WO2012064146A9 - Ｇｋｎ １을 함유하는 항암용 조성물 - Google Patents

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WO2012064146A9
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박원상
윤정환
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    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a composition for anticancer containing GKN 1, and more particularly to a novel use of the GKN 1 gene excellent in activity of inhibiting the development of gastric cancer and inhibiting metastasis of cancer cells.
  • Stomach cancer is one of the most common cancers in Korea and Japan, and it is low in Western countries such as the United States and Europe.However, in Korea, cancer is the first cancer incidence, and mortality is second only to lung cancer. Occupies. In the classification of gastric cancer, 95% of adenocarcinoma is adenocarcinoma of glandular cells of the gastric mucosa, and other lymphomas of the lymphatic system and gastrointestinal interstitial tumors of interstitial tissues.
  • Nitrate and nitrite which are found in processed meats, are known to be strong carcinogens, and burnt and spicy foods are known to cause stomach cancer. have.
  • Helicobacter pylori which has recently received much attention, has been found to be associated with the development of gastric cancer as a causative agent of gastritis and gastric ulcer.
  • cancer cells inhibit the production of cancer cells by inhibiting abnormal proliferation of cells due to abnormal activation of oncogenic genes that cause cancer or, conversely, by suppressing abnormal proliferation of cells or by killing specific cells by operating an apoptosis program.
  • the abnormality occurs in the gene, and even if the cell has an abnormally activated cancer gene, once the cancer suppressor gene shows normal activity, the cell does not form cancer and dies. Therefore, in order to become a cancer cell, not only activation of a carcinogenic gene but also an inactivation of a cancer suppressor gene must appear simultaneously in one cell.
  • Endoscopic mucosal resection is a physiological saline solution injected around the gastric mucosa of cancerous lesions for early gastric cancer. This method is used to convex the lesion area and then remove the lesioned mucosa, which can be avoided by simple endoscopic procedure.However, it is used only when the lymph node metastasis rate is low among the early gastric cancer limited to the mucosa. There is a limit to that.
  • the present inventors focused on the fact that GKN 1 gene is expressed in normal gastric mucosal cells and its expression is reduced in gastric cancer tissues. As a result, the GKN 1 gene inhibits the proliferation and activity of gastric cancer cells.
  • the present invention was completed by first identifying the function of inhibiting cancer metastasis and confirming that the gene can be used as a cancer therapeutic agent.
  • an object of the present invention is to provide an anticancer composition
  • Still another object of the present invention is a method for screening an anticancer agent comprising culturing a GKN 1 protein or a recombinant cell expressing the protein and a candidate, and measuring the effect on the activity of GKN 1 protein or an increase in the expression level of the cell.
  • the present invention provides a composition for anticancer comprising a polynucleotide encoding GKN 1 (Gastrokine 1) protein or GKN 1 protein.
  • the GKN 1 protein may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide encoding the GKN 1 protein may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the polynucleotide may be contained in an expression vector.
  • the expression vector may be pcDNA 3.1- GKN 1 having a cleavage map of FIG.
  • the cancer may be gastric cancer.
  • the present invention provides a method for screening an anticancer agent comprising culturing a GKN 1 protein or recombinant cells expressing the protein and a candidate, and measuring the effect on the activity of the GKN 1 protein or an increase in the expression level in the cell. .
  • the candidate when the candidate increases the activity of the GKN 1 protein or increases the expression level of the GKN 1 gene in cells, it may be to add a step of judging it as an anticancer agent having anticancer activity. have.
  • the activity or expression level of the GKN 1 protein is immunoprecipitation (coimmunoprecipitation), radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), immunohistochemistry, Western blot (Western) Blotting) and flow cytometry (FACS) may be performed by any one method selected from the group consisting of.
  • the anticancer agent may be one that can prevent or treat stomach cancer.
  • GKN 1 according to the present invention is not only excellent in the activity of inhibiting the development of cancer cells, but also has an excellent feature of inhibiting the metastasis of cancer cells during overexpression, there is an effect that can be usefully used as an anticancer composition.
  • A shows the immunological activity in bovine cells and superficial gastric epithelial cells
  • B shows the immune positivity in gastric adenoma
  • C Are negative immunostaining results in coronary adenoma
  • D is immunological positive in gastric cancer
  • E is negative immunostaining in gastric and diffuse gastric cancer.
  • Figure 2 shows the methylation state of GKN 1,
  • A is methylated DNA (M) and unmethylated DNA (U) for the GKN 1 gene in gastric cancer tissue (T) and normal gastric mucosa (N)
  • B shows methylated (M) DNA and unmethylated (U) DNA for GKN 1 gene in gastric cancer cell lines.
  • Figure 3 is a graph showing the fold change of (A) GKN 1 DNA copy number and (B) GKN 1 mRNA expression compared to the control in gastric cancer.
  • FIG 4 shows GKN 1 expression in gastric cancer tissue (T) and normal gastric mucosa (N) of the long (I), diffuse (D) and mixed (M), respectively.
  • FIG. 5 shows cell viability over time in gastric cancer cells transfected with GKN 1 using MTT assay, and (B) in gastric cancer cells transfected with GKN 1 using BrdU assay. It is a graph showing cell proliferation over time.
  • Figure 6 shows the cell death over time after GKN 1 transfection measured by Annexin V binding assay.
  • Figure 7 shows the cell death was measured by Annexin V binding assay 24 hours after GKN 1 transfection treated with caspase-3 inhibitor (Z-DEVD-fmk) and caspase-8 inhibitor (Z-IETD-fmk).
  • FIG. 8 shows the activity of the proteins involved in killing 24 hours after GKN 1 transfection by Western blot analysis, and (B) shows caspase-3 inhibitors (Z-DEVD-fmk) and caspase-8 inhibitors.
  • Z-IETD-fmk caspase-3 inhibitors
  • caspase-8 inhibitors caspase-8 inhibitors
  • Figure 9 shows the effect of GKN 1 on cell migration through the wound-healing method, the dotted line shows the boundaries of the scratch defect.
  • (A) is a picture of the cells infiltrated through the matrix 24 hours after transfection, (B) to calculate the number of cells The graph shown.
  • Figure 12 shows a cleavage map of the recombinant vector pcDNA 3.1-GKN 1 vector prepared by inserting the GKN 1 gene according to the present invention.
  • the present invention is characterized by providing an anticancer composition containing GKN 1 (Gastrokine 1) as an active ingredient, and more specifically, a polynucleotide encoding GKN 1 (Gastrokine 1) protein or GKN 1 (Gastrokine 1) protein. It is characterized by providing an anticancer composition comprising a.
  • GKN 1 a novel protein isolated from gastric mucosal cells of mammals.
  • GKN 1 GKN 1 (Gastrokine 1), also known as AMP-18 (antrum mucosal protein-18) or CA11, is known to be expressed in the gastrointestinal tract and protects the anterior mucosa and facilitates recovery and proliferation after injury. It is known to have an activity that promotes healing (Toback. FG et al ., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 285: G344-353, 2003). However, little is known about the other functions of GKN 1.
  • the present inventors confirmed that the GKN 1 gene is involved in the pathogenesis of cancer by confirming that the expression of GKN 1 gene is reduced in cancer cells, unlike normal cells, and in fact, GKN 1 has anticancer activity. was first identified.
  • the embodiment of the present invention confirmed that the expression of the GKN 1 gene is reduced or lost in cancer cells, that is, according to one embodiment of the present invention, GKN 1 protein in gastric cancer tissue by immunohistochemical method
  • the expression of was examined, and sections were prepared by immobilizing gastric cancer tissues, detected using GKN 1 antibody and biotinylated goat anti-mouse antibody, incubated with avidin-biotin complex linked to peroxidase, and then diaminobenzidine.
  • slides were contrast-stained with Meyer Hematoxillin solution and analyzed for expression.
  • the cells showed immune positivity in the normal gastric mucosa cytoplasm of anterior and corpus.
  • carcinomas tissues were observed to have reduced or lost expression of GKN 1 (see FIG. 1 and Table 1).
  • the copy number of GKN 1 is normal gastric mucosa Compared to tissue DNA, gastric cancer DNA was reduced by more than 50%, and GKN 1 mRNA expression levels expressed GKN 1 gene transcripts in normal gastric mucosal tissues, whereas all gastric cancer tissues decreased or lost expression (see FIG. 3). .
  • the present inventors investigated the effects of overexpression of GKN 1 gene on cancer cell proliferation and apoptosis under the prediction that the GKN 1 gene of the present invention may have anticancer activity.
  • the present invention as a result of performing MTT analysis and BrdU binding analysis of GKN 1 transfected into gastric cancer cell line AGS over time, cell viability and cell proliferation are significantly suppressed in the transfected cells.
  • FITC-labeled annexin V cells staining resulted in an increase in dead cells in GKN 1 transfected cells (see Fig. 6).
  • GKN 1 is characterized by inhibiting the proliferation of cancer cells and causing death.
  • the GKN 1 gene is inserted as compared with AGS cells transfected with the GKN 1 expression vector.
  • Cells transfected with the control expression vector and GKN 1 siRNA were not moved to the wound site after transfection (see FIG. 9), and the migration of AK cells transfected with GKN 1 was decreased (see FIG. 10). Invasion was markedly inhibited in AGS cells overexpressing GKN 1 (see FIG. 11).
  • GKN 1 inhibits cancer cell migration and inhibits the conversion of epithelial cells into stromal cells, and also inhibits invasion in gastric cancer cell lines upon overexpression.
  • the present invention may provide an anticancer composition comprising a polynucleotide encoding a GKN 1 (Gastrokine 1) protein or a GKN 1 (Gastrokine 1) protein.
  • the GKN 1 protein may have an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, and the polynucleotide encoding the GKN 1 protein may have a base sequence as set forth in SEQ ID NO: 2.
  • the GKN 1 protein according to the present invention may preferably be a functional equivalent to the polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the term 'functional equivalent' refers to a sequence homology with at least 60%, preferably 70%, more preferably 80% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO. 1 as a result of the addition, substitution or deletion of amino acids. It refers to a polypeptide that exhibits substantially homogeneous activity with GKN 1 of the present invention.
  • substantially homogeneous activity means the activity of GKN 1 described above.
  • Such functional equivalents may include, for example, amino acid sequence variants in which some of the amino acids of the amino acid sequence of GKN 1 in accordance with the invention have been substituted, deleted or added.
  • Substitution of amino acids may preferably be conservative substitutions, examples of conservative substitutions of amino acids present in nature are as follows; Aliphatic amino acids (Gly, Ala, Pro), hydrophobic amino acids (Ile, Leu, Val), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (His, Lys, Arg, Gln, Asn ) And sulfur-containing amino acids (Cys, Met). Deletion of amino acids may preferably be located at portions not directly involved in the activity of GKN 1 of the present invention.
  • the functional equivalent may also include polypeptide derivatives in which some chemical structures of the polypeptide are modified while maintaining the basic backbone of GKN 1 and its physiological activity.
  • polypeptide derivatives in which some chemical structures of the polypeptide are modified while maintaining the basic backbone of GKN 1 and its physiological activity.
  • a fusion protein made by fusion with other proteins while maintaining structural changes and physiological activities for altering the stability, storage, volatility or solubility of the polypeptide of the present invention may be included.
  • the polynucleotide encoding the GKN 1 (Gastrokine 1) protein may be introduced into an expression vector, such as a plasmid or viral vector, by a known method, followed by transduction or transduction of the expression vector by various methods known in the art. Transfection may be introduced into the target cell phenotype.
  • an expression vector such as a plasmid or viral vector
  • Plasmid expression vectors are FDA's approved gene delivery methods for human use and deliver plasmid DNA directly to human cells (Nabel, EG et al ., Science, 249: 1285-1288, 1990). Unlike viral vectors, there is an advantage that can be purified homogeneously.
  • the plasmid expression vector that can be used in the present invention mammalian expression plasmids known in the art can be used, and in one embodiment of the present invention, a pcDNA3.1 (Invitrogen) plasmid is inserted.
  • a recombinant expression vector pcDNA3.1-GKN 1 having a cleavage map of was prepared.
  • Plasmid expression vectors comprising nucleic acids according to the present invention are methods known in the art, such as, but not limited to, transient transfection, microinjection, transduction, Cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE Dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection , Can be introduced into tumor cells by electroporation, gene gun and other known methods for introducing DNA into cells (Wu. Et al ., J. Bio. Chem., 267: 963-967, 1992; Wu. Et al ., Bio. Chem., 263: 14621-14624, 1988).
  • transient transfection methods can be used.
  • the vector capable of expressing GKN 1 may be administered to cells, tissues or bodies by known methods, for example, topically, parenteral, oral, nasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous or It may be administered by other suitable means.
  • the vector can be injected directly into a target cancer or tumor cell in an effective amount for treating tumor cells of the target tissue.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used as a hollow organ affected by cancer or a tumor. It can be injected directly using a needle, catheter or other type of transport tube within.
  • GKN 1 of the present invention inhibits the proliferation of cancer cells, promotes cell death and at the same time has the activity of inhibiting the metastasis and infiltration of cancer cells, the present invention can provide an anticancer screening method using the gene.
  • the anticancer screening method comprises the steps of: (a) culturing a GKN 1 protein or a recombinant cell and a candidate substance expressing the protein; And (b) measuring the effect on the activity of the GKN 1 protein or an increase in intracellular levels.
  • the increase in the intracellular level of GKN 1 protein means that the expression of the GKN 1 gene is increased or the degradation of the GKN 1 protein is inhibited and the concentration of the GKN 1 protein is increased.
  • the GKN 1 gene expression involves the transcription and translation of the GKN 1 gene into protein. Therefore, when the candidate substance increases the expression of GKN 1 gene and the protein level in the cell, the candidate substance may be determined as a substance having anticancer activity.
  • the method of measuring the activity and intracellular levels of GKN 1 protein can be used in a variety of methods known in the art, for example, but not limited to immunoprecipitation (coimmunoprecipitation), enzyme immunoassay (enzyme) -linked immunosorbentassay, radioimmunoassay (RIA), immunohistochemistry, Western blotting and flow cytometry (FACS).
  • immunoprecipitation coimmunoprecipitation
  • enzyme immunoassay enzyme immunoassay (enzyme) -linked immunosorbentassay
  • RIA radioimmunoassay
  • FACS flow cytometry
  • the screening method targeting the GKN 1 of the present invention may apply high throughput screening (HTS).
  • HTS is a method of testing multiple candidates in parallel and screening simultaneously or nearly simultaneously for the biological activity of the multiple candidates.
  • cell lines can be cultured in 96-well microtiter plates or 192-well microtiter plates, treated with a number of candidates therein, and then the level of expression of GKN 1 can be measured by immunochemical methods.
  • the wells typically require assay volumes ranging from 50 ⁇ l to 500 ⁇ l and, in addition to plates, a number of instruments, instruments, pipettes, robots, robots, etc., to suit 96-well formats for a wide range of homogeneous and heterogeneous assays. Plate washers and plate readers are commercially available.
  • the anticancer composition according to the present invention can be used as a pharmaceutical composition that can prevent and treat cancer
  • the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and that, when administered to a human, typically does not cause allergic or similar reactions, such as gastrointestinal disorders, dizziness, and the like.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, carriers for oral administration such as lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid, and the like for parenteral administration such as water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycols, and the like. And the like may further comprise stabilizers and preservatives.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-parabens and chlorobutanol.
  • Other pharmaceutically acceptable carriers may be referred to those described in the following documents (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in a suitable form according to methods known in the art together with the pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in various parenteral or oral administration forms according to known methods, and isotonic aqueous solution or suspension is preferable as an injectable formulation as a typical formulation for parenteral administration.
  • injectable formulations may be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents.
  • each component may be formulated for injection by dissolving in saline or buffer.
  • formulations for oral administration include, but are not limited to, powders, granules, tablets, pills and capsules.
  • compositions formulated in such a manner can be administered in a effective amount via several routes, including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular.
  • the term 'effective amount' refers to an amount exhibiting a prophylactic or therapeutic effect when administered to a patient.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may be appropriately selected depending on the route of administration, subject to administration, age, gender weight, individual difference and disease state.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient depending on the degree of disease, preferably 1 to 10,000 g / weight kg / day, more preferably 10 to 1000 mg / weight kg
  • the effective dose of / day may be repeated several times a day.
  • the anticancer composition of the present invention may be administered in parallel with a known compound having the effect of preventing, improving or treating cancer.
  • gastric cancer cell line AGS was prepared by incubating at 37 ° C in RPMI-1640 medium of 5% CO 2 with 10% fetal bovine serum thermally inactivated. Then, the cDNA of GKN1 was amplified using the PCR method, and pcDNA3.1 having the cleavage map of FIG. 12 using restriction enzyme sites (using EcoRI and BamHI) in the pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) vector. -GKN 1 recombinant vector was prepared and transformed into Escherchia coli DH5a competent cells.
  • the transformed cells were cultured in LB agar solid medium containing ampicillin and cultured from colonies by mass production. Cells were collected from the culture medium to purify DNA, and a pcDNA3.1-GKN 1 vector was prepared. Then, using a Lipofectamine Plus Transfection Reagent (Invitrogen) in a 60 mm diameter dish, the expression vector (total 5 ⁇ g) was transfected into AGS cells.
  • a Lipofectamine Plus Transfection Reagent Invitrogen
  • tissue microarray award blocks were designed to contain 169 gastric cancer tissue samples that had been paraffin-fixed after formalin solution. Take three tissue cores with a diameter of 2 mm from each arm and transfer them to a new recipient paraffin block using a commercially available microarray instrument (Beecher Instruments, Micro-Array Technologies, Silver Spring, MD, USA) and place the top stomach near each tumor. One cylinder of the mucosa was also transferred to the recipient block. All samples were cut into 2 ⁇ m sections the day before use and stored according to standard protocols. In addition, to maximize the immunohistochemical signal, both antigen recovery in citrate buffer and amplification of the signal with biotinylated tyramide were used.
  • the epitope recovery method induced by heat is 10 mmol / L citrate buffer.
  • the slides were immersed in a Coplin vessel filled with (pH 6.0), boiled for 30 minutes in a pressure cooker (Nordic Ware, Minneapolis, MN, USA) in a 700 W microwave oven, and the Coplin vessel was cooled for 20 minutes.
  • a Renaissance TSA Indirect Kit (NEN Life Science, Boston, A, USA) containing streptavidin-peroxidase and biotinylated tyramide was used, first rinsing the slides with PBS and then removing endogenous peroxidase activity. Soaked in 1% H 2 O 2 diluted with PBS and treated for 15 minutes at room temperature.
  • TNT buffer 0.1 mol / L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol / L NaCl, 0.05% Tween 20
  • TNB buffer 0.1 mol / L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15
  • mol / L NaCl, 0.5% blocking reagent 0.5% blocking reagent.
  • GKN 1 antibody 1/100; Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO, USA
  • biotinylated goat anti-mouse antibodies Sigma, St. Louis, MO, USA
  • Diaminobenzidine was used as the color source and slides were counterstained with Meyer Hematoxylline solution. Antigen staining analysis was considered positive when more than 30% of the cytoplasm was stained positive and was independently reviewed by two pathologists. As a negative control, a replacement of primary antibody with non-immune serum was used.
  • GKN 1 expression was observed to be decreased or lost in 36 (90%) and 170 (89.5%) samples of gastric adenomas and carcinomas.
  • GKN 1 protein expression was observed in 9 (9,7%) and 11 (11.2%) of 92 long and less than 98 gastric cancer samples, and 19 (90.5%) and 151 of early gastric and advanced gastric cancer, respectively. (95.0%) GKN 1 expression was shown to be reduced or lost in dog samples.
  • GKN 1 mutations were examined by sequencing. For this purpose, a total of 81 gastric cancer samples and 40 gastric adenomas that were fixed with methacarn were provided by the clergy University Medical Center. 45 of the gastric cancer samples were long and 36 were less than. The mean size of gastric cancer was 6.5 cm, the size of all adenoma was less than 2 cm, and the samples received were not familial cancer. Genomic DNA of normal mucosal cells corresponding to each tumor cell was amplified with six sets of primers covering the entire coding region of the GKN 1 gene, and the primer sequences are shown in Table 2 below. Each PCR (polymerization reaction) was performed under standard conditions and PCR conditions are shown in Table 3. Sequence analysis of PCR results was performed using a cycle sequencing kit (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA).
  • Example 3 the decrease in expression of GKN 1 in gastric cancer cells was not caused by mutations.
  • 25 frozen gastric cancer samples and 13 gastric cancer cell lines (13) were analyzed to determine whether the GKN 1 promoter region was associated with methylation.
  • AGS, MKN-1, MKN-45, MKN-74, KATO-III, SNU-1, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-520, SNU-601, SNU-638, SNU-668, SNU-719 which were provided by the Korea Human Resources Bank, Chonnam National University Hwasun Hospital, a member of the Human Resources Central Bank, which is supported by the Ministry of Health, Welfare and Family Affairs.
  • the methylation status in the promoter region of the GKN 1 gene was determined by performing methylation specific PCR (MSP) after sodium bisulfite treatment of DNA.
  • MSP methylation specific PCR
  • Primer sequences are shown in Tables 4 and 5 below, and PCR compositions and conditions are shown in Tables 6 and 7, respectively.
  • Each PCR result was immediately transferred to a 2% agarose gel, stained with ethidium bromide and visible for UV light illumination, followed by electrophoresis.
  • Example 3 the decrease in expression of GKN 1 in gastric cancer cells was not caused by mutations.
  • 25 frozen gastric cancer samples and 13 gastric cancer cell lines (13) were analyzed to determine whether the GKN 1 promoter region was associated with methylation.
  • AGS, MKN-1, MKN-45, MKN-74, KATO-III, SNU-1, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-520, SNU-601, SNU-638, SNU-668, SNU-719 which were provided by the Korea Human Resources Bank, Chonnam National University Hwasun Hospital, a member of the Human Resources Central Bank, which is supported by the Ministry of Health, Welfare and Family Affairs.
  • the methylation status in the promoter region of the GKN 1 gene was determined by performing methylation specific PCR (MSP) after sodium bisulfite treatment of DNA.
  • MSP methylation specific PCR
  • Primer sequences are shown in Tables 4 and 5 below, and PCR compositions and conditions are shown in Tables 6 and 7, respectively.
  • Each PCR result was immediately transferred to a 2% agarose gel, stained with ethidium bromide and visible for UV light illumination, followed by electrophoresis.
  • MSP was performed on 25 pairs of noncancerous gastric mucosa and gastric cancer tissue to analyze bisulfite-modified DNA methylation of the GKN 1 gene.
  • FIG. 2A most cancer tissues and the corresponding normal gastric mucosa were shown. Showed both methylated and unmethylated DNA for the GKN 1 gene in. Hypermethylation in the GKN 1 promoter region was observed only in two gastric cancer samples (Nos. 4 and 8).
  • FIG. 2B in 14 gastric cancer cell lines, both methylated and unmethylated PCR products were confirmed.
  • Genomic DNA and mRNA extracted from 25 frozen gastric cancer samples were quantified and real time SYBR Green QPCR was performed on a Stratagene Mx 3000P QPCR system.
  • Primers specific for GKN 1 DNA copy number detection were designed according to Genbank's genomic sequence and are shown in Table 8 below, where all samples were amplified by PCR with oligonucleotide primers specific for the gene GAPDH that is always expressed and normalized. .
  • GAPDH primers are shown in Table 9 below.
  • Primers for SYBR Green analysis were designed based on gene specific non-homologous DNA sequences, and cDNA was synthesized using Roche Molecular System reverse transcription kit (Roche, Mannheim, Germany) for mRNA expression.
  • 50ng cDNA was amplified in the Stratagene Mx 3000P QPCR system using Fullvelocity SYBR Green QPCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, Calif., USA) and 20 pmol / ⁇ l of sense and anti-sense primers, respectively.
  • oligonucleotide primers for mRNA were prepared according to known information about the GKN 1 gene, and are shown in Table 10 below, to ensure the accuracy of DNA and mRNA extraction and reverse transcription, all samples were always expressed genes GAPDH PCR was amplified with oligonucleotide primers specific for and normalized. GAPDH primers used are shown in Table 11 below.
  • Primers for SYBR Green analysis were prepared based on gene-specific non-homologous DNA sequences. Standard curve methods were used to quantify the relative amounts of gene expression products, which provided unit-less normalized expression levels that could be used for direct comparison of the relative amounts of target DNA and mRNA in various samples. do. All samples were replicated and tested and the mean value was used for quantification.
  • the copy number of GKN 1 was reduced by 50% or more in 20 gastric cancer DNAs compared to surrounding gastric mucosal tissue DNA in real time-QPCR analysis.
  • a decrease in the number of copies of GKN 1 was detected in 5 samples of 8 enlarged gastric cancers, 10 of 14 enteric gastric cancers, and 3 of 3 mixed gastric cancers.
  • GKN 1 mRNA in gastric cancer tissue was normalized to GAPDH and then expressed as a fold change compared to the control group.
  • FIG. 3B all non-cancerous gastric mucosal tissues expressed GKN 1 gene transcripts. All gastric cancer tissues showed loss or reduced expression, and 13 gastric cancer cell lines showed complete absence of gene transcripts.
  • Example 2 As confirmed through Example 2, to confirm whether the level of GKN 1 protein in the gastric cancer cell line or tissue is reduced compared to normal cells or tissues, 25 frozen gastric cancer samples, corresponding peripheral normal gastric tissue by Western blot method And 13 gastric cancer cell lines were tested. Samples were first ground to a very fine powder under liquid nitrogen using a mortar and pestle and suspended in cold Nonidet P-40 lysis buffer supplemented with 1X protease inhibitor mix (Roche).
  • GKN 1 protein expression was reduced or lost in 21 (84.0%) out of 25 cancer tissues compared to the corresponding gastric mucosa tissue, 8
  • the expression of GKN 1 protein was reduced in 6 of the diffuse gastric cancers (75.0%), 13 of the 14 gastric cancers (92.8%) and 2 of the 3 mixed gastric cancers (66.7%).
  • Two gastric cancer tissues that were hypermethylated in the promoter region of the gene also showed decreased or lost GKN 1 expression.
  • the present inventors analyzed whether the GKN 1 has an inhibitory activity of gastric cancer through the following experiment.
  • Annexin V binding assays were performed. Annexin V binds to cells displaying phosphatidylserine (PS) on the cell membrane, and propidium iodide (PI) stains cellular DNA with damaged cell membranes. Transfected AGS cells were washed twice with cold PBS, resuspended in 100 ⁇ l binding buffer, and 100 ⁇ l of supernatant was mixed with 400 ⁇ l of blocking solution for each sample.
  • PS phosphatidylserine
  • PI propidium iodide
  • apoptosis cells increased in gastric cancer cells transfected with the GKN 1 expression vector over time.
  • caspase 3 inhibitors Z-DEVD-fmk
  • caspase-8 inhibitors Z-IETD-fmk
  • the present inventors have found that the GKN 1 gene has anticancer activity through promoting apoptosis of gastric cancer cells, and the promotion of apoptosis is associated with the activity of apoptosis factors such as caspase-3 and caspase-8. It was realized through.
  • GKN 1 For another anticancer activity analysis of GKN 1, we examined the effects of GKN 1 on the migration and invasion of cancer cells, ie, transfecting GKN 1 expression vector and GKN 1 siRNA into AGS cells, and then directly 200 ⁇ l pipette tips. The confluent cell monolayer was wound to create cell-free regions. Cell migration was assessed at 6, 12 and 24 hours after transfection, respectively. Cell motility was analyzed by gelatin coated 8 ⁇ m polyvinylpyrrolidine-free polycarbonate (Neuroprobe, Cabin John, MD, USA) in a 48-well microchemotaxis chamber.
  • Cell suspensions containing 6 ⁇ 10 4 cells were each added to the upper chamber of the microchemotaxis chamber and medium containing 1% bovine serum albumin-RPMI was added to the lower chamber. After incubating the chamber for 16 hours in a 5% CO 2 humidified incubator at 37 ° C, the mobile cells pass through the membrane to the lower chamber and the non-mobile cells remain in the upper chamber, with the cell count being independent. In one experiment, it was determined by counting the number of cells in the lower chamber in the 20X field. The degree of infiltration was analyzed with an 8 ⁇ m pore polycarbonate filter coated with 0.5 mm Matrigel in a BD Biocoat Matrigel TM infiltration chamber (BD Bioscience, San Jose, Calif., USA).
  • the infiltration chamber with the upper compartment containing 1 ⁇ 10 5 cells in each and the lower chamber containing 5% bovine serum albumin-RPMI medium were incubated for 24 hours in a 5% CO 2 humidified incubator at 37 ° C. Membranes were then fixed and stained with Diff-Quik, and cell counts were calculated directly on the microscope 20X field through two independent experiments.

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Abstract

본 발명은 GKN 1을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 항암 활성이 우수한 GKN 1 유전자를 포함하는 발현벡터 또는 GKN 1 단백질을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 GKN 1은 암세포의 발생을 억제하는 활성이 우수할 뿐만 아니라, 과발현시 암 세포의 전이를 억제하는 활성도 우수한 특징이 있으므로 항암 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

ＧＫＮ １을 함유하는 항암용 조성물
본 발명은 GKN 1을 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로서, 특히 위암의 발생을 억제하고 암 세포의 전이를 억제하는 활성이 우수한 GKN 1 유전자의 신규한 용도에 관한 것이다.
위암(胃癌, Stomach cancer)은 전 세계적으로 한국, 일본 등에서 많이 발생하는 암으로써 미국, 유럽 등의 서구에서는 발생율이 낮으나, 한국의 경우 암 발생율 1위가 위암이고, 사망율은 폐암에 이어 2위를 차지하고 있다. 위암의 분류를 살펴보면 전체의 95%가 위벽 점막의 샘 세포에서 생기는 선암이며, 그 외 림프계에서 발생하는 림프종, 간질조직에서 발생하는 위장관 간질성종양이 있다.
위암을 일으키는 다양한 발병원 중에서 특히 음식물은 가장 중요한 발병원인으로 밝혀져 있는데, 가공된 육류에 많이 포함되어 있는 질산염, 아질산염이 강력한 발암물질로 알려져 있고, 탄 음식, 맵고 짠 음식이 위암의 원인이 된다고 알려져 있다. 그 밖에 최근 많은 관심을 받고 있는 헬리코박터 파일로리균은 위염과 위궤양의 원인균으로 위암 발생과 연관성이 있는 것으로 밝혀졌다.
또한 암 발병의 원인을 살펴보면, 암을 유발하는 발암 유전자의 비정상적인 활성화로 인해 세포가 증식하거나 반대로 세포의 비정상적인 증식을 억제하거나 세포사멸 프로그램을 작동시켜 특정 세포를 사멸시킴으로써 암세포의 생성을 차단하는 암 억제 유전자에 이상이 생겨 발생하게 되는데, 일단 비정상적으로 활성화된 암 유전자를 갖는 세포라 할지라도 암 억제 유전자가 정상적인 활성을 나타내게 되면 그 세포는 암을 형성하지 못하고 사멸된다. 그러므로 암세포가 되기 위해서는 발암 유전자의 활성화 뿐 아니라 암 억제 유전자의 불활성화가 하나의 세포에서 동시에 나타나야 한다.
이에 최근 들어 전 세계적으로 암의 생성 및 치료와 관련된 유전자의 기능 연구를 통해 치료용 표적을 발굴하고 이들을 진단 및 치료제 개발에 이용하기 위한 치열한 경쟁이 불붙고 있다. 게놈 연구의 활성화와 함께 인간 유전자 DNA 칩 또는 프로테옴 분석 연구가 활발하게 이루어지고 암과 관련된 유전자가 대량 발굴됨에 따라 많은 유전자들의 목록과 관련 데이터베이스는 구축되어 있으나 대부분 이들 유전자들에 대한 세포 내에서의 구체적 생물학적 기능 및 암 관련성은 아직 연구되지 않았거나 불확실하여 실제 암 관련성 또는 진단 및 표적 유전자로서의 활용과 함께 나아가 암을 효과적으로 치료할 수 있는 유전자의 발굴에 상당한 어려움이 있다. 따라서 지금까지 밝혀진 암 관련 유전자 이외에도 새로운 유전자들의 발굴이 필요한 실정이다.
한편, 현재 암을 치료하는 방법 중 3가지 주요 치료법으로는 외과적 치료법, 약물 요법, 방사선 요법이 있는데, 약물요법은 치료에 동반되는 고통이 적고, 외과적 치료나 방사선 치료에 비해 치료 후에도 암의 재발이 상대적으로 적으므로 이에 대해 기대가 모아지고 있다. 따라서 이에 부응할 만한 수많은 항암제가 개발되어 사용되고 있는데, 이들 대부분의 항암제는 암의 이상증식을 염두에 두고 활발하게 분열하는 세포를 선택적으로 죽게 함으로써 항암 효과를 나타내는 것이다. 이러한 항암제는 일반적으로 인체 내에서 활발하게 분열하는 세포인 면역세포, 모근세포와 같은 정상세포도 함께 죽이게 되는 심각한 부작용을 동반하므로 장기간 사용이 불가능한 문제점을 안고 있다. 또한 위암치료를 위한 방법으로는 림프절 절제술, 내시경적 점막절제술, 복강경적 위절제술 등의 방법이 사용되고 있는데, 내시경적 점막절제술은 점막 내 조기위암에 대해 암 병변이 있는 위 점막 주위에 생리식염수를 주입하여 병변부위를 볼록하게 부풀린 다음 병변이 있는 점막을 절제하는 방법으로, 간단한 내시경 시술로 위 절제수술의 고통을 피할 수 있다는 장점이 있지만, 점막에 국한된 조기위암 중 림프절 전이가능성이 낮은 경우에 한해 사용할 수 있다는 한계가 있다.
그러므로 암 발병과 관련하여 주된 기능을 담당하고 이를 이용하여 암의 초기에 예방하고 치료할 수 있는 새로운 항암제의 개발을 위한 표적 유전자의 발굴이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 GKN 1 유전자가 정상 위 점막세포에서 발현되고 위암 조직에서 그 발현이 저하되어 있는 것에 착안하여 상기 유전자의 기능을 연구한 결과, GKN 1 유전자는 위암세포의 증식 및 활성을 억제하고, 암 전이를 저해하는 기능을 갖는다는 사실을 최초로 규명하였고 상기 유전자를 암 치료제로 사용할 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 GKN 1(Gastrokine 1) 단백질 또는 GKN 1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GKN 1 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 세포와 후보물질을 배양하는 단계 및 GKN 1 단백질의 활성 또는 세포 내 발현수준 증가에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 GKN 1(Gastrokine 1) 단백질 또는 GKN 1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GKN 1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GKN 1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 발현벡터 내에 포함되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발현벡터는 도 12의 개열지도를 갖는 pcDNA 3.1-GKN 1일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 위암일 수 있다.
또한 본 발명은 GKN 1 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 세포와 후보물질을 배양하는 단계 및 GKN 1 단백질의 활성 또는 세포 내 발현수준 증가에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 후보물질이 GKN 1 단백질의 활성을 증가시키거나 세포 내에서 GKN 1 유전자의 발현수준을 증가시킬 경우, 항암활성을 갖는 항암제로 판단하는 단계를 추가하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GKN 1 단백질의 활성 또는 세포 내 발현수준은 면역침전법(coimmunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항암제는 위암을 예방 또는 치료할 수 있는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 GKN 1은 암세포의 발생을 억제하는 활성이 우수할 뿐만 아니라, 과발현시 암 세포의 전이를 억제하는 활성도 우수한 특징이 있으므로 항암 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 위암 조직의 GKN 1 면역염색 결과로써, (A)는 소와세포와 표재성 위 상피세포에서의 면역활성을 나타낸 것이고, (B)는 위 선종에서의 면역양성을 나타낸 것이며, (C)는 관상선종에서의 음성 면역염색결과이고, (D)는 위암에서의 면역양성을 나타낸 것이며, (E)와 (F)는 장형위암과 확산형 위암에서의 음성 면역염색 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 GKN 1의 메틸화 상태를 나타낸 것으로써, (A)는 위암조직(T)과 정상 위점막(N)에서 GKN 1 유전자에 대해 메틸화된 DNA(M)와 비메틸화된 DNA(U)를 나타낸 것이고, (B)는 위암세포주에서 GKN 1 유전자에 대한 메틸화된(M) DNA와 비메틸화된(U) DNA를 나타낸 것이다.
도 3은 위암에서 대조군과 비교한 (A) GKN 1 DNA 카피 수와 (B) GKN 1 mRNA 발현의 폴드변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 각각 장형(I), 확산형(D) 및 혼합형(M)의 위암조직(T)과 정상 위점막(N)에서 GKN 1 발현을 나타낸 것이다.
도 5의 (A)는 MTT 분석법을 이용하여 GKN 1이 형질주입된 위암세포에서 시간의 흐름에 따른 세포 생존력을 나타낸 것이고, (B)는 BrdU 분석법을 이용하여 GKN 1이 형질주입된 위암세포에서 시간의 흐름에 따른 세포 증식을 나타낸 그래프이다.
도 6은 GKN 1 형질주입 후 시간에 따른 세포 사멸을 아넥신 V 결합 분석법으로 측정하여 나타낸 것이다.
도 7은 GKN 1 형질주입 24 시간 후 caspase-3 억제제(Z-DEVD-fmk)와 caspase-8 억제제(Z-IETD-fmk) 처리하여 세포 사멸을 아넥신 V 결합 분석법으로 측정하여 나타낸 것이다.
도 8의 (A)는 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 GKN 1 형질주입 24 시간 후 사멸과 관계된 단백질들의 활성을 나타낸 것이고, (B)는 caspase-3 억제제(Z-DEVD-fmk)와 caspase-8 억제제(Z-IETD-fmk)를 처리함으로써, caspase 활성 억제에 대한 결과를 웨스턴 블롯을 수행하여 나타낸 것이다.
도 9는 상처-치유 방법을 통해 세포 이동에 대한 GKN 1의 효과를 나타낸 것으로 점선은 흠집 결함의 경계를 나타낸 것이다.
도 10의 위암세포주 AGS에서 transwell 이동에 대한 GKN 1의 효과에 관한 것으로써, (A)는 멤브레인을 Diff-Quik으로 염색한 결과를 나타낸 것이고, (B)는 광 현미경(light microscopy)하에 세포 수를 계산하여 나타낸 그래프이다.
도 11의 세포 침윤에 대한 GKN1의 효과를 matrigel 분석법을 수행하여 나타낸 결과로써, (A)는 형질주입 24시간 후 매트릭스를 통과하여 침윤한 세포를 촬영한 것이고, (B)는 세포 수를 계산하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명에 따른 GKN 1 유전자를 삽입하여 제조한 재조합 벡터 pcDNA 3.1-GKN 1 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
본 발명은 GKN 1(Gastrokine 1)을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공함에 그 특징이 있으며, 보다 구체적으로는 GKN 1(Gastrokine 1) 단백질 또는 GKN 1(Gastrokine 1) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명자들은 암 발생을 억제할 수 있는 새로운 암 치료제의 개발을 위해 연구하던 중, 최근 포유동물의 위점막 세포로부터 분리된 신규한 단백질인 GKN 1에 주목하였다.
GKN 1(Gastrokine 1)은 AMP-18(antrum mucosal protein-18) 또는 CA11로도 알려져 있으며, 위 전정부에서 발현되어 있는 것으로 알려져 있고, 전정부 점막을 보호하고, 상처 후 회복과 증식을 용이하게 함으로써 치유를 촉진시키는 활성이 있다고 알려진 바 있다(Toback. F. G. et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 285: G344-353, 2003). 그러나 아직까지 GKN 1이 갖는 다른 기능에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.
이에 본 발명자들은 정상세포와는 달리 암세포에서 GKN 1 유전자의 발현이 감소되어 있다는 사실을 확인함으로써 GKN 1 유전자가 암의 발병기작에 관여하고 있다고 추측하였으며, 실제적으로 GKN 1이 항암 활성을 갖는다는 사실을 최초로 규명하였다.
먼저, 본 발명의 일실시예를 통해 GKN 1 유전자의 발현이 암세포에서 감소되거나 소실되어 있다는 사실을 확인했는데, 즉 본 발명의 일실시예에 따르면, 면역조직화학적 방법으로 위암 조직에서의 GKN 1 단백질의 발현을 조사하였는데, 위암 조직을 고정시켜 절편을 제작한 다음 GKN 1 항체, biotinylated goat anti-mouse 항체를 이용하여 검출하고, 페록시다아제가 연결된 아비딘-바이오틴 복합체와 배양한 다음, 디아미노벤지딘을 색원체로 이용하였고, 슬라이드는 메이어 헤마토크실린 용액으로 대비 염색하여 발현을 분석한 결과, 전정부(antrum)와 체부(corpus)의 정상 위점막 세포 세포질에서 면역양성을 보였으며, 위 선종(adenomas)과 암(carcinomas) 조직에서는 GKN 1의 발현이 감소하거나 소실된 것으로 관찰되었다(도 1 및 표 1 참조).
또한 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 동결 위암 샘플로부터 추출한 GKN 1 게놈 DNA와 mRNA를 정량화하여 Stratagene Mx 3000P QPCR 시스템에서 real time SYBR Green QPCR를 수행한 결과, GKN 1의 카피수는 정상 위점막 조직 DNA와 비교하여 위암 DNA에서 50% 이상 감소하였으며, GKN 1 mRNA 발현수치는 정상 위 점막 조직에서는 GKN 1 유전자 전사물을 발현하는 반면, 모든 위암 조직은 발현이 감소하거나 소실되었다(도 3 참조).
이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 본 발명의 GKN 1 유전자가 항암 활성을 가질 수 있다는 예측 하에, 암세포에서 GKN 1 유전자를 과발현 시킬 경우, 암 세포의 세포증식과 세포사멸에 미치는 영향을 조사하였는데, 즉 본 발명의 일실시예에 따르면, 위암세포주 AGS에 형질주입 시킨 GKN 1을 시간의 흐름에 따라 MTT분석과, BrdU 결합 분석을 수행한 결과, 형질주입된 세포에서 세포 생존력과 세포 증식이 눈에 띄게 억제되었으며(도 5참조), FITC-표지된 annexin V 세포 염색한 결과, GKN 1 형질주입된 세포에서 사멸세포가 시간이 흐름에 따라 증가하였다(도 6참조).
따라서 본 발명에 따른 GKN 1은 암 세포의 증식을 억제하고 사멸을 유발하는 특징이 있다.
또한 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 시험관 내(in vitro)에서 상처-치유, transwell chemotaxis, 침윤 분석을 수행한 결과, GKN 1 발현 벡터로 형질주입된 AGS 세포와 비교하여 GKN 1 유전자가 삽입되지 않은 대조군 발현벡터와 GKN 1 siRNA로 형질주입된 세포는 형질주입 후 눈에 띄게 상처 부위로 이동하였고(도 9참조), GKN 1 형질주입된 AGS 세포의 이동은 감소하였으며(도 10참조), GKN 1이 과발현된 AGS세포에서 침윤이 눈에 띄게 억제되었다(도 11참조),
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 GKN 1이 암 세포 이동을 막아 상피세포의 간질세포로의 전환을 억제하고, 과발현시 위암세포주에서 침윤도 억제한다는 사실을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은 GKN 1(Gastrokine 1) 단백질 또는 GKN 1(Gastrokine 1) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암용 조성물을 제공할 수 있다.
바람직하게, 상기 GKN 1 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 GKN 1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
또한 본 발명에 따른 상기 GKN 1 단백질은 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 GKN 1과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 상기에서 기재한 GKN 1의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 본 발명에 따른 GKN 1의 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 GKN 1의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 GKN 1의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른　단백질과　융합으로　만들어진　융합단백질 등이 이에 포함될 수 있다.
또한 상기 GKN 1(Gastrokine 1) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터 내로 공지의 방법에 의해 도입시킨 후 상기 발현 벡터를 당업계에 공지된 다양한 방법으로 형질도입(transduction) 또는 형질주입(transfection)에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.
플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법이며 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로(Nabel, E. G. et al., Science, 249:1285-1288, 1990), 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 pcDNA3.1(Invitrogen) 플라스미드를 사용하여 GKN 1 유전자가 삽입된 도 12의 개열지도를 갖는 재조합 발현벡터인 pcDNA3.1-GKN 1을 제조하였다.
본 발명에 따른 핵산을 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질주입(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질주입(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질주입(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질주입(polybrene-mediated trans fection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 건(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 종양세포 내로 도입할 수 있다(Wu. et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu. et al., Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988). 바람직하게는, 일시적 형질주입방법을 사용할 수 있다.
또한 상기 GKN 1을 발현시킬 수 있는 벡터는 공지의 방법에 의해 세포, 조직 또는 체내로 투여될 수 있는데, 예를 들면, 국소적으로, 비경구, 경구, 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 특히, 상기 벡터는 표적 조직의 종양세포를 치료하기 위한 유효량으로 표적 암 또는 종양세포 내로 직접 주사할 수 있다. 특히, 눈, 위장관, 비뇨생식기관, 폐 및 기관지 시스템과 같은 체강(body cavity)에 있는 암 또는 종양의 경우에는 본 발명의 약학적 조성물을 암 또는 종양에 의해 영향을 받는 유강 기관(hollow organ) 내에 바늘, 도관(catheter) 또는 다른 종류의 수송튜브를 이용하여 직접 주입할 수 있다.
한편, 본 발명의 GKN 1은 암세포의 증식을 억제하고, 세포사멸을 촉진시킴과 동시에 암세포의 전이 및 침윤을 억제하는 활성이 있으므로 본 발명은 상기 유전자를 이용한 항암제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 항암제 스크리닝 방법은, (a) GKN 1 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 세포와 후보물질을 배양하는 단계; 및 (b) GKN 1 단백질의 활성 또는 세포 내 수준 증가에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기에서 GKN 1 단백질의 세포 내 수준 증가의 의미는 GKN 1 유전자의 발현이 증가되거나 또는 GKN 1 단백질의 분해가 억제되어 GKN 1 단백질의 농도가 증가되는 것을 말한다. 상기 GKN 1 유전자 발현은 GKN 1 유전자의 전사 및 단백질로의 번역 과정을 포함한다. 따라서 상기 후보물질이 세포 내에서 GKN 1 유전자의 발현 및 단백질의 수준을 증가시킬 경우, 상기 후보물질을 항암활성을 가지는 물질로 판단할 수 있다.
또한, GKN 1 단백질의 활성 및 세포 내 수준을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 여러 가지 방법을 사용할 수 있는데, 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 면역침전법(coimmunoprecipitation), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbentassay), 방사능면역분석법(RIA), 면역조직화학, 웨스턴 블로팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 GKN 1을 표적으로 한 스크리닝 방법은 고효율 스크리닝(high throughput screening; HTS)을 적용할 수 있다. HTS는 다수의 후보물질을 병행 시험하여, 다수의 후보물질의 생물학적 활성에 대해 동시에 또는 거의 동시에 스크리닝하는 방법이다. 특정 양태로서, 96-웰 미세역가 플레이트 또는 192-웰 미세역가 플레이트에서 세포주를 배양하고, 여기에 다수개의 후보물질을 처리한 다음 면역화학적 방법에 의해 GKN 1의 발현정도를 측정할 수 있다. 상기 웰은 전형적으로 50㎕ 내지 500㎕에 이르는 검정 용적을 필요로 하며, 플레이트 이외에, 96-웰 포맷을 광범위한 균일계 및 불균일계 검정에 적합하게 하기 위해 다수의 계기, 기구, 피펫터, 로봇, 플레이트 세척기 및 플레이트 판독기가 상업적으로 이용 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 항암 조성물은 암을 예방 및 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 항암용 조성물은 암을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수도 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1>
GKN 1 이 삽입된 재조합 벡터 제조 및 위암세포로의 형질전환
GKN 1 을 위암세포주인 AGS에 형질주입하기 위해, 우선 위암세포주 AGS를 열로 불활성화된 10% 소태아혈청과 함께 5% CO2의 RPMI-1640 배지에서 37℃로 배양하여 준비하였다. 이후, GKN1의 cDNA를 PCR 방법을 이용해 증폭시키고, pcDNA3.1(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 벡터에 제한효소 사이트(EcoRⅠ과 BamHⅠ을 사용)를 이용하여 도 12의 개열지도를 갖는 pcDNA3.1-GKN 1 재조합 벡터를 제조한 다음, Escherchia coli DH5a 수용성 세포(competent cell)에 형질 전환하였다. 형질 전환된 세포는 앰피실린이 포함된 LB agar 고체배지에 배양한 후 콜로니로부터 culture seed를 만들어 대량 배양 하였으며, 배양액으로부터 세포를 수집하여 DNA를 정제하고, pcDNA3.1-GKN 1 벡터를 제조하였다. 그리고 직경 60mm디쉬에서 Lipofectamine Plus Transfection Reagent(Invitrogen)를 이용하여, 발현벡터(총 DNA 5㎍)를 배양한 AGS 세포로 형질주입 시켰다.
<실시예 2>
면역조직화학을 통한 GKN 1의 발현 패턴 분석
면역조직화학적 분석을 위해, 포르말린 용액으로 고정한 후 파라핀 처리된 169개의 위암조직 샘플을 함유하도록 조직 마이크로어레이 수여부 블락을 설계하였다. 각 암으로부터 직경 2mm로 3개의 조직 코어를 취해 시판 마이크로어레이 기기(Beecher Instruments, Micro-Array Technologies, Silver Spring, MD, USA)를 이용하여 새로운 수여부 파라핀 블락으로 옮기고, 각 종양 근처에 위치한 정상 위 점막의 실린더 하나도 수여부 블락으로 옮겼다. 모든 샘플은 사용 전 날 2μm 절편으로 절단하여 표준 프로토콜에 따라 보관해 두었다. 또한 면역조직화학 시그널을 최대화하기 위해서, 구연산염 버퍼에서 항원 회복하는 방법과 biotinylated tyramide로 시그널을 증폭하는 방법을 둘 다 사용하였는데, 구체적으로 열로 유발된 에피토프(epitope) 회복 방법은 10 mmol/L 구연산염 버퍼(pH 6.0)로 채운 Coplin 용기에 슬라이드를 담그고, 700W 전자 레인지안의 압력 쿠커(Nordic Ware, Minneapolis, MN, USA)에서 30분 동안 버퍼를 끓여 수행한 다음, Coplin 용기를 20분 동안 식혔다. 그리고 streptavidin-peroxidase와 biotinylated tyramide를 함유하는 Renaissance TSA Indirect Kit(NEN Life Science, Boston, A, USA)를 사용하였는데, 우선 슬라이드를 PBS로 헹군 다음, 내인성 페록시다아제(endogenous peroxidase) 활성을 제거하기 위해 PBS로 희석된 1% H2O2에 담가 실온에서 15분간 처리하였다. 그리고 슬라이드를 TNT 버퍼(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L NaCl, 0.05% Tween 20)로 20분간 세척한 다음, TNB 버퍼(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L NaCl, 0.5% blocking reagent) 처리하였다. 이후 절편을 GKN 1 항체(1/100; Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO, USA)와 함께 4℃에서 밤새 배양하고, biotinylated goat anti-mouse 항체(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 검출한 다음, 페록시다아제 연결된 아비딘-비오틴 복합체와 함께 배양하였다. 디아미노벤지딘을 색원체로 이용하였고, 슬라이드는 메이어 헤마토크실린 용액으로 대비 염색하였다. 항원 염색 결과 분석은 세포질의 30% 이상이 양성으로 염색되었을 때 양성이라고 간주하였으며, 두 명의 병리학자가 독립적으로 검토하였다. 음성 대조군으로, 일차 항체를 비면역성 혈청으로 대체한 것을 이용하였다.
표 1
Parameters GKN 1 protein expression
+ - P value
Adenomas 4 36 -
Carcinomas - - -
Tumor location - - 0.3722
Upper 3 15 -
Lower 17 155 -
Size - - 0.7814
<6.5 cm 11 99 -
>6.5 cm 9 71 -
No. of metastatic L/N≠ - - 0.3295
N0(=0) 2 19 -
N1(1≤ ≥6) 6 57 -
N2(7≤ ≥15) 10 90 -
N3(>15) 2 4 -
Differentiation† - - 0.7459
Intestinal 9 83 -
Diffuse 11 87 -
≠lymph node; †Lauren’s classification
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 위전정부(antrum)와 체부(corpus)의 정상 위점막 세포 세포질에서 GKN 1에 대해 중간부터 강한 면역양성이 눈에 띄게 나타났다. 그러나 섬유아세포 같이 주위의 상응하는 기질세포들은 GKN 1에 음성이었다.
또한 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 위 선종(adenomas)과 암(carcinomas)의 각 36(90%)개 샘플과 170(89.5%)개 샘플에서 GKN 1 발현이 감소하거나 손실된 것으로 관찰되었다. 그리고 92개 장형과 98개 미만형 위암 샘플의 각각 9(9,7%)개와 11(11.2%)개에서 GKN 1 단백질 발현이 관찰되었으며, 조기 위암과 진행형 위암의 각 19(90.5%)개와 151(95.0%)개 샘플에서 GKN 1 발현이 감소하거나 손실된 것으로 나타났다.
<실시예 3>
GKN 1 유전자의 돌연변이(Mutation) 분석
위암세포에서 GKN 1 발현이 감소되는 원인을 알아보기 위해 염기 서열 분석을 통해 GKN 1 돌연변이를 조사하였다. 이를 위해 methacarn 고정된 총 81개의 위암 샘플과 40개의 위 선종 샘플을 가톨릭대학교 의과대학 부속병원으로부터 제공받았으며, 위암 샘플의 45개는 장형이고 36개는 미만형이었다. 위암의 평균 크기는 6.5cm였고, 위선종의 크기는 모두 2cm보다 작았으며, 제공받은 샘플들은 모두 가족성 암이 아니었다. 각 종양 세포에 상응하는 정상 점막세포의 게놈 DNA는 GKN 1 유전자의 전체 코딩 영역을 커버하는 6세트의 프라이머로 증폭되었으며, 프라이머 서열을 하기 표 2에 나타내었다. 각 PCR(중합연쇄반응)은 표준 조건으로 수행되었으며 PCR 조건은 표 3에 나타내었다. PCR 결과물의 서열 분석은 cycle sequencing kit (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA)를 이용하였다.
표 2 6세트의 프라이머 서열
Exon 프라이머 프라이머서열 서열번호 AnnealingTm
E1 sense 5'-CAACCTGGTTAAGTACAAAT-3' 3 52℃
E1 anti-sense 5'-GCAGACCTCCTAAATCTC-3' 4
E2 sense 5'-CAACCTGGTTAAGTACAAAT-3' 3 50℃
E2 anti-sense 5'-GCAGACCTCCTAAATCTC-3' 4
E3 sense 5'-CACCTTTTCAAGTTTGCTAC-3' 5 52℃
E3 anti-sense 5'-ATTGCACGTTGACTACCTAC-3' 6
E4 sense 5'-TCACTATTTGCCATCTACTT-3' 7 50℃
E4 anti-sense 5'-AAACCTCTCCCCTCAC-3' 8
E5 sense 5'-CTCTCCCATTCTTCCTTTCT-3' 9 54℃
E5 anti-sense 5'-CCCACCAGCACTAACTTG-3' 10
E6 sense 5'-CATTAATATAGGCTTCTTCT-3' 11 50℃
E6 anti-sense 5'-CAGCATATTCAGATGACT-3' 12
표 3 PCR 조건
Initially Denatured 12 min at 94℃
Denatured 40 sec 94℃ ┓35 cycle┛
Annealing 40 sec at 50-54℃
Extension 40 sec at 72℃
Final Extension 5 min 72℃
그 결과, 위선종(gastric adenomas)과 위암(gastric carcinomas)에서 GKN 1 유전자의 돌연변이는 발견되지 않았다. 결과의 신빙성을 확실히 하기 위해 조직 미세절제(microdissection), PCR, 염기 서열분석을 포함한 실험들을 세 번 반복하여 수행하였고, 결과는 일치하였다.
따라서 위암세포에서 GKN 1 유전자의 발현 감소는 돌연변이에 의한 것이 아니라는 사실을 알 수 있었다.
<실시예 4>
GKN 1 의 메틸화 상태 분석
상기 실시예 3을 통해 위암세포에서 GKN 1의 발현 감소가 돌연변이에 의한 것이 아님을 확인함에 따라 GKN 1 프로모터영역의 메틸화와 관련이 있는지를 분석하기 위해, 25개의 동결 위암샘플과 13개의 위암세포주(AGS, MKN-1, MKN-45, MKN-74, KATO-III, SNU-1, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-520, SNU-601, SNU-638, SNU-668, SNU-719)를 이용하였는데, 이 샘플들은 보건복지가족부의 지원을 받는 인체자원중앙은행의 구성원인 전남대학교 화순병원 한국인체자원은행으로부터 제공받았다. GKN 1 유전자의 프로모터 영역에서 메틸화 상태는 DNA의 소디움 바이설파이트 처리 후 메틸화 특이적인 PCR(Methylation specific PCR, MSP)를 수행하여 결정되었다. 바이설파이트로 치환된 DNA 5㎕로 메틸화된 GKN 1과 비메틸화된 GKN 1에 대한 2 세트의 프라이머를 이용해 MSP 하였다. 프라이머 서열은 하기 표 4와 표 5에 나타냈으며, PCR 조성 및 조건을 각각 표 6과 표 7에 나타내었다. 각 PCR 결과물은 즉시 2% 아가로즈 겔로 옮겨 UV 광선 조명에 보일 수 있도록 에티듐 브로마이드로 염색한 다음 전기영동 하였다.
그 결과, 위선종(gastric adenomas)과 위암(gastric carcinomas)에서 GKN 1 유전자의 돌연변이는 발견되지 않았다. 결과의 신빙성을 확실히 하기 위해 조직 미세절제(microdissection), PCR, 염기 서열분석을 포함한 실험들을 세 번 반복하여 수행하였고, 결과는 일치하였다.
따라서 위암세포에서 GKN 1 유전자의 발현 감소는 돌연변이에 의한 것이 아니라는 사실을 알 수 있었다.
<실시예 4>
GKN 1 의 메틸화 상태 분석
상기 실시예 3을 통해 위암세포에서 GKN 1의 발현 감소가 돌연변이에 의한 것이 아님을 확인함에 따라 GKN 1 프로모터영역의 메틸화와 관련이 있는지를 분석하기 위해, 25개의 동결 위암샘플과 13개의 위암세포주(AGS, MKN-1, MKN-45, MKN-74, KATO-III, SNU-1, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-520, SNU-601, SNU-638, SNU-668, SNU-719)를 이용하였는데, 이 샘플들은 보건복지가족부의 지원을 받는 인체자원중앙은행의 구성원인 전남대학교 화순병원 한국인체자원은행으로부터 제공받았다. GKN 1 유전자의 프로모터 영역에서 메틸화 상태는 DNA의 소디움 바이설파이트 처리 후 메틸화 특이적인 PCR(Methylation specific PCR, MSP)를 수행하여 결정되었다. 바이설파이트로 치환된 DNA 5㎕로 메틸화된 GKN 1과 비메틸화된 GKN 1에 대한 2 세트의 프라이머를 이용해 MSP 하였다. 프라이머 서열은 하기 표 4와 표 5에 나타냈으며, PCR 조성 및 조건을 각각 표 6과 표 7에 나타내었다. 각 PCR 결과물은 즉시 2% 아가로즈 겔로 옮겨 UV 광선 조명에 보일 수 있도록 에티듐 브로마이드로 염색한 다음 전기영동 하였다.
표 4 메틸화 PCR 결과물을 이용한 MSP
프라이머 프라이머 서열 서열번호
methylated sense 5'-TAATGAATAGGAGTTTATTAAGCGA-3' 13
methylated anti-sense 5'-AAATACATAA ATAAACATAACTCTATCACG-3' 14
표 5 비메틸화 PCR 결과물을 이용한 MSP
프라이머 프라이머 서열 서열번호
unmethylated sense 5'-TTTGAATAATGAATAGGAGTTTATTAAGTG-3' 15
unmethylated anti-sense 5'-AATACATAAATAAACATAACTCTATCACAC-3' 16
표 6 PCR 조성
template DNA 5 ㎕
primer 0.5
dNTP 0.2
MgCI2 1.5 mM
Ampli Taq gold polymerase 0.4 unit
10X buffer 3 ㎕
총 30 ㎕
표 7 PCR 조건
Initially Denatured 1 min at 95℃
Denatured 30 sec 95℃ ┓40 cycle┛
Annealing 30 sec at 58℃
Extension 30 sec at 72℃
Final Extension 5 min 72℃
25쌍의 비암성 위점막과 위암조직에서 MSP를 수행하여 GKN 1 유전자의 바이설파이트-변형된 DNA 메틸화를 분석한 결과, 도 2A에 나타낸 바와 같이, 대부분의 암조직과 그에 상응하는 정상 위 점막에서 GKN 1 유전자에 대해 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA가 둘 다 나타났다. GKN 1 프로모터 영역에서의 과메틸화(Hypermethylation)는 2개의 위암 샘플(4번과 8번)에서만 관찰되었다. 또한 도 2B에 나타낸 바와 같이, 14개의 위암 세포주에서는 메틸화된 PCR 결과물과 비메틸화 된 PCR 결과물을 모두 확인할 수 있었다.
따라서 상기 결과를 통해 위암세포에서의 GKN 1 유전자의 발현감소는 GKN 1 유전자의 프로모터 영역에서의 메틸화와는 크게 관련성이 없다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 5>
GKN 1 의 DNA 카피 수 변화와 mRNA 발현 분석
25개의 동결 위암 샘플로부터 추출한 게놈 DNA와 mRNA를 정량화한 다음, Stratagene Mx 3000P QPCR 시스템에서 real time SYBR Green QPCR를 수행하였다. GKN 1 DNA 카피 수 검출에 특이적인 프라이머는 Genbank의 게놈 서열에 따라 디자인하였고 이를 하기 표 8에 나타냈으며, 모든 샘플은 항상 발현되는 유전자 GAPDH에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 PCR로 증폭되었고, normalize 되었다. GAPDH 프라이머는 하기 표 9과 같다.
표 8
프라이머 프라이머 서열 서열번호
GKN 1 sense 5'-CAACCTGGTTAAGTACAAAT-3' 3
GKN 1 anti-sense 5'-TCACTATTTGCCATCTACTT-3' 7
표 9
프라이머 프라이머 서열 서열번호
GAPDH sense 5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3' 17
GAPDH anti-sense 5'-TTCTAGACGGCAGGTCAGGT-3' 18
SYBR Green 분석을 위한 프라이머는 유전자 특이적인 비상동성 DNA 서열을 토대로 디자인하였고, mRNA 발현을 위해 cDNA를 Roche Molecular System reverse transcription kit(Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 합성하였다. QPCR을 위해 50ng cDNA는 Fullvelocity SYBR Green QPCR Master Mix(Stratagene, La Jolla, CA, USA)와 sense, anti-sense 프라이머 각각 20pmol/㎕를 이용하여 Stratagene Mx 3000P QPCR system에서 증폭되었다. mRNA를 위한 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 GKN 1 유전자에 대해 알려진 정보에 따라 제작하였고, 하기 표 10에 나타냈으며, DNA와 mRNA 추출과 역전사의 정확도를 확실히하기 위해, 모든 샘플은 항상 발현하는 유전자인 GAPDH에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 PCR 증폭되었고, normalize되었다. 사용한 GAPDH 프라이머는 하기 표 11과 같다.
표 10
프라이머 프라이머 서열 서열번호
GKN 1 sense 5'-CAAAGTCGATGACCTGAGCA-3' 19
GKN 1 anti-sense 5'-CTTGCCTCTTGCATCTCCTC-3' 20
표 11
프라이머 프라이머 서열 서열번호
GAPDH sense 5'-AAATCAAGTGGGGCGATGCTG-3' 21
GAPDH anti-sense 5'-GCAGAGATGATGACCCTTTTG-3' 22
SYBR Green 분석을 위한 프라이머는 유전자-특이적인 비상동성 DNA서열을 토대로 제작하였다. 유전자 발현 산물의 상대적 양을 정량하기 위해 표준곡선 방법을 이용하였으며, 이 방법은 다양한 샘플에서 표적 DNA와 mRNA의 상대적인 함량의 직접적인 비교에 사용될 수 있는 유닛-리스(unit-less) normalized 발현 수치를 제공한다. 모든 샘플은 복제되어 테스트되었고 평균값을 정량에 사용하였다.
그 결과, 도 3A에 나타낸 바와 같이, real time-QPCR 분석에서 GKN 1의 카피수는 주위 위 점막 조직 DNA와 비교하여 20개의 위암 DNA에서 50% 이상 감소하였다. 또한 8개의 확장형 위암 중 5개, 14개의 장형 위암 중 10개, 3개의 혼합형 위암 중 3개 샘플에서 GKN 1의 카피 수가 감소한 것으로 검출되었다.
또한 위암 조직의 GKN 1 mRNA 발현 수치는 GAPDH에 normalization한 다음 대조군과 비교해 폴드 변화로 나타냈는데, 그 결과, 도 3B에 나타낸 바와 같이, 모든 비암성 위 점막 조직은 GKN 1 유전자 전사물을 발현한 반면, 모든 위암 조직은 손실이나 감소된 발현을 보였으며, 13개의 위암세포주는 유전자 전사물의 완벽한 부재(complete absence)를 보였다.
<실시예 6>
위암세포주와 조직에서 GKN 1 단백질의 발현 분석
상기 실시예 2를 통해 확인한 바와 같이, 위암세포주 또는 조직에서 GKN 1 단백질의 수준이 정상세포 또는 조직에 비해 감소되는지를 재확인하기 위해, 웨스턴 블롯 법으로 25개의 동결 위암 샘플, 대응하는 주변 정상 위 조직, 그리고 13개의 위암세포주를 대상으로 실험하였다. 우선 샘플을 막자와 막자사발을 이용하여 액체 질소 하에 아주 고운 가루로 갈고, 1X protease inhibitor mix (Roche)가 보충된 차가운 Nonidet P-40 용해 버퍼에 현탁하였다. 그 다음 세포 용해물을 10% 폴리아크릴아미드 겔로 분리하고, hybond-PVDF transfer membrane (Amersham)에서 블롯한 다음, anti-GKN 1 단일 클론 항체(sigma)으로 탐침하고, Horse radish peroxicase(HRP)가 결합되어 anti-mouse IgG와 함께 배양하였다. 단백질 밴드는 enhanced chemiluminescence Western blotting detection reagents(Amersham)를 이용하여 검출하였다.
그 결과, 어떤 위암 세포주에서도 GKN 1 유전자의 발현을 확인할 수 없었다. 또한 위암 조직을 웨스턴 블롯으로 검사한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, GKN 1 단백질 발현이 상응하는 위 점막 조직과 비교하여 25개의 암 조직 중 21개(84.0%)에서 감소하거나 손실되었는데, 8개의 미만형 위암 중 6개(75.0%), 14개의 장형 위암 중 13개(92.8%) 그리고 3개의 혼합형 위암 중 2개(66.7%)에서 GKN 1 단백질의 발현이 감소되었다. 유전자의 프로모터 영역에서 과메틸화(hypermethylation)된 2개의 위암 조직도 GKN 1 발현이 감소하거나 손실된 것으로 나타났다.
<실시예 7>
세포 증식과 세포 사멸에서 GKN 1의 역할 분석
<7-1> 세포 생존력 분석
앞서 살펴본 바와 같이, 정상세포에 비해 위암세포에서 GKN 1 유전자의 발현이 감소된다는 사실을 통해, 본 발명자들은 GKN 1이 위암의 억제활성을 갖는지를 다음과 같은 실험을 통해 분석하였다.
즉, 상기 실시예 1에서 제조한 GKN 1 발현 벡터를 이용하여 세포 생존력 분석을 수행하였는데, 발현벡터로 위암 세포주에 형질주입 시킨 다음 24, 48 및 72시간이 경과했을 때 각각 MTT[3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide]분석을 수행하였다. 흡광도는 분광광도계를 이용하여 540nm에서 측정하였고, 생존능력은 대조군에 상대적인 발현을 통해 측정하였다. 또한 세포 증식에서의 GKN 1의 효과를 보기 위해, BrdU 세포 증식 분석 키트(Millipore, Billerica, MA, USA)를 이용하여 일시적으로 형질주입 시킨 후 24, 48 및 72시간이 경과했을 때 각각 BrdU(Bromodeoxyuridine) 결합 분석을 수행하였다. 흡광도는 분광광도계를 이용하여 450nm에서 측정하였고, 증식은 대조군에 상대적인 발현을 통해 측정하였다. 여기서 상기 대조군으로는 형질주입되지 않은 세포를 이용하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, GKN 1을 발현하는 발현벡터로 형질주입된 세포에서는 대조군에 비해 세포 생존력과 세포 증식이 시간이 흐름에 따라 유의적으로 억제되었다.
<7-2> 세포 사멸 분석
세포사멸 분석을 위해, 아넥신V 결합 분석을 수행하였다. 아넥신V는 세포 멤브레인에 포스파티딜세린(Phosphatidylserine, PS)을 나타내는 세포와 결합하고, 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide, PI)는 손상된 세포막을 가진 세포 DNA를 염색한다. 형질주입된 AGS세포를 차가운 PBS로 두 번 세척하고, 100㎕ 결합버퍼에 재현탁하였으며, 각 샘플마다 상층액 100㎕를 블로킹 용액 400㎕와 혼합하였다. 그 다음 아넥신 V-FITC 5㎕(1㎍/ml)와 PI 5㎕(2㎍/ml)를 혼합물에 추가하고, 빛이 없는 곳에서 15분 배양한 후, 형광활성화세포분류기(fluorescence activated cell sorter; BD Biosciences, USA)에서 세포를 분석하였다. PI에 염색되지 않고 형광에만 양성인 세포를 사멸 세포로 간주하였다. 또한 GKN 1이 caspase에 의한 세포자살을 유발하는지 확인하기 위해, 세포사멸의 억제를 위한 caspase-3 억제제(Z-DEVD-fmk; Calbiochem, San Diego, CA, USA)와 caspase-8 억제제(Z-IETD-fmk; Calbiochem)를 디메틸설폭사이드(dimethylsulphoxide)에 용해시켜 사용하였다.
FITC-표지된 annexin V 세포 염색을 통한 세포사멸 분석 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, GKN 1 발현벡터로 형질주입된 위암세포에서 사멸세포가 시간이 흐름에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 또한 세포 사멸의 억제를 위해 각 50의 caspase 3 억제제(Z-DEVD-fmk), caspase-8 억제제(Z-IETD-fmk)를 처리한 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, GKN 1로 유발된 세포사멸은 두 caspase 억제제에 의해 억제되는 것으로 나타났다.
<7-3> 세포사멸의 웨스턴 블롯 분석
GKN 1 형질주입시킨 다음 세포사멸의 분자적 메카니즘을 확인하기 위해, 세포사멸과 관련된 단백질의 발현 수치를 측정하였는데, 이를 위해 anti-GKN 1, anti-cleaved caspase 8, anti-BAX, anti-cytochrome c, anti-caspase 3, anti-cleaved caspase 3, anti-PARP, anti-GAPDH, anti-mouse IgG, anti-rabbit IgG 등의 항체들을 사용하였고, 결합항체 검출을 위해 ECL plus Western blotting detection system(Amersham)을 사용하였으며, 웨스턴 블롯 후 밴드의 강도는 LAS 3000(Fuji Film, Japan)을 이용하여 정량하였다.
또한 GKN 1이 caspase에 의한 세포자살을 유발하는지 웨스턴 블롯을 통해 알아보기 위해, 세포 사멸 억제를 위한 caspase-3 억제제와 caspase-8 억제제 처리 후 웨스턴 블롯을 수행하였다.
웨스턴 블롯 분석으로 GKN 1 발현벡터로 형질주입된 세포 용해물에서 세포사멸과 관련된 단백질들을 확인한 결과, 도 8A에 나타낸 바와 같이, 잘린 형태의 caspase 8, caspase 3, PARP가 GKN 1 발현벡터로 형질주입된 세포에서 발견되었다. 그러나 BAX, cytochrome c를 포함한 미토콘드리아 경로를 통한 세포 사멸 관련 단백질들의 발현 변화는 나타나지 않았다. 또한 도 8B에 나타낸 바와 같이, GKN 1로 유발된 세포사멸은 두 caspase 억제제에 의해 확실하게 억제되었다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 GKN 1 유전자는 위암 세포의 세포사멸 촉진을 통해 항암 활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었고, 세포 사멸 촉진은 caspase-3 및 caspase-8과 같은 세포사멸 인자의 활성을 통해 이루어진다는 사실을 알 수 있었다.
<실험예 8>
세포이동과 침윤 분석
GKN 1의 또 다른 항암 활성 분석을 위해, GKN 1이 암세포의 이동과 침윤에 미치는 영향을 살펴보았는데, 즉 GKN 1 발현벡터와 GKN 1 siRNA를 AGS세포로 각각 형질주입시킨 후, 직접 200 ㎕ 피펫 팁으로 융합성 세포 단일층을 상처 내어 무세포(cell-free) 영역을 만들었다. 세포 이동은 형질주입시킨 후 6, 12 및 24 시간이 경과하였을 때마다 각각 평가하였다. 세포의 운동성은 48-웰 microchemotaxis 챔버에서 젤라틴 코팅된 8㎛ polyvinylpyrrolidine-free polycarbonate (Neuroprobe, Cabin John, MD, USA)로 분석되었다. 6 X 104 세포를 함유하는 세포 서스펜션은 각각 microchemotaxis 챔버의 상위 챔버로 추가하였고, 1% 소혈청알부민-RPMI를 함유하는 배지는 하부 챔버로 추가하였다. 이후 챔버를 37℃의 5% CO2 가습 인큐베이터에서 16시간동안 배양하고 나면, 이동세포는 멤브레인을 통과해 아래쪽 챔버로 이동하고 비-이동세포는 위쪽 챔버에 남아있게 되는데, 세포수는 독립적인 세 번의 실험으로 20X 필드에서 아래쪽 챔버에 있는 세포수를 계산함으로써 결정하였다. 침윤 정도는 BD Biocoat MatrigelTM 침윤 챔버(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)에서 0.5 mm Matrigel이 코팅된 8 ㎛ 기공의 폴리카보네이트 필터와 함께 분석되었다. 각각 안으로 1X105개 세포를 함유하는 상위 칸막이를 가진 침윤 챔버와 5% 소 혈청 알부민-RPMI 배지를 포함한 하부 챔버는 37℃의 5% CO2 가습 인큐베이터에서 24시간동안 배양하였다. 그 다음 멤브레인을 고정하고 Diff-Quik으로 염색하였으며, 두 번의 독립적인 실험을 통해 현미경 20X필드에서 직접 세포수를 계산하였다.
시험관내에서 상처 치료, transwell chemotaxis, 침윤 분석을 수행한 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, GKN 1 발현벡터로 형질주입된 AGS 세포와 비교하여 GKN 1 유전자가 삽입되지 않은 대조군 발현벡터(mock)와 GKN 1 siRNA로 형질주입된 세포는 각 12시간과 24시간 후 눈에 띄게 상처 부위로 이동한 반면, GKN 1이 과발현된 세포는 세포의 이동이 억제되는 것으로 나타났다.
*또한 microchemotaxis 챔버와 chemoattractant로 혈청을 이용하여 주화성(chemotaxis)에의 GKN 1의 효과를 실험한 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, GKN 1 형질주입된 AGS 세포에서 하부 챔버로의 세포 이동은 대조군 발현벡터만 처리한 것과 siRNA 처리된 AGS 세포에 비해 41.5%로 감소하였다.
*나아가 AGS 위암세포 침윤에 GKN 1의 효과를 알아보기 위해 matrigel 침윤도 분석을 수행한 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 대조군 발현 벡터만 형질주입된 세포에서보다 GKN 1이 과발현된 AGS세포주에서 침윤이 눈에 띄게 억제되었으며, 이는 GKN 1 과발현이 위암 세포주에서 침윤도 억제함을 통해 항암 활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다.
통계분석
GKN 1발현과 위암의 임상병리학 변수간의 연관성 검정을 위해 카이스퀘어 테스트(Chi-square test)를 하였다. P값이 0.05미만인 수준에서 통계적 유의성으로 간주하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

  1. GKN 1(Gastrokine 1) 단백질 또는 GKN 1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 GKN 1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 GKN 1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 발현벡터 내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 발현벡터는 도 12의 개열지도를 갖는 pcDNA 3.1-GKN 1인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 위암인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  7. GKN 1 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 세포와 후보물질을 배양하는 단계; 및
    GKN 1 단백질의 활성 또는 세포 내 발현수준 증가에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 후보물질이 GKN 1 단백질의 활성을 증가시키거나 세포 내에서 GKN 1 유전자의 발현수준을 증가시킬 경우, 항암활성을 갖는 항암제로 판단하는 단계를 추가하는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 GKN 1 단백질의 활성 또는 세포 내 발현수준은 면역침전법(coimmunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항암제는 위암을 예방 또는 치료할 수 있는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
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