WO2012085322A1 - Método para la producción de adenovirus mosaico - Google Patents

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WO2012085322A1
WO2012085322A1 PCT/ES2011/070897 ES2011070897W WO2012085322A1 WO 2012085322 A1 WO2012085322 A1 WO 2012085322A1 ES 2011070897 W ES2011070897 W ES 2011070897W WO 2012085322 A1 WO2012085322 A1 WO 2012085322A1
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adenovirus
type
cells
fiber
hybrid
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PCT/ES2011/070897
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Miguel CHILLON RODRÍGUEZ
Ester RODRÍGUEZ AGUILAR
Marta MIRALLES CONSUEGRA
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Universitat Autonoma de Barcelona UAB
Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA
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Universitat Autonoma de Barcelona UAB
Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Definitions

  • the present invention relates to a method for the production of mosaic adenovirus and to the kits and uses of said method.
  • Gene therapy is one of the disciplines of biomedicine that has allowed the development of techniques and protocols with therapeutic potential to treat diseases of genetic origin.
  • Gene therapy involves the introduction of nucleic acids (DNA and AR) for therapeutic purposes in a target cell, to increase or decrease the gene expression of a specific gene.
  • DNA and AR nucleic acids
  • the treatment of most genetic diseases by somatic gene therapy requires the expression of a therapeutic gene throughout the patient's life. Therefore, the development of safe vectors that allow the expression of the gene or genes of interest encoded by the introduced nucleic acid (the transgene) for long periods of time, and that avoids the patient's immune response, is essential so that these vectors can be used in in vivo gene therapy protocols.
  • Ad adenoviruses
  • adenoviruses also referred to by the abbreviation Ad
  • Ad can infect a large number of cell types, both quiescent cells as dividing cells
  • current Ad production techniques allow you to modify your capsid and thus your cell tropism
  • they are easy to produce at high titers (up to 1013 particles / milliliter); and they are non-integrative viruses, which avoids insertional mutagenesis.
  • Adenoviruses are double-stranded DNA viruses that protect their genetic material through a protein capsid of icosahedral geometry, without outer sheath, from whose vertices thin extensions called fibers depart. Its viral genome contains approximately 36 Kb, flanked by two ITRs. (inverted terminal repetitions) of between 100 and 140 bp, each of which constitutes one of the ends of the adenoviral genome and has as its main function the onset of virus replication.
  • the packaging signal ( ⁇ ) is located, which is the one that directs the encapsidation of the viral genome within the capsid thanks to the interaction with different viral adeno proteins, and which is characterized by containing repetitions of type A (TTTGN8CG) in a variable number, which depends on the serotype.
  • TTTGN8CG type A
  • E1-E4 early genes
  • L1-L5 late genes
  • adenovirus serotypes More than 100 adenovirus serotypes have been identified, some of which are capable of infecting mammals and other birds.
  • adenoviruses that infect mammals are adenoviruses capable of affecting humans, organisms whose main target is the respiratory tract, in which it is typical to cause colds or even pharyngitis.
  • adenoviruses can also cause different types of conjunctivitis and, less frequently, cystitis and gastroenteritis. Adenoviruses are capable of infecting other organs, although it is common for them to give rise to asymptomatic infections. In order to improve the tropism of some of these serotypes, chimeric adenoviruses have been created that present the capsid of one type of adenovirus and the fiber of another type of adenovirus. Or even chimera fibers formed by fragments of different types of adenovirus. A particular case is that of human adenovirus serotype 40, which is an enteric adenovirus that is part of subgroup F (AdF).
  • AdF subgroup F
  • This adenoviral serotype is an important etio logical agent of gastroenteritis in children (Cunliffe NA and cois. Emerg Infec ⁇ Dis 2010, 16: 55-62; Uhnoo I and cois. J Clin Microbiol 1984, 20: 365-372; Wilhelmi I and cois Clin Microbiol Infec ⁇ 2003, 9: 247-262), and a very vector interesting for gene therapy in intestinal diseases, such as Crohn's disease, since it has an enteric tropism.
  • Ad40 cannot grow in HeLa and other cell lines, but it can spread in HEK-293 cells (Brown M et al. J Virol 1992, 66: 3198-3205; Hashimoto S et al.
  • Ad40 contains two different fibers: one long and one short. Long fiber binds to CAR, while short fiber does not and it has been suggested that it is responsible for the enteric tropism of said adenovirus.
  • Ad40 is capable of infecting HEK-293 cells, its in vitro production is not yet efficient enough, since Ad40 is produced in low titers compared to other adenoviral subgroups (Sherwood V et al. J Gen Virol 2007, 88: 71-6).
  • Ad5 / 40S chimeric vectors have been designed, composed of the Ad5 capsid and the Ad40 short fiber protein (F40S).
  • chimeric vectors have the advantage of combining the hypothetical enteric tropism of F40S together with the exhaustive characterization of the Ad5 genome / proteome, due to its use in human clinical trials (Journal of Genetic Medicine Website, www.wiley.co.uk/genmed / clinical).
  • the Ad5 / 40S chimeric vectors retain the intestinal tropism conferred by the Ad40 short fiber protein and acidic pH resistance (Rodr ⁇ guez E et al. Mol Ther 2006.12: S5), which is essential in the oral administration, since the vectors have to cross the stomach exposing themselves to acidic pH before reaching the intestine.
  • the invention relates to a method for obtaining a mosaic hybrid adenovirus comprising a capsid of a first type of adenovirus and fibers of said first type of adenovirus and of at least a second type of adenovirus comprising
  • step (ii) culturing the cells obtained in step (i) under conditions that allow adenovirus amplification for at least one cycle of adenovirus and / or permissive cell replication, (iii) recovering the viral particles of the mosaic hybrid adenovirus a from the cells obtained in step (ii) and,
  • step (iv) optionally, repeat steps (i) to (iii) where the viral particles obtained in stage (iii) are used for infection in stage (i) of the next amplification cycle,
  • permissive cells are cells adapted to the growth in suspension and where the step (i) is carried out in the presence of a polycation.
  • the invention relates to a kit for amplifying a mosaic hybrid adenovirus comprising said adenovirus a capsid of a first type of adenovirus and fibers of at least two types of adenovirus, one of the fiber adenovirus types being of the same type as the capsid, where said kit comprises:
  • the invention relates to the use of a kit according to the invention for the amplification of a mosaic hybrid adenovirus.
  • Figure 1 A) Cell growth curve and viability of IBS 21 cells adapted to suspension growth. B) Duplication time of the 21 IBS cell line adapted to the growth in suspension. Figure 2. Efficiency of infection of 21 IBS cells by Ad5 / 40S with polybrene. The percentage of infected cells is shown by quantifying the expression of GFP (green fluorescent protein).
  • GFP green fluorescent protein
  • Figure 3 A) Scheme of the production of Ad5 / 40S chimeric adenovirus according to the method of the invention.
  • B Characteristics of the different types of adenovirus related to the production of Ad5 / 40S. N.T .: Not Tested.
  • the authors of the present invention have developed a method that, surprisingly, allows an efficient and scalable amplification of difficult-to-obtain hybrid adenoviruses and, especially, of Ad5 / 40 hybrid adenoviruses, reducing the number of amplification stages to one third, time and cost, as well as reducing the risk of generating replication competent virions.
  • the inventors have used permissive cells adapted to growth in suspension that express the fiber of a different type of adenovirus than the fiber of the hybrid adenovirus that is intended to be amplified and of the same type as the capsid of said adenovirus, and have carried out the infection of said cells in the presence of a polycation.
  • the recovered mosaic hybrid adenovirus viral particles can subsequently undergo a final stage of amplification in cells that do not express the fiber of the anterior adenovirus type to recover the original hybrid adenovirus viral particles, that is, non-mosaic hybrid adenovirus.
  • the invention relates to a method for obtaining a mosaic hybrid adenovirus comprising a capsid of a first type of adenovirus and fibers of said first type of adenovirus and at least a second type of adenovirus.
  • step (ii) culturing the cells obtained in step (i) under conditions that allow adenovirus amplification for at least one cycle of adenovirus and permissive cell replication,
  • step (iii) recovering the viral particles of the mosaic hybrid adenovirus from the cells obtained in step (ii) and,
  • step (iv) optionally, repeat steps (i) to (iii) where the viral particles obtained in stage (iii) are used for infection in stage (i) of the next amplification cycle,
  • permissive cells are cells adapted to the growth in suspension and where the step (i) is carried out in the presence of a polycation.
  • adenovirus is understood in the present invention all those viruses belonging to the family Adenoviridae, which have a linear double stranded DNA genome, lack envelope and are icosahedral in shape. Adenoviruses are capable of infecting both humans and animals.
  • the adenoviruses of the present invention include, without limitation, avian, canine, equine adenoviruses, cattle, sheep, pigs, humans or frog. In a preferred embodiment the adenoviruses of the invention are human adenoviruses.
  • chimeric adenovirus By “chimeric adenovirus”, “chimeric adenovirus” or “hybrid adenovirus” as used interchangeably herein, are understood adenoviruses formed from the combination of elements from different serotypes. In the context of the present invention are adenoviruses whose genome codes for a capsid of a serotype and fibers of at least one serotype other than that of the capsid.
  • Each of the chimeric or hybrid adenovirus fibers can come from a single wild-type serotype or a functionally equivalent variant that has at least 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78% , 80%, 90%, 95%, 97%, 99% similarity or identity with the protein sequence of the wild-type serotype fiber.
  • the degree of identity between two polypeptides is determined using computer-implemented algorithms and methods that are widely known to those skilled in the art.
  • the identity between two amino acid sequences is preferably determined using the BLASTP algorithm (BLAST Manual, Altschul, S. et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al, J., 1990, Mol.
  • Said functionally equivalent variants may be the product of deletions, insertions, inversions, repetitions and amino acid substitutions.
  • the variant may consist of conservative changes, in which one amino acid has been substituted for another with similar structural and chemical properties, for example, the replacement of leucine with isoleucine; or non-conservative changes, for example when a glycine is replaced by a tryptophan.
  • the fibers of the hybrid adenoviruses or chimeric adenoviruses can also be hybrid or chimeric fibers, which have been modified incorporating motifs that facilitate the interaction of the adenovirus with the host cell at its C-terminal end (Michael SI et al. Gene Therapy 1995, 2 : 660-668; Wickham TJ and cois J Virol 1997, 71: 8221-8229), or by eliminating the globular domain and replacing it with other binding sequences (as described in international patent applications WO01 / 81607 and WO01 / 02431).
  • the chimeric adenovirus or adenovirus hybrids contemplated in the invention may also include chimeric fibers formed by segments from different serotypes.
  • adenovirus with chimeric fibers from different serotypes are found, for example, in international patent application WO9850053, where Ad5 recombinant adenoviruses are described in which the head of the original fiber protein has been replaced by that belonging to Ad3.
  • hybrid chimera adenoviruses or adenoviruses are recombinant adenoviral vectors that can be generated by molecular biology techniques known in the state of the art (Horwitz MS, "Adenoviruses", in Fields Virology, third edition, edited by BN Fields et al., Lippincott- Raven Publishers: Philadelphia, Pa (1996)).
  • the adenovirus particle consists of a capsid that encapsulates the viral DNA molecule.
  • capsid refers to the outer covering of the adenovirus, which is formed by subunits called capsomeres, which can be hexagonal and pentagonal. Most of the capsid is constituted by the hexone protein, and at each vertex there is a complex formed by the pentone and fiber base proteins.
  • fiber refers to the fiber protein associated with each pentone base of the adenovirus capsid, and whose function is to facilitate the binding of adenovirus to the surface of the infecting cell (Philipson and cois J Virol 1968, 2: 1064-1075).
  • Adenovirus fibers are trimeric proteins that consist of a C-terminal globular domain or head, which contains the putative cell receptor binding region; a central fibrous axis; and an N-terminal part or tail, which binds to the viral capsid.
  • the central segment adopts a triple beta-spiral conformation.
  • Fiber proteins are incorporated as trimers in the capsid structure, constituting projections thin that start from the vertices of the icosahedron. There are 12 fiber homotymers for each viral particle.
  • mosaic hybrid adenovirus or “mosaic chimera adenovirus” as used herein refers to "chimeric adenovirus” or “hybrid adenovirus” comprising a capsid of a first type of adenovirus and fibers of said first type of adenovirus and of at least a second type of adenovirus and where the fibers of the first type of adenovirus have not been encoded by the genome of said adenovirus, but have been provided in trans by the cells in which it has propagated.
  • first type of adenovirus and “second type of adenovirus” is meant a first and a second serotype of adenovirus, which must be different from each other and can be selected from any of the known adenovirus serotypes.
  • fibers of at least a second type of adenovirus it is meant that said fibers can be fibers formed entirely by a second type of adenovirus or chimeric fibers, formed by fragments of a second type of adenovirus and fragments of one or more different types of this second type.
  • the mosaic hybrid adenovirus of the invention may include fibers of additional adenovirus types.
  • serotype is understood to mean each of the immunologically distinct types of adenovirus.
  • serotypes There are 51 different human adenovirus serotypes from 6 subgroups (subgroups A to F).
  • the invention contemplates the use of any adenoviral serotype known in the state of the art including, without any limitation, any of the serotypes defined in Table 1.
  • Table 1 Some examples of adenoviral subgroups and serotypes suitable for use in the present invention.
  • the first and second type of capsid adenovirus and mosaic hybrid adenovirus fibers come from different subgroups.
  • the first type of adenovirus belongs to subgroup C and / or the second type of adenovirus belongs to subgroup F.
  • subgroup C adenovirus refers to a group of adenovirus that causes respiratory tract infections and that includes serotypes 1, 2, 5, and 6. Each of these serotypes has A single type of fiber protein.
  • the invention can be carried out with a hybrid adenovirus containing elements of any serotype of subgroup C known in the state of the art.
  • subgroup F adenovirus refers to a group of viruses known as enteric adenoviruses, which includes serotypes 40 and 41, characterized in that, unlike other adenoviruses, the entry In the cell to be infected, it does not depend on the interaction between the RGD motifs of the pentone base of the adenovirus and the integrin receptor of the cell surface. Instead, adenoviruses of subgroup F can use an alternative mechanism to facilitate endocytosis. In contrast to other human adenovirus species, enteric adenoviruses are also characterized because they have two different fiber proteins, which are found in each virion in approximately the same number.
  • enteric adenoviruses have a long fiber, which binds to the CAR receptor and, additionally, a short fiber that does not bind to CAR, and which has an unknown function.
  • Other characteristics of enteric adenoviruses are the relatively high isoelectric point of their structural proteins, the increase in their viability after exposure to an acidic environment (as in some parts of the gastrointestinal tract), and their ability to bind to certain lipids of the gastric mucosa, especially after exposure to low pH.
  • the invention can be carried out using any subgroup F adenovirus known in the state of the art, and more particularly the short-fiber protein of the Ad40 (SEQ ID NO: 1) or Ad41 (SEQ ID NO: 2) serotypes. .
  • the hybrid adenovirus possesses the Ad40 short fiber protein.
  • the adenovirus belonging to subgroup C is adenovirus type 5 and / or the adenovirus belonging to subgroup F is adenovirus type 40.
  • the hybrid adenovirus is an adenovirus known as Ad5 / 40, preferably Ad5 / 40S.
  • Ad5 / 40S adenovirus is a hybrid adenovirus that is obtained by replacing the complete Ad5 fiber protein with the complete short Ad40 fiber. The method of the invention allows to obtain mosaic hybrid adenovirus by infecting permissive cells with hybrid adenoviruses and their subsequent culture.
  • the first stage of the method is to infect permissive cells that express the fiber of one type of adenovirus with an adenovirus comprising the capsid of a type of adenovirus and fibers of a type of adenovirus other than the type of adenovirus whose fiber is expressed in the cells. permissive
  • infection or "infect”, in the context of the present invention, the method by which adenoviruses penetrate cells is understood. Such infection can be more or less rapid and depends on the type of cell growth or on the expression of the receptors used by adenoviruses to internalize.
  • the entry of adenovirus into the cell involves three types of interactions.
  • the first interaction occurs when the bulge or head of the adenovirus fiber protein binds specifically to a cell surface receptor.
  • the two currently known receptors are the CD46 receptor for group B human adenovirus serotypes and the adenovirus coxsackie receptor (CAR) for the other serotypes.
  • CAR adenovirus coxsackie receptor
  • the secondary interaction then occurs, in which the viral pentone base protein interacts with an alphaV integrin molecule in the cell.
  • a third receptor binding site is located in the third beta-spiral repeat of the fiber body that binds to heparan sulfate glycosaminoglycan.
  • the fiber mainly, that defines the cell types that each adenovirus is capable of infecting, which will be those that possess the appropriate receptors for the adenovirus fiber to interact with them.
  • the infection is carried out by contacting the hybrid adenovirus and the permissive cell for a time determined by any method known in the state of the art.
  • permissive cells are understood cells that express on their surface the receptors and co-receptors necessary to allow the recognition and infection of a given virus, but also have all the metabolic machinery that the virus needs to replicate and lack factors that inhibit the replication of said adeno virus. That is, a permissive cell for the adenoviruses of the invention is any cell capable of being infected by said adenoviruses and allowing said adenoviruses to replicate.
  • permissive cells must, in addition, express the fiber of a type of adenovirus other than the type of adenovirus of the hybrid adenovirus fiber with which said cells are to be infected, and must also be able to grow in suspension.
  • Commercial or known cell lines expressing the fiber of an adenovirus can be used, or said lines can be generated in the laboratory by methods known in the state of the art, as detailed, for example in Von Seggern (Von Seggern DJ and cois. J Gen Virol 1998, 79: 1461-1468).
  • permissive cells of the invention will be chosen based on the serotype of the hybrid adenovirus with which it is intended to infect and are selected, without limitation, from permissive cells that express the fiber of an adenovirus of any known serotype from 1 to 51.
  • said permissive cells are cells that express the Ad5 adenovirus fiber.
  • Examples of known cell lines expressing the Ad5 fiber protein are line 21 IB, 211A and 21 IR (Von Seggern DJ et al. J Gen Virol 1998, 79: 1461-1468; U.S. Patent 7,232,899 B2), lines 601 and 633 (Von Seggern DJ and cois. J Virol 2000, 74: 354-362).
  • the inventors have adapted the 21 IB cell line to growth in supension, obtaining a new cell line which they have called 21 IBS.
  • the characterization of this cell line has shown that its viability is maintained throughout the days, even at high cell concentrations, its growth is efficient and its doubling time is 2.1 days.
  • the adenovirus with which permissive cells are infected comprises the capsid of a type of adenovirus and fibers of a type of adenovirus other than the type of adenovirus whose fiber is expressed in permissive cells.
  • the adenoviruses that can be used to infect are adenoviruses Ad5 modified in which the fiber protein has been totally or partially replaced by the fiber of another serotype, selected from Ad5.Fibl, Ad5.Fib2, Ad5.Fib3, Ad5.Fib4, Ad5.Fib6, Ad5.Fib7, Ad5.Fib8, Ad5.Fib9, Ad5.FiblO, Ad5.Fibl l, Ad5.Fibl2, Ad5.Fibl3, Ad5.Fibl4, Ad5.Fibl5, Ad5.Fibl6, Ad5.Fibl7, Ad5.Fibl8, Ad5.Fibl9, Ad5.Fib20, Ad5 .Fib21, Ad5.Fib22, Ad5.Fib23, Ad5.Fib24, Ad5.Fib25, Ad5.Fib26, Ad5.Fib27, Ad5.Fib28, Ad5.Fib29, Ad5.Fib30, Ad5.Fib31, Ad5.Fib32, Ad5.Fib33 , Ad5.Fib34,
  • hybrid adenoviruses are Ad5 adenoviruses in which the fiber has been replaced by the short or long fiber of Ad40 or Ad41, selected from Ad5.Fib40-S, Ad5.Fib40-L, Ad5.Fib41-S and Ad5 .Fib41-L, where S and L refer to short and long fiber, respectively.
  • the adenoviruses with which the permissive cells are infected are Ad5 / 40S adenoviruses having the Ad5 capsid and the Ad40 short fiber.
  • the cells obtained in step (i) are cultured under conditions that allow adenovirus amplification for at least one cycle of adenovirus and permissive cell replication.
  • culture the cells obtained in step (i) is meant the propagation of cells infected with the adenovirus hybrid in an appropriate growth medium and under conditions of temperature and mixture of suitable gases.
  • Culture conditions vary widely depending on the cell type, but in the context of this invention cell culture is always carried out in suspension.
  • the composition of the growth medium varies in terms of glucose concentration, growth factors and other nutritional components, and the pH also varies.
  • the growth medium will be selected based on the cell line and will contain balanced salt solutions, amino acids, vitamins, other low molecular weight organic supplements, and, optionally, hormones and growth factors (serum) and contaminant growth inhibitors ( as antibiotics and antifungals).
  • Culture media suitable for suspension culture are serum-free media such as SFMII not supplemented or supplemented with small amounts of serum, more specifically SFMII medium supplemented with 0.5% fetal bovine serum.
  • adenovirus amplification is meant the increase in the number of copies of the adeno virus. This amplification is performed at least during an adenovirus replication cycle.
  • adenovirus replication cycle or “adenoviral replication cycle” is understood, in the context of this invention, the set of processes by which adenovirus recognizes a cell, enters it, releases its genome, replicates and assembles Progeny viral particles that remain in the cells until they are used for collection.
  • the adenovirus replication cycle consists of different stages: cell binding, which as explained above is carried out through the interaction of the fiber protein with cell receptors; internalization, which implies the interaction of pentone with integrins V3 and V5; the penetration, which is produced by endocytosis in clathrin-coated vesicles, so that the vesicle subsequently ruptures causing the release of the viral particle within the cytoplasm, with loss of capsid proteins and denial of viral DNA; migration, when the nucleus of the remaining viral particle migrates from the cytoplasm to the nucleus via microtubules and the viral DNA enters the nucleus through the nuclear pores; DNA replication, which takes place in the nucleus, after the viral DNA is converted into a cellular histone-viral DNA complex; and finally, virion assembly, which begins in the cytoplasm, where individual polypeptides are assembled into capsomeres (hexons and pentones), and subsequently these immature and empty capsids are assembled in
  • viral particle refers to adenoviral particles Infectious diseases formed when an adenoviral vector containing all or a part of a viral genome infects a cell line appropriate for the generation of said particles.
  • permissive cell replication cycle is meant the set of processes by which a stem cell divides to form two daughter cells that maintain the ability of the stem cell to allow adenovirus replication.
  • step iii consists in recovering the viral particles of the mosaic hybrid adenovirus from the cells obtained in step (ii).
  • the viral particles obtained will be mosaic hybrid adenovirus, as defined above.
  • mosaic hybrid adenoviruses possess fibers of two different origins: those that come from the genome of the hybrid adenovirus with which the cell line has been infected in step (i), and those that come from the permissive cell line.
  • recovering the viral particles is meant the procedure by which the cells are physically or chemically lysed before the natural lysis occurs by the new adenoviral particles generated in the replication cycle, in order to collect said particles when they are concentrated in the nucleus, which facilitates further purification.
  • the lysis of said cells and collection of the viral particles is carried out by methods known to those skilled in the art, for example by freezing and thawing cycles,
  • stage iv that consists in repeating the previous stages in a cyclic manner with the viral particles obtained in stage (iii) that are used for infection in stage (i) of the next cycle amplification
  • amplification cycle in the context of the present invention, the time elapsed between infection with the hybrid adenovirus and the collection of viral particles of mosaic hybrid adenovirus is understood.
  • the time of a cycle of Complete viral replication will depend on the particular hybrid adenovirus and cell line used and in each case should be determined by one skilled in the art.
  • each amplification cycle when the adenovirus belonging to subgroup C is adenovirus type 5 and / or the adenovirus which belongs to subgroup F is adenovirus type 40, each amplification cycle lasts between 44 and 64 hours, preferably between 48 and 56 hours, more preferably 56 hours.
  • the method of the invention is characterized in that it is carried out in permissive cells adapted to the growth in suspension and where step (i) is carried out in the presence of a polycation.
  • permisive cells adapted to growth in suspension it is understood that the cells are capable of living naturally without adhering to a surface. Said cells may belong to known cell lines that usually grow in suspension or to adherent cell lines that have undergone modifications that allow them to grow in suspension.
  • the use of suspension cultures has the advantage that it allows the amplification of adenovirus in scalable systems, such as bioreactors, either by increasing cell density or by expanding the volume of culture.
  • Permissive cells coincide with a polycation during infection to favor the entry of adenovirus into the cell by allowing interaction between adenovirus capsids, negatively charged, and cell membranes, also negatively charged.
  • polycation or “cationic polymer” means an organic oligomer or polymer of natural or synthetic origin, carrying a large number of positive charges at neutral pH that is capable of directing the entrance of the adenoviral particle into the interior of the producing cells.
  • Suitable polycations for the method of the invention are, but are not limited to, polyethyleneimine, protamine, polyarginine, polyiornithine, polylysine, polybrene (hexadimethrin bromide), protamine sulfate, poly-L-lysine hydrobromide, dimethyldiallylammonium polychloride (Merquat ®-100, Merquat®-280, Merquat®-550), poly-L-arginine hydrochloride, poly-L-histidine, poly (4-vinylpyridine), poly (4-vinylpyridine) hydrochloride, poly (4-vinylpyridine -co-styrene), polyvinylpyrrolidone, succinylated poly-L-lysine, DEAE-dextran, spermine, spermidine, etc.
  • the polycation is polybrene.
  • the viral particles of the non-mosaic hybrid adenovirus that is, of the adenovirus with which the initial infection of the cells in stage (i) has been carried out
  • the viral particles of the mosaic hybrid adenovirus that have been recovered in the stage ( iii) or in step (iv) they undergo a final stage of amplification in cells that do not express the fiber of the first type of adenovirus, viral particles recovering from the non-mosaic hybrid adenovirus.
  • non-mosaic hybrid adenovirus in the context of the present invention, the original adenovirus with which the initial infection of the cells in step (i) has been understood, and which has been previously defined as “hybrid adenovirus ", which comprises the capsid of a type of adenovirus and fibers of a type of adenovirus other than the type of adenovirus whose fiber is expressed in permissive cells.
  • final amplification stage refers to the amplification of the mosaic hybrid adenovirus obtained in stage (iii) or in stage (iv) that takes place in cells other than those used in stage (i) that do not express the fiber of the first type of adenovirus, and therefore allows to obtain viral particles of the original hybrid adenovirus.
  • Cells that do not express the fiber of the first type of adenovirus means any type of cell that does not express any fiber protein and that possesses the necessary machinery so that the mosaic hybrid adenoviruses can be amplified.
  • said cells grow in suspension.
  • growth-adapted cells in suspension are HEK293S cells (Brueggemann LI et al. J Gen Physiol, 2002, 119: 593-612), HEK-293.2sus cells (ATCC number: CRL-1573.3), 293F cells (Invitrogen N Catalog: R790-07), Per.C6 TM, preferably HEK293S cells, more preferably 293F cells.
  • the viral particles of the mosaic hybrid adenovirus recovered in step (iii) or (iv) are subjected to a final stage of amplification in cells adapted for growth in suspension that do not express the fiber of the first type of adenovirus, recovering viral particles from non-mosaic hybrid adenovirus.
  • the cells adapted for growth in suspension that do not express the fiber of the first type of adenovirus are HEK293S cells.
  • the cells adapted for growth in suspension that do not express the fiber of the first type of adenovirus are 293F cells.
  • the final stage of amplification in cells that do not express the fiber of the first type of adenovirus can be carried out both in the presence and in the absence of a polycation, but the presence of said agent facilitates the entry of adenovirus into the cells. Therefore, in a particular embodiment the final stage of amplification in growth-adapted cells that do not express the fiber of the first type of adenovirus is carried out in the presence of a polycation, more preferably in the presence of polybrene.
  • This method makes it possible to optimize the amplification and production process of hybrid adenoviruses, so that the amplification efficiency is improved, reducing the number of amplification cycles required by one third compared to classic protocols, and also reducing time and material. fungible used, as well as the risk of formation of competent particles in replication by recombination with the El sequences of permissive cells.
  • the invention also provides kits for amplification of mosaic hybrid adenovirus according to the method of the invention.
  • kit refers to a combination of a set of components suitable for amplifying a mosaic hybrid adenovirus according to the method of the invention, together with its appropriate containers and containers for commercial sale.
  • suitable component for amplifying a mosaic hybrid adenovirus according to the method of the invention is understood to be any compound that can be used in any of steps (i) to (iv) of the method of the invention and / or in the final amplification stage, and includes, without limitation, media, additives, cell lines, polycations, mosaic hybrid adenovirus, etc.
  • the invention relates to a kit for the amplification of a mosaic hybrid adenovirus comprising said adenovirus a capsid of a first type of adenovirus and fibers of at least two types of adenovirus, one of the adenovirus types of the fibers of the same type as the capsid, where said kit comprises:
  • amplification has been previously defined in the context of The methods of the invention.
  • Said kit includes at least one permissive cell line suitable for suspension culture expressing the fiber of the first type of adenovirus and a polycation which facilitates the infection of the cells by the adenovirus.
  • said kit further comprises a hybrid adenovirus or at least one polynucleotide that allows generating said adenovirus.
  • hybrid adenovirus has already been defined previously and refers to the hybrid adenovirus that is intended to be amplified.
  • polynucleotide indicates a polymeric nucleotide of any length that contains all the necessary genetic material that encodes to generate complete viral adeno particles.
  • kits additionally comprises at least one cell line adapted to the growth in suspension that does not express the fiber of the first type of adenovirus. Said expression has the same meaning as defined in the context of the methods of the invention.
  • kits of the invention can be used with any of the hybrid adenoviruses described in the context of the first aspect of the invention.
  • the polycation used in the kit is polybrene.
  • kits for the amplification of a mosaic hybrid adenovirus.
  • the 21 IB cell line was selected as the producing cell line, since these cells constitutively express the F5 fiber protein of Ad5 (Von Seggern et al. J Virol 2000, 74: 354-62; Von Seggern et al. J Gen Viral 1998, 79: 1461-8).
  • Adherent 21 IB cells constitutively express the viral adeno protein of fiber 5 in the cytoplasm when grown in DMEM medium (Dulbecco Modified Eagle Medium) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS).
  • DMEM medium Dulbecco Modified Eagle Medium
  • the DMEM 10% FBS medium was then replaced by the SFMII. Subsequently, the cells were transferred to 6-well plates for suspension. Some wells were supplemented with a low dose of FBS (1% FBS or 0.5%> FBS). The addition of 0.5% FBS allowed for better growth and viability compared to wells without FBS; while the addition of 1% of FBS led to the formation of large cell aggregates.
  • the new cells adapted to the culture in suspension were called 21 IBS.
  • the 21 IBS cells were transferred to vials under agitation and kept in suspension at a speed of 110 rpm and a density of 7 x 10 5 cells / ml.
  • the adapted cells grew isolated or in small aggregates of 4-5 cells, and at a density of 2.5 x 10 6 cells / ml the 21 IBS cells maintained a high viability.
  • 21 IBS cells were cultured in triplicate at different density. The viability and density was evaluated daily for a week. As seen in Figure 1, the viability of these cells was above 80% and remained constant even at high cell density. In addition, cell growth was constant and its numerical growth constant ⁇ was 0.3246 ( Figure IB).
  • Polybrene improves infection with the chimeric Ad5 / 40S adenovirus in 21 IBS cells
  • the chimeric Ad5 / 40S produced in 293 S cells contain F40S protein in their capsids, while the Ad5 / 40S produced in 21 IBS cells are expected to contain both F5 and F40S proteins, since the 21 IBS cells constitutively express F5 protein (Fig. 3A). Consequently, during the amplification stages, production in 21 IBS cells will generate mosaicism with capsids containing both F5 and F40S proteins ( Figure 3B).
  • the fiber mosaicism improves the infectivity of the Ad5 / 40S virions during the amplification cycles allowing a more efficient entry mediated by the interaction CAR: F5 in 21 IBS producing cells.
  • the last stage of amplification must be performed in HEK-293 cells adapted to suspension growth.
  • the viral cell cycle of Ad5 / 40S mosaic / chimera was studied in 293F cells.
  • viral production was quantified every 4 hours between 44 and 64 hours of production.
  • the Ad5 / 40S chimeric vectors have a viral cycle of 48-56 hours, with the highest peak at 56 hours. However, when higher MOIs are used the peak moves towards 48 hours. Taking these results into account, for the following experiments the optimal collection time was set at 56 hours post-infection.

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Abstract

La presente invención, se relaciona con un método para la producción de adenovirus híbridos mosaico, que presenta la cápside de un primer tipo de adenovirus y fibras de dicho primer tipo y de un segundo, en especial la producción del adenovirus Ad5/40, que comprende: i) infectar células permisivas adaptadas al crecimiento en suspensión que expresan la fibra del primer tipo, con un adenovirus que presenta la cápside del primer tipo y la fibra del segundo, en presencia de un policatión (preferentemente polibreno); ii) cultivar dichas células; iii) recuperar las partículas virales híbridas mosaico. Por último, se pueden amplificar las partículas en células adaptadas al crecimiento en suspensión que no expresan la fibra del primer tipo de adenovirus, recuperándose las partículas del adenovirus híbrido. También se incluyen los kits y usos de dicho método.

Description

MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE ADENOVIRUS MOSAICO
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método para la producción de adenovirus mosaico y con los kits y usos de dicho método.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La terapia génica es una de las disciplinas de la biomedicina que ha permitido desarrollar técnicas y protocolos con potencial terapéutico para tratar enfermedades de origen genético. La terapia génica consiste en la introducción de ácidos nucleicos (ADN y AR ) con finalidad terapéutica en una célula diana, para aumentar o disminuir la expresión génica de un gen específico. En general, el tratamiento de la mayoría de enfermedades genéticas por terapia génica somática requiere la expresión de un gen terapéutico durante toda la vida del paciente. Por ello, el desarrollo de vectores seguros que permitan la expresión del gen o genes de interés codificados por el ácido nucleico introducido (el transgén) durante largos periodos de tiempo, y que evite la respuesta inmune del paciente, es imprescindible para que estos vectores puedan utilizarse en protocolos de terapia génica in vivo.
Actualmente, los adenovirus (a los que se alude también mediante la abreviatura Ad) se han convertido en uno de los vectores más utilizados en ensayos clínicos en humanos, debido a los siguientes factores: el Ad puede infectar un elevado número de tipos celulares, tanto células quiescentes como células en división; las técnicas actuales de producción de Ad permiten modificar su cápside y de esta manera su tropismo celular; además, son fáciles de producir a títulos altos (hasta 1013 partículas/mililitro); y son virus no integrativos, con lo que se evita la mutagénesis insercional.
Los adenovirus son virus de doble cadena de ADN que protegen su material genético mediante una cápside proteica de geometría icosaédrica, sin envuelta exterior, de cuyos vértices parten unas delgadas prolongaciones llamadas fibras. Su genoma viral contiene aproximadamente 36 Kb, flanqueado por dos ITR (repeticiones terminales invertidas) de entre 100 y 140 pb, cada una de las cuales constituye uno de los extremos del genoma adenoviral y tiene como función principal el inicio de la replicación del virus. Muy próxima a una de estas ITR se localiza la señal de empaquetamiento (ψ), que es la que dirige la encapsidación del genoma viral dentro de la cápside gracias a la interacción con diferentes proteínas adeno virales, y que se caracteriza por contener repeticiones de tipo A (TTTGN8CG) en un número variable, que depende del serotipo. Al extremo del genoma del adenovirus cerca del cual se localiza la señal de empaquetamiento se le suele considerar como el extremo 5', pues es también el extremo que tiene más próxima la región El, que contiene los genes que se expresan en primer lugar. El genoma está dividido en genes tempranos (E1-E4), que se transcriben en las primeras fases del ciclo, justo antes de la replicación del ADN viral, y en genes tardíos (L1-L5), transcritos en una fase posterior (producción proteica y encapsidación). Se han identificado más de 100 serotipos de adenovirus, de los cuales unos son capaces de infectar mamíferos y otros aves. Entre los adenovirus que infectan mamíferos se encuentran adenovirus capaces de afectar a los seres humanos, organismos cuya principal diana es el tracto respiratorio, en el que es típico que provoquen resfriados o incluso faringitis.
Algunos adenovirus pueden causar también distintos tipos de conjuntivitis y, con menor frecuencia, cistitis y gastroenteritis. Los adenovirus son capaces de infectar otros órganos, aunque es habitual que den lugar en ellos a infecciones asintomáticas. Con la finalidad de mejorar el tropismo de algunos de estos serotipos, se han creado adenovirus quiméricos que presentan la cápside de un tipo de adenovirus y la fibra de otro tipo de adenovirus. O incluso fibras quimera formadas por fragmentos de diferentes tipos de adenovirus. Un caso particular es el del adenovirus humano de serotipo 40, que es un adenovirus entérico que forma parte del subgrupo F (AdF). Este serotipo adenoviral es un importante agente etio lógico de gastroenteritis en niños (Cunliffe NA y cois. Emerg Infecí Dis 2010, 16:55-62; Uhnoo I y cois. J Clin Microbiol 1984, 20:365-372; Wilhelmi I y cois. Clin Microbiol Infecí 2003, 9:247-262), y un vector muy interesante para terapia génica en enfermedades intestinales, tales como la enfermedad de Crohn, puesto que presenta un tropismo entérico. Ad40 no puede crecer en HeLa y en otras líneas celulares, pero sí puede propagarse en células HEK-293 (Brown M y cois. J Virol 1992, 66:3198-3205; Hashimoto S y cois. J Virol 1991; 65:429-2435). Habitualmente, la primera interacción del adenovirus con la célula huésped se produce entre la proteína de la fibra del adenovirus y el receptor de coxsackievirus y adenovirus (CAR) de la superficie celular a infectar. Se ha descrito que Ad40 contiene dos fibras diferentes: una larga y otra corta. La fibra larga se une a CAR, mientras que la fibra corta no lo hace y se ha sugerido que es la responsable del tropismo entérico de dicho adenovirus.
Aunque el Ad40 es capaz de infectar células HEK-293, su producción in vitro aún no es lo suficientemente eficiente, ya que Ad40 se produce en bajos títulos en comparación con otros subgrupos adenovirales (Sherwood V y cois. J Gen Virol 2007, 88:71-6). Para superar la dificultad en la producción de Ad40 y el amplio tropismo de la vía de entrada dependiente de CAR, se han diseñado vectores quiméricos Ad5/40S, compuestos por la cápside del Ad5 y la proteína de la fibra corta del Ad40 (F40S). Estos vectores quiméricos tienen la ventaja de aunar el hipotético tropismo entérico de F40S junto con la caracterización exhaustiva del genoma/proteoma de Ad5, debido a su uso en ensayos clínicos humanos (Journal of Genetic Medicine Website, www.wiley.co.uk/genmed/clinical). Como se ha demostrado recientemente, los vectores quiméricos Ad5/40S conservan el tropismo intestinal conferido por la proteína de la fibra corta del Ad40 y la resistencia a pH ácidos (Rodríguez E y cois. Mol Ther 2006,12:S5), que es esencial en la administración oral, ya que los vectores han de atravesar el estómago exponiéndose a pH ácidos antes de llegar al intestino.
Diferentes grupos de investigación han desarrollado protocolos para amplificar vectores quiméricos incluyendo Ad5/41 y Ad5/40 (Tiemessen CT y cois, J. Virol 1994 68: 1239-1244). Sin embargo, aunque la producción in vitro del adenovirus quimérico Ad5/40S es más eficiente que la del Ad40 salvaje, la productividad por célula aún no es lo suficientemente alta y los protocolos son largos y consumen tiempo. Por lo tanto, sería deseable disponer de un protocolo de amplificación de adenovirus híbridos o quiméricos, y en particular de vectores quiméricos Ad5/40S, que permita su producción a gran escala. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la invención se relaciona con un método para la obtención de un adenovirus híbrido mosaico que comprende una cápside de un primer tipo de adenovirus y fibras de dicho primer tipo de adenovirus y de al menos un segundo tipo de adenovirus que comprende
(i) infectar células permisivas que expresan la fibra de un primer tipo de adenovirus con un adenovirus que comprende la cápside de dicho primer tipo de adenovirus y fibras de un segundo tipo de adenovirus distinto al primer tipo de adenovirus,
(ii) cultivar las células obtenidas en la etapa (i) en condiciones que permitan la amplificación del adenovirus durante al menos un ciclo de replicación del adenovirus y/o de la célula permisiva, (iii) recuperar las partículas virales del adenovirus híbrido mosaico a partir de las células obtenidas en la etapa (ii) y,
(iv) opcionalmente, repetir las etapas (i) a (iii) en donde las partículas virales obtenidas en la etapa (iii) se utilizan para la infección en la etapa (i) del siguiente ciclo de amplificación,
en donde las células permisivas son células adaptadas al crecimiento en suspensión y en donde la etapa (i) se lleva a cabo en presencia de un policatión.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit para la amplificación de un adenovirus híbrido mosaico comprendiendo dicho adenovirus una cápside de un primer tipo de adenovirus y fibras de al menos dos tipos de adenovirus, siendo uno de los tipos de adenovirus de las fibras del mismo tipo que la cápside, donde dicho kit comprende:
a) al menos una línea celular permisiva que expresa la fibra del primer tipo de adenovirus apta para el cultivo en suspensión y
b) un policatión Aún en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un kit según la invención para la amplificación de un adenovirus híbrido mosaico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. A) Curva de crecimiento celular y viabilidad de las células 21 IBS adaptadas al crecimiento en suspensión. B) Tiempo de duplicación de la línea celular 21 IBS adaptada al crecimiento en suspensión. Figura 2. Eficiencia de infección de las células 21 IBS por Ad5/40S con polibreno. Se muestra el porcentaje de las células infectadas mediante la cuantificación de la expresión de GFP (proteína verde fluorescente).
Figura 3. A) Esquema de la producción de adenovirus quiméricos Ad5/40S según el método de la invención. B) Características de los diferentes tipos de adenovirus relacionados con la producción de Ad5/40S. N.T.: No Testado.
Figura 4. Ciclo de los adenovirus mosaico Ad5/40S en células 21 IBS. IU: Unidades Infectivas del virus.
Figura 5. Diagrama (A) y tabla (B) comparativos entre el protocolo nuevo y el clásico. IU: Unidades Infectivas del virus; PP: partículas físicas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han desarrollado un método que, de forma sorprendente, permite una amplificación eficiente y escalable de adenovirus híbridos de difícil obtención y, especialmente, de adenovirus híbridos Ad5/40, reduciendo a un tercio el número de etapas de amplificación, el tiempo y el coste, así como reduciendo también el riesgo de generación de virio nes competentes en replicación.
Para ello, los inventores han utilizado células permisivas adaptadas al crecimiento en suspensión que expresan la fibra de un tipo de adenovirus distinto al de la fibra del adenovirus híbrido que se pretende amplificar y del mismo tipo que la cápside de dicho adenovirus, y han realizado la infección de dichas células en presencia de un policatión. Las partículas virales del adenovirus híbrido mosaico recuperadas pueden someterse posteriormente a una etapa final de amplificación en células que no expresan la fibra del tipo de adenovirus anterior para recuperar las partículas virales del adenovirus híbrido original, es decir, de adenovirus híbrido no mosaico.
MÉTODO DE LA INVENCIÓN
Por tanto, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un método para la obtención de un adenovirus híbrido mosaico que comprende una cápside de un primer tipo de adenovirus y fibras de dicho primer tipo de adenovirus y de al menos un segundo tipo de adenovirus que comprende
(i) infectar células permisivas que expresan la fibra de un primer tipo de adenovirus con un adenovirus que comprende la cápside de dicho primer tipo de adenovirus y fibras de un segundo tipo de adenovirus distinto al primer tipo de adenovirus,
(ii) cultivar las células obtenidas en la etapa (i) en condiciones que permitan la amplificación del adenovirus durante al menos un ciclo de replicación del adenovirus y de la célula permisiva,
(iii) recuperar las partículas virales del adenovirus híbrido mosaico a partir de las células obtenidas en la etapa (ii) y,
(iv) opcionalmente, repetir las etapas (i) a (iii) en donde las partículas virales obtenidas en la etapa (iii) se utilizan para la infección en la etapa (i) del siguiente ciclo de amplificación,
en donde las células permisivas son células adaptadas al crecimiento en suspensión y en donde la etapa (i) se lleva a cabo en presencia de un policatión.
Por "adenovirus" se entiende en la presente invención todos aquellos virus pertenecientes a la familia Adenoviridae, que poseen un genoma de ADN bicatenario lineal, carecen de envoltura y tienen forma icosaédrica. Los adenovirus son capaces de infectar tanto a humanos como a animales. Los adenovirus de la presente invención incluyen, sin limitación, adenovirus aviar, caninos, equinos, bovinos, ovinos, porcinos, humanos o de la rana. En una realización preferida los adenovirus de la invención son adenovirus humanos.
Por "adenovirus quiméricos", "adenovirus quimera" o "adenovirus híbridos" según se utiliza indistintamente en este documento, se entienden adenovirus formados a partir de la combinación de elementos procedentes de distintos serotipos. En el contexto de la presente invención son adenovirus cuyo genoma codifica para una cápside de un serotipo y fibras de al menos un serotipo distinto al de la cápside. Cada una de las fibras del adenovirus quimera o híbrido puede proceder de un único serotipo wild-type o de una variante funcionalmente equivalente que presenta al menos el 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% de similitud o identidad con la secuencia proteica de la fibra del serotipo wild-type. El grado de identidad entre dos polipéptidos se determina usando algoritmos implementados en ordenador y métodos que son ampliamente conocidos por los expertos en la materia. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferiblemente usando el algoritmo BLASTP (BLAST Manual, Altschul, S. et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al, J., 1990, Mol. Biol. 215:403-410). Dichas variantes funcionalmente equivalentes pueden ser el producto de deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones de aminoácidos. La variante puede consistir en cambios conservativos, en los que se ha sustituido un aminoácido por otro con propiedades estructurales y químicas similares, por ejemplo, el reemplazamiento de leucina por isoleucina; o cambios no conservativos, por ejemplo cuando se reemplaza una glicina por un triptófano.
Otras variantes contempladas en la presente invención son aquellas en las que se ha producido la inserción de una secuencia heteróloga en la cabeza de la fibra (Krasnykh V y cois. J. Virol 1998, 72: 1844-1852).
Las fibras de los adenovirus híbridos o adenovirus quimera también pueden ser fibras híbridas o quiméricas, que han sido modificadas incorporando a su extremo C-terminal motivos que facilitan la interacción del adenovirus con la célula huésped (Michael SI y cois. Gene Therapy 1995, 2:660-668; Wickham TJ y cois. J Virol 1997, 71 :8221-8229), o eliminando el dominio globular y sustituyéndolo por otras secuencias de unión (según se describe en las solicitudes de patente internacional WO01/81607 y WO01/02431). Los adenovirus quimera o adenovirus híbridos contemplados en la invención también pueden incluir fibras quiméricas formadas por segmentos procedentes de diferentes serotipos. Ejemplos de adenovirus con fibras quiméricas procedentes de diferentes serotipos se encuentran, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO9850053, donde se describen adenovirus recombinantes Ad5 en los que la cabeza de la proteína fibra original ha sido sustituida por la perteneciente a Ad3.
Estos adenovirus quimera o adenovirus híbridos son vectores adenovirales recombinantes que pueden generarse por técnicas de biología molecular conocidas en el estado de la técnica (Horwitz MS, "Adenoviruses", en Fields Virology, tercera edición, editado por B.N. Fields y cois., Lippincott-Raven Publishers: Philadelphia, Pa (1996)).
La partícula del adenovirus consiste en una cápside que encapsula la molécula de ADN vírico. El término "cápside" se refiere a la cubierta externa del adenovirus, que está formada por subunidades llamadas capsómeros, que pueden ser hexagonales y pentagonales. La mayor parte de la cápside está constituida por la proteína hexona, y en cada vértice hay un complejo formado por las proteínas base pentona y fibra. El término "fibra", según se utiliza en el presente documento, se refiere a la proteína fibra asociada a cada base pentona de la cápside del adenovirus, y cuya función es facilitar la unión del adenovirus a la superficie de la célula que infecta (Philipson y cois. J Virol 1968, 2: 1064-1075). Las fibras de adenovirus son proteínas triméricas que consisten en un dominio globular C-terminal o cabeza, que contiene la putativa región de unión al receptor celular; un eje fibroso central; y una parte N-terminal o cola, que se une a la cápside viral. En presencia del dominio C- terminal globular, que es necesario para la correcta trimerización, el segmento central adopta una conformación beta-espiral triple. Las proteínas de la fibra se incorporan como trímeros en la estructura de la cápside, constituyendo proyecciones delgadas que parten de los vértices del icosaedro. Hay 12 homotrímeros de fibra por cada partícula viral.
El término "adenovirus híbrido mosaico" o "adenovirus quimera mosaico" según se utiliza en el presente documento se refiere a "adenovirus quimeras" o "adenovirus híbridos" que comprenden una cápside de un primer tipo de adenovirus y fibras de dicho primer tipo de adenovirus y de al menos un segundo tipo de adenovirus y donde las fibras del primer tipo de adenovirus no han sido codificadas por el genoma de dicho adenovirus, sino que han sido proporcionadas en trans por las células en las que se ha propagado. Por "primer tipo de adenovirus" y "segundo tipo de adenovirus" se entiende un primer y un segundo serotipo de adenovirus, que deben ser distintos entre sí y pueden seleccionarse de cualquiera de los serotipos de adenovirus conocidos. Por "fibras de al menos un segundo tipo de adenovirus" se entiende que dichas fibras pueden ser fibras formadas íntegramente por un segundo tipo de adenovirus o bien fibras quimeras, formadas por fragmentos de un segundo tipo de adenovirus y fragmentos de uno o más tipos diferentes de este segundo tipo. Además, el adenovirus híbrido mosaico de la invención podrá incluir fibras de tipos de adenovirus adicionales. Según la presente invención se entiende por "serotipo" cada uno de los tipos de adenovirus inmunitariamente distintos. Existen 51 serotipos de adenovirus humanos distintos procedentes de 6 subgrupos (subgrupos A a F). La invención contempla el uso de cualquier serotipo adenoviral conocido en el estado de la técnica incluyendo, sin ninguna limitación, cualquiera de los serotipos definidos en la tabla 1.
Tabla 1: Algunos ejemplos de subgrupos y serotipos adenovirales adecuados para su uso en la presente invención.
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En una realización preferida de la invención el primer y el segundo tipo de adenovirus de la cápside y las fibras del adenovirus híbrido mosaico proceden de diferentes subgrupos. En otra realización particular el primer tipo de adenovirus pertenece al subgrupo C y/o el segundo tipo de adenovirus pertenece al subgrupo F.
La expresión "adenovirus del subgrupo C", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de adenovirus que produce infecciones del tracto respiratorio y que incluye los serotipos 1, 2, 5 y 6. Cada uno de estos serotipos posee un único tipo de proteína fibra. La invención puede llevarse a cabo con un adenovirus híbrido que contenga elementos de cualquier serotipo del subgrupo C conocido en el estado de la técnica. De los distintos serotipos capaces de infectar a seres humanos, el más utilizado en los ensayos de terapia génica es el serotipo 5 (Ad5), que está asociado principalmente con infecciones respiratorias suaves, cuya secuencia genómica está disponible en la base de datos de GenBank con el código AC-000008 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&T ermToSearch=23238). Por lo tanto, en una realización preferida de la invención, el adenovirus híbrido posee el genoma y la cápside del adenovirus de serotipo 5 (Ad5). La expresión "adenovirus del subgrupo F", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de virus conocido como adenovirus entéricos, que incluye a los serotipos 40 y 41, caracterizado porque, a diferencia de otros adenovirus, la entrada en la célula a infectar no depende de la interacción entre los motivos RGD de la base pentona del adenovirus y el receptor de integrinas de la superficie de la célula. En su lugar, los adenovirus del subgrupo F pueden usar un mecanismo alternativo para facilitar la endocitosis. En contraste con el resto de especies de adenovirus humanos, los adenovirus entéricos también se caracterizan porque poseen dos proteínas fibra diferentes, que se encuentran en cada virión en aproximadamente el mismo número. Concretamente, poseen una fibra larga, que se une al receptor CAR y, adicionalmente, una fibra corta que no se une a CAR, y que tiene una función desconocida. Otras características de los adenovirus entéricos son el punto isoeléctrico relativamente elevado de sus proteínas estructurales, el aumento de su viabilidad después de la exposición a un entorno acídico (como sucede en algunas partes del tracto gastrointestinal), y su habilidad para unirse a ciertos lípidos de la mucosa gástrica, especialmente después de la exposición a pH bajos. La invención puede llevarse a cabo usando cualquier adenovirus del subgrupo F conocido en el estado de la técnica, y más particularmente la proteína de la fibra corta de los serotipos Ad40 (SEQ ID NO: 1) o del Ad41 (SEQ ID NO: 2). En una realización preferida el adenovirus híbrido posee la proteína de la fibra corta del Ad40.
Así, en una realización particular de la invención el adenovirus que pertenece al subgrupo C es adenovirus tipo 5 y/o el adenovirus que pertenece al subgrupo F es adenovirus tipo 40.
En otra realización todavía más particular, el adenovirus híbrido es un adenovirus conocido como Ad5/40, preferiblemente Ad5/40S. En el contexto de la presente invención el adenovirus Ad5/40S es un adenovirus híbrido que se obtiene al reemplazar la proteína de la fibra del Ad5 completa por la fibra corta completa del Ad40. El método de la invención permite obtener adenovirus híbrido mosaico mediante la infección de células permisivas con adenovirus híbridos y su posterior cultivo.
La primera etapa del método consiste en infectar células permisivas que expresan la fibra de un tipo de adenovirus con un adenovirus que comprende la cápside de un tipo de adenovirus y fibras de un tipo de adenovirus distinto al tipo de adenovirus cuya fibra se expresa en las células permisivas.
Por "infección" o "infectar", en el contexto de la presente invención, se entiende el procedimiento por el cual los adenovirus penetran en las células. Dicha infección puede ser más o menos rápida y depende del tipo de crecimiento celular o de la expresión de los receptores que usan los adenovirus para internalizarse.
La entrada del adenovirus en la célula implica tres tipos de interacciones. La primera interacción se produce cuando la protuberancia o cabeza de la proteína fibra del adenovirus se une específicamente a un receptor de la superficie celular. Los dos receptores actualmente conocidos son el receptor CD46 para los serotipos de adenovirus humano del grupo B y el receptor coxsackie adenovirus (CAR) para los demás serotipos. A continuación se produce la interacción secundaria, en la cual la proteína de la base pentona viral interactúa con una molécula de integrina alfaV de la célula. Un tercer lugar de unión a receptor se localiza en la tercera repetición beta-espiral del cuerpo de la fibra que se une a glicosaminoglicano heparan sulfato. Estas interacciones estimulan la señalización celular e inducen la polimerización de actina dando lugar a la introducción del virión en la célula huésped a través de un endosoma.
Por tanto, es la fibra, principalmente, la que define los tipos celulares que cada adenovirus es capaz de infectar, que serán aquellos que posean los receptores adecuados para que la fibra del adenovirus interaccione con ellos.
La infección se realiza poniendo en contacto el adenovirus híbrido y la célula permisiva durante un tiempo determinado por cualquier método conocido en el estado de la técnica. Por "células permisivas" se entienden células que expresan en su superficie los receptores y co-receptores necesarios para permitir el reconocimiento e infección de un virus dado, pero que además poseen toda la maquinaria metabólica que el virus necesita para replicarse y carecen de factores que inhiban la replicación de dicho adeno virus. Es decir, una célula permisiva para los adeno virus de la invención es cualquier célula capaz de ser infectada por dichos adenovirus y de permitir que dichos adenovirus se repliquen. En el contexto de la presente invención las células permisivas deben, además, expresar la fibra de un tipo de adenovirus distinto al tipo de adenovirus de la fibra del adenovirus híbrido con el que se van a infectar dichas células, y también deben ser capaces de crecer en suspensión. Pueden utilizarse líneas celulares comerciales o conocidas que expresan la fibra de un adenovirus, o bien dichas líneas pueden generarse en el laboratorio por métodos conocidos en el estado de la técnica, como se detalla, por ejemplo en Von Seggern (Von Seggern DJ y cois. J Gen Virol 1998, 79: 1461-1468). Las células permisivas de la invención se elegirán en función del serotipo del adenovirus híbrido con el que se pretende infectar y se seleccionan, sin limitación, de células permisivas que expresan la fibra de un adenovirus de cualquier serotipo conocido desde el 1 al 51. Preferiblemente, en una realización de la invención dichas células permisivas son células que expresan la fibra del adenovirus Ad5. Ejemplos de líneas celulares conocidas que expresan la proteína de la fibra del Ad5 son la línea 21 IB, 211A y 21 IR (Von Seggern DJ y cois. J Gen Virol 1998, 79: 1461-1468; la patente estadounidense US 7,232,899 B2), las líneas 601 y 633 (Von Seggern DJ y cois. J Virol 2000, 74:354- 362). Sin embargo, todas estas líneas celulares crecen en adherencia, y un requisito indispensable en el método de la invención es que la línea celular permisiva debe crecer en suspensión. Por ello, los inventores han adaptado la línea celular 21 IB al crecimiento en supensión, obteniendo una nueva línea celular a la que han denominado 21 IBS. La caracterización de esta línea celular ha demostrado que su viabilidad se mantiene a lo largo de los días, incluso en concentraciones celulares elevadas, su crecimiento es eficiente y su tiempo de duplicación es de 2,1 días.
El adenovirus con el que se infectan las células permisivas comprende la cápside de un tipo de adenovirus y fibras de un tipo de adenovirus distinto al tipo de adenovirus cuya fibra se expresa en las células permisivas. En una realización particular, los adenovirus que pueden utilizarse para infectar son adenovirus Ad5 modificados en los que la proteína fibra ha sido reemplazada total o parcialmente por la fibra de otro serotipo, seleccionados de Ad5.Fibl, Ad5.Fib2, Ad5.Fib3, Ad5.Fib4, Ad5.Fib6, Ad5.Fib7, Ad5.Fib8, Ad5.Fib9, Ad5.FiblO, Ad5.Fibl l, Ad5.Fibl2, Ad5.Fibl3, Ad5.Fibl4, Ad5.Fibl5, Ad5.Fibl6, Ad5.Fibl7, Ad5.Fibl8, Ad5.Fibl9, Ad5.Fib20, Ad5.Fib21, Ad5.Fib22, Ad5.Fib23, Ad5.Fib24, Ad5.Fib25, Ad5.Fib26, Ad5.Fib27, Ad5.Fib28, Ad5.Fib29, Ad5.Fib30, Ad5.Fib31, Ad5.Fib32, Ad5.Fib33, Ad5.Fib34, Ad5.Fib35, Ad5.Fib36, Ad5.Fib37, Ad5.Fib38, Ad5.Fib39, Ad5.Fib40-L, Ad5.Fib40-S, Ad5.Fib41-L, Ad5.Fib41-S, Ad5.Fib42, Ad5.Fib43, Ad5.Fib44, Ad5.Fib45, Ad5.Fib46, Ad5.Fib47, Ad5.Fib48, Ad5.Fib49, Ad5.Fib50, Ad5.Fib51. Ejemplos de estos adenovirus híbridos se describen en las solicitudes de patente internacional WO0304661 y WO0227006. En una realización particular los adenovirus híbridos son adenovirus Ad5 en los que la fibra ha sido sustituida por la fibra corta o larga de Ad40 o Ad41, seleccionados de Ad5.Fib40-S, Ad5.Fib40-L, Ad5.Fib41-S y Ad5.Fib41-L, donde S y L hacen referencia a la fibra corta y larga, respectivamente. En una realización particular de la invención los adenovirus con los que se infectan las células permisivas son adenovirus Ad5/40S que tienen la cápside del Ad5 y la fibra corta del Ad40.
Posteriormente, las células obtenidas en la etapa (i) se cultivan en condiciones que permiten la amplificación del adenovirus durante al menos un ciclo de replicación del adenovirus y de la célula permisiva.
Por "cultivar las células obtenidas en la etapa (i)" se entiende la propagación de las células infectadas con el adenovirus híbrido en un medio de crecimiento apropiado y en unas condiciones de temperatura y mezcla de gases adecuados. Las condiciones de cultivo varían ampliamente dependiendo del tipo celular, pero en el contexto de esta invención el cultivo de las células se realiza siempre en suspensión. La composición del medio de crecimiento varía en cuanto a concentración de glucosa, factores de crecimiento y otros componentes nutritivos, y también varía el pH. El medio de crecimiento se seleccionará en función de la línea celular y contendrá soluciones salinas equilibradas, aminoácidos, vitaminas, otros suplementos orgánicos de bajo peso molecular, y, opcionalmente, hormonas y factores de crecimiento (suero) e inhibidores del crecimiento de los contaminantes (como antibióticos y antifúngicos). Se utilizarán medios de cultivo aptos para el cultivo en suspensión. Ejemplos de medios de crecimiento que pueden utilizarse para el cultivo de células en suspensión son medios libres de suero como SFMII no suplementado o suplementado con pequeñas cantidades de suero, más concretamente es medio SFMII suplementado con 0,5% de suero bovino fetal.
Por "amplificación del adenovirus" se entiende el aumento del número de copias del adeno virus. Esta amplificación se realiza al menos durante un ciclo de replicación del adenovirus. Por "ciclo de replicación del adenovirus" o "ciclo de replicación adenoviral" se entiende, en el contexto de esta invención, el conjunto de procesos por los cuales el adenovirus reconoce una célula, entra en ella, libera su genoma, se replica y arma partículas virales progenie que permanecen en las células hasta que estas son Usadas para su recogida.
El ciclo de replicación del adenovirus consta de diferentes etapas: unión a la célula, que como se ha explicado anteriormente se realiza a través de la interacción de la proteína fibra con los receptores celulares; internalización, que implica la interacción de la pentona con las integrinas V3 y V5; la penetración, que se produce por endocitosis en vesículas revestidas de clatrina, de manera que posteriormente la vesícula se rompe produciéndose la liberación de la partícula viral dentro del citoplasma, con pérdida de proteínas de la cápside y denudamiento del ADN viral; migración, cuando el núcleo de la partícula viral restante migra desde el citoplasma al núcleo vía microtúbulos y el ADN viral entra al núcleo a través de los poros nucleares; la replicación del ADN, que tiene lugar en el núcleo, después de que el ADN viral sea convertido en un complejo histonas celulares-ADN viral; y finalmente, ensamblaje del virión, que empieza en el citoplasma, donde polipéptidos individuales se ensamblan en capsómeros (hexones y pentonas), y posteriormente estas cápsides inmaduras y vacías son ensambladas en el núcleo celular, estando el núcleo de la partícula viral formado por ADN genómico y proteínas asociadas. En el contexto de esta invención, el ciclo de replicación del adenovirus termina justo antes de que las nuevas partículas adeno virales lisen la célula y se liberen al exterior.
Los términos "partícula viral", "partícula vírica" o "virión" se utilizan de manera intercambiable a lo largo de la memoria para referirse a partículas adenovirales infecciosas formadas cuando un vector adenoviral que contiene toda o una parte de un genoma viral infecta una línea celular apropiada para la generación de dichas partículas. Por "ciclo de replicación de la célula permisiva" se entiende el conjunto de procesos por el que una célula madre se divide para formar dos células hijas que mantienen la capacidad de la célula madre de permitir la replicación del adenovirus.
La siguiente etapa del método de la invención (etapa iii) consiste en recuperar las partículas virales del adenovirus híbrido mosaico a partir de las células obtenidas en la etapa (ii).
Tras la síntesis y ensamblaje de la cápside las partículas virales obtenidas serán adenovirus híbrido mosaico, según se ha definido anteriormente. Estos adenovirus híbrido mosaico poseen fibras de dos orígenes diferentes: las que proceden del genoma del adenovirus híbrido con el que se ha infectado la línea celular en la etapa (i), y las que proceden de la línea celular permisiva.
Por "recuperar las partículas virales" se entiende el procedimiento por el cual se lisan física o químicamente las células antes de que se produzca la lisis natural por parte de las nuevas partículas adenovirales generadas en el ciclo de replicación, con la finalidad de recoger dichas partículas cuando se hallan concentradas en el núcleo, lo que facilita una posterior purificación. La lisis de dichas células y recolección de las partículas virales se efectúa por métodos conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo por ciclos de congelación y descongelación,
Una vez recuperadas las partículas virales existe una etapa opcional (etapa iv) que consiste en repetir las etapas anteriores de manera cíclica con las partículas virales obtenidas en la etapa (iii) que se utilizan para la infección en la etapa (i) del siguiente ciclo de amplificación.
Por "ciclo de amplificación", en el contexto de la presente invención, se entiende el tiempo transcurrido entre la infección con el adenovirus híbrido y la recogida de las partículas virales de adenovirus híbrido mosaico. El tiempo de un ciclo de replicación viral completo dependerá del adenovirus híbrido particular y de la línea celular utilizada y en cada caso deberá ser determinado por el experto en la técnica En una realización particular, cuando el adenovirus que pertenece al subgrupo C es adenovirus tipo 5 y/o el adenovirus que pertenece al subgrupo F es adenovirus tipo 40, cada ciclo de amplificación tiene una duración de entre 44 y 64 horas, preferiblemente de entre 48 y 56 horas, más preferiblemente de 56 horas.
El método de la invención se caracteriza porque se lleva a cabo en células permisivas adaptadas al crecimiento en suspensión y en donde la etapa (i) se lleva a cabo en presencia de un policatión.
Por "células permisivas adaptadas al crecimiento en suspensión" se entiende que las células son capaces de vivir de forma natural sin adherirse a una superficie. Dichas células pueden pertenecer a líneas celulares conocidas que crezcan habitualmente en suspensión o a líneas celulares adherentes que han sufrido modificaciones que les permiten crecer en suspensión. El uso de cultivos en suspensión tiene como ventaja que permite realizar la amplificación del adenovirus en sistemas escalables, como bioreactores, o bien mediante el aumento de la densidad celular o bien expandiendo el volumen de cultivo.
Las células permisivas se coincuban con un policatión durante la infección para favorecer la entrada del adenovirus en la célula al permitir la interacción entre las cápsides del adenovirus, cargadas negativamente, y las membranas celulares, también cargadas negativamente. En la presente invención se entiende por "policatión" o "polímero catiónico" un oligómero o polímero orgánico de origen natural o sintético, portador de gran cantidad de cargas positivas a pH neutro que es capaz de dirigir la entrada de la partícula adenoviral al interior de las células productoras. Policationes adecuados para el método de la invención son, pero no se limitan a, polietilenimina, protamina, poliarginina, poliornitina, polilisina, polibreno (bromuro de hexadimetrina), sulfato de protamina, hidrobromuro de poli-L-lisina, policloruro de dimetildialilamonio (Merquat®-100, Merquat®-280, Merquat®- 550), hidrocloruro de poli-L-arginina, poli-L-histidina, poli(4-vinilpiridina), hidrocloruro de poli(4-vinilpiridina), poli(4-vinilpiridina-co-estireno), polivinilpirrolidona, poli-L-lisina succinilada, DEAE-dextrano, espermina, espermidina, etc. En una realización particular de la invención el policatión es polibreno.
Para obtener finalmente partículas virales del adenovirus híbrido no mosaico, es decir, del adenovirus con el que se ha realizado la infección inicial de las células en la etapa (i), las partículas virales del adenovirus híbrido mosaico que se han recuperado en la etapa (iii) o bien en la etapa (iv) se someten a una etapa final de amplificación en células que no expresan la fibra del primer tipo de adenovirus, recuperándose partículas virales del adenovirus híbrido no mosaico.
Por "adenovirus híbrido no mosaico", en el contexto de la presente invención, se entiende el adenovirus original con el que se ha realizado la infección inicial de las células en la etapa (i), y que ha sido definido anteriormente como "adenovirus híbrido", que comprende la cápside de un tipo de adenovirus y fibras de un tipo de adenovirus distinto al tipo de adenovirus cuya fibra se expresa en las células permisivas.
La expresión "etapa final de amplificación" hace referencia a la amplificación del adenovirus híbrido mosaico obtenido en la etapa (iii) o en la etapa (iv) que tiene lugar en células distintas de las utilizadas en la etapa (i) que no expresan la fibra del primer tipo de adenovirus, y que por lo tanto permite obtener partículas virales del adenovirus híbrido original.
Por "células que no expresan la fibra del primer tipo de adenovirus" se entiende cualquier tipo de célula que no exprese ninguna proteína fibra y que posea la maquinaria necesaria para que los adenovirus híbridos mosaico puedan amplificarse. Preferiblemente, dichas células crecen en suspensión. Ejemplos de estas células adaptadas al crecimiento en suspensión son células HEK293S (Brueggemann L.I. y col. J Gen Physiol, 2002, 119: 593-612), células HEK- 293.2sus (número ATCC: CRL-1573.3), células 293F (Invitrogen N° Catálogo: R790-07), Per.C6™, preferiblemente células HEK293S, más preferiblemente células 293F. Por lo tanto, en una realización de la invención, las partículas virales del adenovirus híbrido mosaico recuperadas en la etapa (iii) o (iv) son sometidas a una etapa final de amplificación en células adaptadas al crecimiento en suspensión que no expresan la fibra del primer tipo de adenovirus, recuperándose partículas virales del adenovirus híbrido no mosaico. En una realización particular las células adaptadas al crecimiento en suspensión que no expresan la fibra del primer tipo de adenovirus son células HEK293S. En otra realización particular las células adaptadas al crecimiento en suspensión que no expresan la fibra del primer tipo de adenovirus son células 293F.
La etapa final de amplificación en células que no expresan la fibra del primer tipo de adenovirus puede llevarse a cabo tanto en presencia como en ausencia de un policatión, pero la presencia de dicho agente facilita la entrada del adenovirus en las células. Por lo tanto, en una realización particular la etapa final de amplificación en células adaptadas al crecimiento en suspensión que no expresan la fibra del primer tipo de adenovirus se lleva a cabo en presencia de un policatión, más preferiblemente en presencia de polibreno.
Este método permite optimizar el proceso de amplificación y producción de adenovirus híbridos, de modo que se mejora la eficiencia de amplificación, reduciéndose a un tercio el número de ciclos de amplificación necesarios en comparación con protocolos clásicos, y también se reduce el tiempo y el material fungible utilizado, así como el riesgo de formación de partículas competentes en replicación por recombinación con las secuencias El de las células permisivas.
KITS DE LA INVENCIÓN Y SUS USOS
La invención también proporciona kits para la amplificación de adenovirus híbrido mosaico según el método de la invención.
El término "kit", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una combinación de un conjunto de componentes adecuados para amplificar un adenovirus híbrido mosaico según el método de la invención, junto con sus contenedores y envases apropiados para su venta comercial. En la presente invención, se entiende como "componente adecuado para amplificar un adenovirus híbrido mosaico según el método de la invención", a cualquier compuesto que pueda usarse en cualquiera de las etapas (i) a (iv) del método de la invención y/o en la etapa de amplificación final, e incluye, sin limitación, medios, aditivos, líneas celulares, policationes, adenovirus híbrido mosaico, etc.
Así, en un aspecto la invención se relaciona con un kit para la amplificación de un adenovirus híbrido mosaico comprendiendo dicho adenovirus una cápside de un primer tipo de adenovirus y fibras de al menos dos tipos de adenovirus, siendo uno de los tipos de adenovirus de las fibras del mismo tipo que la cápside, donde dicho kit comprende:
a) al menos una línea celular permisiva que expresa la fibra del primer tipo de adenovirus apta para el cultivo en suspensión y
b) un policatión
Los términos "amplificación", "adenovirus híbrido", "adenovirus híbrido mosaico", "cápside", "fibra", "tipo de adenovirus", "línea celular permisiva" y "policatión" ya han sido definidos con anterioridad en el contexto de los métodos de la invención.
Dicho kit incluye al menos una línea celular permisiva apta para el cultivo en suspensión que expresa la fibra del primer tipo de adenovirus y un policatión que facilita la infección de las células por parte del adenovirus En una realización particular dicho kit comprende adicionalmente un adenovirus híbrido o al menos un polinucleótido que permita generar dicho adenovirus. El término "adenovirus híbrido" ya ha sido definido con anterioridad y se refiere al adenovirus híbrido que se pretende amplificar. El término "polinucleótido" indica un nucleótido de forma polimérica de cualquier longitud que contiene todo el material genético necesario que codifica para generar partículas adeno virales completas. Dicho término incluye ribonucleótidos y desoxiribonucleótidos, ARN de cadena simple y doble, y también polinucleótidos modificados, tales como polinucleótidos metilados. En otra realización particular dicho kit comprende adicionalmente al menos una línea celular adaptada al crecimiento en suspensión que no expresa la fibra del primer tipo de adenovirus. Dicha expresión tiene el mismo significado que el definido en el contexto de los métodos de la invención.
En realizaciones preferidas los kits de la invención pueden utilizarse con cualquiera de los adenovirus híbridos descritos en el contexto del primer aspecto de la invención. En una realización preferida de la invención el policatión que se utiliza en el kit es polibreno.
Es otro aspecto de la invención el uso de estos kits para la amplificación de un adenovirus híbrido mosaico.
EJEMPLOS
Adaptación de las células 21 IB al cultivo en suspensión Puesto que la entrada del Ad5/40S en las células HEK-293 es muy ineficiente, se seleccionó como línea celular productora la línea celular 21 IB, ya que estas células expresan constitutivamente la proteína fibra F5 del Ad5 (Von Seggern y cois. J Virol 2000, 74:354-62; Von Seggern y cois. J Gen Viral 1998, 79: 1461-8). Las células 21 IB adherentes expresan constitutivamente la proteína adeno viral de la fibra 5 en el citoplasma cuando son cultivadas en medio DMEM (Medio de Eagle Modificado por Dulbecco) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). Para adaptar estas células al crecimiento en suspensión, el medio DMEM 10% FBS se sustituyó a continuación por el SFMII. Posteriormente, las células fueron transferidas a placas de 6 pocilios para suspensión. Algunos pocilios se suplementaron con una dosis baja de FBS (1% de FBS o 0,5%> de FBS). La adición de 0,5% de FBS permitió un mejor crecimiento y viabilidad en comparación con los pocilios sin FBS; mientras que la adición de 1% de FBS llevó a la formación de grandes agregados celulares. Las nuevas células adaptadas al cultivo en suspensión se denominaron 21 IBS. Las células 21 IBS se transfirieron a frascos en agitación y se mantuvieron en suspensión a una velocidad de 110 rpm y a una densidad de 7 x 105 células/ml. Tras 18 pases seriados, las células adaptadas crecieron aisladas o en pequeños agregados de 4-5 células, y a una densidad de 2,5 x 106 células/ml las células 21 IBS mantuvieron una alta viabilidad. Para determinar su curva de crecimiento, las células 21 IBS se cultivaron por triplicado a diferente densidad. La viabilidad y densidad se evaluó diariamente durante una semana. Como se observa en la Figura 1 A la viabilidad de estas células estaba por encima del 80% y se mantuvo constante incluso a una alta densidad celular. Además, el crecimiento celular fue constante y su constante numérica de crecimiento μ fue de 0,3246 (Figura IB).
El polibreno mejora la infección por el adenovirus quimérico Ad5/40S en células 21 IBS
Se ensayó si el polibreno era capaz de mejorar la entrada del adenovirus en las células productoras durante las etapas de amplificación. Se infectaron diferentes lotes de células 21 IBS con MOI crecientes de Ad5/40S-CMV-GFP en ausencia o presencia de polibreno, y el porcentaje de células infectadas se cuantificó mediante la expresión GFP de células tras análisis mediante separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Como se observa en la Figura 2, la transducción de Ad5/40S en células 21 IBS está significativamente aumentada cuando se co-incuban con polibreno, lo que permite aumentar la eficiencia del protocolo de amplificación. Estudio del ciclo celular viral de Ad5/40S en células 21 IBS
Los Ad5/40S quiméricos producidos en células 293 S contienen proteína F40S en sus cápsides, mientras que los Ad5/40S producidos en células 21 IBS se espera que contengan tanto proteínas F5 como F40S, ya que las células 21 IBS expresan constitutivamente proteína F5 (Fig. 3A). En consecuencia, durante las etapas de amplificación, la producción en células 21 IBS generará mosaicismo con cápsides que contienen tanto las proteínas F5 como las F40S (Figura 3B). El mosaicismo de fibras mejora la infectividad de los viriones Ad5/40S durante los ciclos de amplificación permitiendo una entrada más eficiente mediada por la interacción CAR:F5 en las células productoras 21 IBS. Para generar cápsides quiméricas puras (no mosaicos), la última etapa de amplificación debe realizarse en células HEK-293 adaptadas al crecimiento en suspensión. Para determinar el tiempo de recogida óptimo durante el proceso de amplificación, el ciclo celular viral de Ad5/40S mosaico/quimera se estudió en células 293F. Para hacer un análisis más preciso se cuantificó la producción viral cada 4 horas entre 44 y 64 horas de producción. Como se observa en la Figura 4, los vectores quiméricos Ad5/40S tienen un ciclo viral de 48-56 horas, con el pico más alto a las 56 horas. Sin embargo, cuando se usan MOI más altas el pico se mueve hacia las 48 horas. Teniendo en cuenta estos resultados, para los siguientes experimentos el tiempo de recogida óptimo se estableció en 56 horas post-infección.
Producción del vector Ad5/40S con protocolo optimizado
Con el fin de desarrollar un protocolo optimizado de producción del vector, 2,5 x 107 células 21 IBS (a una densidad de 106 células/ml) se infectaron con un MOI=l de Ad5/40S-CMV-GFP en presencia de polibreno. A las 56 horas después de la infección las células se recogieron y lisaron mediante congelación-descongelación, y el lisado crudo se añadió a células 4 x 108 293F. A las 56 horas las células se recogieron y el lisado crudo se almacenó. El sobrenadante se concentró por diafiltración con el sistema Midjet. El sobrenadante concentrado y el lisado crudo se purificaron mediante gradiente doble de cloruro de cesio. Como se muestra en la Figura 5, el nuevo protocolo desarrollado es escalable y tiene sólo dos etapas de amplificación, lo que reduce considerablemente no sólo el tiempo y el coste del protocolo, sino también la generación de partículas replicativas competentes.

Claims

REIVINDICACIONES
Un método para la obtención de un adenovirus híbrido mosaico que comprende una cápside de un primer tipo de adenovirus y fibras de dicho primer tipo de adenovirus y de al menos un segundo tipo de adenovirus que comprende
(i) infectar células permisivas que expresan la fibra de un primer tipo de adenovirus con un adenovirus que comprende la cápside de dicho primer tipo de adenovirus y fibras de un segundo tipo de adenovirus distinto al primer tipo de adenovirus,
(ii) cultivar las células obtenidas en la etapa (i) en condiciones que permitan la amplificación del adenovirus durante al menos un ciclo de replicación del adenovirus y/o de la célula permisiva,
(iii) recuperar las partículas virales del adenovirus híbrido mosaico a partir de las células obtenidas en la etapa (ii) y,
(iv) opcionalmente, repetir las etapas (i) a (iii) en donde las partículas virales obtenidas en la etapa (iii) se utilizan para la infección en la etapa (i) del siguiente ciclo de amplificación,
en donde las células permisivas son células adaptadas al crecimiento en suspensión y en donde la etapa (i) se lleva a cabo en presencia de un policatión.
Un método según la reivindicación 1 en el que las partículas virales del adenovirus híbrido mosaico recuperadas en la etapa (iii) o (iv) son sometidas a una etapa final de amplificación en células adaptadas al crecimiento en suspensión que no expresan la fibra del primer tipo de adenovirus, recuperándose partículas virales del adenovirus híbrido no mosaico.
Un método según la reivindicación 2 en el que la etapa final de amplificación en células adaptadas al crecimiento en suspensión que no expresan la fibra del primer tipo de adenovirus se lleva a cabo en presencia de un policatión.
4. Un método según las reivindicaciones 2 ó 3 donde las células adaptadas al crecimiento en suspensión que no expresan la fibra del primer tipo de adenovirus son células HEK293S.
5. Un método según las reivindicaciones 2 ó 3 donde las células adaptadas al crecimiento en suspensión que no expresan la fibra del primer tipo de adenovirus son células 293F.
6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el policatión es polibreno. 7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el primer tipo de adenovirus pertenece al subgrupo C y/o el segundo tipo de adenovirus pertenece al subgrupo F.
8. Un método según la reivindicación 7 donde el adenovirus que pertenece al subgrupo C es adenovirus tipo 5 y/o el adenovirus que pertenece al subgrupo F es adenovirus tipo
40.
9. Un método según la reivindicación 8 en donde cada ciclo de amplificación tiene una duración de entre 44 y 64 horas.
10. Un método según la reivindicación 9 en donde cada ciclo de amplificación tiene una duración de entre 48 y 56 horas.
11. Un método según la reivindicación 10 en donde cada ciclo de amplificación tiene una duración de 56 horas.
12. Un kit para la amplificación de un adenovirus híbrido mosaico comprendiendo dicho adenovirus una cápside de un primer tipo de adenovirus y fibras de al menos dos tipos de adenovirus, siendo uno de los tipos de adenovirus de las fibras del mismo tipo que la cápside, donde dicho kit comprende:
a) al menos una línea celular permisiva que expresa la fibra del primer tipo de adenovirus apta para el cultivo en suspensión y b) un olicatión
13. Un kit según la reivindicación 12 que adicionalmente comprende un adenovirus híbrido o al menos un polinucleótido que permita generar dicho adenovirus.
14. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13 que adicionalmente comprende al menos una línea celular adaptada al crecimiento en suspensión que no expresa la fibra del primer tipo de adenovirus. 15. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 donde el policatión es polibreno.
16. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 donde el primer tipo de adenovirus pertenece al subgrupo C y/o el segundo tipo de adenovirus pertenece al subgrupo F.
17. Un kit según la reivindicación 16 donde el adenovirus que pertenece al subgrupo C es adenovirus tipo 5 y/o el adenovirus que pertenece al subgrupo F es adenovirus tipo 40.
18. Uso de un kit según las reivindicaciones 12 a 17 para la amplificación de un adenovirus híbrido mosaico.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107603956A (zh) * 2017-08-24 2018-01-19 乾元浩生物股份有限公司 一种禽腺病毒纸片载体潮汐式悬浮培养方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CLARK, P. R. ET AL.: "Polycations and cationic lipids enhance adenovirus transduction and transgene expression in tumor cells.", CANCER GENE THERAPY., vol. 6, no. 5, September 1999 (1999-09-01), pages 437 - 446, XP002978570, DOI: doi:10.1038/sj.cgt.7700074 *
KRASNYKH, V. ET AL.: "Genetic targeting of an adenovirus vector via replacement of the fiber protein with the phage T4 fibritin.", JOURNAL OF VIROLOGY., vol. 75, no. 9, May 2001 (2001-05-01), pages 4176 - 4183, XP002202288, DOI: doi:10.1128/JVI.75.9.4176-4183.2001 *
MERCIER, G. T. ET AL.: "A chimeric adenovirus vector encoding reovirus attachment protein sigma1 targets cells expressing junctional adhesion molecule 1.", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA., vol. 101, no. 16, April 2004 (2004-04-01), pages 6188 - 6193, XP003007459, DOI: doi:10.1073/pnas.0400542101 *
NICOL, C. G. ET AL.: "Effect of adenovirus serotype 5 fiber and penton modifications on in vivo tropism in rats.", MOLECULAR THERAPY., vol. 10, no. 2, August 2004 (2004-08-01), pages 344 - 354, XP004660571, DOI: doi:10.1016/j.ymthe.2004.05.020 *
SHAYAKHMETOV, D. M. ET AL.: "Dependence of adenovirus infectivity on length of the fiber shaft domain.", JOURNAL OF VIROLOGY., vol. 74, no. 22, November 2000 (2000-11-01), pages 10274 - 10286, XP002401959 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107603956A (zh) * 2017-08-24 2018-01-19 乾元浩生物股份有限公司 一种禽腺病毒纸片载体潮汐式悬浮培养方法

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