WO2012030073A2 - 벼 ｅｘｐｂ５ 유전자 유래 뿌리털 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a rice root EXPB5 gene-derived root hair specific expression promoter and its use. More specifically, when the foreign gene is expressed in plants using a rice EXPB5 gene-derived root hair specific expression promoter, the gene is specifically expressed in plant root hair. It is about the content which confirmed that is expressed.
  • Expansins are non-hydrolytic cell wall-loosening proteins associated with cell expansion, fruit softening, abscission, germination, parasitism, and pollen infiltration (Cosgrove, DJ 2000) Nature 407 : 321-326).
  • the expensin family can be classified into two main subfamilies EXPA and EXPB with limited amino acid identity (about 20%) but with similar molecular size ( ⁇ 27 kD) and several conserved motifs. Although members of both EXP families can relax cell walls with similar rheology, they differ in terms of gene abundance (in other taxonomy), solubility and substrate specificity (Cosgrove, DJ (1999) Annu. Rev. Plant Physiol.Plant Mol.Biol. 50 , 391-417).
  • EXPA In Arabidopsis and calm ssangjayeop plants (eudicots), such as poplar EXPA are monocotyledonous plants such as dominant, while compared to EXPB (26 ⁇ 27 EXPA s over 2 ⁇ 6 EXPB s), the rice has a number of relatively large number of EXPB s ( 34 EXPA s vs. 19 EXPB s) (Sampedro, J., and Cosgrove, DJ (2005) Genome Biol. 6 , 242 (doi: 10.1186 / gb-2005-6-12-242). While working better and being less soluble, EXPB proteins are soluble and have specificity for grass cell walls, despite dicot or grass origin (Li et al., (2003) Plant Physiol. 132 , 2073-2085).
  • a promoter involved in gene expression is required.
  • a promoter derived from Cauliflower mosaic virus (CaMV35S) which is expressed in all tissues of the plant, is widely used, but it has a disadvantage that it is difficult to exceed 0.1% of the total expression soluble protein due to the low expression level of the foreign gene. Therefore, there is a strong demand for a promoter capable of increasing the expression of foreign transgenes in transgenic plants.
  • a strong plant promoter is required to transiently express large quantities of foreign genes in plant tissues using the transient method.
  • Korean Patent Registration No. 0641186 discloses a high efficiency expression promoter sequence for sweet potato-derived plant storage roots, a plant high efficiency transient expression vector including the same, and a method for temporarily expressing in a plant storage root using the expression vector.
  • Patent registration No. 0574563 discloses a Arabidopsis-derived plant high efficiency expression promoter and a plant high efficiency expression vector containing the same, but is different from the root hair specific expression promoter derived from barley EXPB1 gene of the present invention.
  • the present invention has been made in accordance with the above requirements, the insertion of the promoter of rice EXPB5 gene into a binary vector and introduced into rice and Arabidopsis, as a result of the specific expression of the foreign gene in the root tissue of the transformed rice and Arabidopsis By confirming that the present invention was completed.
  • the present invention provides a root hair specific expression promoter derived from rice EXPB5 gene.
  • the present invention also provides a root specific plant expression vector comprising the promoter.
  • the present invention also provides a plant transformed with the vector.
  • the present invention comprises the steps of recombining a foreign gene into the vector; And it provides a method for the root-specific expression of the foreign gene in the transgenic plant comprising the step of transforming the recombinant plant expression vector to the plant.
  • the present invention also provides a transgenic plant in which the foreign gene produced by the above method is expressed in a root-specific manner.
  • the present invention also provides seeds of the transgenic plant.
  • the phylogenetic tree constructed using MEGA 4.0 accounts for the close evolutionary relationship of the HvEXPB1 orthologs in the Expensin family ('RH' in the EXPB branch is indicated by dotted lines).
  • the phylogenetic tree is Arabidopsis (At), rice (Os), sorghum (Sb), grapes (Vv), corn (Zm), poplar (Ptr) and barley (Hv), 13 EXPA7 paralogs and orthologs, ferns (Rd) EXPA and 32 EXPBs from OsEXPL1 as a subpopulation and were constructed after the CLUSTAL W alignment of the amino acid sequence between 55 (Gly) and 181 (Ile) of AtEXPA7 and the equivalent regions of each protein.
  • the dashed 'D' in the EXPB branch represents the dicotyledonous homologue closest to HvEXPB1.
  • FIG. 2 shows the percent amino acid identity of EXPB from the 'RH' and 'D' clusters in FIG. 1.
  • Total amino acid sequence was sorted by CLUSTALW. Red boxes indicate 'RH' clusters and blue boxes indicate 'D' clusters.
  • AtEXPB5 was used as an out-group member.
  • RHE 3 silver HvEXPB1 Ortholog's RHE.
  • A is the relative position of the RHE on the promoter. The number below the sequence is the starting nucleotide position of the RHE core (black and gray box) relative to the putative transcription start site or start codon (ATG) (+1). 'r' indicates the reverse of RHE. The RHEs in the black box are majority, and the RHEs in the gray box are minority RHE.
  • B is HvEXPB1 Alignment of putative RHE sequences from orthologs. Majority nucleotides are shaded, and highly conserved RHE signature nucleotides are indicated by gray bars above the majority sequence.
  • OsEXPB5 and HvEXPB1 promoters operate specifically in rice root hair cells.
  • AD OsEXPB5 promoter ( pOsEXPB5 ; -344 deletion): Confocal microscopy image of GFP transformed rice roots. GFP signals (A and C) were combined with red signals from propidium iodide in (B) and (D), respectively.
  • EJ pHvEXPB5 (-492): Confocal microscopy image of GFP transformed rice roots. GFP signals (E and G) were combined with red signals from propidium iodide at (F) and (H), respectively. In (I) the GFP signal was combined with a bright field image (J).
  • FIG. 5 is a diagram showing that the HvEXPB1 promoter including RHE is functional in Arabidopsis root hair cells.
  • A Relative position of the presumed root hair specific cis- factor (RHE; E) of the HvEXPB1 promoter ( pHvEXPB1 ).
  • RHE presumed root hair specific cis- factor
  • E HvEXPB1 promoter
  • the numbers above the sequences indicate the deletion positions for promoter analysis and the truncated promoter fragments were fused to the GFP coding region.
  • the numbers below the sequence indicate the location of the RHE.
  • the nucleotide position is relative to the putative transcription start site (+1). 'R' in the RHE box indicates the reverse of the RHE sequence.
  • (B) Relative activity (GFP expression) of truncated HvEXPB1 promoter in Arabidopsis roots. Bars represent standard errors: n 10 (control; Cont), 15 (-54), 15 (-193) and 11 (-492). Cont is a Arabidopsis transformant comprising pAtEXPA7: GUS .
  • FIG. 6 shows that OsEXPB5 promoter containing RHE is functional in Arabidopsis root hair cells.
  • RHE root hair specific cis- factor
  • pOsEXPB5 presumptive OsEXPB5 promoter
  • the numbers above the sequences indicate the positions deleted for promoter analysis, wherein the truncated promoter fragments were fused to the GFP coding region.
  • the numbers below the sequence indicate the location of the RHE.
  • the nucleotide position is relative to the putative transcription start site (+1).
  • B Relative activity (GFP expression) of the OsEXPB5 promoter cleaved from Arabidopsis roots.
  • Cont is a Arabidopsis transformant comprising pAtEXPA7: GUS .
  • C Confocal microscopy image of root with cut pOsEXPB5: GFP construct.
  • D An enlarged image of -344 in (C) to show detailed root hair cell specific expression pattern.
  • the present invention provides a plant root hair specific expression promoter comprising the nucleotide sequence of the 1633 to 2015 site of SEQ ID NO: 1.
  • the 1633 site of SEQ ID NO: 1 corresponds to -344 of the OsEXPB5 promoter described in A of FIG. 6, and the 2015 site of SEQ ID NO: 1 represents a position immediately before ATG of the OsEXPB5 gene described in A of FIG. 6.
  • E denoted by E means a root hair-specific cis- element (RHE) motif, wherein the plant root hair specific expression promoter of the present invention may include, for example, one or more of E2 and E3.
  • the present invention also provides a plant root hair specific expression promoter comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the root hair specific expression promoter of the present invention can specifically express root hair specific genes introduced from transgenic plants. have.
  • variants of such promoter sequences are included within the scope of the present invention.
  • a variant is a nucleotide sequence that changes in base sequence but has similar functional properties to that of SEQ ID NO: 1.
  • the promoter sequence has a base sequence having at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% homology with the base sequence of SEQ ID NO: 1 It may include.
  • the "% sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing two optimally arranged sequences with a comparison region, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to).
  • the present invention also provides a plant root hair specific expression vector comprising the root hair specific expression promoter of the plant of the present invention.
  • the root hair specific expression vector of the present invention can be used as a transient expression vector capable of temporarily expressing a plant in which a foreign gene has been introduced and a plant expression vector capable of permanently expressing a foreign gene in a introduced plant. .
  • Binary vectors that can be used in the present invention can be any binary vector containing the right border (RB) and left border (LB) of T-DNA which can transform plants in the presence of Ti plasmid of A. tumefaciens .
  • RB right border
  • LB left border
  • pBI101 Cat #: 6018-1, Clontech, USA
  • pBIN19 Genbank Accession No. U09365
  • pBI121 pCAMBIA vectors, and the like, which are frequently used in the art, are preferably used.
  • vector is used to refer to a DNA fragment (s), a nucleic acid molecule, that is delivered into a cell. Vectors can replicate DNA and be reproduced independently in host cells.
  • carrier is often used interchangeably with “vector”.
  • expression vector refers to a recombinant DNA molecule comprising a coding sequence of interest and a suitable nucleic acid sequence necessary to express a coding sequence operably linked in a particular host organism. Promoters, enhancers, termination signals and polyadenylation signals available in eukaryotic cells are known.
  • Ti-plasmid vectors which, when present in a suitable host such as Agrobacterium tumerfaciens, can transfer part of themselves, the so-called T-region, into plant cells.
  • a suitable host such as Agrobacterium tumerfaciens
  • Another type of Ti-plasmid vector (see EP 0 116 718 B1) is used to transfer hybrid DNA sequences to protoplasts from which current plant cells or new plants can be produced that properly insert hybrid DNA into the plant's genome. have.
  • a particularly preferred form of the Ti-plasmid vector is the so-called binary vector as claimed in EP 0 120 516 B1 and US Pat. No. 4,940,838.
  • viral vectors such as those which can be derived from double stranded plant viruses (eg CaMV) and single stranded viruses, gemini viruses, etc.
  • CaMV double stranded plant viruses
  • gemini viruses single stranded viruses
  • it may be selected from an incomplete plant viral vector.
  • the use of such vectors can be advantageous especially when it is difficult to properly transform a plant host.
  • the expression vector preferably comprises one or more selectable markers.
  • the marker is typically a nucleic acid sequence having properties that can be selected by chemical methods, and all genes that can distinguish transformed cells from non-transformed cells. Examples include, but are not limited to, herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, antibiotic resistance genes such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, and chloramphenicol It doesn't happen.
  • the terminator may use a conventional terminator, such as nopalin synthase (NOS), rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, agro Terminator of the octopine gene of Bacterium tumerfaciens ( Agrobacterium tumefaciens ), but is not limited thereto.
  • NOS nopalin synthase
  • rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator such as rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, agro Terminator of the octopine gene of Bacterium tumerfaciens ( Agrobacterium tumefaciens ), but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a plant transformed with the root hair-specific expression vector of the present invention, Escherichia coli (E. coli) or Agrobacterium tyumeo Pacific Enschede (Agrobacterium tumefaciens).
  • Escherichia coli E. coli
  • Agrobacterium tyumeo Pacific Enschede Agrobacterium tumefaciens
  • the present invention also provides a plant transformed with the root hair specific plant expression vector of the present invention.
  • the root hair specific plant expression vector of the present invention can transform any plant irrespective of dicotyledonous or monocotyledonous plants.
  • the plant was transformed in rice and Arabidopsis.
  • the plant according to an embodiment of the present invention is tomato, Arabidopsis, potato, eggplant, tobacco, pepper, burdock, garland chrysanthemum, lettuce, bellflower, spinach, beetroot, sweet potato, celery, carrot, buttercup, parsley, cabbage, cabbage, Dicotyledonous plants, such as a fresh radish, watermelon, melon, cucumber, pumpkin, gourd, strawberry, soybean, green beans, green beans, or peas, and monocotyledonous plants such as corn, barley, wheat, rice, oats, rye or sugar cane, preferably It is rice or baby pole.
  • Plant transformation refers to any method of transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily have a period of regeneration and / or tissue culture. Transformation of plant species is now common for plant species, including both dicotyledonous plants as well as monocotyledonous plants. In principle, any transformation method can be used to introduce hybrid DNA according to the invention into suitable progenitor cells. Method is calcium / polyethylene glycol method for protoplasts (Krens, FA et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), protoplasts Electroporation (Shillito RD et al., 1985 Bio / Technol.
  • the "plant cells” used for plant transformation may be any plant cells.
  • the plant cells may be cultured cells, cultured tissues, cultured organs or whole plants, preferably cultured cells, cultured tissues or cultured organs and more preferably any form of cultured cells.
  • Plant tissue refers to tissues of differentiated or undifferentiated plants, such as, but not limited to, fruits, stems, leaves, pollen, seeds, cancer tissues and various types of cells used in culture, ie single cells, protoplasts. (protoplast), shoots and callus tissue.
  • the plant tissue may be in planta or in an organ culture, tissue culture or cell culture.
  • the present invention comprises the steps of recombining a foreign gene into the root hair specific expression vector of the present invention.
  • It provides a method for expressing the root gene specific in the transgenic plant comprising the step of transforming the plant with the recombinant root hair specific expression vector.
  • the foreign gene may be any gene desired to be expressed in plant root hairs, and may be located behind the promoter in the root hair specific expression vector of the present invention and may be expressed by fusion with a reporter gene as necessary.
  • the recombinant root hair specific expression vector may be transformed into a plant as described above.
  • the plant is tomato, baby pole, potato, eggplant, tobacco, pepper, burdock, garland chrysanthemum, lettuce, bellflower, spinach, chard, sweet potato, celery, carrot, buttercup, parsley, cabbage , Dicotyledonous plants such as cabbage, mustard, watermelon, melon, cucumber, pumpkin, gourd, strawberry, soybean, green bean, kidney bean, or pea and monocotyledonous plants such as corn, barley, wheat, rice, oat, rye or sugarcane, Preferably, it is rice or baby pole.
  • the present invention also provides a transgenic plant and seed thereof, wherein the foreign gene produced by the method of the present invention is specifically expressed in root hairs.
  • the transgenic plant can express the foreign genes specifically by the root hairs by a root hair specific expression promoter.
  • Arabidopsis Thaliana Cold treated before germination at 23 ° C. with a 16h / 8h light / dark photoperiod.
  • Arabidopsis plants were transformed with Agrobacterium tumerfaciens strain C58C1 (Bechtold, N., and Pelletier, G. (1998) In Arabidopsis Protocols, JM), and the transformants were plate containing hygromycin (10 ⁇ g / mL). GFP fluorescence was observed in 5-6 day old T1 transgenic seedling roots.
  • Rice transformation was essentially performed as previously described (Choi et al., (2000) Nature 407 , 765-767).
  • the promoter construct was transferred to Agrobacterium tumerfaciens strain AgL1.
  • Agrobacterium was plated in AB medium and grown for 3 days.
  • rice caryopses were initially plated under dark conditions in N6 medium supplemented with 2 mg / L 2,4-dichlorophenoxy acetic acid.
  • embryogenic callus was co-cultured for 3 days in the presence of Agrobacterium with vector and 10 mg / mL acetocyring source, washed with sterile water, and then 50 mg / L hygromycin and 150 mg The cells were selected for 4 weeks in N6 medium containing / L celltaxime. Callus was transferred to MS medium containing 0.5 mg / L ⁇ -naphthalene acetic acid and kinetin and grown in an environmental growth chamber controlled to growth conditions of 11 hours, 27 ° C. day / 13 hours, 22 ° C. night. Transgenic rice plants (about 15 cm tall) were grown in greenhouses. T1 rice plants were observed for GFP expression.
  • the deleted promoter (-*, * is a number) was prepared by polymerase chain reaction (PCR) using genomic DNA samples prepared from rice and barley seedlings as a template and the primer sets listed in Table 1.
  • the amplified primers were digested with restriction enzymes and inserted into the HindIII / XbaI site of the pGPTV-HYG vector (Becker et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20 , 1195-1197), the uidA gene as described previously. (Kim et al., (2006) Plant Cell 18 , 2958-2970). All promoter constructs were identified by nucleotide sequencing and transgenic plants were also confirmed by PCR analysis.
  • GFP fluorescence from seedling roots was observed by epi-fluorescence stereomicroscope (MZ FLIII, Leica, Heerbrugg, Switzerland) or confocal laser scanning microscope (LSM 510, Carl Zeiss, Gotingen, Germany). To outline the cell boundaries, the roots were stained with propidium iodide (10 ⁇ g / mL) in some samples. Green fluorescence was detected by excitation at 488 nm and emission at 543 nm. Red fluorescence from propidium iodide was detected by excitation at 568 nm and emission at 617 nm. Fluorescence images from the confocal microscope were digitized with Zeiss LSM Image Browser Version 2.80.1123.
  • Promoter activity was assessed by quantifying GFP fluorescence using the histogram function of Adobe Photoshop (Adobe Systems Inc., San Jose, Calif.) (Cho, H.-T., and Cosgrove, DJ (2002) Plant Cell 14 , 3237 -3253).
  • HvEXPB1 homologues were performed in the NCBI database (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
  • the total HvEXPB1 protein sequence was used for protein blast searches against non-redundant protein sequence databases.
  • the search generated E-values of 4e-163 for HvEXPB1 itself, and 1e-98-4e-92 for OsEXPB5, Sb06g024660, ZmEXPB2 and Sb06g024640.
  • Nucleotide sequences were aligned using CLUSTAL W (DNASTAR, Madison, Wis.). Neighbor-Joining phylogenies were generated using MEGA version 4.0, which adopted Poisson correction distance for amino acid sequences and complete deletion for gaps (Tamura et al., (2007) Mol. Biol. Evol. 24 , 1596-1599). The number of bootstrap replicates is 1000.
  • Example 1 HvEXPB 1-Orthologs EXPBs are specific for Graminaceae.
  • HvEXPB1 In order to determine the phylogenetic relationship between different EXPENSE protein sequences and HvEXPB1, we constructed a neighboring-joining tree using total EXPBs, adjacent HvEXPB1 homologs and AtEXPA7 orthologs from Arabidopsis and rice. Adjacent HvEXPB1 homologues were obtained by blast search of the total HvEXPB1 protein sequence against a non-redundant NCBI protein sequence database. Their close HvEXPB1 homologues from the blast search included the highest scored EXPBs from Graminaceae (corn, wheat, sorghum and rice) and dicotyledons (potato, tomato, castor, grape, poplar and Arabidopsis).
  • HvEXPB1 clustered closely with grass EXPBs from rice (OsEXPB5), maize (ZmEXPB2) and sorghum (Sb06g024640 and Sb06g024660) (the 'RH' cluster in FIG. 1), with OsEXPB5 showing the highest amino acid sequence identity with HvEXPB1 (total) 65.8% when the protein sequence was aligned).
  • OsEXPB5 showing the highest amino acid sequence identity with HvEXPB1 (total) 65.8% when the protein sequence was aligned).
  • Phylogenetic analysis means that the EXPBs in the RH cluster may be HvEXPB1 orthologs.
  • cluster 'D' contains the highest score dicotyledonous EXPB homologs to HvEXPB1 in NCBI protein blast searches. Since cluster 'D' forms an independent group and is separated by other Graminaceae EXPBs, including 5 OsEXPBs from cluster 'RH', the dicotyledonous EXPBs in the 'D' cluster are unlikely to be HvEXPB1-orthologs.
  • the percent amino acid identity comparison of EXPBs also supports the concept that the 'RH' and 'D' clusters are two separate EXPB groups (FIG. 2).
  • HvEXPB1 Manifestation of root hair defects barley rh11.a Damaged in the mutant, Gene transcripts have been found at least in root hair RNA production (Kwasniewski, M., and Szarejko, I. (2006) Plant Physiol. 141 , 1149-1158). This means that the inventors HvEXPB1 We investigated whether expression was root hair specific in root tissue.
  • EXPA7 Multiple root hair specifics in which the near promoter region of the ortholog directs gene expression in a root hair cell specific manner cis- That contain RHEs EXPA7 Proven in earlier studies on orthologs (Kim et al., (2006) Plant Cell 18 , 2958-2970).
  • HvEXPB1 An attempt was made to determine whether the ortholog's promoter also includes RHE-like motifs.
  • quinary HvEXPB1 Of the orthologs, four gene promoters were obtained from the NCBI nucleotide database. When examining the 1000 bp upper region from the start codon (ATG), multiple RHE-like motifs were found in these promoters (FIG. 3A). These RHEs are at least the minimum required RHE consensus' NNNN T NNN (N) NN CACG NN ', where N is any nucleotide and bold nucleotides should appear at their position (FIG. 3B) (Kim et al., (2006) Plant Cell 18 , 2958-2970).
  • HvEXPB1 The promoter has four majority and one minority RHE-like factors within 350 bp from the putative transcription initiation site with two factors reverse. 845bp long OsEXPB5 The promoter contains 3 RHEs, two of which are majority RHEs. Two sorghum orolog promoters also have RHE motifs, where the Sb06g024640 promoter has only one minority RHE and the Sb06g024660 promoter has two majority and two minority RHEs. HvEXPB1 The presence of the RHE-like factor in the near promoter region of the ortholog indicates that this gene promoter EXPA7 Similar to that demonstrated in the orthologs, it is suggested that it may be specifically operated in root hair cells.
  • Example 3 HvEXPB1 And OsEXPB5 The promoter of works specifically on the root hair cells of rice.
  • HvEXPB1 and OsEXPB5 work specifically in rice root hair cells.
  • the deletion of the HvEXPB1 promoter : GFP is -492 (relative to +1, the presumed transcription start position) and the OsEXPB5 promoter : GFP reporter construct.
  • the -344 deletion was introduced into rice plants using Agrobacterium-mediated transformation. GFP fluorescence was observed by confocal microscopy in re-differentiated T1 transgenic rice roots.
  • GFP constructs ( pOsEXPB5: GFP and pHvEXPB5: GFP , respectively) (FIG. 4). GFP expression began to occur in some cells before the appearance of root hair bulges.
  • the distribution pattern of root hair cells in rice root epidermis was basically type 2 (Kim et al., (2006) Plant Cell 18 , 2958-2970). After asymmetric division, shorter cells grew to hair. Along the long axis caused alternating hair distribution patterns (Clowes, FAL (2000) New Phytol. 146 , 83-94).
  • GFP expression in the two transformants in the present invention usually showed a type 2 shift pattern even if GFP expression was absent or adjacent at some hair cell locations (FIG. 4D).
  • GFP constructs were prepared, -492 deletions included 5 RHEs, -193 deletions included 3 RHEs, and -54 deletions excluded all RHEs (FIG. 5A). . Thereafter, GFP fluorescence levels were quantitatively evaluated from multiple independent transgenic plants (10-15) for each promoter-deleting construct.
  • the -492 and -193 promoter deletions showed similar levels of GFP fluorescence from the transformed roots and the fluorescence was root hair cell specific (FIGS. 5B-D).
  • -54 deletion including the absence of RHE, almost completely eliminated GFP expression in the roots.

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Abstract

본 발명은 벼 EXPB5 유전자 유래 뿌리털 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 벼 EXPB5 유전자 유래 뿌리털 특이적 발현 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 뿌리 특이적 식물 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 식물체, 상기 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 뿌리 특이적으로 발현시키는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 뿌리털 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 상기 형질전환 식물체의 종자에 관한 것이다.

Description

벼 ＥＸＰＢ５ 유전자 유래 뿌리털 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도
본 발명은 벼 EXPB5 유전자 유래 뿌리털 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 벼 EXPB5 유전자 유래 뿌리털 특이적 발현 프로모터를 이용하여 외래 유전자를 식물체에서 발현시킨 결과, 식물체 뿌리털에서 특이적으로 유전자가 발현된다는 것을 확인한 내용에 관한 것이다.
익스펜신(Expansins)은 세포 확장, 열매 연화, 탈리(abscission), 발아, 기생(parasitism) 및 화분관 침투와 연관된 비가수분해 세포벽 이완 단백질(non-hydrolytic cell wall-loosening proteins)이다(Cosgrove, D.J. (2000) Nature 407: 321-326). 익스펜신 패밀리는 제한된 아미노산 동일성 (약 20%)을 갖지만 유사 분자 크기(~27 kD) 및 여러개의 보존된 모티프를 갖는 두개의 주요 서브패밀리 EXPA 및 EXPB로 분류될 수 있다. 비록 양 EXP 패밀리의 멤버가 유사 유동성(similar rheology)으로 세포벽을 이완시킬 수 있다고 하더라도, gene abundance (다른 분류학에서), 용해도 및 기질 특이성 측면에서 서로 다르다(Cosgrove, D.J. (1999) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50, 391-417). 애기장대 및 포플러와 같은 진정쌍자엽 식물(eudicots)에서 EXPA는 EXPB에 비해 우세한 반면 (26~27 EXPAs over 2~6 EXPBs), 벼와 같은 단자엽 식물은 EXPBs의 비교적 많은 수를 갖고 있다(34 EXPAs vs. 19 EXPBs)(Sampedro, J., and Cosgrove, D.J. (2005) Genome Biol. 6, 242 (doi:10.1186/gb-2005-6-12-242). EXPA 단백질이 쌍자엽 세포벽에서 더 잘 작동하고 덜 용해되는 반면, EXPB 단백질은 쌍자엽 또는 grass 기원임에도 불구하고 용해성이고 grass 세포벽에 특이성을 갖고 있다(Li et al., (2003) Plant Physiol. 132, 2073-2085).
최근에 유전 공학 기술을 이용하여 식물에서 외래 유전자 도입을 이용한 유용 물질을 생산하고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다. 이러한 과정에서 외래의 유용 유전자를 형질전환 식물체에서 발현시키고자 할 때 유전자 발현에 관여하는 프로모터가 요구된다. 이를 위해 식물체의 전 조직에서 발현이 유도되는 꽃양배추 모자이크 바이러스 (Cauliflower mosaic virus: CaMV35S) 유래의 프로모터가 널리 사용되고 있으나 외래유전자의 발현 양이 낮아 전체 발현 수용성 단백질의 0.1%를 넘기 힘든 단점이 있다. 그러므로 형질전환 식물체에서 외래 도입 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 프로모터가 강력히 요구되고 있는 실정이다. 또한 transient 방법을 이용하여 식물의 조직에서 일시적으로 외래 유전자를 다량 발현시키기 위해서는 강력한 식물 프로모터가 필요한 실정이다.
한국특허등록 제0604186호에는 고구마 유래 식물 저장뿌리용 고효율 발현 프로모터 염기서열, 이를 포함하는 식물체 고효율 일시적 발현 벡터 및 상기 발현벡터를 이용하여 식물의 저장뿌리에 일시적으로 발현시키는 방법이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제0574563호에는 애기장대 유래 식물체 고효율 발현 프로모터 및 이를 함유하는 식물체 고효율 발현 벡터가 개시되어 있으나, 본 발명의 보리 EXPB1 유전자 유래 뿌리털 특이적 발현 프로모터와는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 벼 EXPB5 유전자의 프로모터를 바이너리 벡터에 삽입하여 벼 및 애기장대에 도입한 결과, 형질전환 벼 및 애기장대의 뿌리털 조직에서 외래 유전자가 특이적으로 발현됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 EXPB5 유전자 유래 뿌리털 특이적 발현 프로모터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 뿌리 특이적 식물 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및 상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 뿌리 특이적으로 발현시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 뿌리 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물체의 종자를 제공한다.
본 발명에 따르면, 벼 EXPB5 유전자 유래 뿌리털 특이적 발현 프로모터를 이용하여 외래 유전자를 식물체에서 발현시킨 결과, 식물체 뿌리털에서 특이적으로 유전자를 발현시킬 수 있었으므로, 유용 유전자를 식물체 뿌리털에서 대량으로 생산하는 것이 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 EXPANSIN A 및 B 단백질 서열의 Neighbor-Joining 계통수이다. MEGA 4.0을 이용하여 구축된 계통수는 익스펜신 패밀리에서 HvEXPB1 오쏘로그의 밀접한 진화적 관계를 설명한다(EXPB 가지에서 'RH'는 점선으로 표시하였다). 계통수는 애기장대 (At), 벼 (Os), 수수 (Sb), 포도 (Vv), 옥수수 (Zm), 포플러 (Ptr) 및 보리 (Hv), 13 EXPA7 파라로그 및 오쏘로그, 양치류(Rd) EXPA 및 외집단으로서 OsEXPL1 유래의 32 EXPBs를 포함하고, AtEXPA7의 55 (Gly) 및 181 (Ile) 사이의 아미노산 서열 및 각 단백질의 동등 영역(equivalent regions)의 CLUSTAL W 정렬 후에 구축되었다. EXPB 가지에서 점선으로 나타낸 'D'는 HvEXPB1에 가장 근접한 쌍자엽 상동체를 나타낸다. At, 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana); Bo, 브라시카 올레라케아 (Brassica oleracea); Cm, 켈리도니움 마주스 (Chelidonium majus); Hv, 호르데움 불가리(Hordeum vulgare); Ib, 임파티엔스 발사미나(Impatiens balsamina); Mt, 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula); Os, 오리자 사티바(Oryza sativa); Ptr, 포플러스 트리코카르파 (Populus trichocarpa); Rd, 레그넬리디움 디필룸 (Regnellidium diphyllum); Rs, 라파누스 사티부스 (Raphanus sativus); Sb, 소검 비콜라 (Sorghum bicolor); Ta, 트리티컴 애스티붐 (Triticum aestivum); Vv, 비티스 비니페라 (Vitis vinifera); Zm, 제아 메이스 (Zea mays).
도 2는 도 1에서 'RH' 및 'D' 클러스터로부터 EXPB의 퍼센트 아미노산 동일성을 나타낸다. 총 아미노산 서열은 CLUSTALW로 정렬하였다. 적색 박스는 'RH' 클러스터를 표시하고, 청색 박스는 'D' 클러스터를 표시한다. AtEXPB5은 외집단 멤버로써 사용하였다.
도 3은 HvEXPB1 오쏘로그의 RHE이다. (A)는 프로모터 위의 RHE의 상대적인 위치이다. 서열 아래의 숫자는 추정의 전사 개시 자리 또는 개시 코돈(ATG) (+1)에 대한 RHE 코어(흑색 및 회색 박스)의 개시 뉴클레오티드 위치이다. 'r'은 RHE의 역방향을 표시한다. 흑색 박스의 RHEs은 majority이고, 회색 박스의 RHEs은 minority RHE이다. (B)는 HvEXPB1 오쏘로그로부터 추정의 RHE 서열의 정렬이다. Majority 뉴클레오티드는 음영으로 표시하였고, 고도로 보존된 RHE 시그너처 뉴클레오티드는 majority 서열 위에 회색 바(bar)로 표시하였다.
도 4는 RHE를 포함하는 OsEXPB5 및 HvEXPB1 프로모터가 벼 뿌리털 세포에서 특이적으로 작동하는 것을 나타내는 그림이다. (A-D) OsEXPB5 프로모터 (pOsEXPB5; -344 결실):GFP 형질전환 벼 뿌리의 공초점 현미경 이미지이다. GFP 신호(A 및 C)는 (B) 및 (D)에서 각각 프로피디움 요오디드로부터 적색 신호와 합쳐졌다. (E-J) pHvEXPB5(-492):GFP 형질전환 벼 뿌리의 공초점 현미경 이미지이다. GFP 신호(E 및 G)는 (F) 및 (H)에서 각각 프로피디움 요오디드로부터 적색 신호와 합쳐졌다. (I)에서 GFP 신호는 명시야상(bright field image) (J)와 합쳐졌다.
도 5는 RHE를 포함하는 HvEXPB1 프로모터가 애기장대 뿌리털 세포에서 기능적인 것을 나타내는 그림이다. (A) HvEXPB1 프로모터 (pHvEXPB1)의 추정의 뿌리털 특이적 cis-인자(RHE; E)의 상대적인 위치이다. 서열 위의 숫자는 프로모터 분석을 위한 결실 위치를 표시하고, 절단된 프로모터 절편은 GFP 코딩 영역에 융합시켰다. 서열 아래의 숫자는 RHE의 위치를 표시한다. 뉴클레오티드 위치는 추정의 전사 개시 자리(+1)에 상대적이다. RHE 박스에서 'r'는 RHE 서열의 역방향을 표시한다. (B) 애기장대 뿌리에서 절단된 HvEXPB1 프로모터의 상대적인 활성(GFP 발현)이다. 바(bar)는 표준오차를 나타낸다: n= 10 (대조군; Cont), 15 (-54), 15 (-193) 및 11 (-492). Cont은 pAtEXPA7:GUS를 포함하는 애기장대 형질전환체이다. (C) 절단된 pHvEXPB1:GFP 구조체를 갖는 뿌리의 공초점 현미경 이미지이다. (D) 상세한 뿌리털 세포 특이적 발현 패턴을 보여주기 위해 (C)에서 -492의 확대된 이미지이다.
도 6은 RHE를 포함하는 OsEXPB5 프로모터가 애기장대 뿌리털 세포에서 기능적인 것을 나타내는 그림이다. (A) OsEXPB5 프로모터 (pOsEXPB5)의 추정의 뿌리털 특이적 cis-인자(RHE; E)의 상대적인 위치이다. 서열 위의 숫자는 프로모터 분석을 위해 결실된 위치를 표시하는데, 절단된 프로모터 절편은 GFP 코딩 영역에 융합시켰다. 서열 아래의 숫자는 RHE의 위치를 표시한다. 뉴클레오티드 위치는 추정의 전사 개시 자리(+1)에 상대적이다. (B) 애기장대 뿌리에서 절단된 OsEXPB5 프로모터의 상대적인 활성(GFP 발현)이다. 바는 표준오차를 표시한다: n= 24 (대조군; Cont), 10 (-63) 및 24 (-344). Cont는 pAtEXPA7:GUS를 포함하는 애기장대 형질전환체이다. (C) 절단된 pOsEXPB5:GFP 구조체를 갖는 뿌리의 공초점 현미경 이미지이다. (D) 상세한 뿌리털 세포 특이적 발현 패턴을 보여주기 위해 (C)에서 -344의 확대된 이미지이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 1633 내지 2015 부위의 염기서열을 포함하는 식물 뿌리털 특이적 발현 프로모터를 제공한다. 상기 서열번호 1의 1633 부위는 도 6의 A에 기재된 OsEXPB5 프로모터의 -344에 해당하는 부위이며, 서열번호 1의 2015 부위는 도 6의 A에 기재된 OsEXPB5 유전자의 ATG 직전 위치를 나타낸다. 도 6에서, E라고 표시된 것은 RHE (root hair-specific cis-element) 모티프를 의미하는데, 본 발명의 식물 뿌리털 특이적 발현 프로모터는 예를 들면, E2 및 E3 중 어느 하나 이상을 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 식물 뿌리털 특이적 발현 프로모터를 제공한다.
기존에 널리 사용되고 있는 꽃양배추 모자이크 바이러스 유래의 CaMV35S 프로모터가 전 조직에서 도입된 유전자를 발현시키는데 비해, 상기 본 발명의 뿌리털 특이적 발현 프로모터는 형질전환 식물체에서 도입된 유전자를 뿌리털 특이적으로 발현시킬 수 있다.
또한, 상기 프로모터 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터 서열은 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 식물체의 뿌리털 특이적 발현 프로모터를 포함하는 식물 뿌리털 특이적 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 뿌리털 특이적 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 A. tumefaciens의 Ti 플라스미드와 함께 존재시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB (right border)과 LB (left border)을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101(Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19(Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명의 뿌리털 특이적 식물 발현 벡터로 형질전환된 대장균(E. coli) 또는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 뿌리털 특이적 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.
본 발명의 뿌리털 특이적 식물 발현 벡터는 쌍자엽 혹은 단자엽 식물에 상관없이 어떤 식물체도 형질전환시킬 수 있고, 본 발명에서는 벼 및 애기장대에서 형질전환을 실시하였다. 본 발명의 일 구현예에 따른 상기 식물체는 토마토, 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물 및 옥수수, 보리, 밀, 벼, 귀리, 호밀 또는 사탕수수 등의 단자엽 식물이고, 바람직하게는 벼 또는 애기장대이다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.
"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 뿌리털 특이적 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및
상기 재조합된 뿌리털 특이적 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 뿌리털 특이적으로 발현시키는 방법을 제공한다.
상기 외래 유전자는 식물체 뿌리털에서 발현을 원하는 어떤 유전자도 될 수 있으며, 본 발명의 뿌리털 특이적 발현 벡터에서 상기 프로모터의 뒤에 위치하며 필요에 따라 리포터 유전자와 융합되어 발현될 수도 있다. 상기 재조합된 뿌리털 특이적 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같이 실시할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 식물체는 토마토, 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물 및 옥수수, 보리, 밀, 벼, 귀리, 호밀 또는 사탕수수 등의 단자엽 식물이고, 바람직하게는 벼 또는 애기장대이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 뿌리털 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 상기 형질전환 식물체는 뿌리털 특이적 발현 프로모터에 의해 외래 유전자를 뿌리털 특이적으로 발현시킬 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
재료 및 방법
식물 재료 및 성장 조건
아라비돕시스 탈리아나(콜럼비아 생태형) 및 벼(오리자 사티바 재배종 화영; 자포니카)는 프로모터:GFP (녹색 형광 단백질 유전자) 구조체의 형질전환 및 뿌리털 특이적 GFP 발현의 관찰에 사용되었다. 애기장대 종자는 16h/8h 명/암 광주기로 23℃에서 발아 전에 저온 처리하였다. 애기장대 식물체는 아그로박테리움 투머파시엔스 균주 C58C1을 이용하여 형질전환시켰고(Bechtold, N., and Pelletier, G. (1998) In Arabidopsis Protocols, J.M.), 형질전환체는 하이그로마이신을 포함하는 플레이트(10 ㎍/mL)에서 선별하였다. GFP 형광은 5 ~ 6일 된 T1 형질전환 유묘 뿌리에서 관찰되었다.
벼 형질전환은 앞서 기술한대로 필수적으로 수행하였다(Choi et al., (2000) Nature 407, 765-767). 프로모터 구조체는 아그로박테리움 투머파시엔스 균주 AgL1에 옮겼다. 벼 배형성 캘러스와 공동배양하기 위해, 아그로박테리움은 AB 배지에 도말하고 3일 동안 키웠다. 배형성 캘러스의 생성을 위해, 벼 영과(rice caryopses)는 2 mg/L 2,4-디클로로페녹시 아세트산이 첨가된 N6 배지에서 암조건으로 초기에 플레이팅 하였다. 3주 후에, 배형성 캘러스는 벡터를 갖는 아그로박테리움과 10 mg/mL 아세토시링원의 존재하에 3일 동안 공동배양하였고, 멸균수로 세정하였고, 그 후 50 mg/L 하이그로마이신 및 150 mg/L 세포탁심을 포함하는 N6 배지에서 4주 동안 선별하였다. 캘러스는 0.5 mg/L α-나프탈렌 아세트산 및 키네틴을 포함하는 MS 배지로 옮겼고, 11시간, 27℃ 낮/13시간, 22℃ 밤 성장 조건으로 조절되는 환경 생장 챔버에서 키웠다. 형질전환 벼 식물체(키가 약 15cm)는 온실에서 더 키웠다. T1 벼 식물체는 GFP 발현을 위해 관찰하였다.
프로모터 구조체
결실된 프로모터(-*, *는 숫자)는 주형으로 벼 및 보리 유묘로부터 준비한 게놈 DNA 샘플 및 표 1에 열거한 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)로 제작하였다. 증폭된 프라이머는 제한효소로 절단시켰고 pGPTV-HYG 벡터의 HindⅢ/XbaⅠ자리로 삽입시켰는데(Becker et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20, 1195-1197), uidA 유전자는 앞서 기술한대로 GFP로 대체하였다(Kim et al., (2006) Plant Cell 18, 2958-2970). 모든 프로모터 구조체는 뉴클레오티드 시퀀싱으로 확인하였고, 형질전환 식물체는 또한 PCR 분석으로 확인하였다.
표 1 결실된 프로모터 구조체를 위한 PCR에 이용된 프라이머
Subject Name1 서열 (5' to 3')2
PHvEXPB1 의 결실 -54 HvExBHd619F TCC CAA GCT TAT AAC ACC TAG ACC TT (서열번호 2)
HvExBXb763R AGT CTC TAG ACA GAA AGC CAA CGG GCT A (서열번호 3)
-193 HvExBHd478F GCC AAA GCT TCG TCA TCA AAG GAT (서열번호 4)
HvExBXb763R AGT CTC TAG ACA GAA AGC CAA CGG GCT A (서열번호 3)
-492 HvExBHd182F AGG CAA GCT TCG ATG GCC GAC GAC TT (서열번호 5)
HvExBXb763R AGT CTC TAG ACA GAA AGC CAA CGG GCT A (서열번호 3)
POsEXPB5 의 결실 -63 OsExBHd1905F CGC TAA GCT TCC CTA TAA ATA CCA ACC AA (서열번호 6)
OsExBXb2020R ACC ATC TAG ATT TTC TTG TTG GGC AAT C (서열번호 7)
-344 OsExBHd1623F GTA GAA GCT TGA CAA ACG TAC GGA TGA (서열번호 8)
OsExBXb2020R ACC ATC TAG ATT TTC TTG TTG GGC AAT C (서열번호 7)
1프라이머에서 제한효소 자리의 약자: Hd, HindIII; Xb, XbaI
2 In degenerated primers: Y, C+T; R, A+G
GFP 관찰 및 프로모터의 활성 평가
유묘 뿌리로부터 GFP 형광은 epi-fluorescence stereomicroscope (MZ FLIII, Leica, Heerbrugg, Switzerland) 또는 공초점 레이저 주사 현미경(LSM 510, Carl Zeiss, Gotingen, Germany)으로 관찰하였다. 세포 경계의 윤곽을 보여주기 위해, 뿌리는 몇몇의 샘플에서 프로피디움 요오디드(10 ㎍/mL)로 염색하였다. 녹색 형광은 488 nm에서 여기 및 543 nm에서 방출에 의해 검출되었다. 프로피디움 요오디드로부터 적색 형광은 568 nm에서 여기 및 617 nm에서 방출에 의해 검출되었다. 공초점 현미경으로부터 형광 이미지는 Zeiss LSM Image Browser Version 2.80.1123으로 디지털화하였다. 프로모터 활성은 Adobe Photoshop (Adobe Systems Inc., San Jose, CA)의 히스토그램 기능을 이용하여 GFP 형광을 정량화하여 평가하였다(Cho, H.-T., and Cosgrove, D.J. (2002) Plant Cell 14, 3237-3253).
NCBI에서 단백질의 블라스트 검색
HvEXPB1 상동체의 검색은 NCBI 데이타베이스에서 수행하였다(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). 총 HvEXPB1 단백질 서열은 non-redundant 단백질 서열 데이터베이스에 대한 단백질 블라스트 검색을 위해 사용되었다. 검색은 HvEXPB1 자체를 위해 E-값의 4e-163이 생성되었고, OsEXPB5, Sb06g024660, ZmEXPB2 및 Sb06g024640을 위해 1e-98 ~ 4e-92이 생성되었다. 블라스트에서, 상위 30 hits는 단지 grass EXPBs를 포함하였고, 31st (E=2e-74) 및 32nd (E=3e-74) hits는 각각 감자 및 토마토로부터 EXPBs였다. 33rd-44th hits는 다시 grass EXPBs였고, 45th (E=2e-68) 및 46th (E=9e-68) hits는 각각 포플러 및 포도 EXPBs였다. 계통수의 구축을 위해, 본 발명자들은 가장 근접한 상위 5 unique hits를 포함시켰고, 이는 모두 grass EXPBs에 속하고, 그리고 총 벼 및 애기장대 EXPBs에 더하여 상위 4 dicot hits를 포함시켰다.
서열 정렬 및 계통수
뉴클레오티드 서열은 CLUSTAL W (DNASTAR, Madison, WI)을 이용하여 정렬시켰다. Neighbor-Joining 계통수는 아미노산 서열을 위한 Poisson correction distance 및 갭을 위한 완전한 삭제를 채택한 MEGA version 4.0을 이용하여 생성시켰다(Tamura et al., (2007) Mol. Biol. Evol. 24, 1596-1599). 부트스트랩 반복(bootstrap replicates)의 수는 1000이다.
실시예 1. HvEXPB1-오쏘로그 EXPBs은 벼과(Graminaceae)에 특이적이다.
다른 익스펜신 단백질 서열과 HvEXPB1의 계통 발생적 관계를 알아보기 위해, 본 발명자들은 애기장대 및 벼로부터 총 EXPBs, 근접한 HvEXPB1 상동체 및 AtEXPA7 오쏘로그를 이용하여 Neighbor-Joining tree를 구축하였다. 근접한 HvEXPB1 상동체는 non-redundant NCBI 단백질 서열 데이터베이스에 대한 총 HvEXPB1 단백질 서열의 블라스트 검색에 의해 얻었다. 블라스트 검색으로부터 그것들의 근접한 HvEXPB1 상동체는 Graminaceae (옥수수, 밀, 수수 및 벼) 및 쌍자엽 (감자, 토마토, 피마자, 포도, 포플러 및 애기장대)으로부터 가장 높은 점수의 EXPBs를 포함한다. 계통발생적 분석은 명확하게 익스펜신을 두개의 서브패밀리 EXPBs 및 EXPAs로 분리하였다(도 1). HvEXPB1는 벼 (OsEXPB5), 옥수수 (ZmEXPB2) 및 수수 (Sb06g024640 및 Sb06g024660) (도 1의 'RH' 클러스터)로부터 grass EXPBs와 밀접하게 클러스터링 되었는데, OsEXPB5는 HvEXPB1와 가장 높은 아미노산 서열 동일성을 나타내었다(총 단백질 서열을 정렬하였을 때 65.8%). 계통발생적 분석은 RH 클러스터에서 EXPBs이 HvEXPB1 오쏘로그일 수 있다는 것을 의미한다. 도 1에서 클러스터 'D'는 NCBI 단백질 블라스트 검색에서 HvEXPB1에 가장 높은 점수의 쌍자엽 EXPB 상동체를 포함한다. 클러스터 'D'는 독립적인 그룹을 형성하고, 클러스터 'RH'로부터 5 OsEXPBs를 포함하여 다른 Graminaceae EXPBs에 의해 분리되기 때문에, 'D' 클러스터에서 쌍자엽 EXPBs은 HvEXPB1-오쏘로그가 될 것 같지 않다. EXPBs의 퍼센트 아미노산 동일성 비교는 'RH' 및 'D' 클러스터가 두개의 분리된 EXPB 그룹이라는 개념을 또한 지지한다(도 2).
실시예 2. HvEXPB1 오쏘로그의 프로모터는 근부 영역(proximal region)에서 RHE-유사 cis -인자를 포함한다.
HvEXPB1 발현은 뿌리털 결함 보리 rh11.a 돌연변이체에서 손상되었는데, 유전자 전사체는 뿌리털 RNA 제조에서 적어도 발견되었다(Kwasniewski, M., and Szarejko, I. (2006) Plant Physiol. 141, 1149-1158). 이것은 본 발명자들이 HvEXPB1 발현이 뿌리 조직에서 뿌리털 특이적인지를 조사하게 하였다. EXPA7 오쏘로그의 근부 프로모터 영역이 뿌리털 세포 특이적 방식으로 유전자 발현을 지시하는 다중의 뿌리털 특이적 cis-인자(RHEs)를 포함한다는 것을 EXPA7 오쏘로그에 대한 앞선 연구에서 증명하였다(Kim et al., (2006) Plant Cell 18, 2958-2970). 그러므로, 본 발명자들은 HvEXPB1 오쏘로그의 프로모터가 RHE-유사 모티프를 또한 포함하는지 조사를 시도하였다. 다섯 개의 HvEXPB1 오쏘로그 중에서, 네개의 유전자 프로모터는 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스로부터 얻었다. 개시 코돈(ATG)으로부터 1000bp 상부 영역을 조사하였을 때, 다중의 RHE-유사 모티프가 이들 프로모터에서 발견되었다(도 3A). 이들 RHE는 적어도 최소의 필수 RHE 컨센서스 'NNNNTNNN(N)NNCACGNN'을 포함하였는데, N은 임의의 뉴클레오티드이고 굵은 글자의 뉴클레오티드는 이들의 위치에서 나타나야 한다(도 3B)(Kim et al., (2006) Plant Cell 18, 2958-2970). RHE 컨센서스 'NNNNTGNN(N)NNCACGT(/A)N'은 기능적으로 입증된 RHE에서 좀더 일반적이기 때문에 이러한 후자의 컨센서스는 'majority' RHE로 여기는 반면 전자는 'minority' RHE로 여겼다(도 3). HvEXPB1 프로모터는 두개의 인자가 역방향으로 있는 추정의 전사 개시 자리로부터 350bp 내에 네개의 majority 및 하나의 minority RHE-유사 인자를 가지고 있다. 845bp의 긴 OsEXPB5 프로모터는 3 RHEs를 포함하는데 이들 중 두개는 majority RHE 이다. 두개의 수수 오쏘로그 프로모터는 또한 RHE 모티프를 갖는데, Sb06g024640 프로모터는 단지 하나의 minority RHE를 갖고 Sb06g024660 프로모터는 두개의 majority 및 두개의 minority RHEs를 갖는다. HvEXPB1 오쏘로그의 근부 프로모터 영역에서 RHE-유사 인자의 존재는 이러한 유전자 프로모터가 EXPA7 오쏘로그에서 증명한 바와 유사하게 뿌리털 세포에서 특이적으로 작동될 수도 있다는 것을 제안한다.
실시예 3. HvEXPB1 및 OsEXPB5 의 프로모터는 벼의 뿌리털 세포에서 특이적으로 작동한다.
HvEXPB1 및 OsEXPB5의 프로모터가 벼 뿌리털 세포에서 특이적으로 작동하는지 알아보기 위해, 본 발명자들은 HvEXPB1 프로모터:GFP의 -492 (추정의 전사 개시 위치인 +1에 대하여) 결실 및 OsEXPB5 프로모터:GFP 리포터 구조체의 -344 결실을 벼 식물체에 아그로박테리움-매개 형질전환을 이용하여 도입시켰다. GFP 형광은 재분화된 T1 형질전환 벼 뿌리에서 공초점 현미경으로 관찰되었다. 녹색 형광은 OsEXPB5 및 HvEXPB1 프로모터:GFP 구조체(각각 pOsEXPB5:GFP 및 pHvEXPB5:GFP)에 대해 뿌리털 및 뿌리털 형성 세포에서 우세하게 관찰되었다(도 4). GFP 발현은 뿌리털 돌출의 출현 전에 몇몇 세포에서 발생하기 시작했다. 벼 뿌리 표피에서 뿌리털 세포의 분포 패턴은 기본적으로 타입 2 였는데(Kim et al., (2006) Plant Cell 18, 2958-2970), 비대칭적 분열 후 더 짧은 세포는 털(hair)로 자랐고, 뿌리의 긴 축을 따라서 교대의 털 분포 패턴(alternate hair distribution pattern)을 야기했다(Clowes, F.A.L. (2000) New Phytol. 146, 83-94). 본 발명에서 두개의 형질전환체에서 GFP 발현은 비록 몇몇의 털 세포 위치에서 GFP 발현이 없어지거나 인접하더라도 대개 타입 2 교대 패턴을 보였다(도 4D).
실시예 4. HvEXPB1 및 OsEXPB5 프로모터는 애기장대의 뿌리털 세포에서 유전자 발현을 특이적으로 지시한다.
본 발명자들은 Graminaceae로부터 RHE를 포함하는 EXPA7-오쏘로그 프로모터가 벼 뿐만 아니라 애기장대에서 뿌리털 특이적으로 작동하는 것을 앞서 보여주었는데, 이것은 RHE 및 RHE-결합 전사 인자가 쌍자엽 및 단자엽 사이에서 보존된다는 것을 제안하였다. 또한 HvEXPB1 및 OsEXPB5 프로모터에서 RHEs가 애기장대 뿌리털 세포에서 기능적인지 조사하기 위해, 본 발명자들은 절단된 프로모터:GFP 구조체를 애기장대 식물체로 도입시켰다.
HvEXPB1 프로모터에 대해, 3개의 결실된 프로모터:GFP 구조체를 제조하였는데, -492 결실은 5 RHEs를 포함하였고, -193 결실은 3 RHE을 포함하였고, -54 결실은 모든 RHEs를 배제하였다(도 5A). 그 후, 각 프로모터-결실 구조체에 대한 다중의 독립적인 형질전환 식물체(10~15)로부터 GFP 형광 수준을 정량적으로 평가하였다. -492 및 -193 프로모터 결실은 형질전환 뿌리로부터 GFP 형광의 유사 수준을 보여주었고, 형광은 뿌리털 세포 특이적이었다 (도 5B-D). 그러나, RHE가 없는 것을 포함하는 -54 결실은 뿌리에서 거의 완전하게 GFP 발현을 제거시켰다.
OsEXPB5 프로모터에 대해, 2개의 결실된 프로모터:GFP 구조체를 애기장대에 도입시켰다. -344 결실은 단지 하나의 RHE (E3)를 포함하였고, -63 결실은 RHE를 포함하지 않았다(도 6A). -344 결실은 애기장대 뿌리에서 GFP의 뿌리털-특이적 발현을 보여주었고(도 6D), 이것은 HvEXPB1 프로모터의 -492 결실보다 훨씬 더 약했는데, 아마도 -344 결실 OsEXPB5 프로모터에서 RHE의 더 적은 수 때문인 것 같다. E3가 -63 결실에 의해 배제되었을 때, OsEXPB5 프로모터는 뿌리에서 GFP 발현을 완전하게 잃었다(도 6B, C). RHE를 포함하는 두개의 'RH' 그룹 EXPB 프로모터의 프로모터 분석은 그들 프로모터에서 RHE가 단자엽(grass) 및 쌍자엽에서 뿌리털 특이적 유전자 발현을 사실상 지시하는 것을 제안한다.

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 1633 내지 2015 부위의 염기서열을 포함하는 식물 뿌리털 특이적 발현 프로모터.
  2. 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 식물 뿌리털 특이적 발현 프로모터.
  3. 제1항 또는 제2항의 뿌리털 특이적 발현 프로모터를 포함하는 뿌리털 특이적 식물 발현 벡터.
  4. 제3항의 뿌리털 특이적 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환된 식물체.
  6. 제3항의 뿌리털 특이적 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및
    상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 뿌리털 특이적으로 발현시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼이며, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항의 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 뿌리털 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체.
  10. 제9항의 형질전환 식물체의 종자.
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