WO2012104467A1 - Uso de inhibidores de la actividad de las no sintasas (nos) y sus composiciones, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento y la prevención de la prediabetes y la diabetes mellitus tipo 1 (dm1) - Google Patents

Uso de inhibidores de la actividad de las no sintasas (nos) y sus composiciones, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento y la prevención de la prediabetes y la diabetes mellitus tipo 1 (dm1) Download PDF

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Manuel AGUILAR DIOSDADO
Laura QUINTANA LÓPEZ
Gonzalo PÉREZ ARANA
Manuel BLANDINO ROSANO
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    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics

Definitions

  • NOS NO synthases
  • DM1 ⁇ -monomethyl-L-arginine
  • Diabetes mellitus is a syndrome of high morbidity and mortality, with a permanent rise in blood glucose due to an absolute or relative deficit of insulin secretion by the beta cell of the pancreatic islet. This deficit is due to the death, mainly by apoptosis, of the beta cells as a result of an autoimmune process that begins long before the onset of the first symptoms of the disease.
  • the observation of proliferative processes along insulitis suggests that in addition to cell death there are also mechanisms that slow down the regenerative process of the beta cell in response to these damages.
  • Diabetes mellitus can be defined as a chronic elevation of blood glucose (hyperglycemia). It is often accompanied by polydipsia, polyuria and weight loss and can, in the absence of treatment, trigger coma and death. Hyperglycemia and other biochemical alterations are produced by an insufficient secretion or action of insulin, which is a hormone responsible for controlling the metabolism of glucose, fat and amino acids. DM represents a high risk for progressive disease of the retina, kidney and peripheral nerves; also aggravates the Atherosclerotic process affecting, especially, the heart, lower limbs and brain.
  • Type 1 diabetes mellitus (DM1), both in humans and animals, is a long-term process that is manifested by pancreatic infomonocyte infiltration and by the presence of circulating anti-islet antibodies and which presents with functional impairment and progressive structural mass of beta cells (Brown & Eisenbarth. Annu Rev Immunol. 1990; 8 647-79). It represents between 5 and 1.0% of the total cases of diabetes, but the fact that it has its onset in childhood and the serious complications associated with both short and long term make it a pathology of high impact both Social as sanitary. Regarding its pathogenesis, there is a variable degree of genetic predisposition together with certain environmental factors that determine the immunological and metabolic alterations that ultimately cause chronic hyperglycemia syndrome.
  • DM1 begins with an immunoregulation disorder of unknown origin that results in the presentation of pancreatic autoantigens to autoreactive T lymphocytes. This causes its activation and subsequent recruitment to the pancreatic territory resulting in lymphomonocitary infiltration, with the participation of macrophages and dendritic cells, which results in a local inflammatory process known as insulitis.
  • the infiltrate cells either directly or by the release of inflammatory cytokines (IL-1 beta, TNF-alpha and IF N-gamma) induce a process of death of the beta cell, mostly by apoptosis, which is a active and programmed process of cell death, regulated by genes and controlled by various factors (Mathis et al., 2001.
  • the period preceding the clinical onset of the disease is called prediabetes.
  • the event that determines its onset is the appearance of autoantibodies (Ziegler et al., 1999. Diabetes Care. 1999; 22: 1296-1301) and thereafter begins a stage of variable duration, asymptomatic and in which the Gradual loss of beta mass as a result of the autoimmune process.
  • a new event appears, which is the loss of the first phase of the secretory response of the beta cell to an intravenous glucose overload (Srikanta et al 1983). This stage culminates with the clinical onset of the disease that occurs when the pancreatic beta mass has dropped to 10-20% of its totality.
  • IL-1 beta, IFN-gamma or TNF-alpha bind to specific membrane receptors that are present in the beta cell, activating signaling pathways between the MAPK (mitogen-activated protein kinase) and activation of NF-kB.
  • MAPK mitogen-activated protein kinase
  • Nitric oxide is a molecule that acts as a second messenger in numerous biological processes, including muscle tone control, neuronal functionality and immune response, and in certain situations, it can also exert cytotoxic actions. It is produced from the amino acid L-arginine by the enzyme nitric oxide synthase (NOS) that is present in tissues as one of the following isoforms: neuronal (nNOS or NOS I), endothelial (eNOS or NOS III) and inducible ( ⁇ NOS or NOS II) (Moneada et al., 1991. Pharmacol Rev. 43 (2): 109-42).
  • NOS nitric oxide synthase
  • NOS isoforms can also be regulated by post-transcriptional modifications that modify their stability or activity (Bredt et ai, 1992. J Biol Chem. 267 (16): 10976-818-10; Michel et al., 1993. Proc Nati Acad Sci USA 90 (13): 6252-6; Chesler et al., 2004. J Interferon Cytokine Res. 24 (2): 141 -9.).
  • the mechanisms of action of the NO are diverse and are mediated by the interactions it makes with different proteins regulating its function, thus as for the ability to react with free radicals giving rise to products such as nitrogen oxides or peroxynitrite, powerful oxidizing agents that react with different molecules causing damage to their structure.
  • pancreatic beta cell In pancreatic beta cell, the role of NO in proliferation under physiological conditions or in response to damage has been poorly studied. Recent studies show that the activation of NO production pathways through the supply of L-Arginine stimulates beta cell neogenesis in a murine model of Alloxan-induced diabetes (Vasilijevic et al., 2007. J Physiol. 584 (Pt 3): 921-33). In contrast to this restorative effect of NO, real observations made by our group show that the anti-proliferative effect of proinflammatory cytokines on the beta cells of the islets in culture could be mediated by NO since it is reversed in presence of L-NMMA, an inhibitor of NOS activity.
  • NOS nitric oxide synthase inhibitors
  • pharmaceutical compositions are useful for the prevention and treatment of type I diabetes mellitus, also acting in the period of prediabetes, and preferably in the period of prediabetes with autoimmune component.
  • a first aspect of the invention relates to the use of a composition, which comprises at least one inhibitor of the activity of any of the NO synthases (NOS), for the preparation of a medicament for prevention and / or Treatment of prediabetes and diabetes mellitus type 1 in a mammal, including a human, or alternatively, an inhibitor of the activity of any of the NO synthases (NOS), for the prevention and / or treatment of prediabetes and type 1 diabetes mellitus.
  • NOS NO synthases
  • compositions which comprises an inhibitor of the activity of any of the NO synthases (NOS), for the preparation of a medicament for the treatment of prediabetes in a mammal, including a human, and more preferably, prediabetes with an autoimmune component, or alternatively, an inhibitor of the activity of any of the NO synthases (NOS), for the treatment of prediabetes in a mammal, including a human, and more preferably prediabetes with an autoimmune component.
  • NOS NO synthases
  • the NO synthase (NOS) activity inhibitor is selected from the list comprising:
  • NO synthases refers to a family of eukaryotic enzymes that catalyze the production of nitric oxide (NO) from L-arginine, through an organic catalysis of oxidoreduction (RedOx reaction), without energy expenditure or ATP. They have as EC Number: 1 .14.13.39.
  • oxidoreductases since they have a dom in io oxidase and a reductase domain
  • nitric oxide ON, acronym in Spanish, and NO, acronym in English and more accepted for having the order of increasing electronegativity
  • NADPH reduced nad-phosphate or NADPH (reduced nicotinamide-adenine-dinucleotide phosphate) and dioxygen (O 2 ).
  • NOS is the only known enzyme that binds FAD (flavin-adenine-dinucleotide), FMN (flavin mononucleotide), heme, tetrahydrobiopterin (BH) and calmodulin. They catalyze the following reaction:
  • NOS Non-reactive styrene-maleic anhydride
  • CNOS constitutive styrene-maleic anhydride-styrene-styrene-maleic anhydride-styrene-styrene-styrene-styrene-styrene-styrene-styrene-styrene-styrene-sthelial tissue respectively.
  • NO synthases refers to any of the family members.
  • NOS3 nitric oxide synthase 3, endothelial cell
  • com EC-NOS
  • US type III NOSIII
  • cNOS constitutive NOS
  • endothelial NOS nitric oxide synthase, endothelial
  • chromosome 7 7q36
  • NOS3 also refers to any of its isoforms, and is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and which would include several variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide that It comprises the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of any of the isoforms of NOS3.
  • NOS2 (nitric oxide synthase 2, inducible), also referred to as NOS type I I; NOS, type I I; hepatocyte NOS; inducible NO synthase; inducible NOS; n itric oxide synthase 2A (ind ucible, hepatocytes); n itric oxide synthase, inducible; nitric oxide synthase, macrophage; peptidyl-cysteine S-nitrosylase NOS2, is encoded by a gene found on chromosome 17 (17q1 1 .2-q12). Its amino acid sequence is found in SEQ ID NO: 5.
  • NOS2 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 5, and which would comprise various variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 5, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the NOS2 peptide.
  • NOS1 nitric oxide synthase 1, neuronal
  • NOS bNOS
  • nOS noxide-N-NOS
  • IHPS1 N-NOS
  • NC-NOS NC-NOS
  • NOS1 is encoded by a gene found on chromosome 12 (12q24.2-q24.31). Its sequence amino acid is found in SEQ ID NO: 6.
  • NOS1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 6, and which would comprise various variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 6, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the NOS1 peptide.
  • NO synthase inhibitors are known in the state of the art.
  • L-NAME, 1400W, 1-amino-2-hydroxyguanidine, 1-pyrrolidinecarbodithioic acid, 2-ethyl-2- thiopseudourea, 7-nitroindazole, aminoguanidine, bromocriptine mesylate, peptide are among these inhibitors "scaffolding" domain of calveolin-1, chlorpromazine, dexamethasone, d ifen ileneiodon io chloride, L-NIO, L-thiocytrulline, mercaptoethylguanidine, ADMA, L-NNA, N-PLA, L-NMMA or any of its salts, prodrugs , derivatives or analogs, or any combination thereof.
  • NO synthase (NOS) activity inhibitors are selected from the list comprising: L-NAME, 1400W, 1-amino-2-hydroxyguanidine, 1-pyrrolidinecarbodithioic acid , 2-ethyl-2- thiopseudourea, 7-nitroindazole, aminoguanidine, bromocriptine mesylate, peptide domain "scaffolding" of calveoline-1, chlorpromazine, dexamethasone, d ifen chloride, ileneiodon io, L-NIO, L-thiocytruline, mercaptoethylguine, mercaptoethylguine ADMA, L-NNA, N-PLA, L-NMMA or any of its salts, prodrugs, derivatives or analogs, or any combination thereof.
  • L-NAME, HCI N G- Nitro-L-arginine Methyl Ester, Hydrochloride.
  • 1400W N- (3-Aminomethyl) benzylacetamidine, 2HCI.
  • 1-Pyrrolidinecarbodithioic acid, ammonium salt Cell permeable inhibitor of nitric oxide synthase activity. Tested in alveolar macrophages.
  • Peptide domain "scaffolding" of calveolina-1 It is a cell-permeable peptide formed by the "scaffolding" domain of calveoline-1 (C1-SD 8 2-ioi) attached by the terminal end to the internalization sequence of Antennapedia. It has been described that blocks “in vitro” eNOS activity and reduces tumorigenesis and inflammation “in vivo.”
  • Chlorpromazine Hydrochloride It inhibits NOS in mouse brain and prevents the induction of NOS by lipopolysaccharide in murine lung.
  • L-NIL dihydrochloride.
  • L-Thiocitrulline, dihydrochloride. Inhibitor permeable to the cell and selective of the neuronal form of the NOS (K ⁇ 60 nM).
  • L-NNA N G- Nitro-L-arginine. N G -N0 2 -L-Arg. Powerful reversible and cell permeable inhibitor of NOS neuronal and endothelial isoforms. "In vivo" causes a reduction in heart rate and profound vasoconstriction.
  • NOS NO synthase activity
  • NOS NO synthase activity inhibitor
  • - A is selected from O (oxygen) or S (sulfur), and can be joined together with R4 to form a heterocyclic ring, or - A is N when R 3 and R 7 join to form a heterocyclic ring, or R 5 and AR 3 join to form a covalent bond, or alternatively
  • - A is NR 3 as long as R 3 is not a heterocyclic radical, or alternatively
  • - A is a heterocyclic ring
  • R 1 is not present or is selected from the group consisting of hydrogen, hydroxyalkyl, alkoxyalkyl, alkyl and haloalkyl;
  • R 2 is selected from the group consisting of a linear or branched alkyl, which is alkyl, and which is alkyl, cycloalkyl or cycloalkyl, haloalkyl, all optionally substituted by one or more hydrogens or alkyl groups, alkoxy, hydroxy, halogen, trifluoromethyl, nitro, cyano, or amino groups;
  • R 3 is selected from the group consisting of an aryl heteroaryl, alkylaryl, alkylheteroaryl, all optionally substituted by one or more of halogen, nitrile, carboxy, carboxyalkyl, carboxyalkylaryl, or alternatively
  • R 3 is selected from the group consisting of H, alkyl, alkenyl, CH 2 OC
  • Y is independently selected from O, S, CH 2 , CHR 6 , C (R 6 ) 2 ,
  • R 6 is selected from hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocycle, aryl, heteroaryl, all optionally substituted by one or more alkyl, alkoxy, hydroxy, halogen, trifluoromethyl, nitro, cyano, or amino groups;
  • R 7 is selected from H, S (O) R 9 , SO 2 R 9 , CH 2 OC (O) -R 9 , C (O) -R 9 , where C (O) -R 9 can represent natural amino acids and Synthetic or R 9 may be defined as defined below, or R 7 and R 3 as a whole comprise a 5- or 6-membered heterocyclic ring containing two or more heteroatoms, optionally substituted with alkyl and / or functions, between they carbonyl oxygen, or as a whole comprise a metal complex containing a divalent cation, or a boron complex;
  • R 8 is selected from H, acyl; provided that R 4, R 5, R 7 and R 8 are not simultaneously hydrogen, except when Q is SiE 2;
  • R 9 is selected from substituted dihydropyridyl, alkyl, thioalkoxy, alkoxy, amino, cycloalkoxy, optionally substituted with one or more amino alkyl, alkyl, heteroaryl, alkylheteroaryl, alkylmercaptoalkyl, which may optionally be substituted with one or more of hydroxy, amino, guanidino, iminoalkil;
  • - X is selected from the group consisting of alkyl or ileum, alkene ileum and alkynylene and which may be optionally substituted by one or more alkyl, alkoxy, hydroxy, halogen, trifluoromethyl, nitro, cyano, amino or groups, or alternatively
  • - X is selected from the group consisting of the formula - (CH 2 ) kQ (CH 2 ) t - where k is 1, 2 or 3, t is 1, 2 or 3 and Q is O (oxygen), Se, SiE 2 , where E is alkyl, aryl, S (O) g , where g is 0, 1 or 2, or NR where R is H or alkyl which may be optionally substituted with alkyl, alkoxy, hydroxy, halogen, trifluoromethyl, nitro, cyano, amino, or alternatively
  • - X is selected from the group consisting of the formula - (CH 2 ) mT (CH 2 ) n -, where m is 0, 1 or 2, n is 0, 1 or 2, T is a heterocyclic or carbocyclic ring of 3 with 6 members, an aromatic ring or a heteroaromatic ring that may be optionally substituted by one or more substituents selected from the group consisting of alkyl, alkoxy, hydroxy, halogen, nitro, cyano, trifluoroalkyl and amino.
  • the NO synthase (NOS) activity inhibitor is ⁇ -monomethyl-L-arginine (L-NMMA), of formula (II):
  • derivative includes both pharmaceutically acceptable compounds, including derivatives of the compound of formula (II), which can be used in the preparation of a medicament, as pharmaceutically acceptable derivatives, since these can be useful in the preparation of pharmaceutically acceptable derivatives. Also, within the scope of this invention are the prodrugs of the inhibitor compounds of any of the NOS synthases, and among them that of formula (II).
  • prodrug includes any compound derived from an inhibitor compound of any of the NOS synthases, including that of formula (I), for example, esters, including carboxylic acid esters, amino acid esters, phosphate esters, sulphonate esters of metal salts, carbamates, amides, etc., which, when ad min strainedindindly suitable, are able to directly or indirectly depict said inhibitors of any of the NOS synthases, and between they the compound of formula (II) in said individual.
  • esters including carboxylic acid esters, amino acid esters, phosphate esters, sulphonate esters of metal salts, carbamates, amides, etc.
  • said derivative is a compound that increases the bioavailability of inhibitors of any of the NOS synthases, and among them the compound of formula (I) when administered to an individual or that enhances the release of inhibitors of any of the NOS synthases, and among them the compound of formula (I) in a biological compartment.
  • the nature of said derivative is not critical as long as it can be administered to an individual and provides the compound of formula (II) in a biological compartment of an individual.
  • the preparation of said prodrug can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art.
  • Inhibitors of any of the NOS synthases, and among them ⁇ -monomethyl-L-arginine (L-NMMA), or its salts, prodrugs, derivatives or the like, can be administered in a substantially pure form to a mammal, and preferably a human, or it can be administered as part of a more complex composition.
  • the amount of inhibitors of any of the NOS synthases, and among them ⁇ -monomethyl-L-arginine (L-NMMA), or its salts, prodrugs, derivatives or analogs is such that it achieves the desired effect, thus being an effective amount.
  • prediabetes refers to the period before the clinical onset of the disease in which a series of pathophysiological processes that culminate in the inability of the body to maintain a correct glucose level are taking place.
  • Type 2 Diabetes its preclinical stage of prediabetes is characterized by a state of insulin resistance that leads to a gradual rise in blood glucose levels. This state maintained over time increases the risk of initiating type 2 diabetes in the future in which insulin resistance is combined with the loss of pancreatic beta mass as well as developing cardiovascular complications associated with this disease.
  • Type 1 Diabetes the preclinical or prediabetes stage is presented as asymptomatic although from the physiological and histological point of view it is quite characterized.
  • a lymphomonocitary infiltrate can be identified in the vicinity of the pancreatic islet as well as the presence of autoantibodies directed against antigens present in the beta cell. This process culminates with the destruction of almost all of the beta cells and it is at this time that the clinical onset of the disease characterized by severe hyperglycemia takes place.
  • medication refers to any substance used for prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of diseases in man and animals.
  • the disease is prediabetes or type 1 diabetes mellitus.
  • active ingredient means any component that potentially provide a pharmacological activity or other effect different in the diagnosis, cure, mitigation, treatment, or prevention of a disease, or that affects the structure or function of the body of man or other animals.
  • the term includes those components that promote a chemical change in the preparation of the drug and are present therein in a modified form intended to provide the specific activity or effect.
  • compositions of the present invention can be formulated for administration to an animal, and more preferably to a mammal, including man, in a variety of ways known in the state of the art.
  • they can be, without limitation, in sterile aqueous solution or in biological fluids, such as serum.
  • Aqueous solutions may be buffered or unbuffered and have additional active or inactive components. Additional components include salts to modulate ionic strength, preservatives including, but not limited to, antimicrobial agents, antioxidants, chelators, and the like, and nutrients including glucose, dextrose, vitamins and minerals.
  • the compositions can be prepared for administration in solid form.
  • compositions may be combined with various inert vehicles or excipients, including but not limited to; binders such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, or gelatin; excipients such as starch or lactose; dispersing agents such as alginic acid or corn starch; lubricants such as magnesium stearate, glidants such as colloidal silicon dioxide; sweetening agents such as sucrose or saccharin; or flavoring agents such as peppermint or methyl salicylate.
  • binders such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, or gelatin
  • excipients such as starch or lactose
  • dispersing agents such as alginic acid or corn starch
  • lubricants such as magnesium stearate, glidants such as colloidal silicon dioxide
  • sweetening agents such as sucrose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint or methyl salicylate.
  • compositions and / or their formulations may be administered to an animal, including a mammal and, therefore, to man, in a variety of ways, including, but not limited to, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intracecal, intraventricular, oral. , enteral, parenteral, intranasal or dermal.
  • the route of administration is oral.
  • the dosage to obtain a therapeutically effective amount depends on a variety of factors, such as the age, weight, sex, tolerance, ... of the mammal.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of inhibitors of NOS synthases, and particularly of ⁇ -monomethyl-L-arginine (L-NMMA), or its salts, prodrugs, derivatives or analogs, or combinations thereof, that produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics of said prodrugs, derivatives or analogs and the therapeutic effect to be achieved.
  • the "adjuvants” and “pharmaceutically acceptable carriers” that can be used in said compositions are the vehicles known to those skilled in the art.
  • excipient refers to a substance that aids the absorption, distribution or action of any of the active ingredients of the present invention, stabilizes said active substance or aids in the preparation of the medicament in the sense of giving it consistency or providing flavors. Make it more enjoyable.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together such as starches, sugars or cellulose, sweetening function, dye function, drug protection function such as to isolate it from air and / or moisture, function filling a tablet, capsule or any other form of presentation such as dibasic calcium phosphate, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • pharmaceutically acceptable excipient refers to the excipient being allowed and evaluated so as not to cause damage to the organisms to which it is administered.
  • the excipient must be pharmaceutically suitable, that is, an excipient that allows the activity of the active ingredient or the principles active, that is, compatible with the active principle, in this case, the active principle is any of the compounds of the present invention.
  • a “pharmaceutically acceptable carrier” refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical sector, used in the preparation of pharmaceutical forms of administration and includes, but are not limited to, solids, liquids, solvents or surfactants.
  • the vehicle like the excipient, is a substance that is used in the medicament to dilute any of the compounds of the present invention to a certain volume or weight.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is an inert substance or action analogous to any of the cells of the present invention.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of other compounds, allow a better dosage and administration or give consistency and form to the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is the diluent.
  • Another aspect of the invention relates to a method of selecting therapeutic agents useful in the prevention or treatment of type 1 diabetes mellitus, or in the treatment of prediabetes, preferably with autoimmune component, hereafter referred to as the first method of invention, comprising: (a) determining the activity of NO synthases (NOS) at a certain concentration of the compound to be analyzed, and
  • the first method of the invention comprises: (a) determine the activity of NO synthases (NOS) at a given concentration of the compound to be analyzed, and
  • the compound employed in step (b) is L-NMMA.
  • Another aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data in the diagnosis and / or prognosis of diabetes mell itus type I comprising:
  • Figure 1 Evolution of beta cell proliferation in the "in vivo" model during treatment.
  • Pancreatic tissues were immunolabelled with BrdU and Insulin and a total of 100 islets per animal were counted: 50 from the head and 50 from the tail of the pancreas.
  • BB rats were treated from week 4 of life with L-NMMA or vehicle (Control) and were sacrificed at 7 and 9 weeks of life.
  • the quotient between the Insulin + area and the total area of two pancreas sections per experimental point in one n 4 animals per condition was calculated.
  • the graph shows the mean values ⁇ e.e.m. of the quotient calculated in the head and tail segments of the pancreas, quantified separately, and the value corresponding to the moment prior to the treatment (4s) is also included. It can be observed that in the two times studied, treatment with L-NMMA induces a recovery of the relative area. This recovery is most evident in the pancreas head segment and at the time point of 9 weeks of life, which is when a greater loss of relative islet area can be seen in untreated animals due to the pathological process.
  • BB rats were treated from week 4 of life with L-NMMA or vehicle (Control) and were sacrificed at 7 and 9 weeks of life.
  • the mass of the beta cells was calculated by quantifying the average lnsulin + area in the sections obtained from each pancreas and applying the following formula:
  • beta mass (area lns + x pancreas mass) / total area
  • NOS NO synthase inhibitors
  • BB rats Biobreeding rats
  • autoimmune diabetes model that initiates spontaneous diabetes after approximately 10 weeks of life. They were randomly separated into two groups, control and treated, and at 5 weeks the treatment that consisted of:
  • Control Group It consists of 3-4 animals submitted to the daily intraperitoneal administration of 200 microliters of the vehicle in which the treatment is diluted -> 0.5% DMSO in saline serum
  • Treated group It consists of 3-4 animals submitted to the daily intraperitoneal administration of 200 microliters of LNMMA diluted in vehicle at a dose of 30mg / kg. Both groups of animals were sacrificed at 7 weeks of age using a CO2 chamber. To perform the cell proliferation studies were injected intraperitoneally 6 hours before sacrifice 5'Bromo 2 '- deoxyuridine (BrdU), an analogue of thymidine that is incorporated into DNA of proliferating cells at a concentration of 100 mg / Kg .
  • PrdU 5'Bromo 2 '- deoxyuridine
  • pancreas that were divided into the head (area near the duodenum) and tail (area near the spleen) were removed and stored at -80 ° C until they were processed by cryostat cutting, obtaining sections 10 microns thick.
  • pancreatic beta cells were determined by simultaneous immunomarking with BrdU fluorescence and insulin following the steps specified below:
  • proliferative beta cells The quantification of proliferative beta cells was performed by counting, using the 40x objective, positive BrdU and insulin cells in 50 random islets, with a confocal microscope (Leyca TCS SL). The results were expressed as No. proliferating cells (BrdU + lnsulin + ) / Insulin area * (mm 2 )
  • the proportion of beta cell area in relation to the area of the pancreas was determined in the head and tail tissue sections of the pancreas fixed with 4% parafolmaldehyde in PBS using an immunohistochemical technique revealed by diaminobenzidine following the steps outlined below:
  • the quantification was carried out by microscopic examination using an Olympus BX-40 microscope, the images were analyzed using the Olympus DP71 camera and the Cell D software. The total areas of 20 were quantified islets, considering islet area as Insulin area "1" relative to the total area of the pancreas.
  • the differential effect observed in the head and tail of the pancreas is remarkable. This could be related to the bioavailability of the drug in both areas or to a different proliferative capacity of the islets in response to stimuli.
  • Nitric oxide synthase inhibitors have been tested with different results in the treatment of other pathologies using animal models. In the last 5 years, results have been described in models of damage derived from the phenomenon of reperfusion ischemia (Barocelli et al, 2006 Nitric Oxide 14 (3): 212-8), neuronal lesions (Wang et al, 2009 Exp Neurol. Jan 19 .), amyotrophic lateral sclerosis or drug-induced renal damage models (Ghaznavi R et al, 2007 Arch Toxicol. 81 (6): 453-7). In this regard, trials in patients with coronary artery disease (Kaufmann et al, 2007 Am J Physiol Heart Circ Physiol.
  • this drug raises the original idea of acting not only on the agents that induce direct damage to the beta cell, but also on the pathogenic microenvironment established in the Pancreatic islet throughout the prediabetes period maintaining the proliferative capacity of the beta cell and thus allowing it to carry out a regenerative response to the autoimmune aggression that will take place prior to clinical onset.

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Abstract

Uso de una composición, que comprende al menos un inhibidor de la actividad de las NO sintasas (NOS), preferentemente cualquiera de los inhibidores de la actividad de las NO sintasas (NOS) de fórmula (I), y más preferentemente el L-NMMA o cualquiera de sus sales, profármacos, derivados o análogos, para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la prediabetes y para el tratamiento la diabetes mellitus tipo 1 en un mamífero.

Description

Uso de Inhibidores de la actividad de las NO sintasas (NOS) y sus composiciones, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento y la prevención de la prediabetes y la diabetes mellitus tipo 1 (DM1). La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina y la farmacología, y se refiere al uso de inhibidores de la actividad de las NO sintasas (NOS), más preferiblemente a los inhibidores de NOS de fórmula (I), y aún más preferiblemente a la Νω-monometil-L-arginina (L-NMMA), para la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la prediabetes y la diabetes mellitus tipo 1 (DM1 ).
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La diabetes mellitus (DM) es un síndrome de elevada morbi-mortalidad, que cursa con una permanente elevación de la glucemia debido a un déficit absoluto o relativo de la secreción de insulina por la célula beta del islote pancreático. Este déficit es debido a la muerte, principalmente por apoptosis, de las células beta como consecuencia de un proceso autoinmune que se inicia mucho antes de la aparición de los primeros síntomas de la enfermedad. La observación de los procesos proliferativos a lo largo de la insulitis sugieren que además de la muerte celular existen también mecanismos que frenan el proceso regenerativo de la célula beta en respuesta a estos daños.
La diabetes mellitus puede ser definida como una elevación crónica de la glucosa en sangre (hiperglucemia). Con frecuencia se acompaña de polidipsia, poliuria y pérdida de peso y puede, en ausencia de tratamiento, desencadenar coma y muerte. La hiperglucemia y otras alteraciones bioquímicas son producidas por una insuficiente secreción o acción de la insulina, que es una hormona responsable del control del metabolismo de la glucosa, grasa y aminoácidos. La DM representa un alto riesgo para padecer enfermedad progresiva de la retina, el riñon y los nervios periféricos; además, agrava el proceso aterosclerótico afectando, especialmente, al corazón, los miembros inferiores y el cerebro.
La diabetes mellitus tipo 1 (DM1 ), tanto en humanos como en animales, es un proceso a uto in m u ne q ue se man ifiesta por i nfiltración l infomonocitaria pancreática y por la presencia de anticuerpos antiislotes circulantes y que cursa con deterioro funcional y estructural progresivo de la masa de células beta (Castaño & Eisenbarth. Annu Rev Immunol. 1990; 8 647-79). Representa entre el 5 y el 1 0% de los casos totales de diabetes, pero el hecho de que tenga su comienzo en la infancia y las graves complicaciones que lleva asociada tanto a corto como a largo plazo la convierten en una patología de alto impacto tanto social como sanitario. En cuanto a su patogénesis existe un grado variable de predisposición genética junto a determinados factores ambientales que determinan las alteraciones inmunológicas y metabólicas que causan finalmente el síndrome de hiperglucemia crónica. Afecta, fundamentalmente, a población joven (1 /500 niños; 1 /200 adolescentes) considerándose una incidencia en nuestro país de 10-12 casos/100.000 habitantes/año (Goday & Serrano-Rios 1994. Med Clin (Barc) 102 (8): 306-15; Mathis et al., 2001 . Nature. 414 (6865): 792-8).
La DM1 se inicia con un desorden de la inmunoregulación de origen desconocido que da lugar a la presentación de autoantígenos pancreáticos a linfocitos T autoreactivos. Esto provoca su activación y posterior reclutamiento al territorio pancreático dando lugar a una infiltración linfomonocitaria, con participación de macrófagos y células dendríticas, que deriva en un proceso inflamatorio local conocido como insulitis. Las células del infiltrado, bien de forma directa o mediante la l iberación de citoquinas inflamatorias (IL-1 beta, TNF-alfa e I F N-gamma) inducen un proceso de muerte de la célu la beta, mayoritariamente por apoptosis, que es un proceso activo y programado de muerte celular, regulado por genes y controlado por diversos factores (Mathis et al., 2001 . Nature 414 (6865): 792-8.). El periodo que precede el inicio cl ínico de la enfermedad se denomina prediabetes. El evento que determina su inicio es la aparición de autoanticuerpos (Ziegler et al., 1999. Diabetes Care. 1999;22:1296 - 1301 ) y a partir de entonces comienza una etapa de duración variable, asintomática y en la que se va produciendo la pérdida gradual de la masa beta como consecuencia del proceso autoinmune. Cuando la destrucción de las células beta es muy evidente aparece un nuevo evento que es la pérdida de la primera fase de la respuesta secretora de la célula beta a una sobrecarga intravenosa de glucosa (Srikanta et al 1983). Esta etapa culmina con el inicio cl ínico de la enfermedad que tiene lugar cuando la masa beta pancreática ha descendido hasta el 10-20% de su totalidad.
Se han descrito distintos mecanismos por los cuales las citoquinas proinflamatorias inducen apoptosis en las células beta pancreáticas. IL-1 beta, IFN-gamma o TNF-alfa se unen a receptores específicos de membrana que se encuentran presentes en la célula beta, activando rutas de señalización entre las que se encuentran las MAPK (mitogen-activated protein kinase) y la de activación de NF-kB. Estudios realizados en l íneas celulares productoras de insulina prueban que la vía preferencial activada por acción apoptótica de las citoquinas proinflamatorias dentro de las MAPK es la vía de JNK. Las rutas alternativas ERK1 /2 y p38 no parecen participar en la respuesta de apoptosis ya que su inhibición no altera el porcentaje de células apoptóticas inducido por citoquinas (Ammendrup et ai, 2000. Diabetes. 49 (9): 1468-76). La importancia de la vía JNK en la señalización de apoptosis por las citoquinas proinflamatorias se prueba también por el hecho de que péptidos inhibidores de d icha ruta bloquean la muerte de l íneas celulares productoras de insul ina sensibles a IL-1 beta en respuesta a la citoquina (Bonny et al., 2001 . Diabetes 50 (1 ): 77-82). Además de la capacidad proapoptotica de las citoq u inas proinflamatorias, nuestro grupo ha podido observar un efecto antiproliferativo de las mismas sobre islotes murinos cultivados que parece estar mediada, al menos en parte por una inhibición de la vía de señalización de ERK1 /2, perteneciente al grupo de las MAPK (Blandino-Rosano et al., 2008. J Mol Endocrinol. 41 35-44). Este descenso en los niveles de proliferación puede ser también demostrado "in vivo" en la rata BB, un modelo animal de DM1 , en estadios muy tempranos de la insulitis, antes de que comience el incremento de apoptosis de las células beta.
El óxido nítrico es una molécula que actúa como segundo mensajero en numerosos procesos biológicos entre los que se destacan el control del tono muscular, la funcionalidad neuronal y la respuesta inmune y, en determinadas situaciones, puede ejercer también acciones citotoxicas . Es producido a partir del aminoácido L-arginina por la enzima óxido nítrico sintasa (NOS) que se encuentra presente en los tej idos como una de las sig u ientes isoformas: neuronal (nNOS o NOS I), endotelial (eNOS o NOS I I I) e inducible (¡NOS o NOS I I) (Moneada et al., 1991 . Pharmacol Rev. 43 (2): 109-42). Además de estar reguladas en cuanto a su expresión ya que las dos primeras son constitutivas y la tercera inducible, las isoformas de NOS pueden ser también reguladas mediante modificaciones postranscripcionales que modifican su estabilidad o su actividad (Bredt et ai, 1992. J Biol Chem. 267 (16): 10976-818- 10; Michel et al., 1993. Proc Nati Acad Sci U S A 90 (13): 6252-6; Chesler et al., 2004. J Interferon Cytokine Res. 24 (2): 141 -9.).
En las células beta pancreáticas se ha demostrado la presencia de nNOS en condiciones básales. El NO que produce actúa regulando, entre otros, los procesos de producción de insulina (Lajoix et al., 2001 . Diabetes 50 (6): 131 1 - 23; Rizzo & Pistón 2003. J Cell Biol 161 (2): 243-8). Ante determinados estímulos como pueden ser alguna de las citoquinas proinflamatorias, la célula beta responde sintetizando la forma inducible de la NOS (¡NOS). Las altas concentraciones de NO producidas por la ¡ NOS han sido consideradas clásicamente responsables, al menos en gran medida, de la destrucción de las células beta durante la DM1 (Eizirik et ai, 1986. Diabetologia 39 (8): 875-90).
Los mecanismos de acción del NO son diversos y están mediados por las interacciones que realiza con distintas proteínas regulando su función, así como por la capacidad de reaccionar con radicales libres dando lugar a productos como los óxidos de nitrógeno o el peroxinitrito, potentes agentes oxidantes que reaccionan con distintas moléculas ocasionándoles daño en su estructura.
Clásicamente, se había descrito que la inducción de apoptosis en la célula beta por NO durante la DM1 , estaba mediada por la acción de algunos de estos agentes oxidantes sobre el DNA provocando daños en las bases y cortes en la hélice. Este daño en el DNA activaría p53 que a su vez es un factor inductor de genes proapoptoticos como BAX, FAS y los miembros BH3-only de la familia de Bcl-2 NOXA y PUMA. (Eizirik et al., 1996. Diabetologia 39 (8): 875-90). Sin embargo, estudios más recientes sugieren una vía de apoptosis mediada por NO independiente de p53 (Messmer & Bruñe 1996. Biochem J. 319 (Pt 1 ) (299- 305). Se ha descrito que en célula beta primaria obtenida de rata, la apoptosis ind ucida por las citoquinas proinflamatorias IL-1 beta+TNF-alfa+IFN-gamma está mediada en gran parte por NO, que actuaría inhibiendo la expresión de la bomba de Ca2+ ATPasa2b del retículo endoplásmico (SERCA2b) paralelamente a la inducción de Gadd153/CHOP y de otros componentes de la respuesta a estrés de retículo con la participación específica de la caspasa 12. (Cardozo et al., 2005. Diabetes 54 (2): 452-61 , Eizirik et al., 2008. Endocr Rev 29 (1 ): 42-61 ). Estudios recientes realizados en la l ínea de insulinoma de rata RIN-r muestran también la importancia de la vía mitocondrial en la apoptosis mediada por el NO inducido tras el cultivo en presencia de las citoquinas IL- 1 beta e IFN-gamma (Holohan et ai, 2008. J Cell Mol Med. 12 (2): 591 -606). En contraste con el efecto proapoptótico del NO sobre la célula beta, ha sido descrito también un efecto promotor de la supervivencia cuando actúa a bajas concentraciones a través de la ruta PI3-K/Akt (Tejedo et al., 2004. Endocrinology. 145 (5): 2319-27). La proliferación celular es otro proceso biológico en el que se ha descrito un papel regulador del NO. Aunque su mayor efecto es inhibitorio, existen trabajos que muestran un efecto del NO activando la proliferación en determinados sistemas celulares. El efecto citostático del NO está asociado a altas concentraciones y tiene lugar a través de diversos mecanismos moleculares (Villalobo 2006. Febs J . 273 (1 1 ): 2329-44). De forma general se ha observado que el NO inhibe la transición de las fases G1 a S durante el ciclo celular. Esto, en algunos casos, puede ser debido a la sobreexpresión de p21 , molécula supresora de ciclo, que provoca la caída de Cdk2 y la hipofosforilación de la proteína del retinoblastoma (Villalobo 2006. Febs J. 273 (1 1 ): 2329-44). Se ha descrito también, en células de tumores de mama, que el aumento de NO conlleva una disminución de la ciclina D1 sin cambios en la ciclina E (Pervin et al., 2001 . Proc Nati Acad Sci U S A. 98 (6): 3583-8). En algunos tipos celulares, el efecto antiproliferativo del NO está mediado por la activación de la enzima guanilato ciclasa y el subsecuente aumento de GMPc, que activa a su vez a PKG y culmina con la fosforilación de Raf-1 y la interrupción de la vía de señalización de ERK1 /2 (Yu et al ., 1997. Circulation. 95 (5): 1269-77). NO puede ejercer también su efecto independientemente del GMPc interaccionando directamente con moléculas relacionadas con el ciclo celular o con la señalización a través de factores de crecim iento y modificando su actividad (Estrada et al . 1 997. Biochem J . 326 ( Pt 2) 369-76). En cuanto al efecto proliferativo del NO, este ha sido descrito, a concentraciones bajas, en fibroblastos, en l íneas tumorales de células ductales pancreáticas y en células PC12 (Hajri et al., 1998. Br J Cáncer. 78 (7): 841 -9; Bal-Price et al., 2006. Nitric Oxide. 14 (3): 238-46).
En célula beta pancreática, el papel del NO en la proliferación bajo condiciones fisiológicas o en respuesta a daño ha sido muy poco estudiado. Estudios recientes muestran que la activación de las rutas de producción de NO mediante el suministro de L-Arginina, estimula la neogénesis de células beta en un modelo murino de diabetes inducida por Alloxan (Vasilijevic et al., 2007. J Physiol. 584 (Pt 3): 921 -33). En contraste con este efecto restaurador del NO, observaciones prel im inares real izadas por nuestro grupo muestran que el efecto antiproliferativo de las citoquinas proinflamatorias sobre las células beta de los islotes en cultivo podría estar mediado por NO ya que se revierte en presencia de L-NMMA, un inhibidor de la actividad de la NOS. Este efecto del NO es independiente de la apoptosis ya que se puede observar también en cultivos de islotes tratados con el inhibidor de caspasas z-VAD-fmk donde el porcentaje de apoptosis inducida por las citoquinas no varia con respecto a los cultivos control.
El único abordaje terapéutico de la DM1 ha sido hasta muy recientemente la administración de insulina hasta normalizar los valores de glucosa en sangre. Sin embargo, a lo largo de las últimas décadas han surgido estrategias terapéuticas, en la actualidad en distintas fases de desarrollo, que persiguen el restablecimiento de la función beta pancreática. Entre ellas se incluyen las que tienen como objetivo la sustitución del tejido destruido mediante trasplantes, tanto de páncreas completo como de islotes aislados, y las encaminadas a recuperar masa de células beta a partir de una población inicial de precursores (neogénesis) o de las propias células beta (proliferación). En este sentido sería muy importante conocer los mecanismos íntimos que regulan la regeneración de las células beta pancreática y su afectación por el proceso patogénico de la DM1 DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han demostrado que el uso de Inhibidores de la actividad de los inhibidores de la sintasa de óxido nítrico, también denominados NO sintasas (NOS), así como sus composiciones farmacéuticas, son útiles para la prevención y el tratamiento de la diabetes mellitus tipo I, actuando también en el periodo de prediabetes, y preferiblemente en el periodo de prediabetes con componente autoinmune.
Así pues, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de de una composición, que comprende al menos un inhibidor de la actividad de cualquiera de las NO sintasas (NOS), para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la prediabetes y la diabetes mellitus tipo 1 en un mamífero, incluyendo un humano, o alternativamente, a un inhibidor de la actividad de cualquiera de las NO sintasas (NOS), para la prevención y/o el tratamiento de la prediabetes y la diabetes mellitus tipo 1 . Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una composición, que comprende un inhibidor de la actividad de cualquiera de las NO sintasas (NOS), para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la prediabetes en un mamífero, incluyendo un humano, y más preferiblemente la prediabetes con componente autoinmune, o alternativamente, a un inhibidor de la actividad de cualquiera de las NO sintasas (NOS), para el tratamiento de la prediabetes en un mamífero, incluyendo un humano, y más preferiblemente la prediabetes con componente autoinmune.
En una realización preferida de la presente invención, el inhibidor de la actividad de las NO sintasas (NOS) se seleccionan de la lista que comprende:
(a) una molécula orgánica,
(b) una molécula de RNA,
(c) un oligonucleótido antisentido,
(d) un anticuerpo, o
(e) una ribozima, o
cualquiera de sus combinaciones.
El término "NO sintasas" (NOS), se refiere a una familia de enzimas eucarioticas que catalizan la producción de óxido nítrico (NO) a partir de la L- arginina, a través de una catálisis orgánica de oxidorreducción (reacción RedOx), sin gasto de energía o ATP. Tienen como Número EC: 1 .14.13.39. Son oxidorreductasas (ya q u e tien e u n dom i n io oxidasa y un dominio reductasa) responsable de la síntesis de óxido nítrico (ON, siglas en español , y NO, siglas en inglés y más aceptado por poseer el orden de electronegatividad creciente) a partir del átomo terminal de nitrógeno de la L-arginina en presencia de nad-fosfato reducido o NADPH (nicotinamida-adenín-dinucleótido fosfato reducido) y dioxígeno (O2). NOS es la única enzima conocida que une FAD (flavín-adenín-dinucleótido), FMN (flavín mononucleótido), hemo, tetrahidrobiopterina (BH ) y calmodulina. Catalizan la siguiente reacción:
L-Arg + NADPH + H+ + 02→ NOHLA + NADP+ + H2O
NOHLA + ½ NADPH + ½ H+ + 02→ L-citrulina + ½ NADP+ + NO + H2O
Los distintos miembros de la familia NOS están codificadas por diferentes genes. Hay tres isoformas conocidas, dos son constitutivas (CNOS) y la tercera es inducible (¡NOS). La clonación de enzimas NOS señala q ue NOS2 es inducible, mientras que NOS3 y NOS1 son constitutivos, en cerebro y en tejido endotelial respectivamente. En esta memoria, el término "NO sintasas" se refiere a cualquiera de los miembros de la familia.
Así, la NOS3 (nitric oxide synthase 3, endothelial cell), también denominada com o EC-NOS; NOS type III; NOSIII; OTTHUMP00000213183; cNOS; constitutive NOS; endothelial NOS; nitric oxide synthase, endotelial, está codificado por un gen que se encuentra en el cromosoma 7 (7q36). Tiene varias isoformas, Sus secuencias aminoacídicas se encuentra en la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 En el contexto de la presente invención, NOS3 se refiere también a cualquiera de sus isoformas, y se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en las SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de cualquiera de las isoformas de la NOS3.
La NOS2 (nitric oxide synthase 2, inducible), también denominada como NOS type I I; NOS, type I I; hepatocyte NOS; inducible NO synthase; inducible NOS; n itric oxide synthase 2A (ind ucible, hepatocytes); n itric oxide synthase, inducible; nitric oxide synthase, macrophage; peptidyl-cysteine S-nitrosylase NOS2, está codificado por un gen que se encuentra en el cromosoma 17 (17q1 1 .2-q12). Su secuencia aminoacídica se encuentra en la SEQ ID NO: 5.
En el contexto de la presente invención, NOS2 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 5, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 5,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 5, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales del péptido NOS2. La NOS1 (nitric oxide synthase 1 , neuronal), también denominada como NOS; bNOS; nNOS; IHPS1 ; N-NOS; NC-NOS; NOS1 , está codificado por un gen que se encuentra en el cromosoma 12 (12q24.2-q24.31 ). Su secuencia aminoacídica se encuentra en la SEQ ID NO: 6.
En el contexto de la presente invención, NOS1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 6, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 6,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 6, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales del péptido NOS1 .
Los inhibidores de las NO sintasas son conocidos en el estado de la técnica. Así por ejemplo, se encuentran entre estos inhibidores L-NAME, 1400W, 1 - amino-2-h i d ro x i g u a n i d i n a , á c i d o 1 -pirrolidinacarboditioico, 2-etil-2- tiopseudourea, 7-nitroindazol, aminoguanidina, mesilato de bromocriptina, péptido dominio "scaffolding" de calveolina-1 , clorpromazina, dexametasona, cloruro de d ifen ileneiodon io, L-NIO, L-tiocitrulina, mercaptoetilguanidina, ADMA, L-NNA, N-PLA, L-NMMA o cualquiera de sus sales, profármacos, derivados o análogos, o cualquiera de sus combinaciones. Por tanto, en otra realización preferida de la presente invención, los inhibidores de la actividad de las NO sintasas (NOS) se seleccionan de la lista que comprende: L-NAME, 1400W, 1 -amino-2-hidroxiguanidina, ácido 1 -pirrolidinacarboditioico, 2-etil-2- tiopseudourea, 7-nitroindazol, aminoguanidina, mesilato de bromocriptina, péptido dominio "scaffolding" de calveolina-1 , clorpromazina, dexametasona, cloruro de d ifen ileneiodon io, L-NIO, L-tiocitrulina, mercaptoetilguanidina, ADMA, L-NNA, N-PLA, L-NMMA o cualquiera de sus sales, profármacos, derivados o análogos, o cualquiera de sus combinaciones.
L-NAME, HCI (NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester, Hydrochloríde. tT-NO^L-Arg- OMe, NG-N02-L-Arg-Ome) es un análogo de la arginina permeable en la célula y que actúa como un inhibidor competitivo y lentamente reversible de la NOS endotelial (IC5o = 500 nM). Inhibe de forma prolongada la relajación inducida por acetilcolina en anillos aórticos de rata (IC5o = 400 nM). 1400W, N-(3-Aminomethyl)benzylacetamidine, 2HCI. Es un inhibidor selectivo e irreversible de la NOS inducible (¡NOS, Kd = 7 nM) en ensayos "in vitro" e "in vivo". Tiene un efecto protector en modelos de isquemia cerebral reduciendo el volumen de las lesiones isquémicas. 1 -Amino-2-hidroxiguanidina, p-Toluenesulfonato. Inhibidor permeable a la célula de la forma inducible de la NOS (IC5o = 68 μΜ). Ensayado en macrofagos murinos y células musculares lisas de aorta de rata en cultivo
Ácido 1 -pirrolidinacarboditioico, sal de amonio. Inhibidor permeable a la célula de la actividad óxido nítrico sintasa. Ensayado en macrofagos alveolares.
2-etil-2-tiopseudourea, Bromhidrato. Inhibidor potente, competitivo y permeable a la célula de las tres isoformas de la NOS (K¡ =17 nM para ¡NOS; K¡ = 36 nM para eNOS; K¡ =29 nM para nNOS).
7-Nitroindazol (CAS 2942-42-9). Inhibidor reversible y competitivo de la NOS con una alta especificidad para la forma neuronal (IC5o = 71 0 nM) aunque también se ha descrito actividad inhibidora de la NOS endotelial bovina (IC5o = 800 nM).
Aminoguanidina, Hemisulfato. Inhibidor de las formas constitutiva (IC5o = 526 μΜ) e inducible (IC5o = 250 μΜ) de la NOS. Ensayado en homogeneizados de tejido ¡leal de rata.
Mesilato de bromocriptina. Inhibidor potente y selectivo de la NOS neuronal (IC5o = 10 μΜ) afectando su activación por calmodulina. Presenta solo un suave efecto inhibitorio sobre la NOS inducible de los macrofagos (IC50 >100 μΜ). Presenta además capacidad inhibitoria de la secreción de prolactina, actúa como agonista del receptor de dopamina D2, modula la función de la P- glicoproteina e inhibe las actividades Mg2+ ATPasa (IC50 = 300 nM) y P-gp ATPasa inducida por verapamil (K¡ = 200 nM).
Péptido dominio "scaffolding" de calveolina-1 . Es un peptido permeable a la célula formado por el dominio "scaffolding" de calveolina-1 (C1 -SD82-ioi) unido por el extremo a n i mo terminal a la secuen cia de internalización de Antennapedia. Ha sido descrito que bloquea "in vitro" la actividad eNOS y reduce tumorigenesis e inflamación "in vivo".
Clorpromazina, Clorhidrato. Inhibe la NOS en cerebro de ratón y previene la inducción de NOS por lipopolisacarido en pulmón murino. Dexamethasona. Es uno de los glucocorticoides más activos y estables. Entre sus númerosas acciones, está la de inhibir la forma inducible de la NOS en células endoteliales (IC50 = 5 nM).
Cloruro de difenileneiodon io (DI P). Es un inh ibidor permeable a la célula e irreversible de la NOS endotelial . Se ha descrito que inhibe la relajación inducida por acetilcolina en anillos aórticos de rata previamente contraidos (IC50 = 180 nM). También inhibe NOS inducible en macrofagos (IC50 = 50 nM).
L-NIO L-N5-(1 -lminoetil)ornitina, dihidrocloruro. Potente inhibidor permeable a la célula con mucha mayor especificidad por la NOS endotelial (eNOS; IC50 = 500 nM) que otros análogos de arginina como L-NAME y L-NMMA. Inhibe la relajación inducida por acetilcolina de anillos aórticos de rata (IC50 = 2 μΜ) y causa un incremento dosis dependiente de la presión arterial media en ratas (EC50 = 19.5 mg/kg).
L-NIL, dihidrocloruro. Inhibidor permeable a la célula, potente y selectivo de la NOS que presenta una especificidad 28 veces mayor por la forma inducible de la NOS (IC5o = 3.3 μΜ) que por su forma neuronal (IC50 = 92 μΜ). Presenta una potencia inhibitoria 10 veces superior a la de L-NMMA inhibiendo la producción de NO2- inducida por interferón (IC50 = 460 nM). L-Tiocitrullina, dihidrocloruro. Inhibidor permeable a la célula y selectivo de la forma neuronal de la NOS (K¡ = 60 nM).
Mercaptoetilguanidina, HCI. Inhibidor de la NOS inducible y secuestrador de peroxinitritos. Causa además una inhibición dosisdependiente de actividad COX-1 y COX-2.
ADMA, 2HCI (NG,NG-Dimethyl-L-arginine), Dihidrocloruro Inhibidor permeable a la célula y reversible de la NOS ensayado "in vitro" (IC50 = 2-3 μΜ)β "in vivo". Causa vasoconstricción y bradicardia de una forma dosis-dependiente.
L-NNA (NG-Nitro-L-arginine. NG-N02-L-Arg). Potente inhibidor reversible y permeable a la célula de las isoformas neuronal y endotelial de la NOS. "In vivo" causa una reducción en la frecuencia cardiaca y profunda vasoconstricción.
N-PLA (NG-Propyl-L-arginine. ^-Propyl-L-arginine). Inhibidor potente, permeable a la célula, competitivo y tiempo-dependiente de la forma neuronal de la NOS (K¡ = 57 nM para nNOS; K¡ = 180 μΜ para ¡NOS; K¡ = 8.5 μΜ para eNOS).
L-NMMA {NG-Monomethyl-L-arginine, Monoacetate Salt (hT-Me-L-Arg, NG-Me- L-Arg, AcOH)) es un análogo de la L-arginina y actúa como inhibidor competitivo de las tres isoformas de la NOS (K¡ = 700 nM fpara eNOS; K¡ = 3.9 μΜ fpara ¡NOS; K¡ = 650 nM para nNOS). Inhibe la relajación inducida por histamina y acetilcolina en arteria pulmonar intacta de cobaya contraída mediante norepinefrina con una K¡ = 9.5 μΜ (Ensayo "ex vivo").
Los inhibidores de la actividad de las NO sintasas (NOS) son conocidos en el estado de la técnica, y se describen en numerosos documentos.
Más preferiblemente, el inhibidor de la actividad de las NO sintasas (NOS) es un compuesto que tiene la fórmula (I):
Figure imgf000016_0001
(I)
o cualquiera de sus sales farmacéuticamente aceptables, donde:
- A se selecciona de entre O (oxígeno) o S (azufre), y puede unirse junto con R4 para formar un anillo heterocíclico, o - A es N cuando R3 y R7 se unen para formar un anillo heterocíclico, o R5 y A-R3 se unen para formar un enlace covalente, o alternativamente
- A es N-R3 siempre que R3 no sea un radical heterocíclico, o alternativamente
- A es un anillo heterocíclico;
- R1 no está presente o se selecciona entre el g rupo formado por hidrógeno, hidroxialquilo, alcoxialquilo, alquilo y haloalquilo;
- R2 se selecciona del grupo que consiste en un alquilo lineal o ramificado, alq uen ilo, y alq u in ilo, cicloalq u ilo, cicloalq u ilo, haloalq u ilo, todos opcionalmente sustituido por uno o más hidrógenos o grupos alquilo, alcoxi, hidroxi, halógeno, trifluorometilo, nitro, ciano, o grupos amino; R3 se selecciona del grupo formado por un arilo heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, todos opcionalmente sustituido por uno o más de halógeno, nitrilo, carboxi, carboxialquilo, carboxyalkylaryl, o alternativamente
R3 se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo, alquenilo, CH2 OC
(= S) YR6, alquilhidroxi, alquilpolihidroxi, amino, hidroxi, alquilo (poli) oxiacil, alquilcarboxi, opcionalmente sustituido por uno o más grupos alquilo, hidroxi, amino, carboxi, carboxialquilo alquilcarbonilo,
R4 se selecciona de H, OH, SH, OR6, SR6' OC(= O)R6, SC(=O)R6, CH2
OC(=S)YR6, OC(=S)YR6 , SC(=S)YR6, OSO2R6, OS(O)R6;
Y se selecciona independientemente de entre O, S, CH2, CHR6, C(R6)2,
NH, NR6;
R5 se selecciona entre H, OH, SH, OR6, SR6, OC(=O)R6, SC(=O)R6' CH2 OC(=S)YR6, OC(=S)YR6 , SC(=S)YR6, OSO2R6, OS(O)R6
R6 se selecciona entre hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclo, arilo, heteroarilo, todos opcionalmente sustituido por uno o más grupos alquilo, alcoxi, hidroxi, halógeno, trifluorometilo, nitro, ciano, o grupos amino;
R7 se selecciona de H, S(O)R9, SO2R9, CH2OC(O)-R9, C(O)-R9, donde C(O)-R9 puede representar aminoácidos naturales y sintéticos o R9 puede ser definida como se define más abajo, o R7 y R3 en su conjunto comprenden un anillo heterocíclico de 5 - o 6 - miembros que contiene dos o más heteroátomos, opcionalmente sustituido con alquilo y / o funciones, entre ellas el oxígeno carbonilo, o en su conjunto comprenden un complejo de metal que contiene un catión divalente, o un complejo de boro;
R8 se selecciona entre H, acilo; a condición de que R4, R5, R7 y R8 no son simultáneamente hidrógeno, excepto cuando Q es SiE2;
R9 se selecciona de dihidropiridil sustituido, alquilo, tioalcoxi, alcoxi, amino, cicloalcoxi, opcionalmente sustituido con uno o más de alquilo amino, alquil, heteroarilo, alquilheteroarilo, alkilmercaptoalkil, que opcionalmente puede estar sustituido con uno o más de hidroxi, amino , guanidino, iminoalkil;
- X se selecciona del grupo formado por alq u ileno, alquen ileno y alquinileno y que pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos alquilo, alcoxi, hidroxi, halógeno, trifluorometilo, nitro, ciano, amino o grupos, o alternativamente
- X se selecciona del grupo que consiste en la fórmula - (CH2)kQ(CH2)t - donde k es 1 , 2 o 3, t es 1 , 2 o 3 y Q es O (oxígeno), Se, SiE2, donde E es alquilo, arilo, S(O)g, donde g es 0, 1 o 2, o NR donde R es H o alquilo que puede estar opcionalmente sustituido con alquilo, alcoxi, hidroxi, halógeno, trifluorometilo, nitro, ciano, amino, o alternativamente
- X se selecciona del grupo que consiste de la fórmula - (CH2)mT(CH2)n -, donde m es 0, 1 o 2, n es 0, 1 o 2, T es u n anillo heterocíclico o carbocíclico de 3 a 6 miembros, un anillo aromático o un anillo heteroaromático que puede estar opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados del grupo formado por alquilo, alcoxi, hidroxi, halógeno, nitro, ciano, trifluoroalquilo y amino.
En otra realización más preferida de la presente invención, el inhibidor de la actividad de las NO sintasas (NOS) es la Νω-monometil-L-arginina (L-NMMA), de fórmula (II):
Figure imgf000018_0001
(II) o cualquiera de sus sales, profármacos, derivados o análogos.
Tal como aquí se utiliza, el término "derivado" incluye tanto a compuestos farmacéuticamente aceptables, entre ellos, derivados del compuesto de fórmula (II), que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como derivados farmacéuticamente no aceptables, ya que éstos pueden ser útiles en la preparación de derivados farmacéuticamente aceptables. Asimismo, dentro del alcance de esta invención se encuentran los profármacos de los compuestos inhibidores de cualquiera de las NOS sintasas, y entre ellos el de fórmula (II). El término "profármaco" tal como aquí se utiliza incluye a cualquier compuesto derivado de un compuesto inhibidor de cualquiera de las NOS sintasas, entre ellos el de fórmula (I), por ejemplo, ésteres, incluyendo ésteres de ácidos carboxílicos, ésteres de aminoácidos, ésteres de fosfato, ésteres de sulfonato de sales metálicas, carbamatos, amidas, etc., que, cuando se ad m i n i stra a u n i n d iv i d u o es ca paz d e p ro porcionar, directa o indirectamente, dichos inhibidores de cualquiera de las NOS sintasas, y entre ellos el compuesto de fórmula (II) en dicho individuo. Ventajosamente, dicho derivado es un compuesto que aumenta la biodisponibilidad de inhibidores de cualquiera de las NOS sintasas, y entre ellos el compuesto de fórmula (I) cuando se administra a un individuo o que potencia la liberación de inhibidores de cualquiera de las NOS sintasas, y entre ellos el compuesto de fórmula (I) en un compartimento biológico. La naturaleza de dicho derivado no es crítica siempre y cuando pueda ser administrado a un individuo y proporcione el compuesto de fórmula (II) en un compartimento biológico de un individuo. La preparación de dicho profármaco puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Los inhibidores de cualqu iera de las NOS sintasas, y entre ellos la Νω- monometil-L-arginina (L-NMMA), o sus sales, profármacos, derivados o análogos, pueden administrarse en una forma substancialmente pura a un mamífero, y preferiblemente un humano, o puede administrarse como parte de una composición más compleja. Cuando se administra formando parte de una composición, la cantidad de inhibidores de cualquiera de las NOS sintasas, y entre ellos el Νω-monometil-L-arginina (L-NMMA), o sus sales, profármacos, derivados o análogos, es tal que alcanza el efecto deseado, siendo por tanto una cantidad efectiva.
La definición general de prediabetes se refiere al periodo anterior al inicio clínico de la enfermedad en el que se están dando lugar una serie de procesos fisiopatológicos que culminan con la incapacidad del organismo para mantener un correcto nivel de glucosa. En el caso de la Diabetes tipo 2, su etapa preclínica de prediabetes se caracteriza por un estado de resistencia insulínica que lleva a una elevación gradual de los niveles de glucosa en sangre. Este estado mantenido en el tiempo aumenta el riesgo de iniciar una diabetes tipo 2 en el futuro en la que la resistencia insulínica se combina con la pérdida de masa beta pancreática as í como de desarrol lar las complicaciones cardiovasculares asociadas a esta enfermedad. En el caso de la Diabetes tipo 1 la etapa preclínica o prediabetes se presenta como asintomática aunque desde el punto de vista fisiológico e histológico está bastante caracterizada. Durante esta etapa se está produciendo un proceso autoinmune que tiene como diana específica a las células beta de los islotes pancreáticos. Se puede identificar un infiltrado linfomonocitario en la proximidad del islote pancreático así como la presencia de autoanticuerpos dirigidos contra antígenos presentes en la célula beta. Este proceso culmina con la destrucción de casi la totalidad de las células beta y es en ese momento cuando tiene lugar el inicio clínico de la enfermedad caracterizado por una hiperglucemia severa.
El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención, la enfermedad es la prediabetes o la diabetes mellitus tipo 1 .
Como se emplea aquí, el término "principio activo", "substancia activa", "substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.
Las composiciones de la presente invención pueden formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Así, pueden estar, sin limitarse, en disolución acuosa estéril o en fluidos biológicos, tal como suero. Las disoluciones acuosas pueden estar tamponadas o no tamponadas y tienen componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica, conservantes incluyendo, pero sin limitarse a, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, y similares, y nutrientes incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas y minerales. Alternativamente, las composiciones pueden prepararse para su administración en forma sólida. Las composiciones pueden combinarse con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a; aglutinantes tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto, o gelatina; excipientes tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes tales como ácido algínico o almidón de maíz; lubricantes tales como estearato de magnesio, desl izantes tales como d ióxido de sil icio coloidal ; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes tales como menta o salicilato de metilo.
Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intracecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal o dérmico. Preferiblemente, la vía de administración es oral. La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo, tolerancia,... del mamífero. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de inh ibidores de la NOS sintasas, y particularmente de la Νω-monometil-L- arginina (L-NMMA), o de sus sales, profármacos, derivados o análogos, o de sus combinaciones, que produzcan el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichos profármacos, derivados o análogos y el efecto terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" y "vehículos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia.
El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción, distribución o acción de cualquiera de los principios activos de la presente invención, estabiliza dicha sustancia activa o ayuda a la preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
El término excipiente "farmacéuticamente aceptable" hace referencia a que el excipiente esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.
Además, el excipiente debe ser farmacéuticamente adecuado, es decir, un excipiente que permita la actividad del principio activo o de los principios activos, es decir, que sea compatible con el principio activo, en este caso, el principio activo es cualquiera de los compuestos de la presente invención.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos.
El vehículo, al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los compuestos de la presente invención hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacéuticamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de las células de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de selección de agentes terapéuticos útiles en la prevención o el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 1 , o en el tratamiento de la prediabetes, preferentemente con componente autoinmune, de ahora en adelante primer método de la invención , que comprende: (a) determinar la actividad de las NO sintasas (NOS) a una determinada concentración del compuesto a analizar, y
(b) comparar dicha actividad de las NO sintasas con un valor normal o con los valores en ausencia de dicho compuesto. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el primer método de la invención comprende: (a) determinar la actividad de las NO sintasas (NOS) a una determinada concentración del compuesto a analizar, y
(b) comparar d icha actividad de las NO sintasas (NOS) con los val ores en p resencia de un compuesto empleado en la elaboración de un medicamento para prevenir o tratar la diabetes mellitus tipo I.
En una realización particular de este aspecto de la invención, el compuesto empleado en el paso (b) es el L-NMMA.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles en el d iagnóstico y/o pronóstico de la d iabetes mell itus tipo I que comprende:
(a) determinar la actividad de las NO sintasas (NOS) en una muestra extraída de un mamífero,
(b) comparar los valores de la actividad de las NO sintasas (NOS) obtenidos en a) con los valores estándar en mamíferos sanos o enfermos.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excl u ir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Evolución de la proliferación de la célula beta en el modelo "in vivo" durante el tratamiento. Los tejidos pancreáticos fueron inmunomarcados con BrdU e Insulina y se contaron un total de 100 islotes por animal: 50 de la cabeza y 50 de la cola del páncreas. En las gráficas se muestran los resultados como n° de células BrdU+lns+ por unidad de área de islote expresándose como la media ± e.e.m. para n=3 animales. *p<0,05.
Figura 2: Efecto del la administración de L-MMA sobre el área relativa de islotes pancreáticos
Las ratas BB fueron tratadas desde la semana 4 de vida con L-NMMA o vehículo (Control) y se sacrificaron a las 7 y 9 semanas de vida. Se calculó el cociente entre el área Insulina + y el área total de dos secciones de páncreas por punto experimental en una n=4 animales por condición. En la gráfica se presentan los valores medios ± e.e.m. del cociente calculado en los segmentos de cabeza y cola del páncreas, cuantificados por separado, y se incluye también el valor correspondiente al momento previo al tratamiento (4s). Se puede observar que en los dos tiempos estudiados, el tratamiento con L-NMMA induce una recuperación del área relativa. Esta recuperación resulta más evidente en el segmento cabeza de páncreas y en el punto temporal de las 9 semanas de vida que es cuando se puede apreciar una mayor pérdida de área relativa de islotes en los animales no tratados debida al proceso patológico.
Figura 3: Efecto del la administración de L-MMA sobre el área relativa de islotes pancreáticos
Las ratas BB fueron tratadas desde la semana 4 de vida con L-NMMA o vehículo (Control) y se sacrificaron a las 7 y 9 semanas de vida. Se calculó, en el páncreas completo, la masa de las células beta cuantificando el área media lnsulina+ en las secciones obtenidas de cada páncreas y aplicando la siguiente fórmula:
masa beta=(área lns+ x masa páncreas)/área total
Los valores medios ± e.e.m. obtenidos para cada serie experimental (n=4) se representan en esta gráfica donde se incluye también el valor correspondiente al momento previo al tratamiento (4s). Se puede observar que en los tiempos estudiados, el tratamiento con L-NMMA induce una recuperación de la masa beta pancreática Esta recuperación resulta más evidente a las 9 semanas de vida que es cuando se puede apreciar claramente en los animales no tratados, la pérdida de masa beta pancreática debida al proceso patológico. EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de los inhibidores de las NO sintasas (NOS), y preferentemente del L-NMMA, en la prevención y/o el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 1 , y de la prediabetes, en un mamífero.
Tratamiento farmacológico de un modelo animal de Diabetes autoinmune con un inhibidor general de la sintasa de óxido nítrico.
Tratamiento de los animales:
Los animales utilizados fueron ratas Biobreeding (BB) un modelo de diabetes autoinmune que inicia una diabetes espontánea a partir de las 10 semanas de vida aproximadamente. Se separaron aleatoriamente en dos grupos, control y tratado, y a las 5 semanas se inicio el tratamiento que consistió en:
Grupo Control: Consta de 3-4 animales sometidos a la administración diaria intraperitoneal de 200 microlitros del vehículo en que se encuentra diluido el tratamiento -> 0,5% DMSO en suero salino
Grupo tratado: Consta de 3-4 animales sometidos a la administración diaria intraperitoneal de 200 microlitros de LNMMA diluido en vehículo a una dosis de 30mg/kg. Ambos grupos de animales fueron sacrificados a las 7 semanas de edad utilizando para ello una cámara de CO2. Para realizar los estudios de proliferación celular se les inyectó intraperitonealmente 6 horas antes del sacrificio 5'-Bromo 2'- Deoxiuridina (BrdU), un análogo de la Timidina que se incorpora al ADN de las células proliferantes a una concentración de 100 mg/Kg. De los animales se extrajeron los páncreas que fueron divididos en cabeza (zona próxima al duodeno) y cola (zona próxima al bazo) y se almacenaron a -80°C hasta que fueron procesadas mediante corte en criostato, obteniéndose secciones de 10 mieras de grosor.
Estudio de proliferación en células beta de los islotes pancreáticos
Los cortes de tejido de cabeza y cola de páncreas fueron fijados con paraformaldehido al 4% en PBS durante 30 minutos a 4°C. La proliferación de las células beta pancreáticas fue determinada mediante inmunomarcaje simultáneo con fluorescencia de BrdU e insulina siguiendo los pasos que se especifican a continuación:
- Permeabilización con Tritón X-100 al 0,02% en PBS, 30 minutos a temperatura ambiente.
- Tratamiento con una solución de HCI 2N en PBS durante 25 minutos con el fin de facilitar la accesibilidad del anticuerpo al BrdU.
- Neutralización mediante 2 incubaciones de 15 minutos con tampón Borato 0,1 M, pH 8.
- Inmunomarcaje de los tejidos incubándolos durante un mínimo de 12 h a 4°C con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-BrdU y otro policlonal anti-insulina de cobaya.
- Revelado mediante incubación durante 1 hora a temperatura ambiente con acticuerpos secundarios contra inmunoglobulinas de ratón y cobaya conjugados, respectivamente, con los fluoróforos Alexa 546 y Alexa 488.
La cuantificación de células beta proliferativas se realizó mediante el contaje, utilizando el objetivo 40x, de células BrdU e insulina positivas en 50 islotes al azar, con un microscopio confocal (Leyca TCS SL). Los resultados fueron expresados como N° células proliferantes (BrdU+lnsulina+)/Area insulina* (milímetros2)
H istomorf ometría
La proporción de área celular beta en relación con el área del páncreas, se de determinó en las secciones de tejido de cabeza y cola de páncreas fijadas con Parafolmaldehido al 4% en PBS mediante una técnica de inmunohistoquímica revelada mediante diaminobenzidina siguiento los pasos que se detallan a continuación:
- Permeabilización utilizando Tritón X-100 al 0,02% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Neutralización de las peroxidasas endógenas mediante incubación con agua oxigenada al 3% en metanol durante 1 minuto.
- Lavados con PBS 5 minutos (3 veces).
- Bloqueo con BSA al 1 % en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. - Incubación con un anticuerpo anti-insulina producido en ratón a una concentración 1 :1000 en solución de bloqueo (BSA al 1 % en PBS) un mínimo de 12h a 4°C.
- Lavados con PBS 5 minutos (3 veces)
- Incubación con un anticuerpo secundario anti IgG de ratón conjugado con avidina a una concentración de 1 /200 en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lavados con PBS 5 minutos (3 veces).
- Incubación con estreptavidina-peroxidasa 1 /100 durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Lavados con PBS 5 minutos (3 veces).
- Revelado del mareaje mediante incubación de las secciones con Diaminobencidina y peróxido de hidrógeno diluidos en PBS durante 1 minuto aproximadamente, a temperatura ambiente.
- Lavados con PBS 5 minutos (3 veces)
- Contratinción del tejido con hematoxilina.
- Deshidratación de los tejidos mediante el paso por una sucesión de alcoholes de graduación creciente y montaje de las preparaciones para su estudio microscópico utilizando medio Entellán.
La cuantificación se realizó mediante examen microscópico utilizando un microscopio Olympus BX-40, analizándose las imágenes mediante la cámara Olympus DP71 y el software Cell D. Se cuantificó el total de las áreas de 20 islotes, considerándose área de islote como área Insulina"1" relativizándola al área total del páncreas.
La significación estadística se calculó mediante el test no paramétrico Mann- Withney test en una población n=3 animales por grupo.
Resultados obtenidos
Los resultados pueden observarse en las Fig. 1 - 2. Como se puede observar en la figura 1 , la proliferación tanto en la cabeza como en la cola del páncreas disminuye significativamente en los individuos tratados con vehículo. Sin embargo, en los animales tratados con el inhibidor de la NOS este descenso en proliferación, aunque se sigue observando en la cola del páncreas, es totalmente revertido en la cabeza del mismo donde los niveles de proliferación se mantienen igual que los existentes a las 5 semanas antes del comienzo del proceso autoinmune.
En cuanto al estudio del área relativa de los islotes, en la figura 2 se puede observar una disminución de la misma a lo largo del tiempo del ensayo tanto en la cabeza como en la cola del páncreas. El tratamiento con L-NMMA consiguió una reversión significativa de este parámetro en la cabeza del páncreas, sin embargo la reversión en la cola del páncreas fue de menor magnitud y no alcanzó la significación estadística aunque se observa una tendencia a la misma.
Como puede observarse en los resultados mostrados, la proliferación tanto en la cabeza como en la cola de los islotes de páncreas controles disminuye significativamente en los individuos no tratados en la etapa inicial periodo de insulitis. En cambio, en los individuos tratados con el inhibidor de la NOS LNMMA este efecto antiproliferativo revierte de forma total, al menos en la cabeza del páncreas, por lo que podríamos deducir que el inhibidor de la NOS ejerce un efecto protector en el islote, ya que mantiene los niveles de proliferación igual a los estadios previos a la insulitis.
Es destacable el efecto diferencial observado en la cabeza y en la cola del páncreas. Esto podría estar relacionado con la biodisponibilidad del fármaco en ambas zonas o con una diferente capacidad proliferativa de los islotes en respuesta a estímulos.
Los inhibidores de las óxido nítrico sintasa han sido probados con diferentes resultados en el tratamiento de otras patologías utilizando modelos animales. En los últimos 5 años han sido descritos resultados en modelos de daño derivado del fenómeno de isquemia reperfusión (Barocelli et al, 2006 Nitric Oxide 14(3): 212-8), lesiones neuronales (Wang et al, 2009 Exp Neurol. Jan 19.), esclerosis lateral amiotrófica o modelos de daño renal inducidos por fármacos (Ghaznavi R et al, 2007 Arch Toxicol. 81(6): 453-7). En este sentido merecen una atención especial los ensayos realizados en pacientes con enfermedad arterial coronaria (Kaufmann et al, 2007 Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293(4): H2178-82.) en los que la inhibición de la NOS aumenta la reserva de flujo coronario y los ensayos clínicos en pacientes con infarto de miocardio complicado con shock cardiogénico (fase III) que no mostraron beneficios cl ínicos pero sin embargo rindieron excelentes resultados en cuanto a bioseguridad (Kaluski et al, 2008 Future Cardiol. 4(2):183-9).
Estos antecedentes unidos a los resultados mostrados proponen a los inhibidores de la NOS como una posible alternativa terapéutica en el tratamiento de la prediabetes, utilizándolo desde las etapas iniciales de la etapa precl ínica con el objeto de mantener la capacidad regenerativa de las células beta de los islotes pancreáticos en respuesta al daño autoinmune.
La utilización de este fármaco como proponen en los ejemplos, plantea la idea original de actuar no solo sobre los agentes inductores del daño directo a la célula beta, sino sobre el microambiente patogénico que se establece en el islote pancreático a lo largo del periodo de prediabetes manteniendo la capacidad proliferativa de la célula beta y permitiéndole por tanto llevar a cabo una respuesta regenerativa ante la agresión autoinmune que tendrá lugar previamente al inicio clínico.
Además, respecto a la seguridad de la utilización de este fármaco (LNMMA), ésta quedo demostrada en un ensayo clínico fase III realizado en pacientes con infarto de miocardio complicado con shock cardiogénico que no mostró beneficios clínicos pero sin embargo rindió excelentes resultados en cuanto a bioseguridad (Kaluski et al, 2008 Future Cardiol. 4(2):183-9.

Claims

REIVINDICACIONES
El uso de una composición, que comprende un inhibidor de la actividad de cualquiera de las NO sintasas (NOS), para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la prediabetes y/o la diabetes mellitus tipo 1 en un mamífero.
El uso de una composición, que comprende inhibidores de la actividad de las NO sintasas (NOS), para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la prediabetes en un mamífero.
El uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, donde el inhibidor de la actividad de las NO sintasas (NOS) es un compuesto de fórmula (I),
Figure imgf000032_0001
(l)
donde:
A se selecciona de entre O (oxígeno) o S (azufre), y puede unirse junto con R4 para formar un anillo heterocíclico, o
A es N cuando R3 y R7 se unen para formar un anillo heterocíclico, o R5 y A-R3 se unen para formar un enlace covalente, o
A es N-R3 siempre que R3 no sea un radical heterocíclico, o
A es un anillo heterocíclico;
R1 no está presente o se selecciona entre el grupo formado por hidrógeno, hidroxialquilo, alcoxialquilo, alquilo y haloalquilo; R2 se selecciona del grupo que consiste en un alquilo lineal o ramificado, alquenilo, alqu in ilo, cicloalq u ilo, cicloalqu ilo, haloalqu ilo, todos opcionalmente sustituidos por uno o más hidrógenos o grupos alquilo, alcoxi, hidroxi, halógeno, trifluorometilo, nitro, ciano, o grupos amino;
R3 se selecciona del grupo formado por un arilo heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, todos opcionalmente sustituidos por uno o más grupos halógeno, nitrilo, carboxi, carboxialquilo, carboxialkilaril, o
R3 se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo, alquenilo, CH2 OC
(= S) YR6, alquilhidroxi, alquilpolihidroxi, amino, hidroxi, alquilo (poli) oxiacil, alquilcarboxi, opcionalmente sustituido por uno o más grupos alquilo, hidroxi, amino, carboxi, carboxialquilo alquilcarbonilo,
R4 se selecciona de H, OH, SH, OR6, SR6' OC(= O)R6, SC(=O)R6, CH2
OC(=S)YR6, OC(=S)YR6 , SC(=S)YR6, OSO2R6, OS(O)R6;
Y se selecciona independientemente de entre O, S, CH2, CHR6, C(R6)2,
NH, NR6;
R5 se selecciona entre H, OH, SH, OR6, SR6, OC(=O)R6, SC(=O)R6' CH2 OC(=S)YR6, OC(=S)YR6 , SC(=S)YR6, OSO2R6, OS(O)R6
R6 se selecciona entre h idrógeno, alqu ilo, alq uen ilo, alqu in ilo, cicloalquilo, heterociclo, arilo, heteroarilo, todos opcionalmente sustituido por uno o más grupos alquilo, alcoxi, hidroxi, halógeno, trifluorometilo, nitro, ciano, o grupos amino;
R7 se selecciona de H, S(O)R9, SO2R9, CH2OC(O)-R9, C(O)-R9, donde C(O)-R9 puede representar aminoácidos naturales y sintéticos o R9 puede ser definido como se define más abajo, o R7 y R3 en su conjunto comprenden un anillo heterocíclico de 5 - o 6 - miembros que contiene dos o más heteroátomos, opcionalmente sustituido con alquilo y / o funciones, entre ellas el oxígeno carbonilo, o en su conjunto comprenden un complejo de metal que contiene un catión divalente, o un complejo de boro;
R8 se selecciona entre H, acilo; a condición de que R4, R5, R7 y R8 no son simultáneamente hidrógeno, excepto cuando Q es SiE2;
R9 se selecciona de dihidropiridil sustituido, alquilo, tioalcoxi, alcoxi, amino, cicloalcoxi, opcionalmente sustituido con uno o más de alquilo am ino, alqu il , heteroahlo, alquilheteroarilo, alquilmercaptoalquil, que opcionalmente puede estar sustituido con uno o más de hidroxi, amino , guanidino, iminoalquil;
- X se selecciona del grupo formado por alquileno, alquenileno y alquinileno y que pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos alquilo, alcoxi, hidroxi, halógeno, trifluorometilo, nitro, ciano, amino o grupos, o
- X se selecciona del grupo que consiste en la fórmula - (CH2)kQ(CH2)t - donde k es 1 , 2 o 3, t es 1 , 2 o 3 y Q es O (oxígeno), Se, SiE2, donde E es alquilo, arilo, S(O)g, donde g es 0, 1 o 2, o NR donde R es H o alquilo que puede estar opcionalmente sustituido con alquilo, alcoxi, hidroxi, halógeno, trifluorometilo, nitro, ciano, amino, o
- X se selecciona del grupo que consiste de la fórmula - (CH2)mT(CH2)n -, donde m es 0, 1 o 2, n es 0, 1 o 2, T es un anillo heterocíclico o carbocíclico de 3 a 6 miembros, un anillo aromático o un anillo heteroaromático que puede estar opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados del grupo formado por alquilo, alcoxi, hidroxi, halógeno, nitro, ciano, trifluoroalquilo y amino.
o cualquiera de sus sales farmacéuticamente aceptables.
- El uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, donde los inh ibidores de la actividad de las NO sintasas (NOS) se seleccionan de la lista que comprende: ÑAME, 1400W, 1 -amino-2- hidroxiguanidina, ácido 1 -pirrolidinacarboditioico, 2-etil-2-tiopseudourea, 7-n itroindazol , am inoguan id ina, mesilato de bromocriptina, péptido dom in io "scaffold ing" de calveol ina-1 , clorpromazina, dexametasona, cloruro de difenileneiodonio, L-N IO, L-tiocitrulina, mercaptoetilguanidina, ADMA, L-NNA, N-PLA, L-NMMA o cualquiera de sus sales, profármacos, derivados o análogos, o cualquiera de sus combinaciones. 5- El uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, donde el inhibidor de la actividad de las NO sintasas (NOS) es el L- NMMA, o cualquiera de sus sales, profármacos, derivados o análogos.
El uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, donde la composición además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
El uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, donde la composición además comprende otro principio activo.
Un método de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 1 y de la prediabetes, según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, que comprende:
(a) determinar la actividad de las NO sintasas (NOS) a una determinada concentración del compuesto a analizar, y
(b) comparar dicha actividad de las NO sintasas con un valor normal o con los valores en ausencia de dicho compuesto.
Método de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 1 y de la prediabetes según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, que comprende
(a) determinar la actividad de las NO sintasas (NOS) a una determinada concentración del compuesto a analizar, y
(b) comparar dicha actividad de las NO sintasas (NOS) con los valores en presencia de un compuesto empleado en la elaboración de un medicamento para prevenir o tratar la diabetes mellitus tipo I, y/o la prediabetes. -Método de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 1 y de la prediabetes, según la reivindicación anterior, donde el compuesto empleado en el paso (b) es el L-NMMA. -Método de obtención de datos útiles en el diagnóstico y/o pronóstico de la diabetes mellitus tipo I y de la prediabetes, que comprende:
(a) determinar la actividad de las NO sintasas (NOS) en una muestra extraída de un mamífero,
(b) comparar los valores de la actividad de las NO sintasas (NOS) obtenidos en a) con los valores estándar en mamíferos sanos o enfermos.
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ES2193285T3 (es) * 1995-12-22 2003-11-01 Smithkline Beecham Plc Inhibidor de oxido nitrico (no)-sintasa para prevenir la diabetes de tipo ii.

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