KR102430127B1 - 인테그린 알파 6 와 알파 x를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인테그린 α6, 인테그린 αX로 이루어진 군중 어느 하나 이상의 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는, 엑소좀을 표적 세포에 전달하기 위한 키트, 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 항암성분이 암세포로 특이적으로 내재화할 수 있도록 하여 암 예방 또는 치료 효능을 높일 수 있다.

Description

인테그린 알파 6 와 알파 X를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION INCLUDING EXOSOME CONTAINING INTEGRIN α6 AND αX FOR PREVENTING OR TREATING GASTRIC CANCER}

본 발명은 인테그린 α6, 인테그린 αX로 이루어진 군 중 어느 하나 이상의 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는, 엑소좀을 표적 세포에 전달하기 위한 키트, 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

위암은 전 세계적으로 한국, 중국, 일본 등에서 많이 발생하는 암으로써 미국, 유럽 등의 서구에서는 발생율이 낮으나, 한국의 경우 암 발생율 1위가 위암이고, 사망율은 폐암에 이어 2위를 차지하고 있다. 위암의 분류를 살펴보면 전체의 95%가 위벽 점막의 샘 세포에서 생기는 선암이며, 그 외 림프계에서 발생하는 림프종, 간질조직에서 발생하는 위장관 간질성종양이 있다.

현재 암을 치료하는 3가지 주요 치료법으로는 외과적 치료법, 약물 요법, 방사선 요법이 있다. 내시경적 점막절제술, 복강경적 위절제술 및 림프절 절제술등의 방법이 사용되고 있는데, 내시경적 점막절제술은 점막 내 조기위암에 대해 암 병변이 있는 위 점막 주위에 생리 식염수를 주입하여 병변부위를 볼록하게 부풀린 다음 병변이 있는 점막을 절제하는 방법으로, 간단한 내시경 시술로 위 절제수술의 고통을 피할 수 있다는 장점이 있지만, 점막에 국한된 조기위암 중 림프절 전이 가능성이 낮은 경우에 한해 사용할 수 있다는 한계가 있다. 최근 들어, 전 세계적으로 암의 생성 및 치료와 관련된 유전자의 기능 연구를 통해 치료용 표적을 발굴하고 이들을 진단 및 치료제 개발에 이용하기 위한 연구를 진행하고 있다. 게놈 연구의 활성화와 함께 인간 유전자 DNA 칩 또는 프로테옴 분석 연구가 활발하게 이루어지고 암과 관련된 유전자가 대량 발굴됨에 따라 많은 유전자들의 목록과 관련 데이터베이스는 구축되어 있으나 대부분 이들 유전자들에 대한 세포 내에서의 구체적 생물학적 기능 및 암 관련성은 아직 연구되지 않았거나 불확실하여 실제 암 관련성 또는 진단 및 표적 유전자로서의 활용과 함께 나아가 암을 효과적으로 치료할 수 있는 유전자의 발굴에 상당한 어려움이 있다. 따라서 지금까지 밝혀진 암 관련 유전자 이외에도 새로운 유전자들의 발굴과 함께 암 유전자들을 대상으로 한 표적치료제의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 약물요법은 치료에 동반되는 고통이 적고, 외과적 치료나 방사선 치료에 비해 치료 후에도 암의 재발이 상대적으로 적으므로 이에 대해 기대가 모아지고 있다. 따라서 이에 부응할 만한 수많은 항암제가 개발되어 사용되고 있는데, 이들 대부분의 항암제는 암의 이상 증식을 염두에 두고 활발하게 분열하는 세포를 선택적으로 죽게 함으로써 항암 효과를 나타내는 것이다. 그러나, 이러한 항암제는 일반적으로 인체 내에서 활발하게 분열하는 세포인 면역세포, 모근 및 점막 상피세포와 같은 정상세포도 함께 죽이게 되는 심각한 부작용을 동반하므로 장기간 사용이 불가능한 문제점을 안고 있다. 최근, 우리 몸을 구성하는 모든 세포는 엑소좀을 포함하는 세포밖 소포체들을 분비하고 있으며 세포밖 소포체를 매개로 세포간 정보 교환이 이루어지고 있는 것으로 알려지고 있다. 엑소좀은 세포밖 소포체 중 하나이며, 특정 엑소좀의 표적 세포와의 특이적 결합과 세포내로의 흡수는 엑소좀 표면에 농축된 인테그린 단백질 종류와 표적 세포의 세포막에 있는 수용체 상호작용을 통해 결정되는 것으로 보고되었다. 이러한 특정 엑소좀과 표적세포 세포막의 특성을 이용하면 타 정상세포에 대한 부작용을 예방하고 암 세포를 비롯한 질환 세포만을 특이적으로 치료할 수 있는 치료제의 개발이 가능할 것으로 예상된다.

한국등록특허 제10-1215069호

본 발명의 발명자들은 인테그린 α6 및 인테그린 αX가 항암물질을 함유하는 엑소좀의 암세포로의 내재화를 유도함을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 인테그린 α6, 인테그린 αX로 이루어진 군중 어느 하나 이상의 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는, 엑소좀을 표적 세포에 전달하기 위한 키트, 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 암의 예방 또는 치료 방법 및 엑소좀의 표적세포 전달여부에 대한 정보 제공방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인테그린 α6, 인테그린 αX로 이루어진 군중 어느 하나 이상의 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는, 엑소좀을 표적 세포에 전달하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 분리된 시료에서 인테그린 α6, 인테그린 αX 또는 이의 조합의 발현양을 측정하는 것을 포함하는, 엑소좀의 표적세포 전달여부에 대한 정보 제공방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 인테그린 α6 및 인테그린 αX로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 인테그린 α6 단백질에 결합하는 모이어티 및 인테그린 α X에 결합하는 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 암세포를 특이적 표적화하기 위한 엑소좀을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 인테그린 α6 및 인테그린 αX를 포함하고 있어, 항암성분을 함유한 엑소좀이 암세포로 특이적으로 내재화하여 암 예방 또는 치료 효능을 높일 수 있다. 또한, 항암성분으로서 사용되는 GKN1 단백질은 암세포의 세포증식을 억제하고 암세포의 세포사멸을 유도하고, Ras/Raf/MEK/ERK 경로 시그널링을 하향조절하여 암세포 성장을 저해하며, 암세포의 상피-간엽 변이를 저해하므로, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 HFE-145 불멸화 위 상피 세포, AGS 및 MKN1 위암 세포, HT29 대장암 세포, H460 폐암 세포, 및 SNU449 간세포암종 세포의 배양 상청액으로부터 엑소좀 존재 여부를 확인하는 TEM 분석 결과 이미지 및 엑소좀 마커 단백질의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 1b는 HFE-145 불멸화 위 상피 세포 유래 엑소좀을 처리한 HFE-145 위 상피 세포, AGS 및 MKN1 위암 세포, HT29 대장암 세포, H460 폐암 세포, 및 SNU449 간세포암종 세포에서의 엑소좀 마커 발현을 확인한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 1c는 HFE-145 위 상피 세포 유래 엑소좀을 처리한 HFE-145 위 상피 세포, AGS 및 MKN1 위암 세포, HT29 대장암 세포, H460 폐암 세포, 및 SNU449 간세포암종 세포의 면역형광 및 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 1d는 AGS 및 MKN1 위암 세포의 세포질에서 GKN1과 PKH-26 표지된 엑소좀의 공동-국소화(co-localization)를 나타낸 것이다.
도 1e는 단백질 마이크로어레이 칩을 이용하여 HFE-145 불멸화 위 상피 세포 유래 엑소좀의 다양한 인테그린 단백질들과의 결합 친화성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 1f는 HFE-145 위 상피 세포 유래 엑소좀으로 처리된 HFE-145 위 상피 세포, AGS 및 MKN1 위암세포, HT29 대장암 세포, H460 폐암 세포, SNU449 간세포암종 세포에서 엑소좀 GKN1 단백질의 발현을 나타낸 것이다.
도 2a는 단백질 마이크로어레이 칩에서 인테그린 α1, β1, α6 및 αX을 포함하는 인테그린 단백질에 대한 HFE-145 세포 유래 엑소좀의 결합 친화도를 나타낸 것이다.
도 2b는 HFE-145, AGS, MKN1, HT29, H460, 및 SNU449 세포로부터의 세포 용출물 및 엑소좀에서 α1, β1, α6 및 αX를 비롯한 인테그린 단백질의 발현 수준을 보이는 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 인테그린 α6 및 αX가 녹아웃된 AGS 및 MKN1 위암세포에 HFE-145 위 상피 세포 유래 엑소좀을 처리한 다음 인테그린 α6 및 αX 및 GKN1 단백질의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 2d는 인테그린 α6 및 αX의 녹아웃이 AGS 및 MKN1 세포의 세포질로의 엑소좀의 내재화를 저해함을 나타내는 면역형광 및 FACS 분석 결과이다.
도 2e는 SNU449, H460 및 HT29 세포에서의 인테그린 α6 및 αX의 이소성 발현이 이들 세포로의 HFE-145 위 상피 세포 유래 엑소좀의 내재화를 유도함을 나타내는 면역형광 및 FACS 분석 결과이다.
도 2f는 SNU449, H460 및 HT29 세포에서의 인테그린 α6 및 αX의 이소성 발현이 인테그린 α6 및 αX의 발현을 유도함을 나타낸 것이다.
도 2g는 인테그린 α6 및 αX를 발현하는 SNU449, H460 및 HT29 세포로부터 유래된 엑소좀이 AGS 세포에서 검출되는 것을 나타내는 면역형광 및 FACS 분석 결과이다.
도 3a는 HFE-145 위 상피 세포, AGS 및 MKN1 위암세포, HT29 대장암 세포, H460 폐암 세포, SNU449 간세포암종 세포에서 베시클-트래픽킹 관련 단백질의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 3b는 AGS 및 MKN1 위암세포에서 엑소좀을 처리하기 전에 제니스테인, 피트스톱 2 및 아밀로라이드를 처리한 후 엑소좀의 세포성 흡수를 나타낸 것이다.
도 3c는 HFE-145 위 상피 세포 유래 엑소좀의 처리 전에 제니스테인, 피트스톱 2 및 아밀로라이드를 처리한 AGS 및 MKN1 위암세포에서 GKN1 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 3d는 클라스린의 녹다운이 AGS 및 MKN1 세포로의 엑소좀의 내재화를 저해함을 나타내는 면역형광 및 FACS 분석 결과이다.
도 3e는 HFE-145 위 상피 세포 유래 엑소좀을 처리한 AGS 및 MKN1에서 클라스린의 녹다운이 GKN1을 저해하며(좌측 패널), AGS 세포에서의 카베올린의 이소성 발현이 GKN1 단백질의 발현을 증가시키고 MKN1 세포에서의 카베올린 1의 녹다운이 GKN1 단백질의 발현을 감소시킴을(우측 패널) 나타낸 것이다.
도 4a는 HFE-145 불멸화 위 상피 세포와 AGS 위암 세포의 트랜스웰 공동-배양 시스템(좌측 패널) 및 세포 생존능 및 증식을 확인한 결과(우측 패널)를 나타낸 것이다.
도 4b는 HFE-145 위 상피 세포와 AGS 위암 세포의 트랜스웰 공동-배양에 의한 c-Myc, p-PI3K, p-Akt, HRas, b-Raf, c-Raf 및 p-Erk의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4c는 HFE-145 세포 유래 엑소좀의 처리에 의해 AGS 및 MKN1 세포에서 c-Myc, p-PI3K, p-Akt, HRas, b-Raf, c-Raf 및 p-Erk의 발현 수준이 감소함을 나타낸 것이다.
도 4d는 HFE-145 세포에서 HRas로의 GKN1의 결합을 보이는 면역침강 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4e는 HFE-145 세포와 공동배양된 AGS 세포에서의 HRas로의 GKN1의 결합이 b-Raf 및 c-Raf와 HRas의 결합을 저해함을 나타낸 것이다.
도 4f는 AGS 세포 단독으로 또는 HFE-145와 함께 공동 배양했을 때 HRas로의 GKN1의 결합을 검출하는 풀다운 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4g는 HFE-145 유래 엑소좀으로 처리된 AGS 세포 및 MKN1 세포에서 b-Raf 및 c-Raf로의 HRas의 결합이 저해됨을 나타낸 것이다.
도 4h는 PBS로 처리된 AGS 세포 및 MKN1 세포에서 Ras 단백질이 GTPγS 및 GST-Raf1-RBD에 결합하고, HFE-145 세포 유래 엑소좀이 Ras 단백질의 GTPγS 및 GST-Raf1-RBD로의 결합을 저해함을 나타낸 것이다.
도 5a는 GKN1^f/f(fulllength),GKN1^Δ68-199,GKN1^{Δ1-67,165-199},GKN1^Δ1-164,및 GKN1^Δ1-67및 GAPDH의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 분석 결과이다.
도 5b는 GKN1의 아미노 말단 소수성 영역 (GKN1^Δ68-199)이 HRas에 약하게 결합하고, BRICHOS 도메인 (GKN1^{Δ1-67,165-199},GKN1^Δ1-67)이 HRas에 강하게 결합함을 나타낸 것이다.
도 5c는 GKN1의 아미노 말단 소수성 영역 (GKN1^Δ68-199) 및 카로복시 말단 영역 (GKN1^Δ1-164)으로 트랜스펙션시킨 AGS 및 MKN1 세포에서, Ras 단백질이 GTPγS 및 GST-Raf1-RBD에 결합하고, GKN1의 BRICHOS 도메인 (GKN1^{Δ1-67,165-199},GKN1^Δ1-67)이 Ras 단백질의 GTPγS 및 GST-Raf1-RBD로의 결합을 저해함을 나타낸 것이다.
도 5d는 HFE-145 세포 유래 엑소좀 처리에 의해 MKN1 유래 이종이식 종양 조직에서 c-Myc, p-PI3K, p-Akt, HRas, b-Raf, c-Raf, 및 p-Erk의 발현 수준이 감소됨을 나타낸 것이다.
도 5e는 PBS로 처리된 MKN1 유래 이종이식 종양 조직에서, Ras 단백질이 GTPγS 및 GST-Raf1-RBD에 결합하고, HFE-145 세포 유래 엑소좀으로 처리했을 때 Ras 단백질이 GTPγS 및 GST-Raf1-RBD에 결합하는 것을 저해함을 나타낸 것이다.
도 6a는 AGS 위암 세포와 HFE-145 불멸화 위 상피 세포의 공동-배양에 의한 세포 이동 및 침습 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 AGS 위암 세포와 HFE-145 불멸화 위 상피 세포의 공동-배양에 의한 세포 이동 및 침습 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6c는 AGS 위암 세포와 HFE-145 불멸화 위 상피 세포의 공동-배양에 의한 E-cadherin, N-cadherin, ZEB1, Snail, Slug, 및 Rho-GTP의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6d는 AGS 및 MKN1 위암 세포와 HFE-145 불멸화 위 상피 세포의 공동-배양에 의한 세포 이동 및 침습 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6e는 AGS 및 MKN1 위암 세포와 HFE-145 불멸화 위 상피 세포의 공동-배양에 의한 세포 이동 및 침습 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6f는 HFE-145 유래 엑소좀 또는 PBS로 처리된 AGS 세포 및 MKN1 세포에서 E-cadherin, N-cadherin, ZEB1, Snail, Slug, 및 Rho-GTP의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6g는 HFE-145 유래 엑소좀 또는 PBS로 처리된 MKN1-유래 이종이식 종양에서 E-cadherin, N-cadherin, ZEB1, Snail, Slug, 및 Rho-GTP의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.

따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 인테그린 α6, 인테그린 αX로 이루어진 군중 어느 하나 이상의 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는, 엑소좀을 표적 세포에 전달하기 위한 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 인테그린 α6 및 인테그린 αX로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

상기 인테그린 α6는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 3으로 표시되는 유전자 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 인테그린 αX는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 4로 표시되는 유전자 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 엑소좀은 위 상피 세포, 예를 들어 HFE-145 불멸화 위 상피 세포 유래의 엑소좀일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 엑소좀은 항암물질을 포함할 수 있으며, 상기 항암성분은 본 분야에서 사용되는 항암제라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 상기 항암물질은 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-FU), 글리벡(gleevec), 카보플라틴(carboplatin), 두아노루비신(daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 플로타미드(flutamide), 젬시타빈(gemcitabine), 트라스투주맵(trastuzumab), 펨브로리주맵(pembrolizumab) 및 GKN1 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항암제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 항암물질은 GKN1(Gastrokine 1) 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 GKN1 단백질이 내재된 엑소좀은 GKN1 단백질을 발현하는 세포에서 분비되는 엑소좀일수 있으며, 예를 들어 GKN1 단백질을 발현하는 세포의 배양 상청액에서 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 GKN1 단백질이 내재된 엑소좀은 0.1 내지 20 μg/μL의 농도로 처리되는 것일 수 있고, 바람직하게는 0.5 내지 10 μg/μL의 농도로 처리되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1 μg/μL의 농도로 처리되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 GKN1 단백질은 암세포의 세포증식을 억제하고 암세포의 세포사멸을 유도하는 것일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀 내 GKN1 단백질은 Ras/Raf/MEK/ERK 경로 시그널링을 하향조절하여 암세포 성장을 저해할 수 있으며, 암세포의 상피-간엽 변이(transition)를 저해할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 키트 또는 조성물은 카베올린 저해제를 추가 포함할 수 있으며, 상기 카베올린 저해제는 예를 들어, 제니스테인(genistein), siCaveolin 1, 필리핀(fillipin) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 키트 또는 조성물은 클라스린(clathrin)을 추가 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 암세포는 위암세포, 폐암세포, 대장암세포, 간암세포, 전립선암세포, 직장암세포, 피부암세포, 유방암세포, 난소암세포 및 자궁암세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포일 수 있으며, 예를 들어 위암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 인테그린 α6 또는 인테그린 αX는 표적 세포의 세포막에 발현되어, 엑소좀의 세포 내 내재화를 유도할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 키트 또는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 치료 방법은 상기 약학적 조성물을 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 치료가 필요한 개체는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

또한, 본 발명은 분리된 시료에서 인테그린 α6, 인테그린 αX 또는 이의 조합의 발현양을 측정하는 것을 포함하는, 엑소좀의 표적세포 전달여부에 대한 정보 제공방법에 관한 것이다.

상기 분리된 시료는 개체로부터 수득된 조직, 혈액, 뇨 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 엑소좀은 위 상피 세포, 예를 들어 HFE-145 불멸화 위 상피 세포 유래의 엑소좀일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 표적세포는 위암세포, 폐암세포, 대장암세포, 간암세포, 전립선암세포, 직장암세포, 피부암세포, 유방암세포, 난소암세포 및 자궁암세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포일 수 있으며, 예를 들어, 위암세포일 수 있다.

또한, 본 발명은 인테그린 α6 단백질에 결합하는 모이어티 및 인테그린 α X에 결합하는 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 암세포를 특이적 표적화하기 위한 엑소좀에 관한 것이다.

상기 엑소좀은 항암물질이 내재화된 것일 수 있으며, 상기 항암물질은 본 분야에서 사용되는 항암제라면 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어, 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-FU), 글리벡(gleevec), 카보플라틴(carboplatin), 두아노루비신(daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 플로타미드(flutamide), 젬시타빈(gemcitabine), 트라스투주맵(trastuzumab), 펨브로리주맵(pembrolizumab) 및 GKN1 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항암제일 수 있다. 예를 들어, 상기 항암물질은 GKN1(Gastrokine 1) 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험 방법

세포배양 및 인테그린의 트랜스펙션

AGS 위암 세포, MKN1 위암 세포, HT29 대장암 세포, H460 폐암 세포, 및 SNU449 간세포암종 세포, MCF-7과 MDA-MB-231 유방암 세포 및 U343 과 U87 교모세포종 세포를 37℃ 및 5% CO₂ 하에서 10% 열-불활성화 우태아 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지(Lonza, Basel, Switzerland)에서 배양하였다. 상기 세포들은 GKN1 단백질을 발현하지 않았다. GKN1 단백질을 발현하는 HFE-145 불멸화 위 상피 세포 또한 37℃ 및 5% CO₂ 하에서 10% 열-불활성화 우태아 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지(Lonza, Basel, Switzerland)에서 배양하였다. 인테그린 α6-, αX- 및 카베올린 1 각각의 전체 cDNA를 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 클로닝하였다. AGS, HT29, H460 및 SNU449 세포를 60 mm-지름 디쉬에서 Lipofectamine Plus transfection reagent (Invitrogen)를 사용하여 발현 플라스미드(5 mg total DNA)로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 또한, AGS 및 MKN1 세포를 siIntegrin α6, siIntegrin αX, siClathrin 및 siCaveolin 1로 트랜스펙션시켰다. GKN1 단백질의 결합 도메인을 확인하기 위해, 4개의 결실-형성 플라스미드인 NH2-말단 소수성 영역을 포함하는 pGKN1^△68-199, BRICHOS 도메인을 갖는 pGKN1^{△1-67, 165-199}, COOH-말단을 갖는 pGKN1^△1-164 및 BRICHOS 및COOH-말단을 갖는 pGKN1^△1-67을 제조하였다. 피트스톱 2(Pitstop 2), 제니스테인(genistein) 및 아밀로라이드(amiloride)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

트랜스웰(transwell) 시스템에서 HFE-145 및 AGS 세포의 공동-배양

HFE-145 위 상피 세포로부터 유래된 엑소좀의 생존능력 및 AGS 위암 세포의 EMT에서의 능력을 평가하기 위해, 하기와 같이 트랜스웰 공동-배양 시스템을 실시하였다. 우선, 상기 기재한 바와 같이 완전 배지 및 배양 환경을 이용하여 6개-웰 트랜스웰 세포-배양 시스템(system (Pore size: 0.4 μm; Costar Corp., USA)의 바닥에 3× 10³ AGS세포를 플레이팅하였다. 3× 10³ HFE-145세포를 트랜스웰 세포-배양 인서트의 막 상에 배양하고 상기 기재한 조건 하에서 밤새 성장시켰다. 다음 날에 상기 세포를 무혈청 배지로 세척하고 성장 인자가 없는 무혈청 배지에 24시간 동안 인큐베이션하였다. 공동-배양 동안, HFE-145 세포를 포함하는 트랜스웰 인서트의 막을 1 × 10⁴ AGS 세포를 포함하는 6개-웰 트랜스웰 배양 시스템으로 이동시키고 무혈청 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 완전 배지를 사용하여 10일간 배양한 후 세포의 생존능력, 이동 및 침습 실험을 실시하였다.

엑소좀 분리

HFE-145 불멸화 위 상피 세포의 상청액으로부터 엑소좀을 분리하였다. 우선, 세포를 무혈청 배지에서 패시지 3~8로 배양하고 이 배지를 회수하기 전에 48시간 동안 37℃ 및 5% CO₂의 습한 대기 하에서 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충하였다. 4℃에서 10분간 2,000g로 조건화 배지를 원심분리하여 세포 잔해를 제거한 후 0.22 μm 필터에 통과시켰다. 맑은 상청액을 새로운 유리 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관하였다. 새로운 튜브에서 A/B/C 용액(101Bio company, CA, USA; 0.75 ml A/B/C 용액과 2 ml 상청액)과 혼합하고 30초 동안 강하게 볼텍싱한 후 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 혼합물은 두 층으로 분리되었고, 상층을 제거하였다. 하층을 마이크로센트리퓨즈 튜브로 옮기고 3분간 5000g로 회전시켰다. 중간의 플러프 층을 마이크로센트리퓨즈 튜브로 옮기고 3분간 5000g로 회전시킨 후 캡을 열어둔 채로 실온에서 10분간 공기 건조시켰다. 그런 다음 4× 용적이 되도록 1× PBS를 튜브에 첨가하고 힘차게 파이펫팅하고 15분 동안 고속의 horizontal shaker 위에 위치시킨 후 5분 동안 5,000g으로 회전시켰다. 그 후, 상청액을 조심스럽게 PureExo® Column (101Bio company, CA, USA)으로 옮기고 1,000g에서 5분간 회전시켰다. 분리 정제된 엑소좀 분획을 포함하는 flow-through를 PBS에 현탁하였다.

Transmission Electron microscopy (TEM)

TEM 분석을 위해, 정제된 엑소좀을 실온에서 3시간 동안 2% 글루타르알데하이드 및 2% 파라포름알데하이드를 포함하는 0.1 M Sorensen's phosphate buffer에 고정시켰다. 시료를 세척하고 10분간 formvar/carbon-coated copper grid에 올려놓았다. Grid를 PBS로 세척하고 1% 수성 우라닐 아세테이트(Ted Pella)로 염색했다. 200 kV의 가동 전압에서 JEM-1010 (JEOL, Tokyo, Japan)으로 엑소좀 시료의 이미지를 촬영하였다.

엑소좀 표지

PKH26 (Sigma)로 엑소좀을 표지하였다. 엑소좀 펠렛을 1 mL의 Diluent C에 재현탁하였다. 별도로, 1 mL의 Diluent C를 4 μL 의 PKH26와 혼합하고, 그 후에 염색 용액과 함께 엑소좀과 혼합한 후 37℃에서 20분간 인큐베이션하였다. 동일 부피의 1% 우혈청 알부민을 첨가하여 표지 반응을 중단시켰다. Total Exosome Isolation kit(Invitrogen)를 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하여 표지된 엑소좀을 분리하였다. 우선, 0.5 용적의 분리 시약을 표지된 엑소좀에 첨가하고 볼텍싱하여 잘 혼합하였다. 상기 표지된 엑소좀을 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후 4℃에서 1시간 동안 10,000g로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 각 펠렛을 100 μL의 PBS에 재현탁하였다.

면역블롯 및 면역형광 연구

HFE-145 세포로부터 유래된 엑소좀의 장기친화성(organotropism)을 평가하기 위해, 40 μg/ml PKH26-표지 엑소좀을 세포와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 및 고정 후에, 시료를 DAPI로 염색하였다. 그런 다음 공초점 이미징을 실시하였다.

HFE-145, AGS, MKN1, HT29, H460, 및 SNU449 세포 용해물에서 HFE-145 세포로부터의 엑소좀의 흡수 및 시그널링 경로를 웨스텐 블롯 분석으로 조사하였다. 동량의 세포 용해물과 엑소좀을 12% SDS-PAGE로 분리하고 이들을 Hybond-polyvinylidene difluoride transfer membranes (Amersham)으로 옮겼다. 5% 스킴 밀크로 차단한 후, 상기 막을 CD9, CD63, 및 CD81을 포함하는 엑소좀 마커, GKN1 (Abcam, , Cambridge, UK), c-Myc, RAS/Raf/MAPK 시그널링 경로 관련 단백질, PI3K, 및 Akt에 대해 특이 항체로 블롯팅한 후 호스레디쉬 퍼옥시다아제-결합 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 엑소좀 및 위 상피 세포에서의 인테그린 발현 패턴을 확인하기 위해, ITGB1, ITGAV, ITGA5, ITGAX, ATGA1, ITGB7, ITGA6, 및 ITGAE(표 1)에 대한 항체를 사용하였다. 또한 엑소좀 마커 및 카베올린(caveolin)1 및 신탁신6를 포함하는 베시클 트래픽킹 관련 단백질에 대한 항체도 사용하였다(표 1). ECL substrate (LI-COR Biosciences, NE, USA)를 사용하여 단백질 밴드를 검출하고 LAS 4000 image analyzer (Fuji Film, Japan)를 사용하여 밴드의 강도를 확인하였다.

면역형광 연구를 위해, 40 μg/ml PKH26-표지 엑소좀을 세포와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고 실온에서 8분간 PBS 로 희석된 4% 포름알데하이드에 고정하고 실온에서 10분간 PBS 중의 0.2% Triton X-100으로 투과성으로 만들었다. 비특이 결합은 1시간 동안 5% 염소 또는 당나귀 혈청과 함께 인큐베이션하여 차단하였다. 세포를 블로킹 용액에 희석된 일차 항체(anti-ITGα6, anti-ITGαX, 및 anti-GKN1, Abcam; anti-클라스린, BD Transduction Laboratories; anti-Cav1 및 anti-APPL1, Cell signaling Technology)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 이차 항체(anti-alexa-488 conjugated goat anti-mouse IgG, Invitrogen)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 추가 세척 후, 실온에서 5분간 2 μg/ml DAPI로 핵을 염색하였다. 유리 커버슬립에 부착된 세포를 Slowfade Gold solution (Life Technologies)으로 완충시키고 유리 슬라이드 위에 올려놓았다.

FACS 분석

엑소좀 유입 연구를 위해, subconfluent HFE-145, AGS, MKN1, H460, HT29, 및 SNU449 세포를 HFE-145 세포 유래 PKH-26 표지 엑소좀 (40 μg/mL)과 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 분리하고 남이있는 표면-결합 엑소좀을 트립신화하여 제거하였다. 세포를 PBS 용액으로 세척하고 PBS 용액에 현탁한 후, Cell-Quest software가 장비된 FACSCalibur instrument (BD Biosciences)로 분석하였다.

공동-면역침강

AGS 및 MKN1 세포 유래 엑소좀을 PBS로 세척하고 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 10 mM NaF, 1.0 mM NaVO4, 및 1% protease inhibitor cocktail (Sigma)을 포함하는 PBS, pH 7.2로 용해시켰다. 동일한 단백질 분취액(1.0 mg)을 단백질 A/G-agarose (Santa Cruz Biotechnology) 중의 GKN1 (Abcam), HRas, c-Myc, b-Raf, 및 c-Raf (Cell signaling Technology)에 대한 2.0 μg의 항체로 면역침강시켰다.

활성 Ras 검출 검정

위암 세포 (AGS 및 MKN1)를 6개-웰 플레이트에 RPMI-1640 배지 중 웰 당 3 x 10⁵의 밀도로 접종하였다. 24시간 후 세포를 GKN1을 운반하는 엑소좀으로 48시간 동안 처리하였다. 세포를 비-변성 조건 하에서 수확하고 아주 차가운 PBS로 세척한 후 세포를 용해 버퍼로 용해시켰다. 그런 다음 제조업자의 프로토콜에 따라 active Ras detection assay kit (Cell Signaling Technology)를 사용하여 활성 Ras의 친화성 침강을 실시하였다. 세포 용해물(500 μg)을 GTPγS 또는 GDP로 처리하여 Ras를 활성 또는 불활성시키고, 이를 각각 양성 또는 음성 대조군으로 사용하였다. 그런 다음, 세포 용해물을 글루타치온 레진 중의 GST-Raf1-RBD 융합 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 용출된 시료를 전기영동하고 Ras 마우스 모노클로날 항체를 사용하여 면역블롯팅하였다.

세포 생존능력 및 증식의 측정

세포 생존능력 분석을 위해, AGS 위암 세포를 HFE-145 세포와 함께 공동-배양한 후 96시간 동안 MTT 검정을 실시하였다. 분광광도계를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존능력은 비-처리 세포에 비례하여 나타냈다.

세포 증식 검정을 위해 HFE-145 세포와의 공동-배양 후에 BrdU cell proliferation assay kit (Millipore, Billerica, MA, USA)를 제조업자의 지시에 따라 사용하여 96시간 동안 BrdU 인코포레이션 검정을 실시하였다. 분광광도계를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 증식은 비-처리 세포에 비례하여 나타냈다.

HuProtTM 마이크로어레이를 통한 HFE-145 유래 엑소좀-결합 단백질의 확인

HFE-145 세포 유래 엑소좀-결합 단백질을 확인하기 위해, 19,000 개 이상의 전장 재조합 인간 단백질을 함유하는 인간 단백질 마이크로어레이(CDI Labs, USA)를 사용하였다. 블로킹 버퍼(5% BSA in PBS with 0.05% tween-20)와 함께 단백질 마이크로어레이를 2시간 동안 인큐베이션하고 1 μg의 PKH26-표지된 HFE-145 유래 엑소좀을 4℃에서 8시간 동안 마이크로어레이에 처리하였다. 그런 다음, 마이크로어레이를 1 μg의 streptavidin-fluorescence (Alexa-Fluor 635nm)와 함께 인큐베이션하였다. GenePix 4100A microarray laser scanner (Molecular Devices, USA)로 스케닝하여 마이크로어레이 결과를 검출하였다.

세포 이동 및 침습 검정

세포 이동을 6개-웰 트랜스웰 시스템으로 확인하였다. 3회의 독립적인 실험으로 20x 필드에서 1 × 10⁴세포를 함유하는 상청액을 각 상부 챔버에 첨가하고 하부 챔버에서 세포수를 계수하였다.

0.5 mm Matrigel로 코팅된 8 μm 포어 폴리카르보네이트 필터를 수반한 BD Biocoat Matrigel TM invasion chambers (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하여 침습을 확인하였다. 막을 고정하고 Diff-Quick (Sysmex, Kobe, Japan)로 염색한 후, 두 개의 20x 필드에서 핵의 직접적인 가시화(direct visualization)로 계수하였다.

생체내 검정

동물 실험은 아주대 의과대학(Suwon, Gyeonggi-do, Korea) 에서 Institutional Animal Care 및 Use Committee에 따라 승인받고 실행하였다. 16 내지 18 g 체중의 6 내지 8주령 수컷 BALB/c-nu 누드 마우스(Orient Bio, Gyeonggi-do, Korea)에게 50 mL Matrigel (Corning, Corning, NY) 중의 1 x 10⁶ MKN1세포를 피하 이식하였다. 종양 세포 주입 후 5일째부터 마우스에게 GKN1 양성 엑소좀 (1 mg/mL, 50 mL) 또는 PBS (50 mL)를 IC50 및 주입된 세포수에 근거하여 3주간 6회 정맥내 처리하였다. 마우스를 희생시키고 추가 분석을 위해 종양을 수집하였다.

통계 분석

세포 생존능력 및 증식에서의 GKN1 효과를 분석하기 위해 Student’s t-test를 사용하였다. 연구 결과의 재현성을 확인하기 위해 모든 실험은 2회 실시하였다. 데이터는 2회의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± S.D.로 나타냈다. P-value가 0.05보다 작을 때 통계적 유의성이 있다고 간주되었다.

실시예 2. 결과

세포의 기원에 따른 위 상피세포 유래 엑소좀의 세포성 흡수

위 상피 세포로부터 유래된 엑소좀이 위 세포 및 위 세포가 아닌 세포로 내재화되는지를 확인하기 위해, HFE-145 불멸화 위 상피 세포, AGS 및 MKN1 위암세포, H460 비소세포성 폐암 세포, SNU449 간세포암종 세포 및 HT29 대장 선암 세포의 배양 상청액으로부터 엑소좀을 분리하였다. TEM 분석에서, 30 nm 내지 100 nm 크기 범위의 베히클이 있는 구조적으로 온전한 엑소좀이 검출되었다(도 1a). 또한, CD9, 63, 및 81과 같은 엑소좀 마커의 발현도 엑소좀에서 관찰되었으며(도 1b), 흥미롭게도 GKN1의 발현은 HFE-145 불멸화 위 상피 세포에서 유래된 엑소좀에서만 검출되었다(도 1b). HFE-145 불멸화 위 상피 세포, AGS 및 MKN1 위암 세포, HT29 대장암 세포, H460 비소세포 폐암 세포, 및 SNU449 간세포암종 세포를 HFE-145 세포로부터 유래된 엑소좀으로 처리했을 때, HFE-145, AGS, 및 MKN1 세포의 세포질에서만 엑소좀이 검출되었다(도 1c). 면역형광 연구에서, PKH-26 표지된 HFE-145 세포로부터 유래된 엑소좀과 GKN1 단백질의 공동-국지화(co-localization)가 PKH-26 표지된 엑소좀으로 처리된 AGS 및 MKN1 세포의 세포질에서 발견되었다(도 1d). 웨스턴 블롯 분석에서, CD9, 63 및 81과 같은 엑소좀 마커와 GKN1 단백질이 HFE-145 세포 유래 엑소좀으로 처리된 HFE-145, AGS 및 MKN1 세포에서만 발현됨을 보였으며(도 1c), 이는 HFE-145-유래 엑소좀이 HFE-145, AGS 및 MKN1 세포 내로만 내재화된 것임을 제시하는 것이다(도 1e).

인테그린 α6 및 αX에 의존하는 위 상피 세포 유래 엑소좀의 위 세포의 세포질로의 특이 흡수

위 상피 세포로부터 유래된 엑소좀의 위 특이 흡수가 인테그린 단백질과 관련되었는지를 확인하기 위해, 단백질 마이크로어레이 칩에서 인테그린 α6, β1, 및 αX를 포함하는 인테그린 단백질과 HFE-145 세포로부터 유래된 엑소좀의 결합 친화성을 분석하였다. 도 2a 및 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 엑소좀은 인테그린 α5, α11, αX, βL1, 및 β1에 높은 결합 친화성을 갖는다. 또한, HFE-145 불멸화 위 상피 세포, AGS 및 MKN1 위암 세포, HT29 대장암 세포, H460 폐암 세포, SNU449 간세포암종 세포, 및 이들 세포로부터의 엑소좀에서의 인테그린 단백질 조성을 시험하였다. HFE-145, AGS, 및 MKN1 세포에서, 인테그린 α5, α6, α10, αε, 및 αX의 발현 수준이 다른 조직 기원의 암 세포에서보다 더 높았으며, HFE-145, AGS, 및 MKN1 세포 사이에서 인테그린 단백질 조성의 유의차는 없었다(도 2b). 특히, 인테그린 α6 및 αX는 HFE-145, AGS, 및 MKN1 세포에서만 발현되었다(도 2b). 이를 종합하면, 이들 결과는 인테그린 α1, α4, αε, β1, 및 β6이 위 상피 세포로부터 유래된 엑소좀의 막 결합을 위해 필요한 것이고, 위 상피 세포로부터 유래된 엑소좀의 위 특이 흡수가 위 세포 및 엑소좀 둘 다에서 인테그린 α6 및 αX와 같은 인테그린 단백질의 다른 발현 수준과 관련됨을 나타내는 것이다.

AGS 및 MKN1 세포에서의 HFE-145 위 상피 세포로부터 유래된 엑소좀의 흡수에 대한 인테그린 α6 및 αX의 효과를 평가하였다. 도 2c에서 볼 수 있는 바와 같이, AGS 및 MKN1 세포에서 siIntegrin α6 및 siIntegrin αX로 인테그린 α6 및 αX를 녹아웃시키면 인테그린 α6 및 αX의 발현 수준이 각각 두드러지게 감소하였다. AGS 및 MKN1 세포를 PKH26-표지된 엑소좀으로 처리하면, 이들 엑소좀이 이들 세포의 세포질 내로 확실히 내재화되었다. 그러나, 인테그린 α6 및 αX의 녹아웃은 PKH26-표지된 엑소좀의 AGS 및 MKN1 세포 세포질로의 내재화를 극적으로 저해하였다(도 2d). 또한, GKN1의 발현 수준도 AGS 및 MKN1 세포에서 상당히 감소하였다(도 2c). 또한, 인테그린 α6 및 αX가 비-위 세포에서 위 상피 세포로부터 유래된 엑소좀의 유입에 어떤 역할을 하는지 확인하였다. HT29 대장 선암 세포, H460 비소세포 폐암 세포, 및 SNU449 간세포 암종 세포에서 실시된 일시적 트랜스펙션 분석에서, 인테그린 α6 또는 αX의 이소성 발현이 HFE-145 위 상피세포 유래 엑소좀의 내재화를 약간 유도하였다 (도 2E). 그러나, 인테그린 α6 및 αX 둘 다의 발현은 HFE-145 위 상피세포 유래 엑소좀의 내재화를 현저하게 유도하였다 (도 2E). 웨스턴 블롯 분석에서, 인테그린 α6 및 αX 둘 다의 이소성 발현은 SNU449, H460, 및 HT29 세포에서의 GKN1의 발현 수준을 현저하게 증가시켰다 (도 2F). 또한, SNU449, H460, 및 HT29 세포에서의 인테그린 α6 및 αX의 이소성 발현은 이들 세포로부터 유래된 엑소좀의 AGS 세포의 세포질로의 내재화를 현저하게 증가시켰다 (도 2G).이러한 결과는 인테그린 α6 및 αX가 위 상피 세포로부터 유래된 엑소좀의 장기친화성에 필요함을 제안하는 것이다.

위 상피 세포로부터 유래된 엑소좀의 내재화에서의 카베올린, 클라스린 및 마크로피노사이토시스의 효과

카베올린 1 및 신탁신 6와 같은 베시클-트래픽킹 관련 단백질이 위 상피 세포로부터 유래된 엑소좀의 내재화에 관련되는지를 평가하였다. HFE-145, AGS, 및 MKN1 위 상피 기원 세포에서 베시클-트래픽킹 관련 단백질은 HT29 대장암 세포, H460 폐암 세포, SNU449 간세포암종 세포에서와 유사한 발현 수준을 보였다(도 3a). 그러나, 카베올린 1 단백질은 HFE-145에서는 발현되지 않았다(도 3A). AGS 세포에서는 카베올린 1이 낮은 발현 수준을 보였으며, MKN1 및 다른 비-위암 세포는 높은 카베올린 1 단백질 발현 수준을 보였다(도 3a).

카베올린, 클라스린, 및 마크로피노사이토시스가 위 상피 세포에서 엑소좀의 흡수에 기여하는지를 확인하기 위해, AGS 및 MKN1 위암 세포를 100 μM 제니스테인(카베올린-의존 엔도사이토시스의 저해제), 5 μM 피트스톱 2 (클라스린-엔도사이토시스의 저해제), 및 마크로피노사이토시스 저해제인 50 μM 5-(n-ethyl-n-isopropyl)-amiloride (EIPA)로 처리하였다. 특히, 클라스린 및 마크로피노사이토시스의 저해가 AGS 및 MKN1 세포로의 엑소좀 흡수를 현저하게 감소시켰으며(도 3b 및 3c), 이는 위 상피 세포에서의 엑소좀의 흡수가 클라스린 및 마크로피노사이토시스를 필요로 함을 암시하는 것이다. 높은 카베올린 발현을 보이는 MKN1 세포와 낮은 카베올린 발현을 보이는 AGS 세포를 GKN1 단백질을 운반하는 엑소좀으로 처리했을 때, 엑소좀 흡수가 MKN1 세포보다 AGS 세포에서 더 높았다. 그에 반해, MKN1 세포에서의 카베올린 저해는 MKN1 위암 세포로의 엑소좀 흡수를 증가시켰다(도 3b 및 3c). 위 상피 세포에서 엑소좀의 흡수에서의 클라스린 및 카베올린 발현의 효과를 확인했을 때, 클라스린의 녹다운이 AGS 및 MKN1 세포로의 엑소좀의 내재화를 저해함을 확인하였다 (도 3D 및 E). 흥미롭게도, AGS 세포에서의 카베올린 1의 이소성 발현은 엑소좀의 내재화를 저해하는 반면, MKN1 세포에서의 카베올린 1의 녹다운은 엑소좀의 내재화를 증가시켰다 (도 3D and E). 이러한 결과는 카베올린 1이 위 상피 세포로의 엑소좀 흡수를 저해함을 나타내는 것이다.

GKN1는 위 세포에서 Ras/Raf/MEK/ERK 신호전달계를 하향조절하여 세포 성장을 저해함

HFE-145 위 상피 세포와 AGS 위암 세포의 트랜스웰 공동-배양으로 AGS 암 세포의 생존능력 및 증식이 현저하게 저해되었으며(도 4a), 이는 HFE-145 위 상피 세포의 엑소좀 성분이 암 세포의 생존 및 성장을 저해할 수 있음을 제안하는 것이다. 이전에 본 발명자는, GKN1-양성 HFE-145 세포로부터 유래된 엑소좀이 AGS 및 MKN1 위암 세포의 생존능력 및 증식을 상당히 저해할 수 있음을 보고하였다(Yoon JH et al., Gastrokine 1 protein is a potential theragnostic target for gastric cancer. Gastric Cancer 2018; 21:956-967). GKN1의 종양 억제 활성을 가능하게 하는 분자 메커니즘을 확인하기 위해, Ras/Raf/MEK/ERK 신호전달계 캐스케이드에서 GKN1 단백질의 효과를 평가하였다. 예상한대로, HFE-145 세포와 공동-배양한 AGS 세포에서 c-Myc, p-PI3K, p-Akt, HRas, b-Raf, c-Raf, 및 p-Erk의 발현 수준이 현저하게 감소되었다(도 4b). 또한, AGS 및 MKN1 세포를 HFE-145 유래 엑소좀으로 처리했을 때, GKN1은 AGS 및 MKN1 세포에서 c-Myc, p-PI3K, p-Akt, HRas, b-Raf, c-Raf, 및 p-Erk의 발현 수준을 감소시켰으며 (도 3C), 이는 GKN1이 Ras/Raf/MEK/ERK 키나아제 스그널링 경로를 하향조절할 수 있음을 시사하는 것이다.

그런 다음, GKN1이 어떻게 Ras/Raf/MEK/ERK 키나아제 시그널링 경로를 조절하는지를 확인하기 위해 HRAS 및 GKN1 단백질의 결합을 연구하였다. HFE-145 세포에서 HRas로의 GKN1 단백질의 결합을 면역침강 분석으로 관찰하였다 (도 4D). 또한, GKN1 단백질은 HRas에 결합하여 HRas가 HFE-145 세포와 공동-배양한 AGS 세포의 b-Raf 및 c-Raf 에 결합하는 것을 저해하였다(도 4e). 예상한대로, Ras 단백질은 AGS 세포에서 GTPγS 및 GST-Raf1-RBD 둘 다에 결합하였지만, HFE-145 세포와 공동-배양한 AGS 세포에서는 결합하지 않았다(도 4f). AGS, 및 MKN1 세포를 HFE-145 유래 엑소좀으로 처리했을 때, GKN1 단백질은 HFE-145에서 HRas에 직접적으로 결합하고, AGS 및 MKN1 세포에서 b-Raf 및 c-Raf로 HRas가 결합하는 것을 완전히 저해한다(도 4g). 이전 연구에서와 마찬가지로 Ras 단백질은 PBS 처리된 AGS 세포에서 GTPγS 및 GST-Raf1-RBD 둘 다에 결합한 반면, Ras 단백질은 HFE-145 세포 유래 엑소좀으로 처리한 AGS 및 MKN1 세포에서GTPγS 및 GST-Raf1-RBD 둘 다에 결합하지 않았다(도 4h). 이러한 발견은 GKN1 단백질을 포함하는 정상 엑소좀이 Ras 단백질의 활성을 저해할 수 있음을 입증한다.

GKN1 도메인의 HRas로의 결합 활성을 확인했을 때 (도 5A), GKN1의 아미노 말단 소수성 영역 (GKN1^Δ68-199)이 HRas에 약하게 결합하는 반면, BRICHOS 도메인 (GKN1^{Δ1-67,165-199},GKN1^Δ1-67)은 HRas에 강하게 결합하였다 (도 5B). 또한, Ras 단백질은 GKN1의 아미노 말단 소수성 영역 (GKN1^Δ68-199)또는 카로복시 말단 영역 (GKN1^Δ1-164)으로 트랜스펙션된 AGS 세포에서 GTPγS 및 GST-Raf1-RBD 둘 다에 결합하였다. 그러나, Ras 단백질은 GKN1의 BRICHOS 도메인 (GKN1^{Δ1-67,165-199},GKN1^Δ1-67)으로 트랜스펙션된 AGS 세포에서 GTPγS 및 GST-Raf1-RBD 둘 다에 결합하지 않았다 (도5C). 이러한 발견은 GKN1의 BRICHOS 도메인이 위 상피 세포에서 Ras 단백질로의 GTP 결합을 저해하는 생리학적 저해제일 수 있음을 입증한다. 또한, GKN1은 HFE-145 세포 유래 엑소좀으로 처리한 MKN1-유래 이종이식 종양에서 c-Myc, HRas, c-Raf, b-Raf, 및 p-Erk의 발현 수준을 감소시켰다(도 5d). 또한, Ras 단백질은 PBS로 처리된 MKN1-유래 이종이식 종양에서, GTPγS 및 GST-Raf1-RBD에 결합하였다. 그러나, HFE-145 세포 유래 엑소좀은 활성을 저해하며 (도 5E), 이는 GKN1이 Ras 불활성화를 유도함을 시사하는 것이다. 이를 종합하면, 이들 결과는 위 상피 세포로부터 유래된 엑소좀 내의 GKN1 단백질은 Ras/Raf/MEK/ERK 신호전달계를 하향조절하여 세포 성장을 저해할 수 있음을 제시하는 것이다.

위 상피 세포로부터 유래된 엑소좀은 위암 세포의 상피-간엽 변이를 저해함

AGS 위암 세포와 HFE-145 불멸화 위 상피 세포의 공동-배양 후에, AGS 세포의 상피-간엽 변이(EMT)에서의 GKN1 양성 엑소좀의 효과를 분석하였다. 트랜스웰 microchemotaxis 및 Matrigel 검정에서, HFE-145 세포와 공동-배양된 AGS 세포는 감소된 세포 이동 및 침습 활성을 보였다(도 6a 및 6b). 웨스턴 블롯 분석에서, HFE-145 세포와 공동-배양된 AGS 세포는 증가된 E-cadherin 발현을 보였으나, N-cadherin, ZEB1, Snail, Slug 및 Rho-GTP를 포함하는 EMT-관련 단백질의 감소된 발현을 보였다(도 6c). AGS 및 MKN1 세포를 HFE-145 세포 유래 엑소좀으로 처리하여 정상 엑소좀이 위암 세포의 진행을 저해하는지를 확인하였다. 도 6d 및 6e에서 볼 수 있는 바와 같이, 위암 세포의 이동 및 침습이 대조 세포에 비해 HFE-145 유래 엑소좀이 처리된 세포에서 극적으로 감소하였다. AGS와 HFE-145 세포의 공동-배양과 유사하게, HFE-145 세포 유래 엑소좀의 처리도 AGS 세포, MKN1 세포, 및 이종이식 종양 조직에서 증가된 E-cadherin 발현 및 감소된 N-cadherin, ZEB1, Snail, Slug, 및 Rho-GTP의 발현을 보였다(도 6f 및 6g). 이러한 결과는 위 상피 세포로부터 유래된 엑소좀 내의 GKN1 단백질이 상피-간엽 변이 관련 단백질 발현을 조절하여 위암 세포 이동 및 침습을 저해할 수 있음을 제시하는 것이다.

결론

엑소좀의 높은 장기친화성에 때문에, 엑소좀-기저 약물 수송 시스템은 불충분한 타겟팅 효율 및 전달의 어려움을 해결할 수 있을 것이다. 엑소좀 표면의 단백질은 수용 세포로의 엑소좀의 흡수 비율에 영향을 줄 수 있음이 보고되었다 엑소좀 내재화를 이루는 메커니즘을 설명하는 것은 엑소좀의 기관-특이적 타겟팅의 과정을 이해하는데 중요하다. 특히, 인테그린은 CD9, CD63, 및 CD81과 같은 테트라스파닌(tetraspanin)과 이종이분자 복합체를 형성하여 표적 세포로 엑소좀을 부착시키는 역할을 한다. 최근 연구는 인테그린 α_v 및 β₄가 각각 간 전이 및 폐 전이를 갖는 암 환자로부터의 엑소좀에서 증가함을 입증하였으며, 이는 인테그린 발현 패턴이 엑소좀 흡수의 장기친화성과 밀접하게 연관됨을 제시하는 것이다(Hoshino A, Costa-Silva B, Shen TL, Rodrigues G, Hashimoto A, Tesic Mark M, et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 2015;527(7578):329-35). 엔도사이토시스는 엑소좀 함유물의 세포내 수송을 위한 일차 방법이다. 식세포작용, 마크로피노사이토시스(macropinocytosis), 클라스린-매개, 카베올린-매개, 클라스린/카베올린-의존성, 및 지질 래프트-매개 엔도사이토시스와 같은 다양한 유형의 엔도사이토시스가 확인되었다. 엑소좀 내의 인테그린 아형이 엑소좀을 특정 기관 및 조직으로 수송하는데 기여하지만, 특이 기관 및 조직으로 수송 후 개별 세포로 엑소좀이 통합되는데 관련된 분자 메커니즘은 추가 연구가 필요하다. HFE-145 불멸화 위 상피 세포로부터 유래된 엑소좀의 흡수가 대장, 간 또는 폐암 세포가 아닌 HFE-145, AGS, 및 MKN1 세포에서만 일어남을 발견하였다(도 1). 또한, 인테그린 α5, αX, α6, 및 αε의 발현 수준이 결장, 간 및 폐암 세포 유래 엑소좀에 비해 위 세포 및 HFE-145, AGS, 및 MKN1 세포 유래 엑소좀에서 더 높았다 (도 2b). 특히, 인테그린 α6 및 αX는 HFE-145, AGS, 및 MKN1 세포에서만 발현되었다 (도 2b). AGS 및 MKN1 세포에서 siIntegrin α6 및 siIntegrin αX로 인테그린 α6 및 αX을 녹다운시키면 AGS 및 MKN1 세포의 세포질로의 PKH26-양성 엑소좀의 내재화가 각각 현저하게 저해되었다 (도 2d). 게다가, HT29 결장암 세포, H460 폐암 세포 및 SNU449 간세포 암종 세포에서의 인테그린 α6 및 αX 둘 다의 이소성 발현이 HFE-145 위 상피세포 유래 엑소좀의 증가된 내재화를 유도하였다 (도 2e 및 2f). 또한, 인테그린 α6 및 αX를 이소성 발현하는 HT29 세포, H460 세포 및 SNU449 세포 유래 엑소좀이 AGS 세포 내로 내재화되었다(도 2g). 이러한 결과는 엑소좀 흡수가 수용 세포 및 엑소좀의 인테그린 단백질의 발현 패턴에 의존하고 위 상피 세포로부터 유래된 엑소좀의 위 특이 흡수가 위 상피 세포 및 엑소좀 둘 다에서 더 높은 α6 및 αX 인테그린 단백질 발현을 필요로 함을 시사한다.

그런 다음, 마크로피노사이토시스, 클라스린-매개 엔도사이토시스, 및 카베올린-매개 엔도사이토시스가 위 상피 세포로부터 유래된 엑소좀의 내재화를 조절하는지를 연구하였다. 특히, HFE-145 위 상피 세포 및 위, 폐, 간 및 결장에서 유래한 암 세포 사이에서 신탁신 6 또는 클라스린 중쇄 1 (CLTC)과 같은 베시클 트래픽킹-관련 단백질 발현의 유의차가 없었다. 물론, 카베올린 1 단백질이 HFE-145에서 발현하지 않았으며 AGS 세포는 약한 카베올린 1 발현을 보였다 (도 3a). 그러나, MKN1 및 다른 암 세포는 카베올린 1 단백질의 강한 발현을 보였다 (도 3a). 흥미롭게도, 클라스린 및 마크로피노사이토시스의 저해는 AGS 및 MKN1 세포로의 엑소좀의 흡수를 현저하게 감소시키는 반면 (도 3b 내지 3d), 제니스테인에 의한 카베올린 저해는 GKN1 단백질을 운반하는 엑소좀의 AGS 및 MKN1 위암 세포로의 흡수를 증가시켰다 (도 3d 및 3e). 제니스테인 및 siCaveolin 1에 의한 카베올린의 저해는 GKN1 단백질을 운반하는 엑소좀의 MKN1 위암 세포로의 흡수를 증가시키는 반면, AGS 위암 세포에서의 카베올린 1의 이소성 발현은 엑소좀의 흡수를 저해하였다 (도 3d 및 3e). 이러한 결과는 효율적인 엑소좀 흡수가 클라스린-의존 엔도사이토시스에 의해 매개되고 카베올린1이 엑소좀의 엔도사이토시스를 음성적으로 조절한다는 이전 연구 결과와 일치하는 것이다. 따라서, 위 상피 세포에서의 엑소좀의 흡수가 클라스린 및 마크로피노사이토시스를 필요로 하고 카베올린이 위 상피 세포로의 엑소좀의 흡수를 저해할 수 있다는 결론을 내렸다.

엑소좀의 세포 상호작용은 세포 증식, 아폽토시스, 침윤 및 전이를 유도한다. 본 발명의 발명자들은 이전 연구에서 엑소좀-관련 GKN1 단백질이 AGS 및 MKN1 위암 세포의 생존능력 및 증식을 상당히 저해할 수 있음을 보고하였다. 또한, GKN1-양성 엑소좀이 세포주기 중 S 기를 현저히 감소시키지만 G1 및 G2/M 기의 세포 집단은 증가시켰다. G1 기 정지(arrest)에서, GKN1-양성 엑소좀은 p53 및 p21와 같은 음성 세포 주기 조절자의 발현 수준을 증가시켰으나 cdk4 및 cyclin D와 같은 양성 세포 주기 조절자의 발현은 하향-조절하였다. G2/M 정지에서, GKN1-양성 엑소좀은 HFE-145, AGS, 및 MKN1 세포에서 p-cdc2, cdc25c, 및 cyclin B 단백질의 발현을 하향-조절하였다. GKN1 단백질과 HFE-145 세포로부터 유래된 엑소좀의 공동-국소화 조사에서 PKH-26 표지된 엑소좀은 AGS 및 MKN1 세포의 세포질에서 발견되었다 (도 1d). 위 상피의 항상성 유지에서의 엑소좀-관련 GKN1 단백질의 효과를 추가 연구하기 위해, 트랜스웰 공동-배양 시스템을 사용하여 세포 증식과 관련된 분자 경로를 조사하였다. 본 발명의 발명자들은 이전 연구에서 GKN1이 위 세포 및 인간 위 점막에서 Ras 및 Raf 패밀리 단백질의 H. pylori CagA-유도 과발현을 하향조절할 수 있음을 보고하였다. Ras/Raf/MEK/ERK 키나아제 캐스케이드가 Ras GTPase 시그널링에 요구되는 필수적인 이펙터 캐스케이드임이 널리 알려져 있다. Ras/Raf/MEK/ERK 시그널링 경로를 시발하기 위해, 성장인자가 이의 동종 수용체에 결합하여 성장인자 수용체로의 GRB2 및 SOS의 결합에 의해 Ras-GTP를 활성화시킨다. serine/threonine 단백질 키나아제 및 Ras 이펙터인 Raf는 MEK/ERK 활성화를 통해 단백질 인산화를 촉진할 수 있다. 이의 업스트림 키나아제 MEK1/2는 세포 증식 및 아폽토시스를 매개하는 것으로 알려진 ERK1/2 키나아제를 활성화시킬 수 있다. ERK1/2은 Ets-1, c-Jun, c-Myc, 및 NFkB와 같은 다양한 전사 인자의 인산화를 유도할 수 있다. p-ERK는 Ras/Raf/MEK/ERK 시그널링 경로의 주요한 다운스트림 표적이다. 이 캐스케이드는 세포 증식, 아폽토시스, 분화 및 이동을 비롯한 세포 생물학에 관련된다. 이러한 경로의 비정상적 활성화는 인간 암에서 공통적으로 관찰된다. 이는 또한 화학치료 약물 내성에 영향을 미친다. 본 발명에서는 Ras/Raf/MEK/ERK 시그널링 경로의 불활성화에서 엑소좀-관련 GKN1 단백질의 새로운 역할을 밝혀냈다. 트랜스웰 시스템에서, HFE-145 불멸화 위 상피 세포와 AGS 위암 세포의 공동-배양은 AGS 암세포의 생존능력 및 증식을 현저히 저해하고 c-Myc, p-PI3K, p-Akt, HRas, b-Raf, c-Raf, 및 p-Erk의 발현 수준을 감소시켰다 (도 4). 또한, GKN1, 특히 BRICHOS 도메인이 HRas에 결합하여, b-Raf 및 c-Raf로의 HRas의 결합을 저해하고, 최종적으로 HFE-145 세포 유래 엑소좀으로 처리된 AGS 세포, MKN1 세포, 및 이종이식 종양에서의 p-ERK의 발현을 감소시켰으며 (도 4 및 도 5), 이는 Ras/Raf/MEK/ERK 시그널링 경로를 저해하여 위 상피 세포의 세포 증식을 억제할 수 있음을 나타내는 것이다. BRICHOS 슈퍼패밀리는 소수성, 링커, BRICHOS, 및 C-말단의 4개 개별 영역으로 이루어져 있다. GKN 단백질은 BRICHOS 도메인, COOH-말단 세그먼트 및 소수성 NH₂-말단 시그널 펩타이드를 포함한다. 본 발명자의 이전 연구에서 BRICHOS 도메인이 GKN1 종양 억제자 기능의 주요 도메인임을 발견하였다. 이러한 결과는 위 상피 세포로부터 분비된 엑소좀 GKN1 단백질이 위 세포 내로 내재화되어 세포 성장을 조절하는데 관련된 시그널링 경로를 대체함을 강력히 시사하는 것이다.

흥미롭게도, GKN1 단백질은 c-Myc, RhoA, Snail, 및 Slug 발현을 하향조절하고 NF-kB 경로를 불활성화하여 위암 세포의 이동 및 침윤을 저해한다. 이와 일관되게, AGS 위암 세포와 HFE-145 불멸화 위 상피 세포의 공동-배양은 AGS 세포의 이동 및 침윤을 현저하게 감소시켰다 (도 6). 또한, 증가된 E-cadherin 발현 및 N-cadherin, ZEB1, Snail, Slug, 및 Rho-GTP와 같은 EMT-관련 단백질의 감소된 발현이 HFE-145 세포와 공동배양된 AGS 위암 세포 및 HFE-145 세포 유래 엑소좀이 처리된 이종이식 종양 둘 다에서 관찰되었다 (도 6). 이러한 데이터는 엑소좀-관련 GKN1 단백질이 EMT를 억제하여 위암 세포의 이동 및 침윤을 억제할 수 있음을 시사한다.

종합하면, 위-유래 엑소좀의 위 특이 흡수는 위 세포 및 위 세포 유래 엑소좀에서 인테그린 α6 및 αX 단백질을 필요로 한다. 클라스린 및 마크로피노사이토시스는 위 상피 세포로의 엑소좀의 흡수를 증가시킬 수 있으나, 카베올린은 엑소좀의 흡수를 저해할 수 있다. 트랜스웰 공동-배양에서, HFE-145 세포로부터 유래된 엑소좀은 AGS 및 MKN1 암 세포의 생존능력 및 증식을 현저하게 저해하였다. GKN1 단백질은 HRas에 결합하여 PI3K/Akt 및 HRas/Raf/MEK/ERK 시그널링 경로를 하향조절하였다. 또한, 엑소좀-관련 GKN1 단백질은 EMT를 저해하여 위암 세포의 이동 및 침윤을 억제하였다. 따라서, 위 상피 세포로부터 유래된 엑소좀의 위 특이 흡수는 위 상피 세포 및 엑소좀 둘 다에서 인테그린 α6 및 αX 단백질을 필요로 하며 엑소좀-관련 GKN1 단백질은 HRas/Raf/MEK/ERK 시그널링 경로를 하향조절하여 위암 발암을 저해할 수 있다는 결론을 내렸다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> COMPOSITION INCLUDING EXOSOME CONTAINING INTEGRIN a6 AND aX FOR PREVENTING OR TREATING GASTRIC CANCER <130> PN2010 <150> KR 2019-0132798 <151> 2019-10-24 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1091 <212> PRT <213> Homo sapiens Integrin alpha-6 <400> 1 Met Ala Ala Ala Gly Gln Leu Cys Leu Leu Tyr Leu Ser Ala Gly Leu 1 5 10 15 Leu Ser Arg Leu Gly Ala Ala Phe Asn Leu Asp Thr Arg Glu Asp Asn 20 25 30 Val Ile Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Gly Ser Leu Phe Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Ala Met His Trp Gln Leu Gln Pro Glu Asp Lys Arg Leu Leu Leu Val 50 55 60 Gly Ala Pro Arg Ala Glu Ala Leu Pro Leu Gln Arg Ala Asn Arg Thr 65 70 75 80 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys Asp Ile Thr Ala Arg Gly Pro Cys Thr Arg 85 90 95 Ile Glu Phe Asp Asn Asp Ala Asp Pro Thr Ser Glu Ser Lys Glu Asp 100 105 110 Gln Trp Met Gly Val Thr Val Gln Ser Gln Gly Pro Gly Gly Lys Val 115 120 125 Val Thr Cys Ala His Arg Tyr Glu Lys Arg Gln His Val Asn Thr Lys 130 135 140 Gln Glu Ser Arg Asp Ile Phe Gly Arg Cys Tyr Val Leu Ser Gln Asn 145 150 155 160 Leu Arg Ile Glu Asp Asp Met Asp Gly Gly Asp Trp Ser Phe Cys Asp 165 170 175 Gly Arg Leu Arg Gly His Glu Lys Phe Gly Ser Cys Gln Gln Gly Val 180 185 190 Ala Ala Thr Phe Thr Lys Asp Phe His Tyr Ile Val Phe Gly Ala Pro 195 200 205 Gly Thr Tyr Asn Trp Lys Gly Ile Val Arg Val Glu Gln Lys Asn Asn 210 215 220 Thr Phe Phe Asp Met Asn Ile Phe Glu Asp Gly Pro Tyr Glu Val Gly 225 230 235 240 Gly Glu Thr Glu His Asp Glu Ser Leu Val Pro Val Pro Ala Asn Ser 245 250 255 Tyr Leu Gly Phe Ser Leu Asp Ser Gly Lys Gly Ile Val Ser Lys Asp 260 265 270 Glu Ile Thr Phe Val Ser Gly Ala Pro Arg Ala Asn His Ser Gly Ala 275 280 285 Val Val Leu Leu Lys Arg Asp Met Lys Ser Ala His Leu Leu Pro Glu 290 295 300 His Ile Phe Asp Gly Glu Gly Leu Ala Ser Ser Phe Gly Tyr Asp Val 305 310 315 320 Ala Val Val Asp Leu Asn Lys Asp Gly Trp Gln Asp Ile Val Ile Gly 325 330 335 Ala Pro Gln Tyr Phe Asp Arg Asp Gly Glu Val Gly Gly Ala Val Tyr 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Claims (19)

1. 인테그린 α6, 인테그린 αX로 이루어진 군중 어느 하나 이상의 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는, 위상피세포 유래의 엑소좀을 표적 세포에 전달하기 위한 키트로서, 상기 표적 세포는 위암세포, 폐암세포, 대장암세포 및 간암세포로 이루어진 군으로부터 선택된 암세포인 것인, 키트.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 엑소좀은 항암물질을 포함하고 있는 것인, 키트.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 항암물질은 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-FU), 글리벡(gleevec), 카보플라틴(carboplatin), 두아노루비신(daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 플로타미드(flutamide), 젬시타빈(gemcitabine), 트라스투주맵(trastuzumab), 펨브로리주맵(pembrolizumab) 및 GKN1 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 키트.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 암세포는 위암세포인 것인, 키트.
6. 삭제
7. 제 1 항에 있어서, 카베올린 저해제를 추가 포함하는 것인, 키트.
8. 제 1 항에 있어서, 클라스린(clathrin)을 추가 포함하는 것인, 키트.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 인테그린 α6 또는 인테그린 αX는 표적 세포의 세포막에 발현되어, 엑소좀의 세포 내 내재화를 유도하는 것인, 키트.
10. 분리된 시료에서 인테그린 α6, 인테그린 αX 또는 이의 조합의 발현양을 측정하는 것을 포함하는, 위상피세포 유래의 엑소좀의 표적 세포 전달여부에 대한 정보 제공방법으로서,
    상기 표적 세포는 위암세포, 폐암세포, 대장암세포 및 간암세포로 이루어진 군으로부터 선택된 암세포인 것인, 방법.
11. 삭제
12. 제 10 항에 있어서, 상기 표적 세포는 위암세포인 것인, 방법.
13. 인테그린 α6 및 인테그린 αX로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는, 위암, 폐암, 대장암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 인테그린 α6 및 인테그린 αX는 암세포의 외부에 발현되어, 위 상피 세포에서 분비되는 GKN1을 포함하는 엑소좀의 암세포 내재화를 유도하는 것인, 조성물.
15. 제 13 항에 있어서, 카베올린 저해제 또는 클라스린을 추가 포함하는 것인, 조성물.
16. 인테그린 α6 단백질에 결합하는 모이어티 및 인테그린 α X에 결합하는 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 위암세포, 폐암세포, 대장암세포 및 간암세포로 이루어진 군으로부터 선택된 암세포를 특이적 표적화하기 위한, 위상피세포 유래의 엑소좀.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 엑소좀은 항암물질이 내재화된 것인, 엑소좀.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 항암물질은 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-FU), 글리벡(gleevec), 카보플라틴(carboplatin), 두아노루비신(daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 플로타미드(flutamide), 젬시타빈(gemcitabine), 트라스투주맵(trastuzumab), 펨브로리주맵(pembrolizumab) 및 GKN1 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 엑소좀.
19. 제 18 항에 있어서, 상기 항암물질은 GKN1 단백질인 것인, 엑소좀.

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