WO2012061911A9 - Utilização do gene homeobox de café cahb12 na produção de plantas transgênicas mais tolerantes ao déficit hídrico e estresse salino - Google Patents

Utilização do gene homeobox de café cahb12 na produção de plantas transgênicas mais tolerantes ao déficit hídrico e estresse salino Download PDF

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WO2012061911A9 PCT/BR2011/000412 BR2011000412W WO2012061911A9 WO 2012061911 A9 WO2012061911 A9 WO 2012061911A9 BR 2011000412 W BR2011000412 W BR 2011000412W WO 2012061911 A9 WO2012061911 A9 WO 2012061911A9
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Marcio Alves Ferreira
Fernanda Pinheiro Da Cruz Waltenberg
Eduardo Romano De Campos Pinto
Maria Fátima GROSSI DE SÁ
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Universidade Federal Do Rio De Janeiro
Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuaria Embrapa (Cenargen)
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    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the present invention relates to the plant biotechnological improvement of species of commercial interest. More specifically, the present invention relates to the production of transgenic plants more tolerant to water deficit and salt stress through the expression of a new coffee gene (sp. Coffea arabica), belonging to the HD-Zip family, characterized by the presence of homedomain associated with a leucine zipper.
  • a new coffee gene sp. Coffea arabica
  • the expression of this transcriptional factor is induced in leaves and roots of coffee plants under different water deficit conditions (moderate and severe), and transgenic plants overexpressing this gene have a higher tolerance, both at different drought levels, as well as at different levels. at high salt concentrations.
  • HD-Zip protein family is characterized by the presence of homeodomain (HD) associated with an adjacent leucine zipper (LZ), important for homo- and heterodimer formation (Frank et al., 1998; Johannesson et al., 2001 ; Ruberti et al., 1991; Sessa et al., 1993).
  • HD homeodomain
  • LZ leucine zipper
  • HD-Zip protein subfamilies can be distinguished based on sequence similarity and gene structure inside and outside HD (Mukherjee et al., 2009).
  • the expression of genes belonging especially to the HD-Zipl subfamily are generally modulated by environmental factors (eg light, low temperatures, saline and water stress), and their role in regulating plant development in response to these stimuli may occasionally lead to phenotypes of. greater drought tolerance (Ariel et al., 2007).
  • US Patent No. 5981729 refers to a new gene from the homeobox family, isolated from the Arabidopsis thaliana species that encodes the transcription factor ATHB-12, related to the drought response to abscisic acid (ABA). Said gene can be cloned into expression vectors to produce a recombinant DNA expression system suitable for transformation of plant cells and production of more drought tolerant transgenic plants. Said patent, however, does not mention or refer to any tolerance experiment with transgenic plants carrying said gene.
  • WO 04/099365 describes an invention characterized by an isolated Helianthus annuus gene encoding the transcription factor HAHB-4, belonging to the HD-Zip family.
  • the HAHB4 gene has its expression induced by water deficit or abscisic acid (ABA), and can be cloned into DNA constructs to transform host cells and plants.
  • Transgenic plants expressing the transcription factor gene are tolerant and resistant to water deficit and high salinity.
  • the new CAHB12 coffee gene also encodes a transcriptional factor of the HD-Zip family, expressed in leaves and roots of Coffea arabica coffee plants grown under water deficit, showing increasing levels of expression, according to the severity of the stress experienced.
  • Transgenic plants carrying this gene under the control of the 35S promoter which guarantees constitutive expression, ie in All organs at higher levels have a higher tolerance to different water deficit conditions at different stages of development, as well as a higher tolerance to salt stress.
  • Saline stress tolerance levels of plants carrying the CAHB12 gene are even higher than those observed in plants carrying the HAHB4 gene, described in WO 04/099365.
  • fresh weight measurements were also evaluated, as well as the water deficit-mediated lipid peroxidation levels were monitored. malonic.
  • Transgenic plants expressing the CAHB12 gene presented germination rates of 20 to 45% higher than non-transgenic plants grown in the presence of 150mM NaCI.
  • the percentage of transgenic and non-transgenic plants germinated 46 hours after the start of the experiment was the same (100%).
  • plants belonging to the transgenic lines expressing the CAHB12 gene showed higher fresh weight measurements than those observed for wild plants germinated in culture medium containing 100mM NaCI.
  • lipid peroxidation level remained virtually unchanged in two of the three transgenic strains tested when grown in the presence of 100mM NaCl.
  • the present invention can be used to confer greater tolerance to drought and salt stress in plants and to obtain better salt stress performance than that observed and described in WO 04/099365.
  • the object of the present invention is the use of the coffee CAHB12 gene, or a fragment thereof, for plant production. coffee or related species that are more tolerant of water deficit and salt stress.
  • the pB2GW7 binary vector construct contains the nucleotide sequence encoding the 35S promoter-fused CAHB12 protein and can be used directly for plant transformation.
  • the CAHB12 gene was isolated in coffee by searching for homeobox genes that presented their modulated expression under water deficit conditions, using data provided by the Café Genome project.
  • the CAHB12 gene was classified as belonging to the HD-Zipl family, through phylogenetic analyzes using the maximum likelihood method.
  • the sequence corresponding to the complete cDNA of the CAHB12 gene has been amplified by PCR reactions, and has 693 base pairs, yielding a protein consisting of 230 amino acids.
  • the HD (homeodomain) and Lz (leucine zipper) domains are located in the region near the N-terminal portion of the protein ( Figure 1).
  • CAHB12 The nuclear localization of the CAHB12 protein was confirmed by transient expression assays by bombarding gold-leaf coated coffee particles with a plasmid construct containing the translationally fused CAHB12 and green fluorescent protein (GFP) coding region. , and under the control of the 35S promoter ( Figure 2).
  • GFP green fluorescent protein
  • CAHB12 gene expression pattern in coffee leaves and roots was analyzed by real-time PCR (RT-qPCR) reactions in Coffea arabica coffee plants, cultivars 'Catua ⁇ Vermelho IAC44' and 'Bourbom Amarelo IAC J10' .
  • RT-qPCR real-time PCR
  • the CAHB12 gene presented low expression levels and was gradually induced under deficit conditions. in plants with characteristic stress potential water measurements ( Figures 3 and 4).
  • the greenhouse water stress experiments were carried out using six-month-old coffee plants in trays containing 20 plants each. Watering of the control plants was performed using 500 ml of water per tray at one-day intervals.
  • the water potential (IJJ w ) of each plant was measured before dawn with the aid of a Scholander pressure chamber. Water stress was induced by interrupting irrigation for 10 days. Samples composed of fully expanded leaves (third pair) and lateral roots were collected at different induction periods (2, 5 and 10 days). The experiments were performed in duplicate, and each sample consisted of material from 5 coffee plants under the same conditions. In both experiments, the expression profile of CAHB 12 under water deficit conditions showed the same induction trend. Samples of plants grown under control conditions were collected at the same stress induction periods for comparison.
  • Plants overexpressing the CAHB12 gene were obtained by cloning the complete gene cDNA under the control of the 35S promoter into the Gateway ® pB2GW7 vector (Karimi et al., 2002) ( Figure 5).
  • Transgenic plants of the Arabidopsis thaliana species were transformed through the inflorescence infiltration system mediated by Agrobacterium tumefaciens (floral-dip) (Desfeux et al., 2000).
  • transgenic plants up to the third generation were performed only through segregation assays. Seeds and plants belonging to the T3 strains produced by the homozygous T2 plants were then used for water and salt stress tolerance tests. Expression studies by RT-PCR were performed with T3 generation homozygous plants belonging to strains A, B and D ( Figure 6A). In general, transgenic plants showed no apparent phenotypic alteration. For plaque assays using PEG 8000-treated culture medium, malonic aldehyde (MDA) rates were monitored to measure the level of stress suffered by plants. MDA is an indicator of lipid peroxidation process mediated by free radicals resulting from water stress (Hodges et al., 1999).
  • MDA malonic aldehyde
  • transgenic strain D was the one with the lowest MDA production levels, about 37 ⁇ / kg, followed by strains B and A, which presented approximate values of 40 and 41 ⁇ / kg, respectively.
  • the measurements observed for lineage B were those with the highest fluctuation, ranging from 34 to 45 mol / kg.
  • the CAHB12 gene is specifically induced under coffee leaf and root water deficit conditions indicating its importance in the response to this stress. Under the control of the 35S promoter, the CAHB12 gene is capable of conferring greater tolerance to water deficit and salt stress of A. thaliana species at different stages of their development. Said invention may be used for the production of transgenic plants belonging to different species of commercial interest. It is also noteworthy that the use of genes of their own species in the production of transgenic plants is a biotechnological advantage.
  • the complete cDNA sequence of the homeobox CAHB12 gene was cloned by PCR amplification of cDNA synthesized from RNA from coffee plants subjected to seven days without watering.
  • PCR reactions were performed on a total of 50 ⁇ _ containing 1 ⁇ _ of 1: 2 diluted cDNA, 1 mM MgSO 4 , 0.4mM of each dNTP, 0.1 ⁇ of each primer, 10 ⁇ 1_ of concentrated 10X Pfx PCR buffer , and 1 U of Platinum®Pfx DNA Polymerase enzyme (Invitrogen).
  • PCR reactions were purified using the DNA Clean & Concentrator TM kit (Zymo Research) according to the manufacturer's instructions. CDNA was then first cloned into the pENTR TM D-TOPO (Invitrogen) input vector for later recombination into Gateway system expression (Invitrogen). Binding reactions were performed containing 4 ⁇ _ of the purified PCR reaction, 1 ⁇ _ of saline (1.2M NaCl, 0.06M MgCI 2 ) diluted 1: 4, and 1 ⁇ _ of TOPO® vector in a final volume of 6pL. 16 hours at room temperature (22-23 ° C), ⁇ _ of the ligation reaction was used to transform electrocompetent Escherichia coli XL1-6 cells.
  • Transforming bacteria were selected in solid LB culture medium (10g / L peptone, 5g / L yeast extract, 5g / L NaCl, 15g / L agar, pH7.0) containing the kanamycin antibiotic at the final concentration of 25 ⁇ g / mL. Confirmation of positive clones for the CAHB12 insert was then performed by colony PCR using the same primer pairs used in the cDNA isolation reaction. Two clones containing the coffee homeobox gene were then chosen for sequencing.
  • the cloning of the CAHB12 gene into the Gateway® pB2GW7 binary vector was performed by recombination.
  • the homeobox gene cDNA was cloned under the control of the 35S promoter region by recombining between the attl_1 / attR1 and attL2 / attR2 regions of the input and destination vectors, pENTR TM D-TOPO / pB2GW7, respectively.
  • the recombination reactions were performed under the following conditions: 1 ⁇ _ of the enzyme LR Clonase TM II (Invitrogen), 150ng of the pENTR TM D-TOPO input vector (containing cDNA from each coffee homeobox), 150ng of the target vector pB2GW7 and TE buffer (10mM Tris-HCI, 1m EDTA) in a final volume of 5pL. This mixture was incubated for 1 hour at 25 ° C. Then 1 ⁇ l of a 2 g / pL proteinase K solution was added to each previous reaction and a further incubation for 10 minutes at 37 ° C was performed. 2pL of reaction were then used for transformation of electrocompetent E.coli XL1-8 cells, and clones Positive results were selected this time in solid LB medium containing the antibiotic spectinomycin at the final concentration of 50pg / pL
  • Positive clones were then confirmed by colony PCR reactions using the same primer pairs described earlier in this item. Plasmid DNA from these clones was extracted and purified with the Wizarcf Plus Minipreps DNA Purification System Kit (Promega) according to the manufacturer's instructions, and 1 ⁇ _ of 1: 100 diluted DNA was used for transformation of Agrobaterium tumefasciens cells. GV3101 Electrocompetent. Selection of positive clones was performed on solid LB medium containing 100 g / ml of the rifampicin and spectinomycin antibiotics. Following confirmation by colony PCR reactions, a clone containing the CAHB12 gene was selected for transformation of A. thaliana plants.
  • the greenhouse water stress experiments were performed using six-month-old C. arábica, cvs. 'Catua ⁇ Red IAC44' and 'Bourbon Yellow IAC J10'. At The plants were cultivated under controlled conditions of temperature (21 ⁇ 2 ° C) and natural photoperiod in trays containing 20 plants each. Watering of control plants was performed using 500 mL of water per tray at one-day intervals. The water potential (ip w ) of each plant was measured before dawn with the aid of a Scholander pressure chamber. During the water deficit experiments, the plants remained covered at night, and this protection was removed only when the IJJ w measurements were performed, to avoid the transpiration rate interference on the obtained values. Water stress was induced by interrupting irrigation for 10 days.
  • Samples composed of fully expanded leaves (third pair) and lateral roots were collected at different induction periods (2.5 and 10 days). The experiments were performed in duplicate, and each sample consisted of material from 5 coffee plants under the same conditions. Samples of plants grown under control conditions were collected at the same stress induction periods for comparison. All collected samples were immediately frozen in liquid nitrogen and kept at -80 ° C until RNA extraction.
  • RNA was precipitated with an equal volume of isopropanol for 10 minutes at room temperature, followed by a centrifugation step at 4 ° C for 10 minutes at 12000xg.
  • the precipitate was washed with a 75% ethanol (EtOH) solution, dried at room temperature, and dissolved in 30 ⁇ of sterile distilled water.
  • RNA samples were treated with DNAsel (Invitrogen) at 37 ° C for 15 minutes, followed by two extractions with a phenol solution: chloroform: isoamyl alcohol (25:24: 1), and precipitated with 3M sodium acetate (NaOAc), and 100% EtOH.
  • RNA concentration and purity were determined before and after DNasel treatment with the aid of the NanoDrop TM ND-1000 spectrophotometer (Thermo Scientific). RNA integrity was verified on 1% agarose gel.
  • CDNA synthesis was performed by adding 50 ⁇ Oligo (dT 2 4), and 10mM of each deoxyribonucleotide 5 '- triphosphate (dNTP) 1 pg of total RNA. The mixture was incubated at 65 ° C for 5 minutes, and cooled briefly on ice. 2 ⁇ _ First Strand Buffer buffer 0X, 20mM dithio-threitol (DTT), and 200 units of Superscript III enzyme (Invitrogen) were added to the above mixture to a final volume of 20 pL. After 1 hour at 50 ° C, the action of the enzyme was thermo inactivated at 70 ° C for 15 minutes,
  • the pairs of primers for amplification of the CAHB12 gene were designed with the aid of the Primer3 program (Rozen & Skaletsky, 2000), using as criteria the amplification of products of size between 80-100 nucleotides and annealing temperature of approximately 60 °. ⁇ (Table 2). Dissociation curve analyzes of amplified products, and 1% agarose gel runs were performed to confirm amplification of a single PCR product.
  • the reference genes were the UBI9 (ubiquitin - /// ej, S24 (ribosomal protein S24) and GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase C-2) genes.
  • RT-qPCR Real-time polymerase chain reactions
  • BioRad Chromo 4 Real-time PCR Detector
  • SYBR ® Green fluorophore to monitor double synthesis.
  • DNA strands 0.2 ⁇ of each primer, 50 ⁇ of each dNTP, 2 ⁇ _ of Taq 10X concentrated PCR buffer (Invitrogen), 3mM MgCl 2 , 1 ⁇ _ of SYBR ® Green I (Molecular Probes) diluted in water (1: 10,000), and 0.25 units of Platinum Taq DNA Polymerase enzyme (Invitrogen) were added to 10 ⁇ _ 1: 50 diluted cDNA in a final volume of 20 ⁇ _.
  • the reactions were incubated for 5 minutes at 94 ° C, followed by 40 cycles of 15 second amplification at 94 ° C, 10 seconds at 60 ° C, and 15 seconds at 72 ° C.
  • tumefasciens GV3101 containing the CAHB12 gene under the control of the 35S promoter (vector pB2GW7), was grown for 48 hours at 28 ° C under agitation of approximately 200rpm in 2mL of liquid LB medium (peptone 10g / L, yeast extract 5g / L, NaCl 5g / L, pH7.0), containing 100g / ml rifampicin antibiotic and 25g / ml kanamycin antibiotic, or 100g / ml_ spectinomycin antibiotic, depending on construction to be transformed.
  • This culture was used to inoculate 200mL of liquid LB medium containing the same antibiotics present in the previous culture.
  • the seeds produced by the transformed plants were sterilized in a 70% EtOH and 0.05% TWEEN 20 solution for 10 minutes, and sown in solid MS medium (MS salts 4.6g / L, sucrose 20g / L, glycine 2mg / L nicotinic acid 5mg / L, pyridoxine-HCl 0.5 mg / L, thiamine-HCl 0.1 mg / L, agar 8g / L, pH5.8) (Murashige & Skoog, 1962) containing the herbicide glufosinate ammonium salt (sufficient) at the final concentration of 10 g / mL.
  • the resistant transgenic strains were transferred to pots containing the Plantmax® commercial substrate at a ratio of 3: 1 (substrate: vermiculite), and thus cultivated under light conditions (18 hours light / 6 hours dark) and temperature. (22 ° C, ⁇ 2 ° C) controlled.
  • the seeds of the TO generation of plants containing the CAHB12 gene in the pB2GW7 vector were re-screened with the aim of identifying those strains presenting a 3: 1 segregation between resistant and sensitive plants, indicating the presence of only one insert.
  • T-DNA. 15-25 resistant T1 generation plants from each previously selected independent strain were transferred to pots containing substrate, and a new segregation test was performed with the seeds.
  • T2 plants produced by these plants in order to identify the heterozygous and homozygous T2 strains.
  • the T2 plants grown in plaques showing approximately 100% resistance to the herbicide or antibiotic used were transferred to substrate pots under the conditions mentioned above, and the T3 seeds produced were then used for further tolerance testing. For each segregation test, 50 to 150 seeds were used.
  • RNA integrity was verified on 1% agarose gel.
  • CDNA synthesis was performed as described previously in section 3.4.2 of this section. PCR reactions were performed with GW1 1 1 16 and 1 1 16mon primers (Table 1) according to the following conditions: 1 ⁇ _ cDNA, 2.5 ⁇ _ of 10X concentrated PCR buffer, 2mM MgCb, 0.2 ⁇ each primer, 0.8mM of each dNTP, and 1 U of Taq DNA Polymerase enzyme (Invitrogen), for a total of 25 ⁇ _. Each reaction was incubated for 3 minutes at 94 ° C, followed by 25 cycles of 25 second amplification at 94 ° C, 25 seconds at 59 ° C, and 55 seconds at 72 ° C. Finally, a final extension step at 72 ° C for 10 minutes was performed.
  • Actinall gene expression was used as internal control.
  • Ath_Actinll (5'-GGAATCCACGAGACAACCTATAAC-3 ') primers were used in the forward orientation, and Ath_Actinll (5'-AGGAATCGTTCACAGAAAATGTTTC-3') in the reverse orientation, containing the same reagent and cDNA concentrations described in the paragraph. previous.
  • Each reaction was incubated for 3 minutes at 94 ° C, followed by 25 cycles of 30 second amplification at 94 ° C, 45 seconds at 62 ° C, and 45 seconds at 72 ° C. Finally, a final extension step at 72 ° C for 10 minutes was performed. PCR products were checked on 1% agarose gels.
  • Example 4 Water stress tolerance testing with transgenic plants overexpressing the CAHB12 gene
  • the seedlings were transferred to regular sized (100mm diameter x 20mm high) Petri dishes containing 20mL of the modified MS culture medium as previously described, previously treated with a PEG8000 solution (MS 2 salts). , 3g / L, 2mg / L glycine, 5mg / L nicotinic acid, 0.5 mg / L pyridoxine-HCl, 0.1 mg / L thiamine-HCl, 6mM MES buffer, 550g / L PEG8000, pH5.7). These plates were covered with 30mL of PEG solution in order to reduce the water potential of the culture medium to -1.2MPa. After 16 hours of infusion, the PEG solution was completely removed with the aid of a sterile pipette, and 30 seedlings of each transgenic and wild strain were transferred to the treated medium.
  • a PEG8000 solution MS 2 salts
  • Plant material was collected 7 days after transfer to PEG-treated medium. A total of two biological replicates were performed for each transgenic strain. In each experiment, two individual seedling sets were collected, containing 15 individuals each. THE The amount of malonic aldehyde (MDA) produced was subsequently monitored in an attempt to measure the level of lipid peroxidation of plants under stress. To avoid the effect of plate transfer on MDA measurements, seedlings transferred to plates containing non-PEG-treated culture medium were used as controls. The collected material was frozen in liquid nitrogen and kept at -80 ° C until MDA quantification.
  • MDA malonic aldehyde
  • the previously frozen material was first sprayed on liquid nitrogen with the aid of metal microspheres and vortex stirrer. Then, 700 ⁇ _ of 0.1% trichloroacetic acid (TCA), previously refrigerated, was added. The extraction with 0.1% TCA was repeated once more, and the samples were centrifuged at 12000xc / for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant was then divided into two tubes (600 ⁇ _ each).
  • the first tube contained 600 ⁇ _ of solution composed of 20% TCA and 0.01% butylated hydroxytoluene (BHT).
  • BHT butylated hydroxytoluene
  • the second tube contained the same volume (600 ⁇ _) of a solution composed of 20% TCA, 0.01% BHT, and 0.65% thiobarbituric acid (TBA).
  • MDA measurements were performed with seedlings germinated in medium containing 100mM NaCl 15 days after transfer of the plates to the growth chamber. This experiment was performed in duplicate, and for each one, three sets of 10 seedlings were collected. These samples were immediately weighed and frozen in liquid nitrogen. As control were used samples of plants grown in MS medium without the addition of NaCl.
  • sequences ID1 and ID2 represent the CAHB12 gene. (THE)
  • CAHB protein coding nucleotide sequence 2 (B) CAHB12 protein amino acid sequence. The homeodomain position is indicated by the horizontal black bar above the sequence. The position of the leucine zipper is indicated by the dotted horizontal bar.
  • FIGURE 1 Nuclear Addressing of CAHB12 Protein.
  • C. arabica coffee leaves were bombarded with the following constructs: GFP protein under the control of the 35S promoter (A.B.C) and complete cDNA of the GFP protein fused CAHB12 gene under the control of the 35S promoter (D, E, F).
  • Transient expression was observed 24h after bombardment under confocal microscopy using the red (A and D), green (B and E), and red and green (C and F) fluorescence filters. Bars - 10pm.
  • FIGURE 2 CAHB12 gene expression pattern in lateral roots of C.arabica plants, Catua ⁇ Vermelho (A) and Yellow Bourbom (B) cultivars. Relative expression values are indicated on the y axis. Samples were collected at different induction times: 2 days (2d), 5 days (5d) and 10 days (10d). Plant samples kept under conditions Control (Ctlr) were collected at each experimental time for comparison. Below the expression graphs are indicated the means of i
  • FIGURE 4 Scheme of the destination vector pB2GW7 (Karimi et al., 2002).
  • the pink arrows indicate the location of the resistance genes for the herbicide glufosinate ammonium salt (Bar) and the antibiotics streptomycin (Sm) and spectinomycin (Sp).
  • the position of the 35S promoter and terminator are indicated by the green arrow and box respectively.
  • the ccdB region is indicated by the light blue box between the two recombination regions attR1 and attR2.
  • the red boxes indicate the T-DNA, flanked by the right border (RB) and left border (LB) regions.
  • FIGURE 5 (A) Transcript detection by RT-PCR for CAHB12 gene in third generation homozygous plants of transgenic strains A, B and D. Actinall gene expression level (ACTII) was used as internal control (indicated at the bottom of the figure). (B) Measurements of malonic aldehyde (MDA) after 7 days in culture medium treated with PEG8000 (-1, 2MPa). Error bars correspond to standard error (SE) obtained from two repetitions containing 15 seedlings each. NT - not transgenic.
  • Figure 7 Continuous water stress survival test.
  • the image shows plants 2 days after rehydration.
  • NT not transgenic.
  • FIGURE 8 Characterization of transgenic plants overexpressing the CAHB12 gene in saline stress assays.
  • A Germination rates seven days after transfer of the plates to the growth chamber. The error bars correspond to the standard deviation (SD) calculated for four plates, containing 50 plants each, for experiments performed in culture medium containing 100mM NaCl, and two plates, containing 50 seeds each, for experiments performed with 150mM of NaCI. NaCI.
  • B Fresh weight observed in experiments with 100mM NaCI. Each measurement was performed on a set of 10 seedlings 15 days after transfer of the plates to the growth chamber. Error bars correspond to the observed SD for a total of six measurements. NT - not transgenic.
  • FIGURE 9 Tolerance to salt stress in plants overexpressing the CAHB12 gene.
  • A Effect of saline treatment on wild and transgenic plants in culture medium containing 100mM NaCl 15 days after transfer to growth chamber.
  • B MDA measurements performed on germinated plants in culture medium containing 100mM NaCl 15 days after transfer to the growth chamber. Error bars correspond to the EP calculated from 6 replicates containing 10 seedlings each. NT - not transgenic.

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Abstract

A inovação ora proposta está relacionada ao melhoramento biotecnológico vegetal de espécies de interesse comercial. Mais especificamente, a presente invenção está relacionada com a produção de plantas transgênicas mais tolerantes ao déficit hídrico e estresse salino, através da expressão de um novo gene de café (sp. Coffea arábica), pertencente à família HD-Zip, caracterizada pela presença do homeodomínio associado a um zíper de leucina. A expressão desse fator transcricional é induzida em folhas e raízes de plantas de café submetidas a diferentes condições de déficit hídrico (moderado e severo), e plantas transgênicas sobre-expressando esse gene apresentam uma maior tolerância, tanto a diferentes níveis de seca, quanto a elevadas concentrações de sal.

Description

UTILIZAÇÃO DO GENE HOMEOBOX DE CAFÉ CAHB12 NA PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS MAIS TOLERANTES AO DÉFICIT HÍDRICO E ESTRESSE SALINO
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção está relacionada ao melhoramento biotecnológico vegetal de espécies de interesse comercial. Mais especificamente, a presente invenção está relacionada com a produção de plantas transgênicas mais tolerantes ao déficit hídrico e estresse salino, através da expressão de um novo gene de café (sp. Coffea arábica), pertencente à família HD-Zip, caracterizada pela presença do homeodomínio associado a um zíper de leucina. A expressão desse fator transcricional é induzida em folhas e raízes de plantas de café submetidas a diferentes condições de déficit hídrico (moderado e severo) e, as plantas transgênicas sobre-expressando esse gene apresentam uma maior tolerância, tanto a diferentes níveis de seca, quanto a elevadas concentrações de sal.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os estresses abióticos, causados por temperaturas muito baixas ou elevadas, pela falta de água, ou por altas concentrações de sais ou metais pesados nos solos, são responsáveis por grandes perdas na agricultura, reduzindo de forma drástica a produção e gerando perdas que podem chegar a mais de 50% (Boyer, 1982; Wang et ai., 2003). Para sobreviver em ambientes tão hostis, os vegetais desenvolveram uma série de complexas estratégias que envolvem alterações morfológicas, fisiológicas e moleculares, na tentativa de se tornarem mais tolerantes (Nakashima et ai., 2009; Verslues et ai, 2006). Dentre os estresses abióticos, a seca tem recebido crescente atenção, pois, além de limitar a produtividade, possui um importante papel na determinação da distribuição das espécies em diferentes ecossistemas. A preocupação com o impacto potencial que as mudanças climáticas podem causar na temperatura e nos padrões pluviométricos esbarra na crescente necessidade do aumento de produtividade agrícola (Ramalho et al. , 2009). Em todo o mundo, cerca de 70% de água disponível para consumo é utilizada na agricultura e, apesar de a irrigação ser uma estratégia utilizada para amenizar os danos causados pela escassez hídrica, o sistema irrigado também apresenta desvantagens, como o aumento do custo da produção e a salinização dos solos (Somerville & Briscoe, 2001 ). O melhoramento clássico de espécies importantes agronomicamente (e.g. Coffea arábica) visando ao desenvolvimento de características como, floração, maior produtividade, e maior resistência a pragas e a estresses abióticos (e.g. geadas e secas), apesar de bem sucedido, é também considerado um processo lento e que requer uma imensa demanda de trabalho e recursos financeiros (Etienne et al. , 2002).
Estudos com fatores de transcrição pertencentes à família homeobox, mais especificamente à família HD-Zip, revelaram que esses fatores podem estar envolvidos na modulação de respostas das plantas à seca, controlando o desenvolvimento vegetal em tais condições (Deng et al. , 2006; Dezar et al. , 2005). A família de proteínas HD-Zip é caracterizada pela presença do homeodomínio (HD) associada a um zíper de leucina (LZ) adjacente, importante para a formação de homo- e heterodímeros (Frank et al. , 1998; Johannesson et al. , 2001 ; Ruberti et al., 1991 ; Sessa et al., 1993). A associação desses dois elementos (HD e LZ) em uma única proteína é exclusiva de plantas, e essa família representa, em número de membros, de 40 a 50% de todos os genes homeobox presentes desde musgos até angiospermas. Até o momento, quatro subfamílias de proteínas HD-Zip (HD- Zipl, II, III e IV) podem ser distinguidas com base na similaridade de sequência e estrutura gênica dentro e fora do HD (Mukherjee et al. , 2009). A expressão de genes pertencentes especialmente à subfamília HD-Zipl é, em geral, modulada por fatores ambientais (e.g. luz, baixas temperaturas, estresse salino e hídrico), e o seu papel na regulação do desenvolvimento vegetal em respostas a esses estímulos pode levar ocasionalmente a fenótipos de maior tolerância à seca (Ariel et ai. , 2007).
A patente, US n° 5981729, refere-se a um novo gene da família homeobox, isolado da espécie Arabidopsis thaliana que codifica o fator de transcrição ATHB-12, relacionado com a resposta à seca a ao ácido abscísico (ABA). O dito gene pode ser clonado em vetores de expressão para produzir um sistema de expressão recombinante de DNA, adequado para a transformação de células vegetais e produção de plantas transgênicas mais tolerantes à seca. A referida patente, no entanto, não menciona, nem faz referência a nenhum experimento de tolerância com plantas transgênicas portando o referido gene.
A patente WO 04/099365 descreve uma invenção caracterizada por um gene isolado de Helianthus annuus que codifica o fator de transcrição HAHB-4, pertencente à família HD-Zip. O gene HAHB4 possui sua expressão induzida pelo déficit hídrico ou pelo ácido abscísico (ABA), e pode ser clonado em construções de DNA para transformar células hospedeiras e plantas. As plantas transgênicas que expressam o gene do fator de transcrição são tolerantes e resistentes ao déficit hídrico e salinidade elevada. Na presente invenção, o novo gene de café CAHB12 codifica também um fator transcricional da família HD-Zip, expresso em folhas e raízes de plantas de café da espécie Coffea arábica cultivadas em condições de déficit hídrico, apresentando níveis crescentes de expressão, de acordo com a severidade do estresse experimentado. Plantas transgênicas portando esse gene sob o controle do promotor 35S, que garante uma expressão constitutiva, i.e, em todos os órgãos em altos níveis, apresentam uma maior tolerância a diferentes condições de déficit hídrico, em diferentes estádios do desenvolvimento, assim como uma maior tolerância ao estresse salino. Os níveis de tolerância ao estresse salino de plantas portando o gene CAHB12 são ainda maiores do que aqueles observados em plantas portando o gene HAHB4, descrito na patente WO 04/099365. No presente estudo, além da taxa de germinação na presença de concentrações variadas de NaCI (100 e 150mM), foram também avaliadas medidas de peso fresco, assim como foram também monitorados os níveis de peroxidação lipídica mediado pelo déficit hídrico, através das taxas de aldeído malônico. Plantas transgênicas, expressando o gene CAHB12 apresentaram taxas de germinação de 20 a 45% superiores às de plantas não transgênicas cultivadas na presença de 150mM de NaCI. Na patente WO 04/099365, a porcentagem de plantas transgênicas e não transgênicas germinadas 46 horas após o início do experimento foi a mesma (100%). Na presente invenção, as plantas pertencentes às linhagens transgênicas expressando o gene CAHB12 apresentaram medidas de peso fresco mais elevadas do que aquelas observadas para plantas selvagens germinadas em meio de cultivo contendo 100mM de NaCI. Além disso, o nível de peroxidação lipídica permaneceu praticamente inalterada em duas, das três linhagens transgênicas testadas quando cultivadas na presença de 100mM de NaCI. Nesse contexto, a presente invenção pode ser utilizada para conferir uma maior tolerância à seca e estresse salino em plantas, obtendo-se ainda uma melhor performance em relação ao estresse salino, do que aquela observada e descrita na patente WO 04/099365.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
O objetivo da presente invenção é a utilização do gene CAHB12 de café, ou um fragmento dele originado, para a produção de plantas transgênicas de café ou espécies relacionadas, que sejam mais tolerantes ao déficit hídrico e ao estresse salino. A construção em vetor binário pB2GW7 contém a sequência de nucleotídeos que codifica para a proteína CAHB12 fusionada ao promotor 35S, e pode ser utilizada diretamente para a transformação de plantas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
O gene CAHB12 foi isolado em café, através de buscas por genes homeobox que apresentassem sua expressão modulada em condições de déficit hídrico, utilizando-se dados disponibilizados pelo projeto Genoma Café. O gene CAHB12 foi classificado como pertencente à família HD-Zipl, através de análises filogenéticas utilizando-se do método de máxima verossimilhança. A sequência correspondente ao cDNA completo do gene CAHB12 foi amplificado através de reações de PCR, e possui 693 pares de base, dando origem a uma proteína formada por 230 aminoácidos. Os domínios HD (homeodomínio) e Lz (zíper de leucina) encontram-se localizados na região próxima à porção N-terminal da proteína (Figura 1 ). A localização nuclear da proteína CAHB12 foi confirmada através de ensaios de expressão transiente, através do bombardeamento de folhas de café com partículas de ouro revestidas com uma construção plasmidial contendo a região codificadora completa para a proteína CAHB12 e GFP (green fluorescent protein), fusionadas traducionalmente, e sob o controle do promotor 35S (Figura 2).
O padrão de expressão do gene CAHB12 em folhas e raízes de café foi analisado através de reações de PCR em tempo real (RT-qPCR) em plantas de café da espécie Coffea arábica, cultivares 'Catuaí Vermelho IAC44' e 'Bourbom Amarelo IAC J10'. Em condições normais de cultivo em casa de vegetação (21± 2 °C e fotoperíodo natural) o gene CAHB12 apresentou baixos níveis de expressão, sendo induzido gradativamente em condições de déficit hídrico, em plantas apresentando medidas de potencial hídrico característico de estresse (Figuras 3 e 4). Os experimentos de estresse hídrico em casa de vegetação foram realizados utilizando-se de plantas de café com seis meses de idade, em bandejas contendo 20 plantas cada. A rega das plantas utilizadas como controle foi realizada utilizando-se 500ml_ de água por bandeja, em intervalos de um dia. O potencial hídrico (IJJw) de cada planta foi medido no período antes do amanhecer com o auxílio de uma câmara de pressão tipo Scholander. O estresse hídrico foi induzido através da interrupção da rega, por 10 dias. Amostras compostas por folhas totalmente expandidas (terceiro par) e raízes laterais foram coletadas em períodos distintos de indução (2, 5 e 10 dias). Os experimentos foram realizados em duplicata, e cada amostra foi composta por material proveniente de 5 plantas de café submetidas às mesmas condições. Em ambos os experimentos, o perfil de expressão do CAHB 12 em condições de déficit hídrico apresentou a mesma tendência de indução. Amostras de plantas cultivadas em condições controle foram coletadas nos mesmos períodos de indução de estresse para comparação.
Após 5 dias de indução, plantas do cv. 'Catuaí Vermelho' (total de 5 plantas) apresentaram uma média de IJJw igual a -1 ,05 MPa (±0,92 DP), enquanto plantas pertencentes ao cv. 'Bourbom Amarelo' apresentaram uma média de -3,4 MPa (±2, 15 DP). O mesmo pode ser observado para o período de indução de 10 dias, em que as plantas apresentaram médias de IJJw iguais a -4,45 MPa (±1 ,30 DP) e <-6,5 MPa, para os cvs. 'Catuaí Vermelho' e 'Bourbom Amarelo', respectivamente, caracterizando um déficit hídrico severo (Figura 3). No entanto, para o período de 2 dias de indução, ambos os cultivares apresentaram médias de qjw similares ao das plantas controle, que permaneceu aproximadamente igual a -0,23 MPa (±0,10 DP) para plantas do cv. 'Catuaí Vermelho', e -0,23 MPa (±0, 15) para plantas do cv. 'Bourbom Amarelo'. Embora os resultados obtidos para ambos os cultivares não possam ser diretamente comparados, nos dois casos as plantas apresentaram valores de ψνν característicos de estresse somente 5 dias após o início dos experimentos, coincidindo com a indução de expressão de CAHB12, o que demonstra a especificidade de indução desse gene em condições de seca.
A obtenção de plantas sobre-expressando o gene CAHB12 foi realizada através da clonagem do cDNA completo do gene sob o controle do promotor 35S no vetor Gateway® pB2GW7 (Karimi et al., 2002) (Figura 5). Plantas transgênicas da espécie Arabidopsis thaliana foram transformadas através do sistema de infiltração da inflorescência mediado por Agrobacterium tumefaciens (floral-dip) (Desfeux et al., 2000). Três linhagens independentes (A, B e D) de plantas transgênicas contendo o gene CAHB12 de café, segregando 3:1 , foram selecionadas em meio de cultura contendo o herbicida glifosinato sal de amónio (basta). A seleção das plantas transgênicas até a terceira geração foi realizada somente através dos ensaios de segregação. Sementes e plantas pertencentes às linhagens T3, produzidas pelas plantas T2 homozigotas, foram então utilizadas para os testes de tolerância ao estresse hídrico e salino. Estudos de expressão através de RT-PCR foram realizados com plantas homozigotas da geração T3 pertencentes às linhagens A, B e D (Figura 6A). De maneira geral, as plantas transgênicas não apresentaram nenhuma alteração fenotípica aparente. Para os ensaios realizados em placas, utilizando meio de cultura tratado com PEG 8000, as taxas de aldeído malônico (MDA) foram monitoradas com o objetivo de medir o nível de estresse sofrido pelas plantas. O MDA é um indicador do processo de peroxidação lipídica mediado por radicais livres consequentes do estresse hídrico (Hodges et al., 1999). Plântulas pertencentes às três linhagens transgênicas sobre- expressando o gene CAHB12 produziram menos MDA do que as plantas selvagens de A. thaliana quando submetidas às mesmas condições de estresse em placa (-1 ,2 MPa) (Figura 6B). Em todos o experimentos, a linhagem transgênica D foi aquela que apresentou os menores níveis de produção de MDA, cerca de 37 μιηοΙ/Kg, seguida pelas linhagens B e A, que apresentaram valores aproximados de 40 e 41 μιτιοΙ/Kg, respectivamente. As medidas observadas para a linhagem B, no entanto, foram aquelas que apresentaram uma maior flutuação, variando entre 34 e 45 mol/Kg.
Dois tipos distintos de ensaios de sobrevivência ao estresse hídrico foram realizados com plantas em solo. No primeiro experimento, plantas selvagens e transgênicas foram submetidas a um déficit hídrico severo. A taxa de sobrevivência das plantas transgênicas e selvagens foi calculada dois dias após a reidratação das bandejas. As plantas transgênicas apresentaram sempre a mesma tendência durante os ensaios, apresentando uma taxa média de sobrevivência, em torno de 29% a mais do que aquela observada para as plantas selvagens (Figura 7). No segundo tipo de ensaio de sobrevivência, foi aplicado um estresse hídrico contínuo, em que as plantas foram submetidas a uma desidratação mais lenta e gradual. Para os testes de estresse contínuo, foram utilizadas plantas no momento de transição da fase reprodutiva para a fase de frutificação. Novamente, as plantas transgênicas apresentaram uma taxa média de sobrevivência, após a reidratação, aproximadamente 87% mais elevadas do que aquela observada para plantas selvagens (Figura 8).
Ensaios de tolerância ao estresse salino foram realizados em placas contendo meio de cultura suplementado com 00 e 150 mM de NaCI (Liu et al. , 2009). As plantas transgênicas sobre-expressando o gene CAHB12 apresentaram taxas de germinação mais elevadas do que as plantas selvagens em placas contendo 100 mM e 150 mM de NaCI (Figura 9). A diferença entre as taxas de germinação de plantas selvagens e transgenicas se mostrou mais evidente nos experimentos realizados em placas contendo 150 mM de NaCI, do que nos experimentos realizados com 100 mM NaCI. Nos dois casos, porém, a linhagem D foi aquela que apresentou os menores níveis de inibição da germinação pelo estresse salino (Figura 9A).
As plantas pertencentes às três linhagens transgenicas germinadas em meio contendo 100 mM de NaCI apresentaram medidas de peso fresco mais elevadas do que aquelas observadas para plantas selvagens (Figura 9B e 10A). Estas medidas foram realizadas 15 dias após a transferência das placas para a câmara de crescimento. O peso fresco das plantas transgênicas sob condições de estresse foi ainda maior do que aquele observado para plantas da mesma linhagem, cultivadas em condições-controle. Essa diferença foi ainda mais contrastante para plantas pertencentes às linhagens B e D, que apresentaram valores em torno de 45 e 50mg para cada 10 plântulas cultivadas em meio de cultura suplementado com 100 mM de NaCI, respectivamente, contra 27mg para cada 10 plântulas cultivadas em condições controle.
As medidas de MDA para os experimentos realizados em placas contendo 100 mM de NaCI demonstram uma maior tolerância das plantas transgênicas ao estresse salino, uma vez que estas apresentaram níveis de peroxidação lípidica menores do que aqueles observados em plantas selvagens (Figura 10B). Dois experimentos independentes de estresse salino em placas contendo 100 mM de NaCI foram realizados.
De forma resumida, o gene CAHB12 é induzido especificamente em condições de déficit hídrico em folha e raízes de café indicando a sua importância na resposta a esse estresse. Sob o controle do promotor 35S, o gene CAHB12 é capaz de conferir maior tolerância ao déficit hídrico e estresse salino de plantas da espécie A. thaliana, em diferentes fases do seu desenvolvimento. A referida invenção pode ser utilizada para a produção de plantas transgênicas pertencentes a diferentes espécies de interesse comercial. Cabe ainda ressaltar que a utilização de genes da própria espécie na produção de plantas transgênicas constitui uma vantagem do ponto de vista biotecnológico.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1 - ISOLAMENTO E CLONAGEM DO CDNA COMPLETO DO GENE CAHB12 EM VETO ES BACTERIANOS Ε DE EXPRESSÃO EM PLANTAS.
A sequência completa do cDNA do gene homeobox CAHB12 foi clonada através da amplificação por PCR do cDNA sintetizado a partir do RNA de plantas de café submetidas a sete dias sem rega. Os pares de iniciadores Θννΐ Ι Ι β/ Ι Ι Ιδιηοη, descritos na Tabela 1 , foram utilizados para a amplificação do gene CAHB12. As reações de PCR foram realizadas em um total de 50μΙ_, contendo 1 μΙ_ de cDNA diluído 1 :2, MgSO4 1 mM, 0,4mM de cada dNTP, 0,1 μΜ de cada iniciador, 10μ1_ do tampão de PCR Pfx 10X concentrado, e 1 U da enzima Platinum®Pfx DNA Polymerase (Invitrogen). Cada reação foi incubada por 2 minutos a 94°C seguidos por 35 ciclos de amplificação de 15 segundos, a 94°C, 30 segundos a 55°C, e 2 minutos a 68 °C. Finalmente, uma etapa final de extensão a 68°C, por 10 minutos, foi realizada. A banda obtida apresentou o tamanho esperado de aproximadamente 693pb pára o gene CAHB12.
As reações de PCR foram purificadas utilizando-se do kit DNA Clean & Concentrator™ (Zymo Research), de acordo com as instruções do fabricante. O cDNA foi então primeiramente clonado no vetor de entrada pENTR™D-TOPO (Invitrogen), para posterior recombinação em vetores de expressão do sistema Gateway (Invitrogen). As reações de ligação foram realizadas contendo 4μΙ_ da reação de PCR purificada, 1 μΙ_ de solução salina (1.2M NaCI, 0,06M MgCI2) diluída 1 :4, e 1 μΙ_ do vetor TOPO®, em um volume final de 6pL Após 16 horas à temperatura ambiente (22-23°C), μΙ_ da reação de ligação foi utilizado para transformar células de Escherichia coli XL1-6/ue eletrocompetentes. As bactérias transformantes foram selecionadas em meio de cultura LB sólido (peptona 10g/L, extrato de levedura 5g/L, NaCI 5g/L, ágar 15g/L, pH7,0) contendo o antibiótico canamicina na concentração final de 25μg/mL. Em seguida, a confirmação dos clones positivos para o inserto CAHB12 foi realizada através de PCR de colónia, utilizando-se dos mesmos pares de iniciadores utilizados na reação de isolamento do cDNA. Dois clones contendo o gene homeobox de café foram então escolhidos para sequenciamento.
A clonagem do gene CAHB12 no vetor binário Gateway® pB2GW7 (Karimi et al., 2002) foi realizada através de recombinação. Nesse vetor, o cDNA do gene homeobox foi clonado sob o controle da região promotora 35S, através da recombinação entre as regiões attl_1/attR1 e attL2/attR2 dos vetores de entrada e de destinação, pENTR™D- TOPO/pB2GW7, respectivamente. As reações de recombinação foram realizadas nas seguintes condições: 1 μΙ_ da enzima LR Clonase™ II (Invitrogen), 150ng do vetor de entrada pENTR™D-TOPO (contendo o cDNA de cada homeobox de café), 150ng do vetor de destinação pB2GW7 e tampão TE (10mM Tris-HCI, 1 m EDTA) em um volume final de 5pL. Essa mistura foi incubada por 1 hora a 25 °C. Em seguida, 1 iL de uma solução de proteinase K 2 g/pL foi adicionado à cada reação anterior e uma nova incubação por 10 minutos a 37°C foi realizada. 2pL de reação foram então utilizados para a transformação de células de E.coli XL1-8/ue eletrocompetentes, e os clones positivos foram desta vez selecionados em meio LB sólido contendo o antibiótico espectinomicina na concentração final de 50pg/pL
Os clones positivos foram em seguida confirmados através de reações de PCR de colónia, utilizando os mesmos pares de iniciadores descritos anteriormente neste item. O DNA plasmidial destes clones foi extraído e purificado com o kit Wizarcf Plus Minipreps DNA Purification System (Promega), segundo as instruções do fabricante, e 1 μΙ_ de DNA diluído na proporção de 1 :100 foi utilizado para a transformação de células de Agrobaterium tumefasciens GV3101 eletrocompetentes. A seleção dos clones positivos foi realizada em meio LB sólido, contendo 100 g/ml_ dos antibióticos rifampicina e spectinomicina. Após a confirmação através de reações de PCR de colónia, um clone contendo o gene CAHB12 foi selecionado para a transformação de plantas de A. thaliana.
TABELA 1 - INICIADORES UTILIZADOS PARA O ISOLAMENTO E CLONAGEM DA SEQUÊNCIA COMPLETA DOS CDNAS DO GENE CAHB12
Iniciadores Sequência Orientação
GW11116 5'-caccatggaacaaacaggcta-3' Direta
11 16mon 5'-GTTCTGGAGGCATATGCACTGG-3' Reversa
EXEMPLO 2 - ANÁLISE DO PADRÃO DE EXPRESSÃO DO GENE CAHB12 EM FOLHAS E
RAÍZES DE CAFÉ SOB CONDIÇÕES DE DÉFICIT HÍDRICO
a. MATERIAL VEGETAL
Os experimentos de estresse hídrico em casa de vegetação foram realizados utilizando-se plantas com seis meses de idade, da espécie C. arábica, cvs. 'Catuaí Vermelho IAC44' e 'Bourbon Amarelo IAC J10'. As plantas foram cultivadas sob condições controladas de temperatura (21 ± 2 °C) e fotoperíodo natural, em bandejas contendo 20 plantas cada. A rega das plantas controle foi realizada utilizando-se 500 mL de água por bandeja, em intervalos de um dia. O potencial hídrico (ipw) de cada planta foi medido no período antes do amanhecer com o auxílio de uma câmara de pressão tipo Scholander. Durante os experimentos de déficit hídrico, as plantas permaneceram cobertas durante a noite, e essa proteção foi retirada somente no momento em que as medidas de IJJw foram realizadas, para evitar a interferência da taxa de transpiração nos valores obtidos. O estresse hídrico foi induzido através da interrupção da rega, por 10 dias. Amostras compostas por folhas totalmente expandidas (terceiro par) e raízes laterais foram coletadas em períodos distintos de indução (2,5 e 10 dias). Os experimentos foram realizados em duplicata, e cada amostra foi composta por material proveniente de 5 plantas de café submetidas às mesmas condições. Amostras de plantas cultivadas em condições controle foram coletadas nos mesmos períodos de indução de estresse para comparação. Todas as amostras coletadas foram imediatamente congeladas em nitrogénio líquido e mantidas a -80 °C até o momento da extração de RNA.
b. EXTRAÇÃO DE RNA E SÍNTESE DE CDNA
Amostras compostas por folhas e raízes de café foram pulverizadas em nitrogénio líquido, com o auxílio de pistilo e gral, até obter-se um pó fino. Aproximadamente 100mg de amostra pulverizada foram ressuspensas em 500μΙ_ do reagente Concert™ Plant RNA Reagent (Invitrogen) refrigerado (4°C), de acordo com as instruções do fabricante. Após 5 minutos à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas por 2 minutos, a 12000xg. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo, e 100μΙ_ de uma solução de cloreto de sódio (NaCI) 5M e 300μΙ_ de clorofórmio foram adicionados às amostras e misturados por inversão. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 4°C, por 10 minutos, a 12000xg. A fase aquosa foi recuperada, e o RNA total foi precipitado com um volume igual de isopropanol, por 10 minutos, à temperatura ambiente, seguidos de uma etapa de centrifugação a 4°C, por 10 minutos, a 12000xg. O precipitado foi lavado com uma solução de etanol (EtOH) 75%, seco a temperatura ambiente, e dissolvido em 30 μΙ_ de água destilada estéril.
Para evitar qualquer contaminação com DNA genômico, as amostras de RNA foram tratadas com DNAsel (Invitrogen) a 37°C por 15 minutos, seguidas por duas extrações com uma solução de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24: 1 ), e precipitadas com acetato de sódio (NaOAc) 3M, e EtOH 100%. A concentração e pureza do RNA foram determinadas antes e depois do tratamento com DNasel com o auxílio do espectrofotômetro NanoDrop™ ND-1000 (Thermo Scientific). A integridade do RNA foi verificada em gel de agarose 1 %.
A síntese de cDNA foi realizada através da adição de 50μΜ de iniciadores Oligo (dT24), e 10mM de cada desoxirribonucleotídeo 5' - trifosfato (dNTP) a 1 pg de RNA total. A mistura foi incubada a 65°C por 5 minutos, e resfriada brevemente em gelo. 2 μΙ_ de tampão First Strand Buffer 0X, 20mM de dithio-threitol (DTT), e 200 unidades da enzima Superscript III (Invitrogen) foram adicionados à mistura anterior até um volume final de 20 pL Após 1 hora a 50°C, a ação da enzima foi termo-inativada a 70°C por 15 minutos,
c. REAÇÃO DE RT-QPCR
Os pares de iniciadores para amplificação do gene CAHB12 foram desenhados com o auxílio do programa Primer3 (Rozen & Skaletsky, 2000), utilizando-se como critério a amplificação de produtos de tamanho entre 80-100 nucleotídeos, e temperatura de anelamento de aproximadamente 60°C (Tabela 2). Análises da curva de dissociação dos produtos amplificados, e corridas em gel de agarose 1 % foram realizadas para a confirmação da amplificação de um produto único de PCR. Para a normalização da expressão do gene CAHB12 foram utilizados como genes de referência os genes UBI9 (ubiquitina-/// ej, S24 (proteína ribossomal S24) e GAPDH (gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase C-2).
As reações em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR) foram realizadas em placas óticas com 96 poços, no termociclador Chromo 4 Real-time PCR Detector (BioRad), utilizando-se do fluoróforo SYBR®Green para monitorar a síntese de dupla fitas de DNA. 0.2μΜ de cada iniciador, 50μΜ de cada dNTP, 2μΙ_ do tampão de PCR Taq 10X concentrado (Invitrogen), MgCI2 3mM, 1 μΙ_ de SYBR®Green I (Molecular Probes) diluído em água (1 : 10.000), e 0.25 unidades da enzima Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen) foram adicionados a 10μΙ_ de cDNA diluído 1 :50, em um volume final de 20μΙ_. A reações foram incubadas por 5 minutos a 94°C, seguidos por 40 ciclos de amplificação de 15 segundos a 94°C, 10 segundos a 60°C, e 15 segundos a 72°C.
Os valores de ciclo de corte (cyc/e threshold - Ct) foram convertidos no programa qBase v1 .3.5 (Hellemans et ai, 2007) em quantidades relativas normalizadas (NRQ), através da fórmula NRQ=2"A(ACT), em que 2 corresponde à eficiência de amplificação igual a 100%, ACt é a diferença entre o Ct da amostra com menor expressão no experimento e o Ct da amostra em questão, e AACt corresponde a diferença entre o ACt da amostra em condição estressada, menos o ACt da amostra em condição controle. O fator de normalização (FN) calculado a partir da expressão dos três genes de referência (UBI9, S24 e GAPDH) foi utilizado para a normalização dos dados. TABELA 2 - PARES DE INICIADORES UTILIZADOS PARA A AMPLIFICAÇÃO DO GENE
CAHB12, UBI9, S24 E GAPDH DE CAFÉ.
Gene Par de iniciadores (direta/reversa)
5'-TGTTTAATCGGGAGGCAAAG-37
CAHB12 5'-GCCCTTTTGTTCTGAAACCA-3'
5'-AAGAAGGAATTCCCCCTGTG-37
UBI9 5'-ACCTCCACCTCTCAGAGCAA-3'
5'-AGGCTGTTGGGAAAGTTCTTC-37
S24 5'-ACTGTTGGAACTCGGAATGC-3'
5'- CCGAATGCCATTTTTGTCTT-37
GAPDH 5'-TCCAAACCCAGTTGACTTGC-3'
EXEMPLO 3 - PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS SOBRE-EXPRESSANDO O GENE CAHB12
a. TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS E SELEÇÃO DAS LINHAGENS TRANSGÊNICAS
A obtenção de plantas superexpressando os genes CAHB1 e CAHB12 foi realizada através do sistema de infiltração da inflorescência mediado por Agrobacterium tumefaciens (floral-dip) (Desfeux et ai, 2000). Para isso, uma colónia isolada de A. tumefasciens GV3101, contendo o gene CAHB12 sob o controle do promotor 35S (vetor pB2GW7), foi crescida por 48 horas a 28°C sob agitação de aproximadamente 200rpm, em 2mL de meio LB líquido (peptona 10g/L, extrato de levedura 5g/L, NaCI 5g/L, pH7,0), contendo 100 g/mL do antibiótico rifampicina e 25 g/mL do antibiótico canamicina, ou 100 g/ml_ do antibiótico espectinomicina, dependendo da construção a ser transformada. Essa cultura foi utilizada para inocular 200mL de meio LB líquido, contendo os mesmo antibióticos presentes na cultura anterior. Após 16 horas de crescimento a 28°C sob agitação, a cultura foi centrifugada por 15minutos a 4000rpm. O sobrenadante foi descartado, e as células foram ressuspensas em 200mL de uma solução contendo 5% de sacarose e 0,01 % do surfactante Silwet L-77. As flores de plantas adultas da espécie A. thaliana ecotipo Columbia (Col-0), foram imersas nessa solução agitando-se levemente. Após 1 minuto, as plantas foram colocadas na posição horizontal em uma bandeja, e cobertas por um filme plástico com o objetivo de manter a umidade. No dia seguinte, o filme plástico foi retirado, e as plantas foram colocadas na posição vertical novamente. Cerca de 12 plantas foram transformadas para cada construção.
As sementes produzidas pelas plantas transformadas foram esterilizadas em uma solução de EtOH 70% e TWEEN 20 0,05% por 10 minutos, e semeadas em meio MS sólido (sais MS 4,6g/L, sacarose 20g/L, glicina 2mg/L; ácido nicotínico 5mg/L, piridoxina-HCI 0,5 mg/L, tiamina-HCI 0, 1 mg/L, ágar 8g/L, pH5,8) (Murashige & Skoog, 1962) contendo o herbicida glufosinato sal de amónio (basta) na concentração final de 10 g/mL. As linhagens transgênicas resistentes foram transferidas para potes contendo o substrato comercial Plantmax® em uma proporção de 3: 1 (substrato: vermiculita), e dessa forma cultivadas sob condições de luz (fotoperíodo de 18 horas de luz/6 horas de escuro) e temperatura (22 °C, ±2 °C) controlada. As sementes da geração TO de plantas contendo o gene CAHB12 no vetor pB2GW7 foram submetidas novamente à seleção com basta, com o objetivo de identificar aquelas linhagens apresentando uma segregação de 3: 1 entre plantas resistentes e sensíveis, indicando a presença de apenas uma inserção de T-DNA. 15-25 plantas resistentes da geração T1 de cada linhagem independente previamente selecionada foram transferidas para potes contendo substrato, e um novo teste de segregação foi realizado com as sementes produzidas por essas plantas, com o objetivo de identificar as linhagens T2 heterozigotas e homozigotas. As plantas T2 cultivadas em placas apresentando aproximadamente 100% de resistência ao herbicida ou antibiótico utilizado foram transferidas para potes contendo substrato, segundo as condições mencionadas anteriormente, e as sementes T3 produzidas foram então utilizadas para os testes posteriores de tolerância. Para cada teste de segregação foram utilizadas de 50 a 150 sementes.
b. CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS LINHAGENS SOBRE-EXPRESSADO O GENE CAHB12
Aproximadamente 100mg de material vegetal de plantas homozigotas pertencentes à geração T3 das linhagens transgênicas nomeadas de A, B e D foram coletados em nitrogénio líquido e utilizados para o isolamento de RNA segundo o protocolo descrito por Tai e colaboradores, com algumas modificações (Tai et al. , 2004). O material vegetal foi pulverizado com o auxílio de microesferas de metal e agitador do tipo vortex, e ressuspensos em 500pL do tampão de extração [uréia 6M, LiCI 3M, 0.01 M Tris-HCI (pH8,0), 20mM EDTA (pH8,0)]. As amostras foram misturadas por inversão, e 500μΙ_ de uma solução contendo fenol:clorofórmio:álcool isoamílico, na proporção 25:24:1 foram adicionados ao tubo. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 12000xg, por 5 minutos, a 4°C. O sobrenadante foi transferido para um novo microtubo, e uma nova extração com um volume da solução fenol:clorofórmio:álcool isoamílico foi realizada. Ao sobrenadante recuperado, após centrifugação como na etapa anterior, foi adicionado um volume da solução contendo clorofórmio: álcool isoamílico (24: 1 ). As amostras foram centrifugadas por 5 minutos, a 12000xg (4°C), e o RNA foi precipitado com a adição de 1/10 do volume de NaOAc 3M (pH5,2) e 1 volume de isopropanol ao sobrenadante. Os tubos foram mantidos no gelo por 5 minutos, seguidos por uma etapa de centrifugação a 12000xg, por 10 minutos a 4°C. O precipitado foi então lavado duas vezes com EtOH 70%, e finalmente ressuspenso em 25μ!_ de água Milli-Q® estéril. A integridade do RNA foi verificada em gel de agarose 1 %.
A síntese de cDNA foi realizada conforme descrito anteriormente no item 3.4.2 desta seção. As reações de PCR foram realizadas com os iniciadores GW1 1 1 16 e 1 1 16mon (Tabela 1 ) de acordo com as seguintes condições: 1 μΙ_ de cDNA, 2,5μΙ_ do tampão de PCR 10X concentrado, MgCb 2mM, 0,2μΜ de cada iniciador, 0,8mM de cada dNTP, e 1 U da enzima Taq DNA Polymerase (Invitrogen), em um total de 25μΙ_. Cada reação foi incubada por 3 minutos a 94°C, seguidos por 25 ciclos de amplificação de 25 segundos a 94°C, 25 segundos a 59°C, e 55 segundos a 72°C. Finalmente, uma etapa final de extensão a 72°C por 10 minutos foi realizada.
A expressão do gene Actinall foi utilizada como controle interno. Para essas reações de amplificação, foram utilizados os iniciadores Ath_Actinll (5'-GGAATCCACGAGACAACCTATAAC-3') na orientação direta, e Ath_Actinll (5'-AGGAATCGTTCACAGAAAATGTTTC-3') na orientação reversa, contendo as mesmas concentrações de reagentes e cDNA descritos no parágrafo anterior. Cada reação foi incubada por 3 minutos a 94°C, seguidos por 25 ciclos de amplificação de 30 segundos a 94°C, 45 segundos a 62°C, e 45 segundos a 72°C. Finalmente, uma etapa final de extensão a 72°C por 10 minutos foi realizada. Os produtos de PCR foram verificados em géis de agarose 1 %. EXEMPLO 4 - ENSAIOS DE TOLERÂNCIA AO ESTRESSE HÍDRICO COM PLANTAS TRANSGÊNICAS SOBRE-EXPRESSANDO O GENE CAHB12
a. ENSAIOS DE TOLERÂNCIA AO ESTRESSE HÍDRICO EM PLACAS TRATADAS COM PEG 8000
Os ensaios de tolerância ao estresse hídrico em placas tratadas com polietilenoglicol (PEG) 8000 foram realizados de acordo com o protocolo descrito por van der Weele e colaboradores (van der Weele et al. , 2000), com algumas modificações (Verslues & Bray, 2004). Sementes de plantas de A. thaliana pertencentes às linhagens transgênicas e selvagens foram semeadas em meio de cultura MS contendo metade da concentração de sais, sem sacarose, e suplementado com tampão MES 6mM (sais MS 2,3g/L, glicina 2mg/L; ácido nicotínico 5mg/L, piridoxina-HCI 0,5 mg/L, tiamina-HCI 0, 1 mg/L, ágar 8g/L, pH5,7). 20 dias após a germinação, as plântulas foram transferidas para placas de Petri de tamanho regular (100mm de diâmetro x 20mm de altura), contendo 20mL do meio de cultura MS modificado conforme descrito anteriormente, tratadas previamente com uma solução de PEG8000 (sais MS 2,3g/L, glicina 2mg/L; ácido nicotínico 5mg/L, piridoxina-HCI 0,5 mg/L, tiamina- HCI 0, 1 mg/L, tampão MES 6mM, PEG8000 550g/L, pH5,7). Estas placas foram cobertas com 30mL da solução de PEG, com o objetivo de reduzir o potencial hídrico do meio de cultura para -1 ,2MPa. Após 16 horas de infusão, a solução de PEG foi totalmente retirada com o auxílio de uma pipeta estéril, e 30 plântulas de cada linhagem transgênica e selvagem foram transferidas para o meio tratado.
O material vegetal foi coletado 7 dias após a transferência para o meio tratado com PEG. Foram realizadas ao todo duas réplicas biológicas para cada linhagem transgênica. Em cada experimento, foram coletados dois conjuntos individuais de plântulas, contendo 15 indivíduos cada um. A quantidade de aldeído malônico (MDA) produzido foi posteriormente monitorada, na tentativa de medir o nível de peroxidação lipídica das plantas sob estresse. Para evitar o efeito da transferência de placas nas medidas de MDA, plântulas transferidas para placas contendo meio de cultura não tratado com PEG foram utilizadas como controle. O material coletado foi congelado em nitrogénio líquido e mantido a -80°C até o momento da quantificação de MDA. b. QUANTIFICAÇÃO DE ALDEÍDO MALÔNICO (MDA)
Para a quantificação da produção de MDA, o material previamente congelado foi primeiramente pulverizado em nitrogénio líquido, com o auxílio de microesferas de metal e agitador do tipo vortex. Em seguida, foram adicionados 700μΙ_ de ácido tricloroacético (TCA) 0.1 %, previamente refrigerado. A extração com TCA 0, 1 % foi repetida mais uma vez, e as amostras foram centrifugadas a 12000xc/ por 10 minutos, a 4°C. O sobrenadante foi então dividido em dois tubos (600μΙ_ em cada). O primeiro tubo continha 600μΙ_ de solução composta por TCA 20% e hidroxitolueno butilado (BHT) 0,01 %. O segundo tubo continha o mesmo volume (600μΙ_) de uma solução composta por TCA 20%, BHT 0,01 % e ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,65%. As amostras foram misturadas, e os tubos incubados a 95 °C por 30 minutos. Após esse período, as amostras foram centrifugadas a 12000xg, por 5 minutos a 4°C. Os valores de absorbância (Abs) dos tubos contendo a solução TCA 20% e BHT 0,01% foram lidos no espectrofotômetro para os comprimentos de onda 532 e 600nm, enquanto os valores de absorbância para os tubos contendo TCA 20%, BHT 0,01 % e TBA 0,65%, foram lidos nos comprimentos de ondas de 440, 532 e 600nm. A solução de TCA 0,1 % foi utilizada para calibrar as leituras do aparelho.
Os valores de MDA/mL de tecido processado foram estimados através da seguinte fórmula (Hodges et ai., 1999): MDA mol/L) = [(A-B)/157000] x 106,
onde A=[Abs532+TBA - Abs600+TBA) - (Abs532.TBA - Abs600.TBA)l
e B = [Abs440+TBA - Abs600+TBA) x 0,0571].
Esses valores foram então transformados em nmol/g através da fórmula: MDA (μηιοΙ/L) x volume total da extração ( igual a 1,4mL)/peso fresco em Kg.
C. EnSAIOS DE SOBREVIVÊNCIA EM SOLO - ESTRESSE HÍDRICO SEVERO
Os ensaios de tolerância ao estresse hídrico em potes contento substrato foram realizados em câmaras de crescimento sob condições de luz (fotoperíodo de 18 horas de luz/6 horas de escuro) e temperatura (22°C, ±2°C) controlada, com uma unidade relativa de aproximadamente 50%. Sementes de plantas de A. thaliana pertencentes às linhagens transgênicas sobre- expressando o gene CAHB12 e selvagens foram semeadas diretamente em potes do mesmo tamanho (8 x 7cm), dispostos em bandejas, contendo aproximadamente a mesma quantidade de substrato (100g) cada (Dezar et ai , 2005). As bandejas foram, em um primeiro momento, irrigadas à saturação (aproximadamente 2L de água), por 3 horas e, após esse período, o excesso de água foi retirado. Em cada pote, foram semeadas quatro sementes do mesmo genótipo. As bandejas foram então cobertas por um filme plástico, até o momento do surgimento do primeiro par de folhas verdadeiras, sendo retirado em seguida. A partir desse momento, as bandejas não foram mais regadas até a observação do sintoma de murcha constante das plantas selvagens, quando então se procedeu a reidratação das bandejas. O número de sobreviventes ao ensaio foi verificado dois dias após a reidratação. Todos os experimentos foram realizados em duplicata, sendo analisadas ao todo, um total de 98 plantas do genótipo selvagem, 64 plantas da linhagem transgênica A, 32 plantas da linhagem transgênica B, e 64 plantas da linhagem transgênica D. d. ENSAIOS DE SOBREVIVÊNCIA EM SOLO - ESTRESSE HÍDRICO CONTÍNUO
Estes ensaios foram realizados nas mesmas condições do item 3.9.3, porém com algumas modificações. Após a retirada do filme plástico, as bandejas foram regadas normalmente por 30 dias. A partir deste momento, 1 mL de água foi adicionado por dia a cada pote, até a observação do sintoma de murcha constante das plantas selvagens, quando então as bandejas foram reidratadas. O número de plantas sobreviventes foi contabilizado 2 dias após a reidratação. Neste ensaio, as plantas se encontravam em um período mais tardio do desenvolvimento, já no estádio de frutificação. Os ensaios foram realizados em duplicata e um número total de 64 plantas selvagens e 56 plantas de cada linhagem transgênica foram analisados.
EXEMPLO 5 - ENSAIOS DE TOLERÂNCIA AO ESTRESSE SALINO COM PLANTAS TRANSGÊNICAS SOBRE-EXPRESSANDO O GENE CAHB12
Os experimentos de tolerância ao estresse salino foram realizados em placas contendo meio de cultura MS sólido, suplementado com 100 e 150mM de NaCI (Liu et ai , 2009). Sementes de plantas transgênicas e selvagens foram semeadas em condições assépticas, e mantidas a 4°C durante quatro dias. Após esse período, as placas foram transferidas para a câmara de crescimento, onde foram mantidas em condições de luz (18 horas de luz/6 horas de escuro) e temperatura controladas (22°C, ±2°C). As taxas de germinação foram medidas sete dias após a transferência das placas para a câmara de crescimento. Foram considerados como positivos para a germinação somente aqueles indivíduos que apresentaram a raiz totalmente inserida no meio de cultura no momento das análises. Para os experimentos realizados na presença de 100mM de NaCI, foram analisadas quatro placas contendo 50 sementes cada, enquanto somente duas placas contendo 50 sementes foram analisadas para os experimentos realizados na presença de 150mM de NaCI.
Medidas de MDA foram realizadas com plântulas germinadas em meio contendo 100mM de NaCI, 15 dias após a transferência das placas para a câmara de crescimento. Este experimento foi realizado em duplicata, e, para cada um, três conjuntos de 10 plântulas foram coletados. Estas amostras foram imediatamente pesadas e congeladas em nitrogénio líquido. Como controle foram utilizadas amostras de plantas cultivadas em meio MS sem a adição de NaCI.
As sequências ID 1 e ID2 representam o gene CAHB12. (A)
Sequência de nucleotídeos codificadora da proteína CAHB 2. (B) Sequência de aminoácidos da proteína CAHB12. A posição do homeodomínio está indicada pela barra negra horizontal acima da sequência. A posição do zíper de leucina está indicada pela barra horizontal pontilhada.
Abaixo segue a descrição de cada Figura:
FIGURA 1 - Endereçamento nuclear da proteína CAHB12. Folhas de café da espécie C. arábica foram bombardeadas com as seguintes construções: proteína GFP sob o controle do promotor 35S (A.B.C) e cDNA completo do gene CAHB12 fusionado à proteína GFP sob o controle do promotor 35S (D,E,F). A expressão transiente foi observada 24h após o bombardeamento em microscópio confocal, utilizando-se os filtros de fluorescência vermelho (A e D), verde (B e E), e vermelho e verde (C e F). Barras - 10pm.
FIGURA 2 - Padrão de expressão do gene CAHB12 em raízes laterais de plantas da espécie C.arabica, cultivares Catuaí Vermelho (A) e Bourbom Amarelo (B). Os valores de expressão relativa estão indicados no eixo y. Foram coletadas amostras em diferentes tempos de indução: 2 dias ( 2d), 5 dias (5 d) e 10 dias (10 d). Amostras de plantas mantidas sob condições controle (Ctlr) foram coletadas em cada tempo experimental para comparação. Abaixo dos gráficos de expressão estão indicadas as médias de i|jw observadas no momento da coleta do material. Barra de erros = 2EPM (n = 3).
FIGURA 3 - Padrão de expressão do gene CAHB12 em folhas de plantas da espécie C.arabica, cultivar 'Catuaí Vermelho'. Os valores de expressão relativa estão indicados no eixo y. Foram coletadas amostras em diferentes tempos de indução: 2dias (2d), 5 dias (5d) e 10 dias (10d). Amostras de plantas mantidas sob condições controle (Ctlr) foram coletadas em cada tempo experimental para comparação. Abaixo dos gráficos de expressão estão indicadas as médias de ψνν observadas no momento da coleta do material. Barra de erros = 2EPM (n=3).
FIGURA 4 - Esquema do vetor de destinação pB2GW7 (Karimi et aí., 2002). As setas rosas indicam a localização dos genes de resistência para o herbicida glufosinato sal de amónio (Bar) e, os antibióticos, estreptomicina (Sm) e espectinomicina (Sp). A posição do promotor e terminador 35S são indicadas pela seta e pela caixa verdes, respectivamente. A região ccdB é indicada pela caixa azul clara, entre as duas regiões de recombinação attR1 e attR2. As caixas vermelhas indicam o T-DNA, flanqueado pelas regiões right border (RB) e left border (LB).
FIGURA 5 - (A) Detecção de transcritos, através de RT-PCR, para o gene CAHB12 em plantas homozigotas da terceira geração das linhagens transgênicas A, B e D. O nível de expressão do gene Actinall (ACTII) foi utilizado como controle interno (indicados na parte inferior da figura). (B) Medidas de aldeído malônico (MDA) após 7 dias em meio de cultura tratado com PEG8000 (-1 ,2MPa). As barras de erro correspondem ao erro padrão (EP) obtido a partir de duas repetições contendo 15 plântulas cada. NT - Não transgênica. FIGURA 6 - Ensaio de sobrevivência ao déficit hídrico severo. Plantas transgênicas superexpressando o gene CAHB12 e selvagens foram submetidas a condições de estresse hídrico severo, e reidratadas após a observação de sintomas de murcha permanente. No painel superior, a imagem mostra plantas 2 dias após a reidratação. O quadro no painel inferior indica em porcentagem (total = 16 plantas) a taxa de sobrevivência das plantas após reidratação. NT - Não transgênica.
Figura 7 - Ensaio de sobrevivência ao estresse hídrico contínuo. No painel superior, a imagem mostra plantas 2 dias após a reidratação. O quadro no painel inferior indica em porcentagem (total = 16 plantas) a taxa de sobrevivência das plantas selvagens e transgênicas superexpressando o gene CAHB12 após reidratação. NT - Não transgênica.
Figure imgf000028_0001
FIGURA 8 - Caracterização de plantas transgênicas sobre-expressando o gene CAHB12 em ensaios de estresse salino. (A) Taxas de germinação sete dias após a transferência das placas para a câmara de crescimento. As barras de erro correspondem ao desvio padrão (DP) calculado para quatro placas, contendo 50 plantas cada, para os experimentos realizados em meio de cultura contendo 100mM de NaCI, e duas placas, contendo 50 sementes cada, para os experimentos realizados com 150mM de NaCI. (B) Peso fresco observado nos experimentos com 100mM de NaCI. Cada medida foi realizada para um conjunto de 10 plântulas, 15 dias após a transferência das placas para a câmara de crescimento. As barras de erro correspondem ao DP observado para um total de seis medidas. NT - Não transgênica.
Figure imgf000029_0001
FIGURA 9 - Tolerância ao estresse salino em plantas sobre-expressando o gene CAHB12. (A) Efeito do tratamento salino em plantas selvagens e transgênicas em meio de cultura contendo 100mM de NaCI, 15 dias após a transferência para a câmara de crescimento. (B) Medidas de MDA realizadas em plantas germinadas em meio de cultura contendo 100mM de NaCI, 15 dias após a transferência para a câmara de crescimento. As barras de erro correspondem ao EP calculado a partir de 6 réplicas, contendo 10 plântulas cada. NT - Não transgênica.

Claims

REIVINDICAÇÕES
UTILIZAÇÃO DO GENE HOMEOBOX DE CAFÉ CAHB12 NA PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS MAIS TOLERANTES AO DÉFICIT HÍDRICO E ESTRESSE SALINO
1 - Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada pelo fato de codificar o fator transcricional CAHB12.
2- Molécula de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada pelo fato de ser uma molécula de RNA mensageiro.
3- Molécula de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada pelo fato de ser uma molécula de cDNA do grupo que compreende as sequências ID 1 e ID2.
4- Molécula de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada pelo fato de ter sido isolada da espécie Coffea arábica.
5- Vetor compreendendo a molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de ser fusionada à um promotor operacional 35S capaz de induzir a expressão de tal molécula.
6- Vetor de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de conferir uma maior tolerância de células hospedeiras ao estresse hídrico e salino, quando comparadas com células não contendo o referido vetor.
7- Planta transgênica, caracterizada pelo fato de ser estavelmente transformada com a molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 3.
8- Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de apresentar níveis elevados de tolerância ao estresse hídrico e salino, quando comparada à plantas selvagens não transgênicas. 9- Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de ser uma monocotiledônea.
10- Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de ser uma dicotiledônea.
11- Semente de plantas, caracterizadas pelo fato de ser estavelmente transformadas com a molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 3.
12- Célula hospedeira caracterizada pelo fato de ser estavelmente transformada com a molécula de ácido nucléico, conforme reivindicação 3.
13- Célula, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de ser uma célula bacteriana, fúngica, vegetal ou animal.
14- Método para produção de plantas transgênicas mais tolerantes ao estresse, hídrico e salino, caracterizado pelo fato de sofrer transformação estável de células vegetais com a molécula de ácido nucléico, cuja sequência se encontra demonstrada na Figura 1 , dando origem às plantas transgênicas regeneradas.
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