ｆ遺伝子欠損したｈＰＩＶ２がＭ２蛋白を発現していることを確認するウエスタンブロッティングを示す。
　本発明は、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ遺伝子を非誘導的に発現する様式で有するＶｅｒｏ細胞を用いて、Ｆ遺伝子を欠損したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスを増殖させる方法を提供する。
　ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、パラミクソウイルス科に属するウイルスであり、そのゲノムは約15,000塩基のモノシストロニックな一本鎖マイナスＲＮＡである。図１に、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルス(ｈＰＩＶ２)の基本粒子構造を示す。この核酸にヌクレオカプシド蛋白（ＮＰ）が結合し、らせん対称リボヌクレオシドプロテイン複合体（ヌクレオカプシド、ＲＮＰ）を形成している。ウイルスゲノムがコードする蛋白のうち、ＮＰ蛋白、Ｐ（ホスホ）蛋白およびＬ（ラージ）蛋白がＲＮＰの形成に必要である。Ｆ（フュージョン）蛋白およびＨＮ（ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ）蛋白はエンベロープ蛋白であり、細胞への感染に重要である。Ｍ(マトリクス)蛋白はエンベロープ構造を支える膜蛋白である。
　ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、感染細胞の細胞質で増殖するＲＮＡウイルスであるため、宿主細胞の染色体中に遺伝子が組み込まれることはない。また、このウイルスは、ヒト気道粘膜に感染し、IｇAの誘導発現による粘膜免疫を誘導することが知られており、さらにこれまでに成人での重篤報告例がないことから、ワクチン用または治療用ウイルスベクターとしてきわめて有用であると考えられる。
　ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスを、ＮＰ蛋白、Ｐ蛋白およびＬ蛋白を発現し、Ｆ蛋白を発現しないよう改変すると、ウイルス粒子１回は細胞に感染することができるが、その細胞中で感染能のあるウイルス粒子を産生することができない。したがって、治療・ワクチン用ウイルスベクターとして安全性が高いという利点を有する。
　本発明のヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ蛋白発現Ｖｅｒｏ細胞は、このような該ウイルスゲノムのＦ遺伝子欠損ウイルスを増殖させて、Ｆ遺伝子を欠損したウイルス粒子を製造するのに有用な宿主細胞である。
　「Ｖｅｒｏ細胞」とは、アフリカミドリザルの腎臓上皮由来の培養細胞であって、インターフェロンを産生しないことを特徴とし、ウイルス感染実験・ワクチン生産に多く用いられるなど世界中で広く用いられている細胞株である。本発明においては、市販のＶｅｒｏ細胞のいずれを用いてもよい。
　「Ｆ遺伝子」とは、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのF蛋白をコードする遺伝子であり、本明細書においてこの用語は、ウイルス遺伝子のゲノムＲＮＡのみならず、対応する配列またはその相補配列をもつＤＮＡおよびＲＮＡのいずれをも意味するものとして用いられる。
　「非誘導的に発現する」とは、誘導発現系ではなく発現するよう設計され、誘導操作を加えることなく発現することを意味する。ここで、誘導発現系とは、誘導操作を行わないときまたは抑制操作を行ったときには発現せず、誘導操作を行ったときまたは抑制操作を解除したときにのみ発現するよう設計された、宿主／ベクターと培養条件との組み合わせからなる系である。当該技術分野においては多くの誘導発現系が知られている。非誘導的な発現とは、誘導操作または抑制操作の解除を行うことなく発現することを意味する。典型的には、非誘導的な発現は常時発現であるが、細胞分裂や細胞周期の特定のフェーズで発現が抑制されることがある場合や、培養温度、培地組成、細胞密度などの培養条件により発現が抑制されることがある場合も、本発明における「非誘導的」な発現に包含される。　
　本発明のＦ蛋白発現Ｖｅｒｏ細胞を製造するためには、まず、Ｆ遺伝子およびマーカー（例えば薬剤耐性）を有する組換えプラスミドベクターを調製し、これをＶｅｒｏ細胞にトランスフェクションする。Ｆ遺伝子の配列は既に知られており、市販の適当なプラスミドベクターにＦ遺伝子を組み込むことにより、組換えプラスミドベクターを容易に製造することができる。トランスフェクションは、種々の市販のトランスフェクション用試薬を用いて、あるいはエレクトロポレーションによって、定法にしたがって行うことができる。次に、マーカーを利用して形質転換体を同定し、単離し、拡大培養する。形質転換Ｖｅｒｏ細胞中のＦ蛋白の発現は、抗体による免疫染色や、後述の実施例に示されるように、ウエスタンブロッティングにより蛋白レベルの発現を調べることによって、あるいはＲＴ－ＰＣＲなどによりＲＮＡレベルの発現を調べることによって、分析することができる。あるいは、感染細胞の細胞融合における多核体形成を観察することにより、Ｆ蛋白の発現を確認してもよい。多核体形成とは、Ｆ蛋白とウイルスの別の膜蛋白質である受容体結合蛋白ＨＮが同一細胞内で共に発現することにより、隣接する細胞が融合し、細胞核が多数集まった巨大細胞を形成することをいう。Ｆ遺伝子を導入できたと想定されるＶｅｒｏ細胞に、ＨＮ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションし、多核体形成が認められれば、当該細胞はＦ遺伝子を機能的発現していることが確認できる。このようにして、Ｆ遺伝子を発現する所望の組換えＶｅｒｏ細胞をクローン化することができる。
　本発明の別の観点においては、Ｆ遺伝子を欠損した非増殖型ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターの製造方法が提供される。この方法は、Ｆ遺伝子を欠損したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスを、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ遺伝子を非誘導的に発現する様式で有する本発明のＶｅｒｏ細胞と共培養し、そして培養上清からウイルス粒子を単離する、の各工程を含む。
　「ウイルスベクター」とは、感染した細胞中で発現させるべき遺伝子がウイルスゲノム遺伝子とともにパッケージングされているウイルス粒子を意味する。
　Ｆ遺伝子を欠損したウイルスゲノム遺伝子は、ｈＰＩＶ２の全ゲノム遺伝子に対応するアンチセンスｃＤＮＡを含むプラスミドから、慣用の遺伝子組換え技術を用いて、Ｆ遺伝子の全部または一部の領域を欠失させるか、Ｆ遺伝子の一部にストップコドン変異を導入することにより構築することができる。被験者に投与したウイルスベクターが突然変異によりＦ遺伝子の機能を再び獲得することを回避するため、Ｆ遺伝子の全部を欠失させることが好ましい。また好ましくは、本発明にしたがう非増殖型ウイルスベクターは、各種の治療用遺伝子を組み込むためのクローニングサイトを含むよう設計される。
　Ｆ遺伝子を欠損したウイルスゲノム遺伝子からＦ遺伝子欠損ウイルス粒子を製造するためには、Ｆ遺伝子を欠損したウイルスゲノム遺伝子をＴ７プロモーターの制御下に発現するよう構築したプラスミドを、ｈＰＩＶ２のＦ蛋白およびポリメラーゼユニット（ＮＰ蛋白、Ｐ蛋白およびＬ蛋白）を発現する４種類のベクターとともにＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞、またはＴ７ポリメラーゼを発現するプラスミド共にｈＰＩＶ２のポリメラーゼユニット（ＮＰ蛋白、Ｐ蛋白およびＬ蛋白）をＦ遺伝子を発現するＶｅｒoにトランスフェクションする。感染した細胞を３～６日間培養した後、培養上清からＦ遺伝子欠損ウイルス粒子を回収することができる。
　このようにして得られたＦ遺伝子欠損ウイルス粒子を、本発明のＦ遺伝子を発現するＶｅｒｏ細胞に感染させると、ウイルス粒子は細胞内で増殖して、Ｆ遺伝子欠損ウイルス粒子ではあるが、それ自体はウイルスエンヴベロープ上にF蛋白を有する感染性のウイルス粒子が産生される。
　本発明の１つの好ましい態様においては、Ｆ遺伝子を欠損したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスに基づくウイルスベクター中には治療用・ワクチン用遺伝子が組み込まれており、本発明の方法により得られる非増殖型ウイルスベクターを標的細胞に感染させることにより、標的細胞に治療用遺伝子を導入することができる。治療用遺伝子とは、感染した細胞中で発現させるべき遺伝子であり、例としては、ヒトを含む哺乳動物由来の蛋白またはその一部をコードする遺伝子、癌抗原またはその一部をコードする遺伝子、細菌やウイルス由来の遺伝子、治療用抗体またはその一部をコードする遺伝子、およびこれらの遺伝子のフラグメント、ならびにこれらの遺伝子に変異が導入されている遺伝子が挙げられる。細菌やウイルス由来の遺伝子またはそのフラグメントを含むウイルスベクターはワクチンとして有用である。ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスの遺伝子中への治療用遺伝子の組み込みは、慣用の組換えＤＮＡ技術及びリバースジェネティクス技術を用いて定法により行うことができる。
　本発明にしたがって製造されるウイルスベクターは、典型的には、噴霧剤としてヒトを含む哺乳動物細胞に投与することができる。噴霧剤は定法により調製することができる。例えば、ウイルスベクターを含む培養上清を、必要により濃縮し、適当な担体または賦形剤とともに、ＰＢＳ等の緩衝液または生理食塩水に懸濁した後、必要に応じてフィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。噴霧剤には、必要に応じて安定化剤、保存剤などを加えてもよい。こうして得られた発現ベクターを被験者に吸入投与することができる。
　本明細書において用いる場合、「・・・を含む（comprising）」との表現により表される態様は、「本質的に・・・からなる（essentially　consisting　of）」との表現により表される態様、ならびに「・・・からなる（consisting　of）」との表現により表される態様を包含する。
　本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。
　以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１　Ｆ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞の作製
　ネオマイシン耐性遺伝子（Neo）を保持し、トリβアクチンプロモーター配列およびウサギβグロビンpolyA配列を保持するプラスミドに、ｈＰＩＶ２のゲノム遺伝子から切り出したＦ遺伝子を導入して、プラスミドｐＣＸＮ２－Ｆを構築した。対照としては、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ誘導系によりＦ遺伝子を発現しうるよう構築したプラスミドｐＣＡＬ－Ｆを用いた。これらのプラスミドをａｍａｘａ社のヌクレオフェクターを用いてＶｅｒｏ細胞にトランスフェクションした。
　トランスフェクションした細胞をネオマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）を含む培地中で培養して、ネオマイシンによる薬剤耐性によりスクリーニングを行った。ｐＣＸＮ２－Ｆを導入した細胞から２０株、ｐＣＡＬ－Ｆを導入した細胞から２７株の薬剤耐性コロニーを単離して、Ｆ遺伝子の発現について調べた。その際、プラスミドとしてｐＣＡＬ－Ｆを用いた場合には、Ｃｒｅ遺伝子保持アデノウイルスを感染させて、ｌｏｘＰ配列で不要遺伝子断片を除去することによりＦ遺伝子発現を誘導させた。
　次に、多核体形成を確認した。ＨＮ遺伝子を保持するプラスミドＳＲα－ＨＮを作製し、取得したネオマイシン耐性のＶｅｒｏ細胞に当該プラスミドをヌクレオフェクターを用いてトランスフェクションした。１または2日後に多核体形成を顕微鏡下で観察し、多核体を形成している細胞をＦ遺伝子発現細胞として二次選抜を行った。ｐＣＸＮ２－Ｆを導入した細胞から単離された２０個のクローンのうち、１２クローンが多核形成能を示した。　
　次に、ＲＴ－ＰＣＲによりＦ遺伝子の発現をＲＮＡレベルで測定した。その結果、ｐＣＸＮ２－Ｆを導入した細胞から単離された２０個のクローンのうち、１２クローンが多核形成能を示し、このうち９クローンがＲＴ－ＰＣＲにおいて陽性であった。また、ｐＣＡＬ－Ｆを導入した細胞から単離された２７個のクローンのうち、９クローンが多核形成能を示し、このうち７クローンがＲＴ－ＰＣＲにおいて陽性であった。また、ｐＣＸＮ２－ＦによりＦ遺伝子を導入し1年間培養した２ｘ１０６個のＶｅｒｏ細胞をＯｎｅ－Ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ（ＱＩＡＧＥＮ）に供した。ＰＣＲは、Ｆ遺伝子欠損ウイルスゲノムが存在する場合には５５０ｂｐ付近にＰＣＲ増幅産物が得られるようにプライマーを設定して行った。その結果、異なる３クローンのそれぞれのＰＣＲで５５０ｂｐ付近にＰＣＲ増幅産物のバンドが確認された。依然としてF遺伝子が発現していることが確認できた（図２)。すなわち、Ｆ遺伝子を常時発現するＶｅｒｏ細胞を、Ｆ遺伝子を誘導発現するＶｅｒｏ細胞と匹敵する効率で得ることができ、しかも長期間安定的に発現し続けることができた。このことは、Ｖｅｒｏ細胞がＦ蛋白に対する許容性が高く、Ｆ遺伝子を常時に長期間発現させた場合でも安定して増殖しうることを示す。
　次に、F遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞でのF蛋白の発現確認を行った。９．５ｘ１０５個のF遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞に対して、０．０３％Sulfo-NHS-LC-Biotin溶液1mlを用いて細胞膜上にある全ての蛋白にビオチン化を行ない、穏やかな条件で500μlの細胞溶解液を作製した。次に細胞溶解液300μlをF蛋白質特異的抗体80μlで免疫沈降法を用いてF蛋白のみを抗体と結合させ選択的に回収、濃縮を行なった。このサンプル全量をSDS-PAGEを行ないPVDFメンブレンに転写した。この時点で、既にF蛋白はビオチン化された状態となっており、アビジン－ビオチン複合体（avidin-biotin　complex）法によってアビジン-ビオチン複合体を形成させた。アビジンには西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）が標識されているのでECL試薬と反応させHRPの発光によってビオチン化されたF蛋白を検出した（図３)。
実施例２　Ｆ遺伝子欠損アンチセンスｈＰＩＶ２ゲノムの構築
　Ｔ７プロモーターの下流にｈＰＩＶ２の全ゲノム遺伝子に対応するアンチセンスｃＤＮＡを含むプラスミドから、全Ｆ遺伝子コード領域を含む配列を完全に欠失させ、ＮｏｔＩ制限部位にＧＦＰ（グリーン蛍光蛋白）遺伝子を組み込んだプラスミド（ｈＰＩＶ２－ΔＦ－ＧＦＰ）を構築した（図４）。構築は、Ｆ遺伝子の上流領域と下流領域の配列に基づいて設計したプライマーと、市販のＧＦＰ含有ベクターから切り出したＧＦＰ遺伝子断片とを用いて、ｈＰＩＶ２のゲノム遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとして、多段階ＰＣＲにより行った。
実施例３　Ｆ発現Ｖｅｒｏ細胞を用いたＦ遺伝子欠損ウイルス粒子の回収
　実施例２で作製したプラスミド（ｈＰＩＶ２－ΔＦ－ＧＦＰ）を、トランスフェクション試薬としてリポフェクタミン又はＦＵＧＥＮＥ６を用いて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞にトランスフェクションした。このとき、ｈＰＩＶ２のＦ蛋白およびポリメラーゼユニット（ＮＰ蛋白、Ｐ蛋白およびＬ蛋白）を発現する計４種類のベクターをともにトランスフェクションした。
　３日間培養した後、上清を回収して、Ｆ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞またはＦ遺伝子を発現しない通常のＶｅｒｏ細胞に感染させ、感染６日後に、ＧＦＰ蛍光を観察した。Ｆ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞では、細胞全体でＧＦＰの蛍光が認められた。一方、通常のＶｅｒｏ細胞では、ＧＦＰの蛍光を呈する細胞の数は、Ｆ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞と比較して遥かに少なかった。
　次に、ＧＦＰ蛍光を呈するＦ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞の培養上清を回収し、シャーレ上で別のＦ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞に感染させ、その培養上清を回収した。この操作を３回繰り返した後、培養上清１．５ｍｌを取り、１０００ｘｇ、１分間遠心し残渣を除去した。上清を２０，０００ｘｇ、３０分間遠心し、上清を除去し沈殿物を２０μｌのＲＮＡａｓｅフリー水に懸濁した。０．５μｌを取り、Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ（ＱＩＡＧＥＮ）に供した。ＰＣＲの結果は、Ｆ遺伝子欠損ウイルスゲノムが存在する場合には約４００ｂｐ、ＧＦＰ遺伝子が挿入されている場合には約５００ｂｐが存在するようにそれぞれプライマーを設定した。その結果、それぞれのＰＣＲで４００ｂｐ付近と５００ｂｐ付近にＰＣＲ増幅産物のバンドが確認された。このことから、Ｆ遺伝子欠損型のＰＩＶ２ウイルスが回収できたものと考えられた。
　上述のようにして得られたＧＦＰ発現Ｆ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞の培養上清を、０．４５μｍ径のフィルターを通して残渣を除去した。当該培養上清液を順次１０倍希釈し、Ｆ遺伝子を発現していないＶｅｒｏ細胞に感染させた。３日後にＧＦＰの蛍光を呈する細胞を確認した。その結果、ＧＦＰの蛍光を呈する細胞が認められ、希釈に比例してＧＦＰの陽性細胞数が減少していた。このことから、Ｆ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞の培養上清中にＦ遺伝子欠損ｈＰＩＶ２ウイルスが存在し、このウイルスがＦ遺伝子を発現していないＶｅｒｏ細胞に感染したことが確認された。なお、Ｆ遺伝子を発現していないＶｅｒｏ細胞の培養上清からは、感染性のあるウイルス粒子は得られなかった。
　また、ＧＦＰ遺伝子を保持するＦ遺伝子を欠損したｈＰＩＶ２ウイルスをマウスＮＩＨ－３Ｔ３細胞に感染させたところ、ＧＦＰ陽性ＮＩＨ－３Ｔ３細胞の存在が観察されたが、感染の効率はＶｅｒｏ細胞より低かった。
実施例４　インフエンザウイルスのウイルスＭ２蛋白を発現するＦ遺伝子欠損型ＰＩＶ２ウイルスの作製
　実施例２と同様にして、Ｆ遺伝子欠損アンチセンスｈＰＩＶ２ゲノムのＮｏｔＩ制限部位にインフルエンザウイルスのウイルスの脂質層の膜上に存在するＭ２蛋白（Ｍ２イオンチャネル）遺伝子を組み込んだプラスミド（ｈＰＩＶ２－ΔＦ－Ｍ２）を構築した。このプラスミド（ｈＰＩＶ２－ΔＦ－Ｍ２）を、実施例３と同様にして、トランスフェクション試薬としてリポフェクタミンまたはＦＵＧＥＮＥ６を用いて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞にトランスフェクションした。このとき、ｈＰＩＶ２のＦ蛋白およびポリメラーゼユニット（ＮＰ蛋白、Ｐ蛋白およびＬ蛋白）を発現する計４種類のベクターをともにトランスフェクションした。次に、実施例３と同様の方法でウイルス回収を行い、Ｍ２遺伝子保持Ｆ遺伝子欠損したｈＰＩＶ２を、Ｆ遺伝子を発現しているＶｅｒｏ細胞（２ｘ１０６個）に感染させ、２日後に細胞を回収し、Ｍ２抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。その結果、Ｍ２の発現を確認することができた（図５）。すなわち、ＧＦＰ以外の遺伝子についてもＦ遺伝子欠損型のＰＩＶ２ウイルスが回収できたことが確認された。
　以上の結果から、Ｆ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞を用いることにより、Ｆ遺伝子を欠損した非増殖型ｈＰＩＶ２ウイルスの回収が可能であること、当該ウイルスがＦ遺伝子発現細胞でのみ増殖が可能であり、Ｆ遺伝子を発現していない細胞で１次感染することができるが、感染性ウイルスを産生しないことが分かった。
　本発明は、遺伝子治療用のウイルスベクターの製造に有用である。
 

Claims (3)

  1. 非増殖型ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターの製造方法であって、
    Ｆ遺伝子を欠損したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスを、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ遺伝子を非誘導的に発現する様式で有するＶｅｒｏ細胞と共培養し、そして培養上清からウイルス粒子を単離する、
    の各工程を含む方法。
  2. Ｆ遺伝子を欠損したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスの遺伝子中にワクチン用または治療用遺伝子が組み込まれている、請求項１記載の方法。
  3. ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ遺伝子を非誘導的に発現する様式で有するＶｅｒｏ細胞。
     
     
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