WO2012059617A1 - Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico del cáncer de páncreas y para evaluar la respuesta al tratamiento - Google Patents

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico del cáncer de páncreas y para evaluar la respuesta al tratamiento Download PDF

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Trinidad Villegas Herrera
Carmen OLMEDO MARTÍN
Karim Muffak-Granero
Ana Comino Pardo
Antonio Becerra Massare
Daniel Garrote Lara
Pablo BUENO LARAÑO
Jose Antonio FERRÓN ORIHUELA
Carlos CANO GUTIÉRREZ
Armando BLANCO MORÓN
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Universidad de Granada
Servicio Andaluz de Salud
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention is within medicine and molecular biology, and refers to a method of obtaining useful data for the diagnosis at an early stage of pancreatic adenocarcinoma, as well as for evaluating the response to the treatment of said disease, which It allows the establishment of a specific individual (qualitative and quantitative) recognition pattern, which is different depending on the disease status and is modified post-treatment, allowing the establishment of groups of patients, as well as early diagnosis.
  • Pancreatic cancer is among the top five causes of cancer death in the developed world with a survival rate of 19% at 1 year. 95% of malignant tumors of the pancreas are infiltrating ductal adenocarcinoma. In most cases it is diagnosed in a very advanced state and even patients with localized resectable tumors have metastases. Tumors that surround or compress large arterial structures such as the branches of the celiac trunk or the superior mesenteric artery are considered unresectable. Surgical intervention remains the central treatment, although it must be complemented with other options to increase survival time. In this sense, chemotherapy and radiation treatment are used either in combination with surgery, or as a definitive treatment in cases of advanced, unresectable tumors (Yeo et al.
  • the molecular level knowledge of the signaling pathways involved in cell transformation has allowed the development of new cancer treatments.
  • Deregulation of signaling through the EGFR epidermal growth factor receptor is involved in the carcinogenesis process.
  • Various types of cancer tend to express high levels of EGFR and their activation initiates a signaling cascade whose components are potential new targets for cancer treatment.
  • Molecules such as erlotinib, a tyrosine kinase inhibitor at the intracellular level, act by preventing the autophosphorylation of the EGFR receptor and subsequent signal transduction.
  • EGFR inhibitors appear to show maximum activity in lung cancer patients with activating mutations in the cytoplasmic domain. This suggests that patients in whom the tumors present certain mutations of this receptor, would benefit from a better clinical outcome. This fact would indicate that the study of the presence of these mutations in patients could be used as a guideline for the application of therapy for those who responded better to EGFR inhibitors (3-5). However, this is not entirely true, since not all patients with detected mutations respond to treatment, while patients without such mutations are responders. In addition to EGFR, other molecules seem to have a role in the onset and progression of cancer.
  • cancer-associated proteins such as HER2
  • results indicate the value of using analytics that allow the detection in the blood of cancer patients or circulating cancer cells or the molecules they can produce, and that are involved in the carcinogenic process. This procedure is less invasive to monitor both the evolution of the disease and the response to therapy or surgery. In this way, these target molecules can help characterize the biology of the tumorigenesis, the progression of the disease and can also identify biomarkers to monitor the treatment of cancer patients.
  • One way to detect these molecules is to use specific antibodies, to detect their presence in the serum of cancer patients, so in patients with bladder cancer, the presence of p33ING1 and cyclin D2 has been associated with loss of cycle regulation. mobile; angiostatin and epidermal growth factor with antiangiogenic response; osteopontin and CXCR4 with metastatic risk.
  • the serum protein profile that can be detected using antibodies may be characteristic of the disease (Orchekowski et al., 2005. Cancer Res 65: 1 1 193-202).
  • Neovascularization et al., 2006. J Mol Diagn. 8:51-61; Golub et al. , 1999. Science 286: 531-537; Smirnov et al., 2005. Cancer Researc. 65: 4993-4997).
  • pancreatic cancer in a study on the expression of prostate stem cell antigen (PSCA) mRNA was detected by RT-PCR in the blood of 7 of 1 1 patients with pancreatic cancer (63.6%) , and was not observed in the blood of healthy individuals.
  • PSCA prostate stem cell antigen
  • the viability of measuring in peripheral blood molecules that allow to know the evolution of pancreatic cancer was the demonstration that the levels of mRNA transcripts of the tumor necrosis factor alpha (TN F- ⁇ ) in peripheral blood were elevated in the 10 Patients with pancreatic cancer studied compared to 9 healthy controls (p ⁇ 0.05) measured by Q-RT-PCR and TNF- ⁇ mRNA transcripts were reduced to a level similar to the controls after tumor excision.
  • TN F- ⁇ tumor necrosis factor alpha
  • This biotinylated cRNA is fragmented and hybridized specifically with the panel of cDNA or synthetic oligonucleotide probes present in the microarray under specific conditions, the one that has not hybridized is eliminated and the amount of biotinylated cRNA for each gene is placed manifestly by adding a fluorophore that is usually Cy5 bound to streptavidin. Fluorescence is detected with a scanner, which converts it into numerical data and a database is created in which we can have fluorescence intensity values directly related to the expression level of each particular gene. This allows to visualize the interactions of thousands of genes simultaneously.
  • gene expression profiles based on microarrays have been used for the diagnosis of various diseases including cancer, although studies have been limited to certain types of this disease, which has allowed classifying the different types of cancer in clinically relevant subgroups, in a more precise manner and before severe clinical manifestations appear, thereby increasing the possibility of a better early diagnosis, better monitoring of clinical evolution and the response to different treatments with regarding conventional methods or in conjunction with them.
  • the gene expression profile it is possible to predict the response to chemotherapy or agents directed against cancer molecular targets (Burczynski et al., 2006. J Mol Diagn. 8:51-61; Golub et al., 1999. Science 286: 531-537; Smirnov et al., 2005.
  • the molecular profile can be used as an additional tool within of clinical examinations to determine the sensitivity to a particular treatment, and thus reduce unnecessary treatments.
  • Peripheral blood is a type of tissue essential for clinical research due to its critical role in the immune and metabolic response, and its easy collection, which is essential for the discovery of biological markers of disease.
  • the application of peripheral blood microarray technology can provide new insights into the variations in global genetic expression specifically associated with the disease (Burczynski et al., 2005. Clin Cancer Res 1 1: 1 181-9; Feezor et al., 2004. Physiol. Genomics 19: 247-254; Samuel et al., 2003. ASCO Molecular Therapeutics Symposium Nov 2002 San Diego. BMC Cancer 3: 3; Jazaeri et al., 2005. Cancer Clin Res. 1 1: 6300-10; McPhail et al., 2005. 10: 1485-1487).
  • RNA collection are suitable for studies that require many samples, monitoring over time or multicentre. It has been shown that the globin mRNA reduction method manages to increase the data quality of the stabilized RNA samples with less intragroup variation and a detection rate of expressed genes similar to that of blood mononuclear cells.
  • the use of peripheral blood allows an increase in the identification of biomarkers based on the RNA expression profile and can help in what is already known as pharmacogenomics.
  • peripheral blood mononuclear cells for transcriptome analysis has proven its value in assessing the genetic signature associated with the disease and related to drug response.
  • the availability of DNA microarrays is accelerating the discovery of cancer targets (Andrea et al., 2006. Nature 439: 353-357).
  • RT-PCR has been used to detect mRNA transcripts of breast cancer or associated with epithelium such as cytokeratins, EGFR, mamoglobulin, MUC-1, beta-HCG, c-Met, GalNac-T, MAGE-3.
  • pancreatic cancer protein microarrays have been studied for the detection of serum markers (Orchekowski et al., 2005. 65: 1 1 193-202), as well as 158 expressed genes have been identified by means of cDNA microarrays. in the neoplastic epithelium with greater expression (greater than double, p ⁇ 0.01) in 10 pancreatic cancers compared with 10 samples of non-tumor pancreas (Logsdon et al., 2003. Cancer Res 63: 2649-57).
  • the present invention provides a method of obtaining useful data for the early diagnosis of pancreatic cancer, as well as for evaluating the response to the treatment of said disease, allowing the establishment of groups of patients.
  • a first aspect of the invention relates to the use of one of the genes selected from the list comprising HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and FKBP1B, or any combination thereof, to obtain useful data in the diagnosis, prognosis, or monitoring of pancreatic cancer.
  • the genes are used simultaneously.
  • Another aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data for the diagnosis, prognosis and monitoring of pancreatic cancer, hereinafter the first method of the invention, comprising:
  • the first method of the invention further comprises:
  • step (b) compare the quantities obtained in step (b) with a reference quantity.
  • the isolated biological sample of an individual from step (a) is obtained from peripheral blood, and / or comprises peripheral blood cells (PBCs).
  • PBCs peripheral blood cells
  • the first method of the invention further comprises assigning the individual according to step (a) to the group of individuals to whom a peripheral blood sample has been taken seven days after a surgical intervention for pancreatic cancer, when it presents an amount of expression product of the HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and FKBP1B genes, or any combination thereof, detected in step (b) greater and statistically significant compared to a reference amount (obtained from the control group individuals with pancreatic cancer before surgery).
  • the detection of the expression product of at least one gene that is selected from the list comprising: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20 , MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and FKBP1B, or any combination thereof, is performed by RT-PCR.
  • the detection of the expression product of at least one gene that is selected from the list comprising: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20 , MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and FKBP1B, or any combination thereof, is performed using a microarray.
  • Another aspect of the invention relates to a method of diagnosis, prognosis or monitoring of pancreatic cancer, hereinafter second method of the invention, comprising:
  • step (b) compare the quantities obtained in step (b) with a reference quantity
  • step (a) assign the individual of step (a) to the group of individuals with pancreatic cancer when they have an expression level twice as high as that of healthy individuals.
  • the reference amount is obtained from the constitutive expression values of the gene, in a group of healthy individuals, or from the expression of the gene in the group of individuals before undergoing surgical intervention.
  • peripheral blood samples were obtained before surgery (TO) and seven days after it was performed (T7d).
  • steps (b) and / or (c) of the methods described above can be totally or partially automated, for example, by means of a robotic sensor device for the detection of the quantity in step (b) or the computerized comparison in step (c).
  • the isolated biological sample of an individual from step (a) is obtained from peripheral blood, and / or comprises peripheral blood cells (PBCs).
  • PBCs peripheral blood cells
  • the detection of the expression product of at least one gene that is selected from the list comprising: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20 , MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and FKBP1B, or any combination thereof, is performed by RT-PCR.
  • the detection of the expression product of at least one gene that is selected from the list comprising: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20 , MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and FKBP1B, or any combination thereof, is performed using a microarray.
  • This discrimination as understood by one skilled in the art, is not intended to be correct in 100% of the samples analyzed. However, it requires that a statistically significant amount of the analyzed samples be classified correctly. The amount that is statistically significant can be established by a person skilled in the art by using different statistical tools, for example, but not limited, by determining confidence intervals, determining the significance value P, Student test or discriminant functions.
  • the confidence intervals are at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98% or at least 99%.
  • the value of p is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001.
  • the present invention makes it possible to correctly detect the disease differentially at least 60%, more preferably at least 70%, much more preferably at least 80%, or even much more preferably at least 90 % of the subjects of a certain group or population analyzed.
  • an “isolated biological sample” includes, but is not limited to, cells, tissues and / or biological fluids of an organism, obtained by any method known to a person skilled in the art.
  • the isolated biological sample comprises peripheral blood cells (PBCs).
  • the term “individual” is not intended to be limiting in any aspect, and may be of any age, sex and physical condition.
  • the detection of the quantity of the expression product of the genes selected from the list comprising: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and FKBP1B , or any combination thereof, can be carried out by any means known in the state of the art.
  • the authors of the present invention have demonstrated that the detection of the quantity or concentration of these expression products in a semi-quantitative or quantitative manner makes it possible to differentiate between Different stages of pancreatic cancer. In this way, a differential diagnosis can be established in individuals affected by pancreatic cancer, which allows them to subclassify them.
  • the measurement of the amount or concentration can be carried out directly or indirectly.
  • Direct measurement refers to the measure of the quantity or concentration of the gene expression product, based on a signal that is obtained directly from the transcripts of said genes, or from the proteins to which they are translated, and which is directly correlated with the number of RNA molecules or proteins produced by genes.
  • Said signal - which we can also refer to as an intensity signal - can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of said products.
  • the indirect measurement includes the measurement obtained from a secondary component or a biological measurement system (for example the measurement of cellular responses, ligands, "tags" or enzymatic reaction products).
  • quantity refers to, but is not limited to, the absolute or relative quantity of gene expression products, as well as any other value or parameter related thereto or that can be derived from these.
  • Said values or parameters comprise signal intensity values obtained from any of the physical or chemical properties of said expression products obtained by direct measurement. Additionally, said values or parameters include all those obtained by indirect measurement, for example, any of the measurement systems described elsewhere in this document.
  • comparison refers to, but is not limited to, the comparison of the quantity of expression products of the HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1 genes.
  • GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and / or FKBP1B of the biological sample to be analyzed also called the biological problem sample
  • the reference sample can be analyzed, for example, simultaneously or consecutively, together with the problem biological sample.
  • the comparison described in section (c) of the method of the present invention can be performed manually or assisted by a computer.
  • Gene expression profile means the gene profile obtained after quantification of mRNA and / or protein produced by the genes of interest or biomarkers, that is, by the genes H LAG, ARFGAP 1, S 1 00A2, SLC25A23, KLRG 1, GZM B, GFOD 1, GPI, GPR56, M UC20, MAP4K1, H BD, RPS5, BN I P3L, PCDH9 and FKBP1 B, in an isolated biological sample.
  • the expression profile of the genes is preferably performed by determining the level of mRNA derived from its transcription, after extracting the total RNA present in the isolated biological sample, which can be performed by protocols known in the state of the art.
  • the level of mRNA derived from the transcription of the HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and FKBP1B genes can be determined, for example, , but not limited to, by amplification by polymerase chain reaction (PCR), retrotranscription in combination with the polymerase chain reaction (RT-PCR), quantitative RT-PCR, retrotranscription in combination with the chain reaction of the ligase (RT-LCR), or any other nucleic acid amplification method; serial analysis of gene expression (SAGE, SuperSAGE); DNA chips made with oligonucleotides deposited by any mechanism; DNA microarrays made with oligonucleotides synthesized in situ by photolithography or by any other mechanism; in situ hybridization using specific probes marked with any method of marking; by electrophoresis gels; by membrane transfer and hybrid
  • the gene expression profile could also be obtained by the detection and / or quantification of the proteins resulting from the translation of the mRNA derived from the transcription of the HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20 genes. , MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and FKBP1B, for example, but not limited to, western blot immunodetection.
  • Quantitative detection of the expression of the HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and FKBP1B genes can be performed more preferably by real-time PCR ( RT-PCR or RTqPCR).
  • the real-time detection of the amplified products can be carried out by means of the use of fluorescent molecules that are intercalated in the double-stranded DNA or by hybridization with different types of probes.
  • reference quantity refers to the absolute or relative quantity (to the reference gene) of expression products of the HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB genes, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and / or FKBP1B that allows to discriminate a certain stage of pancreatic cancer from other stages, or other diseases.
  • Suitable reference amounts can be determined by the method of the present invention from a reference sample that can be analyzed, for example, simultaneously or consecutively, together with the problem biological sample.
  • the reference sample may be the negative controls, that is, the amounts detected by the method of the invention in samples of individuals not suffering from pancreatic cancer.
  • the reference amount will be, for example, in the case of differentiation between patients affected by pancreatic cancer from healthy individuals, the constitutive expression of the gene in a control group of healthy individuals.
  • the control group will consist of a group of patients with pancreatic cancer who did not have that clinical manifestation.
  • the sample or reference samples can be, for example, obtained from the blood cells of a patient with pancreatic cancer, in a certain clinical phase.
  • the reference amount is obtained from a reference sample.
  • the reference amount can also be obtained, for example, from the limits of normal distribution of an amount found in samples obtained from a population of individuals with pancreatic cancer in different phases, by means of well-known statistical techniques.
  • the HLAG gene major histocompatibility class I antigen, involved in the presentation of antigens to the immune system. Its amino acid sequence is found with access number in GenBank (NCBI) NP_0021 18; and / or in SEQ ID NO: 1).
  • the HLAG gene is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 1, and which would comprise various variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 1, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the KMP1 1 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in the GenBank sequence (NCBI) NM 002721.
  • the ARFGAP1 or ADP-ribosylation factor GTPase activating protein 1 gene (RP1 1 - 261 N 1 1 .1, ARF 1 GAP, H RI H FB2281, MGC39924), encodes a GTPase activating protein that interacts with the factor of ribosylation ARF1 (Weimer et al., 2008. J Cell Biol. Nov 17; 183 (4) 725-35). Its amino acid sequence is found with access number in GenBank (NCBI) NP_060679; and / or SEQ ID NO: 2.
  • ARFGAP1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 2, and which would comprise various variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 2, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the protein ARFGAP1.
  • nucleic acid molecules is the collection in the GenBank sequence (NCBI) NM 018209.2.
  • the S100A2 gene or "S100 calcium binding protein A2" (RP1 1-49N14.8, CAN 19, MGC1 1 1539, S100L), is a gene that codes for a S100 family protein, involved in the regulation of processes such as cell cycle and differentiation. An altered expression of this gene has been detected in breast cancer. Under-expression of this gene is associated with poor tumor differentiation and reduced survival in laryngeal carcinoma (Almadori et al., 2009. J Otolaryngol Head Neck Surg. Feb; 38 (1): 16-22).
  • S100A2 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein found in the Ban Ban Gen (NCBI) NP_005969 and / or in SEQ ID NO: 3, and which would include several variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 3, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the S100A2 protein.
  • GenBank sequence NCBI
  • the SLC25A23 or "solute carr ⁇ er family 25 mitochondrial transporter of Ca-dependent solutes. It can act as an ATP-Mg / Pi exchanger that mediates the transport of Mg-ATP in phosphate exchange, catalyzing the net level or efflux of adenine nucleotides inside or outside the mitochondria (Bassi et al., 2005. Gene. Jan 31; 345 (2): 173 -82 Epub 2005 Jan 7.).
  • SLC25A23 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence that It has an access number in GenBank (NCBI) NP_077008 and / or in SEQ ID NO: 4, and which would include several variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 4, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the SLC25A23 protein.
  • GenBank sequence NCBI
  • KLRG1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence found with access number in GenBank (NCBI) NP_077008 and / or in SEQ ID NO: 5, and that it would include several variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 5, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the KLRG1 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in the GenBank sequence (NCBI) NM 005810.3.
  • This gene encodes the enzyme Granzima B, necessary to direct cell lysis in cell-mediated immune responses. It appears to be linked to an activation of caspases responsible for apoptosis (Rotonda et al., 2001. Chem Biol. Apr; 8 ( 4): 357-68).
  • GZMB is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence found with access number in GenBank (NCBI) NP_004122 and / or in SEQ ID NO: 6, and that it would include several variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 6, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the GZMB protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in the GenBank sequence (NCBI) NM 004131 .3.
  • the GFOD1 gene or "glucose-fructose oxidoreductase domain containing 1”, is involved in induction of apoptosis.
  • This gene encodes the enzyme Granzima B, necessary to direct cell lysis in cell-mediated immune responses. It seems to be linked to an activation of caspases responsible for apoptosis (Rotonda et al., 2001. Chem Biol. Apr; 8 (4): 357-68).
  • GFOD1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence found with access number in GenBank (NCBI) NP_061861 and / or in SEQ ID NO: 7, and that it would include several variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the a) polynucleotide sequence
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 7, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the GFOD1 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in the GenBank sequence (NCBI) NM 018988.2.
  • the GPI or "glucose-6-phosphate isomerase” gene encodes a dimeric enzyme that catalyzes the reversible isomerization of glucose-6-phosphate and fructose-6- phosphate, it can also act as a tumor-secreted cytokine and as an angiogenic factor ( AMF) that stimulates the motility of the endothelial cell (25).
  • GPI is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence that meets the number of Access in GenBank (NCBI) NP_000166, NP_001 171651.1 and / or in SEQ ID NO: 8, and which would include various variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 8, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the GPI protein.
  • GenBank GenBank sequence NM_000175.3 or NM_001 184722.1.
  • GPR56 or "G protein-coupled receptor 56" gene (UNQ540 / PRO1083, BFPP, DKFZp781 L1398, TM7LN4, TM7XN1) G protein-linked receptor whose overexpression can suppress tumor growth and metastasis (Huang et al., 2008. Mol Cell Biochem. Jan; 308 (1-2): 133-9. Epub 2007 Oct 12).
  • GPR56 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence found with access number in GenBank (NCBI) NP_002057 and / or in SEQ ID NO: 9, and that it would include several variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 9, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the GPR56 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in the GenBank sequence (NCBI) NM 201524.1.
  • the MUC20 gene or "mucin 20, cell surface associated", (UNQ2782 / PR07170, FLJ 14408, FLJ53153, KIAA1359, MUC-20) codes for a mucin, glycoprotein that forms an insoluble mucous barrier (Higuchi et al., 2004. Mol Cell Biol. Sep; 24 (17): 7456-68).
  • This gene appears to reduce the transient activation of MAPK induced by hepatocyte growth factor (HGF). It also inhibits the proliferation of MMP1 and MMP9 expression induced by HGF (Higuchi et al., 2004. Mol Cell Biol. Sep; 24 (17): 7456-68).
  • MUC20 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence found with access number in GenBank (NCBI) NP_002057 and / or in SEQ ID NO: 10, and that it would include several variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, a 98% or 99% with SEQ ID NO: 10, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the MUC20 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in the GenBank sequence (NCBI) NM 152673.
  • the MAP4K1 gene or "mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase kinase 1", (HPK1) codes for a mucin, glycoprotein that forms an insoluble mucosal barrier (Higuchi et al., 2004. Mol Cell Biol. Sep; 24 (17): 7456-68). This gene appears to reduce the transient activation of MAPK induced by hepatocyte growth factor (HGF). It also inhibits the proliferation of MMP1 and MMP9 expression induced by HGF (Higuchi et al., 2004. Mol Cell Biol. Sep; 24 (17): 7456-68).
  • HGF hepatocyte growth factor
  • MAP4K1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence found with access number in GenBank (NCBI) NP_002057 and / or in SEQ ID NO: 1 1 , and that would include several variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 1,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 1 1, and wherein the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the MAP4K1 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in the GenBank sequence (NCBI) NM 007181 .3.
  • the HBD or "hemoglobin, delta” gene is involved in the transport of oxygen from the lung to other peripheral tissues.
  • HBD is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence found with access number in GenBank (NCBI) NP_002057 and / or in SEQ ID NO: 12, and that it would include several variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, b) nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 12, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the HBD protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in the GenBank sequence (NCBI) NM 000519.3.
  • the RPS5 or "ribosomal protein S5" gene encodes a ribosomal protein whose variable expression has been detected, in addition to pancreatic cancer, in colorectal cancer, although it has not been related to the severity of the disease (Campagna et al. , 2008. Int J Clin Exp Pathol 1: 32-43, Frigerio et al., 1995. Biochim Biophys Acta 1262: 64-68).
  • RPS5 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence found with access number in GenBank (NCBI) NP_002057 and / or in SEQ ID NO: 13, and that it would include several variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 13, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the RPS5 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in the GenBank sequence (NCBI) NM 031902.3.
  • BN I P3L or "BCL2 / adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like" gene can function as a tumor suppressor. I nhibits BNIP3-induced apoptosis (Fei et al., 2004. Cancer Cell. Dec; 6 (6): 597-609; Mellor et al., 2007. Cancer Metastasis Rev. Dec; 26 (3-4): 553-66).
  • BNIP3L is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence found with access number in GenBank (NCBI) NP_004322 and / or in SEQ ID NO: 14, and that it would include several variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 14, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the BN I P3L protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in the GenBank sequence (NCBI) NM 004331 .2.
  • PCDH9 or "protocadherin 9" gene is a gene that encodes a calcium-dependent cell adhesion protein (protocadherin) and altered in pancreatic cancer (Hidalgo, 2010. Pancreatic Cancer. N Engl J Med 362 : 1605-17).
  • PCDH9 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence found with access number in GenBank (NCBI) NP_065136 and / or in SEQ ID NO: 15, and that it would include several variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 15, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the protein PCDH9.
  • GenBank NCBI sequence NM 020403.4 or NM 203487.2.
  • the FKBP1 B or "FK506 binding protein 1B, 12.6 kDa" gene (FKBP12.6, FKBP1 L, OTK4, PKBP1 L, PPIase) this gene encodes a member protein of the immunophilin family, involved in immunoregulation and processes basic cell phones such as protein folding and their passage through membranes.
  • This protein is a cis-trans prolyl isomerase that binds to immunosuppressant FK506 and rapamycin.
  • FKBP1 B is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence found with access number in GenBank (NCBI) NP_004107 and / or in SEQ ID NO: 16 , and that would include several variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 16, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the FKBP1 B protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in the GenBank sequence (NCBI) NM 0041 16.2
  • variant refers to a protein substantially homologous to any of the proteins HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5 , BN I P3L, PCDH9 and / or FKBP 1 B.
  • a variant includes additions, deletions or amino acid substitutions.
  • variant also includes proteins resulting from posttranslational modifications such as, but not limited to, glycosylation, methylation phosphorylation or acylation.
  • a protein is "substantially homologous" to any of the proteins HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and / or FKBP1 B, when its amino acid sequence shows a good alignment with the sequence amino acid SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEO ID NO: 3, SEO ID NO: 4, SEO ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, and SEQ ID NO: 16, respectively as described above; that is, when its amino acid sequence has an identity degree with respect to the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:
  • sequences homologous to any of the HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BN I P3L, PCDH9 and / or FKBP 1 B proteins can easily be identified by a person skilled in the art, for example, with the help of an appropriate computer program to compare sequences.
  • the detection of the amount of any of the proteins LAG, ARFGAP1, S 100A2, SLC25A23, KLRG1, GZM B, G FO D1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and / or FKBP1 B is performed by an immunoassay.
  • immunoassay refers to any analytical technique that is based on the reaction of conjugation of an antibody with an antigen.
  • immunoassays known in the state of the art are, for example, but not limited to: immunoblot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), linear immunoassay (LIA), radioimmunoassay (RIA), immunofluorescence, x-map or protein chips .
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • LIA linear immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • immunofluorescence x-map or protein chips .
  • the immunoassay is an enzyme-linked immunosorbent assay or ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
  • ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
  • the ELISA is based on the premise that uni nm or norreactive (antigen or antibody) can be immobilized on a solid support, then bringing that system into contact with a fluid phase containing the complementary reagent that can bind to a compound marker.
  • ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay.
  • the ELISA is based on the premise that uni nm or norreactive (antigen or antibody) can be immobilized on a solid support, then bringing that system into contact with a fluid phase containing the complementary reagent that can bind to a compound marker.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • sandwich ELISA sandwich ELISA.
  • marker compound refers to a compound capable of giving rise to a chromogenic, fluorogenic, radioactive and / or chemiluminescent signal that allows the detection and quantification of the amount of antibodies against to the antigens HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and / or FKBP1 B.
  • the marker compound is selected from the list comprising radioisotopes enzymes, fluorophores or any molecule capable of being conjugated with another molecule or detected and / or quantified directly.
  • This marker compound can bind to the antibody directly, or through another compound.
  • Some examples of marker compounds that bind directly are, but are not limited to, enzymes such as alkaline phosphatase or peroxidase, radioactive isotopes such as 32 P or 35 S, fluorochromes such as fluorescein or metal particles, for direct detection by colorimetry, auto-radiography , fluorimetry, or metallography respectively.
  • the second method of the invention further comprises assigning the individual according to step (a) to the group of individuals surgically operated and at which seven days after it is taken, a peripheral blood sample is taken when a quantity of product is present. of expression of the HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and FKBP1B genes, or any combination thereof, detected in step (b) greater and statistically significant compared to a reference amount (obtained from the control group individuals with cancer of pancreas before surgery).
  • the value of p is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001.
  • the present invention makes it possible to correctly detect the disease differentially by at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90% of the subjects of a certain group or population analyzed.
  • Another aspect of the invention relates to a method of monitoring the evolution of pancreatic cancer, hereinafter the third method of the invention, comprising:
  • b) detect the amount of expression product of at least one of the genes that are selected from the list comprising HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, H BD , RPS5, BN I P3L, PCDH9 and FKBP 1 B, or any combination thereof, in the biological sample isolated from (a).
  • step (b) compare the quantities obtained in step (b) with a reference quantity
  • step (a) repeat at least twice the sequence of steps (a) - (c) in samples obtained from the same individual according to step (a), not simultaneously.
  • the isolated biological sample of an individual from step (a) is obtained from peripheral blood, and / or comprises peripheral blood cells (PBCs).
  • PBCs peripheral blood cells
  • the detection of the expression product of at least one gene that is selected from the list comprising: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20 , MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and FKBP1B, or any combination thereof, is performed by RT-PCR.
  • the detection of the expression product of at least one gene that is selected from the list comprising: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and FKBP1B, or any combination thereof, is performed using a microarray.
  • neural network refers to the monitoring of disease development, such as, but not limited to, the evaluation of the response to a particular cancer treatment of pancreas, or surgery. Therefore, in a preferred embodiment of this aspect of the invention, the follow-up is carried out post-treatment.
  • the detection of expression products is performed at least two, preferably three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve thirteen, fourteen, fifteen, and even more preferably the Sixteen HLAG, ARFGAP1, S 100A2, SLC25A23, KLRG 1, GZMB, GFOD 1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and FKBP1 B genes.
  • the detection of the products of HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and FKBP1B genes are performed simultaneously.
  • kit or device comprising the elements necessary to analyze the amount of the expression product of the genes in the list comprising: HLAG, ARFGAP1 , S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and FKBP1B, or any combination thereof.
  • step (b) More preferably it comprises the means necessary to compare the amount detected in step (b) with a reference amount.
  • the kit of the present invention comprises the elements necessary to carry out any of the methods of the present invention.
  • Said kit may contain all those reagents necessary to analyze the quantity quantity of the expression product of the genes HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 and FKBP1B, or any combination thereof, by any of the methods described above in this document.
  • the kit can also include, without any limitation, buffers, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit It can include all the supports and containers necessary for its implementation and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out any of the methods of the invention.
  • kits or device of the invention for obtaining useful data in the diagnosis, prognosis or monitoring of pancreatic cancer.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA).
  • amino acid sequence refers to a polymeric form of amino acids of any length, which may be coding or non-coding , chemically or biochemically modified.
  • Fig. 1 Visualization of the 3 tubes with RNA stabilizer for each patient and time.
  • RNA samples were obtained before surgery (T0) and seven days after it was performed (T7d) using for each patient and sampling time, three tubes containing an RNA stabilizer. Once extracted, this RNA is purified by checking its quality in a bioanalyzer, so that the RNA samples whose ratio 28S / 1 8S is not of the order of 1, 5 are discarded.
  • the reverse transcription reaction is carried out, as well as to mark the cRNAs obtained with Cy5-streptavidin, proceeding to hybridize these in the human complete genome microarrays of the CodeLink system.
  • Each microarray is performed in duplicate by loading 2 ⁇ g of each patient's cRNA, to compare it with 2 ⁇ g of healthy volunteers' cRNA. Once the hybridization was finished during a period of 12h and at 37 ° C, the reading of the microarrays was carried out on a laser scanner, quantifying and normalizing the values obtained by means of the CodeLink 5.0 software.
  • the gene expression profile was studied using bioarrays of the CodeLink system (Applied Microarrays, Tempe, AZ, USA) from total peripheral blood RNA obtained with Paxgene Blood RNA Tubes (PreAnalytix, Qiagen, The Netherlands) and purified with Paxgene Blood RNA kit (Qiagen, The Netherlands).
  • the quality of the RNA obtained was measured by microfluidics in a bioanalyzer (Experion, Bio-Rad, Richmond, VI, USES).
  • the fluorescence of the bioarrays was determined on a GenePix-4000B (Axon I nstruments) scanner.
  • the data was processed with the software of the CodeLink 5.0 platform (GE Healthcare).
  • HLAG involved in the presentation of antigens to the immune system
  • ARFGAP GTPase activating protein that interacts with the ribosylation factor ARF1
  • S100A2 involved in the regulation of processes such as cell cycle and differentiation
  • SLC25A23 Ca-dependent mitochondrial solute transporter
  • KLRG1 which plays an inhibitory role of "natural killer” cells (N K)
  • GZM B involved in induction of apoptosis
  • GFOD1 a glucose-fructose oxidoreductase
  • GPI glucose phosphate isomerase that in addition to glycolytic function can act as a cytokine secreted by tumors and as an angiogenic factor
  • GPR56 G-protein linked receptor whose overexpression can suppress tumor growth and metastasis
  • MUC20 which codes for a mucin, glycoprotein that
  • T7d compared with T0, 1 1 genes have been detected with an overexpression greater than 2 times (p ⁇ 0.05), among which are: HBD, hemoglobin delta, involved in the transport of oxygen from the lung to other peripheral tissues; RPS5, which codes for a ribosomal protein whose variable expression has been detected in colorectal cancer, although it has not been related to the severity of the disease.

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Abstract

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico en un estadio temprano del adenocarcinoma de páncreas, así como para evaluar la respuesta al tratamiento de dicha enfermedad, que permite el establecimiento de un patrón individual de reconocimiento (cuali- y cuantitativo) específico, que es diferente dependiendo del estado de la enfermedad y se ve modificado post-tratamiento, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes, así como el diagnóstico precoz. Kit que comprende los medios necesarios para llevar a cabo el método de la invención.

Description

METODO DE OBTENCION DE DATOS UTILES PARA EL DIAGNOSTICO DEL CÁNCER DE PÁNCREAS Y PARA EVALUAR LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO.
La presente invención se encuentra dentro de la medicina y la biología molecular, y se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico en un estadio temprano del adenocarcinoma de páncreas, así como para evaluar la respuesta al tratamiento de dicha enfermedad, que permite el establecimiento de un patrón individual de reconocimiento (cuali- y cuantitativo) específico, que es diferente dependiendo del estado de la enfermedad y se ve modificado post-tratamiento, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes, así como el diagnóstico precoz.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El cáncer de páncreas se encuentra entre las cinco primeras causas de muerte por cáncer en el mundo desarrollado con una tasa de supervivencia del 19% a 1 año. Un 95% de tumores malignos del páncreas son adenocarcinoma ductal infiltrante. En la mayoría de los casos se diagnostica en un estado muy avanzado e incluso pacientes con tumores resecables localizados, presentan metástasis. Los tumores que rodean o comprimen estructuras arteriales grandes como las ramas del tronco celíaco o la arteria mesentérica superior son considerados irresecables. La intervención quirúrgica permanece como el tratamiento central, si bien hay que complementarla con otras opciones para aumentar el tiempo de supervivencia. En este sentido, el tratamiento quimioterápico y de radiación se utilizan bien en combinación con la intervención quirúrgica, o bien como tratamiento definitivo en los casos de tumores avanzados, no resecables (Yeo et al. Cáncer of the Páncreas. Cáncer : principies and practice of oncology. Vincent T. DeVita, Jr., Samuel Hellman, Steven A. Rosenberg;7th Edition 2005). Así, en enfermedad avanzada, la administración de gemcitabina es el agente estándar, combinándola con citostáticos para mejorar la respuesta.
El conocimiento a nivel molecular, de las rutas de señalización que intervienen en la transformación celular ha permitido el desarrollo de tratamientos nuevos contra el cáncer. La desregulación de la señalización a través del receptor del factor de crecimiento epidérmico EGFR está implicada en el proceso de carcinogénesis. Diversos tipos de cáncer tienden a expresar altos niveles de EGFR y su activación inicia una cascada de señalización cuyos componentes son nuevas dianas potenciales para el tratamiento del cáncer. Moléculas como erlotinib, inhibidor de tirosin-quinasa a nivel intracelular, actúa impidiendo la autofosforilación del receptor de EGFR y posterior transducción de la señal.
Los inhibidores de EGFR parecen mostrar máxima actividad en pacientes de cáncer de pulmón con mutaciones activadoras en el dominio citoplásmico. Esto sugiere que los pacientes en los cuales los tumores presenten determinadas mutaciones de este receptor, se beneficiarían de un resultado clínico mejor. Este hecho indicaría que el estudio de la presencia de estas mutaciones en los pacientes se podría utilizar como pauta de aplicación de la terapia para aquellos que respondieran mejor a inhibidores de EGFR (3-5). Sin embargo, esto no es totalmente cierto, ya que no todos los pacientes con mutaciones detectadas responden al tratamiento, mientras que pacientes sin dichas mutaciones son respondedores. Además de EGFR, otras moléculas parecen tener un papel en la aparición y progresión del cáncer. Así la activación del oncogen K-ras junto con la inactivación de genes supresores tumorales (p53, DPC4, p16, y BRCA2) se ha asociado con el desarrollo de cáncer de páncreas (Orchekowski et al., 2005. Cáncer Res 65:1 1 193-202).
Por otra parte, ciertos genes se encuentran sobre-expresados en adenocarcinoma de páncreas, entre ellos claudin 4, fascin, Hsp47, mesotelin, Muc4, PSCA, S100A4. Estos datos indican que un estudio del perfil de expresión génica proporciona una oportunidad única para mejorar el conocimiento del diagnóstico y evolución de este letal tumor y proporcionar una mejora en las pautas del tratamiento del paciente, tanto a nivel de búsqueda de biomarcadores apropiados que reflejen una respuesta eficaz como a nivel de aplicación del mejor tratamiento a nivel individual a cada paciente según los biomarcadores que manifiesten.
Por otro lado, las alteraciones genéticas dan lugar a que las células tumorales produzcan diferentes moléculas que están involucradas en la transformación neoplásica y la progresión tumoral. Estas moléculas a menudo hacen emerger señales autocrinas y paracrinas estimuladoras del crecimiento, factores de crecimiento peptídicos secretados, citoquinas y hormonas. Los niveles aumentados de estas moléculas solubles pueden ser utilizados para el diagnóstico del cáncer y el manejo terapéutico. Se ha detectado expresión de proteínas asociadas al cáncer, como HER2, por las células tumorales circulantes en sangre. Estas células tienen valor pronóstico en la enfermedad metastásica, y su presencia aumenta, tras un ciclo de tratamiento, en pacientes con probabilidad de que la terapia fuese inefectiva. Estos resultados indican el valor de utilizar analíticas que permitan la detección en la sangre de los pacientes con cáncer o bien células cancerosas circulantes o las moléculas que puedan producir, y que estén involucradas en el proceso cancerígeno. Este procedimiento es menos invasivo para monitorizar tanto la evolución de la enfermedad como la respuesta a la terapia o intervención quirúrgica. De esta manera, estas moléculas-diana pueden ayudar a caracterizar la biología de la tumorigénesis, la progresión de la enfermedad y además pueden identificar biomarcadores para monitorizar el tratamiento de los pacientes con cáncer.
Una manera de detectar estas moléculas es utilizando anticuerpos específicos, para detectar su presencia en el suero de los pacientes con cáncer, así en pacientes con cáncer de vejiga, la presencia de p33ING1 y ciclina D2, se ha asociado con pérdida de la regulación del ciclo celular; angiostatina y factor de crecimiento epidérmico con repuesta antiangiogénica; osteopontina y CXCR4 con riesgo metastásico. El perfil de proteínas en suero que se pueden detectar utilizando anticuerpos puede ser característico de la enfermedad (Orchekowski et al., 2005. Cáncer Res 65:1 1 193-202).
Estas moléculas alcanzan el torrente sanguíneo tanto por secreción o excreción como por mecanismos de degradación incluyendo apoptosis o necrosis tisular. La neovascularización, vías celulares tumorales autocrinas y las paracrinas, son factores colaboradores de que estas dianas antigénicas alcancen la circulación y se puedan detectar en sangre (Burczynski et al., 2006. J Mol Diagn. 8:51 -61 ; Golub et al., 1999. Science 286:531 -537; Smirnov et al., 2005. Cáncer Researc. 65:4993-4997).
En el caso del cáncer de páncreas, en un estudio realizado sobre la expresión del antígeno de células madre prostático (PSCA) mRNA se detectó mediante RT-PCR en la sangre de 7 de 1 1 pacientes con cáncer de páncreas (63,6%), y no se observó en la sangre de individuos sanos. Otras alteraciones genéticas características del cáncer de páncreas, como mutación K-ras que está presente en el 80-90% de los casos, pueden detectarse en el plasma de dichos pacientes por la misma técnica, con potencial aplicación en la monitorización de la enfermedad. En esta línea, la viabilidad de medir en sangre periférica moléculas que permitan conocer la evolución de cáncer de páncreas fue la demostración de que los niveles de transcritos de RNAm del factor de necrosis tumoral alfa (TN F-α) en sangre periférica estaban elevados en los 10 pacientes con cáncer de páncreas estudiados comparados con 9 controles sanos (p < 0.05) medidos por Q-RT-PCR y los transcritos de RNAm del TNF-α se redujeron a un nivel similar a los controles tras la extirpación del tumor.
La tecnología actual permite determinar el perfil molecular de la enfermedad, mediante micromatrices (microarrays) capaces de medir simultáneamente los niveles de expresión de miles de genes. Se puede medir la expresión a nivel de ARNm, para ello están los microarrays que utilizan sondas con ADNc u oligonucleótidos sintéticos o medir las proteínas utilizando como "sondas" anticuerpos específicos. En el caso de medir los niveles de expresión de los genes a nivel de ARNm, se puede partir de ARN total o ARNm aislado de la muestra de tejido o de células. Tanto en el caso de partir de ARN total como de ARN m se realiza un paso previo de obtención de ADN complemetario (ADNc), y posteriormente se realiza una transcripción in vitro para la obtención de ARNc marcado con biotina de manera proporcional al mARN original expresado en el tejido. Este ARNc biotinilado se fragm enta y se h í bri da específicamente con el panel de sondas de ADNc u oligonucleótuidos sintéticos presentes en el microarray en condiciones específicas, se elimina el que no ha hibridado y la cantidad de ARNc-biotinilado para cada gen se pone de manifiesto al añadir un fluoróforo que suele ser Cy5 unido a estreptavidina. La fluorescencia se detecta con un escáner, que la convierte en datos numéricos y se crea una base de datos en la q ue podemos tener u nos valores de i ntensidad de fluorescencia directamente relacionados con el nivel de expresión de cada gen particular. Esto permite visualizar las interacciones de miles de genes simultáneamente.
En los últimos años, se han usado los perfiles de expresión génica basados en microarrays, para el diagnóstico de diversas enfermedades entre ellas el cáncer, si bien los estudios se han limitado a ciertos tipos de esta enfermedad , lo cual ha permitido clasificar los distintos tipos de cáncer en subgrupos clínicamente relevantes, de una manera más precisa y antes de que aparezcan manifestaciones cl ínicas severas, con lo que aumenta la posibilidad de un mejor diagnóstico precoz, un mejor seguimiento de la evolución clínica y de la respuesta a los diferentes tratamientos con respecto a los métodos convencionales o en conjunto con ellos. De esta manera mediante el análisis del perfil de expresión génica es posible predecir la respuesta a quimioterapia o a agentes dirigidos frente a dianas moleculares del cáncer (Burczynski et al., 2006. J Mol Diagn. 8:51 -61 ; Golub et al., 1999. Science 286:531 -537; Smirnov et al., 2005. Cáncer Researc. 65:4993-4997; Burczynski et al., 2005. Clin Cáncer Res 1 1 :1 181 -9). El perfil molecular se puede utilizar como una herramienta adicional dentro de los exámenes clínicos para determinar la sensibilidad a un tratamiento determinado, y de esta manera reducir tratamientos innecesarios.
La sangre periférica es un tipo de tejido esencial para la investigación clínica debido a su papel crítico en la respuesta inmune y metabólica, y a su fácil recolección, lo cual es esencial para el descubrimiento de marcadores biológicos de enfermedad. Así, la aplicación de la tecnolog ía de m icroarrays en sangre periférica puede proporcionar nuevos conocimientos de las variaciones en la expresión genética global específicamente asociadas a la enfermedad (Burczynski et al., 2005. Clin Cáncer Res 1 1 :1 181 -9; Feezor et al., 2004. Physiol. Genomics 19:247-254; Samuel et al., 2003. ASCO Molecular Therapeutics Symposium Nov 2002 San Diego. BMC Cáncer 3:3; Jazaeri et al., 2005. Clin cáncer Res. 1 1 : 6300-10; McPhail et al., 2005. 10:1485- 1487). Es posible el aislamiento de ARN total de sangre sin riesgo de su degradación, y aunque inicialmente se comprobó que había diferencias en la expresión debido a sobreabundancia de mRNA de hemoglobina, una vez que se dispone de técnicas que eliminan ARN de la fracción eritrocitaria los sistemas de recolección de ARN de sangre son idóneos para estudios que requieran muchas muestras, seguimiento a lo largo del tiempo o multicéntricos. Se ha demostrado que el método de reducción de RNAm de globina consigue aumentar la calidad de los datos de las muestras de RNA estabilizado con menor variación intragrupos y una tasa de detección de genes expresados similar a la de células mononucleares en sangre. La utilización de sangre periférica, permite un aumento en la identificación de biomarcadores basados en el perfil de expresión de ARN y puede ayudar en lo que ya se conoce como farmacogenómica. El uso de células mononucleares de sangre periférica para análisis de transcriptoma ha probado su valor para valorar la firma genética asociada a la enfermedad y relacionada a respuesta a fármacos. La disponibilidad de microarrays de ADN está acelerando el descubrimiento de dianas del cáncer (Andrea et al., 2006. Nature 439: 353-357). Se ha empleado RT-PCR para detectar tránscritos mRNA de cáncer de mama o asociados a epitelio como citoqueratinas, EGFR, mamoglobulina, MUC-1 , beta-HCG, c-Met, GalNac-T, MAGE-3.
En el caso del cáncer de páncreas se han estudiado microarrays de proteínas para detección de marcadores en suero (Orchekowski et al., 2005. 65:1 1 193-202), así como se han identificado, mediante microarrays de cDNA, 158 genes expresados en el epitelio neoplásico con mayor expresión (mayor del doble, p<0,01 ) en 10 cánceres de páncreas comparados con 10 muestras de páncreas no tumoral (Logsdon et al., 2003. Cáncer Res 63:2649-57). Investigadores de la Universidad de Ulm, aprovechando el conocimiento de estudios previos de perfil de expresión genética de cáncer de páncreas, diseñaron un array diagnóstico de cDNA especialmente diseñado para diagnóstico diferencial de tumores pancreáticos basado en el perfil de expresión de biopsias obtenidas con aspiración mediante aguja fina, puesto que más del 90% de tumores pancreáticos representan adenocarcinomas ductales; según estos autores los resultados permitían diferenciar adenocarcinomas ductales de tumores no malignos de páncreas con un 95% de especificidad (Buchloz et al., 2005. Clin Cáncer Res. Nov 15;1 1 (22):8048-54). Así mismo se han realizado estudios comparativos de los análisis de microarrays utilizados en cáncer de páncreas a fi n de encontrar genes y biomarcadores que pudiesen ser utilizados en nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas (Brandt et al., 2004. Pancreatology 4: 587-597).
Es importante, por tanto, encontrar biomarcadores que puedan emplearse para el diagnóstico precoz del cáncer de páncreas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico precoz del cáncer de páncreas, así como para evaluar la respuesta al tratamiento de dicha enfermedad , permitiendo el establecimiento de grupos d e pacientes.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de uno de los genes que se seleccionan de la lista que comprende HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico, o seguimiento del cáncer de páncreas. En una realización preferida de este aspecto de la invención, los genes se usan de manera simultánea.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento del cáncer de páncreas, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende:
a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y b) detectar la cantidad de expresión de, al menos, uno de los genes que se seleccionan de la lista que comprende HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG 1, GZMB, GFOD 1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1 , HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, en la muestra biológica aislada de (a).
En una realización preferida, el primer método de la invención comprende además:
c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) se obtiene de sangre periférica, y/o comprende células de sangre periférica {peripheral blood cells PBCs).
En otra realización preferida, el primer método de la invención además comprende asignar al individuo según el paso (a) al grupo de individuos a los que se ha tomado muestra de sangre periférica a los siete días de efectuada una intervención quirúrgica por cáncer de páncreas, cuando presenta una cantidad de producto de expresión de los genes HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, detectado en el paso (b) mayor y estadísticamente significativa en comparación con una cantidad de referencia (que se obtiene del grupo control individuos con cáncer de páncreas antes de una intervención quirúrgica).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección del producto de expresión de al menos un gen que se selecciona de la lista que comprende: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, se realiza mediante RT-PCR.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección del producto de expresión de al menos un gen que se selecciona de la lista que comprende: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, se realiza mediante un microarray.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de diagnóstico, pronóstico o seguimiento del cáncer de páncreas, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende:
a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y b) detectar la cantidad de expresión de, al menos, uno de los genes que se seleccionan de la lista que comprende HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, en la muestra biológica aislada de (a),
c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia, y
d) asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos con cáncer de páncreas cuando presentan un nivel de expresión dos veces superior al de los individuos sanos.
La cantidad de referencia se obtiene a partir de los valores de expresión constitutiva del gen, en un grupo de individuos sanos, o de la expresión del gen en el gru po de individuos antes de ser sometidos a una intervención quirúrgica. En particular, en la presente invención, las muestras de sangre periférica se obtuvieron antes de la intervención quirúrgica (TO) y a los siete días después de realizada ésta (T7d).
Los pasos (b) y/o (c) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la cantidad en el paso (b) o la comparación computerizada en el paso (c).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) se obtiene de sangre periférica, y/o comprende células de sangre periférica {peripheral blood cells PBCs).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección del producto de expresión de al menos un gen que se selecciona de la lista que comprende: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, se realiza mediante RT-PCR.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección del producto de expresión de al menos un gen que se selecciona de la lista que comprende: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, se realiza mediante un microarray.
El término "diagnóstico", tal y como se utiliza en la presente invención, a la capacidad de discriminar entre individuos afectados o no por adenocarcinoma de páncreas. A su vez, atendiendo al método de la presente invención, se podrían establecer otras subclasificaciones dentro de esta principal, facilitando, por tanto, la elección y el establecimiento de regímenes terapéuticos adecuados. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor significación P, test de Student o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Wh itney, correlación de Spearman , regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de ROC (AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1 , de 0,05, de 0,01 , de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma d iferencial en al menos el 60% , más preferiblemente en al menos el 70%, mucho más preferiblemente en al menos el 80%, o aún mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.
Una "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada comprende células de sangre periférica {peripheral blood cells PBCs).
El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción , se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término "individuo" no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pud iendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.
La detección de la cantidad del producto de expresión de los genes seleccionados de la lista que comprende: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica. Los autores de la presente invención han demostrado que la detección de la cantidad o la concentración de estos productos de expresión de manera semi-cuantitativa o cuantitativa permiten diferenciar entre los diferentes estadios del cáncer de páncreas. De esta manera, se puede establecer un diagnóstico diferencial en individuos afectados por cáncer de páncreas, que permite subclasificarlos.
La medida de la cantidad o la concentración, preferiblemente de manera semi- cuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del producto de expresión de los genes, basada en una señal que se obtiene directamente de los transcritos de dichos genes, o de las proteínas a las que se traducen, y que está correlacionada directamente con el número de moléculas de RNA o de proteínas producidas por los genes. Dicha señal - a la que también podemos referirnos como señal de intensidad - puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática).
El término "cantidad", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los productos de expresión de los genes, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de dichos productos de expresión obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.
El término "comparación", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la comparación de la cantidad de los productos de expresión de los genes HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y/o FKBP1B de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad de los productos de expresión de los genes HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y/o FKBP1B de una o varias muestras de referencia deseable descrita en otra parte de la presente descripción. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. La comparación descrita en el apartado (c) del método de la presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.
Los productos de expresión de los genes van a dar un determinado perfil de expresión génica. Se entiende por "perfil de expresión génica" el perfil génico obtenido tras la cuantificación del ARNm y/o de proteína producida por los genes de interés o biomarcadores, es decir, por los genes H LAG, ARFGAP 1 , S 1 00A2, SLC25A23, KLRG 1 , GZM B, GFOD 1 , GPI, GPR56, M UC20, MAP4K1 , H BD, RPS5, BN I P3L, PCDH9 y FKBP1 B, en una muestra biológica aislada. El perfil de expresión de los genes se realiza, preferiblemente, determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, previa extracción del ARN total presente en la muestra biológica aislada, lo cual puede realizarse mediante protocolos conocidos en el estado de la técnica. La determinación del nivel de ARNm derivado de la transcripción de los genes HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, puede realizarse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), RT-PCR cuantitativa, retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; análisis en serie de la expresión génica (SAGE, SuperSAGE); chips de ADN elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de ADN elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualqu ier método de mareaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio. El perfil de expresión génica también podría obtenerse mediante la detección y/o cuantificación de las proteínas producto de la traducción del ARNm derivado de la transcripción de los genes HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, mediante por ejemplo, pero sin limitarnos, inmunodetección por western blot. La detección cuantitativa de la expresión de los genes HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B puede realizarse más preferiblemente mediante PCR en tiempo real (RT-PCR ó RTqPCR). La detección en tiempo real de los productos amplificados puede llevarse a cabo mediante la utilización de moléculas fluorescentes que se intercalan en el ADN de cadena doble o mediante hibridación con diferentes tipos de sondas.
El término "cantidad de referencia", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a la cantidad absoluta o relativa (al gen de referencia) de productos de expresión de los genes HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y/o FKBP1B que permite discriminar un determinado estadio de cáncer de páncreas de otros estadios, o de otras enfermedades. Las cantidades de referencia adecuadas pueden ser determinadas por el método de la presente invención a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. Así, por ejemplo pero sin limitarnos, la muestra de referencia pueden ser los controles negativos, esto es, las cantidades detectadas por el método de la invención en muestras de individuos que no padecen cáncer de páncreas.
La cantidad de referencia será, por ejemplo, en el caso de la diferenciación entre los pacientes afectados por cáncer de páncreas de los individuos sanos, la expresión constitutiva del gen en un grupo control de individuos sanos. Sin embargo, en el caso de la subclasificación de los pacientes afectados por cáncer de páncreas en función de sus manifestaciones, el grupo control estará formado por un grupo de enfermos con cáncer de páncreas que no tuvieron esa manifestación clínica.
Así pues, la muestra o muestras de referencia pueden ser, por ejemplo, obtenidas a partir de las células sanguíneas de un paciente con cáncer de páncreas, en una determinada fase clínica. En otra realización preferida de este aspecto de la presente invención, la cantidad de referencia se obtiene a partir de una muestra de referencia. La cantidad de referencia puede obtenerse también, por ejemplo, de los límites de distribución normal de una cantidad encontrada en muestras obtenidas de una población de individuos con cáncer de páncreas en distintas fases, mediante técnicas estadísticas bien conocidas.
El gen HLAG, antígeno mayor de histocompatibilidad clase I, implicado en la presentación de antígenos al sistema inmune. Su secuencia aminoacídica se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_0021 18 ; y/o en la SEQ ID NO: 1 ). En el contexto de la presente invención, el gen HLAG se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 1 , y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1 ,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1 , y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KMP1 1 . Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 002721 .
El gen ARFGAP1 ó ADP-ribosylation factor GTPase activating protein 1 (RP1 1 - 261 N 1 1 .1 , ARF 1 GAP, H RI H FB2281 , MGC39924), cod ifica para u na proteína activadora de GTPasa que interacciona con el factor de ribosilación ARF1 (Weimer et al., 2008. J Cell Biol. Nov 17; 183(4)725-35). Su secuencia aminoacídica se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_060679; y/o la SEQ ID NO: 2.
En el contexto de la presente invención, ARFGAP1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 2, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína ARFGAP1 . Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 018209.2.
El gen S100A2, o "S100 calcium binding protein A2" (RP1 1 -49N14.8, CAN 19, MGC1 1 1539, S100L), es un gen que codifica para una proteína de la familia S100, implicado en la regulación de procesos como ciclo celular y diferenciación. Una expresión alterada de este gen se ha detectado en cáncer de mama. La subexpresión de este gen se asocia a una pobre diferenciación tumoral y menor supervivencia en carcinoma de laringe (Almadori et al., 2009. J Otolaryngol Head Neck Surg. Feb;38(1 ):16-22).
En el contexto de la presente invención, S100A2 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína q ue se encuentra con n ú mero de acceso en el Gen Ban k (N C B I ) NP_005969 y/o en la SEQ ID NO: 3, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 3,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 3, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína S100A2. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 005978.3.
El gen SLC25A23 o "solute carríer family 25 (mitochondríal carrier; phosphate carrier), member 23", (APC2, MCSC2, MGC2615, SCaMC-3j. Es un transportador mitocondrial de solutos dependiente de Ca . Puede actuar como un ATP-Mg/Pi intercambiador que media el transporte de Mg-ATP en intercambio por fosfato, catalizando el nivel neto o eflujo de nucleótidos de adenina dentro o fuera de la mitocondria (Bassi et al., 2005. Gene. Jan 31 ;345(2): 173-82. Epub 2005 Jan 7.).
En el contexto de la presente invención, SLC25A23 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_077008 y/o en la SEQ ID NO: 4, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 4,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 4, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína SLC25A23. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 024103.2.
El gen KLRG1 o "killer cell lectin-like receptor subfamily G, member l", (2F1 , CLEC15A, MAFA, MAFA-2F1 , MAFA-L, MAFA-LIKE, MGC13600 , desempeña un papel inhibidor de las células "natural killer" (NK) (Schwartzkopff et al., 2007. J Immunol. Jul 15; 179(2): 1022-9)
En el contexto de la presente invención, KLRG1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_077008 y/o en la SEQ ID NO: 5, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 5,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 5, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KLRG1 . Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 005810.3. El gen GZMB o "granzyme B (granzyme 2, cytotoxic T-lymphocyte-associated serine esterase 1", (CCPI, CGL-1 , CGL1 , CSP-B, CSPB, CTLA1 , CTSGL1 , HLP, SECTJ está implicado en inducción de apoptosis. Este gen codifica para la enzima Granzima B, necesaria para dirigir la lisis celular en respuestas inmunes mediadas por células. Parece estar ligada a una activación de caspasas responsables de la apoptosis (Rotonda et al., 2001 . Chem Biol. Apr;8(4):357-68).
En el contexto de la presente invención, GZMB se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_004122 y/o en la SEQ ID NO: 6, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 6,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 6, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína GZMB. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 004131 .3.
El gen GFOD1 o "glucose-fructose oxidoreductase domain containing 1", está implicado en inducción de apoptosis. Este gen codifica para la enzima Granzima B, necesaria para dirigir la lisis celular en respuestas inmunes mediadas por células. Parece estar ligada a una activación de caspasas responsables de la apoptosis (Rotonda et al., 2001 . Chem Biol. Apr;8(4):357-68).
En el contexto de la presente invención, GFOD1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_061861 y/o en la SEQ ID NO: 7, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 7,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 7, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína GFOD1 . Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 018988.2.
El gen GPI o "glucose-6-phosphate isomerase", codifica para una enzima dimérica que cataliza la isomerización reversible de glucosa-6-fosfato y fructosa-6- fosfato, además puede actuar como una citoquina segregada por tumores y como factor angiogénico (AMF) que estimula la motilidad de la célula endotelial (25).
En el contexto de la presente invención, GPI (AMF, DKFZp686C13233, GNPI, NLK, PGI, PHI, SA-36, SA36) se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_000166, NP_001 171651.1 y/o en la SEQ ID NO: 8, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 8,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 8, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína GPI. Entre d ichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM_000175.3 ó NM_001 184722.1 .
El gen GPR56 o "G protein-coupled receptor 56", (UNQ540/PRO1083, BFPP, DKFZp781 L1398, TM7LN4, TM7XN1 ) receptor ligado a proteína G cuya sobre- expresión puede suprimir crecimiento tumoral y metástasis (Huang et al., 2008. Mol Cell Biochem. Jan;308(1 -2):133-9. Epub 2007 Oct 12). En el contexto de la presente invención, GPR56 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_002057 y/o en la SEQ ID NO: 9, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 9,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 9, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína GPR56. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 201524.1 .
El gen MUC20 o "mucin 20, cell surface associated", (UNQ2782/PR07170, FLJ 14408, FLJ53153, KIAA1359, MUC-20) codifica para una mucina, glicoproteína que forma una barrera mucosa insoluble (Higuchi et al. , 2004. Mol Cell Biol . Sep;24(17):7456-68). Este gen parece reducir la activación transitoria de MAPK inducida por hepatocyte growth factor (HGF). Así mismo inhibe la proliferación de la expresión de MMP1 y MMP9 inducida por HGF (Higuchi et al., 2004. Mol Cell Biol. Sep;24(17):7456-68).
En el contexto de la presente invención, MUC20 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_002057 y/o en la SEQ ID NO: 10, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 10,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 10, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína MUC20. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 152673.
El gen MAP4K1 o "mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 1", (HPK1 ) codifica para una mucina, glicoproteína que forma una barrera mucosa insoluble (Higuchi et al., 2004. Mol Cell Biol. Sep;24(17):7456-68). Este gen parece reducir la activación transitoria de MAPK inducida por hepatocyte growth factor (HGF). Así mismo inhibe la proliferación de la expresión de MMP1 y MMP9 inducida por HGF (Higuchi et al., 2004. Mol Cell Biol. Sep;24(17):7456-68).
En el contexto de la presente invención, MAP4K1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_002057 y/o en la SEQ ID NO: 1 1 , y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1 1 ,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1 1 , y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína MAP4K1 . Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 007181 .3.
El gen HBD o "hemoglobin, delta", está implicado en el transporte de oxígeno desde el pulmón a otros tejidos periféricos.
En el contexto de la presente invención, HBD se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_002057 y/o en la SEQ ID NO: 12, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 12, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 12, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HBD. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 000519.3.
El gen RPS5 o "ribosomal protein S5", codifica para una proteína ribosomal cuya expresión variable se ha detectado, además de en cáncer de páncreas, en cáncer colorrectal, si bien no se ha relacionado con la severidad de la enfermedad (Campagna et al., 2008. Int J Clin Exp Pathol 1 : 32-43, Frigerio et al., 1995. Biochim Biophys Acta 1262: 64-68).
En el contexto de la presente invención, RPS5 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_002057 y/o en la SEQ ID NO: 13, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 13,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 13, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína RPS5. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 031902.3.
El gen BN I P3L o "BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like", (BN I P3a, N IX) puede funcionar como supresor de tumores. I nhibe la apoptosis inducida por BNIP3 (Fei et al., 2004. Cáncer Cell. Dec;6(6):597-609; Mellor et al., 2007. Cáncer Metástasis Rev. Dec;26(3-4):553-66).
En el contexto de la presente invención, BNIP3L se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_004322 y/o en la SEQ ID NO: 14, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 14,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 14, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína BN I P3L. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 004331 .2.
El gen PCDH9 o "protocadherín 9", (BNIP3a, NIX) es un gen que codifica para una proteína de adhesión celular dependiente de calcio (protocadherina) y alterada en cáncer de páncreas (Hidalgo, 2010. Pancreatic Cáncer. N Engl J Med 362:1605-17).
En el contexto de la presente invención, PCDH9 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_065136 y/o en la SEQ ID NO: 15, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 15,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 15, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína PCDH9. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 020403.4 o NM 203487.2.
El gen FKBP1 B o "FK506 binding protein 1B, 12.6 kDa", (FKBP12.6, FKBP1 L, OTK4, PKBP1 L, PPIase) este gen codifica para una proteína miembro de la familia de las inmunofilinas, implicadas en inmunoregulación y en procesos celulares básicos como plegamiento de proteínas y su paso a través de membranas. Esta proteína es una cis-trans prolil-isomerasa que se une al inmunosupresor FK506 y a rapamicina
En el contexto de la presente invención, FKBP1 B se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_004107 y/o en la SEQ ID NO: 16, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 16,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 16, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína FKBP1 B. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 0041 16.2
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "variante" se refiere a una proteína sustancialmente homologa a cualquiera de las proteínas HLAG, ARFGAP1 , S100A2, SLC25A23, KLRG1 , GZMB, GFOD1 , GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1 , HBD, RPS5, BN I P3L, PCDH9 y/o FKBP 1 B. En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos. El término "variante" incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones postranslacionales como, por ejemplo, pero sin limitarse, glicosilación, fosforilación metilación o acilación.
Tal como aquí se utiliza, una proteína es "sustancialmente homologa" a cualquiera de las proteínas HLAG, ARFGAP1 , S100A2, SLC25A23, KLRG1 , GZMB, GFOD1 , GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1 , HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y/o FKBP1 B, cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen alineamiento con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEO ID NO: 3, SEO I D NO: 4, SEO ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ I D NO: 15, y SEQ I D NO: 16, respectivamente a como se ha descrito anteriormente; es decir, cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ I D NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, y SEQ ID NO: 16, de al menos, un 50%, típicamente de, al menos, un 80%, ventajosamente de, al menos, un 85%, preferentemente de, al menos un 90%, más preferentemente de, al menos, un 95%, y, aún más preferentemente de, al menos, un 99%. Las secuencias homologas a cualquiera de las proteínas HLAG, ARFGAP1 , S100A2, SLC25A23, KLRG1 , GZMB, GFOD1 , GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1 , HBD, RPS5, BN I P3L, PCDH9 y/o FKBP 1 B pueden ser identificadas fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias.
La expresión "funcionalmente equivalente", tal como aquí se utiliza, significa que las proteínas o el/los fragmento/s de la/s proteína/s en cuestión mantiene/n esencialmente las propiedades biológicas o inmu nológicas descritas en este documento. Dicha capacidad se puede determinar mediante métodos convencionales.
En otra realización preferida, la detección de la cantidad de cualquiera de las proteínas H LAG, ARFGAP1 , S 100A2, SLC25A23, KLRG1 , GZM B, G FO D1 , GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1 , HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y/o FKBP1 B se realiza mediante un inmunoensayo. El término "inmunoensayo", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier técnica analítica que se basa en la reacción de la conjugación de una anticuerpo con un antígeno. Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse: inmunoblot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo lineal (LIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluoresecencia, x-map o chips de proteína.
En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). El ELISA se basa en la prem isa de que u n i nm u norreactivo (antígeno o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA sándwich.
El término "compuesto marcador", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un compuesto capaz de dar lugar a una señal cromogénica, fluorogénica, radiactiva y/o quimioluminiscente que permita la detección y cuantificación de la cantidad de anticuerpos frente a los antígenos HLAG, ARFGAP1 , S100A2, SLC25A23, KLRG1 , GZMB, GFOD1 , GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1 , HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y/o FKBP1 B. El compuesto marcador se selecciona de la lista que comprende radioisótopos, enzimas, fluoróforos o cualquier molécula susceptible de ser conjugada con otra molécula o detectada y/o cuantificada de forma directa. Este compuesto marcador puede unirse al anticuerpo directamente, o a través de otro compuesto. Algunos ejemplos de compuestos marcadores que se unen directamente son, pero sin limitarse, enzimas como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, isótopos radiactivos como 32P o 35S, fluorocromos como fluoresceína o partículas metálicas, para su detección directa mediante colorimetría, auto-radiografía, fluorimetría, o metalografía respectivamente.
En otra realización preferida, el segundo método de la invención además comprende asignar al individuo según el paso (a) al grupo de individuos intervenidos quirúrgicamente y a los que siete días después de realizada ésta se les toma muestra de sangre periférica cuando presenta una cantidad de producto de expresión de los genes HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, detectado en el paso (b) mayor y estadísticamente significativa en comparación con una cantidad de referencia (que se obtiene del grupo control individuos con cáncer de páncreas antes de una intervención quirúrgica).
A su vez, atendiendo a los métodos de la presente invención, se podrían establecer otras subclasificaciones dentro de esta principal, facilitando, por tanto, la elección y el esta bl eci m iento de regímenes terapéuticos adecuados. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 1 00% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad q ue es significativamente estad ística puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student o funciones discriminantes de Fisher. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1 , de 0,05, de 0,01 , de 0,005 o de 0,0001 . Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80%, o en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.
La quimioterapia actual es muy eficaz en los primeros estadios. El método de la presente invención permite el diagnóstico precoz, y por tanto, adelantar significativamente el inicio del tratamiento.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de seguimiento de la evolución del cáncer de páncreas, de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende:
a) tomar una muestra biológica aislada de un individuo,
b) detectar la cantidad de producto de expresión de, al menos, uno de los genes que se seleccionan de la lista que comprende HLAG, ARFGAP1 , S100A2, SLC25A23, KLRG1 , GZMB, GFOD1 , GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1 , H BD, RPS5, BN I P3L, PCDH9 y FKBP 1 B, o cualquiera de sus combinaciones, en la muestra biológica aislada de (a).
c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia, y
d) repetir al menos dos veces la secuencia de pasos (a) - (c) en muestras obtenidas del mismo individuo según el paso (a), de manera no simultánea.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) se obtiene de sangre periférica, y/o comprende células de sangre periférica {peripheral blood cells PBCs).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección del producto de expresión de al menos un gen que se selecciona de la lista que comprende: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, se realiza mediante RT-PCR.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección del producto de expresión de al menos un gen que se selecciona de la lista que comprende: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, se realiza mediante un microarray.
El término "seguimiento de la evolución", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere, a la supervisión del desarrollo de la enfermedad, como por ejemplo, pero sin limitarse, la evaluación de la respuesta a un determinado tratamiento del cáncer de páncreas, o a una intervención quirúrgica. Por tanto, en una realización preferida de este aspecto de la invención, el seguimiento se realiza post-tratamiento.
En una realización preferida, la detección de los productos de expresión se realiza de al menos dos, preferiblemente tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce trece, catorce, quince, y aún más preferiblemente los dieciséis genes HLAG, ARFGAP1, S 100A2, SLC25A23, KLRG 1, GZMB, GFOD 1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1 B. En otra realización más preferida, la detección de los productos de expresión de los genes HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B se realiza simultáneamente.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para analizar la cantidad del producto de expresión de los genes de la lista que comprende: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones.
Más preferiblemente comprende los medios necesarios para comparar la cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia.
Aún más preferiblemente, el kit de la presente invención comprende los elementos necesarios para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la presente invención.
Dicho kit puede contener todos aquellos reactivos necesarios para analizar la cantidad cantidad del producto de expresión de los genes HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, por medio de cualquiera de los métodos descritos anteriormente en este documento. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación , tampones, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico o seguimiento del cáncer de páncreas.
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aqu í de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxiribonucleótidos (ADN ó DNA).
Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aqu í de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Visualización de los 3 tubos con estabilizador de RNA para cada paciente y tiempo.
Fig. 2. Expresión génica. Sobre-expresión superior a dos veces respecto a los voluntarios sanos (>2-fold, p<0,05) y de la sub-expresión. (A) Antes de la intervención. (B) A los 7 días de la intervención quirúrgica.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de los métodos de la invención para obtener datos útiles en el diagnóstico de la enfermedad de Chagas, y para el diagnóstico y el seguimiento de dicha enfermedad.
MATERIALES Y MÉTODOS
Pacientes y Métodos
Estudio aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica del Hospital Universitario Virgen de las Nieves de Granada, en el cual se han estudiado cuatro pacientes con adenocarcinoma de páncreas comparando con un grupo de cinco voluntarios sanos. Las muestras de sangre periférica se obtuvieron antes de la intervención quirúrgica (T0) y a los siete días de realizada ésta (T7d) utilizando para cada paciente y tiempo de toma de muestra, tres tubos que contienen un estabilizador de RNA. Una vez extraído, se procede a la purificación de este RNA comprobándose su calidad en un bioanalizador, de modo que las muestras de RNA cuya razón 28S/1 8S no sea del orden de 1 ,5 son desechadas. A continuación se procede a realizar la reacción de transcripción inversa, así como a marcar los cRNA obtenidos con Cy5-streptavidina, procediéndose a hibridar éstos en los microarrays de genoma completo humano del sistema CodeLink. Cada microarray se realiza por duplicado cargando 2 μg de cRNA de cada paciente, para compararlo con 2 μg de cRNA de los voluntarios sanos. Una vez finalizada la hibridación durante un periodo de 12h y a 37°C, se realizó la lectura de los microarrays en un láser escáner, procediéndose a la cuantificación y normalización de los valores obtenidos mediante el software CodeLink 5.0.
De cada paciente partici pante en el estudio se obtuvieron antes de la intervención quirúrgica (T0) y 7 días después de ésta (T7d) 18 mi de sangre periférica distribuidos del siguiente modo: 12 mi para la obtención de ARN, 6 mi para un estudio de bioquímica sérica de los parámetros lipasa, amilasa, γ-glutamil transferasa (GGT) y alanin-L-transferasa (ALT=GPT) como indicadores de funcionalidad pancreática, y 6 mi para realización de un hemograma completo así como fórmula leucocitaria. El perfil de expresión génica se estudió mediante bioarrays del sistema CodeLink (Applied Microarrays, Tempe, AZ, USA) a partir de RNA total de sangre periférica obtenido con Paxgene Blood RNA Tubes (PreAnalytix, Qiagen, The Netherlands) y purificado con Paxgene Blood RNA kit (Qiagen, The Netherlands). La calidad del RNA obtenido se midió mediante microfluídica en un bioanalizador (Experion, Bio-Rad, Richmond, VI, USA). La fluorescencia de los bioarrays se determinó en un escáner GenePix-4000B (Axon I nstruments). Los datos se procesaron con el software de la plataforma CodeLink 5.0 (GE Healthcare).
Resultados
Antes de la intervención quirúrgica (T0), y comparando con los voluntarios sanos, se han detectado 176 genes con un nivel de sobre-expresión superior a 2 veces (p<0,05), entre los cuales se encuentran: HLAG, implicado en la presentación de antígenos al sistema inmune; ARFGAP1 , proteína activadora de GTPasa que interacciona con el factor de ribosilación ARF1 ; S100A2, implicado en la regulación de procesos como ciclo celular y diferenciación; SLC25A23, transportador mitocondrial de solutos dependiente de Ca; KLRG1 , que desempeña un papel inhibidor de las células "natural killer" (N K); GZM B, implicado en inducción de apoptosis; GFOD1 , una glucosa-fructosa oxidoreductasa; GPI , glucosa fosfato isomerasa que además de función glicolítica puede actuar como una citoquina segregada por tumores y como factor angiogénico; GPR56, receptor ligado a proteína G cuya sobre-expresión puede suprimir crecimiento tumoral y metástasis; MUC20, que codifica para una mucina, glicoproteína que forma una barrera mucosa insoluble. Después de la intervención, T7d , comparando con T0, se han detectado 1 1 genes con una sobre-expresión superior a 2 veces (p<0,05), entre los que se encuentran: HBD, hemoglobina delta, implicada en el transporte de oxígeno desde el pulmón a otros tejidos periféricos; RPS5, que codifica para una proteína ribosomal cuya expresión variable se ha detectado en cáncer colorrectal, si bien no se ha relacionado con la severidad de la enfermedad.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . El uso de uno de los genes que se seleccionan de la lista que comprende HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico, o seguimiento del cáncer de páncreas.
2. Un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico , pronóstico, o seguimiento del cáncer de páncreas, que comprende:
a. obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y b. detectar la cantidad de producto de expresión de, al menos, uno de los genes que se seleccionan de la lista que comprende HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, en la muestra biológica aislada de (a).
3. El método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico o seguimiento del cáncer de páncreas según la reivindicación anterior, que además comprende
c. comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia.
4. Un método de diagnóstico, pronóstico o seguimiento del cáncer de páncreas, que comprende los pasos (a) - (c) del método según la reivindicación 3, y además comprende:
d. asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos con cáncer de páncreas cuando presenta un nivel de expresión dos veces superior al de los individuos sanos.
5. Un método de seguimiento de la evolución del cáncer de páncreas, que comprende los pasos (a) - (c) del método según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, y además:
d. repetir al menos dos veces la secuencia de pasos (a) - (c) en muestras obtenidas del mismo individuo según el paso (a), de manera no simultánea.
6. Un método que comprende los pasos (a) - (c) del método según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, que además comprende asignar al individuo de (a) al grupo de individuos intervenidos quirúrgicamente de cáncer de páncreas a los que se toma muestra de sangre periférica siete días después de efectuada la intervención quirúrgica, cuando presenta un nivel de expresión de un gen que se selecciona de la lista que comprende: HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, dos veces superior al de los individuos sanos.
7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-6, donde la muestra se obtiene de sangre periférica.
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-7, donde la detección del producto de expresión de al menos un gen que se selecciona de la lista que comprende: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1 , o cualquiera de sus combinaciones, se realiza mediante RT-PCR.
9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-8, donde la detección del producto de expresión de al menos un gen que se selecciona de la lista que comprende: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, se realiza mediante un microarray.
10. Un kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo un método según cualquiera de las reivindicaciones 2-9.
1 1 . Un kit o dispositivo comprende los elementos necesarios para detectar el producto de expresión de un gen que se selecciona de la lista que comprende: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones.
12. El uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 10-1 1 , para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico o seguimiento del cáncer de páncreas.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105829893A (zh) * 2013-06-14 2016-08-03 西班牙格拉纳达大学 用于胰腺癌诊断及治疗响应的生物标记物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DOWNS-KELLY A. ET AL.: "The role of HLA-G in gastrointestinal inflammatory disease and malignancy.", SEMINARS IN CANCER BIOLOGY, vol. 17, 2007, pages 451 - 458 *
HANSEL D. E. ET AL.: "HLA-G upregulation in pre-malignant and malignant lesions of the gastrointestinal tract.", INTERNATIONAL JOURNAL OF GASTROINTESTINAL CANCER, vol. 35, 2005, pages 15 - 24 *
PISTOIA V. ET AL.: "Soluble HLA-G: Are they clinically relevant?", SEMINARS IN CANCER BIOLOGY, vol. 17, 2007, pages 469 - 479 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109120471A (zh) * 2018-07-24 2019-01-01 储晓慧 一种基于区块链的通信网络交换机智能检测系统
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