WO2012053515A1

WO2012053515A1 - ゲル粒子測定試薬及びこれを用いた測定方法

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Publication number: WO2012053515A1
Application number: PCT/JP2011/073945
Authority: WO
Inventors: 小幡　徹; 正和土谷
Original assignee: Obata Toru; Tsuchiya Masakazu
Priority date: 2010-10-18
Filing date: 2011-10-18
Publication date: 2012-04-26
Also published as: CN103168243B; KR20130116868A; JP5319842B2; JPWO2012053515A1; EP2631655B1; EP2631655A4; CN103168243A; KR101512576B1; EP2631655A1; US20130203177A1; US8969092B2

Abstract

【課題】ゲル粒子の生成開始時点を早期に測定する上で有効なゲル粒子測定試薬を提供する。【解決手段】ゲル粒子測定試薬Ｒは、測定対象である目的物質Ｓｔが含まれる試料Ｓに混合され、前記目的物質Ｓｔをゲル粒子化する上で使用されるものであって、前記目的物質Ｓｔとの間でゲル化反応する試薬基剤１と、この試薬基剤１に添加され、前記試料Ｓに対して可溶性を有し且つ０．００２ないし１％の濃度で溶解すると共に、所定範囲の粒子サイズに集中したゲル粒子Ｇの生成を促進する生物的に不活性な粒子形成促進因子２とを含むものである。

Description

ゲル粒子測定試薬及びこれを用いた測定方法

　本発明は、ゲル化反応によって測定対象の試料中のエンドトキシンやβ－D－グルカンなどの目的物質をゲル粒子化する上で使用されるゲル粒子測定試薬に係り、特に、ゲル粒子が出現し始める時点を早急に測定することを企図したゲル粒子測定試薬及びこれを用いた測定方法に関する。

　エンドトキシン（内毒素）と呼ばれるものは、主としてグラム染色に染まらない（グラム陰性）細菌類の菌体の膜成分の一部で、その成分はリポポリサッカライドと呼ばれる脂質多糖類、具体的には、リピドＡ（Lipid Ａ）と呼ばれる脂質と多糖鎖が２－ケト－３－デオキシオクトン酸（ＫＤＯ）を介して結合したリポ多糖（ＬＰＳ）であるが、そこに含まれるリピドＡ（Lipid Ａ）と呼ばれる脂質構造部分が、感染により人の体内に入ったときに細胞の受容体と結合して炎症を引き起こし、多くの場合様々な重篤な臨床症状を引き起こす。このように、エンドトキシンは、人において敗血症や菌血症という致死率の非常に高い臨床症状の原因となる物質であるため、体内に入ったエンドトキシンの推定をすることは臨床的に要求の高いことである。
　また、医薬品（注射剤等）や血液製剤・医療用具（血管カテーテル等）あるいは人工透析における大量の精製水などはエンドトキシンによる汚染がないこと（パイロジェンフリー）が重要であり、細菌を用いて調製した医薬品（組み換えタンパク質、遺伝子治療に用いるＤＮＡ等）や食品添加物・化粧品などではエンドトキシンを適正に除去または制御することが不可欠になっている。

　このエンドトキシンの除去確認、あるいは救急医学における計測は、測定試料数の多さばかりでなく、救命治療という目的にかなった迅速性が求められている。
　敗血症などの治療のため、エンドトキシン値を計ろうとする研究は古くよりなされ、アメリカカブトガニ（Limulus）のアメーバ状血球成分に含まれる因子群が、エンドトキシンに特異的に反応し、凝集塊となって傷口をふさぐという現象が発見されてから、このリムルスのアメーバ状血球水解物（Limulus Amebocyte Lysate；ＬＡＬ試薬又はリムルス試薬）を用いてエンドトキシンの定量をする試みがなされている。

　最初にリムルス試薬を使った測定法は、単に試料となる患者の血漿を混合して静置し、一定時間後に転倒して混合溶液のゲル化の有無を溶液が固まることで確認し、ゲル化を起こすための最大希釈率でエンドトキシン量を推定する所謂ゲル化法と呼ばれる半定量の測定法であった。
　その後、ゲル化反応の過程における濁度増加に着目し、光学的な計測方法を用いた濁度計で、静置した混合溶液のゲル化反応に伴う濁度変化によりエンドトキシン濃度を定量測定する比濁時間分析法が知られている。
　また、リムルス試薬による反応過程の最終段階でコアギュロゲン（Coagulogen）がコアグリン（Coagulin）に転換するゲル化反応を合成基質の発色反応に置き換えた発色合成基質法も既に知られている。これは、凝固過程における凝固前駆物質（コアギュロゲン：Coagulogen）の代わりに発色合成基質（Boc-Leu-Gly-Arg-p-ニトロアリニド）を加えることにより、その加水分解でp-ニトロアニリンが遊離され、その黄色発色の比色によりコアギュロゲン分解能を測り、エンドトキシン濃度を測定するものである。

　更に、従来におけるエンドトキシンの測定方法としては、例えば特許文献１～５に記載のものが既に使用されている。
　特許文献１は、水溶液中のエンドトキシン濃度を長時間に渡って精度よく測定するために、エンドトキシンを含む水溶液に、エンドトキシンに親和性を有し、且つエンドトキシンとカブトガニの血球成分液との反応を阻害又は促進する性質を有さない水溶液のタンパク質を共存させる水溶液中のエンドトキシンの安定化方法である。
　特許文献２は、エンドトキシンの活性を抑制するために、エンドトキシンを含む試料に、エンドトキシンと結合してエンドトキシンの活性を抑制する性質を有するペプチド誘導体(又は蛋白質)と界面活性剤とを共存させる方法である。
　特許文献３は、比濁時間分析方法を利用してエンドトキシン等を高感度に検出するために、所定の水溶性ポリマーの共存下で、カブトガニの血球成分と、エンドトキシン又はβ－D－グルカンを含有する試料とを混合し、光学変化の程度が所定値に到達するまでの時間を測定し、得られた時間とエンドトキシン等の量との相関関係に基づいて、試料中のエンドトキシン等の量を求める方法である。
　特許文献４は、エンドトキシンやβ－D－グルカンなど、ゲル化反応により測定される物質の濃度を短時間で正確に測定するために、ゲル化反応によって試料中の目的物質を測定する測定装置において、測定目的の物質を含む検体とゲル化を生ずる試薬を含む溶液を収容する試料セルに対して、発光ダイオードの照明光を照射し、試料中の溶液は撹拌棒により撹拌され微小且つ均一なゲル粒子を生成させ、照明光中を通過させる。そして。試料セル中で生成するゲル粒子の透過光をダイオードで検出し、この透過光検出出力に基づき、産生するゲル粒子の大きさ及び量の変化を測ることで、溶液中の前記物質の濃度を測定する技術である。
　特許文献５は、試料セルと、この試料セル内に予め収容され且つ試料中の目的物質と反応してゲル化する試薬と、試料セルに予め収容され且つ注入された試料及び試薬からなる混合溶液全体がゲル化するのを抑制するように混合溶液を撹拌する撹拌部材と、試料セル内に前記試薬及び撹拌部材が収容された状態で試料セルの開口を密封すると共に密封後試料セル内に試料が注入可能な密封部材とを備え、試料セル内に試料が注入された時点で撹拌部材による撹拌動作を開始し、混合溶液全体がゲル化するのを抑制した状態でゲル粒子を生成する技術である。

　更に、ゲル化反応を利用した測定技術は、前述したエンドトキシンのみならず、β－D－グルカン（β－D－glucan）などの測定にも利用される。
　β－D－グルカン（β－D－glucan）は真菌に特徴的な細胞膜を構成しているポリサッカライド（多糖体）である。このβ－D－グルカンを測定することにより、カンジダやアスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、まれな真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングなどで有効である。
　このβ－D－グルカンの測定においても、カブトガニの血球抽出成分がβ－D－グルカンによってゲル化することが利用されており、上述したゲル化法や比濁時間分析法、発色合成基質法によって測定される。
　エンドトキシンやβ－D－グルカンの測定手法には共通点があり、例えば略同様の測定ハードウェアを用い、カブトガニの血球抽出成分中からβ－D－グルカン特異的に反応するFactor G成分を除くことによりエンドトキシンに選択的なゲル化反応や発色反応が測定でき、また、試料中のエンドトキシンに前処理により不活性化することにより、β－D－グルカンに選択的なゲル化反応や発色反応を測定することが可能である。

特許第２８１７６０６号公報(発明の構成) 特許第３１０６８３９公報（発明の構成）特許第３３２７０７６号公報（発明の構成）ＷＯ２００８－１３９５４４号公報（発明の実施の形態，図１）特開２０１０－０８５２７６号公報（発明を実施するための最良の形態，図１）

　しかしながら、従来のゲル化法、比濁時間分析法及び発色合成基質法にあっては、次のような不具合がある。
　ゲル化法及び比濁時間分析法は、いずれもゲルが生成するのに低濃度では約９０分以上という長時間を要する。すなわち、反応溶液のゲル化時間は、測定対象の試料中の目的物質の濃度に比例するが、ゲル化法及び比濁時間分析法は共に感度の点から正確なゲル化開始時間などが検出できないため、ある程度のゲル化が進行するまでの時間から反応量を算出してゲル化時間の目安としている。
　例えば比濁時間分析法を例に挙げると、比濁時間分析法は、同一条件下での試薬の調製により変化の始まる最初の濃度レベルの濁度と変化の行き着く濃度レベルの濁度については分かるが、夫々のシグモイド曲線的に変化する濁度の変化の始まる時間や終わりの時間が分かり難く、最初と最後のレベルの間の一定レベルの変化到達（濁度の増加）を測ることで、ゲル化全体の変化観察に換えるということで定量法として確立されたものである。しかし、低濃度のエンドトキシンになると、系全体のゲル化が遷延し、それにつれて観測する濁度変化も遅延することから一定レベルへの変化到達が測り難くなり、その分、感度が必然的に鈍くなってしまう。
　従って、ゲル化法及び比濁時間分析法は共に救急を要する場合や多数の検体を測定するのに適した方法とは言い難い。更に、比濁時間分析法ではエンドトキシンとは無関係の非特異的濁りが生ずることがあり、測定精度に欠ける懸念がある。また、ゲル化法の測定限界濃度は３pg/ml、比濁時間分析法の測定限界濃度は１pg/ml程度である。
　尚、ゲル化反応測定装置に適用される比濁時間分析法として、仮に例えば特許文献１に示す散乱測光法を適用したとしても、溶液全体のゲル化の変化観察に換えた定量法である以上、上述した問題は解決し得ない。
　一方、発色合成基質法はゲル化法及び比濁時間分析法に比べて測定時間が約３０分程度と短時間であるが、臨床試料など天然物における測定では、人工基質を用いる弊害として混在する非特異的蛋白分解酵素による偽陽性反応が生ずる場合があり、臨床試料などにおいては特に特異度の高い測定を行うことが難しく、測定の信頼性を失うという問題を起こしている。また、測定準備が煩雑であり、測定限界濃度も３pg/mlと比濁時間分析法に劣る。

　また、特許文献１，２にあっては、いずれもエンドトキシンに対して長時間の測定を前提し、水溶液中のエンドトキシンを安定化したり、あるいは、エンドトキシンの活性化を抑制する方法を提供しているに過ぎない。
　また、特許文献３，４は比濁時間分析法を前提としたものであるため、エンドトキシンの量を求めるには、溶液全体のゲル化を起こさせ、そのゲル化速度を濁度で図り、エンドキシンの濃度を演算することが必要になってしまう。
　この点、特許文献５は本件出願人が先に出願した方式であり、例えばエンドトキシンを含む試料に試薬を混合し、混合溶液全体のゲル化を抑制しながら、ゲル粒子出現させるようにし、このゲル粒子の出現タイミングを光学的な検出手段によって検出しようとするものである。
　この方式は、例えば特許文献３，４の方式による検出対象が混合溶液全体のゲル化した状態であるのに対し、混合溶液がゾル相からゲル相へ相変化する時点に相当するゲル粒子の生成開始時点を検出対象とするものであるから、特許文献３，４の方式に比べて、短時間で混合溶液のゲル化への移行現象を高感度に捉えることが可能である点で優れている。
　本件出願人は、このような方式を更に快適に使用するために、ゾル相からゲル相への安定な相変化を制御する新規なゲル粒子測定試薬を見出し、本発明を案出するに至ったものである。

　本発明は、ゲル粒子の生成開始時点を早期に測定する上で有効なゲル粒子測定試薬及びこれを用いた測定方法を提供するものである。

　請求項１に係る発明は、測定対象である目的物質が含まれる試料に混合され、前記目的物質をゲル粒子化する上で使用されるゲル粒子測定試薬であって、前記目的物質との間でゲル化反応する試薬基剤と、この試薬基剤に添加され、前記試料に対して可溶性を有し且つ０．００２ないし１％の濃度で溶解すると共に、所定範囲の粒子サイズに集中したゲル粒子の生成を促進する生物的に不活性な粒子形成促進因子とを含むことを特徴とするゲル粒子測定試薬である。
　請求項２に係る発明は、請求項１に係るゲル粒子測定試薬において、前記粒子形成促進因子は、可溶性の熱変性蛋白質であることを特徴とするゲル粒子測定試薬である。
　請求項３に係る発明は、請求項１に係るゲル粒子測定試薬において、前記粒子形成促進因子は、可溶性で不活性な生物由来の高分子又は石油高分子化学成分由来の多孔質微粒子であることを特徴とするゲル粒子測定試薬である。
　請求項４に係る発明は、請求項１ないし３いずれかに係るゲル粒子測定試薬において、
　測定対象である目的物質はエンドトキシン又はβ－D－グルカンであり、試薬基剤はリムルス試薬であることを特徴とするゲル粒子測定試薬である。
　請求項５に係る発明は、ゲル化反応によって試料中の目的物質を粒子化して測定するゲル粒子測定方法であって、少なくとも一部に光が入射される入射部及び出射される出射部を有する試料セルに、測定対象である目的物質が含まれる試料及び前記目的物質のゲル化を生ずる請求項１ないし４いずれかに係るゲル粒子測定試薬が含まれる溶液を収容する収容工程と、この試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液全体がゲル化するのを抑制するように撹拌手段にて前記混合溶液を撹拌する撹拌工程と、前記試料セルの入射部の外部に設けられた入射光源から、前記試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液に対してコヒーレントな光を照射する光照射工程と、前記試料セルの出射部の外部に設けられた検出手段にて、前記試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液中で前記混合溶液がゾル相からゲル相へ相変化する時点に生成されるゲル粒子に対し散乱若しくは透過した光成分を検出する検出工程と、この検出工程にて得られた検出出力に基づいて混合溶液内の前記ゲル粒子の生成開始時点を判別するゲル粒子生成判別工程と、を備えたことを特徴とするゲル粒子測定方法である。

　請求項１に係る発明によれば、ゲル粒子の生成開始時点を早期に測定する上で有効なゲル粒子測定試薬を提供することができる。
　請求項２又は３に係る発明によれば、代表的な粒子形成促進因子を用い、ゲル粒子測定試薬を簡単に製造することができる。
　請求項４に係る発明によれば、測定対象の目的物質としてエンドトキシン又はβ－D－グルカンの定量に適用することができる。
　請求項５に係る発明によれば、ゲル粒子の生成開始時点を早期に測定することができる。

（ａ）は本発明が適用されるゲル粒子測定試薬の実施の形態の概要を示す説明図、（ｂ）は本実施の形態で採用されるゲル粒子測定方法を示す模式図、（ｃ）は（ｂ）の測定方法による測定原理として、ゲル化反応の進行工程における反応時間と散乱光強度との関係を示す説明図である。（ａ）は本実施の形態に係るゲル粒子測定試薬を用いた際に生ずるゲル粒子の生成過程を模式的に示す説明図、（ｂ）は比較の形態に係るゲル粒子測定試薬を用いた際に生ずるゲル粒子の生成過程を模式的に示す説明図である。リムルス試薬を用いた際のエンドトキシンのゲル化反応過程を模式的に示す説明図である。実施の形態１に係るゲル粒子測定装置を示す説明図である。（ａ）は実施の形態１で用いられるレーザ光源、後方散乱光検出器の構成例を示す説明図、（ｂ）は（ａ）の一部断面平面説明図である。（ａ）は実施の形態１で用いられる試料セルを示す分解斜視図、（ｂ）はその断面説明図である。（ａ）はゲル粒子にコヒーレント光が照射されたときの散乱光の散乱方向を示す説明図、（ｂ）はゲル粒子の粒子径の変化に伴う散乱光の光度分布を示す説明図である。実施の形態１に係るゲル粒子測定装置のデータ解析処理の一例を示すフローチャートである。（ａ）は既知のエンドトキシン濃度の試料に対して後方散乱測光によるゲル粒子の検出例を示す説明図、（ｂ）は（ａ）の結果を用いた検量線作成例を示す説明図である。（ａ）は標準品エンドトキシンを加えた水試料に対し、実施の形態１に係るゲル粒子測定装置を用いて後方散乱測光した実測データ例を示す説明図、（ｂ）は（ａ）と同様な標準品エンドトキシンを加えた水試料に対し、比較の形態１に係るゲル粒子測定装置を用いて前方散乱測光した実測データ例を示す説明図、（ｃ）は（ａ）と同様な標準品エンドトキシンを加えた水試料に対し、比較の形態２に係るゲル粒子測定装置を用いて前方透過光の実測データ例を示す説明図である。（ａ）（ｂ）は実施の形態１に係るゲル粒子測定装置の変形形態を示す説明図である。（ａ）は実施の形態２に係るゲル粒子測定装置を示す説明図、（ｂ）は（ａ）中Ｂ方向から見た矢視図である。実施の形態２に係るゲル粒子測定装置のデータ解析処理の一例を示すフローチャートである。（ａ）は既知のエンドトキシン濃度の試料に対して透過測光によるゲル粒子の検出例を示す説明図、（ｂ）は（ａ）の結果を用いた検量線作成例を示す説明図である。（ａ）～（ｃ）は、実施例１において、粒子形成促進因子として無エンドトキシンで熱変性した血漿を利用した態様で、同一エンドトキシン濃度（10pg/ml）に対するこの血漿の濃度を変化させたときのゲル粒子の生成過程を示す説明図（１）であり、（ａ）は血漿濃度が０．２％のとき、（ｂ）は血漿濃度が０．１％のとき、（ｃ）は血漿濃度が０％のときを示す。（ａ）（ｂ）は、実施例１において、粒子形成促進因子として無エンドトキシンで熱変性した血漿を利用した態様で、同一エンドトキシン濃度（10pg/ml）に対するこの血漿の濃度を変化させたときのゲル粒子の生成過程を示す説明図（２）であり、（ａ）は血漿濃度が１０％のとき、（ｂ）は血漿濃度が５％のときを示す。（ａ）（ｂ）は、実施例１において、粒子形成促進因子として無エンドトキシンで熱変性した血漿を利用した態様で、同一エンドトキシン濃度（10pg/ml）に対するこの血漿の濃度を変化させたときのゲル粒子の生成過程を示す説明図（３）であり、（ａ）は血漿濃度が１％のとき、（ｂ）は血漿濃度が０．５％のときを示す。図１５～図１７における同一エンドトキシン濃度（10pg/ml）に対する熱変性血漿蛋白質濃度とゲル粒子の生成開始に至るまでの反応時間との関係を示すグラフ図である。ゲル粒子測定試薬に粒子形成促進因子としての変性蛋白質を添加した実施例２と、ゲル粒子測定試薬に実施例２の変性蛋白質に代えて未変性蛋白質を添加した比較例に対し、濃度を変化させたときのゲル粒子の生成過程を示す説明図である。実施例２と比較例とについて、変性蛋白質、未変性蛋白質の濃度とゲル量子が生成されるに至るまでの反応時間との関係を示すグラフ図である。（ａ）～（ｃ）は、実施例３において、一定量のエンドトキシンを含む(10pg/ml)サンプル試料に対し粒子形成促進因子として精製した熱変性アルブミン（ＤＡ：Denatured Albumin）を利用した態様で、このＤＡ濃度を変化させたときに産生するゲル粒子の生成過程を示す説明図（１）であり、（ａ）はＤＡ濃度が１％のとき、(ｂ)はＤＡ濃度が０．８％のとき、（ｃ）はＤＡ濃度が０．４％のときを示す。（ａ）～（ｃ）は、実施例３において、一定量のエンドトキシンを含む(10pg/ml)サンプル試料に対し粒子形成促進因子として精製した熱変性アルブミン（ＤＡ：Denatured Albumin）を利用した態様で、このＤＡ濃度を変化させたときに産生するゲル粒子の生成過程を示す説明図（２）であり、（ａ）はＤＡ濃度が０．２％のとき、（ｂ）はＤＡ濃度が０．１％のとき、（ｃ）はＤＡ濃度が０．０５％のときを示す。（ａ）～（ｄ）は、実施例３において、一定量のエンドトキシンを含む(10pg/ml)サンプル試料に対し粒子形成促進因子として精製した熱変性アルブミン（ＤＡ：Denatured Albumin）を利用した態様で、このＤＡ濃度を変化させたときに産生するゲル粒子の生成過程を示す説明図（３）であり、（ａ）はＤＡ濃度が０．０２％のとき、（ｂ）はＤＡ濃度が０．０１％のとき、（ｃ）はＤＡ濃度が０．００１％のとき、（ｄ）はＤＡ濃度が０．０００１％を示す。図２１～図２３における実施例３のＤＡ濃度とゲル粒子の生成開始に至るまでの反応時間との関係を示すグラフ図である。実施例３において利用した粒子形成促進因子としての変性アルブミンの電子顕微鏡観察による構造を示す説明図である。ゲル粒子の生成過程に当たって変性アルブミンの果たす役割を模式的に示す説明図である。血液凝固反応での本件発明の適用例を示す説明図である。（ａ）（ｂ）は抗原抗体反応での本件発明の適用例を示す説明図である。

◎実施の形態の概要
　図１（ａ）は本発明が適用された実施の形態に係るゲル粒子測定試薬の概要を示す説明図である。
　同図において、ゲル粒子測定試薬Ｒは、測定対象である目的物質Ｓｔが含まれる試料Ｓ（図１（ｂ）参照）に混合され、前記目的物質Ｓｔをゲル粒子化する上で使用されるものであって、前記目的物質Ｓｔとの間でゲル化反応する試薬基剤１と、この試薬基剤１に添加され、前記試料Ｓに対して可溶性を有し且つ０．００２ないし１％の濃度で溶解すると共に、所定範囲の粒子サイズに集中したゲル粒子Ｇの生成を促進する生物的に不活性な粒子形成促進因子２とを含むものである。尚、本願における粒子形成促進因子２の濃度値は容量パーセント（ｖ／ｖ）で表記したものである。
　同図において、試料Ｓの目的物質Ｓｔに対し特異的に反応する試薬Ｒが存在すると、試料Ｓ中の目的物質Ｓｔの濃度に依存した割合にて、その目的物質Ｓｔが試薬Ｒと特異的に反応する現象が起こる。この反応過程において、試薬Ｒは、目的物質Ｓｔの刺激を受けて所定の因子が活性化し、これに起因して所定の酵素が活性化するタイミングで例えば水溶性のタンパク質が酵素による分解反応にて不溶性のタンパク質に転換し、ゲル粒子Ｇの出現に至ることが起こる。

　本実施の形態において、前記目的物質Ｓｔは、測定試薬Ｒとの間でゲル化反応し、ゲル粒子Ｇが生成されるものであれば広く含む。例えばエンドトキシンやβ－D－グルカンが挙げられる。
　また、試薬基剤１は、目的物質Ｓｔとゲル化反応する因子（酵素等）を含んでいればよい。例えば目的物質Ｓｔがエンドトキシンやβ－D－グルカンであれば代表的にはリムルス試薬が挙げられるが、リムルス試薬に限定されるものではなく、アメリカカブトガニ（Limulus）以外のカブトガニ類のアメーバ状血球成分に含まれる因子群がエンドトキシンやβ－D－グルカンに特異的に反応するものであれば、当該アメーバ状血球水解物を利用して試薬基剤Ｓｔを作製するようにしてもよいことは勿論である。
　更に、粒子形成促進因子２は、試料Ｓに対して可溶性であることを要する。仮に、不溶性である場合には、ゲル粒子の生成開始時点を正確に把握する点で邪魔になる懸念があるからである。
　また、粒子形成促進因子２は、ゲル粒子Ｇに至る産物（例えば酵素の産物）の凝集を促進させる凝集因子として働き、ゲル粒子Ｇの形成を促進する作用を奏するものであればよい。この場合、粒子形成促進因子２としては、ゲル粒子Ｇ形成に至るリムルス反応最終産物コアグリンを一定サイズに集積させる作用を奏するものと推測される。
　ここで、粒子形成促進因子２を加えると、図２（ａ）に模式的に示すように、時間の経過に伴って、無制限、無定型な大きさの様々な粒子サイズを生成するのではなく、所定範囲の粒子サイズ（図２では粒子サイズ１～３２のレベルに対し小さいＳサイズに偏った範囲）に集中したゲル粒子Ｇに至る産物を生成し、これが凝集してゲル粒子Ｇに早期に至るものである。ここでいう‘所定範囲の粒子サイズ’とは凝集し易い比較的小サイズのものであればよく、ある範囲内に含まれていれはよい。
　尚、参考までに、粒子形成促進因子２を加えない場合のゲル化反応におけるゲル粒子Ｇの生成過程では、図２（ｂ）に模式的に示すように、粒子サイズが所定範囲に集中しない状態でゲル粒子Ｇに至る産物を生成しており、その産物の生成タイミングも、粒子形成促進因子２を加えた場合に比べて遅いことが理解される。
　そして、粒子形成促進因子２は、０．００２～１％の濃度であることを要する。この場合、０．００２％未満である場合には、ゲル粒子Ｇの形成を促進するには不十分であり、一方、１％を超えると、過剰な粒子形成促進因子２が加わり、逆に凝集反応が抑制される傾向が見られる。これは、粒子形成促進因子２が多すぎるとコアグリン分子が分散して相互の作用が却って干渉し合う結果につながるものと推測される。
　更に、粒子形成促進因子２は生物的に不活性であることを要する。これは、例えば生物的に活性がある因子では、因子の特性が活性に伴って変化するため、因子としての作用が不安定になるばかりか、試薬基剤１による反応自体にも影響する懸念がある。

　ここで、粒子形成促進因子２の代表的態様としては、例えば可溶性の熱変性蛋白質が挙げられる。この熱変性蛋白質としては、血漿蛋白質類、酵素類、植物蛋白質類、卵白アルブミンなどを含む。例えば血漿蛋白質は希釈溶液を熱処理（例えば１２０℃・２０分高圧滅菌処理）することで可溶性の熱変性蛋白質として得られる。
　また、粒子形成促進因子２としては、粒子形成という微小なゲル化の核となる物質であればよいため、必ずしも熱変性蛋白質である必要はなく、粒子形成促進因子２としての別の代表的態様としては、生物由来の高分子又は石油高分子化学成分由来の多孔質微粒子が挙げられる。但し、これらについても、可溶性で且つ生物的に不活性であることを要する。
　前記生物由来の高分子には、例えばセルロース、多糖類、糖蛋白質などが含まれ、また、石油高分子化学成分由来の多孔質微粒子には例えばナノパーティクル樹脂などが挙げられる。

　次に、本実施の形態において、上述したゲル粒子測定試薬Ｒを用いたゲル粒子測定方法の概要について説明する。
　本実施の形態において、ゲル粒子測定方法は、図１（ｂ）に示すように、ゲル化反応によって試料Ｓ中の目的物質Ｓｔを粒子化して測定するゲル粒子測定方法であって、少なくとも一部に光が入射される入射部及び出射される出射部を有する試料セル３に、測定対象である目的物質Ｓｔが含まれる試料Ｓ及び前記目的物質Ｓｔのゲル化を生ずる上述したゲル粒子測定試薬Ｒが含まれる溶液を収容する収容工程と、この試料セル３内の試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液からなる混合溶液Ｗ全体がゲル化するのを抑制するように撹拌手段４にて前記混合溶液Ｗを撹拌する撹拌工程と、前記試料セル３の入射部の外部に設けられた入射光源５から、前記試料セル３内の試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液からなる混合溶液Ｗに対してコヒーレントな光を照射する光照射工程と、前記試料セル３の出射部の外部に設けられた検出手段６にて、前記試料セル３内の試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液からなる混合溶液Ｗ中で前記混合溶液Ｗがゾル相からゲル相へ相変化する時点に生成されるゲル粒子Ｇに対し散乱若しくは透過した光成分を検出する検出工程と、この検出工程にて得られた検出出力に基づいて混合溶液Ｗ内の前記ゲル粒子Ｇの生成開始時点を判別するゲル粒子生成判別工程と、を備える。

　このようなゲル粒子測定方法においては、試料セル３、撹拌手段４、入射光源５、検出手段６、更には図示外の制御装置（例えばコンピュータ）が用いられる。
　ここで、試料セル３は、少なくとも一部に光が入射される入射部及び出射される出射部を有するものであればよく、その形状は円筒状周壁を有するものに限られず、多角形状周壁を有するものでもよい。また、酵素反応であるリムルス反応の測定条件を一定に保つという観点からすれば、この試料セル３は図示外の恒温槽内に設けられる態様が好ましい。
　更に、撹拌手段４としては、試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液からなる混合溶液Ｗに対して撹拌作用を与えるものであれば広く含み、内蔵して直接的に撹拌する態様は勿論のこと、エアによる撹拌作用を与えたり、振盪による撹拌作用を与えるなど適宜選定して差し支えない。
　そして、撹拌手段４の撹拌の程度は、試料セル３内の試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液からなる混合溶液Ｗ全体がゲル化するのを抑制するものであることを要する。
　特に、撹拌手段４による撹拌動作を確実に行うという観点からすれば、試料セル３は、セル容器内に試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液からなる混合溶液Ｗが直接撹拌可能な撹拌手段４を内蔵したものであることが好ましい。
　更にまた、入射光源５はコヒーレントな光を照射するものであればレーザ光源によるレーザ光に限られず、例えばナトリウムランプの光のような単色光をピンホールに通すことによっても作成可能であるほか、高輝度ＬＥＤとフィルタとを用いて構成してもよい。

　また、検出手段６としては、入射光源５とは異なる部位に設けて散乱光又は透過光を検出してもよいし、あるいは、入射光源５と同じ側に設けて入射光源の後方に戻る散乱光成分を検出するようにしてもよい。
　例えば検出手段６が入射光源５とは異なる部位に設けられる態様では、透過光又は散乱光のいずれかを検出してもよいが、例えば検出手段６の配設部位が透過光及び散乱光が混在するような態様で、透過光検出方式を採用する場合には、検出手段６と試料セル３との間に、ゲル粒子Ｇで散乱した位相のずれた散乱光のうち検出手段６に向かう成分が除去される散乱光除去手段を備えた態様が好ましい。この散乱光除去手段としては、散乱光成分をカットして透過光成分のみを透過させる偏向フィルタが挙げられる。尚、逆に散乱光を検出する方式では、同様な原理で透過光除去手段にて透過光を除去する態様が好ましい。
一方、例えば検出手段６が後方散乱光を検出する場合には、入射光源５からの入射光の周りで前記後方散乱光成分を直接検出する態様でもよいし、あるいは、入射光源５からの入射光の周りの光を集め、グラスファイバ等の導光部材にて任意の場所まで導いて検出する態様でもよい。また、入射光源５から入射された光で混合溶液Ｗ中にて入射光源５側の方向に戻らない透過光又は散乱光成分が迷光として後方散乱光の検出手段６に検出されないように、迷光成分を除去する迷光除去手段（試料セル３の周壁内又は外部に光吸収材を設けたり、試料乱反射させる構造）を採用することが好ましい。

　更に、演算装置としては、上述したゲル粒子生成判別工程を具現化するものであればよく、代表的には、前記検出手段６の検出結果に基づいて検出出力の変動成分を計測し、この計測結果に基づいて前記混合溶液Ｗ内のゲル粒子Ｇの生成開始時点を判別するという手法が採用されている。
　ここで、検出光の変動成分の計測手法としては、例えば検出出力を平均化又はスムージングすると共にフィルタリング化する手法が挙げられる。
　また、演算装置としては、ゲル粒子Ｇの生成開始時点を判別するものであるが、これに限られずに、広くゲル粒子Ｇの生成状態を判別するようにしてもよい。この場合の「ゲル粒子の生成状態を判別する」とは、ゲル粒子の生成状態に関する情報を直接判別することは勿論、ゲル粒子の生成状態に基づいて判別可能な情報（例えば目的物質の定量情報）を判別することをも含むものである。ここで、ゲル粒子Ｇの生成状態とは、ゲル粒子の生成開始（出現）時点、生成過程の変化、生成終了時点、生成量などを広く含むものであるため、本実施の形態では、前記混合溶液Ｗがゾル相からゲル相へ相変化するタイミングが少なくとも含まれていれば、他の事項を含んでいても差し支えない。

　次に、図１（ｂ）に示すゲル粒子測定方法（例えば散乱光検出方式を採用）によるゲル粒子Ｇの生成開始時点の測定原理について図１（ｃ）に基づいて説明する。
　本実施の形態において、図１（ｂ）に示すように、試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液の混合溶液Ｗにゲル粒子Ｇがない場合（混合溶液Ｗがゾル相である場合に相当）には、入射光源５から照射光Ｂｍはゲル粒子によって遮られることがないため、その照射光Ｂｍがゲル粒子Ｂによって散乱することはなく、検出手段６に検出される散乱光成分はない。このため、検出手段６にて検出される散乱光強度は略０に保たれる（図１（ｃ）Ｐ_１参照）。
　そして、図１（ｂ）に示すように、試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液の混合溶液Ｗにゲル粒子Ｇが生成開始し始めた場合（混合溶液Ｗがゾル相からゲル相へ相変化し始めた場合に相当）、入射光源５から照射光Ｂｍはゲル粒子Ｇの存在によって一部遮られるため、その照射光Ｂｍが散乱することになり、その散乱光成分が検出手段６に検出されることになる。このため、検出手段６による検出出力が安定領域である０レベルから立ち上がり変化しようとする（図１（ｃ）Ｐ_２参照）。
　この後、図１（ｂ）に示すように、試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液の混合溶液Ｗにゲル粒子Ｇの生成が次第に進行していく場合には、入射光源５から照射光Ｂｍは順次生成される多くのゲル粒子Ｇの存在によって散乱度合が次第に増加することになり、検出手段６に検出される散乱光成分も次第に増加する。このため、検出手段６による検出出力が順次増加していき、検出手段６にて検出される散乱光強度は変化点Ｐ_２を境に順次立ち上がり変化していく（図１（ｃ）Ｐ_３参照）。
　上述した実施の形態では、混合溶液Ｗ中に照射された照射光Ｂｍの散乱光の変動成分に基づいて、混合溶液Ｗがゾル相からゲル相へ相変化するタイミングにつながるゲル粒子の生成開始時点（図１（ｃ）Ｐ_２に相当）を判別する態様が示されている。

　次に、エンドトキシンを例に挙げて、エンドトキシンのゲル化反応過程を模式的に示すと、図３の通りである。
　同図において、（１）に示すエンドトキシンの刺激がリムルス試薬に伝わると、先ず（２）に示すように、因子Ｃ（Factor C）が活性化されて活性化因子Ｃ（Activated Factor C）となり、次いで、活性化因子Ｃの作用により、（３）に示すように、因子Ｂ（Factor B）が活性化されて活性化因子Ｂ（Activated Factor B）になる。この後、活性化因子Ｂの作用により、（４）に示すように、Pro-Clotting酵素がClotting酵素になり、（５）に示すように、このClotting酵素がCoagulogen（水溶性タンパク質）を分解してCoagulin（不溶性タンパク質）に生成する。このCoagulin（不溶性タンパク質）は、この条件下で攪拌が行われると全体のゲル化が阻害されるに伴ってゲル粒子Ｇとして出現し、一方ここで静置すると（６）に示すように、溶液系全体が重合化・ゲル化を起こす。
　つまり、試料Ｓの目的物質Ｓｔがエンドトキシンである場合には、混合溶液Ｗに対して一定の撹拌状態を与えることで混合溶液Ｗ全体のゲル化を阻害しつつ、この状態で、リムルス試薬Ｒにエンドトキシンの刺激が伝わると、Clotting酵素の周りにCoagulin（不溶性タンパク質）のゲル粒子Ｇを産出させることが可能であり、Coagulin（不溶性タンパク質）がゲル粒子Ｇとして生成された後に、ゲル粒子Ｇが順次生成される反応過程を経ることが理解される。
　また、リムルス試薬Ｒの反応の流れ（カスケード）にエンドトキシンの刺激が伝わる速度（リムルス反応速度）はエンドトキシン濃度に依存的であり、エンドトキシン濃度が高い程リムルス反応速度が速く、Coagulin（不溶性タンパク質）からなるゲル粒子Ｇの出現タイミングが早いことが見出された。
　よって、混合溶液内で散乱光又は透過光変化を精度良く検出するようにすれば、ゲル粒子Ｇの生成開始時点として前記Coagulin（不溶性タンパク質）からなるゲル粒子Ｇの出現タイミングを把握することは可能であり、本実施の形態に係るゲル粒子測定方法の基本である。
　このようなゲル粒子測定方法は、例えば従前のゲル化法や比濁時間分析法の測定原理（リムルス試薬Ｒによる反応過程において、静置した条件下、活性化されたClotting酵素の影響で最終的に反応系の溶液全体がゲル化するに至り、この系全体が均一にゲル化する過程を濁度により定量測定する態様）とは全く相違するものである。

　一般に、臨床試料におけるエンドトキシン測定の要請は、特に救命救急という目的の下では、簡便で・早く測れることが第一に求められるゆえんである。
　従来法の比濁時間法で問題になっていた事項である‘感度の悪さによる測り落とし’と、‘測定時間の長さによる不便さ’は、上述した測定方法でより確実に解消される。
　つまり、本実施の形態に係るゲル粒子測定方法は、原理的に、均一に試料及びリムルス試薬からなる混合溶液Ｗを攪拌することで、均一な反応の下、混合溶液系全体としてではなく、局所での微小なゲル粒子を発生させ、それをレーザ光のようなコヒーレントな均一の光を当てることで散乱を起こさせ、それを検出することにより、エンドトキシンが加わったことによるゲル粒子の出現というゾル相からゲル相への相変化につながる相変化点を検出し、その相変化点に至るまでの時間を測ることにより、リムルス試薬におけるエンドトキシンの量を推量することが可能になるものである。
　要約すれば、本実施の形態に係るゲル粒子測定方法は、混合溶液系全体の変化（ゲル化）を追うことなく、相変化を起こすまでのタイミング（ゲル粒子の生成開始時点）がエンドトキシン濃度に依存的な反応であることに着眼して構成されたものであり、これにより、従来法の比濁時間法に比べて、エンドトキシンを早く検出することができるゆえんである。

　以下、添付図面に示す実施の形態に基づいてこの発明をより詳細に説明する。
◎実施の形態１
　本実施の形態１に係るゲル粒子測定装置は、エンドトキシンを含む試料が注入される試料セル１００を有し、例えば試料の目的物質としてのエンドトキシンの濃度をリムルス試薬を用いたゲル化反応にて測定するものである。
－ゲル粒子測定装置－
　本実施の形態において、ゲル粒子測定装置は図４に示すように構成されている。
　同図において、試料セル１００は、予め決められた測定ステージに設置されるが、本実施の形態では、恒温槽１１５内に配置されて試料Ｓ及び試薬Ｒからなる混合溶液Ｗを一定の恒温環境（例えば３７℃）下におき、測定条件を一定にするようになっている。
　本実施の形態では、試料Ｓは目的物質としてエンドトキシンを含むものを対象としている。
　一方、試薬Ｒは、試薬基剤として前記エンドトキシンとゲル化反応を起こすリムルス試薬と、このリムルス試薬に添加される粒子形成促進因子とを含む。ここで、粒子形成促進因子としては、試料Ｓに対して可溶性の熱変性蛋白質（例えば血漿蛋白質、卵白アルブミンなど）が用いられ、試料Ｓに対し０．００２～１％の濃度になる程度に調整されている。
　ここで、粒子形成促進因子は、リムルス試薬と一緒に提供されるものであってもよいし、あるいは、リムルス試薬とは別に提供されるようにしてもよい。前者の代表的態様としては、リムルス試薬に粒子形成促進因子が予め添加したものを例えば凍結乾燥粉末状に構成するようにしたものが挙げられ、また、後者の代表的態様としては、測定のための血液などの試料Ｒは希釈されるため、例えば凍結乾燥粉末状のリムルス試薬とは別に、粒子形成促進因子入りの希釈液という形態が挙げられる。但し、後者の態様では、粒子形成促進因子がゲル化反応時にリムルス試薬と共存するようにゲル化反応前にリムルス試薬と十分に撹拌されていることを要する。
　また、符号１２０は試料セル１００内の混合溶液Ｗを撹拌するために試料セル１００内の磁性撹拌子１２１を駆動する撹拌駆動装置であり、例えば混合溶液Ｗに対して一定の撹拌状態を与え、混合溶液Ｗを均一に撹拌しながら混合溶液Ｗ全体がゲル化するのを抑制するようになっている。
　特に、本例では、撹拌駆動装置１２０は、試料セル１００内の底壁に内蔵された磁性体からなる撹拌子（スターラーバー）１２１に対して磁力による撹拌力を作用させる撹拌駆動源（マグネチックスターラー）として構成されている。

　更に、符号１３０は試料セル１００の側周壁の外側に設けられ且つコヒーレントな光を照射するレーザ光源である。
　本例において、レーザ光源１３０からのコヒーレントな光Ｂｍは、図５（ａ）（ｂ）に示すように、試料セル１００の略直径部分を横切る経路に沿って照射されており、その光径ｄは生成されるゲル粒子径（例えば０.２～２μｍ程度）に対して十分に大きい値（例えば５～２０μｍ程度）に設定される。
　更にまた、符号１４０は試料セル１００の外部でレーザ光源１３０と同じ側に設けられ、レーザ光源１３０からの照射光Ｂｍが試料セル１００内の混合溶液中に生じたゲル粒子にて散乱した光のうちレーザ光源１３０側の方向に戻る後方散乱光成分を検出する後方散乱光検出器である。
　本例では、後方散乱光検出器１４０は、中央部に通孔１４２が開設された筒状の検出器本体１４１を有し、この検出器本体１４１の通孔１４２にはレーザ光源１３０から試料セル１００内に照射された照射光を通過させるようにすると共に、この検出器本体１４１の試料セル１００の側周壁外面に対向してリング状検出面１４３を設け、更に、この検出器本体１４１内の一部にはリング状検出面１４３にて検出された散乱光が感知可能なフォトダイオードなどの受光素子（図示せず）を組み込むようにしたものである。
　ここで、後方散乱光検出器１４０の検出精度は、レーザ光源１３０からの照射光Ｂｍの通過面積内に１ないし数個のゲル粒子の有無による後方散乱光量変化を検出可能な程度に設定されている。
　尚、後方散乱光検出器１４０のリング状検出面１４３は試料セル１００の側周壁外面に対して接触又は非接触配置されてもよいが、後方散乱光成分の検出性を良好に保つという観点からすれば、接触配置する態様が好ましい。

　更に、本実施の形態では、試料セル１００の外部で試料セル１００を挟んで前記レーザ光源１３０の反対側には迷光除去部材１５０が設けられている。
　この迷光除去部材１５０は、レーザ光源１３０から試料セル１００内に照射された照射光Ｂｍがそのまま透過して試料セル１００の反対側周壁に到達した領域及びその周辺領域に対応して光吸収材を配設したものである。
　このように試料セル１００の一部に迷光除去部材１５０を設けた理由は以下のようである。つまり、レーザ光源１３０からの照射光が例えばゲル粒子にて散乱した光のうちレーザ光源１３０側に戻る後方散乱光成分以外の散乱光成分、あるいは、発生したゲル粒子の周囲をそのまま透過する透過光成分は、試料セル１００内壁などで反射されて後方散乱光検出器１４０に向かう迷光成分になり得るが、これらの中で、特に指向性の高い迷光成分が透過光成分及び透過光成分と同じ方向に向かう散乱光成分であることから、これらに対応した箇所に迷光除去部材１５０を設けるようにしたものである。

　符号１６０は後方散乱光検出器１４０からの検出出力を取り込み、例えば図８に示すデータ解析処理を実行するデータ解析装置、１７０はデータ解析装置１６０で解析された解析結果を表示するディスプレイである。
　このデータ解析装置１６０はＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、Ｉ／Ｏインターフェースなどを含むコンピュータシステムにて構成されており、例えばＲＯＭ内に図８に示すデータ解析処理プログラムを予め格納しておき、後方散乱光検出器１４０からの検出出力に基づいてＣＰＵにてデータ解析処理プログラムを実行するものである。
　尚、後方散乱光検出器１４０からの検出出力は例えば図示外の増幅器により電流電圧変換された後、ＡＤ変換器によりＡＤ変換され、データ解析装置１６０に取り込まれる。

＜試料セルの構成例＞
　次に、本実施の形態で用いられる試料セル１００の構成例、及び、試料セル１００への撹拌子１２１、試料Ｓの導入例を図６（ａ）（ｂ）に基づいて詳述する。
　同図において、試料セル１００は、例えばガラス材料にて一体的に成形され且つ上部が開口した横断面円形の有底の筒状容器１０１からなり、その上部にフランジ部１０２を形成すると共に、このフランジ部１０２の下部にくびれ部１０３を形成し、フランジ部１０２及びくびれ部１０３には小径孔部１０４を形成し、この小径孔部１０４より大径の大径空間部１０５を内部に形成したものである。
　そして、この試料セル１００内には、エンドトキシンを含む試料とゲル化反応を生ずる試薬１０６が例えば凍結乾燥粉末状にて予め無菌的かつ無エンドトキシン的（“エンドトキシンフリー”あるいは“パイロジェンフリー”と一般的にはいわれている）に収容されると共に、磁性材料を用いた撹拌子１２１が予め収容される。
　更に、この試料セル１００の小径孔部１０４にはゴム等の弾性材料からなる密封栓１０８が嵌め込まれている。この密封栓１０８は断面略Ｔ字状に成形されており、その頭部１０８ａが試料セル１００のフランジ部１０２に載置され、その脚部１０８ｂが小径孔部１０４に密接した状態で挿入されている。尚、密封栓１０８の脚部１０８ｂの一部には切欠１０８ｃが設けられている。
　更にまた、試料セル１００のフランジ部１０２及び密封栓１０８の頭部１０８ａは例えばアルミニウム製のキャップ状の保持カバー１０９で覆われ、この保持カバー１０９は試料セル１００のフランジ部１０２の周壁に嵌り込み、密封栓１０８を外側から抱き込み保持するようになっている。そして、この保持カバー１０９の例えば中央には密封栓１０８の頭部１０８ａに面して孔部１０９ａが形成されている。

　また、試料セル１００は、図６（ａ）（ｂ）に示すように、筒状容器１０１の小径孔部１０４を開放した状態で試薬１０６及び撹拌子１２１を収容し、この状態で、筒状容器１０１の小径孔部１０４を密封栓１０８で密封すると共に、この密封栓１０８を保持カバー１０９で覆うようにしたものである。
　このような試料セル１００は、ゲル粒子測定装置の付属品や測定キットとしてユーザーに供給される。
　そして、本態様の試料セル１００の筒状容器１０１への試料Ｓの導入法としては、例えば保持カバー１０９の孔部１０９ａを利用して密封栓１０８に注射針のような穿孔具（図示せず）にて穿孔し、この穿孔を通じて注入器（図示せず）にて試料Ｓを注入するようにしたものが挙げられる。更に、試料Ｓの導入を容易に行うため、筒状容器１０１内が大気圧に対して所定の負圧レベルを保つように密封栓１０８の密封仕様を設定してもよい。

　次に、本実施の形態に係るゲル粒子測定装置の作動について説明する。
　本実施の形態において、図４に示すように、試料セル１００にエンドトキシンを含む試料Ｓを注入した後、図示外のスタートスイッチをオン操作すると、ゲル粒子測定装置による測定シーケンスが開始される。
　この測定シーケンスは、撹拌駆動装置１２０にて撹拌子１２１が回転され、試料セル１００内の試料Ｓ及びリムルス試薬からなる混合溶液Ｗを撹拌する。このため、混合溶液Ｗ全体が均一に撹拌されると共に、混合溶液Ｗ全体としてはゲル化することが抑制される。
　更に、測定シーケンスは、レーザ光源１３０からコヒーレントな光Ｂｍを試料セル１００内の混合溶液Ｗに照射し、混合溶液Ｗ中で散乱した光のうちレーザ光源１３０側の方向に向かう後方散乱光成分を後方散乱光検出器１４０にて検出すると共に、後方散乱光検出器１４０の検出出力をデータ解析装置１６０に取り込む。

　一方、試料セル１００内の混合溶液Ｗ中では、リムルス試薬にエンドトキシンの刺激が伝わり、図３に示すようなリムルス反応が起こり、混合溶液Ｗ全体のゲル化が抑制された状態で、ゲル粒子Ｇが順次生成されていく。
　本実施の形態では、レーザ光源１３０からのコヒーレントな光Ｂｍの通過面積内にゲル粒子Ｇが例えば１個生成されたときに、混合溶液Ｗがゾル相からゲル相に変化する相変化点のタイミングにつながるゲル粒子Ｇの生成開始時点として把握されるものである。
　このような反応過程において、データ解析装置１６０は、例えば図８に示すように、後方散乱光検出器１４０からの検出出力を散乱光量データ（デジタルデータ）として読み込んだ後、平均化・フィルタリング化処理を行って散乱光量データの変動成分を計測する。
　次いで、散乱光量データの変動成分に基づいて、後方散乱光検出器１４０にて検出された散乱光量データの増加変化点（図１（ｃ）Ｐ_２に相当）を抽出し、予め規定されている検量線を参照することによって試料Ｓのエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）を決定し、ディスプレイ１７０に表示する。
　本例では、検量線は、エンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）と散乱光量データの増加変化点に至るまでの時間閾値との関係を示すものであり、散乱光量データの増加変化点に至る時間と検量線との相関に基づいてエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）が決定される。また、ディスプレイ１７０にはエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）以外に、散乱光量データの時系列データ、散乱光量データの変動成分の時系列計測データなどのデータが切り換え表示されるようになっている。
　特に、本実施の形態では、試薬Ｒを工夫することにより、ゲル粒子Ｇの生成開始時点をより促進することが可能になっている。
　この点については後述する実施例にて裏付けられる。

＜検量線の作成例＞
　ここで、本実施の形態で採用された検量線の作成例について説明する。
　本実施の形態１に係るゲル粒子測定装置を用い、予め決められた実験条件を例えば以下のように定め、様々なエンドトキシン濃度（例えば１０・１・０．１pg/ml）のサンプル試料を添加したときのリムルス試薬に対して、ゲル粒子測定装置で後方散乱光検出器１４０による散乱光度（散乱光量データ）の変化を調べたものである。
　本例で用いられる実験条件は以下の通りである。
・レーザ光源１３０：赤色光又は青色光
・後方散乱光検出器１４０：フォトダイオード
・撹拌子（スターラーバー）１２１の回転数：１０００rpm
・恒温条件：３７℃
　図９（ａ）は、エンドトキシン濃度１０pg/ml、１pg/ml、０．１pg/mlのサンプル試料に対する散乱光強度につき夫々の時間経過を追ってプロットしたものである。尚、図９（ａ）の縦軸は散乱光強度（グラフ中の最大散乱光強度スケールをＵｙで表記）、横軸は反応時間（グラフ中の最大反応時間スケールをｔｘ［例えば１００min］で表記）を示す。
　同図において、各条件の散乱光強度の変化は、いずれも略０の一定のレベルを維持する部分がある時間になって増加する傾向を示している。この散乱光強度の増加変化点はゲル粒子の生成開始時点（エンドトキシンを含むサンプル試料がゾル相からゲル相へと相変化するタイミング）に相当し、ゲル化開始時による増光を意味するものと想定される。
　このゲル化開始時を求めるために、本実施の形態では、図９（ａ）のグラフにおいて、マニュアルで、一定散乱光度の部分を近似した直線（通常は０）と散乱光強度が増加傾斜していく変化部分を近似した直線との交点を求め、夫々ゲル化開始時間（反応時間）ｔ（10）、ｔ（1）、ｔ（0.1）を求めた。
　更に、本実施の形態では、図９（ａ）のグラフから求めたゲル化開始時間ｔ（10）、ｔ（1）、ｔ（0.1）の値を用いて検量線を作成するようにした（図９（ｂ）参照）。
　図９（ｂ）において、検量線は、Ｘ軸をエンドトキシン濃度であるＥＴＸ濃度（log変換）、Ｙ軸をゲル化開始時間として各ゲル化開始時間の値をプロットし、これらの値に対して最小自乗法による直線を描くことで求められるものである。このとき、各エンドトキシン濃度のサンプル試料に対するゲル化開始時間の値には直線関係が得られ、相関係数の高い相関が示される。

　ちなみに、本実施の形態で求めた検量線の一例を示すと、以下の通りである。
　エンドトキシン濃度（pg/ml）ゲル化開始時間（min.）
　　　１０pg/ml：ｔ（10）＝１２（min.）
　　　　１pg/ml：ｔ（1）＝２０（min.）
　　０．１pg/ml：ｔ（0.1）＝７０（min.）
　これに対し、和光純薬工業株式会社製の比濁時間分析法を採用したエンドトキシンキット（ゲル化反応測定装置）を用い、エンドトキシン濃度とゲル化時間とを調べたところ、以下のような結果が得られた。
　エンドトキシン濃度（pg/ml）　　　　　ゲル化時間（min.）
　　　１０．０　　　　　　　　　　　　　　　１８．０
　　　　１．０　　　　　　　　　　　　　　　４１．８
　　　　０．５　　　　　　　　　　　　　　　５６．３
　　　　０．１　　　　　　　　　　　　　　１２３．７

　このように、本実施の形態においては、ゲル粒子測定装置は、試料Ｓ及びリムルス試薬からなる混合溶液Ｗを所定の恒温環境下で撹拌し、混合溶液Ｗ中に産生するCoagulin粒子からなるゲル粒子Ｇの出現によって照射光Ｂｍが一部遮られて散乱する光のうちレーザ光源１３０側の後方に戻る後方散乱光成分を検出し、ゲル化の開始時期を捉えようとするものである。
　つまり、本実施の形態では、後方散乱光成分を検出する方式を採用しているが、他の散乱光成分を検出する方式に比べて、ゲル粒子の生成開始時点を把握する上で有効である。
　本実施の形態において、散乱光のうち入射光源側の後方に戻る後方散乱光成分に着眼した理由は以下の通りである。
　一般に、図７（ａ）に示すように、粒子に例えばレーザ光等のコヒーレントな均一の光（コヒーレント光）が照射されたモデルを想定すると、コヒーレント光は粒子の存在によって散乱することは広く知られている。このような散乱現象において、粒子の大きさと散乱光の関係とについて調べたところ、単一光の入射によって生じる散乱光の強さ及び方向性は例えば図７（ｂ）に示すような関係が見られる。同図において、散乱現象としては、粒子に対して入射した光と同方向に発生する前方散乱、入射した光と直角方向に発生する側方散乱、そして入射光と反対の方向に発生する後方散乱がある。
　このような散乱現象においては、発生するエネルギはさておき、粒子の大きさと散乱の方向を考えると、粒子が大きくなるほど前方散乱が主になり、粒子が小さいと後方散乱を含めた全方位への散乱が観察される。このような観察結果からすれば、大きな粒子を捉えるには前方散乱が有利と言える。一方、無の状態から発生し、成長するという現象の下、最初に発生する小さな粒子を早く捉えるためには、どの方向でもよいとはいえるが、エネルギが小さいことを考えると、粒子の存在する溶媒中における散乱光の減衰を考慮したときには、その減衰の少ない（溶媒の影響による吸収の少ない）後方散乱が適していると考えられる。
　とりわけ、本実施の形態でのゲル粒子測定装置は、無から生成する粒子（ゲル化という相変位）を捉えるため、なるべく早く発生する微小な粒子を検出するという目的に、試料セル直後での後方散乱によるゲル粒子検出は他のいかなる方向の散乱検出よりも優っているものと推測される。
　このように、リムルス試薬による相変化によって出現する微小粒子を、早く感度よく検出することを目的として、後方散乱による検出方式を採用することで前記相変化のタイミングをより測ろうとするものである。
　要するに、微小粒子出現により発生する散乱光のうち後方散乱光成分を検出する方式は、小さな粒子を早く検出できることと、粒子の浮遊する溶媒による減衰無く散乱光を検出することができることの２つが優れている点である。また、入射光源からの入射光が通過する光路を基本的に設定する必要のないことから、装置の機構もより簡単なものにすることが出来ることも優れている点の１つである。
　また、本例では、後方散乱光検出器１４０の検出精度を高感度にするため、レーザ光というコヒーレントで強い光を利用し、また、微細な変化を検出するために、低濃度での変化では特に散乱した光のうち、後方散乱光以外の散乱光とゲル粒子の周囲をそのまま透過した透過光が迷光として後方散乱光検出器１４０側に向かわないように、迷光除去部材１５０にて迷光が除去されることから、後方散乱光検出器１４０にはレーザ光源１３０からの照射光Ｂｍのうちゲル粒子で散乱した後方散乱光成分だけが入射することになり、その分、後方散乱光変化が正確に検出される。

　実際に、実施の形態１に係るゲル粒子測定装置を具現化したモデル装置を用いて後方散乱検出による後方散乱光変化を測定したところ、以下のような結果が得られた。
◎実施の形態１についての測定例
　実施の形態１に係るゲル粒子装置は、水に標準品エンドトキシン１０ｐｇ／ｍｌを添加した試料サンプルを用意し、この試料サンプルに対し後方散乱光の変化を時系列で測定したものである。
　結果については図１０（ａ）に示す。尚、同図の縦軸は相対散乱光強度、横軸は時間（sec.）である。
◎比較の形態１についての測定例
　比較の形態１に係るゲル粒子測定装置（後方散乱光とは反対側の前方に向かう前方散乱光を検出する前方散乱検出器を使用した態様）は、実施の形態１で用いられる試料サンプルと同様な試料サンプルに対し、後方散乱光とは反対側の前方に向かう前方散乱光の変化を時系列で測定したものである。
　結果については図１０（ｂ）に示す。尚、同図の縦軸は相対散乱光強度、横軸は時間（sec.）である。
◎比較の形態２についての測定例
　比較の形態２に係るゲル粒子測定装置（後方散乱光とは反対側の前方に向かう透過光を検出する透過光検出器を使用した態様）は、実施の形態１で用いられる試料サンプルに対し、後方散乱光とは反対側の前方に向かう透過光（本例では前方散乱光を含む）の変化を時系列で測定したものである。
　結果については図１０（ｃ）に示す。尚、同図の縦軸は透過光強度、横軸は時間（sec.）である。
＜実施の形態１と比較の形態１，２との対比＞
　実施の形態１と比較の形態１とを対比してみるに、どれも、比較の形態２における透過光減少からみた試料サンプルの相変化のタイミングと比較して、比較の形態１に係る前方散乱光による試料サンプルの相変化のタイミングに相当するゲル化開始時点（散乱光度の増加変化点）は、実施の形態１に係る後方散乱光による試料サンプルの相変化のタイミングに相当するゲル化開始時点（散乱光度の増加変化点）よりも検出開始が遅れている傾向（約１０～４０秒）が見られる。
　このように、後方散乱検出での優位性（迅速性）は、低濃度のエンドトキシンにおいて顕著に見られる。

◎変形形態
　本実施の形態では、試料セル１００の外部で当該試料セル１００を挟んでレーザ光源１３０と反対側に迷光除去部材１５０を配設するようにしているが、これに限られるものではなく、例えば図１１（ａ）に示すように、試料セル１００の周囲を囲繞するように筒状カバー１５１を設置し、この筒状カバー１５１の内面を例えば黒色の光吸収材で覆うと共に、筒状カバー１５１の一部には後方散乱光検出器１４０を装着するための取付孔１５２を開設し、この取付孔１５２に後方散乱光検出器１４０を装着し、後方散乱光検出器１４０の通孔１４２を通じてレーザ光源１３０からの照射光Ｂｍを通過させるようにしてもよい。
　また、本実施の形態では、試料セル１００は透過性のある材料にて構成されているが、試料セル１００内の混合溶液Ｗ中での光の透過をほとんど求めないため、試料セル１００のうちレーザ光源１３０及び後方散乱光検出器１４０の設置箇所に対応した一部だけ透過性を有する入射部としておけば、試料セル１００の他の部位については非透過性の材料で構成してもよいし、非透過性の塗料を塗布するようにしてもよい。
　更に、本実施の形態では、レーザ光源１３０と後方散乱光検出器１４０とを別ユニットとして構成しているが、例えば図１１（ｂ）に示すように、レーザ光源１３０の周囲を囲繞するように導光部材としての多数の光透過性グラスファイバ１４５を束ね、各グラスファイバ１４５の試料セル１００側の一端部を光導入面１４６として機能させると共に、各グラスファイバ１４５の他端部に対向して検出面が配置されるように後方散乱光検出器１４０を設け、レーザ光源１３０、後方散乱光検出器１４０及び導光部材としてのグラスファイバ１４５を用いて光学検出ユニットを一体的に構成するようにしてもよい。
　更にまた、迷光除去部材１５０は試料セル１００の外部に設ける態様に限られるものではなく、例えば図１１（ｂ）に示すように、試料セル１００の内壁周面に迷光除去部材１５０として微小粗面１５５を形成し、この微小粗面１５５にてレーザ光源１３０から照射された照射光のうち迷光成分を乱反射させることで減衰させるようにしてもよい。
　尚、本実施の形態では、迷光除去部材１５０を設けているが、必ずしも迷光除去部材１５０を用いる必要はなく、例えば予め迷光成分がどの程度影響するかを既知のエンドトキシン濃度のサンプル試料を用いて実測し、この実測値に基づいて例えば後方散乱光検出器１４０による検出出力から実測した迷光成分を補正するようにしてもよい。
　また、本実施の形態では、一検体（試料Ｓ）分の試料セル１００に対するゲル粒子測定装置を示しているが、複数の検体（試料）を同時に処理するという要請下では、例えば複数の試料セル１００を一体化したマルチ試料セルを用意し、各試料セルに対応して夫々レーザ光源１３０、後方散乱光検出器１４０を配置し、複数の検体（試料）を同時に測定できるようにすればよい。
　更に、実施の形態１では、測定対象の物質をエンドトキシンとするものが開示されているが、これに限られるものではなく、例えば同じ測定ハードウェアで、かつ、同様ないしは類似のリムルス試薬を用い、測定対象の物質をβ－D－グルカンとすることも可能である。

◎実施の形態２
　図１２は本発明が適用されたゲル粒子測定装置の実施の形態２の要部を示す。尚、実施の形態１と同様な構成要素については、実施の形態１と同様な符号を付し、その詳細な説明は省略する。
　同図において、ゲル粒子測定装置は、実施の形態１と略同様に、試料セル１００の外部にレーザ光源１３０を有し、このレーザ光源１３０と同じ側に前記後方散乱光検出器１４０を設置したものであるが、実施の形態１と異なり、試料セル１００の外部で例えば試料セル１００を挟んでレーザ光源１３０とは反対側に例えば透過光検出器１８０を設置し、この透過光検出器１８０の検出出力をデータ解析装置１６０に取込み、透過光検出器１８０による検出出力に基づいて実施の形態１と同様にゲル粒子の生成開始時点を判別するようにしたものである。
　本例では、透過光検出器１８０は、レーザ光源Ｂｍからの光束領域を検出可能な検出面を有し、この透過光検出器１８０の検出精度は、透過光Ｂｍの通過面積に存在する１ないし数個のゲル粒子Ｇの有無による透過光量変化を検出可能な程度に設定される。
　更に、本実施の形態では、試料セル１００と透過光検出器１８０との間に偏向フィルタ１９０が配設されている。この偏光フィルタ１９０は、レーザ光源１３０からの照射光Ｂｍのうち混合溶液Ｗにて生成されたゲル粒子Ｇによって散乱した散乱光で透過光検出器１８０に向かう成分の迷光を除去するものである。この偏光フィルタ１９０による迷光除去原理は、レーザ光源１３０からのコヒーレントな光Ｂｍがゲル粒子Ｇで散乱すると、その散乱光の位相がずれることを利用し、透過光Ｂｍの位相以外の位相成分の迷光成分をカットするようにしたものである。
　また、このような偏向フィルタ１９０を用いない場合には、透過光検出器１８０は散乱光成分が含まれた透過光成分を検出することになるが、データ解析装置１６０側で散乱光成分が含まれることを考慮して透過光成分を解析するようにしてもよいし、あるいは、データ解析装置１６０側で散乱光成分を除去するように補正した後に透過光成分を解析するようにしてもよい。
　尚、本実施の形態では、透過光検出器１８０にて透過光を検出する方式を採用しているが、透過光検出器１８０に代えて散乱光検出器を用いるようにしてもよいし、更に、散乱光検出器の設置箇所についてはレーザ光源１３０に対して試料セル１００の反対側に限られるものではなく、レーザ光源１３０と異なる部位であれば任意の部位に設置して差し支えない。例えばレーザ光源１３０に対して試料セル１００の周囲方向に９０°偏倚した部位に設置するようにすれば、側方散乱光を検出することが可能である。

　次に、本実施の形態に係るゲル粒子測定装置の作動について説明する。
　本実施の形態において、図１２（ａ）（ｂ）に示すように、試薬Ｒ（本例ではリムルス試薬に実施の形態１と同様な粒子形成促進因子を添加したもの）が予め収容されている試料セル１００にエンドトキシンを含む試料Ｓを注入した後、図示外のスタートスイッチをオン操作すると、ゲル粒子測定装置による測定シーケンスが開始される。
　この測定シーケンスは、撹拌駆動装置１２０にて撹拌棒１０７が回転され、試料セル１００内の試料Ｓ及び試薬Ｒからなる混合溶液Ｗを撹拌する。このため、混合溶液Ｗ全体が均一に撹拌されると共に、混合溶液Ｗ全体としてはゲル化することが抑制される。
　更に、測定シーケンスは、レーザ光源１３０から照射光Ｂｍを照射し、試料セル１００内の混合溶液Ｗを通過した透過光Ｂｍを透過光検出器１８０にて検出すると共に、透過光検出器１８０の検出出力をデータ解析装置１６０に取り込む。
　一方、試料セル１００内では、このリムルス試薬にエンドトキシンの刺激が伝わり、図３に示すようなリムルス反応が起こり、混合溶液Ｗ全体のゲル化が抑制された状態で、ゲル粒子Ｇが順次生成されていく。
　本実施の形態では、レーザ光源１３０からの照射光Ｂｍの通過面積内にゲル粒子Ｇが例えば１個生成されたタイミングがゲル粒子Ｇの生成開始点として把握されており、透過光Ｂｍの減衰変化点又は散乱光の出現のタイミングになるものである。
　このような反応過程において、データ解析装置１６０は、例えば図１３に示すように、透過光検出器１８０からの検出出力を透過光量データ（デジタルデータ）として読み込んだ後、平均化・フィルタリング化処理を行って透過光量データの変動成分を計測する。
　次いで、透過光量データの変動成分に基づいて透過光Ｂｍの減衰変化点（図１（ｃ）のＰ_２に相当）を抽出し、予め規定されている検量線を参照することによって試料Ｓのエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）を決定し、ディスプレイ１７０に表示する。
　本例では、検量線は、エンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）と透過光Ｂｍの減衰変化点に至るまでの時間閾値との関係を示すものであり、透過光Ｂｍの減衰変化点の時間と検量線との相関に基づいてエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）が決定される。また、ディスプレイ１７０にはエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）以外に、透過光量データの時系列データ、透過光量データの変動成分の時系列計測データなどのデータが切り換え表示されるようになっている。
　尚、検量線の作成法については後述する。

　このように、本実施の形態においては、ゲル粒子測定装置は、試料Ｓ及び試薬Ｒ（リムルス試薬＋粒子形成促進因子）からなる混合溶液Ｗを所定の恒温環境下で撹拌し、混合溶液Ｗ中に産生するCoagulin粒子からなるゲル粒子Ｇの出現によって透過光Ｂｍが一部遮られて減光することまたは散乱光を検出し、ゲル化の開始時期を捉えようとするものである。
　特に、本例では、透過光検出器１８０の検出精度を高感度にするため、レーザ光というコヒーレントで強い光を利用し、また、微細な変化を検出するために、低濃度での変化では特に散乱した迷光がCoagulin粒子からなるゲル粒子Ｇに当たって位相がずれることを利用し、偏光フィルタ１９０にて迷光成分が除去されることから、透過光検出器１８０にはレーザ光源１３０からの透過光成分だけが入射することになり、その分、透過光変化が正確に検出される。

　本実施の形態で採用された検量線の作成例について説明する。
　本例での実施条件は以下の通りである。
・レーザ光源１３０：赤色光又は青色光
・透過光検出器１８０：フォトダイオード
・撹拌棒（スターラーバー）１０７の回転数：１０００rpm
・恒温条件：３７℃
　本例では、様々なエンドトキシン濃度（１０・１・０．１pg/ml）を添加したときの試薬Ｒ（リムルス試薬＋粒子形成促進因子）に対して、ゲル粒子測定装置で透過光度の変化を調べたものである。
　図１４（ａ）は、１０pg/mlは２回、１pg/ml、０．１pg/mlの夫々の時間経過を追った透過光度をプロットしたものである。
　同図において、各条件の透過光度の変化は、いずれも略一定のレベルを維持する部分がある時間になって減衰低下する傾向を示している。この透過光度の減衰変化点はゲル粒子の生成開始点（ゲル化開始時間）に相当し、ゲル化開始時による減光を意味するものと想定される。
　このゲル化開始時を求めるため、本例では、図１４（ａ）のグラフにおいて、マニュアルで、一定透過光度の部分を近似した直線と透過光度が減衰傾斜していく変化部分を近似した直線との交点を求め、夫々ゲル化開始時間（反応時間）ｔ１(10)、ｔ２(10)、ｔ(1)、ｔ(0.1)を求めた。
　本例では、１０pg/ml：ｔ１(10)＝１６（min.）
　　　　　　　　　　　ｔ２(10)＝１９（min.）
　　　　　　　１pg/ml：ｔ(1)＝２８（min.）
　　　　　０．１pg/ml：ｔ(0.1)＝７０（min.）
であった。
　そして、本例では、図１４（ａ）のグラフから求めたゲル化開始時間ｔ１(10)、ｔ２(10)、ｔ(1)、ｔ(0.1)の値を用いて検量線を作成するようにした（図１４（ｂ）参照）。
　本例の検量線は、Ｘ軸をエンドトキシン濃度であるＥＴＸ濃度（log変換）、Ｙ軸をゲル化開始時間（log変換）とすると、直線関係が得られ、相関係数－０．９８０４という高い相関が示され、この検量線の有用性が証明される。

◎実施例１（図１５～図１８）
　実施例１は、ゲル粒子測定試薬の粒子形成促進因子として不活性血漿蛋白質の影響を調べたものである。
　具体的には、エンドトキシン活性を持たない血漿を用いて、サンプル試料のエンドトキシンを希釈した。本例では、１００％～１％血漿で１０ｐｇ／ｍｌのエンドトキシンを含む溶液を作り、それを０．０２％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００水で１０倍希釈し、加熱処理（７０℃１０分）した。更に、測定時には１０倍希釈した。
　そして、最終血漿濃度が０．２％、０．１％、０％、１０％、５％、１％、０．５％の条件のものを用いて、実施の形態１に係るゲル粒子測定装置による測定を行ってゲル粒子の生成開始時点を判別すると共に、夫々の条件におけるゲル粒子の生成過程におけるゲル粒子に至る産物の粒子サイズ毎の分布を粒子分布測定装置にて測定した。ここで、粒子分布測定装置としては、側方散乱で粒子検出を行う血小板凝集計（興和社製）を用いた。
　結果を図１５～図１７に示す。
　同図において、各図の左側列の三次元グラフは、粒子サイズを１～３２のレベルに分け、各レベルに対応した粒子数を時間経過毎にカウントしたものであり、各図の右側例のグラフは左側列の三次元グラフの粒子数を小サイズ（レベル１～１５）、中サイズ（レベル１５～２３）、大サイズ（レベル２４～３２）毎に合算し、時間経過と共に表したもの及び経時的な濁度変化（－Ｘ－）である。
　また、図１５～図１７に示す各条件での血漿濃度とゲル粒子の生成開始時点までの反応時間との関係を図１８に示す。
　図１５～図１７及び図１８によれば、以下の結果が把握される。
（１）本来同一のエンドトキシンであるから、ゲル粒子の生成開始時点に至るまでの反応時間は同一になるものと想定されていたが、共存する血漿濃度によって実施例１のゲル化反応が異なることが確認された。このことから、血漿濃度が反応時間に影響を与えることが理解される。
（２）本例では、同じエンドトキシン濃度のサンプル試料に対し、最終血漿濃度１％の場合に、ゲル粒子の生成開始時点に至るまでの反応時間が最速になり、１０％の場合の方が反応が阻害されることが確認された。
（３）図１５～図１７によれば、血漿のない試料では、粒子形成が微小あるいは不揃いになっているのに対し、加熱処理した血漿は、一定の大きさの粒子を形成することを促進している傾向が見られる。本例では、血漿濃度が１０％～１％の場合にこの傾向が確認された。また、同一エンドトキシン濃度に対し、最終濃度１％加熱変性血漿が一番早くゲル粒子出現を検出した（図１８）。この加熱変性血漿成分のうち、何かがこの粒子形成促進をしていると考えられる。尚、有効成分の濃度は血漿蛋白質の濃度と１００倍希釈を考えると、血漿１％といっても有効濃度はその十～数十分の一と思われる。

◎実施例２（図１９，図２０）
　実施例１では熱変性血漿の影響を見たが、血漿成分中の何が有効であるか明らかにするため検討し、その結果アルブミン他の幾つかの成分を検討した。実施例２は、ゲル粒子測定試薬の粒子形成促進因子として変性蛋白質（熱変性蛋白質）を用いたものであり、比較例は、前記変性蛋白質に代えて、未変性蛋白質を用いたものである。
　実施の形態１に係るゲル粒子測定装置を用いて、所定濃度のエンドトキシンを含む試料に対し、実施例２、比較例のゲル粒子測定試薬によるゲル粒子測定を行った。
　このとき、試料に対する変性蛋白質、未変性蛋白質の濃度を２％、０．０２％、０．０００２％に変化しながら、夫々の条件で同一のエンドトキシン濃度の試料に対してリムルス試薬による反応を行わせた。
　結果を図１９、図２０に示す。
　図１９は、各条件でのゲル粒子の生成過程におけるゲル粒子に至る産物の粒子サイズ毎の分布を粒子分布測定装置にて測定した。ここで、粒子分布測定装置としては、実施例１と同様なものを用いた。
　また、図２０は、各条件での試料に対する変性蛋白質、未変性蛋白質の濃度とゲル粒子の生成開始に至るまでの反応時間（縦軸は１／反応時間）の関係を示すグラフである。
　実施例１において、血漿試料を１００倍希釈して反応させると、ゲル粒子の生成開始に至るまでの反応時間が最短になり、ゲル粒子の形成が促進されることから、その因子探索を行ったところ、試料処理として加熱処理を行っていることから、生物学的な蛋白質の活性はあまり考えられず、変性蛋白質の可能性について実験した。
　図２０によれば、未変性蛋白質では、添加による粒子形成促進効果はなく、変性蛋白質だけにその効果が見られた。また、濃度範囲は、濃すぎても（２％）、薄すぎても（０又は０．０００２％）でもだめで、一定の効果を得るには、ある濃度範囲（１％～０．００２％）が必要であることが確認される。
　また、変性蛋白質濃度が０．０２％である場合のゲル粒子の生成過程では、図１８に示すように、一定の大きさの粒子に集中した状態でゲル粒子が生成されていることが確認される。この点、変性蛋白質濃度が２％である場合にはゲル粒子形成が阻害され、また、０．０００２％である場合には、０．０２％の場合に比べて生成される粒子の大きさが不揃いであることが確認される。

◎実施例３（図２１～図２４）
　この現象を検討した試薬は国産（和光純薬工業製、ＬＡＬ－ＥＳ）で、様々な加工をしてあるため、リムルス試薬の原液に近い試薬（チャールスリバー社（ＣＲ）、Ｅｎｄｏｓａｆｅ）を用いて、粒子形成に関する効果を再検討した。
　実施例３は、このＣＲのゲル粒子測定試薬に一定量のエンドトキシン(10pg/ml)を加え、粒子形成促進因子として変性アルブミン（ＤＡ：Denatured Albumin）の影響を調べたものである。
　熱変性処理した精製アルブミン溶液（図２４中、Ｄｅ－Ａ２％、Ｄｅ－Ａ１％、ＤｅＮ－Ａ１％）を用いて様々な濃度１％、０．８％、０．４％、０．２％、０．１％、０．５％、０．０２％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％のＤＡを作成し、夫々の条件で同一のエンドトキシン濃度の試料に対してリムルス試薬による反応を行わせ、ゲル粒子の生成開始までの反応時間を測定すると共に、夫々の条件におけるゲル粒子の生成過程におけるゲル粒子に至る産物の粒子サイズ毎の分布を粒子分布測定装置にて測定した。ここで、粒子分布測定装置としては、実施例１と同様なものを用いた。
　図２１～図２３の上の３次元グラフは、時間軸に沿って様々な大きさの粒子（レベル１～３２）が生成される状況を示し、その下のグラフは、上の三次元グラフの粒子数を小サイズ（レベル１～１５）、中サイズ（レベル１５～２３）、大サイズ（レベル２４～３２）毎に合算し、時間経過と共に表したもの及び経時的な濁度変化（－Ｘ－）である。
　　図２４は、ＤＡ濃度とゲル粒子の生成開始に至るまでの反応時間との関係を示す。
　図２１ないし図２３において、１％（図２１（ａ））の場合と、０．０００１％（図２３（ｄ））場合、濃度が低すぎても高すぎても反応がうまくいかず、０．０２％から０．２％付近の濃度で、一定の大きさの粒子が集中していることが示されている。すなわち、ＤＡ１～０．８％では粒子の形成が不全で、非特異的な濁度上昇が発生した。一方、ＤＡ０．０１％以下では、粒子形成は制御されず、様々サイズが形成された。しかし、ＤＡ０．２～０．０２％前後では一定のサイズの粒子が効率よく形成されることが分かった。
　これらの出現時間（ゲル粒子の生成開始時間）をプロットしたものが図２４であり、０．０２％付近がゲル粒子の生成開始時間に至る反応時間が早いことが理解される。
　尚、図２４において、右の下がり部分は、高濃度の添加変性アルブミンによる非特異的な沈殿によるもので、この部分でゲル粒子が生成されたものでないことは例えば図２１（ａ）からも明らかである。
　この結果、リムルス試薬がエンドトキシンによって反応し、不溶性のコアグリン分子ができたとしても、粒子として一定の濃度に至るまで形成しない状態であるところに、この変性アルブミンが存在することで、一定の大きさに集中して粒子が形成されることが示されている。またこの因子が存在しないと、自然発生的に様々なサイズの粒子が形成されることを示している。
　すなわち、本例のゲル粒子測定方法の基本であるゲル粒子の検出については、コアグリン分子が凝集する条件で一定にし、試薬基剤に粒子形成促進因子を添加することで、粒子形成を一定条件に保ち、その条件に至るコアグリン分子の産生の検出を一定にし、これにより、エンドトキシンの定量性を確保することが可能になるのである。
　また、血漿試料では１％前後の濃度至適を示したが、血液中の血漿蛋白質濃度、さらにはその有効成分の濃度を考えると、実効濃度はその十～十数分の一以下であり、純粋な蛋白質を用いたこの検証実験から得られた濃度０．２～０．０２％とほぼ一致すると考えられる。しかし、血漿試料の蛋白質濃度は患者の状態などにより変わり、また、エンドトキシンなどの測定対象には人工透析に使う透析液のように蛋白質を含有しない試料も存在する。このゲル粒子形成が、この測定法の基本原理である以上、これらの試料において安定な定量条件を確保する意味では、その至適濃度範囲に当たる特定の粒子形成促進因子をあらかじめ加えるリムルス試薬を作ることは、必要不可欠な条件である。

＜変性アルブミンの構造＞
　実施例３において、粒子形成促進因子として用いた「変性アルブミン」の構造を調べるために、可溶性の変性アルブミン（原液１％（ｖ／ｖ））のネガティブ染色による透過型電子顕微鏡の写真を図２５に示す。
　同図によれば、熱変性を受けて変性したアルブミンが複数集まって細い繊維状の構造を作っていることが確認された。その大きさは径寸法が約１０ｎｍで５０ないし数１００ｎｍの長さの繊維構造を呈していた。
　尚、未変性のアルブミンは分子量約５０，０００の蛋白質でネガティブ染色を用いても、球状塊の構造は観察されるものの、繊維状の構造を観察することは出来ない。
＜変性アルブミンの役割＞
　図２５に示す観察結果と、粒子形成促進因子の至適濃度が０．００２％ないし１％の範囲が存在することとを勘案すると、ゲル粒子の生成に当たってコアグリン分子が凝集する条件として、この繊維状の変性アルブミンの果たす役割は、コアグリン分子がまとわりつく核（又は種子）になるものと推測される。
　つまり、図２６（ａ）に示すように、変性アルブミンＤＡが至適濃度範囲であれば、臨界に達したコアグリン分子ＣＧは適当に凝集し適正な大きさに成長した凝集塊（観察しているゲル粒子Ｇに相当）として形成されるが、核となる変性アルブミンＤＡが多すぎると、図２６（ｂ）に示すように、コアグリン分子ＣＧは分散し大きな凝集塊を形成できない。また、核となる変性アルブミンＤＡが少なすぎる場合には、図２６（ｃ）に示すように、一定サイズの凝集塊を形成できず、観察可能なゲル粒子Ｇに至るまでに余分な時間を要することにつながる懸念がある。

◎実施例４
　本実施例は、実施例３で用いた粒子形成促進因子としての変性蛋白質(変性アルブミン)とは異なるものを用い、実施例３と略同様な実験を行ったものである。
　本例では粒子形成促進因子として以下のものを用いた。
・変性アルブミン以外の他の変性蛋白質
・セルロース
・多糖類
・糖蛋白質
　リムルス試薬の原液に近い試薬（チャールスリバー社（ＣＲ）、Ｅｎｄｏｓａｆｅ）に対し夫々の粒子形成促進因子を予め決められた濃度で添加し、エンドトキシンを含む溶液に撹拌混合した状態で、粒子形成の効果について検討したところ、実施例３と略同様な傾向（０．００２％ないし１％の濃度の粒子形成促進因子を添加するものに対し良好な結果）が確認された。
　尚、その他の粒子形成促進因子としてのナノパーティクル樹脂については、例えばフラーレン（籠状炭素繊維）を用いて同様の実験を行ったところ、前述した他の粒子形成促進因子と略同様な傾向が確認された。
　このことは、粒子形成促進因子として、変性アルブミンを始めとする変性蛋白質に限られるものではなく、セルロース、多糖類、糖蛋白質などの生物由来の高分子微粒子や、ナノパーティクル樹脂などの石油高分子化学成分由来の多孔質微粒子も略同様に作用することを裏付けるものである。

　本発明は、リムルス試薬を用いたエンドトキシンやβ－D－グルカンなどを測定対象とするゲル粒子測定装置を始め、ゲル化反応によってゲル粒子が生成可能な目的物質を測定対象とする測定装置に広く適用される。
　例えば血液凝固反応や抗原抗体反応において適用することが可能である。
－血液凝固反応（図２７）－
　血漿中のプロトロンビンは、様々な血液凝固因子の活性化を経てトロンビンとなり、フィブリンが凝集する。
　この点について補足すると、血漿の凝固系は、以下の開始期、増幅期、伝播期を経て進行する。
＜開始期＞
（外因性経路）
　血液凝固カスケードにおいて、細胞が傷害を受けると、組織因子が第VIIa因子（第VII因子が活性化したもの）と結合する。
　ここで、第VIIa因子は第IX因子を活性化して第IXa因子とする。また、第IXa因子は第X因子を活性化して第Xa因子とする。
（内因性経路）
　血液が負に帯電した固体（例えば、岩石や砂）に触れると、プレカリクレインと高分子量キニノゲンが第XII因子を活性化し、第XIIa因子とする。また、第XIIa因子は第XI因子を活性化して第XIa因子とする。また、第XIa因子は第IX因子を活性化して第IXa因子とする。
＜増幅期＞
　トロンビンは第XI因子を活性化して第XIa因子とする。第XIa因子は第IX因子を活性化して第IXa因子とする。また、トロンビン自体も第V因子と第VIII因子を活性化させてそれぞれ第Va因子、第VIIIa因子とする。さらにトロンビンは血小板を活性化して、第XIa因子、第Va因子、第VIIIa因子を血小板表面に結合させる。
＜伝播期＞
　血小板表面に結合した第VIIIa因子と第IXa因子は第X因子を活性化して血小板表面に結合させる。また、血小板表面に結合した第Xa因子と第XIa因子はプロトロンビンを次々とトロンビンに変化させる。更に、大量のトロンビンが血漿中のフィブリノーゲンを分解してフィブリンモノマーにする。フィブリンモノマーは第XIII因子によって架橋されてフィブリンポリマーとなり、他の血球を巻き込んで血餅（かさぶた）となる。

　これは生体においては血液凝固で傷口をふさぐなど有用な反応であるが、一方微小な凝集塊が血流中に発生すると、血栓となり様々な微小血管をふさいで脳梗塞・心筋梗塞・肺塞栓など重篤な臨床症状を引き起こす。よって、臨床的に‘凝集の起こしやすさ’を求めることは、この発生を予知する上で重要なこととなる。従来凝集時間の延長は、‘血が止まらない’という心配のもとに測られていたが、‘血が固まりやすい’ことは測る方法が確立されていない。それを適当な希釈された血漿と、一定量の凝集を促進する試薬（例えばＡＤＰ・コラーゲン・エピネフリンなど）と混合することで、凝集の程度を測ることが、この粒子計測の方法で可能と予想される。
　このため、本例では、試料セル１００内に磁性撹拌子１２１と共に、一定量のＡＤＰ等を無菌的に入れて、凍結乾燥などの処理を行った試料セル１００を作成することで、臨床現場において適宜に希釈した血漿を、上部の密封栓１０８を通して導入し、凝集塊の発生時間すなわちゲル化開始時間を実施の形態１と同様なゲル粒子測定装置で測ることで、凝集能の程度を測ることが可能となる。

－抗原抗体反応（図２８）－
　図２８（ａ）に示すように、様々な抗原３００に対する特異抗体３１０は、会合することで不溶性の沈殿としてその抗原３００の不活性化を促し、生体の防御作用を担っている。一方この現象を利用して、特異抗体３１０をあらかじめ用意しておけば、発生する沈殿は存在する抗原３００の量に比例することから、様々な抗原３００を定量する方法が考案されている。しかし、沈殿させる（または抗原抗体の会合を促進する）には時間がかかるため、様々な検出法や鋭敏な検出装置が開発されてきた。抗原抗体反応の沈殿形成をゲル化の粒子形成と捉えると、粒子を安定に形成させ、それを計測するゲル粒子測定装置は応用可能と考えられる。
　とりわけ、図２８（ｂ）に示すように、抗体３３０を樹脂等のミクロビーズ（ＭＢ）３２０等に結合させ、そのビーズ表面にて抗原３００との間で抗原抗体反応を起こさせるタイプの検出反応には、粒子形成のパターンが変化することで捉えることは容易であり、その方法にも応用できる。
　そのため、試料セル１００には、磁性撹拌子１２１と共に、一定量の抗体３３０またはミクロビーズ３２０に結合させた抗体溶液を無菌的に入れておく。この場合、抗体３３０の活性を保持する必要から、凍結乾燥ではなく溶液として保存する方がよいと思われる。測定を行う場合には、一定に希釈した血漿など検液を、上部の密封栓１０８を通して導入し、抗原抗体反応による凝集塊の発生速度を、例えば実施の形態１のゲル粒子測定装置で測る。特に、ゲル粒子生成の速度として捉えるため、透過光の減少速度を計測する。

　実施の形態１で示したエンドトキシン活性反応、血液凝固反応、抗原抗体反応の３つの使用方法で共通することは、水に均一に溶けている分子が会合し、不溶性の粒子になる反応を捉えて、定量しようとするものであるが、可溶性から不溶性になるとき、反応の偏り（反応の中心となる酵素などの廻りに反応分子が局部的に不足する）現象が生じる。正しく反応を進め、その速度を測るためには、この偏りが理論的には‘０（ゼロ）’でなければならない。その解決法が、‘撹拌する’ということになる。この測定法の中心は、溶液を均一に撹拌し、粒子形成を安定に行わせる事を意図したことにある。

　１…試薬基剤，２…粒子形成促進因子，３…試料セル，４…撹拌手段，５…入射光源，６…検出手段，Ｇ…ゲル粒子，Ｓ…試料，Ｒ…試薬，Ｗ…混合溶液，Ｂｍ…光
　

Claims

　測定対象である目的物質が含まれる試料に混合され、前記目的物質をゲル粒子化する上で使用されるゲル粒子測定試薬であって、
　前記目的物質との間でゲル化反応する試薬基剤と、
　この試薬基剤に添加され、前記試料に対して可溶性を有し且つ０．００２ないし１％の濃度で溶解すると共に、所定範囲の粒子サイズに集中したゲル粒子の生成を促進する生物的に不活性な粒子形成促進因子とを含むことを特徴とするゲル粒子測定試薬。
　請求項１記載のゲル粒子測定試薬において、
　前記粒子形成促進因子は、可溶性の熱変性蛋白質であることを特徴とするゲル粒子測定試薬。
　請求項１記載のゲル粒子測定試薬において、
　前記粒子形成促進因子は、可溶性で不活性な生物由来の高分子又は石油高分子化学成分由来の多孔質微粒子であることを特徴とするゲル粒子測定試薬。
　請求項１ないし３いずれかに記載のゲル粒子測定試薬において、
　測定対象である目的物質はエンドトキシン又はβ－D－グルカンであり、試薬基剤はリムルス試薬であることを特徴とするゲル粒子測定試薬。
　ゲル化反応によって試料中の目的物質を粒子化して測定するゲル粒子測定方法であって、
　少なくとも一部に光が入射される入射部及び出射される出射部を有する試料セルに、測定対象である目的物質が含まれる試料及び前記目的物質のゲル化を生ずる請求項１ないし４いずれかに記載のゲル粒子測定試薬が含まれる溶液を収容する収容工程と、
　この試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液全体がゲル化するのを抑制するように撹拌手段にて前記混合溶液を撹拌する撹拌工程と、
　前記試料セルの入射部の外部に設けられた入射光源から、前記試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液に対してコヒーレントな光を照射する光照射工程と、
　前記試料セルの出射部の外部に設けられた検出手段にて、前記試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液中で前記混合溶液がゾル相からゲル相へ相変化する時点に生成されるゲル粒子に対し散乱若しくは透過した光成分を検出する検出工程と、
　この検出工程にて得られた検出出力に基づいて混合溶液内の前記ゲル粒子の生成開始時点を判別するゲル粒子生成判別工程と、を備えたことを特徴とするゲル粒子測定方法。