WO2012096500A2

WO2012096500A2 - 축산용 생균제 조성물 및 그 제조방법.

Info

Publication number: WO2012096500A2
Application number: PCT/KR2012/000242
Authority: WO
Inventors: 정대이; 허윤정; 최창순; 최대건
Original assignee: 광주시농업기술센터; 주식회사 씨티씨바이오
Priority date: 2011-01-11
Filing date: 2012-01-10
Publication date: 2012-07-19
Also published as: KR101062555B1; US20130295055A1; WO2012096500A3

Abstract

본 발명은 친환경 생균제 조성물에 관한 것으로써, 보다 구체적으로 유산균 배양액 및 유기산을 포함하되, 상기 유기산을 유산균 배양액 1중량부에 대하여 0.002~0.1중량부 함유된 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 친환경 생균제 조성물은 항생제를 함유하지 않으면서도 살균, 살바이러스 효과를 나타내는 복합 효과를 나타낼 수 있다.

Description

축산용 생균제 조성물 및 그 제조방법.

본 발명은 축산용 생균제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유산균 배양액 및 유기산을 포함하는 축산용 생균제 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 축산용 생균제 조성물의 보존력 향상 방법에 관한 것이다.

종래 축산 현장에서는 가축의 생산성 향상을 위해 항생물질, 합성항균제 등이 광범위하게 사용되고 있다.

그러나, 최근 항생제의 축산물 중 잔류 문제가 사회적 이슈로 거론되고, 병원균의 내성 획득에 따른 슈퍼박테리아의 출현이 동물용 항생제의 과다 사용에서 비롯된 것으로 볼 수 있다는 우려에 따라, 미국, 유럽 등 선진국에서는 항생 물질에 대한 사용 규제 및 관리를 강화하고 있다. 이러한 추세에 따라 근래에는 병원성 미생물에 대해 경쟁적 배제 효과를 발현하고, 대사산물에 의한 억압 작용으로 가축의 항병성을 강화시켜주는 미생물제제인 생균제를 이용함으로써, 화학약품의 사용량을 최소화하고 가축의 성장능력을 극대화시키려는 시도가 실용화되고 있다.

생균제란 살아있는 유익 미생물을 함유한 제제로서 동물의 장내에 정착하여 다른 병원성 미생물과 경쟁적 배제를 통해 유해 미생물의 성장을 억제하고, 섭취한 사료의 소화 및 흡수를 도와줌으로써 동물의 성장을 촉진시키고 사료 효율을 개선시켜 주는 미생물제제를 말하며, 프로바이오틱(probiotic) 또는 DFM(direct-fedmicrobials)이라고도 불린다. 이러한 생균제의 생균으로 이용되는 미생물 중 동물이나 사람에게 특이한 병원성을 주지 않는 안전한 균으로, 면역력 향상, 축사환경 개선, 가축 생산성 향상 등의 효과가 우수한 유산균이 가장 많이 사용되고 있으며, 유산균을 이용한 생균제의 사용은 최근 축산업 규모가 커짐에 따라 사양관리의 집약화, 고단위 사료급여에 의한 소화기관의 스트레스 및 운동부족, 소독 등에 의한 유용 환경미생물의 축소, 가축의 생산성 등을 저하시킬 수 있는 요인을 극복하기 위한 효과적인 대안이 되고 있다.

또한 생균제로 가장 많이 쓰이고 있는 유산균은 다양한 항세균 활성을 보이는데 이는 유산균이 생성하는 각종 유기산, 과산화수소, 박테리오신 등에 의한 것으로 보고 있다. 이중 특히 최근 주목받고 있는 항세균 물질인 박테리오신은 낮은 pH에서 유해균주에 대한 세포벽 침투율이 높아져 살균 효능이 증가하는 것으로 알려져 있어 유산균 배양액의 pH를 낮춤으로써 유산균의 항균효능을 증가시킬 수 있을 것으로 사료된다.

한편, 축산용 생균제에 있어, 생균제 본연의 생균 효능 이외의 유용성을 구비한 축산용 생균제에 대한 연구가 일부 진행되고 있으며, 축산물의 경우 배설물 등을 통해 전파되는 살모넬라균, 대장균 등에 의한 식중독균 문제, 최근 대한민국에서 큰 경제사회적 피해를 낳은 구제역 바이러스, 철새에 의한 전파가 가능하여 해마다 문제가 되고 있는 고병원성 조류 인플루엔자과 관련하여 개별 치료제 또는 예방제 이외에 축산용 생균제를 이용하여 복합 효능을 발휘할 수 있는 축산용 생균제에 대해서는 연구가 미흡한 실정이다. 살모넬라를 위시한 식중독균, 구제역 바이러스, 조류인플루엔자 바이러스 등을 제어하기 위한 축사내부의 위생관리는 단순히 소독제만을 이용하기는 어렵다. 소독제를 상시 사용함으로써 발생되는 환경 오염과 소독제 상시 노출에 따른 가축의 면역력 저하 등도 축산 현장에는 문제가 되고 있다. 병원균 제어를 위해 유해 살균제와 소독제를 남용함으로 인해 발생할 수 있는 부작용 및 잔류성 문제를 해결하고, 이와 동시에 유해 미생물의 증식으로 인해 발생할 수 있는 가축 질병을 최소한으로 감소시킬 수 있는 복합 효능을 발휘할 수 있는 생균제의 개발이 더욱 절실하다. 생균제는 상시 급여를 통해 가축의 생산성에 유익한 기능을 하며 축사 살포를 통해 유해 미생물을 억제하는 효능을 동시에 발휘할 수 있다.

이에, 축산물의 식중독균과 악성 가축 전염병인 구제역 바이러스, 조류인플루엔자바이러스 등과 관련된 개별 치료제 또는 예방제 이외에, 경제적이고 간편한 사용이 가능하며 부작용의 염려가 없는 복합 효능을 겸비한 축산용 생균제 조성물 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

따라서, 본 발명은 주요 생균으로 유산균을 포함하는 축산용 생균제 조성물로서, 유기산을 첨가하여 생균 효능은 물론, 식중독균 등에 대한 소독 효능을 구비한 새로운 축산용 생균제 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 주요 생균으로 유산균을 포함하는 축산용 생균제 조성물에 식중독균 등의 살균 효능을 겸비하도록 하기 위해 유기산을 첨가하는 방법의 최적 조건을 제공하고자 한다.

또한, 주요 생균으로 유산균을 포함하는 축산용 바이러스 생균제 조성물로서, 바이러스에 대한 소독 효과를 구비한 살 바이러스 효능의 축산용 생균제 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 상기 축산용 생균제 조성물의 보존력을 향상시키기 위하여 액상 안정제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물의 보존력 향상 방법을 제공하고자 한다.

이를 위해 본 발명은 축산용 생균제 조성물에 있어서, 유산균 배양액 및 유기산을 포함하되, 상기 유기산은, 상기 유산균 배양액 1중량부에 대하여 0.002~0.1 중량부 함유된 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 유산균 배양액을 준비하는 단계; (b) 유기산을 상기 (a) 유산균 배양액에 첨가하여 pH 2.1~3.5의 생균제 조성물을 제조하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 유산균 배양액 및 유기산을 포함하되, 상기 유기산은, 상기 유산균 배양액 1중량부에 대하여 0.002~0.1중량부 함유된 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물에 액상 안정제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물의 보존력 향상 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 주요 생균으로 유산균에 유기산이 첨가되어 복합 효능을 구비하면서 경제적이고 안전한 새로운 축산용 생균제 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 유산균에 유기산을 첨가하여 생균 효능은 물론, 식중독균 등의 살균 효능을 구비한 축산용 생균제 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 주요 생균으로 유산균에 유기산이 첨가된 새로운 축산용 생균제 조성물을 제조하는 최적의 조건을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 유산균에 유기산을 첨가하여 바이러스에 대한 소독효과를 구비한 축산용 생균제 조성물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 상기의 축산용 생균제 조성물의 보존력 향상방법을 제공함으로써 축산용 생균제 조성물 내의 유산균의 생존력을 높일 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 유산균 배양액의 배양시간에 따른 pH 변화를 나타낸 그래프이다.

도 2는 비교예 1 및 실시예 1 내지 6에 대한 유산균 개체수 검사에 따른 배양 시험 결과를 나타낸 사진이다.

도 3은 본 발명의 비교예 1 및 실시예 1 내지 2에 대한 살모넬라 균 제어효과를 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4a는 살모넬라에 유산균 배양액 및 구연산을 첨가하여 살모넬라 균 제어 효과를 평가한 결과를 나타내며, 도 4b는 살모넬라에 구연산만을 첨가한 결과를 나타낸다.

도 5a는 살모넬라에 유산균 배양액 및 젖산을 첨가하여 살모넬라 균 제어 효과를 평가한 결과를 나타내며, 도 5b는 살모넬라에 젖산만을 첨가한 결과를 나타낸다.

도 6a는 살모넬라에 유산균 배양액 및 말산을 첨가하여 살모넬라 균 제어 효과를 평가한 결과를 나타내며, 도 6b는 살모넬라에 말산만을 첨가한 결과를 나타낸다.

도 7a는 대장균에 유산균 배양액 및 구연산을 첨가하여 대장균 제어 효과를 평가한 결과를 나타내며, 도 7b는 대장균에 구연산만을 첨가한 결과를 나타낸다.

도 8a는 대장균에 유산균 배양액 및 젖산을 첨가하여 대장균 제어 효과를 평가한 결과를 나타내며, 도 8b는 대장균에 젖산만을 첨가한 결과를 나타낸다.

도 9a는 대장균에 유산균 배양액 및 말산을 첨가하여 대장균 제어 효과를 평가한 결과를 나타내며, 도 9b는 대장균에 말산만을 첨가한 결과를 나타낸다.

도 10a는 리스테리아균에 유산균 배양액 및 구연산을 첨가하여 리스테리아균 제어 효과를 평가한 결과를 나타내며, 도 10b는 리스테리아균에 구연산만을 첨가한 결과를 나타낸다.

도 11a는 리스테리아균에 유산균 배양액 및 젖산을 첨가하여 리스테리아균 제어 효과를 평가한 결과를 나타내며, 도 11b는 리스테리아균에 젖산만을 첨가한 결과를 나타낸다.

도 12a는 리스테리아균에 유산균 배양액 및 말산을 첨가하여 리스테리아균 제어 효과를 평가한 결과를 나타내며, 도 12b는 리스테리아균에 말산만을 첨가한 결과를 나타낸다.

[ 발명을 지원한 국가연구개발사업]

[과제고유번호] K111101

[부처명] 경기도

[연구관리전문기관](재)경기과학기술진흥원

[연구사업명] 공공기술개발

[연구과제명] 구제역 예방을 위한 유산균-유기산 복합 사료첨가제 개발

[기여율] 1/1

[주관기관] 광주시농업기술센터

[연구기간] 2011. 06. 01~2012.05. 31

이하 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명은 축산용 생균제 조성물에 있어서, 유산균 배양액 및 유기산을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 유산균(lactic acid bacteria)은 생균으로 이용되는 미생물 중 가장 대표적인 생균으로, 동물이나 사람에게 특이한 병원성을 주지 않기 때문에 특별한 경우를 제외하고 생균으로 사용하는데 가장 효과적이고 안전한 균이다. 이러한 유산균은 에너지원이 되는 당 성분을 이용하여 발효산물로 유산을 생산하는 균으로서, 축산물에 사용할 경우 부패 또는 병원성 미생물의 생육을 억제하여 장기능 강화, 소화기 질병 예방 효과가 있다. 또한, 소화 효소 생산으로 사료 효율성을 증대시키고, 축산물의 증체량을 향상시키며, 부패균 내지 식중독균 등의 억제를 통한 축사의 악취를 감소시키는 효과가 있다.

한편, 최근 문제가 되고 있는 구제역 바이러스는 pH 7.2~7.6에서 가장 활동성이 좋으며, 4℃ 이하에서는 pH 6.7 이하 또는 pH 9.5 이상에서도 상당 기간 동안 생존할 수 있다. 그러나, pH 5.0 이하 또는 pH 11.0 이상에서는 급속히 사멸하고 56℃에서 30분 정도면 완전히 파괴되는 것으로 알려져 있다. 조류인플루엔자 바이러스의 경우도 구제역 바이러스와 마찬가지로 산도에 매우 민감하여 pH5.0 이하에서 급속히 사멸한다. 따라서, 상기 유산균을 구제역, 조류인플루엔자 관련 축산물 매몰지에 대량 사용할 경우에는, 자가 증식하여 부패균 내지 식중독균의 침입을 막고 매몰지의 악취를 예방할 수 있으며, 가스 발생 감소 등의 효과를 기대할 수 있다. 보통 이러한 유산균을 축산용 생균제로 실제 사용할 경우 희석 단계를 거치게 되는데, 이때 유산균 배양 및 희석 농도에 따라 과도한 pH 상승으로 인해 생균 효능은 유지될 수 있으나, 상기와 같은 효과를 발휘하도록 하기는 쉽지 않다.

이에, 본 발명자들은 축산용 생균제 조성물의 축산물에의 투여 또는 살포에 있어, 생균 효능을 포함한 살 바이러스 효능, 살균 효능 등 복합 효능을 발휘할 수 있는 축산용 생균제 조성물 연구 끝에, 가장 우수한 생균 효능을 발휘하는 유산균에 유기산을 첨가함으로써 생균 효능뿐만 아니라 살 구제역, 살 조류인플루엔자 바이러스 효능, 살균 효능 등 복합 효능을 발휘할 수 있다는 것을 발견하게 된 것이다.

본 발명에 따른 축산용 생균제 조성물에 사용되는 유산균을 속으로 분류하면, 엔테로코커스(Enterococcus)와 같은 구균, 락토바실러스(Lactobacillus)와 같은 간균 및 비피도박테리아(Bifidobacteria)와 같은 무정형으로 나뉠 수 있다. 본 발명에서는 유해균을 사멸시키는 능력이 우수하고 3.0 이하의 낮은 산도에서도 생존율이 높은 균을 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii),락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 사용할 수 있다.

상기 유산균 배양액은 특별히 한정되지 않으나, 유기산 첨가 및 희석 후 생균 효능 및 소독 효능 등 복합 효능 발휘를 위한 최적 pH를 고려하여 pH 4.0이하인 것이 바람직하다.

상기 유기산은 상기 유산균 배양액의 투여 또는 살포시 희석으로 인한 pH의 과도한 증가를 제어하고, 생균제 조성물의 생균 효능 유지 및 살균 효능 발휘를 위해 첨가되는 것으로, 상기 유산균 배양액 1 중량부에 대하여 0.002~0.1중량부 함유된 것이 바람직하며, 0.01~0.02 중량부 함유된 것이 더욱 바람직하다. 상기 유기산의 함량이 0.002 중량부 미만일 경우 축산물에의 투여 또는 축사 등의 살포를 위한 희석 시 과도한 pH 증가로 살균 효능이 미흡할 수 있고, 0.1 중량부를 초과할 경우 살균 효능은 증가하나 과량의 첨가로 유산균의 생육을 저해하여 생균 효능이 감소될 수 있다. 또한, 상기 유기산 첨가량에 따른 생균제 조성물의 pH는 2.1~3.5인 것이 바람직하다. 이러한 상기 유기산은 특별히 한정되지 않으나, 안전성 확보를 위해 식품첨가용 무수구연산, 말산, 젖산으로 이루어진 군에서 선택된 하나인 것이 바람직하다.

여기서, 상기 유산균 배양액 및 상기 유기산을 포함하는 생균제 조성물을 축산물에의 투여 또는 축사 등에 살포를 위해 희석하게 되는데, 생균 효능 발휘를 위해 상기 생균제 조성물은, 희석 비율을 10~100배로 하여 pH가 4이하로 희석된 생균제 조성물인 것이 바람직하다.

이러한 본 발명에 따른 축산용 생균제 조성물은 기존 유산균을 생균으로 이용하는 생균제 조성물과 동등한 수준의 생균 효능을 유지하며, 나아가 구제역, 조류 독감 바이러스 사멸 효능을 발휘할 수 있음을 발견하였다.

한편, 본 발명에 따른 축산용 생균제 조성물의 상기 효능들이 발휘될 수 있는 축산물로는, 소, 돼지, 염소 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명에 따른 축산용 생균제 조성물 제조방법에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 축산용 생균제 조성물 제조방법은, (a) 유산균 배양액을 준비하는 단계; (b) 유기산을 상기 (a) 유산균 배양액에 첨가하여 pH 2.1~3.5의 생균제 조성물을 제조하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 유산균 배양액에 포함되는 유산균은 특별히 한정되는 것은 아니나, 유해균을 사멸시키는 능력이 우수한 락토바실러스 균을 사용하는 것이 바람직하다. 이를 위하여 본 발명에서는 유해균을 사멸시키는 능력을 가지면서도 살균, 살 바이러스 효능을 나타내는 pH에서도 생존하는 데 적합한 균을 선별하여 사용하였으며, 내산성이 강한 유산균이라면 제한없이 본 발명의 목적에 맞도록 사용할 수 있다.

또한, 상기 유산균 배양액 제조에 사용되는 배지는 일반적으로 사용되는 배지가 사용될 수 있으나, 배양 단가 측면에서는 기존 유산균 배양법은 바람직하지 않다.

이에, 본 발명에 따른 축산용 생균제 조성물 제조방법에 사용되는 유산균 배양 배지는, 효모추출물 5~50%, 포도당(glucose) 1~10% 및 설탕(sucrose) 1~10 %를 포함하는 유산균용 배양 배지인 것을 특징으로 하여, 경제적인 유산균용 배양 배지를 제공하고 있다. 이러한 본 발명에서 사용될 수 있는 유산균용 배양 배지는 식물성 원료만을 사용하는 것으로, 배양시 유산균 개체수가 2.1×10⁸수준으로 기존에 사용되는 배지에 의한 유산균 개체수 1.0×10⁷수준보다 월등히 뛰어난 활성을 나타내고 있다. 또한, 배양 단가를 1/3 수준으로 절감할 수 있다.

이와 같은 유산균용 배양 배지를 이용하여, 34~36℃ 조건에서 24~48시간 정치배양하여 축산용 생균제 조성물을 제조할 수 있다. 이때, 상기 온도 및 시간 조건에서 벗어날 경우 희석 사용시 살균 효능이 만족할 정도로 발휘되지 않을 수 있다. 상기 온도 및 시간 조건을 적용하고, 배양된 유산균 배양액의 pH가 4 이하일 때 살균 효능발휘를 위해 가장 바람직하다.

또한, 상기 유산균 배양 완료 후 겨울철 동결 방지를 위한 첨가제로, 상기 유산균 배양액에 대하여 글루타민산(glutamic acid) 0.05~0.15중량% 및 염화나트륨(NaCl) 0.5~1.5 중량%를 첨가하는 것이 바람직하다.

상기 유기산은 상기 유산균 배양액 1중량부에 대하여 10~100배의 비율로 희석되어 상기 유산균 배양액에 첨가하도록 함으로써, 생균제 조성물의 pH가 2.1~3.5가 되도록 할 수 있다. 사용되는 유기산의 종류는 특별히 한정되지 않으나, 안전성 확보를 위해 식품첨가용 무수구연산, 말산, 젖산으로 이루어진 군에서 선택된 하나인 것이 바람직하다 한편, 본 발명에 따른 축산용 생균제 조성물의 한 양태에 따르면, 축산물에의 투여 또는 축사에 살포를 위해 증류수 등에 최종 희석을 하게 된다. 이때, 상기 희석에도 불구하고 생균 효능 발휘를 위한 적정 pH(바람직하게는 pH 4 이하)를 유지하는 것이 중요하다. 본 발명에서는 유산균 배양액에 유기산을 첨가 후 증류수 등으로 10배 내지 100배 비율로 희석하여, 생균제 조성물의 pH가 4 이하로 유지되면서 효과적인 소독 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 또한 본 발명은 상기의 축산용 생균제 조성물의 살 바이러스 효과에 관한 것이며, 상기 바이러스는 인플루엔자바이러스, 구제역 바이러스, 돼지수포병바이러스, 조류인플루엔자바이러스 등 일반적으로 낮은 pH 의해 사멸하는, 축사에서 발생할 수 있는 가축의 바이러스를 모두 포함할 수 있다.

축산용 생균제 조성물의 살 바이러스 효과를 효과적으로 나타내기 위해서는 본 발명의 축산용 생균제 조성물을 1배 내지 100배 희석하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 10배 내지 50배 희석하여 처리할 수 있다.

또한 본 발명은 축산용 생균제 조성물에 들어있는 유산균 배양액의 유산균의 생존력을 높이기 위하여 유산균 배양액 및 유기산을 포함하되, 상기 유기산은, 상기 유산균 배양액 1중량부에 대하여 0.002~0.1중량부 함유된 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물에 액상 안정제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물의 보존력 향상 방법에 관한 것이다.

본 발명의 액상 안정제는 트레할로스, 글리세롤, 프락토올리고당, 베타인, 프롤린, 덱스트란, 말토스, 수크로스, 만니톨, 폴리올, 실리카겔, 아미노구아니딘, 파이리독사민 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 글리세롤 또는 프락토올리고당일 수 있다. 액상 안정제는 유산균 배양액 1 중량부에 대하여 0.001~0.1 중량부로 첨가 가능하며 액상안정제를 첨가함으로써 본 발명의 액상 유산균의 생존성을 높일 수 있다.

본 발명의 축산용 생균제 조성물은 액상형태 또는 분말형태로 제조될 수 있으며, 분말제제로 제형화하기 위해서 당업계의 공지된 방법, 예를 들면 유산균 펄라이트와 알지네이트를 이용할 수 있다.

제조된 축산용 생균제 조성물은 사료 등에 첨가하여 투여하거나 직접 경구 투여하여 사용할 수 있으며, 축사 내 살포하는 방식으로 사용하여 축사 내의 바이러스 또는 균을 소독할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

1. 축산용 생균제 살균 효능 평가

1.1 유산균 배양액 제조

본 발명의 목적에 적합한 충분한 내산성을 가진 유산균주를 선별하기 위하여 다음과 같은 분리방법을 취했다.

김치 시료 10개와 양계 분변 10개를 시료로 하여 김치 시료와 양계 분변을 0.85% 식염수로 10 배 희석한 후, 구연산을 2% 첨가하여 4℃에서 48시간 보관하였다. 이 후 상기 시료를 0.1ml씩 MRS 아가 배지(디프코(Difco)) 플레이트에 유리막대로 도말하였다. 이후, 플레이트를 35℃의 항온 배양기에서 36시간 동안 배양하였다. 생성된 각각의 콜로니를 MRS 아가 배지 플레이트에 획선 접종하였고, 35℃의 항온 배양기에서 36시간 동안 배양하여 유산균 콜로니를 분리하였다. 상기 분리한 유산균 콜로니를 각각 MRS 액상 배지(디프코)에 35℃의 항온 배양기에서 24시간 동안 배양하여 최종 유산균 배양 후 MRS 배지의 pH를 확인하여 pH3.8 이하의 유산균 만을 선택하였다.

당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 상기 선별된 유산균들의 16S rDNA의 염기서열을 분석하였다. 그 결과 상기 방법으로 분리된 유산균은 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 델브루에키이 (Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis)로 밝혀졌다. 따라서, 상기 균들은 충분한 내산성을 가진 균주임을 확인하였으며, 상기와 같은 균들은 본 발명의 산도가 조절된 축산용 생균제 조성물에 사용가능함을 확인하였다.

보다 구체적인 실험을 수행하기 위하여 상기의 균들 중 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 선택하였다. 이후의 실험은 락토바실러스 플란타럼을 이용하였다.

락토바실러스 플란타럼의 합제를 2.0×10⁸ 수준으로 1% 종균 접종하기 위해 이하와 같은 배지를 사용하여 유산균 배양액을 제조하였다. 배지의 제조는 효모 추출물 2.5중량%, 포도당 1.5중량% 및 설탕 2중량%를 포함하도록 하였다. 이후, 35℃에서 48시간 정치배양을 하여 유산균 배양액을 제조하였다. 또한, 동결 방지를 위한 첨가제로, 유산균 배양액에 대하여 글루타민산 0.1중량% 및 염화나트륨 1중량%를 첨가하였다.

1.2 유기산 희석 및 첨가

(1) 유산균 배양액에 구연산 첨가

상기 유산균 배양 후 식품첨가용 무수구연산을 상기 유산균 배양액 1중량부에 대하여 0.002중량부, 0.0025중량부, 0.0033중량부, 0.005중량부, 0.01 중량부, 0.02 중량부, 0.03 중량부, 0.0 5중량부, 0.07중량부 및 0.1중량부 포함되도록 하기 위해 하기 표 1과 같은 희석 배율로 희석 후 유산균 배양액에 첨가하였다.

표 1

구분	비교예1	실시예1	실시예2	실시예3	실시예4	실시예5	실시예6	실시예7	실시예8	실시예9	실시예10
희석배율(배)	0	10	14	20	33	50	100	200	300	400	500
함량(중량부)	0	0.1	0.07	0.05	0.03	0.02	0.01	0.005	0.0033	0.0025	0.002

표1에서 비교예 1 및 실시예 1 내지 10에 대하여 각각 증류수(pH 7)로 하기 표 2와 같이, 100배 및 200배의 희석 비율로 희석하였다.

표 2

구분	구연산 함량(중량부)	증류수 희석비율(배)
비교예2	0	100
실시예11	0.1	100
실시예12	0.07	100
실시예13	0.05	100
실시예14	0.03	100
실시예15	0.02	100
실시예16	0.01	100
실시예17	0.005	100
실시예18	0.0033	100
실시예19	0.0025	100
실시예20	0.002	100
비교예3	0	200
실시예21	0.1	200
실시예22	0.07	200
실시예23	0.05	200
실시예24	0.03	200
실시예25	0.02	200
실시예26	0.01	200
실시예27	0.005	200
실시예28	0.0033	200
실시예29	0.0025	200
실시예30	0.002	200

상기 실시예 및 비교예에 따라 제조된 생균제 조성물에 대해 유산균 배양액의 배양시간에 따른 pH 변화를 도 1에, 유산균 배양액에 구연산 첨가 후 pH 변화를 하기 표 3에, 생균제 조성물 희석 후 pH 변화를 하기 표 4에 나타내었다.

표 3

구분	비교예1	실시예1	실시예2	실시예3	실시예4	실시예5	실시예6	실시예7	실시예8	실시예9	실시예10
pH	3.67	2.16	2.25	2.48	2.68	2.84	3.04	3.21	3.3	3.37	3.45

표 4

구분	pH
비교예2	4.01
실시예11	2.97
실시예12	3.10
실시예13	3.20
실시예14	3.37
실시예15	3.42
실시예16	3.60
실시예17	3.71
실시예18	3.77
실시예19	3.83
실시예20	3.85
비교예3	5.15
실시예21	3.17
실시예22	3.30
실시예23	3.45
실시예24	3.56
실시예25	3.63
실시예26	3.86
실시예27	4.17
실시예28	4.30
실시예29	4.42
실시예30	4.45

도 1을 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 유산균 배양액은 배양시간 15시간 이후에는 pH가 4 이하로 유지되는 것을 알 수 있다. 또한, 표 3을 참조하면, 구연산 함량이 0.002~0.1중량부에서 생균제 조성물(실시예 1 내지 10)의 pH가 2.1~3.5 범위에 있음을 알 수 있으며, 표 4를 참조하면, 증류수로 100~200배 희석된 생균제 조성물의 pH가 4 이하인 생균제 조성물(실시예 11 내지 26)을 얻을 수 있음을 알 수 있다.

(2) 유산균 배양액에 젖산 첨가

유산균 배양액에 젖산을 첨가하여 생균제 조성물을 제조하였다. 생균제 조성물을 제조하기 위한 유산균 배양액의 제조방법은 상기 1.1의 방법과 동일하며, 상기 (1)의 과정과 같이 젖산을 첨가한 후 희석하여 최종적으로 젖산의 농도가 0.5%, 1%, 2%가 되도록 제조하였다.

(3) 유산균 배양액에 말산 첨가

유산균 배양액에 말산을 첨가하여 생균제 조성물을 제조하였다. 생균제 조성물을 제조하기 위한 유산균 배양액의 제조방법은 상기 1.1의 방법과 동일하며, 상기 (1)의 과정과 같이 말산을 첨가한 후 희석하여 최종적으로 말산의 농도가 0.5%, 1%, 2%가 되도록 제조하였다.

1.3 축산용 생균제의 살균 효능 평가

제조된 축산용 생균제의 살균 효능을 평가하기 위하여 유산균 배양액에 각각 구연산, 말산, 젖산을 첨가하여 희석 후 살모넬라균, 대장균, 리스테리아균에 처리하였다. 억제 효과의 평가는 시간에 따른 총 균수를 평가하여 수행하였으며, 균수는 로그값을 취하여 log₁₀CFU/ml로 이하 표시하였다.

(1) 살모넬라균 억제 효능 평가

공시균주인 살모넬라 균 Salmonella typhimurium ATCC 19585 및 Salmonella typhimurium ATCC 43174를 American Type culture collection에서 구매하여, Rappaport-Vassiliadis Soya Peptone Broth(CM0866, Oxoid, 영국)에 37℃ 세균배양기에서 24시간 배양하였다. 총균수는 정지기의 균주를 6~7log(cfu/㎖)로 희석하여 사용하였다.

1) 구연산(citric acid, CA) 첨가 생균제의 효과

상기 Salmonella typhimurium ATCC 19585 및 Salmonella typhimurium ATCC 43174를 1:1로 혼합한 살모넬라 균과 실시예 5, 6 및 비교예 1에 따른 생균제 조성물을 각각 1:1로 혼합하여, 0분, 10분, 20분, 30분 및 60분 동안 처치한 후, 10배 단계희석하여 살모넬라의 평판 선택배지인 MacConkey Agar(CM0115, Oxoid, 영국)에 도말하였다. 이때, 희석액은 0.2% peptone water를 사용하였으며, 도말된 평판배지는 37℃ 세균배양기에서 24시간 배양한 후 백색의 단일집락을 계수하였다. 평가는 총 3회 반복한 평균으로 실시하였다.

도 3을 참조하면, 구연산이 첨가되지 않은 비교예 1의 경우 접종 60분 후에도 여전히 다량(5% 이상)의 살모넬라균이 생존해 있으나, 구연산이 첨가된 실시예 5 및 6의 경우 99.9999% 이상 살균한 것을 알 수 있고, 실시예 5의 경우는 100% 살균되었음을 알 수 있다.

한편, 상기 실시예 5 및 6에 따른 생균제 조성물을 살모넬라 균에 감염되어 설사병에 걸린 송아지에 경구 투여한 결과 설사 치유 효과가 있음을 확인하였다.

구연산을 각각 0.5%, 1.0%, 2.0%가 되도록 첨가하여 시간에 따른 살모넬라균 억제 효과를 확인하였다. 표5 및 표6은 살모넬라에 유산균과 농도를 달리한 구연산을 첨가한 경우와 살모넬라에 구연산만을 첨가한 경우 시간에 따른 억제 효과를 나타내는 것이다. 해당 결과를 도 4a, 4b에 각각 도시하였다.

표 5

	0min	10min	20min	30min	60min
SAL+ LAB	8.59	8.40	8.45	8.28	6.68
SAL+ LAB (CA0.5%)	8.59	8.28	8.22	7.70	4.42
SAL+ LAB(CA1.0%)	8.59	8.02	7.29	6.33	0.00
SAL+ LAB(CA2.0%)	8.59	6.31	3.31	0.00	0.00

표 6

	0min	10min	20min	30min	60min
SAL+ BROTH	8.68	8.68	8.67	8.67	8.63
SAL+ BROTH (CA 0.5%)	8.68	8.63	8.62	8.66	8.67
SAL+ BROTH(CA 1.0%)	8.68	8.67	8.70	8.72	8.77
SAL+ BROTH(CA 2.0%)	8.68	8.63	8.63	8.61	8.48

상기 결과에 따라 본 발명의 생균제가 살모넬라균을 효과적으로 살균할 수 있음을 확인할 수 있었으며, 이는 구연산을 단독으로 첨가한 경우보다 더욱 뛰어난 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

2) 젖산(lactic acid, LA) 첨가 생균제의 효과

상기와 같이 제조된 살모넬라 단일 집락에 젖산을 각각 0.5%, 1.0%, 2.0%가 되도록 첨가하여 시간에 따른 살모넬라균 억제 효과를 확인하였다. 표7 및 표8은 살모넬라에 유산균과 농도를 달리한 젖산을 첨가한 경우와 살모넬라에 젖산만을 첨가한 경우 시간에 따른 억제 효과를 나타내는 것이다. 해당 결과를 도 5a, 5b에 각각 도시하였다.

표 7

	0min	10min	20min	30min	60min
SAL+ LAB	8.55	8.56	8.61	8.49	8.30
SAL+ LAB (LA0.5%)	8.55	8.42	8.56	8.39	7.83
SAL+ LAB(LA1.0%)	8.55	8.37	8.30	8.18	6.30
SAL+ LAB(LA2.0%)	8.55	6.32	4.47	3.22	0.00

표 8

	0min	10min	20min	30min	60min
SAL+ BROTH	8.68	8.68	8.67	8.67	8.63
SAL+BROTH(CA 0.5%)	8.68	8.63	8.62	8.66	8.67
SAL+BROTH(CA 1.0%)	8.68	8.67	8.70	8.72	8.77
SAL+BROTH(CA 2.0%)	8.68	8.63	8.63	8.61	8.48

상기 결과에 따라 본 발명의 생균제가 살모넬라균을 효과적으로 살균할 수 있음을 확인할 수 있었으며, 이는 젖산을 단독으로 첨가한 경우보다 더욱 뛰어난 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 특히 이러한 차이는 1%이상의 젖산을 첨가한 경우에 두드러지게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

3) 말산(malic acid, MA) 첨가 생균제의 효과

상기와 같이 제조된 살모넬라 단일 집락에 말산을 각각 0.5%, 1.0%, 2.0%가 되도록 첨가하여 시간에 따른 살모넬라균 억제 효과를 확인하였다. 표9 및 표10은 살모넬라에 유산균과 농도를 달리한 말산을 첨가한 경우와 살모넬라에 말산만을 첨가한 경우 시간에 따른 억제 효과를 나타내는 것이다. 해당 결과를 도 6a, 6b에 각각 도시하였다.

표 9

	0min	10min	20min	30min	60min
SAL+ LAB	8.55	8.54	8.53	8.49	8.13
SAL+ LAB (MA0.5%)	8.55	8.59	8.39	8.15	6.85
SAL+ LAB(MA1.0%)	8.55	8.40	8.14	7.63	5.31
SAL+ LAB(MA2.0%)	8.55	7.67	6.05	3.51	0.00

표 10

	0min	10min	20min	30min	60min
SAL+ BROTH	9.02	9.07	9.03	9.03	9.07
SAL+ BROTH (MA0.5%)	9.02	9.04	9.05	9.04	9.09
SAL+ BROTH(MA1.0%)	9.02	9.03	9.04	9.04	8.88
SAL+ BROTH(MA2.0%)	9.02	8.88	8.73	8.63	7.50

상기 결과에 따라 본 발명의 생균제가 살모넬라균을 효과적으로 살균할 수 있음을 확인할 수 있었으며, 이는 말산을 단독으로 첨가한 경우보다 더욱 뛰어난 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 특히 이러한 차이는 첨가되는 말산의 농도가 증가할수록 뚜렷하게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며 2%의 말산을 첨가하는 경우 1시간 이내에 거의 모든 균을 제거할 수 있음을 확인할 수 있어 본 발명의 생균제가 매우 우수한 효과를 나타내고 있음을 보여준다.

(2) 대장균 억제 효능 평가

공시균주인 대장균과 본 발명의 생균제 조성물을 각각 1:1로 혼합하여, 0분, 10분, 20분, 30분 및 60분 동안 처치한 후, 10배 단계 희석하여 도말하였다. 이때, 희석액은 0.2% peptone water를 사용하였으며, 도말된 평판배지는 37℃ 세균배양기에서 24시간 배양한 후 백색의 단일집락을 계수하였다. 평가는 총 3회 반복한 평균으로 실시하였다.

1) 구연산(citric acid, CA) 첨가 생균제의 효과

구연산(citric acid, CA)을 각각 0.5%, 1.0%, 2.0%가 되도록 첨가하여 시간에 따른 대장균 억제 효과를 확인하였다. 표11 및 표12는 대장균에 유산균과 농도를 달리한 구연산을 첨가한 경우와 대장균에 구연산만을 첨가한 경우 시간에 따른 억제 효과를 나타내는 것이다. 해당 결과를 도 7a, 7b에 각각 도시하였다.

표 11

	0min	10min	20min	30min	60min
EC+LAB	8.72	8.69	8.62	8.51	8.23
EC+LAB (CA 0.5%)	8.72	8.70	8.74	8.40	8.05
EC+LAB (CA 1.0 %)	8.72	8.70	8.61	8.40	8.03
EC+LAB(CA 2.0 %)	8.72	8.72	8.51	8.39	7.56

표 12

	0	10.00	20.00	30.00	60.00
EC+Broth	8.72	8.65	8.69	8.68	8.68
EC+ Broth(CA 0.5%)	8.72	8.70	8.64	8.66	8.67
EC+ Broth(CA 1.0%)	8.72	8.71	8.65	8.70	8.71
EC+ Broth(CA 2.0%)	8.72	8.71	8.67	8.65	8.61

상기 결과에 따라 본 발명의 생균제는 구연산 단독 첨가 대조군에서 시간에 따른 균의 수가 변화가 없는 것과 비교하여 뚜렷한 살균효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

2) 젖산(lactic acid, LA) 첨가 생균제의 효과

상기와 같이 제조된 대장균 단일 집락에 젖산을 각각 0.5%, 1.0%, 2.0%가 되도록 첨가하여 시간에 따른 대장균 억제 효과를 확인하였다. 표13 및 표14는 대장균에 유산균과 농도를 달리한 젖산을 첨가한 경우와 대장균에 젖산만을 첨가한 경우 시간에 따른 억제 효과를 나타내는 것이다. 해당 결과를 도 8a, 8b에 각각 도시하였다.

표 13

	0min	10min	20min	30min	60min
EC+ LAB	8.80	8.82	8.76	8.71	8.36
EC+LAB LA0.5%	8.80	8.78	8.55	8.47	8.03
EC+LAB LA 1.0%	8.80	8.68	8.21	7.48	6.52
EC+LAB LA 2.0%	8.80	8.64	7.90	6.66	4.43

표 14

	0min	10min	20min	30min	60min
EC+Broth	8.61	8.74	8.67	8.76	8.73
EC+Broth (LA 0.5%)	8.61	8.61	8.78	8.76	8.74
EC+ Broth (LA 1.0%)	8.61	8.74	8.63	8.66	8.66
EC+ Broth (LA 2.0%)	8.61	8.64	8.56	8.60	8.63

도8에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명의 생균제는 구연산 단독 첨가 대조군에서 시간에 따른 균의 수가 변화가 없는 것과 비교하여 뚜렷한 살균효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

3) 말산(malic acid, MA) 첨가 생균제의 효과

상기와 같이 제조된 대장균 단일 집락에 말산을 각각 0.5%, 1.0%, 2.0%가 되도록 첨가하여 시간에 따른 대장균 억제 효과를 확인하였다. 표15 및 표16은 대장균에 유산균과 농도를 달리한 말산을 첨가한 경우와 대장균에 말산만을 첨가한 경우 시간에 따른 억제 효과를 나타내는 것이다. 해당 결과를 도 9a, 9b에 각각 도시하였다.

표 15

	0min	10min	20min	30min	60min
EC+LAB	8.80	8.70	8.67	8.77	8.74
EC+LAB MA0.5%	8.80	8.78	8.65	8.71	8.43
EC+LAB MA 1.0%	8.80	8.71	8.67	8.56	8.09
EC+LAB MA+2.0%	8.80	8.56	8.44	7.44	0.00

표 16

	0min	10min	20min	30min	60min
EC+Broth	8.61	8.73	8.72	8.80	8.90
EC+ Broth (MA 0.5%)	8.61	8.67	8.66	8.86	8.79
EC+ Broth (MA 1.0%)	8.61	8.78	8.74	8.77	8.94
EC+ Broth (MA 2.0%)	8.61	8.69	8.68	8.79	8.63

2% 말산을 추가한 생균제의 경우 60분 경과 후 약 99.999%의 살균효과를 나타내는 것을 확인할 수 있어 본 발명의 말산 추가 생균제는 효과적으로 대장균을 살균할 수 있음을 확인할 수 있었다.

(3) 리스테리아균 억제 효능 평가

공시균주인 리스테리아균과 본 발명의 생균제 조성물을 각각 1:1로 혼합하여, 0분, 10분, 20분, 30분 및 60분 동안 처치한 후, 10배 단계 희석하여 도말하였다. 이때, 희석액은 0.2% peptone water를 사용하였으며, 도말된 평판배지는 37℃ 세균배양기에서 24시간 배양한 후 백색의 단일집락을 계수하였다. 평가는 총 3회 반복한 평균으로 실시하였다.

1) 구연산(citric acid, CA) 첨가 생균제의 효과

구연산(citric acid, CA)을 각각 0.5%, 1.0%, 2.0%가 되도록 첨가하여 시간에 따른 리스테이라균 억제 효과를 확인하였다. 표17 및 표18은 리스테리아균에 유산균과 농도를 달리한 구연산을 첨가한 경우와 리스테리아균에 구연산만을 첨가한 경우 시간에 따른 억제 효과를 나타내는 것이다. 해당 결과를 도 10a, 10b에 각각 도시하였다.

표 17

	0min	10min	20min	30min	60min
Lis + LAB	8.62	8.55	8.50	8.44	8.37
LIS+ LAB (CA 0.5%)	8.62	8.55	8.53	8.47	8.31
LIS+ LAB(CA 1.0%)	8.62	8.56	8.52	8.52	7.98
LIS+ LAB(CA 2.0%)	8.62	8.42	8.31	8.29	7.63

표 18

	0min	10min	20min	30min	60min
LIS+ LAB	8.62	8.58	8.48	8.45	8.46
LIS+ BROTH (CA 0.5%)	8.62	8.52	8.48	8.51	8.39
LIS+ BROTH(CA 1.0%)	8.62	8.47	8.48	8.41	8.42
LIS+ BROTH(CA 2.0%)	8.62	8.37	8.37	8.38	8.40

2) 젖산(lactic acid, LA) 첨가 생균제의 효과

상기와 같이 제조된 리스테리아균 단일 집락에 젖산을 각각 0.5%, 1.0%, 2.0%가 되도록 첨가하여 시간에 따른 리스테리아균 억제 효과를 확인하였다. 표19 및 표20은 리스테리아균에 유산균과 농도를 달리한 젖산을 첨가한 경우와 리스테리아균에 젖산만을 첨가한 경우 시간에 따른 억제 효과를 나타내는 것이다. 해당 결과를 도 11a, 11b에 각각 도시하였다.

표 19

	0min	10min	20min	30min	60min
Lis + LAB	8.89	8.94	8.94	8.86	8.85
LIS+ LAB (LA0.5%)	8.89	8.94	8.92	8.81	8.78
LIS+ LAB(LA1.0%)	8.89	8.93	8.86	8.79	8.78
LIS+ LAB(LA2.0%)	8.89	8.81	8.73	8.64	8.57

표 20

	0min	10min	20min	30min	60min
LIS+ broth	8.67	8.61	8.61	8.55	8.50
LIS+ BROTH (LA 0.5%)	8.67	8.59	8.72	8.77	8.57
LIS+ BROTH(LA 1.0%)	8.67	8.56	8.73	8.64	8.48
LIS+ BROTH(LA 2.0%)	8.67	8.51	8.53	8.53	8.31

도11a 에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명의 생균제는 구연산 단독 첨가 대조군과 비교하여 시간에 따라 지속적인 살균효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

3) 말산(malic acid, MA) 첨가 생균제의 효과

상기와 같이 제조된 리스테리아균 단일 집락에 말산을 각각 0.5%, 1.0%, 2.0%가 되도록 첨가하여 시간에 따른 리스테리아균 억제 효과를 확인하였다. 표21 및 표22는 리스테리아균에 유산균과 농도를 달리한 말산을 첨가한 경우와 리스테리아균에 말산만을 첨가한 경우 시간에 따른 억제 효과를 나타내는 것이다. 해당 결과를 도 12a, 12b에 각각 도시하였다.

표 21

	0min	10min	20min	30min	60min
Lis + LAB	8.89	8.83	8.79	8.66	8.62
LIS+ LAB (MA0.5%)	8.89	8.76	8.81	8.68	8.68
LIS+ LAB(MA1.0%)	8.89	8.73	8.73	8.64	8.63
LIS+ LAB(MA2.0%)	8.89	8.78	8.65	8.61	8.22

표 22

	0min	10min	20min	30min	60min
LIS+ broth	8.67	8.54	8.51	8.46	8.65
LIS+ BROTH (MA0.5%)	8.67	8.55	8.61	8.56	8.58
LIS+ BROTH(MA1.0%)	8.67	8.69	8.60	8.60	8.59
LIS+ BROTH(MA2.0%)	8.67	8.51	8.62	8.55	8.61

대조군과 비교하여 본 발명의 말산 추가 생균제가 리스테리아균의 수를 감소시키는 것을 확인할 수 있었고, 특히 2% 말산의 추가한 경우 가장 효과적인 살균효과를 확인할 수 있었다.

2. 축산용 생균제의 살바이러스 효능 평가

유산균 배양액에 유기산을 첨가한 본 발명의 생균제의 살바이러스 효과를 확인하였다.

2.1 조류독감바이러스에 대한 살바이러스 효능

(1) 실험 준비

본 발명의 바이러스는 조류독감바이러스 AIV0028(H9N2)를 사용하였다. 생균제는 상기 1.1 방법으로 제조된 유산균 배양액에 구연산을 2%농도가 되도록 첨가하여 제조하였으며 이를 용해하여 소독액으로 준비하고 대조 희석액으로는 펩톤 워터를 사용하였다.

증류수에 1리터의 CaCl₂0.305g과 MgCl_2·6H₂O 0.139g(w/v)을 첨가하여 경수를 제조하고 제조된 경수에 소 태아혈청을 5%되게 첨가하여 유기물 희석액을 제조하였다. 증류수를 포함한 모든 희석용액과 소독제 및 조류인플루엔자 바이러스는 냉장 온도가 되도록 보관하고 시험도 냉장 온도에서 수행하였다.

바이러스에 대한 소독 효과는 희석액 종류(증류수, 경수, 유기물)별로 측정하였으며, 소독액은 1/50, 1/100, 1/150, 1/200의 희석 배수에서 효과를 측정하였다. 조류인플루엔자 바이러스는 각 희석액으로 1/10 희석시켜 사용하였다.

각 희석액으로 1/10으로 희석한 조류인플루엔자 바이러스 1ml과 배수별로 희석한 소독제 1ml을 섞어 4℃에서 30분간 반응시켰다. 이와 동일한 방법으로 증류수, 경수, 유기물을 처리하였으며, 모든 실험군에서 처리 후 즉시 0.45nm여과지로 여과하여 유산균을 제거하였다. 소독제 처리가 끝난 바이러스 재료는 50% 소 태아혈청 함유 세포배양배지(항생제 및 중조 첨가)와 1:1(동량)로 혼합하여 소독제를 중화하였다. 중화 처리 후 즉시 혈청 무첨가 배지로(항생제 및 중조 첨가) 1/10로 희석하고 얼음에 보관하여 처리 시간이 끝난 후 계속될 수 있는 소독 효과를 희석시켰으며 이는 10^-1로 간주하였다. 이후 혈청 무첨가 배지로 10진 희석을 수행하였다.

접종 범위는 소독제 처리 바이러스의 경우 10^-1~10^-6 로 수행하였으며, 대조 바이러스의 경우 10^-4부터 10^-7까지 수행하였다.

10~12일령의 배의 요막강(allantoic cavity)으로 0.1ml 바이러스 접종하고 4~5일 후 well별로 배양액 약간씩을 채취하여 plate HA test를 실시하였다.

(2) 희석배수에 따른 효과

2% 구연산이 함유된 본 발명의 생균제를 상기와 같이 소독액으로 제조하여 사용한 경우 표23과 같은 효과를 보였다. 구연산 단독으로 처리한 경우의 소독 효과와 비교하기 위하여 구연산 농도를 2% 내지 8%로 달리하여 조류독감바이러스의 역가를 측정하였다. 그 결과를 표24에 나타냈다.

표 23

희석액	소독제희석배수	시험 회차별 역가 (log10)				최종 유효희석배수
		생균형소독제
		1차	2차	3차	4차
연수(증류수)	1:50	0.50	0.50	0.50	0.50	50배
	1:100	4.50	4.00	1.25	1.75
	1:150	4.50	-	-	3.75
	1:200	5.25	-	-	4.00
	병원체 대조 역가	5.50	5.88	4.50	6.00
	유효 희석배수	50배	50배	50배	100배
경수	1:25	-	0.50			50배
	1:50	0.75	0.50
	1:100	2.50	1.50
	1:150	-	-
	병원체 대조 역가	5.88	5.83
	유효 희석배수	50배	50배
유기물	1:25	-	1.75			25배
	1:50	0.75	2.50
	1:100	3.00	3.25
	병원체 대조 역가	4.75	5.83
	유효 희석배수	50배	25배

표 24

구연산농도	희석액	희석배수	Avian Influenza역가 (log10)
2%	연수(증류수)	1:12.5	1.25
2%		1:25	2.00
4%		1:50	2.00
6%		1:50	2.00
8%		1:50	0.75
병원체 대조 역가			5.00

유산균에 구연산을 2%첨가한 본 발명의 생균제는 조류인플루엔자 바이러스에 대하여 8%의 구연산을 첨가한 것과 비슷한 정도의 소독 효능을 나타냄을 확인하였다. 특히, 유효 희석 농도를 살피면 증류수에선 50~100배까지, 경수는 50배, 유기물에선 25~50배정도의 소독 효능을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 생균제를 이용하면 저농도의 구연산을 첨가하여 효과적으로 살바이러스 효과를 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다.

2.2 구제역 바이러스(FMDV)에 대한 살바이러스 효능

구제역 바이러스로 A22 Iraq 106 TCID50 사용하여 본 발명의 생균제의 살바이러스 효과를 확인하였다.

바이러스 소독제로 사용된 생균제는 상기 2.1 과 같은 방법으로 제조하였으며, 기타 경수 및 유기물도 동일한 방법으로 제조하였다. 희석배율에 따른 생균제의 살바이러스 효과 실험 결과를 표 25에 나타냈다.

표 25

구분		Log 값
소독액(경수희석)+ FMDV	희석배율	반복 1	반복 2	반복 3	비고
	10배	-	-	-	No CPE
	20배	1.5	-	0.9
	50배	4.5	4.3	4.8
소독액(유기물포함경수희석)+FMDV	10배	-	-	-	No CPE
	20배	1.1	-	0.9
	50배	4.7	4.7	4.9
경수+FMDV		5.1	5.5	5.5
유기물포함경수(FBS 5%)+FMDV		5.2	5.3	5.4

상기 표에서 확인하는 바와 같이 비록 효과가 감소하였으나 50배 희석까지도 살바이러스 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 20배까지 희석하는 경우 효과적으로 살바이러스 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있어 본 발명의 축산용 생균제 조성물이 바이러스에 효과적인 소독제로 사용 가능함을 확인하였다.

3. 축산용 생균제의 보존력 향상 평가

유산균 배양액에 구연산 첨가 후 유산균 개체수를 하기와 같은 방법으로 평가하고, 그 결과를 하기 표 26에 나타내었다. 또한, 도 2는 표1의 비교예 1 및 실시예 1 내지 6에 대한 유산균 개체수 검사에 따른 배양 시험 결과를 나타낸 사진으로, 도 2(a)는 왼쪽부터 비교예 1, 실시예 6 및 실시예 5의 결과를 나타낸 사진이고, 도 2(b)는 왼쪽부터 실시예 4 내지 1의 결과를 나타낸 사진이다.

비교예 1, 실시예 1 내지 7 및 10의 생균제 조성물을 이용하여 MRS agar에서 유산균 개체수(CFU/㎖)를 검사하였다.

표 26

구분		비교예1	실시예1	실시예2	실시예3	실시예4	실시예5	실시예6	실시예7	실시예10
개체수 검사결과	1회	1.9x10⁸	6.0x10⁶	4.0x10⁷	5.0x10⁷	4.0x10⁷	2.0x10⁸	1.8x10⁸	1.5 x 10⁸	2.2x10⁸
	2회	2.3x10⁸	1.1x10⁷	2.0x10⁷	6.0x10⁷	5.0x10⁷	1.6x10⁸	1.5x10⁸	1.8x10⁸	2.3 x10⁸
	3회	2.2x10⁸	4.0x10⁶	2.0x10⁷	4.0x10⁷	8.0x10⁷	1.3 x10⁸	2.4x10⁸	2.7x10⁸	2.4x10⁸
평균		2.1x10⁸	7.0x10⁶	2.7x10⁷	5.0x10⁷	5.7x10⁷	1.6x10⁸	1.9x10⁸	2.0x10⁸	2.3x10⁸

표 26를 참조하면, 본 발명에 따른 축산용 생균제 조성물에서 사용하는 유산균용 배양 배지에 의해 제조된 유산균 배양액의 유산균 개체수(비교예 1 참조)는 종래보다 월등히 우수한 것을 알 수 있으며, 구연산 함량이 0.1중량부일 때까지도 다수의 유산균이 생존해 있으며, 특히 0.002~0.02중량부일 경우(실시예 5 내지 7 및 10)에는 유산균 생육 저해가 거의 없는 것을 알 수 있었다.

비록 본 발명의 생균제에서 상기의 최적의 구연산 농도에서 유산균의 생육 저해가 거의 없는 것을 확인할 수 있지만, 실제 사용 시 축산용 생균제에서 유산균의 생존을 더욱 지속시키기 위하여 적절한 액상 안정제 탐색 실험을 수행하였다. 상기의 결과를 토대로 구연산 2% 첨가를 액상제 실험 대상으로 선정하였으며 보존제 종류를 달리하여 유산균의 생존성이 개선되는지 여부를 확인하였다.

각각의 액상 안정제는 유산균 배양액 1중량부에 대하여 0.01중량부 또는 0.001중량부로 첨가되었다.

표 27

Period of storage(day)	무첨가		트레할로스		글리세롤		프락토올리고당
Period of storage(day)	무첨가		0.01		0.01		0.01
	생균수	생존율	생균수	생존율	생균수	생존율	생균수	생존율
	(CFU/ml)	(%)	(CFU/ml)	(%)	(CFU/ml)	(%)	(CFU/ml)	(%)
0	1.62E+09	100	1.50E+09	100	1.59E+09	100	1.67E+09	100
5	1.51E+09	93.2	1.42E+09	94.7	1.44E+09	90.6	1.59E+09	95.2
7	1.50E+09	92.6	1.41E+09	94	1.20E+09	75.5	1.69E+09	101.2
12	6.13E+08	37.8	3.60E+08	24	3.37E+08	21.2	4.37E+08	26.2
14	5.00E+07	3.1	8.67E+07	5.8	6.13E+08	38.6	3.03E+08	18.1

표 27의 결과에 따르면, 구연산을 2%농도로 첨가한 액상제의 생균제 조성물에서 글리세롤과 프락토올리고당을 첨가할 경우, 14일의 기간이 지난 후에도 생존율이 약 20% 내지 40%에 달하는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 생균제 내의 유산균의 생존기간을 연장하여 효과적인 생균제로 사용하기 위해서 액상 안정제를 추가로 첨가할 수 있음을 확인하였으며, 장기간의 보존을 위해서는 글리세롤과 프락토올리고당이 가장 적합한 액상 안정제임을 확인하였다.

본 발명의 축산용 생균제 조성물은 유산균 및 유기산을 함유하는 친환경 제재이면서도 살균제 및 소독제의 복합 효능을 나타낸다. 따라서 항생제를 첨가하지 않고도 효과적으로 균, 바이러스를 살균 및 소독할 있으므로 축산 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

축산용 생균제 조성물에 있어서, 유산균 배양액 및 유기산을 포함하되, 상기 유기산은, 상기 유산균 배양액 1중량부에 대하여 0.002~0.1중량부 함유된 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유기산은 구연산, 말산, 젖산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 유기산임을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 축산용 생균제 조성물은, 10~100배 비율로 희석된 pH가 4 이하인 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 축산용 생균제 조성물은, 살균 효능을 구비한 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물.
(a) 유산균 배양액을 준비하는 단계;

(b) 유기산을 상기 (a) 유산균 배양액에 첨가하여 pH 2.1~3.5의 생균제 조성물을 제조하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 (a) 유산균 배양액은, 효모 추출물 5~50%, 포도당(glucose) 1~10% 및 설탕(sucrose) 1~10%를 포함하는 배지를 이용하여, 34~36℃ 조건에서 15~48시간 정치배양하여 제조된 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물 제조방법.
제5항에 있어서, (d) 상기 생균제 조성물을 10~100배 비율로 희석하되, pH 4 이하의 생균제 조성물을 제조하는 단계; 를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물 제조방법.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 축산용 생균제 조성물은, 살균 효능을 구비한 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 축산용 생균제 조성물은, 살 바이러스 효능을 구비한 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물.
제9항에 있어서, 상기 바이러스는 구제역바이러스 또는 조류독감바이러스인 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물.
제9항 또는 제10항에 있어서 상기 축산용 생균제 조성물은 10배 내지 50배 희석된 것을 특징으로 하는 축산용 바이러스 소독제 조성물.
유산균 배양액 1중량부에 대하여 유기산이 0.002~0.1중량부 함유된 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물에 액상 안정제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물의 보존력 향상 방법.
제12항에 있어서, 상기 액상 안정제는 트레할로스, 글리세롤, 프락토올리고당, 베타인, 프롤린, 덱스트란, 말토스, 수크로스, 만니톨, 폴리올, 실리카겔, 아미노구아니딘, 파이리독사민으로 구성된 군으로부터 선택된 1이상의 안정제임을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물의 보존력 향상 방법.
제13항에 있어서, 상기 액상안정제는 유산균 배양액 1 중량부에 대하여 0.001 중량부 내지 0.1 중량부로 첨가되는 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물의 보존력 향상 방법.
제1항의 축산용 생균제 조성물을 가축에 경구투여하는 것을 특징으로 하는 살균 및 소독 방법.
제1항의 축산용 생균제 조성물을 축사에 분사하는 것을 특징으로 하는 살균 및 소독 방법.
제1항의 축산용 생균제 조성물은 액상 또는 분말 제제형태로 제형화 된 것을 특징으로 하는 축산용 생균제 조성물.