WO2012081893A2 - 신규한 3-인돌리논 유도체 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

신규한 3-인돌리논 유도체 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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WO2012081893A2
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ethyl
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oxoindolin
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배명애
최은복
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    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/006—Biological staining of tissues in vivo, e.g. methylene blue or toluidine blue O administered in the buccal area to detect epithelial cancer cells, dyes used for delineating tissues during surgery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/30—Indoles; Hydrogenated indoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/42—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals

Definitions

  • the present invention relates to novel 3-indolinone derivatives and compositions comprising them.
  • Molecular imaging is a technique for detecting and imaging molecular-level changes, such as biochemical and biological changes, that occur in a cell or in vivo, and directly understands living cells for understanding complex life phenomena and for early diagnosis of diseases. It's an observable way.
  • Low-molecular fluorescent materials are an indispensable means of research in the field of chemical biology, where biomolecular labels, enzyme substrates, environmental indicators, and intracellular cells are found in various places. It acts as a cellular stain. Thus, it is known that low molecular weight phosphors can image live phenomena in cells in real time.
  • tryptophan fluoresce, among which tryptophan is the most fluorescent compound.
  • polycyclic aromatic molecules such as anthracene
  • fluorescent tools are also used as useful fluorescent tools.
  • Coumarins are both fluorophores and pharmaceuticals, and representative examples thereof include 7-hydroxy-4-methylcoumarin (ie, 4-methylumbelliferone: 4-MU).
  • 4-MU 7-hydroxy-4-methylcoumarin
  • AMC also shows similar spectral properties.
  • Indole and imidazole Traditional indole derivatives are tryptophan. Later, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 12 in Figure 1) binds to a small groove of the DNA, which is useful for staining DNA.
  • DAPI 6-diamidino-2-phenylindole
  • Dibenzimidazole dyes have also been developed by Hoechst AG and used as useful DNA-binding probes.
  • Hoechst 33342 (13 in Figure 1) is cell permeable and can be used in living cells.
  • NBD 4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole
  • the main amine adduct of NBD-Cl (eg, 14 in FIG. 1) emits light in the green region.
  • lambda max 465 nm
  • lambda em 535 nm
  • e 2.2 x 10 4 M -1 cm -1
  • F 0.3.
  • the well known xanthenes dye fluorescein (17 in FIG. 1) was synthesized by Bayer in 1871. Fluorescein is currently the most widely used phosphor in biochemistry, biology and medicine.
  • Sulforhodamine 101 (SRh 101 , 20 in Figure 1) shows a high quantum yield as a gluolidine-based dye and is sold under the trademark Texas red.
  • BODIPY Boron difluoride dipyrromethene
  • Another object of the present invention is to provide a composition comprising the 3-indolinone derivative or a salt thereof.
  • Still another object of the present invention is to provide a kit for screening a metabolic syndrome therapeutic drug comprising the 3-indolinone derivative or a salt thereof and a method for screening a metabolic syndrome therapeutic drug using the same.
  • the present invention to achieve the above object
  • R 1 is hydrogen, C 1-6 alkoxy, C 1-4 alkenyl C 2-6 optionally substituted by an alkyl Al-oxy, benzyloxy or C 1-4 alkoxy and phenyl;
  • R 2 is C 1-6 alkyl
  • R 3 and R 4 are each independently hydrogen, C 1-6 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, benzyl or C 3-6 cycloalkyl, optionally substituted with C 1-4 alkyl Methyl;
  • R 5 is C 2-6 alkenyl or C 3-6 cycloalkylmethyl, optionally substituted with C 1-6 alkyl, C 1-4 alkyl.
  • the present invention provides a composition for fluorescent staining, a kit for detecting lipids, a kit for diagnosing metabolic syndrome comprising a 3-indolinone derivative represented by Formula 1 or 2 or a salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a screening kit of a drug for treating metabolic syndrome comprising a 3-indolinone derivative represented by Formula 1 or 2 or a salt thereof.
  • the present invention comprises the steps of administering a 3-indolinone derivative represented by Formula 1 or 2 or a salt thereof and a candidate drug in an animal model; And analyzing a biofluorescence image of the animal.
  • novel 3-indolinone derivatives or salts thereof according to the present invention can be particularly useful as a biodiagnostic reagent because they can selectively fluoresce fat. Therefore, the composition containing the novel 3-indolinone derivative or salt thereof of the present invention can be usefully applied to screening operations for discovering fat regulating compounds for drug development and to study biological phenomena. .
  • the 3-indolinone derivatives or salts thereof represented by Formula 1 or 2 of the present invention have a characteristic of dyeing only fats with high sensitivity, and thereby confirming the amount of fat by an optical method by measuring the fluorescence intensity generated therefrom. Can be. Since this method can be performed without surgery or tissue extraction, it can prevent unnecessary sacrifice of experimental animals, and the movement, production and disappearance of adipose tissue in vivo can be observed for a long time. Therefore, the screening kit comprising a 3-indolinone derivative represented by Formula 1 or 2 of the present invention or a salt thereof may be usefully used for the development of a drug for treating metabolic syndrome.
  • 1 is a view showing a structural formula to classify conventional fluorescent materials
  • Figure 2 is a photograph observing the cells before and after differentiation in Experimental Example 1 with a fluorescence microscope
  • Figure 3 is a photograph observing zebrafish adipocyte differentiation over time after staining in Experimental Example 2 under a fluorescence microscope
  • FIG. 4 is a photograph of fluorescence microscopy of the change of adipose tissue during starvation of zebrafish and re-feeding after staining in Experimental Example 2.
  • FIG. 4 is a photograph of fluorescence microscopy of the change of adipose tissue during starvation of zebrafish and re-feeding after staining in Experimental Example 2.
  • FIG. 5 is a photograph (A, A ') of undifferentiated 3T3-L1 cells through the compound of Example 4, a compound staining photograph (B, B') and differentiated of Example 4 for differentiated 3T3-L1 cells. Nile Red staining pictures (C, C ′) of 3T3-L1 cells are shown.
  • Example 6 is a photograph of various kinds of cells stained with the compound of Example 4 (KR 68432).
  • Figure 7 is a photograph of the comparative staining of the compound of Example 4 (KR 68432) and LipidTOX TM .
  • Example 8 is a photograph of the comparative staining results of the compound of Example 4 (KR 68432) and BODIPY 493/503.
  • Figure 9 is a photograph showing the results of observing the degree of staining of adipose tissue after oral administration of the compound of Example 4 (KR 68432) to the rat.
  • 11 is a result graph showing the fat reduction effect of the DGAT1 inhibitor through the amount of fluorescence reduction.
  • the present invention provides a 3-indolinone derivative or a salt thereof represented by the following formula (1) or (2):
  • R 1 is hydrogen, C 1-6 alkoxy, C 1-4 alkenyl C 2-6 optionally substituted by an alkyl Al-oxy, benzyloxy or C 1-4 alkoxy and phenyl;
  • R 2 is C 1-6 alkyl
  • R 3 and R 4 are each independently hydrogen, C 1-6 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, benzyl or C 3-6 cycloalkyl, optionally substituted with C 1-4 alkyl Methyl;
  • R 5 is C 2-6 alkenyl or C 3-6 cycloalkylmethyl, optionally substituted with C 1-6 alkyl, C 1-4 alkyl.
  • R 1 is hydrogen, methoxy, allyloxy, benzyloxy or methoxyphenyl
  • R 2 is methyl, ethyl or isopropyl
  • R 3 and R 4 are each independently hydrogen, methyl, propyl, hexyl, allyl, propargyl, 2-butenyl, 3-methylbut-2-enyl, benzyl or cyclopropylmethyl
  • R 5 is methyl, propyl, allyl or cyclopropylmethyl.
  • 3-indolinone derivatives of the general formula (1) or (2) according to the present invention can be prepared according to the synthetic route represented by the following schemes 1 to 6, for example.
  • Scheme 1 is where the substituents R 3 and R 4 are the same:
  • Reagents and Conditions (a) H 2 SO 4 catalyst, EtOH, reflux; (b) POCl 3 , DMF; (c) mCPBA, p-TSA, CH 2 Cl 2 ; (d) R 3 -I (or R 4 -I), K 2 CO 3 , acetone, reflux 10 hr.
  • R 3 and R 4 are the same as defined in Chemical Formulas 1 and 2, but are the same substituents.
  • Scheme 2 is the case where the substituents R 3 and R 4 are different.
  • R 3 and R 4 are the same as defined in Chemical Formulas 1 and 2, but are different from each other.
  • Reagents and Conditions (a) TBDPSCl, imidazole, THF, reflux 5 hr; (b) NaH, propargyl bromide, DMF, reflux 3hr; (c) TBAF, CH 2 Cl 2 , reflux, 2 hr; (d) propargyl bromide, K 2 CO 3 , acetone, reflux 10 hr.
  • Reagents and Conditions (a) R 3 -Br, NaH, DMF; (b) Pd (OAc) 2 , PhI (OAc) 2 , acetic acid, reflux; (c) sodium tert-butoxide, K 2 CO 3 , MeOH, THF; (d) R 4 -Br or R 5 -Br, K 2 CO 3 , acetone, reflux.
  • R 3 , R 4 and R 5 are as defined in formulas (1) and (2).
  • Reagents and Conditions (a) H 2 SO 4 catalyst, EtOH, reflux; (b) POCl 3 , DMF; (c) mCPBA, p-TSA, CH 2 Cl 2 ; (d) TBDPSCl, imidazole, THF, reflux 5 hr; (e) boronic acid, K 3 PO 4 , Pd (OAc) 2 , tri-o-polyphosphine, EtOH; (f) NaH, allyl iodide, DMF, reflux 3 hr; (g) TBAF, CH 2 Cl 2 , reflux 2hr; (h) allyl iodide, K 2 CO 3 , acetone, reflux 10 hr.
  • Reagents and Conditions (a) H 2 SO 4 catalyst, EtOH, reflux; (b) POCl 3 , DMF; (c) mCPBA, p-TSA, CH 2 Cl 2 ; (d) TBDPSCl, imidazole, THF, reflux 5 hr; (e) H 2 , Pd / C, MeOH, 2 hr; (f) NaH, allyl iodide, DMF, reflux 3 hr; (g) TBAF, CH 2 Cl 2 , reflux 2hr; (h) allyl iodide, K 2 CO 3 , acetone, reflux 10 hr.
  • the 3-indolinone derivatives of Formula 1 or 2 and salts thereof according to the present invention prepared by the above method are particularly excellent in the ability to fluoresce fat to quantitatively or qualitatively analyze the amount, site, etc. of fat in vivo. It can be usefully used as a diagnostic reagent for the living body.
  • the present invention provides a composition for fluorescent staining, particularly a composition for fatty fluorescent staining, comprising the 3-indolinone derivative represented by Chemical Formula 1 or 2 or a salt thereof as an active ingredient.
  • the 3-indolinone derivative of Formula 1 or 2 may be included in a concentration of 0.1 to 100 ⁇ M, preferably 1 to 100 ⁇ M.
  • the present invention also provides a kit comprising a 3-indolinone derivative represented by Formula 1 or 2 or a salt thereof as an active ingredient.
  • the kit may include a material used to determine the reaction between the indolinone derivative and the sample.
  • a material used to determine the reaction between the indolinone derivative and the sample For example, buffers, stabilizers, inert proteins, detection labels, and the like can be included.
  • kits of the present invention may include instructions for performing the analysis (eg, written, tape, VCR, CD-ROM, etc.).
  • composition for fluorescent staining comprising a 3-indolinone derivative represented by Formula 1 or 2 or a salt thereof as an active ingredient, and a diagnostic kit including the same may be used as a fat of the 3-indolinone derivative represented by Formula 1 or 2 above. Based on the specific staining effect, it can be used for lipid detection purposes or for diagnosis of diseases related to fat.
  • the fat-related disease may include metabolic syndrome
  • the metabolic syndrome may include obesity, hypertension, arteriosclerosis, hyperlipidemia, liver disease, hyperinsulinemia, hyperglycemia, type 1 and type 2 diabetes, and insulin resistance.
  • features include but are not limited to dyslipidemia, erectile dysfunction, cardiovascular disease and ischemic disease.
  • the liver disease includes fatty liver, hepatitis and cirrhosis due to lipid metabolism abnormalities between alcoholic and non-alcoholic, and dyslipidemia includes a significant increase in non-esterified fatty acids, ultra low density lipoproteins, an increase in triglyceride rich particles. , High ApoB levels, small dense low density lipoprotein particles, high ApoB levels in the presence of phenotype B and low high density lipoprotein levels associated with low ApoA particle levels.
  • the cardiovascular diseases also include macrovascular disease, heart failure, cerebrovascular disease and terminal peripheral artery failure of various internal organs that cause myocardial infarction.
  • the present invention provides a screening kit of a drug for treating metabolic syndrome comprising a 3-indolinone derivative represented by Formula 1 or 2 or a salt thereof.
  • the 3-indolinone derivatives represented by Formula 1 or 2 according to the present invention can be selectively fluorescently stained with fat, and thus are applied to screening operations for discovering fat-modulating compounds for the development of new drugs and to study biological phenomena. It can be useful for doing so.
  • the kit of the present invention uses a 3-indolinone derivative represented by Formula 1 or 2 or a salt thereof to detect a fat in vivo in an experimental animal model and administer a candidate drug that is expected to be effective in treating metabolic syndrome.
  • the candidate drug can then be screened by confirming its effect in real time in vivo.
  • the 3-indolinone derivative represented by Formula 1 or 2 or a salt thereof and a candidate drug are injected into a laboratory animal model through a conventional administration method, and then biofluorescence images are obtained through a small animal fluorescence imaging device, and fluorescence intensity is obtained.
  • candidate drugs can be screened by observing the quenching of.
  • the metabolic syndrome is obesity, hypertension, arteriosclerosis, hyperlipidemia, liver disease, hyperinsulinemia, hyperglycemia, type 1 and type 2 diabetes, dyslipidemia characterized by insulin resistance, erectile dysfunction, cardiovascular system Relationship diseases and ischemic diseases include, but are not limited to.
  • the liver disease includes fatty liver, hepatitis and cirrhosis due to lipid metabolism abnormalities between alcoholic and non-alcoholic, and dyslipidemia includes a significant increase in non-esterified fatty acids, ultra low density lipoproteins, an increase in triglyceride rich particles. , High ApoB levels, small dense low density lipoprotein particles, high ApoB levels in the presence of phenotype B and low high density lipoprotein levels associated with low ApoAI particle levels.
  • the cardiovascular diseases also include macrovascular disease, heart failure, cerebrovascular disease and terminal peripheral artery failure of various internal organs that cause myocardial infarction.
  • the kit of the present invention has a feature that can be screened quantitatively in real time without limitation of the type of candidate drug, mode of administration, or order of administration. Therefore, there is an advantage in that it is possible to detect a quantitative change in the amount of fat regardless of the relationship between the candidate drug and the 3-indolinone derivative represented by Formula 1 or 2.
  • the kit of the present invention may include a formulation of the 3-indolinone derivative represented by Formula 1 or 2 with the control reagent (positive and / or negative) in a dosage form.
  • the control reagent positive and / or negative
  • it can be administered orally as sugar-coated tablets, capsules, elixirs and microcapsules as needed, or in the form of injectables of sterile solutions or suspensions with water or other pharmaceutically acceptable liquids. Parenteral administration.
  • the 3-indolinone derivative represented by Formula 1 or 2 is a pharmaceutically acceptable carrier or media, specifically sterile water, physiological saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, flavors Agents, excipients, vehicles, preservatives, binders and the like.
  • the amount of active ingredient in the above formulation is in a suitable dosage within the preferred range.
  • additives examples include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth rubber and arabic rubber; Excipients such as crystalline cellulose; Swelling agents such as cornstarch, gelatin, alginic acid; Lubricants such as magnesium stearate; Sweetening agents such as sugar, lactose or saccharin; And flavoring agents such as peppermint, Gaultheria adenothrix oil and cherries.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth rubber and arabic rubber
  • Excipients such as crystalline cellulose
  • Swelling agents such as cornstarch, gelatin, alginic acid
  • Lubricants such as magnesium stearate
  • Sweetening agents such as sugar, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, Gaultheria adenothrix oil and cherries.
  • liquid carriers such as oils may also be included in the above components further.
  • Sterile compounds for injection may be formulated according to the normal drug preparation using a vehicle such as sterile water used in the injection.
  • Other isotonic solutions including physiological saline, glucose, and adjuvants such as D-sorbitol, D-mannitol, D-mannose, and sodium chloride can be used as aqueous solutions of injections. It may be used with suitable solubilizers such as alcohols, in particular polyalcohols such as ethanol, propylene glycol and polyethylene glycol, non-ionic surfactants such as polysorbate 80 (TM) and HCO-50.
  • kits of the present invention may include instructions for performing the assay (eg, written, tape, VCR, CD-ROM, etc.).
  • the analysis format of the kit is a fluorescence image using a small animal fluorescence imaging device known in the art.
  • the present invention also provides a method for preparing an animal model comprising administering a 3-indolinone derivative represented by Formula 1 or 2 or a salt thereof and a candidate drug according to the present invention to an animal model; And analyzing the biofluorescence image of the animal, the method for screening a drug for treating metabolic syndrome.
  • the first step is administering a 3-indolinone derivative or a salt thereof and a candidate drug represented by Formula 1 or 2 to an animal model.
  • 3-indolinone derivatives represented by Formula 1 or 2 may be prepared in a conventional formulation.
  • the liquid is preferably, but not particularly limited thereto.
  • the candidate drug may also be used prepared in a conventional formulation.
  • it may be used in the form of a liquid for direct injection, capsules for oral administration and the like, but is not particularly limited thereto.
  • the administration may be carried out according to a conventional administration method, such as direct injection, oral administration, vascular injection, but is not particularly limited thereto.
  • mice mice, mice, guinea pigs, rabbits, cats, dogs, sheep, pigs, cattle, monkeys, baboons, chimpanzees, and the like may be used as the animals.
  • the second step is to obtain a fluorescent image in vivo from an animal administered with the 3-indolinone derivative represented by Formula 1 or 2 and the candidate drug, and to analyze the same.
  • the in vivo fluorescent image can be obtained from the liver of the animal model to be analyzed, but is not limited thereto.
  • the in vivo fluorescent image may be obtained using a small animal fluorescence imaging apparatus, but is not limited thereto.
  • the 3-indolinone derivative represented by Formula 1 or 2 of the present invention exhibits a fat-specific strong fluorescence, it is possible to quantitatively or qualitatively analyze the amount, site, and the like of fat in a living body, and to administer a candidate drug to reduce it. In this case, it can be confirmed through fluorescence imaging that the fluorescence sensitivity is decreased in vivo, and thus it can be usefully used for screening candidate drugs having an effect of reducing the amount of fat.
  • 5-methoxyindole-2-carboxylic acid (5 g, 0.026 mmol) was dissolved in EtOH (40 mL), and then stirred for 10 hours under sulfuric acid (4 ml) and reflux. After the reaction was completed, the mixture was concentrated under reduced pressure, dissolved in water, adjusted to pH 7 with 2N-NaOH, extracted with EtOAc, dried (Na 2 SO 4 ), filtered, and concentrated under reduced pressure to obtain the title compound.
  • step 7-2 using ethyl 5-methoxy-1-propyl-1H-indole-2-carboxylate instead of ethyl 1-benzyl-5-methoxy-1H-indole-2-carboxylate, In the same manner, the title compound was obtained in 72% yield.
  • step 7-2 using 1-hexyl-5-methoxy-1H-indole-2-carboxylate instead of ethyl 1-benzyl-5-methoxy-1H-indole-2-carboxylate, In the same manner, the title compound was obtained in a yield of 50%.
  • Step 7-2 of ethyl 1-cyclopropylmethyl-5-methoxy-1H-indole-2-carboxylate was used instead of ethyl 1-benzyl-5-methoxy-1H-indole-2-carboxylate. In the same manner as in 1, the title compound was obtained in 97% yield.
  • Ethyl 1-benzyl-3-hydroxy-5-methoxy-1H-indole-2-carboxylate 100 mg, 0.3 mmol was dissolved in acetone (10 mL), followed by K 2 CO 3 (190 mg, 1.5 mmol) and allyl eye. It was added to Odide (0.16ml, 1.5mole) and stirred for 5 hours at reflux conditions. After the reaction was completed, the mixture was concentrated under reduced pressure, dissolved in water, extracted with EtOAc, dried (Na 2 SO 4 ), filtered, and concentrated under reduced pressure, and then separated by column chromatography to obtain the title compound.
  • the compound of Example 1 (ethyl 1,2-diallyl-5-methoxy-3-oxoindolin-2-carboxylate) was used.
  • the cells were stained with 3T3-L1 cells, which are preadipocytes.
  • 3T3-L1 cells (ATCC, CL-173 TM) were prepared using DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, GIBCOBRL), 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone) and 1% antibiotic-antifungal ( Incubated in an antibiotic-antimycotic (containing penicillin / streptomycin, GIBCOBRL) at 5% CO 2 at 37 ° C. and then treated with 10 ⁇ M of the compound of Example 1. Meanwhile, the stained sites were lipid droplets.
  • DMEM medium Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, GIBCOBRL)
  • FBS fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • antibiotic-antifungal Incubated in an antibiotic-antimycotic (containing penicillin / streptomycin, GIBCOBRL) at 5% CO 2 at 37 ° C. and then treated with 10 ⁇ M of the compound of Example 1. Meanwhile, the stained sites were lipid droplets
  • FIG. 2 The cells before and after differentiation were observed with a Leica fluorescence microscope (DMI 3000b), and the results are shown in FIG. 2.
  • a and A 'of FIG. 2 show undifferentiated 3T3-L1 cells observed with a fluorescence microscope, and B shows differentiated 3T3-L1 cells observed with a fluorescence microscope.
  • zebrafish which is a genetically generated animal model, was stained with the compound of Example 1.
  • zebrafish after 1 day, 15 days, 30 days, 60 days, and 90 days of age were incubated in 10 ml of petri-dish, respectively, and treated with 100 ⁇ M of the compound of Example 1 to 15 at 28.5 ° C. Staining was carried out by the method of dark reaction for a minute. Adipogenesis over time after staining was observed with a fluorescence microscope (MZ10F, Leica), and the results are shown in FIG. 3.
  • 3A to 3C show adipose tissue staining results at the head region of zebrafish, D and E are adipose tissue staining results at the tail region, and F and G are adipose tissue staining results at the belly region.
  • I and J of Figure 3 shows the result of staining the lipid granules of zebrafish with an anti-perilipin antibody
  • Figure 3 K shows the adipose tissue using the compound of Example 1 After the zebrafish liver and intestine was extracted and confirmed the staining of adipose tissue present around the organ
  • L of Figure 3 is the result of analyzing the organ and the surrounding adipose tissue through paraffin sections.
  • dpf means day post fertilization.
  • adipose tissue was first observed around the pancreas at 15 days after fertilization (FIG. 3B), and at 20 days after fertilization (FIG. 3C), fat was detected in the viscera including the pancreas and around the liver. Tissues appeared, and fat tissue in zebrafish 20 days after fertilization was larger in number and larger in size than in 15 days after fertilization. At 30 days after fertilization (FIG. 3E), fat tissue was expanded in the pectoral fin, around the heart, and in the entire visceral area. In the zebrafish 60 days after fertilization (Fig.
  • the distribution of adipose tissue was more prominently differentiated, and the fat wrapped around the eyes, jaw, heart, intestine, liver, pectoral fin, caudal fin and spine. there was.
  • the adipose tissue was stained with an enlarged area (J to J '' 'in FIG. 3)
  • the fat was distributed in a specific organ, and it was found that the fat was in a round shape.
  • the anatomical structure of zebrafish fat cells was observed through paraffin sections, and it was confirmed that a large amount of fat was interspersed in the body cavity between the intestine, liver, bure, and intestinal liver (K and L of FIG. 3).
  • the adipocytes were stained by the compound of the present invention, and only the fragments were re-extracted to confirm that the structure of the adipocytes was similar to that of human adipocytes.
  • the compound of Example 4 (ethyl 5-methoxy-1,2-bis (3-methylbut-2-enyl) -3-oxoyne Mouse embryonic fibroblast cell line (3T3-L1), Human prostate cancer cell line (PC3), Human breast adenocarcinoma cell line (MCF7), Human colon cancer cell line (HT29), HepG2 ( Human liver carcinoma cell line), CHL-1 (Human melanoma cell line), and NIH3T3 (Mouse embryonic fibroblast cell line) were stained.
  • 3T3-L1 Mouse embryonic fibroblast cell line
  • PC3 Human prostate cancer cell line
  • MCF7 Human breast adenocarcinoma cell line
  • HT29 Human colon cancer cell line
  • HepG2 Human liver carcinoma cell line
  • CHL-1 Human melanoma cell line
  • NIH3T3 Mae embryonic fibroblast cell line
  • 3T3-L1 Mae embryonic fibroblast cell line
  • PC3 Human prostate cancer cell line
  • MCF7 Human breast adenocarcinoma cell line
  • HT29 Human colon cancer cell line
  • HepG2 Human liver carcinoma cell line
  • CHL-1 Human melanoma cell line
  • CHL-3T3 cells contained Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, GIBCOBRL) containing 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone). was cultured at 5% CO 2 at 37 ° C.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS Hyclone
  • LLC-PK1 (Porcine kidney cell line) was cultured in Medium 199 containing 15% bovine serum, and differentiation of adipocytes was 10% FBS, dexamethasone (0.25 ⁇ M, 2 days (0 to 2 days) treatment in a DMEM medium mixture containing Sigma Aldrich, St. Louis, MO), isobutylmethylxanthine (0.5 mM, IBMX, Sigma Aldrich) and insulin (166 nM, Sigma Aldrich) The medium was then replaced with DMEM medium containing 10% FBS and insulin for 2 days. The cells were treated with DMEM containing 10% FBS, the medium was changed every two days.
  • the cells were incubated with 10 ⁇ M of the compound of Example 4 in DMEM medium containing 10% FBS for 4 hours at 37 ° C., and then observed under a LeicaMZ10F microscope.
  • the compound of Example 4 or Nile Red 5 ⁇ M was stained for 30 minutes, and then diluted with dimethyl sulfoxide (DMSO). After staining, cells were washed three times with PBS and observed under fluorescence microscopy.
  • Laser filters of 470/40 nm or 545/30 nm were used for electron excitation. Images were acquired with a 545 / 50nm 620 / 60nm emission filter.
  • FIG. 5 is a photograph (A, A ′) for undifferentiated 3T3-L1 cells, a compound staining picture (B, B ′) of Example 4 for differentiated 3T3-L1 cells and Nile for differentiated 3T3-L1 cells. Dye pictures of red (C, C ') are shown. The scale bar represents 100 ⁇ m at A and A 'and 20 ⁇ m at B, B', C and C '.
  • Example 4 (KR 68432) of the present invention stained the fat of differentiated 3T3-L1 cells with high sensitivity.
  • Nile Red compounds which are generally used for the fat staining used as comparative examples, also showed the fat staining effect of differentiated 3T3-L1 cells, but the image obtained by staining the compound of Example 4 (KR 68432) of the present invention was It appeared more clear and specific.
  • FIG. 6 is a photograph of various kinds of cells stained with the compound of Example 4 (KR 68432) of the present invention.
  • a and A 'are Mouse embryonic fibroblast cell line (NIH3T3) cell lines B and B' are human melanoma cell line (CHL-1) cells, C and C 'are human colon cancer cell line (HT29) cell lines, D and D' Is a human breast adenocarcinoma cell line (MCF7) cell line, E and E 'is a LLC-PK1 (Porcine kidney cell line) cell line, F and F' is a human prostate cancer cell line (PC3) cell line, and G and G 'is a HepG2 (Human liver carcinoma cell line) cell line. Scale bars represent 100 ⁇ m.
  • Cells were LipidTOX, a compound for detecting phosphate lipids in propranolol (30 ⁇ M).
  • TM phospholipid
  • Cyclosporin A (30 ⁇ M) was used as a positive control (50 ⁇ L / well).
  • the cells were cultured under normal culture conditions for a period of time capable of exhibiting the effect of the compound of Example 4 above. Then, formaldehyde / Hoechst 33342 fixed solution (100 ⁇ L) was added to each well and incubated at room temperature for 30 minutes. After removing the fixed solution, the cells were observed under a fluorescence microscope.
  • LipidTOX TM neutral lipid
  • a compound for neutral lipid detection 100 ⁇ L was added to each well. After incubation for 30 minutes at room temperature, cells were observed.
  • Lipids are a mixture of triglycerides and phospholipids.
  • LipidTOX TM phospholipid
  • LipidTOX TM neutral lipid
  • Example 4 of the present invention was incubated together, and the results are shown in FIG. 7.
  • the HepG2 cells were incubated with neutral fat or phospholipid specific staining reagent (LipidTOX TM ), which was purchased commercially.
  • the compound of Example 4 of the present invention can be combined with LipidTOX TM, and in particular, it can be seen that it overlaps with red staining of LipidTOX TM for neutral fat staining. Arrows in FIG. 7 indicate overlapping dyed triglyceride sites. Therefore, the compound of Example 4 of the present invention was found to specifically stain the neutral fat. Scale bars represent 100 ⁇ m.
  • HepG2 cells were exposed to excess fat. Cells were incubated for 72 hours with 2% alcohol, 10 ⁇ M amiodarone, 50 ⁇ M tetracycline and 5 ⁇ M tamoxifen. After the compound treatment, 10 ⁇ M of the compound of Example 4 and 40 ⁇ g / ml BODIPY 493/503 were treated for 30 minutes. The compound was then diluted to obtain the desired final concentration, the final DMSO concentration in the culture medium did not exceed 1% and the transport sample was treated with the same amount of DMSO. Laser filters of 470/40 nm or 493/30 nm were used for electron excitation. Images were acquired with a 545 / 50nm 503 / 60nm emission filter.
  • the above results show that the adipose tissue can be effectively stained using the 3-indolinone derivatives according to the present invention, and thus the derivatives of the present invention are useful for biodiagnosis, fat control substances, or for studying biological phenomena.
  • the derivatives of the present invention are useful for biodiagnosis, fat control substances, or for studying biological phenomena.
  • Example 1 In order to use the compound of Example 1 in the screening of candidate drugs, screening was performed using a DGAT1 inhibitor as a candidate drug.
  • DGAT1 is a potential target for treating metabolic syndromes such as diabetes and obesity.
  • Microsomal enzyme catalyzes the esterification reaction of 1,2-diacylglycerol with fatty acyl CoA to form triglycerides.
  • DGAT1 knockout mice express reduced levels of triacylglycerides, which are the major components of fat. Recent studies have shown that small molecule DGAT-1 inhibitors have the effect of reducing the amount and weight of triacylglycerides.
  • Example 1 KR 68425, lipid green
  • PF04620110 clinical phase 1 in progress
  • PF04620110-exposed zebrafish was stained with the compound of Example 1. The results are shown in FIG.
  • the fat of the control zebrafish stained with the compound lipid green (Example 1) of the present invention was confirmed to disappear by treatment with the candidate drug PF04620110 (see B). Therefore, as expected, it was confirmed through fat-specific staining of the compound of Example 1 that the fat of zebrafish was significantly reduced due to the treatment of PF04620110.
  • FIG. 11 is a graph showing the fat accumulation amount by measuring its fluorescence sensitivity. Referring to FIG. 11, it can be seen that fluorescence was reduced due to the treatment of the candidate drug PF04620110, and the amount of fat reduction can be quantitatively inferred through the relative decrease in fluorescence.

Abstract

본 발명은 신규한 3-인돌리논 유도체 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 이는 특히 지방을 선택적으로 형광염색할 수 있어 생체 진단시약으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 3-인돌리논 유도체 및 이를 포함하는 조성물
본 발명은 신규한 3-인돌리논 유도체 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
분자영상(molecular imaging)은 세포 또는 생체 내에서 일어나는 분자 수준의 변화, 즉 생화학적, 생물학적 변화를 감지하고 이를 영상화하는 기술로서, 복잡한 생명현상을 이해하고 질병의 조기진단 등을 위해서 살아있는 세포를 직접 관찰할 수 있는 방법이다.
한편, 저분자 형광물질은 화학적 생물학(chemical biology) 분야에서 절대적으로 필요한 연구 수단으로서, 이들은 다양한 곳에서 생분자 라벨(biomolecular labels), 효소 기질(enzyme substrates), 환경 지표(environmental indicators), 그리고 세포내 착색체(cellular stains) 등으로 작용한다. 그리하여, 저분자 형광물질은 세포내의 생명 현상을 실시간으로 이미징할 수 있는 것으로 알려져 있다.
저분자 형광물질을 이용하여 세포를 형광염색할 경우 방사능 물질로 인해 발생하는 위험이 없고, 감도가 뛰어나며, 감지 시간이 짧고, 비침습적이라는 장점이 있어, 세포 형광염색용 저분자 형광물질에 대한 연구가 국내외 연구진에 의해서 다양하게 진행되어 왔다. 지금까지 알려진 형광물질들을 도 1에 분류하여 나타내었으며, 이들의 발광 특성을 구체적으로 정리하면 다음과 같다:
가장 먼저 발견된 저분자 형광물질은 퀴닌(quinine)인데, 퀴닌은 λmax = 347 nm, λem = 448 nm, e = 5.4 x 103 M-1cm-1, F = 0.55를 나타낸다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-FIGURE-6
천연 아미노산 중에서는 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 등이 형광성을 내는데, 이중 트립토판이 가장 형광성 있는 화합물이다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-8
피렌-유도된 분자는 형광 프로브(fluorescent probe)로 이용되고 있다. 피렌은 λmax = 340 nm, λem = 376 nm, e = 4.3 x 104 M-1cm-1, F = 0.75를 나타낸다. 페릴렌(perylene)은 좋은 양자 수율(quantum yield)을 보여주는 물질이지만 물에서 이용되기 어렵다는 단점을 갖는다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-10
또한 안트라센(anthracene)과 같은 또다른 폴리사이클릭 방향족 분자들도 유용한 형광 도구(fluorescent tool)로 이용되고 있다.
쿠마린(coumarins)은 형광체(fluorophore)이면서 약학물질(pharmaceuticals)이기도 하며, 이의 대표적인 예로는 7-하이드록시-4-메틸쿠마린 (즉, 4-메틸움벨리페론(methylumbelliferone): 4-MU)을 들 수 있다. 염기 조건하에서, 4-MU의 페놀레이트 형태(phenolate form)는 λmax = 360 nm, λem = 450 nm, e = 1.7 x 103 M-1cm-1, F = 0.63을 나타낸다. 또한 AMC의 경우도 유사한 스펙트럼 물성을 보여준다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-13
쿠마린의 경우 큰 스토크스 시프트(stokes shift)를 보여주는데, 이는 여기상태(excitation)에서 큰 쌍극자(dipole)의 변화와 용매 재조직(solvent reorganization)에 의한 에너지 손실(energy loss)에 의한 것이며, 3,4-위치에 치환체가 붙은 화합물의 유용한 생분자 프로브(biomolecular probe)로 이용되고 있다.
인돌 및 이미다졸: 전통적인 인돌 유도체는 트립토판이다. 이후에 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 도 1에서 12)이 DNA의 작은 그루브(minor groove)에 결합하고 이는 DNA를 염색하는 데에 유용하게 이용되고 있다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-16
또한, 디벤즈이미다졸 염료는 Hoechst AG에서 개발되어 유용한 DNA-결합 프로브로 이용되고 있다. Hoechst 33342(도 1에서 13)의 경우 세포 침투성이 있어 살아있는 세포에서 이용이 가능하다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-18
4-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸(NBD)은 잘 알려진 저분자 헤테로사이클릭 형광체이다. NBD-Cl의 주요 아민 부가생성물(예컨대 도 1에서 14)은 녹색 영역의 빛을 방출한다. λmax = 465 nm, λem = 535 nm, e = 2.2 x 104 M-1cm-1, F = 0.3.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-20
잘 알려진 잔틴 염료 플루오레신(xanthenes dye fluorescein)(도 1에서 17)은 1871년 Bayer에 의해서 합성되었다. 플루오레신은 현재 생화학, 생물학, 그리고 의학 분야에서 가장 널리 이용되고 있는 형광체이다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-22
플루오레신은 수용액 중에서 몇 가지 재미있는 성질을 보여주며, 가장 생물학적으로 유용한 분자형태는 일가음이온(monoanion)과 이가음이온(dianion)이다. 이가음이온의 경우 λmax = 490 nm, λem = 514 nm, e = 9.3 x 104 M-1cm-1, F = 0.95을 나타낸다. 플루오레신은 "닫힌(closed)" 락톤형(lactone form)과 "열린(open)" 퀴노이드형(quinoid form)으로 존재한다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-24
로다민(rhodamine)은 플루오레신의 동급체(isologue)로서 널리 이용되는 형광체이며, 대표적으로 Rh118은 λmax = 496 nm, λem = 517 nm, e = 7.4 x 104 M-1cm-1, F = 0.92를 나타낸다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-26
테트라메틸로다민(TMR, 도 1에서 19)은 긴 여기 및 방출 파장(λmax = 540 nm, λem = 565 nm)을 나타내고 보통의 양자수율(F = 0.68)을 나타낸다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-28
설포로다민(sulforhodamine) 101 (SRh101, 도 1에서 20)은 줄로리딘계 염료로서 높은 양자수율을 보여주며, Texas red라는 상표로서 판매되고 있다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-30
페난트리딘(phenanthridine) 유도체는 높은 형광강도(fluorescence intensity)를 가지고 핵산(nucleic acid)과 결합함으로써 DNA 인터칼레이터(intercalator)로서 널리 이용된다. 대표적으로 프로피디움(propidium, 도 1에서 23)이 있다. 이는 DNA 존재하에서 λmax = 535 nm, λem = 617 nm, e = 5.4 x 103 M-1cm-1, F = 0.13를 나타내며, 이 강도는 자유로운(free) 상태보다 20-30배 증가된다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-32
보론 디플루오라이드 디피로메텐(boron difluoride dipyrromethene(BODIPY), 도 1에서 24)은 플루오레신과 유사한 파라미터(parameter)를 나타낸다 (λmax = 505 nm, λem = 511, e = 9.1 x 104 M-1cm-1, F = 0.94). 대표적으로 BODIPY-FL가 알려져 있다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-34
"시아닌 염료(cyanine dye)"는 2개의 질소 사이에 폴리메틴 결합(polymethine chain)을 가진 것을 의미한다 (R2N-(CH=CH)n-CH=N+R2). Cy3 (도 1에서 26)은 λmax = 554 nm, λem = 568, e = 1.3 x 105 M-1cm-1, F = 0.14를 나타내며, 이는 TMR과 유사한 성질을 보인다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-36
Cy5 (도 1에서 27)은 긴 파장을 보여주며, λmax = 652 nm, λem = 672, e = 2.0 x 105 M-1cm-1, F = 0.18 을 나타낸다. 또한 Cy7 (도 1에서 28)은 더욱 긴 파장(λmax = 755 nm, λem = 788)과 낮은 양자수율(F = 0.02)을 나타낸다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-38
치환된 옥사진 화합물은 유용한 형광체이다. 리소루핀(resorufin, 도 1에서 30)은 λmax = 572 nm, λem = 585, e = 5.6 x 104 M-1cm-1, F = 0.74를 나타낸다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-40
이와 같이, 다양한 저분자 형광물질이 개발되어 다양한 생명현상을 규명하고 있지만, 무궁무진한 새로운 생명현상을 규명할 수 있는 저분자 형광물질에 대한 개발이 아직도 절실하게 요구되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 새로운 저분자 형광물질인 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 포함하는 대사증후군 치료 약물의 스크리닝 키트 및 이를 이용하는 대사증후군 치료 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
하기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 제공한다:
화학식 1
Figure PCTKR2011009597-appb-C000001
화학식 2
Figure PCTKR2011009597-appb-C000002
R1은 수소, C1-6 알콕시, C1-4 알킬로 치환되거나 치환되지 않은 C2-6 알케닐옥시, 벤질옥시 또는 C1-4 알콕시페닐이고;
R2는 C1-6 알킬이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-4 알킬로 치환되거나 치환되지 않은 C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 벤질 또는 C3-6 사이클로알킬메틸이고;
R5는 C1-6 알킬, C1-4 알킬로 치환되거나 치환되지 않은 C2-6 알케닐 또는 C3-6 사이클로알킬메틸이다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 형광염색용 조성물, 지질검출용 키트, 대사증후군 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 포함하는 대사증후군 치료 약물의 스크리닝 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염 및 후보 약물을 동물 모델에 투여하는 단계; 및 상기 동물의 생체 형광 이미지를 분석하는 단계를 포함하는 대사증후군 치료 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염은 특히 지방을 선택적으로 형광염색할 수 있어 생체 진단시약으로 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 신규한 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 포함하는 조성물을 신약개발을 위해 지방 조절 화합물을 발굴하는 스크리닝(screening) 작업에 응용하고 생물학적 현상을 연구하는 데에 유용하게 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염은 지방만을 특이적으로 높은 민감도로 염색하는 특성이 있어, 이를 통해 발생하는 형광 강도를 측정하여 광학적 방법으로 지방의 양을 확인할 수 있다. 이 방법은 수술이나 조직의 추출 없이도 가능하므로, 실험용 동물의 불필요한 희생을 막을 수 있으며, 생체 내에서 지방조직의 이동 및 생성, 소멸을 장기간 동안 관찰할 수 있다. 따라서 본 발명의 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 포함하는 스크리닝 키트는 대사증후군 치료 약물의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 종래의 형광물질들을 분류하여 구조식으로 나타낸 도면이고,
도 2는 실험예 1에서 분화 전 및 분화 후 세포를 형광현미경으로 관찰한 사진이고,
도 3은 실험예 2에서 염색 후 시간 경과에 따른 제브라피쉬 지방세포분화를 형광현미경으로 관찰한 사진이고,
도 4는 실험예 2에서 염색 후 제브라피쉬의 기아상태에서의, 그리고 먹이 재공급에 따른 지방 조직의 변화를 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 5는 실시예 4의 화합물을 통한 미분화된 3T3-L1 세포에 대한 사진 (A, A'), 분화된 3T3-L1 세포에 대한 실시예 4의 화합물 염색 사진(B, B') 및 분화된 3T3-L1 세포에 대한 Nile Red의 염색 사진(C, C')를 나타낸다.
도 6은 실시예 4의 화합물(KR 68432)에 의해 염색된 다양한 종류의 세포에 대한 사진이다.
도 7은 실시예 4의 화합물(KR 68432)과 LipidTOXTM 와의 비교염색 결과 사진이다.
도 8은 실시예 4의 화합물(KR 68432)과 BODIPY 493/503와의 비교염색 결과 사진이다.
도 9는 실시예 4의 화합물(KR 68432)을 쥐에 경구투여 후 지방조직을 염색 정도를 관찰한 실험 결과 사진이다.
도 10은 제브라피쉬에 있어서 실시예 1의 화합물을 통한 DGAT1 저해제의 스크리닝 결과이다.
도 11은 형광 감소량을 통한 상기 DGAT1 저해제의 지방 감소 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
본원 명세서에서 사용되는 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에 언급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 하기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2011009597-appb-I000018
[화학식 2]
Figure PCTKR2011009597-appb-I000019
R1은 수소, C1-6 알콕시, C1-4 알킬로 치환되거나 치환되지 않은 C2-6 알케닐옥시, 벤질옥시 또는 C1-4 알콕시페닐이고;
R2는 C1-6 알킬이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-4 알킬로 치환되거나 치환되지 않은 C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 벤질 또는 C3-6 사이클로알킬메틸이고;
R5는 C1-6 알킬, C1-4 알킬로 치환되거나 치환되지 않은 C2-6 알케닐 또는 C3-6 사이클로알킬메틸이다.
본 발명의 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체에 있어서, 바람직하게는, 상기 R1은 수소, 메톡시, 알릴옥시, 벤질옥시 또는 메톡시페닐이고; 상기 R2는 메틸, 에틸 또는 이소프로필이고; 상기 R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸, 프로필, 헥실, 알릴, 프로파길, 2-부테닐, 3-메틸부트-2-에닐, 벤질 또는 사이클로프로필메틸이고; 상기 R5는 메틸, 프로필, 알릴 또는 사이클로프로필메틸이다.
본 발명에 따른 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염 중 더욱 바람직한 화합물의 구체적인 예는 다음과 같다:
에틸 1,2-디알릴-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68425);
에틸 1,2-디알릴-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68426);
에틸 1,2-디((E)-부트-2-에닐)-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68429);
에틸 5-메톡시-1,2-비스(3-메틸부트-2-에닐)-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68432);
에틸 1-알릴-5-메톡시-2-(3-메틸부트-2-에닐)-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68433);
(E)-에틸 2-알릴-1-(부트-2-에닐)-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68434);
에틸 5-메톡시-3-옥소-1,2-디(프로프-2-이닐)인돌린-2-카복실레이트 (KR67705);
에틸 2-알릴-1-벤질-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68456);
에틸 3-(알릴옥시)-1-벤질-5-메톡시-인돌-2-카복실레이트 (KR68457);
에틸 1,2-디벤질-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68458);
에틸 2-알릴-5-메톡시-1-메틸-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68459);
에틸 5-메톡시-1,2-디메틸-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68461);
에틸 3,5-디메톡시-1-메틸-1H-인돌-2-카복실레이트 (KR68462);
에틸 5-메톡시-3-옥소-1,2-디프로필인돌린-2-카복실레이트 (KR67703);
에틸 5-메톡시-3-프로필-1-프로필-인돌-2-카복실레이트 (KR67704);
에틸 1,2-디헥실-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR67796);
에틸 1,2-비스(사이클로프로필메틸)-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR67833);
에틸 1,2-디알릴-5-(4-메톡시페닐)-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR67718);
에틸 1,2-디알릴-5-(벤질옥시)-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR67738);
1,2-비스(사이클로프로필메틸)-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR67832); 및
에틸 1,2-디알릴-5-(알릴옥시)-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR67834).
본 발명에 따른 화학식 1 또는 2의 3-인돌리논 유도체는 예컨대 하기 반응식 1 내지 6으로 표시되는 합성경로에 따라 제조할 수 있다. 이때, 반응식 1은 치환체 R3과 R4가 동일한 경우이다:
[반응식 1]
Figure PCTKR2011009597-appb-I000020
시약 및 조건: (a) H2SO4 촉매, EtOH, 환류; (b) POCl3, DMF; (c) mCPBA, p-TSA, CH2Cl2; (d) R3-I(또는 R4-I), K2CO3, 아세톤, 환류 10hr.
상기 식에서,
R3 및 R4는 화학식 1 및 2에서 정의한 바와 같으나 서로 동일한 치환체이다.
반응식 1에서는, 5-메톡시-1H-인돌-2-카복실산을 H2SO4 촉매를 사용하여 에스터화 반응시켜 에스터를 형성한 후, 이를 DMF, POCl3로 포밀화시키고, 이를 mCPBA로 산화 시켜 3-하이드록시인돌 유도체를 만들고, 이를 다양한 친전자체(electrophile)와 반응시켜 목적하는 3-인돌리논 유도체를 합성할 수 있다. 반응식 1에 의해 제조되는 본 발명 화합물의 일례에 대하여 구조 및 물성을 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
Figure PCTKR2011009597-appb-T000001
반응식 2는 치환체 R3과 R4가 상이한 경우이다.
[반응식 2]
Figure PCTKR2011009597-appb-I000021
상기 식에서,
R3 및 R4는 화학식 1 및 2에서 정의한 바와 같으나 서로 상이한 치환체이다.
반응식 2에서는, 인돌의 1번 위치의 질소와 2번 위치의 탄소에 치환된 치환기의 효과를 보기 위해서, 2번 위치의 탄소가 치환된 인돌로부터 K2CO3와 아세토니트릴 환류 조건에서 목적하는 유도체를 합성할 수 있다. 반응식 2에 의해 제조되는 본 발명 화합물의 일례에 대하여 구조 및 물성을 하기 표 2에 나타내었다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
표 2
Figure WO-DOC-TABLE-119
[반응식 3]
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-121
시약 및 조건: (a) TBDPSCl, 이미다졸, THF, 환류 5hr; (b) NaH, 프로파길 브로마이드, DMF, 환류 3hr; (c) TBAF, CH2Cl2, 환류, 2hr; (d) 프로파길 브로마이드, K2CO3, 아세톤, 환류 10hr.
반응식 3에서는, 3번 위치의 OH 작용기를 TBDPS로 보호하고 질소를 먼저 치환한 후 2번 위치의 탄소에 치환기를 도입함으로써 보다 좋은 수득률을 얻을 수 있다. 반응식 3에 의해 제조되는 본 발명 화합물의 일례에 대하여 구조 및 물성을 하기 표 3에 나타내었다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
표 3
Figure WO-DOC-TABLE-124
[반응식 4]
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-126
시약 및 조건: (a) R3-Br, NaH, DMF; (b) Pd(OAc)2, PhI(OAc)2, 아세트산, 환류; (c) 소듐 tert-부톡사이드, K2CO3, MeOH, THF; (d) R4-Br 또는 R5-Br, K2CO3, 아세톤, 환류.
상기 식에서,
R3, R4 및 R5는 화학식 1 및 2에서 정의한 바와 같다.
반응식 4에서는, 에틸 5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트에서 NaH를 사용하여 DMF 실온 조건에서 질소에 치환기를 도입한 후, 이를 Pd(OAc)2 및 PhI(OAc)2와 아세트산 환류조건으로 반응시켜 3번 탄소에 OAc를 형성한 다음, 소듐 tert-부톡사이드를 사용하여 하이드록시화하고 3번 탄소에 알킬화 반응을 하여 목적하는 유도체를 합성할 수 있다. 반응식 4에 의해 제조되는 본 발명 화합물의 일례에 대하여 구조 및 물성을 하기 표 4에 나타내었다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
표 4
Figure WO-DOC-TABLE-131
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-TABLE-132
[반응식 5]
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-134
시약 및 조건: (a) H2SO4 촉매, EtOH, 환류; (b) POCl3, DMF; (c) mCPBA, p-TSA, CH2Cl2; (d) TBDPSCl, 이미다졸, THF, 환류 5hr; (e) 보론산, K3PO4, Pd(OAc)2, 트리-o-폴리포스핀, EtOH; (f) NaH, 알릴아이오다이드, DMF, 환류 3hr; (g) TBAF, CH2Cl2, 환류 2hr; (h) 알릴아이오다이드, K2CO3, 아세톤, 환류 10hr.
반응식 5에서는, 5번 위치의 치환기 효과를 보기 위하여 앞서 언급된 방법과 유사한 방법으로, 5-브로모-1H-인돌-2-카복실산의 3번 위치의 탄소의 OH 작용기를 TBDPS로 보호하고, 5번 위치의 브롬을 스즈키 반응(suzuki reaction)을 통해 4-메톡시페닐로 대신하고, 이를 알릴화 반응시켜 질소에 알릴기를 도입한 후 보호기를 제거하고 2번 탄소에 알릴기를 도입하여 목적하는 유도체를 합성할 수 있다. 반응식 5에 의해 제조되는 본 발명 화합물의 일례에 대하여 구조 및 물성을 하기 표 5에 나타내었다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
표 5
Figure WO-DOC-TABLE-137
[반응식 6]
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-139
시약 및 조건: (a) H2SO4 촉매, EtOH, 환류; (b) POCl3, DMF; (c) mCPBA, p-TSA, CH2Cl2; (d) TBDPSCl, 이미다졸, THF, 환류 5hr; (e) H2, Pd/C, MeOH, 2hr; (f) NaH, 알릴아이오다이드, DMF, 환류 3hr; (g) TBAF, CH2Cl2, 환류 2hr; (h) 알릴아이오다이드, K2CO3, 아세톤, 환류 10hr.
반응식 6에서는, 출발 물질로 5-벤질옥시인돌 유도체를 사용하여 앞서 언급된 방법과 유사한 방법으로 5번 위치를 변형한 목적하는 유도체를 합성할 수 있다. 반응식 6에 의해 제조되는 본 발명 화합물의 일례에 대하여 구조 및 물성을 하기 표 6에 나타내었다.
[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2012]　
표 6
Figure WO-DOC-TABLE-142
상기와 같은 방법에 의해 제조된 본 발명에 따른 화학식 1 또는 2의 3-인돌리논 유도체 및 그의 염은 특히 지방을 형광염색하는 능력이 탁월하여 생체 내 지방의 양, 부위 등을 정량 또는 정성 분석 할 수 있고, 생체 진단시약으로 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 형광염색용 조성물, 특히 지방 형광염색용 조성물을 제공한다. 이때, 화학식 1 또는 2의 3-인돌리논 유도체는 0.1 내지 100 μM, 바람직하게는 1 내지 100 μM의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 키트를 제공한다.
상기 키트는 상기 인돌리논 유도체와 시료 간의 반응을 파악하는데 사용되는 재료를 포함할 수 있다. 예를 들어, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질, 검출라벨 등을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 키트에는 분석을 수행하기 위한 사용설명서(예, 서면, 테이프, VCR, CD-ROM 등)가 포함될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 형광염색용 조성물 및 이를 포함하는 진단키트는 상기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체의 지방 특이적 염색 효과를 바탕으로 지질 검출 용도 또는 지방과 관련된 질환의 진단에 사용될 수 있다.
더욱 구체적으로 상기 지방과 관련된 질환으로는 대사증후군을 예로 들 수 있으며, 대사증후군으로는 비만, 고혈압, 동맥경화, 고지혈증, 간질환, 과인슐린혈증, 과혈당증, 1형 및 2형 당뇨병, 인슐린 내성을 특징으로 하는 이상지혈증, 발기부전, 심혈관계질환 및 허혈성질환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로 상기 간질환은 알코올성 및 비알콜성 간의 지질대사 이상으로 인한 지방간, 간염 및 간경화를 포함하며, 상기 이상지혈증은 비-에스테르화 지방산의 상당한 증가, 초저밀도 리포단백질, 트리글리세리드 풍부 입자의 증가, 높은 ApoB 수치, 작고 밀집된 저밀도 리포단백질 입자, 표현형 B의 존재시 높은 ApoB 수치 및 낮은 ApoA 입자 수치와 연관되는 낮은 고밀도 리포단백질 수치로 특징지어 진다. 또한 상기 심혈관계 질환에는 심근경색을 유발하는 다양한 내부기관의 매크로 혈관증, 심부전, 뇌혈관질병 및 말단 말초동맥부전이 포함된다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 포함하는 대사증후군 치료 약물의 스크리닝 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체는 특히 지방을 선택적으로 형광염색할 수 있는 바, 신약개발을 위해 지방 조절 화합물을 발굴하는 스크리닝(screening) 작업에 응용하고 생물학적 현상을 연구하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 키트는 상기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 이용하여 실험용 동물 모델의 생체 내에서 지방을 검출하고 대사증후군 치료 효과를 보일 것이라고 기대되는 후보 약물을 투약한 후에 이의 효과를 생체 내에서 실시간으로 확인함으로써 후보 약물을 스크리닝할 수 있는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염과 후보 약물을 통상의 투여 방식을 통해 실험용 동물 모델에 주입한 다음 소형 동물용 형광 촬영 장치를 통해 생체 형광 이미지를 얻고 형광 강도의 소광을 관찰하여 후보 약물을 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 대사증후군은 비만, 고혈압, 동맥경화, 고지혈증, 간질환, 과인슐린혈증, 과혈당증, 1형 및 2형 당뇨병, 인슐린 내성을 특징으로 하는 이상지혈증, 발기부전, 심혈관계질환 및 허혈성질환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로 상기 간질환은 알코올성 및 비알콜성 간의 지질대사 이상으로 인한 지방간, 간염 및 간경화를 포함하며, 상기 이상지혈증은 비-에스테르화 지방산의 상당한 증가, 초저밀도 리포단백질, 트리글리세리드 풍부 입자의 증가, 높은 ApoB 수치, 작고 밀집된 저밀도 리포단백질 입자, 표현형 B의 존재시 높은 ApoB 수치 및 낮은 ApoAⅠ 입자 수치와 연관되는 낮은 고밀도 리포단백질 수치로 특징지어 진다. 또한 상기 심혈관계 질환에는 심근경색을 유발하는 다양한 내부기관의 매크로 혈관증, 심부전, 뇌혈관질병 및 말단 말초동맥부전이 포함된다.
또한, 본 발명의 키트는 후보 약물의 종류, 투여 방식, 또는 투여 순서의 제한 없이 실시간으로 정량적으로 스크리닝 할 수 있는 특징이 있다. 따라서 후보 약물 및 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체의 선후관계에 관계 없이 정량적인 지방의 양 변화를 검출할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 본 발명의 키트는 대조군 시약(양성 및/또는 음성)과 함께 상기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체를 투여 형태로 제형화한 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 필요에 따라, 당-코팅된 정제, 캡슐제, 엘릭서제 및 마이크로캡슐제로서 경구투여될 수 있으며, 또는 물 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 액체를 가지는 멸균 용액 또는 현탁제의 주사제 형태로 비경구 투여될 수 있다.
또한, 상기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 매질(media), 구체적으로는 멸균수, 생리 식염수, 식물성 오일, 유화제, 현탁제, 계면 활성제, 안정제, 향신제, 부형제, 비히클(vehicle), 보존제, 결합제등과 혼합될수 있다. 상기 제제화에서 활성 성분의 양은 바람직한 범위 내에서 적절한 투여량으로 한다.
정제 및 캡슐제에 혼합될 수 있는 첨가제의 예는 젤라틴, 옥수수 녹말, 트라거캔스 고무 및 아라빅 고무와 같은 결합제; 크리스탈 셀룰로스와 같은 부형제; 옥수수 녹말, 젤라틴, 알긴산(alginic acid)과 같은 팽윤제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 설탕, 락토스 또는 사카린과 같은 감미제; 및 페퍼민트, 가울테리아 아데노쓰릭스(Gaultheria adenothrix) 오일 및 체리와 같은 향신제이다.
단위-투여 형태가 캡슐일 경우, 오일과 같은 액상 담체가 또한 추가로 상기의 성분에 포함될 수 있다. 주사제용 멸균 합성물들은 주사제에 사용된 멸균수와 같은 비히클을 사용하는 정상 약물 제조법에 따라 제형화될 수 있다. 생리 식염수, 글루코스, 및 D-솔비톨, D-만니톨, D-만노스, 및 염화 나트륨과 같은 보조제를 포함하는 다른 등장액이 주사제의 수용액으로 사용될 수 있다. 이는 알코올, 구체적으로는 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알코올, 폴리솔베이트 80(TM) 및 HCO-50과 같은 비-이온성 계면 활성제와 같은 적합한 용해제와 함께 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트에는 분석을 수행하기 위한 사용설명서(예, 서면, 테이프, VCR, CD-ROM 등)가 포함될 수 있다. 상기 키트의 분석 포맷은 당해 기술분야에 알려진 소형 동물용 형광 촬영 장치를 이용한 형광 이미지이다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염 및 후보 약물을 동물 모델에 투여하는 단계; 및 상기 동물의 생체 형광 이미지를 분석하는 단계를 포함하는 대사증후군 치료 약물의 스크리닝 방법을 제공한다:
본 발명의 대사증후군 치료 약물의 스크리닝 방법을 단계적으로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
제1단계는 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염 및 후보 약물을 동물 모델에 투여하는 단계이다.
상기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체는 통상의 제형으로 제조된 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 액제인 것이 좋으나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 후보약물 역시 통상의 제형으로 제조된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어 직접 주사를 위한 액제 형태, 경구 투여를 위한 캡슐제 등을 사용할 수 있으나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 투여는 직접 주사, 경구 투여, 혈관 주사 등 통상의 투여방식에 따라 실시될 수 있으며, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 후보 약물의 투여 순서는 제한 없이 사용될 수 있다.
또한, 상기 동물로 제브라피쉬, 생쥐, 집쥐, 기니피그, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 원숭이, 비비, 또는 침팬지 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 대사증후군 치료 약물의 스크리닝 방법에 있어서, 제2단계는 상기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체와 후보 약물이 투여된 동물에서 생체 내 형광 이미지를 얻고, 이를 분석하는 단계이다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 생체 내 형광 이미지는 분석 대상 동물 모델의 간에서 얻을 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 생체 내 형광 이미지는 소형 동물용 형광 촬영 장치를 이용하여 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 얻어진 형광 이미지로부터 형광 강도의 소광을 분석함으로써, 후보 약물이 대사증후군 치료에 효과가 있는지 여부를 판단할 수 있다.
본 발명의 상기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체는 지방 특이적으로 강한 형광을 나타내므로, 생체 내 지방의 양, 부위 등을 정량 또는 정성 분석 할 수 있고, 이를 감소시키는 후보 약물을 투여하는 경우, 생체 내 형광 감도가 감소함을 형광 이미징을 통해 확인할 수 있어, 지방의 양을 감소시키는 효과를 나타내는 후보 약물을 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 내지 4 : 5-메톡시-1H-인돌-2-카복실산으로부터 화합물 KR68425 내지 KR68432의 합성
실시예 1 : 에틸 1,2-디알릴-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68425)의 제조
[1-1단계] 에틸 5-메톡시인돌-2-카복실레이트
5-메톡시인돌-2-카복실산 (5g, 0.026mmole)을 EtOH (40mL)에 녹인 후 황산 (4ml), 환류조건에서 10시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결되면, 감압 농축하고 물에 녹인 후 2N-NaOH로 pH 7로 조절한 다음 EtOAc로 추출, 건조 (Na2SO4), 여과 및 감압 농축하여 표제의 화합물을 얻었다.
(황색 고체 5.5g, 96 %)
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.84 (bs, 1H), 7.30 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.14 (dd, J = 2.4 Hz, J = 1.0 Hz, 1H), 7.07 (d, J =2.4Hz, 1H), 6.99 (dd, J = 9.0Hz, 1H), 4.40 (q, J = 7.0Hz, 2H), 3.85 (s, 3H), 1.41(t, J = 7.0Hz, 3H); LC/MS(M+H): 220.
[1-2단계] 에틸 3-포밀-5-메톡시인돌-2-카복실레이트
에틸 5-메톡시인돌-2-카복실레이트 (4.8g, 21.9mmole)을 DMF (40mL)에 녹인 후 인 옥시클로라이드 (5.1ml, 54.75mmole)를 넣고 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결되면, 얼음을 첨가하여 2N-NaOH로 pH 7로 조절하고 30분간 교반한 후 생성된 고체를 여과하여 표제의 화합물을 얻었다.
(황색 고체 5g, 92 %)
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 10.73 (s, 1H), 9.25 (bs, 1H), 7.90 (d, J =2.4Hz, 1H), 7.60 (d, J = 9.0Hz, 1H), 7.07 (dd, J = 9.0Hz, J = 2.4Hz, 1H), 4.48 (q, J = 7.0Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 1.28 (t, J = 7.0Hz, 3H); LC/MS(M+H): 248.
[1-3단계] 에틸 3-히드록시-5-메톡시인돌-2-카복실레이트
에틸 3-포밀-5-메톡시인돌-2-카복실레이트 (5g, 0.02mole)를 CH2Cl2 (40mL)에 녹인 후 pTSA (3.8g, 0.02mole)와 mCPBA (7g, 0.03mole)를 넣고 실온에서 8시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결되면, 감압 농축하고 물에 녹인 후 EtOAc로 추출, 건조 (Na2SO4), 여과, 감압 농축한 다음 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다.
(황색 고체 4.6g, 88 %)
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.70 (bs, 1H), 7.18 (d, J = 9.0Hz, 1H), 7.10 (d, J = 2.4Hz, 1H), 7.00 (dd, J = 9.0Hz, J = 2.4Hz, 1H), 4.44 (q, J = 7.0Hz, 2H), 3.85 (s, 3H), 1.41 (t, J = 7.0Hz, 3H); LC/MS(M+H): 236.
[1-4단계] 에틸 1,2-디알릴-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68425)
에틸 3-히드록시-5-메톡시인돌-2-카복실레이트 (100mg, 0.37mmole)를 아세톤 (5mL)에 녹인 후 K2CO3 (235mg, 1.85mmole)와 알릴 아이오다이드 (0.2ml, 1.85mmole)에 넣고 환류조건에서 5시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결되면, 감압 농축하고 물에 녹인 후 EtOAc로 추출, 건조 (Na2SO4), 여과, 감압 농축한 다음 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다.
(갈색 액체 15mg, 12 %)
LC/MS(M+H): 236.
실시예 2 : 에틸 1,2-디알릴-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68426)의 제조
에틸 3-히드록시-인돌-2-카복실레이트 (50mg, 0.24mmole)를 아세톤 (5mL)에 녹인 후 K2CO3 (610mg, 50.8mmole)와 알릴 브로마이드 (589mg, 50.8mmole)를 넣고 환류조건에서 5시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결되면, 감압 농축하고 물에 녹인 후 EtOAc로 추출, 건조 (Na2SO4), 여과, 감압 농축한 다음 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다.
(갈색 액체 22mg, 32 %)
LC/MS(M+H): 286.
실시예 3 : 에틸 1,2-디((E)-부트-2-에닐)-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68429)의 제조
에틸 3-히드록시-5-메톡시인돌-2-카복실레이트 (100mg, 0.42mmole)를 아세톤 (10mL)에 녹인 후 K2CO3 (534mg, 6.3mmole)와 크로틸 브로마이드 (0.65ml, 4.2mmole)를 넣고 환류조건에서 5시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결되면, 감압 농축하고 물에 녹인 후 EtOAc로 추출, 건조 (Na2SO4), 여과, 감압 농축한 다음 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다.
(갈색 액체 15mg, 11 %)
LC/MS(M+H): 344.
실시예 4 : 에틸 5-메톡시-1,2-비스(3-메틸부트-2-에닐)-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68432)의 제조
에틸 3-히드록시-5-메톡시인돌-2-카복실레이트 (500mg, 2.12mmole)를 아세토니트릴 (10mL)에 녹인 후 K2CO3 (1.3g, 10.6mmole)와 디메틸알릴 브로마이드 (1.2ml, 10.6mmole)를 넣고 환류조건에서 5시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결되면, 감압 농축하고 물에 녹인 후 EtOAc로 추출, 건조 (Na2SO4), 여과, 감압 농축한 다음 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다.
(갈색 액체 7mg, 1 %)
LC/MS(M+H): 372.
에틸 5-메톡시-2-(3-메틸부트-2-에닐)-3-옥소인돌린-2-카복실레이트로부터 화합물 KR68433의 합성
실시예 5 : 에틸 1-알릴-5-메톡시-2-(3-메틸부트-2-에닐)-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68433)의 제조
에틸 5-메톡시-2-(3-메틸부트-2-에닐)-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (100mg, 0.32mmole)를 아세토니트릴 (10mL)에 녹인 후 K2CO3 (419mg, 3.2mmole)와 알릴 브로마이드 (0.3ml, 3.2mmole)를 넣고 환류조건에서 5시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결되면, 감압 농축하고 물에 녹인 후 EtOAc로 추출, 건조 (Na2SO4), 여과, 감압 농축한 다음 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다.
(갈색 액체 10mg, 8 %)
LC/MS(M+H): 344.
에틸 2-알릴-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트로부터 화합물 KR68434의 합성
실시예 6 : (E)-에틸 2-알릴-1-(부트-2-에닐)-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68434)의 제조
에틸 2-알릴-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (100mg, 0.36mmole)를 아세토니트릴 (10mL)에 녹인 후 K2CO3 (229mg, 1.8mmole)와 크로틸 브로마이드 (0.19ml, 1.8mmole)에 넣고 환류조건에서 5시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결되면, 감압 농축하고 물에 녹인 후 EtOAc로 추출, 건조 (Na2SO4), 여과, 감압 농축한 다음 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다.
(갈색 액체 18mg, 21 %)
LC/MS(M+H): 330.
실시예 7 내지 17 : 에틸 5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트로부터 화합물 KR68456 내지 KR67833의 합성
[7-1단계] ① 에틸 1-벤질-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트
에틸 5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트 (1g, 4.56mmole)를 DMF (20mL)에 녹인 후 NaH(218mg, 9.12mmole)을 넣고 벤질 브로마이드 (1ml, 9.12mmole)를 천천히 첨가하여 실온에서 5시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결되면, NHCl4 첨가 후 EtOAc로 추출, 건조 (Na2SO4), 여과, 감압 농축한 다음 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다.
(황색 고체 1.2g, 85 %)
1H NMR (300 MHz, CDCl3) 7.38-7.18 (m, 5H), 7.08 (d, J = 2.4Hz, 1H), 7.03-7.01 (m, 2H), 6.96 (dd, J = 9.0Hz, J = 2.4Hz, 1H), 5.81 (s, 2H), 4.32 (q, J = 7.1Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 1.32 (t, J = 7.1Hz, 3H); LC/MS(M+H): 310.
② 에틸 5-메톡시-1-메틸인돌-2-카복실레이트
벤질 브로마이드 대신에 메틸 브로마이드를 사용하여 [7-1단계]의 ①과 동일한 방법으로 표제 화합물을 수율 66 %로 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.29-7.25 (m, 2H), 7.05-7.00 (m, 2H), 4.37 (q, J = 7.0Hz, 2H), 4.04 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 1.40 (t, J = 7.0Hz, 3H); LC/MS(M+H): 234.
③ 에틸 5-메톡시-1-프로필-1H-인돌-2-카복실레이트
벤질 브로마이드 대신에 프로필 브로마이드를 사용하여 [7-1단계]의 ①과 동일한 방법으로 표제 화합물을 수율 85 %로 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) 7.28 (d, J = 9.0Hz, 1H), 7.20 (s, 1H), 7.04 (d, J = 2.2Hz, 1H), 7.00 (dd, J = 9.0Hz, J = 2.2Hz, 1H), 4.49 (t, J = 7.1Hz, 2H), 4.36 (q, J = 7.1Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 1.84-1.77 (m, 2H), 1.40 (t, J = 7.1Hz, 2H), 0.92 (t, J = 7.1Hz 3H); LC/MS(M+H): 262.
④ 에틸 1-헥실-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트
벤질 브로마이드 대신에 헥실 브로마이드를 사용하여 [7-1단계]의 ①과 동일한 방법으로 표제 화합물을 수율 95 %로 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) 7.27 (d, J = 9.0Hz, 1H), 7.20 (s, 1H), 7.05 (d, J = 2.4Hz, 1H), 7.00 (dd, J = 9.0Hz, J=2.4Hz, 1H), 4.51 (t, J = 7.1Hz, 2H), 4.35 (q, J = 7.1Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 1.79-1.74 (m, 2H), 1.40 (t, J = 7.1Hz, 3H), 1.35-1.30 (m, 6H), 0.91-0.84 (m, 3H); LC/MS(M+H): 304.
⑤ 에틸 1-사이클로프로필메틸-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트
벤질 브로마이드 대신에 사이클로프로필메틸 브로마이드를 사용하여 [7-1단계]의 ①과 동일한 방법으로 표제 화합물을 얻었다.
[7-2단계] ① 에틸 3-아세톡시-1-벤질-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트
에틸 1-벤질-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트 (500mg, 1.61mmole)를 아세트산 (20mL)에 녹인 후 아이오도벤젠 디아세테이트 (777mg, 2.41mmole)과 팔라듐(Ⅱ) 아세테이트 (18mg, 5%mol)를 넣고 환류조건에서 1시간 30분 동안 교반시켰다. 반응이 종결되면, EtOAc을 첨가하여 추출, 염수로 2회 씻어주고 건조 (Na2SO4), 여과, 감압 농축한 다음 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다.
(고체 221mg, 38 %)
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.27-7.19 (m, 5H), 7.04-7.01 (m, 1H), 6.97 (dd, J = 9.1Hz, J = 2.4Hz, 1H), 6.87 (d, J = 2.4Hz, 1H), 5.76 (s, 2H), 4.29 (q, J = 7.1Hz, 2H), 3.83 (s, 3H), 2.42 (s, 3H), 1.28 (t, J = 7.1Hz, 3H); LC/MS(M+H): 368.
② 에틸 3-아세톡시-5-메톡시-1-메틸인돌-2-카복실레이트
에틸 1-벤질-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트 대신에 에틸 5-메톡시-1-메틸인돌-2-카복실레이트를 사용하여 [7-2단계]의 ①과 동일한 방법으로 표제 화합물을 수율 66 %로 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.27 (d, J = 9.0Hz, 1H), 7.02 (dd, J = 9.0Hz, J = 2.4Hz, 1H), 6.84 (d, J = 2.4Hz, 1H), 4.35 (q, J = 7.0Hz, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 2.42 (s. 3H), 1.37 (t, J = 7.0Hz, 3H); LC/MS(M+H): 292.
③ 에틸 3-아세톡시-5-메톡시-1-프로필-1H-인돌-2-카복실레이트
에틸 1-벤질-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트 대신에 에틸 5-메톡시-1-프로필-1H-인돌-2-카복실레이트를 사용하여 [7-2단계]의 ①과 동일한 방법으로 표제 화합물을 수율 72 %로 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.27 (d, J = 9.0Hz, 1H), 7.01 (dd, J = 9.0Hz, J = 2.2Hz, 1H) 6.83 (d, J = 2.2Hz, 1H), 4.44 (t, J = 7.1Hz, 2H), 4.34 (q, J = 7.1Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 2.40 (s, 3H), 1.84-1.77 (m, 2H), 1.38 (t, J = 7.1Hz, 2H), 0.92 (t, J = 7.1Hz 3H); LC/MS(M+H): 320.
④ 에틸 3-아세톡시-1-헥실-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트
에틸 1-벤질-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트 대신에 에틸 1-헥실-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트를 사용하여 [7-2단계]의 ①과 동일한 방법으로 표제 화합물을 수율 50 %로 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.27 (d, J = 9.0Hz, 1H), 7.01 (dd, J = 9.0Hz, J = 2.2Hz, 1H) 6.84 (d, J = 2.2Hz, 1H), 4.46 (t, J = 7.1Hz, 2H), 4.34 (q, J = 7.1Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 2.40 (s, 3H), 1.78-1.73 (m, 2H), 1.38 (t, J = 7.1Hz, 2H), 1.30-1.26 (m, 6H), 0.89-0.84 (m, 2H); LC/MS(M+H): 362.
⑤ 에틸 3-아세톡시-1-(사이클로프로필메틸)-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트
에틸 1-벤질-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트 대신에 에틸 1-사이클로프로필메틸-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트를 사용하여 [7-2단계]의 ①과 동일한 방법으로 표제 화합물을 수율 97 %로 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.28 (d, J = 9.0Hz, 1H), 7.00 (dd, J = 9.0Hz, J = 2.2Hz, 1H) 6.84 (d, J = 2.2Hz, 1H), 4.42 (d, J = 6.7Hz, 2H), 4.32 (q, J = 7.1Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 2.41 (s, 3H), 1.27 (t, J = 7.1Hz, 3H), 1.30-1.26 (m, 1H), 0.50-0.37 (m, 4H); LC/MS(M+H): 332.
[7-3단계] ① 에틸 1-벤질-3-하이드록시-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트
에틸 3-아세톡시-1-벤질-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트 (210mg, 0.59mmole)를 MeOH/THF (10mL)에 녹인 후 K2CO3 (73mg, 0.59mmole)를 넣고 실온에서 30분 동안 교반시켰다. 반응이 종결되면, 농축하고 물을 첨가하여 EtOAc로 추출, 염수로 2회 씻어주고 건조 (Na2SO4), 여과, 감압 농축한 다음 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다.
(고체 112g, 60 %)
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.25-6.95 (m, 5H), 7.01 (dd, J = 9.1Hz, J = 2.6Hz, 1H), 6.98-6.95 (m, 2H), 5.54 (s, 2H), 4.35 (q, J = 7.1Hz, 2H), 3.85 (s, 3H), 1.27 (t, J = 7.1Hz, 3H); LC/MS(M+H): 326.
② 에틸 3-하이드록시-5-메톡시-1-메틸인돌-2-카복실레이트
에틸 3-아세톡시-1-벤질-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트 대신에 에틸 3-아세톡시-5-메톡시-1-메틸인돌-2-카복실레이트를 사용하여 [7-3단계]의 ①과 동일한 방법으로 표제 화합물을 수율 91 %로 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.58 (bs, 1H), 7.18-7.15 (m, 1H), 7.10-7.08 (m, 1H), 7.06-7.02 (m, 1H), 4.49 (q, J = 7.0Hz, 2H), 3.85 (s, 3H), 1.45 (t, J = 7.0Hz, 3H); LC/MS(M+H): 250.
③ 에틸 3-하이드록시-5-메톡시-1-프로필-1H-인돌-2-카복실레이트
에틸 3-아세톡시-1-벤질-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트 대신에 에틸 3-아세톡시-5-메톡시-1-프로필-1H-인돌-2-카복실레이트를 사용하여 [7-3단계]의 ①과 동일한 방법으로 표제 화합물을 수율 90 %로 얻었다.
④ 에틸 3-하이드록시-1-헥실-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트
에틸 3-아세톡시-1-벤질-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트 대신에 에틸 3-아세톡시-1-헥실-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트를 사용하여 [7-3단계]의 ①과 동일한 방법으로 표제 화합물을 수율 80 %로 얻었다.
⑤ 에틸 1-(사이클로프로필메틸)-3-하이드록시-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트
에틸 3-아세톡시-1-벤질-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트 대신에 에틸 3-아세톡시-1-(사이클로프로필메틸)-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트를 사용하여 [7-3단계]의 ①과 동일한 방법으로 표제 화합물을 수율 91 %로 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.65 (bs, 1H), 7.17 (d, J = 9.0Hz, 1H), 7.10 (d, J = 2.4Hz, 1H), 7.02 (dd, J = 9.0Hz, J = 2.4Hz, 1H), 4.46 (q, J = 7.1Hz, 2H), 4.23 (d, J = 6.7Hz, 2H), 3.85 (s, 3H), 1.44 (t, J = 7.1Hz, 3H), 1.25-1.14 (m, 1H), 0.47-0.28 (m, 4H); LC/MS(M+H): 290.
[7-4단계]
실시예 7 : 에틸 2-알릴-1-벤질-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68456)의 제조
에틸 1-벤질-3-하이드록시-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트 (100mg, 0.3mmole)를 아세톤 (10mL)에 녹인 후 K2CO3 (190mg, 1.5mmole)와 알릴 아이오다이드 (0.16ml, 1.5mole)에 넣고 환류조건에서 5시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결되면, 감압 농축하고 물에 녹인 후 EtOAc로 추출, 건조 (Na2SO4), 여과, 감압 농축한 다음 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다.
(갈색 액체 62mg, 61 %)
LC/MS(M+H): 366.
실시예 8 : 에틸 3-(알릴옥시)-1-벤질-5-메톡시-인돌-2-카복실레이트 (KR68457)의 제조
실시예 7의 방법의 또다른 생성물로 표제 화합물을 수율 5 %로 얻었다.
LC/MS(M+H): 366.
실시예 9 : 에틸 1,2-디벤질-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68458)의 제조
알릴 아이오다이드 대신에 벤질 아이오다이드를 사용하여 실시예 7과 동일한 방법으로 표제 화합물을 수율 42 %로 얻었다.
LC/MS(M+H): 416.
실시예 10 : 에틸 2-알릴-5-메톡시-1-메틸-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68459)의 제조
에틸 1-벤질-3-하이드록시-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트 대신에 에틸 3-하이드록시-5-메톡시-1-메틸인돌-2-카복실레이트를 사용하여 실시예 7과 동일한 방법으로 표제 화합물을 수율 52 %로 얻었다.
LC/MS(M+H): 290.
실시예 11 : 에틸 5-메톡시-1,2-디메틸-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR68461)의 제조
알릴 아이오다이드 대신에 메틸 아이오다이드를 사용하여 실시예 10과 동일한 방법으로 표제 화합물을 수율 61 %로 얻었다.
LC/MS(M+H): 264.
실시예 12 : 에틸 3,5-디메톡시-1-메틸-1H-인돌-2-카복실레이트 (KR68462)의 제조
실시예 11의 방법의 또다른 생성물로 표제 화합물을 수율 33 %로 얻었다.
LC/MS(M+H): 264.
실시예 13 : 에틸 5-메톡시-3-옥소-1,2-디프로필인돌린-2-카복실레이트 (KR67703)의 제조
에틸 1-벤질-3-하이드록시-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트 대신에 에틸 3-하이드록시-5-메톡시-1-프로필-1H-인돌-2-카복실레이트를 사용하고 알릴 아이오다이드 대신에 프로필 아이오다이드를 사용하여 실시예 7과 동일한 방법으로 표제 화합물을 수율 4 %로 얻었다.
LC/MS(M+H): 264.
실시예 14 : 에틸 5-메톡시-3-프로폭시-1-프로필-인돌-2-카복실레이트 (KR67704)의 제조
실시예 13의 방법의 또다른 생성물로 표제 화합물을 수율 64 %로 얻었다.
LC/MS(M+H): 264.
실시예 15 : 에틸 1,2-디헥실-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR67796)의 제조
에틸 1-벤질-3-하이드록시-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트 대신에 에틸 3-하이드록시-1-헥실-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트를 사용하고 알릴 아이오다이드 대신에 헥실 아이오다이드를 사용하여 실시예 7과 동일한 방법으로 표제 화합물을 수율 8 %로 얻었다.
LC/MS(M+H): 404.
실시예 16 : 1,2-비스(사이클로프로필메틸)-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트 (KR67832)의 제조
에틸 1-벤질-3-하이드록시-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트 대신에 에틸 1-(사이클로프로필메틸)-3-하이드록시-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트를 사용하고 알릴 아이오다이드 대신에 사이클로프로필메틸 아이오다이드를 사용하여 실시예 7과 동일한 방법으로 표제 화합물을 수율 3 %로 얻었다.
LC/MS(M+H): 344.
실시예 17 : 에틸 3-(사이클로프로필메톡시)-1-(사이클로프로필메틸)-5-메톡시-1H-인돌-2-카복실레이트 (KR67833)의 제조
실시예 16의 방법의 또다른 생성물로 표제 화합물을 수율 80 %로 얻었다.
LC/MS(M+H): 344.
실험예 1: 실시예 1의 화합물의 지방 염색 효과(시험관내)
본 발명에 따른 3-인돌리논 유도체의 지방 염색 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1의 화합물(에틸 1,2-디알릴-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트)을 이용하여 전지방세포(preadipocyte)인 3T3-L1 세포를 염색하였다.
구체적으로, 3T3-L1 세포(ATCC, CL-173™)를 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, GIBCOBRL), 10% 우혈청(fetal bovine serum(FBS, Hyclone)) 및 1% 항생제-항진균제(antibiotic-antimycotic(페니실린/스트렙토마이신, GIBCOBRL) 함유)에서 5% CO2, 37℃ 조건으로 배양한 후, 실시예 1의 화합물 10 μM로 처리하였다. 한편, 염색된 부위가 지방 소립(lipid droplet)인지 확인하고자 상기 염색된 3T3-L1 세포를 0.25μM의 덱사메타손(dexamethasone(DEX)), 0.5mM의 1-메틸-3-이소부틸잔틴(IBMX), 10ug/ml 인슐린을 넣은 배지로 2일 처리한 후, 10ug/ml 인슐린만 처리한 배지로 교환하였다. 처리 2일 후 DMEM 배지(10% FBS 함유)로 교환한 후 지방 소립을 분화시켰다.
상기 분화 전 및 분화 후 세포를 레카(Leica) 형광현미경(DMI 3000b)으로 관찰하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2의 A 및 A'는 형광현미경으로 관찰된 미분화 3T3-L1 세포를, B는 형광현미경으로 관찰된 분화 3T3-L1 세포를 나타낸다.
도 2의 A'에서 본 발명의 화합물에 의해 미분화된 세포의 지방 소립이 염색된 것으로 나타났으며, 이는 도 2의 B에서 분화된 세포의 지방인 것으로 확인되었다. 상기 결과는 본 발명의 화합물이 지방을 염색하는데 효과적임을 입증한다.
실험예 2: 실시예 1의 화합물의 지방 염색 효과(생체내)
본 발명에 따른 3-인돌리논 유도체의 지방 염색 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1의 화합물로 발생유전학적 동물모델인 제브라피쉬를 염색하였다.
구체적으로, 생후 하루, 15일, 30일, 60일, 그리고 90일이 지난 제브라피쉬 5마리씩을 각각 페트리디쉬(petri-dish) 10ml에 배양하고 실시예 1의 화합물 100μM로 처리하여 28.5℃에서 15분간 암반응시키는 방법으로 처리하여 염색하였다. 염색 후 시간 경과에 따른 지방세포분화(adipogenesis)를 형광현미경(MZ10F, Leica)으로 관찰하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3의 A 내지 C는 제브라피쉬의 머리 부위에서의 지방 조직 염색 결과를, D 및 E는 꼬리 부위에서의 지방 조직 염색 결과를, F 및 G는 배 부위에서의 지방 조직 염색 결과를 나타낸다. 또한, 도 3의 I 및 J는 제브라피쉬의 지방 소립을 항-페릴리핀(anti-perilipin) 항체로 염색한 결과를 나타내고, 도 3의 K는 실시예 1의 화합물을 사용하여 지방조직을 염색한 후 제브라피쉬 간과 장을 적출하여 장기 주변에 존재하는 지방조직 염색을 확인한 것이며, 도 3의 L은 장기와 그 주변의 지방조직을 파라핀 절편을 통해 분석한 결과이다. 도 3에서 dpf는 수정 후 일자(day post fertilization)를 의미한다.
도 3의 결과에서 보는 바와 같이, 제브라피쉬에서 지방조직은 수정 후 15일째(도 3B)에 췌장 주위에서 처음으로 관찰되었고, 수정 후 20일째(도 3C)에는 췌장을 포함한 내장과 간 주위에서 지방조직이 나타났으며, 수정 후 15일째와 비교하여 수정 후 20일째에서의 제브라피쉬에서의 지방조직은 그 수가 많아지고 크기가 커지는 것으로 나타났다. 수정 후 30일째(도 3E)에선 가슴 지느러미와 심장주위, 그리고 전체적인 내장 부위에 지방조직이 확장되어 나타나는 것을 확인하였다. 수정 후 60일째(도 3D) 된 제브라피쉬에서는 지방조직의 분포형태가 보다 두드러지게 분화되어 있음을 확인하였으며, 지방은 눈, 턱, 심장, 장, 간, 가슴지느러미, 꼬리지느러미, 척추 주위를 감싸고 있었다. 지방조직이 염색된 부위를 확대한 경우(도 3의 J 내지 J''') 지방이 특정기관에 분포하고 있으며, 둥근 원형 형태를 취하고 있음을 알 수 있었다.
한편, 파라핀 절편(Paraffin section)을 통해 제브라피쉬 지방세포의 해부학적인 구조를 관찰한 결과, 장, 간, 부레, 장간 사이 체강에서 지방이 다량 산재 되어있는 것을 확인하였다(도 3의 K 및 L). 제브라피쉬의 간과 장을 적출한 것에서 그 사이에 지방세포가 본 발명의 화합물에 의해 염색되었으며 그것만을 다시 절편한 결과 지방세포의 구조가 사람의 지방세포와 유사하다는 것을 확인할 수 있었다.
제브라피쉬의 기아상태에서의, 그리고 먹이 재공급에 따른 지방 조직의 변화를 살펴보기 위하여, 수정 후 80일 된 제브라피쉬를 격리하여 14일 동안 먹이를 주지 않고 기아상태를 유도하였다. 이때, 수정 후 80일째에 본 발명에 따른 실시예 1의 화합물로 처리하여 제브라피쉬를 염색하고, 기아상태 5일째, 10일째 및 14일째에 지방 조직을 관찰하였다. 관찰 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 A 내지 D에서 보는 바와 같이, 기아상태가 길어질수록 지방조직이 점차 사라지는 것을 확인하였고, 14일째에 지방조직이 완전히 사라져 관찰되지 않는 것을 알 수 있었다. 이는 기아상태에서 생체 내 지방을 에너지원으로 사용하였다는 것을 입증하며, 지방 조직이 모두 소비되어 없어지는 기간이 성체에서 14일 정도임을 알 수 있다.
또한, 상기와 같이 지방조직이 사라진 제브라피쉬에 다시 먹이를 공급하여 어느 부위에서 얼마만큼의 지방조직이 다시 발생하는지 관찰하였다. 관찰 결과, 도 4의 E 및 F에서 보는 바와 같이, 먹이 재공급으로 인해 지방조직이 다시 생겨남을 알 수 있었다. 지방조직이 늘어나는 부위는 심장 부근과 전체적인 장 부위였다. 먹이 공급 8일째에서 정상과 같은 분포양상의 지방조직을 관찰할 수 있었다.
실험예 3: 실시예 4의 화합물의 지방 염색 효과
1. 다양한 세포 염색
본 발명에 따른 3-인돌리논 유도체의 지방 염색 효과를 확인하기 위하여, 실시예 4의 화합물(에틸 5-메톡시-1,2-비스(3-메틸부트-2-에닐)-3-옥소인돌린-2-카복실레이트)을 이용하여 3T3-L1 (Mouse embryonic fibroblast cell line), PC3 (Human prostate cancer cell line), MCF7 (Human breast adenocarcinoma cell line), HT29 (Human colon cancer cell line), HepG2 (Human liver carcinoma cell line), CHL-1 (Human melanoma cell line), 및 NIH3T3 (Mouse embryonic fibroblast cell line)를 염색하였다.
구체적으로, 3T3-L1 (Mouse embryonic fibroblast cell line), PC3 (Human prostate cancer cell line), MCF7 (Human breast adenocarcinoma cell line), HT29 (Human colon cancer cell line), HepG2 (Human liver carcinoma cell line), CHL-1 (Human melanoma cell line), 및 NIH3T3 (Mouse embryonic fibroblast cell line) 세포는 10% 우혈청(fetal bovine serum(FBS, Hyclone)를 포함하는 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, GIBCOBRL))에서 5% CO2, 37℃ 조건으로 배양되었다. LLC-PK1 (Porcine kidney cell line)는 15% 우혈청을 포함하는 Medium 199에서 배양되었다. 지방세포의 분화는 10% FBS, 덱사메타손(0.25 μM, Sigma Aldrich, St. Louis, MO), 이소부틸메틸잔틴(0.5 mM, IBMX, Sigma Aldrich) 및 인슐린(166 nM, Sigma Aldrich)을 포함하는 DMEM배지 혼합액에서 2일간(0일부터 2일까지) 처리하여 유도되었다. 상기 배지는 이후 2일동안 10% FBS 및 인슐린을 포함한 DMEM 배지로 교체되었다. 4일부터는 세포는 10% FBS를 포함하는 DMEM으로 처리되었고, 이 배지는 2일마다 교체되었다.
상기 세포는 실시예 4의 화합물 10 μM과 함께 4시간동안 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 37℃의 조건으로 배양되었고, 그 후 LeicaMZ10F 현미경으로 관찰하였다. 지방적을 관찰하기 위해 실시예 4의 화합물 또는 Nile Red 5 μM 으로 30분간 염색하였고, 그 후 디메틸설폭사이드(DMSO)로 희석하였다. 염색 후, 세포는 PBS로 세번 세척되었고, 형광 현미경으로 관찰되었다. 470/40nm 또는 545/30nm의 레이저 필터가 전자 여기(excitation)을 위해 사용되었다. 영상은 545/50nm 620/60nm emission filter로 획득되었다.
결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5는 미분화된 3T3-L1 세포에 대한 사진 (A, A'), 분화된 3T3-L1 세포에 대한 실시예 4의 화합물 염색 사진(B, B') 및 분화된 3T3-L1 세포에 대한 Nile Red의 염색 사진(C, C')을 나타낸다. 스케일 바는 A, A'에서는 100μm를 나타내며, B, B', C, C' 에서는 20μm를 나타낸다.
도 5를 참조하면, 본 발명의 실시예 4의 화합물(KR 68432)은 분화된 3T3-L1 세포의 지방적을 높은 민감도로 염색함을 확인할 수 있었다. 반면 비교예로 사용된 지방적 염색에 일반적으로 사용되는 Nile Red 화합물 또한 분화된 3T3-L1 세포의 지방적 염색 효과를 보였으나 본 발명의 실시예 4의 화합물(KR 68432)의 염색으로 인해 획득된 이미지가 보다 선명하고 특이적으로 나타났다.
도 6은 본 발명의 실시예 4의 화합물(KR 68432)에 의해 염색된 다양한 종류의 세포에 대한 사진이다. A 및 A'는 NIH3T3 (Mouse embryonic fibroblast cell line)세포주, B 및 B'는 CHL-1 (Human melanoma cell line) 세포주, C 및 C'는 HT29 (Human colon cancer cell line)세포주, D 및 D'는 MCF7 (Human breast adenocarcinoma cell line) 세포주, E 및 E'는 LLC-PK1 (Porcine kidney cell line) 세포주, F 및 F'는 PC3 (Human prostate cancer cell line) 세포주, G 및 G'는 HepG2 (Human liver carcinoma cell line) 세포주를 나타낸다. 스케일 바는 100μm를 나타낸다.
2. LipidTOX TM 와의 비교염색
세포는 프로프라노롤(30 μM)에서 인산 지질 검출용 화합물인 LipidTOXTM(phospholipid) (50 μL/웰)와 함께 배양되었다. Cyclosporin A (30 μM)은 양성 대조군으로 사용되었다(50 μL/웰). 세포는 상기 실시예 4 화합물의 효과를 나타낼 수 있는 기간동안 일반적인 배양 조건에서 배양되었다. 그 후 formaldehyde/Hoechst 33342 고정용액(100 μL)을 각각의 웰에 가하고, 상온에서 30분간 배양하였다. 고정용액을 제거한 후, 세포는 형광 현미경으로 관찰되었다.
중성 지질 염색을 위해 중성 지질 검출용 화합물인 LipidTOXTM (neutral lipid) 100 μL를 각각의 웰에 가하였다. 상온에서 30분 배양 후, 세포를 관찰하였다.
지방적은 중성지방 및 인지질의 혼합물인 바, 상기 LipidTOXTM(phospholipid) 및 LipidTOXTM (neutral lipid) 세트를 사용하여 인지질과 중성 지방을 확인할 수 있다.
중성 지방 및 인지질 중 어떤 지방이 염색되는지 확인하기 위해, 본 발명의 실시예 4의 화합물과 HepG2 세포가 함께 배양되었고, 결과를 도 7에 나타내었다. 상기 HepG2 세포는 중성 지방 또는 인지질 특이적 염색 시약(LipidTOXTM)과 함께 배양되었고, 이는 시중에서 구입하여 사용하였다.
도 7을 참조하면, 본 발명의 실시예 4의 화합물은 LipidTOXTM과 복합 염색이 가능하며, 특히 중성 지방 염색용 LipidTOXTM의 적색 염색과 겹쳐 나타남을 알 수 있었다. 도 7의 화살표는 중복 염색된 중성 지방 부위를 나타낸다. 따라서 본 발명의 실시예 4의 화합물은 중성 지방을 특이적으로 염색함을 알 수 있었다. 스케일 바는 100μm를 나타낸다.
3. BODIPY 493/503와의 비교염색
HepG2 세포는 과량의 지방적에 노출되었다. 세포는 2% 알코올, 10 μM 아미오다론, 50 μM 테트라사이클린 및 5 μM 타목시펜과 72시간동안 배양되었다. 상기 화합물 처리 후, 10 μM의 실시예 4의 화합물 및 40 μg/ml BODIPY 493/503을 30분간 처리하였다. 그 후 화합물은 원하고자 하는 최종 농도를 얻기 위해 희석되었고, 배양 배지에서 최종 DMSO의 농도는 1%를 넘지 않았으며, 운반 샘플은 DMSO의 양과 동일하게 처리하되었다. 470/40nm 또는 493/30nm의 레이저 필터가 전자 여기(excitation)을 위해 사용되었다. 영상은 545/50nm 503/60nm emission filter로 획득되었다.
결과를 도 8에 나타내었다. 도 8을 참조하면, 본 발명의 실시예 4의 화합물(KR-68432)가 처리된 경우, 지방증 유도된 HepG2 세포가 BODIPY 493/503이 처리된 경우보다 더욱 선명하고 특이적으로 지방을 염색함을 확인할 수 있었다.
4. 경구 투여 후 마우스 지방조직 염색 효과
실시예 4의 화합물(KR68432)의 조직내 분포도를 측정 하기 위하여 Mouse는 4주령 nude male을 사용하였다. KR-68432를 5% DMSO로 먼저 녹이고 그 이후 95%의 olive oil을 첨가해 100 mpk로 맞추었다. 실험에 사용한 Mouse가 20g 정도이므로 투여액은 0.2 ml 씩 준비 하였다. 실시예 4의 화합물(KR68432)를 구강 투여 후 30 min, 1 h, 2 h 이후 장기를 시간별로 적출하였다. 장기는 background를 최소화 하기 위해 가장 위를 가장 마지막에 분리하고 브레인, 간, 폐, 지방, 심장 등의 순서로 적출하였다. 적출한 장기를 PBS용액으로 잘 세척한 후 fluorescence microscope에서 excitation 470 nm, emission 525 nm에서 측정하였다.
결과를 도 9에 나타내었다.
도 9를 참조하면, 적출된 장기의 지방은 실시예 4의 화합물 구강 투여 후 시간이 지날수록 형광이 뚜렷하게 나타남을 알 수 있었다.
따라서 상기 결과들은 본 발명에 따른 3-인돌리논 유도체를 이용하여 지방 조직을 효과적으로 염색할 수 있음을 보여주며, 따라서 본 발명의 유도체는 생체 진단, 지방 조절 물질 탐색, 또는 생물학적 현상을 연구하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
실험예 4: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제 1(DGAT1) 저해제 스크리닝
상기 실시예 1의 화합물을 후보 약물의 스크리닝에 사용하기 위해, 후보 약물로 DGAT1 저해제를 사용하여 스크리닝을 수행하였다.
DGAT1은 당뇨병 및 비만과 같은 대사 증후군 치료를 위한 잠재적인 타겟에 해당한다. 미소체 효소(microsomal enzyme)는 1,2-디아실글리세롤과 fatty acyl CoA 과의 에스터화 반응을 촉매하여 트리글리세라이드를 형성하도록 한다. DGAT1 넉아웃 마우스는 감소된 수준의 트리아실글리세라이드를 발현하는데, 트리아실글리세라이드는 지방의 주요 성분이다. 최근 연구는 소분자 DGAT-1 저해제가 트리아실글리세라이드의 양 및 체중을 감소시키는 효과가 있음을 밝혀낸 바 있다.
따라서 본 발명의 발명자들은 현재 존재하는 DGAT1 저해제인 PF04620110(임상 1상 진행중)을 후보약물로 사용하여 본 발명의 실시예 1의 화합물(KR 68425, lipid green)이 이를 스크리닝 하는 효과가 있는지를 검토하였다. PF04620110-노출된 제브라피쉬는 실시예 1의 화합물로 염색되었다. 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10을 참조하면, 본 발명의 화합물 lipid green(실시예 1)에 의해 염색되었던 대조군 제브라피쉬의 지방(A 참조)은 후보약물인 PF04620110의 처리에 의해 사라짐(B 참조)을 확인할 수 있었다. 따라서 기대한 바와 같이 PF04620110의 처리로 인해 제브라피쉬의 지방이 현저히 감소됨을 실시예 1 화합물의 지방 특이적 염색을 통해 확인 할 수 있었다.
또한 도 11은 이의 형광 감도의 측정을 통한 지방 축적량을 나타낸 그래프이다. 도 11을 참조하면, 후보약물인 PF04620110의 처리로 인해 형광이 감소되었고, 이러한 형광의 상대적 감소량을 통해 지방의 감소량을 정량적으로 유추할 수 있음을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (19)

  1. 하기 화학식 1 또는 2로 표시된 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2011009597-appb-I000027
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2011009597-appb-I000028
    R1은 수소, C1-6 알콕시, C1-4 알킬로 치환되거나 치환되지 않은 C2-6 알케닐옥시, 벤질옥시 또는 C1-4 알콕시페닐이고;
    R2는 C1-6 알킬이고;
    R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-4 알킬로 치환되거나 치환되지 않은 C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 벤질 또는 C3-6 사이클로알킬메틸이고;
    R5는 C1-6 알킬, C1-4 알킬로 치환되거나 치환되지 않은 C2-6 알케닐 또는 C3-6 사이클로알킬메틸이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R1이 수소, 메톡시, 알릴옥시, 벤질옥시 또는 메톡시페닐이고, 상기 R2가 메틸, 에틸 또는 이소프로필이고, 상기 R3 및 R4가 각각 독립적으로 수소, 메틸, 프로필, 헥실, 알릴, 프로파길, 2-부테닐, 3-메틸부트-2-에닐, 벤질 또는 사이클로프로필메틸이고, 상기 R5가 메틸, 프로필, 알릴 또는 사이클로프로필메틸인 것을 특징으로 하는 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염.
  3. 제 1 항에 있어서,
    하기 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염:
    에틸 1,2-디알릴-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트;
    에틸 1,2-디알릴-3-옥소인돌린-2-카복실레이트;
    에틸 1,2-디((E)-부트-2-에닐)-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트;
    에틸 5-메톡시-1,2-비스(3-메틸부트-2-에닐)-3-옥소인돌린-2-카복실레이트;
    에틸 1-알릴-5-메톡시-2-(3-메틸부트-2-에닐)-3-옥소인돌린-2-카복실레이트;
    (E)-에틸 2-알릴-1-(부트-2-에닐)-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트;
    에틸 5-메톡시-3-옥소-1,2-디(프로프-2-이닐)인돌린-2-카복실레이트;
    에틸 2-알릴-1-벤질-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트;
    에틸 3-(알릴옥시)-1-벤질-5-메톡시-인돌-2-카복실레이트;
    에틸 1,2-디벤질-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트;
    에틸 2-알릴-5-메톡시-1-메틸-3-옥소인돌린-2-카복실레이트;
    에틸 5-메톡시-1,2-디메틸-3-옥소인돌린-2-카복실레이트;
    에틸 3,5-디메톡시-1-메틸-1H-인돌-2-카복실레이트;
    에틸 5-메톡시-3-옥소-1,2-디프로필인돌린-2-카복실레이트;
    에틸 5-메톡시-3-프로필-1-프로필-인돌-2-카복실레이트;
    에틸 1,2-디헥실-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트;
    에틸 1,2-비스(사이클로프로필메틸)-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트;
    에틸 1,2-디알릴-5-(4-메톡시페닐)-3-옥소인돌린-2-카복실레이트;
    에틸 1,2-디알릴-5-(벤질옥시)-3-옥소인돌린-2-카복실레이트;
    1,2-비스(사이클로프로필메틸)-5-메톡시-3-옥소인돌린-2-카복실레이트; 및
    에틸 1,2-디알릴-5-(알릴옥시)-3-옥소인돌린-2-카복실레이트.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 형광염색용 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 1 내지 100 μM의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 형광염색용 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 조성물이 지방을 형광염색하는 데에 사용되는 것을 특징으로 하는 형광염색용 조성물.
  7. 제 4 항에 있어서,
    상기 조성물이 생체를 진단하는 데에 이용되는 것을 특징으로 하는 형광염색용 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 지질 검출용 키트.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 대사증후군 진단용 키트.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 대사증후군은 비만, 고혈압, 동맥경화, 고지혈증, 간질환, 과인슐린혈증, 과혈당증, 1형 및 2형 당뇨병, 인슐린 내성을 특징으로 하는 이상지혈증, 발기부전, 심혈관계질환 및 허혈성질환을 포함하는 것인 대사증후군 진단용 키트.
  11. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 대사증후군 치료 약물의 스크리닝 키트.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 대사증후군은 비만, 고혈압, 동맥경화, 고지혈증, 간질환, 과인슐린혈증, 과혈당증, 1형 및 2형 당뇨병, 인슐린 내성을 특징으로 하는 이상지혈증, 발기부전, 심혈관계질환 및 허혈성질환을 포함하는 것인 대사증후군 치료 약물의 스크리닝 키트.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 간질환은 알코올성 및 비알콜성 간의 지질대사 이상으로 인한 지방간, 간염 및 간경화를 포함하는 것인 대사증후군 치료 약물의 스크리닝 키트.
  14. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염 및 후보 약물을 동물 모델에 투여하는 단계; 및
    상기 동물의 생체 형광 이미지를 분석하는 단계를 포함하는 대사증후군 치료 약물의 스크리닝 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 대사증후군은 비만, 고혈압, 동맥경화, 고지혈증, 간질환, 과인슐린혈증, 과혈당증, 1형 및 2형 당뇨병, 인슐린 내성을 특징으로 하는 이상지혈증, 발기부전, 심혈관계질환 및 허혈성질환을 포함하는 것인 대사증후군 치료 약물의 스크리닝 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 간질환은 알코올성 및 비알콜성 간의 지질대사 이상으로 인한 지방간, 간염 및 간경화를 포함하는 것인 대사증후군 치료 약물의 스크리닝 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 3-인돌리논 유도체 또는 그의 염은 액제 상태인 것인 대사 증후군 치료 약물의 스크리닝 방법.
  18. 제14항에 있어서,
    동물이 제브라피쉬, 생쥐, 집쥐, 기니피그, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 원숭이, 비비, 또는 침팬지인 것인 대사증후군 치료 약물의 스크리닝 방법.
  19. 제14항에 있어서,
    분석은 형광 강도의 소광을 측정하는 것인 대사증후군 치료 약물의 스크리닝 방법.
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