WO2012020679A1 - Ａ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うための方法および試験片 - Google Patents

Ａ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うための方法および試験片 Download PDF

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism

Definitions

  • the present invention relates to a method and a test piece for simultaneously performing typing of influenza A virus and detection of oseltamivir phosphate resistance mutation.
  • Influenza is mainly divided into A, B, and C types.
  • influenza A has a wider variety of subtypes.
  • influenza caused by the H1N1 subtype influenza virus which is different from the conventional so-called seasonal H1N1 subtype influenza virus, called “new influenza”, was prevalent.
  • Pregnant women and children infected with this “new influenza virus” are said to be more likely to become more serious than pregnant women and children infected with seasonal H1N1 subtype influenza. Therefore, in the future diagnosis of influenza, whether or not it is this “new influenza” is also important.
  • the H3N2 subtype influenza virus which is a subtype different from the H1N1 subtype, is also in fashion.
  • oseltamivir phosphate (IUPAC name: ( ⁇ )-ethyl (3R, 4R, 5R) -4-acetamido-5-amino-3-ethylpropyl) cyclohex-1-ene- Anti-influenza virus agent (registered trademark: Tamiflu (F Hoffman La Roche registered trademark), manufacturer / distributor / Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., see Non-patent Document 2) based on carboxylate monophosphate) is known .
  • oseltamivir phosphate-resistant influenza A virus that has acquired resistance to oseltamivir phosphate has also become a problem. Because oseltamivir phosphate can cause frequent side effects such as abdominal pain, diarrhea and nausea, administration should be avoided for patients infected with oseltamivir phosphate resistant influenza A virus.
  • infected influenza virus is a new influenza virus, a seasonal influenza virus, or an A-type H3N2 subtype influenza virus, and information on the oseltamivir phosphate resistance mutation of the influenza virus can be obtained more quickly.
  • -A method that can be easily obtained is desired.
  • the present invention relates to the determination of whether the influenza A virus in a sample corresponds to a new influenza virus, a seasonal influenza virus, or an A type H3N2 subtype influenza virus, that is, typing of the influenza A virus in a sample,
  • An object of the present invention is to provide a reagent for detecting oseltamivir phosphate resistance mutation of influenza virus quickly and easily.
  • the present inventors have analyzed the polymorphism of the neuraminidase gene of influenza A virus, and have performed typing of influenza A virus in the sample and oseltamivir phosphate.
  • the present inventors have found that resistance mutations can be detected at a time, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides a test strip for simultaneously performing typing of influenza A virus in a sample and detection of oseltamivir phosphate resistance mutation, wherein the test strip has at least three probes fixed at different positions.
  • At least one of the probes can hybridize with any region consisting of the wild-type base sequence of the neuraminidase gene of the new influenza virus, but the wild-type base of the neuraminidase gene of another influenza virus
  • At least one of the probes is hybridized with an arbitrary region consisting of a wild-type base sequence of a neuraminidase gene of seasonal influenza virus.
  • At least one of the probes is (3-1) an influenza A virus Oligonucleotide that can hybridize with an arbitrary region consisting of a nucleotide sequence having a oseltamivir phosphate-resistant mutation of a neuraminidase gene, but cannot hybridize with an arbitrary region consisting of a wild-type base sequence of a neuraminidase gene of influenza A virus Or (3-2) oseltamivir phosphate resistance of influenza A virus neuraminidase gene, which can hybridize with any region consisting of the wild type nucleotide sequence of influenza A virus neuraminidase gene Consisting of an oligonucleotide which can not be arbitrary region hybridizing with a base sequence having a different.
  • the probe may be a probe different from the at least three probes, and (4) can hybridize with any region consisting of the wild-type base sequence of the neuraminidase gene of type A H3N2 subtype influenza virus. And at least one probe consisting of an oligonucleotide that cannot hybridize with any region consisting of the wild-type base sequence of another influenza virus neuraminidase gene is immobilized at a position different from the at least three probes of the test piece. ing.
  • the oseltamivir phosphate resistance mutation of the neuraminidase gene of influenza A virus is H275Y of the neuraminidase gene of type A H1N1 subtype influenza virus, and E119V of the neuraminidase gene of type A H3N2 subtype influenza virus, It is at least one selected from the group consisting of E119D and R292K.
  • the present invention also provides a kit for simultaneously performing typing of influenza A virus in a specimen and detection of oseltamivir phosphate resistance mutation, and the kit includes the above-mentioned test piece.
  • the kit includes a detection reagent for a hybridized probe and a primer pair for amplification of a neuraminidase gene of influenza A virus.
  • the present invention further provides a method for simultaneously performing typing of influenza A virus in a specimen and detection of oseltamivir phosphate resistance mutation, the method amplifying the neuraminidase gene of influenza A virus in the specimen
  • typing of influenza A virus in a sample and detection of oseltamivir phosphate resistance mutation can be performed quickly and easily. For this reason, an appropriate treatment can be performed on a patient who is likely to become serious, and at the same time, unnecessary administration of osetamivir phosphate can be avoided.
  • influenza A virus is a generic term for viruses classified into the genus A influenza virus of the Orthomyxoviridae family.
  • Influenza A virus has a large variation in two glycoproteins, hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), which protrude from the surface of the virus particle, and there are many subtypes. Subtypes are represented by, for example, H1N1, H2N2, H3N2, etc. mainly by serotype.
  • Influenza virus is an RNA virus, and its genome is composed of RNA.
  • the seasonal influenza virus refers to an influenza virus of the A type H1N1 subtype known before 2009.
  • seasonal influenza virus strains include A-Hawaii-21-2007H1N1 (accession number: EU516112; SEQ ID NO: 1), A-Paris-341-2007H1N1 (accession number: EU551811; SEQ ID NO: 3), A- Denmark-122-2008H1N1 (accession number: FJ264981; SEQ ID NO: 4), A-Hawaii-20-2008H1N1 (accession number: GQ475841; SEQ ID NO: 5), A-Chille-1-1983H1N1 (accession number: CY020439; SEQ ID NO: 6) and A-Kyoto-07K001-2007H1N1 (accession number: CY043591; SEQ ID NO: 7) and the like.
  • the new influenza virus is an influenza virus different from the conventional influenza virus among influenza viruses of the A type H1N1 subtype caused by influenza prevalent after 2009, and is named A / H1N1pdm Refers to the influenza virus.
  • the new influenza virus strain include A-California-04-2009-H1N1 (accession number: FJ969517; SEQ ID NO: 8) at the time of filing the present application.
  • H3N2 subtype influenza viruses include, for example, A-Boston-14-2008H3N2 (accession number: CY044494; SEQ ID NO: 10), A-Bethesda-956-2006H3N2 (accession number: GU968161; SEQ ID NO: 12 ), A-Texas-12-2007H3N2 (Accession number: FJ445772; SEQ ID NO: 13), A-Pennsylvania-13-2008H3N2 (Accession number: GQ369891; SEQ ID NO: 14), A-Texas-AF01-2007H3N2 (Accession) No .: CY044335; SEQ ID NO: 15) and A-Pennsylvania-PIT34-2008H3N2 (accession number: CY044359; SEQ ID NO: 16).
  • oseltamivir phosphate (IUPAC name: ( ⁇ )-ethyl (3R, 4R, 5R) -4-acetamido-5-amino-3-ethylpropyl) cyclohex-1-ene-carboxylate monophosphate)
  • Tamiflu an anti-influenza virus drug substance sold under the registered trademark: Tamiflu.
  • the oseltamivir phosphate resistance mutation of the neuraminidase (NA) gene of influenza A virus includes, for example, the NA gene of A type H1N1 subtype (whether new or seasonal) (for example, SEQ ID NO: 2 and 9) H275Y, A type H3N2 subtype NA gene (for example, SEQ ID NO: 11) E119V, E119D, R292K.
  • NA neuraminidase
  • H275Y means that the 275th amino acid of the protein encoded by the NA gene of influenza A virus has been mutated from wild-type histidine (H) to tyrosine (Y).
  • H histidine
  • Y tyrosine
  • the oseltamivir phosphate resistance mutation of the NA gene of influenza A virus is not limited to the known mutation as described above, and may be an unknown mutation.
  • a method for identifying an unknown mutation is not particularly limited.
  • the NA gene is isolated from oseltamivir phosphate-resistant influenza A virus using reverse transcription RT-PCR method, the nucleotide sequence of the gene is decoded, and then the decoded nucleotide sequence of the gene and the wild type
  • RT-PCR refers to PCR combined with reverse transcription (RT). Specifically, it means that cDNA (complementary DNA) is synthesized from RNA by reverse transcription and PCR is performed using the cDNA as a template.
  • the probe of the present invention is used as a test piece for simultaneously performing typing of influenza A virus in a specimen and detection of oseltamivir phosphate resistance mutation.
  • any region consisting of the wild type base sequence of the NA gene of the new influenza virus can be hybridized, but any region consisting of the wild type base sequence of the NA gene of another influenza virus Oligonucleotide probe that may not hybridize with (hereinafter may be referred to as “new type determination probe”), (2) can hybridize with any region consisting of the wild-type base sequence of the NA gene of seasonal influenza virus, Oligonucleotides that cannot hybridize to any region consisting of the wild-type nucleotide sequence of the NA gene of another influenza virus (hereinafter sometimes referred to as “seasonal determination probe”), (3-1) Nucleotide with oseltamivir phosphate resistance mutation of NA gene Oligonucleotide probe that can hybridize with any region consisting of the wild-type base sequence of the NA gene of influenza A virus (hereinafter sometimes referred to as “mutant probe”). ).
  • mutant probe (3-2) it can hybridize with any region consisting of the wild-type base sequence of the NA gene of influenza A virus, but oseltamivir phosphate of the NA gene of influenza A virus It may be an oligonucleotide probe (hereinafter sometimes referred to as “wild type probe”) that cannot hybridize with any region consisting of a base sequence having a resistance mutation.
  • wild type probe an oligonucleotide probe
  • each probe is generally 10 to 30 nucleotides, preferably 12 to 26 nucleotides, although it depends on the hybridization conditions.
  • the position of the mutation in the mutant probe is preferably near the center of the oligonucleotide constituting the mutant probe in order to reliably identify the mutation.
  • the probe of the present invention can be hybridized with any region comprising the wild type base sequence of the NA gene of (4) type A H3N2 subtype influenza virus, but the wild type base of the NA gene of other influenza viruses Examples include oligonucleotide probes that cannot hybridize to any region of the sequence (hereinafter sometimes referred to as “H3N2 subtype determination probe”).
  • the origin of the NA gene targeted by these two probes is not particularly limited to the influenza virus subtype.
  • an RT-PCR primer pair may be set so that the NA gene of new influenza virus and seasonal influenza virus can be amplified as a specimen.
  • an RT-PCR primer pair may be set so that the NA gene of the A-type H3N2-type influenza virus can also be amplified as a specimen.
  • mutant probe and wild-type probe in which the subtype of influenza virus from which the NA gene to be detected is specified is specified, “subtype” + “•” + “mutant / wild type”
  • type probe a mutant probe having a new influenza virus from which the NA gene to be detected is derived is named “new / mutant probe”.
  • a wild-type probe in which the influenza virus from which the NA gene to be detected is derived is an H3N2 subtype is named “H3N2 subtype / wild-type probe”.
  • Each of the above probes can be designed using standard programs and primer analysis software, such as Primer Express (Perkin Elmer), and synthesized using standard methods such as automated oligonucleotide synthesizers. Can do.
  • each probe may be modified at either the 5 'or 3' end to be fixed to the test piece.
  • At least three probes are fixed at different positions. At least one probe is a new type determination probe, at least one probe is a seasonal type determination probe, and at least one remaining probe is a mutant type probe or a wild type probe.
  • the test piece of the present invention can be prepared by fixing the probe to the surface of the carrier.
  • the surface of the carrier is divided and fixed for each probe.
  • the carrier include organic materials such as vinyl polymer, nylon, polyester, polyethylene, polypropylene, polystyrene, polyethylene terephthalate, and nitrocellulose; inorganic materials such as glass and silica; and metal materials such as gold and silver.
  • organic materials such as vinyl polymer, nylon, polyester, polyethylene, polypropylene, polystyrene, polyethylene terephthalate, and nitrocellulose
  • inorganic materials such as glass and silica
  • metal materials such as gold and silver.
  • An organic material is preferable in terms of easy molding processability, and polyesters such as polyethylene terephthalate are more preferable.
  • the carrier is preferably white in order to make the color development easily visible when the color development method is used in the following determination method.
  • a physical method and a chemical method may be mentioned.
  • the physical method is not particularly limited.
  • a method of coating the carrier surface with a polycationic polymer such as polylysine, and when the carrier surface is a metal material such as gold, a thiol or disulfide compound having an amino group such as 2-aminoethanethiol is used.
  • a method for treating the surface of the carrier can be mentioned. Since these methods use electrostatic interaction with a probe that is a polyanion, the immobilization efficiency can be increased.
  • immobilization efficiency can be increased by adding an irrelevant base sequence (such as a polythymine chain) to the end of the probe and increasing the molecular weight of the probe itself to be immobilized.
  • the probe can be fixed relatively easily by discharging a solution containing a polythymine-added oligonucleotide probe onto a nitrocellulose membrane using a dispenser and then irradiating the nitrocellulose membrane with ultraviolet rays.
  • the solution containing each probe is placed in a dispenser equipped with a 24-gauge needle and applied at a rate of 2.5 to 8.5 mm / sec while being discharged at a rate of 0.5 to 1.0 ⁇ L / min.
  • a stripe having a width of about 1 to 2 mm is formed in which the probes are arranged at a certain interval.
  • the probe is fixed on the surface of the nitrocellulose film by irradiating the nitrocellulose film on which the stripe of the probe is formed with ultraviolet rays. Furthermore, if necessary, if a thin cut is made so as to cross these stripes, a large number of test pieces in which the probes are sequentially fixed can be obtained at a time.
  • the chemical method is not particularly limited.
  • the end of the probe is modified with a functional group capable of silane coupling reaction such as trimethoxysilane or triethoxysilane, and the carrier is modified with a modified probe.
  • a method of immersing in a solution containing for 24 to 48 hours, taking out the solution, and then washing it may be mentioned.
  • the carrier is treated with a silane coupling agent having an amino group such as aminoethoxysilane so that the surface of the carrier is aminated and then subjected to an amino coupling reaction with a probe having a carboxylic acid introduced at the terminal. .
  • the end of the probe is modified with a functional group capable of binding to a metal such as a thiol group or a disulfide group, and the carrier is added to a solution containing the modified probe in 24 to A method of immersing for 48 hours, taking it out, and washing it.
  • the method of the present invention comprises the steps of amplifying the NA gene of influenza A virus in a sample, contacting the amplified NA gene with the test piece, and hybridizing with the probe fixed to the test piece, A step of detecting a probe hybridized with the amplified NA gene, and a step of simultaneously performing typing of influenza A virus and detection of oseltamivir phosphate resistance mutation from the position of the detected probe.
  • the sample refers to a substance containing influenza virus.
  • the specimen include nasal cavity and throat swab, and influenza virus obtained by culturing from these. Extraction of RNA from a sample can be carried out as appropriate, but the “Pathogen Detection Manual (URL: http://www.nih.go.jp/niid/reference/) published on the homepage of the International Institute for Infectious Diseases. pathogen-manual-60.pdf) ".
  • RT-PCR is performed using the influenza A virus RNA in the sample as a starting material. Conditions for amplifying the influenza virus NA gene by RT-PCR are appropriately set, and the above-mentioned “Pathogen Detection Manual” can be referred to.
  • the primer pair used for RT-PCR may be designed so that almost the entire region of cDNA corresponding to the NA gene synthesized from the target RNA by reverse transcription can be amplified.
  • an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 17 and 18 described in the following examples is seasonal.
  • an oligonucleotide having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 19 and 20 described in the following examples As a primer for amplifying the NA gene of H3N2 subtype influenza virus (hereinafter sometimes referred to as “primer for H3N2 subtype”), an oligonucleotide comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 21 and 22 described in the following Examples Respectively.
  • the NA gene can be amplified by RT-PCR regardless of whether the influenza A virus is H1N1 or H3N2 subtype.
  • the influenza virus in the sample is likely to be B-type or C-type. it can.
  • the primer sequence can also be obtained by using a standard program and primer analysis software, for example, Primer Express (manufactured by Perkin Elmer), in the same manner as the above-described probe, and a standard method such as an automated oligonucleotide synthesizer. Can be synthesized.
  • the method of contacting the amplified NA gene with the test strip and hybridizing with the probe immobilized on the test strip is not particularly limited.
  • a method of immersing a test piece in a solution containing the amplified NA gene for a predetermined time can be mentioned. Conditions such as the temperature during the immersion are appropriately set in consideration of suppression of non-specific hybridization.
  • the method for determining the probe hybridized with the amplified NA gene is not particularly limited.
  • a method for detecting these labeling substances added to the amplified NA gene Is mentioned.
  • a probe is modified with a labeling substance such as a radioisotope, a fluorescent substance, or a chemiluminescent substance, and a probe hybridized with an NA gene amplified using these labeling substances as a clue is detected.
  • the method for detecting the labeling substance is not particularly limited. For example, a nitro blue tetrazolium (NBT) / 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatase-p-toluidinyl salt (BCIP) color development method can be mentioned.
  • NBT nitro blue tetrazolium
  • BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatase-p-toluidinyl salt
  • a primer pair in which the 3 'or 5' end is modified with biotin is used.
  • the test piece is immersed in a solution containing a gene having biotin at the amplified end.
  • the amplified NA gene can hybridize with the probe fixed to the test piece.
  • the specimen is then washed and immersed in a solution containing alkaline phosphatase labeled streptavidin.
  • alkaline phosphatase-labeled streptavidin binds to the NA gene hybridized with the probe immobilized on the test piece.
  • NBT / BCIP is added to the washed test piece, and color development due to the reaction of alkaline phosphatase is detected. This color development is visible. In order to clarify the presence / absence of color development, a difference in color development between the wild type probe and the mutant type probe may be confirmed.
  • Each probe is associated with a new influenza virus, a seasonal influenza virus and an influenza H3N2 subtype influenza virus, and the oseltamivir phosphate resistance of the influenza virus, so that typing of influenza A virus in the sample and oseltamivirlin Detection of acid salt tolerance mutations can be performed simultaneously.
  • the kit of this invention contains said test piece.
  • any reagent suitable for simultaneous typing of influenza A virus in the sample and detection of oseltamivir phosphate resistance mutation may be included.
  • reagents include gene amplification reagents and detection reagents for hybridized probes.
  • the gene amplification reagent may also include an RT-PCR amplification primer pair.
  • reagents for detecting hybridized probes include biotin, streptavidin-modified alkaline phosphatase, NBT, and BCIP in the case of the NBT / BCIP color development method.
  • Example 1 Preparation of a test piece for simultaneously performing typing of influenza A virus and detection of oseltamivir phosphate resistance mutation
  • Probe Synthesis The following new type determination probe, seasonal type determination probe, and H3N2 subtype determination probe are prepared.
  • New determination probe GAAATGAATGCCCCTAATTA (SEQ ID NO: 23)
  • Seasonal probe GAGTTGAATGCACCCAATTT (SEQ ID NO: 24)
  • H3N2 subtype determination probe ACATTGTCAGGAAGTGCTCA (SEQ ID NO: 25)
  • DNA amplified by RT-PCR using new influenza RNA as a starting material DNA amplified by RT-PCR using seasonal influenza RNA as a starting material
  • H3N2 subtype influenza RNA shown below A wild type probe and a mutant probe are prepared for DNA amplified by RT-PCR as a starting material.
  • New and wild type probe CCCTAATTATCACTATGAGG (SEQ ID NO: 26) New / mutant probe: CCCTAATTATTACTATGAGG (SEQ ID NO: 27) Seasonal / wild type probe: ACCCAATTTTCATTATGAGG (SEQ ID NO: 28) Seasonal / mutant probe: ACCCAATTTTTATTATGAGG (SEQ ID NO: 29) H3N2 subtype / wild type probe 1: TGACAAGAGAACCTTATGTG (SEQ ID NO: 30) H3N2 subtype / mutant probe 1a: TGACAAGAGTACCTTATGTG (SEQ ID NO: 31) H3N2 subtype / mutant probe 1b: TGACAAGAGACCTTTATGTG (SEQ ID NO: 32) H3N2 subtype / wild type probe 2: TGACAAGAGAACTTTATGTG (SEQ ID NO: 33) H3N2 subtype / mutant probe 2: TGACAAGAGACCTTTATGTG (SEQ ID NO: 34)
  • the H3N2 subtype / wild type probe 1 and the H3N2 subtype / mutant probe 1a are probes corresponding to the E119V mutation of the NA gene of the H3N2 subtype (regardless of the new type or seasonal type).
  • the H3N2 subtype / wild type probe 2 and the H3N2 subtype / mutant probe 1b are probes corresponding to the E119D mutation of the NA gene of the H3N2 subtype.
  • the H3N2 subtype / wild type probe 2 and the H3N2 subtype / mutant probe 2 are probes corresponding to the R292K mutation of the NA gene of the H3N2 subtype.
  • Probe Immobilization Polythymine is added to the 5 ′ end of each probe using terminal transferase (Promega). Specifically, 0.4 ⁇ L of terminal transferase (30 units / ⁇ L), 2 ⁇ L of thymidine triphosphate (10 pmol / ⁇ L), 2 ⁇ L of oligonucleotide probe (50 mM), 2 ⁇ L of reaction buffer attached to the product, and purified water A reaction solution was prepared by mixing 3.6 ⁇ L, reacted at 37 ° C. for 4 hours, and then added with 90 ⁇ L of 10 ⁇ SSC buffer solution to the reaction solution, thereby containing a solution containing an oligonucleotide probe to which polythymine was added ( 1 pmol / ⁇ L).
  • the solution containing each probe to which polythymine has been added is placed in a dispenser equipped with a 24-gauge needle, and discharged at a rate of 0.7 mm / min. It is applied in a vertical direction at intervals of 2 mm on a nitrocellulose film (length 75 mm ⁇ width 150 mm: manufactured by Whatman) so as to form a stripe of Next, the probe is fixed to the nitrocellulose membrane by irradiating these nitrocellulose membranes with ultraviolet rays of 312 nm for 2 minutes. Next, the nitrocellulose membrane is cut so as to include all the stripes, thereby producing a test piece of 5 mm ⁇ 150 mm.
  • Example 2 Simultaneous implementation of influenza A virus typing and detection of oseltamivir phosphate resistance mutation using the test piece of Example 1.
  • Amplification of NA gene by RT-PCR Nasal swabs of patients suspected of influenza are collected. This specimen was prepared by using the new primer 1 consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17, the new primer 2 consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 and having biotin bound to the 5 ′ end, and the sequence shown in SEQ ID NO: 19.
  • Seasonal primer 1 consisting of a base sequence
  • seasonal primer 2 consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 and biotin bound to the 5 ′ end
  • H3N2 subtype consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 21
  • Amplification is performed by PCR using primer 1, primer 3 for H3N2 subtype consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 22 and having biotin bound to the 5 ′ end, and Taq DNA polymerase (Roche Diagnostics).
  • New primer 1 ATGAATCCAAACCAAAAGATAATAA (SEQ ID NO: 17)
  • New primer 2 AGACCAACCCACAGTGTCACTGTTT (SEQ ID NO: 18)
  • Seasonal primer 1 ATGAACCCAAATCAAAAGATAATAA (SEQ ID NO: 19)
  • Seasonal primer 2 AGACCAGTTTGCAGTATCACTATTA (SEQ ID NO: 20)
  • H3N2 subtype primer 1 ATGAATCCAAATCAAAAGATAATAA (SEQ ID NO: 21)
  • Primer 2 for H3N2 subtype TGAGCCTGTTCCATATGTACCTGAG (SEQ ID NO: 22)
  • test piece is taken out from the mixed solution, washed, and alkaline phosphatase-labeled streptavidin is added to the test piece. Further, nitroblue tetrazolium (NBT) and 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatase-p-toluidinyl are added. Salt (BCIP) is added to color the specimen.
  • influenza A virus in a sample and detection of oseltamivir phosphate resistance mutation can be performed quickly and easily. For this reason, it becomes possible to treat appropriately the patient infected with the new influenza virus with a high risk of seriousness, and the patient infected with the influenza A virus of the oseltamivir phosphate tolerance.
  • Appropriate implementation of influenza treatment not only reduces the burden on patients and doctors, but also contributes to reducing the medical costs of society as a whole.

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Abstract

　本発明によれば、検体中のＡ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを迅速・簡便に行うための試薬が提供される。

Description

Ａ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うための方法および試験片
　本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うための方法および試験片に関する。
　現在、厚生労働省の資料によれば、日本では年間約１万人が、地球規模では年間約２５～５０万人がインフルエンザ（超過死亡概念）により死亡しているといわれている（非特許文献１参照）。インフルエンザは、主にＡ、Ｂ、Ｃ型に大別される。特にＡ型インフルエンザは、さらに多種多様の亜型が存在する。２００９年度は、「新型インフルエンザ」と称される、従来の、いわゆる季節型のＨ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスとは異なる、Ｈ１Ｎ１亜型のインフルエンザウイルスに起因するインフルエンザが流行した。この「新型インフルエンザウイルス」に感染した妊婦および小人は、季節型のＨ１Ｎ１亜型インフルエンザに感染した妊婦および小人と比較して、重篤化しやすいといわれている。したがって、今後のインフルエンザの診断においては、この「新型インフルエンザ」であるか否かも重要となる。また、Ｈ１Ｎ１亜型とは異なる亜型である、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスも流行を起こしている。
　また、インフルエンザに有効な医薬品として、オセルタミビルリン酸塩（ＩＵＰＡＣ名：（－）－エチル（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－アセトアミド－５－アミノ－３－エチルプロピル）シクロヘックス－１－エン－カルボキシレート　モノホスフェート）を原薬とする抗インフルエンザウイルス剤（登録商標：タミフル（Ｆ　ホフマン・ラ・ロシュ社登録商標）、製造販売元／中外製薬社、非特許文献２参照）が知られている。
　しかし、最近は、オセルタミビルリン酸塩に対する耐性を獲得したオセルタミビルリン酸塩耐性のＡ型インフルエンザウイルスの存在も問題となっている。オセルタミビルリン酸塩は、腹痛、下痢および嘔気などの頻度の高い副作用のおそれがあるので、オセルタミビルリン酸塩耐性のＡ型インフルエンザウイルスに感染した患者には、投与を避けるべきである。
　このように、感染したインフルエンザウイルスが新型インフルエンザウイルス、季節型インフルエンザウイルスまたはＡ型Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのいずれに該当するかの情報、および該インフルエンザウイルスのオセルタミビルリン酸塩耐性変異に関する情報をより迅速・簡便に得ることができる方法が望まれている。
URL: http://www.mhlw.go.jp/bunya/kenkou/kekkaku-kansenshou04/02.html#100 「タミフル（登録商標）カプセル７５」添付文書、２００９年１２月改訂（第２１版）
　本発明は、検体中のＡ型インフルエンザウイルスが新型インフルエンザウイルス、季節型インフルエンザウイルスまたはＡ型Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのいずれに該当するかの判定、すなわち検体中のＡ型インフルエンザウイルスのタイピングと、該インフルエンザウイルスのオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを迅速・簡便に行うための試薬を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の多型を解析することにより、検体中のＡ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを一度に行うことができることを見出し、本発明を完成した。
　本発明は、検体中のＡ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うための試験片を提供し、該試験片は、少なくとも３つのプローブが異なる位置に固定されており、（１）該プローブのうちの少なくとも１つのプローブは、新型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、他のインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドからなり、（２）該プローブのうちの少なくとも１つのプローブは、季節型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、他のインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドからなり、（３）該プローブのうちの少なくとも１つのプローブは、（３－１）Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のオセルタミビルリン酸塩耐性変異を有する塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチド、または（３－２）Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のオセルタミビルリン酸塩耐性変異を有する塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドからなる。
　１つの実施態様では、さらに、上記少なくとも３つのプローブとは異なるプローブであって、（４）Ａ型Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、他のインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１つのプローブが、上記試験片の該少なくとも３つのプローブとは異なる位置に固定されている。
　１つの実施態様では、上記Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のオセルタミビルリン酸塩耐性変異は、Ａ型Ｈ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のＨ２７５Ｙ、ならびにＡ型Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のＥ１１９Ｖ、Ｅ１１９ＤおよびＲ２９２Ｋからなる群より選択される少なくとも１種である。
　本発明はまた、検体中のＡ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うためのキットを提供し、該キットは、上記試験片を含む。
　１つの実施態様では、上記キットは、ハイブリダイズしたプローブの検出用試薬およびＡ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子増幅用プライマー対を含む。
　本発明はさらに、検体中のＡ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うための方法を提供し、該方法は、検体中のＡ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子を増幅する工程、増幅したノイラミニダーゼ遺伝子を請求項１から３のいずれかの項に記載の試験片と接触させて、該試験片に固定された上記プローブとハイブリダイズさせる工程、該増幅したノイラミニダーゼ遺伝子がハイブリダイズしたプローブを検出する工程、および検出したプローブの位置からＡ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行う工程を含む。
　本発明によれば、検体中のＡ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを迅速・簡便に行うことができる。このため、重篤化のおそれのある患者に対して適切な処置ができると同時にオセタミビルリン酸塩の不必要な投与を回避することができる。
Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の塩基配列ならびに設計したプライマーおよびプローブの位置の関係を示す図である。 Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の塩基配列ならびに設計したプライマーおよびプローブの位置の関係を示す図である。 Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の塩基配列ならびに設計したプライマーおよびプローブの位置の関係を示す図である。
　本発明において、Ａ型インフルエンザウイルスとは、オルトミクソウイルス科のＡ型インフルエンザウイルス属に分類されるウイルスの総称をいう。Ａ型インフルエンザウイルスは、ウイルス粒子の表面に突出するヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）という二つの糖たんぱく質の変異が大きく、多くの亜型が存在する。亜型は、主に血清型により、例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２などと表記される。インフルエンザウイルスはＲＮＡウイルスであり、ＲＮＡからゲノムが構成される。
　本発明において、季節型インフルエンザウイルスとは、２００９年より前に知られているＡ型のＨ１Ｎ１亜型のインフルエンザウイルスをいう。季節型インフルエンザウイルス株としては、例えば、Ａ－Ｈａｗａｉｉ－２１－２００７Ｈ１Ｎ１（アクセッション番号：EU516112；配列番号１）、Ａ－Ｐａｒｉｓ－３４１－２００７Ｈ１Ｎ１（アクセッション番号：EU551811；配列番号３）、Ａ－Ｄｅｎｍａｒｋ－１２２－２００８Ｈ１Ｎ１（アクセッション番号：FJ264981；配列番号４）、Ａ－Ｈａｗａｉｉ－２０－２００８Ｈ１Ｎ１（アクセッション番号：GQ475841；配列番号５）、Ａ－Ｃｈｉｌｅ－１－１９８３Ｈ１Ｎ１（アクセッション番号：CY020439；配列番号６）、および、Ａ－Ｋｙｏｔｏ－０７Ｋ００１－２００７Ｈ１Ｎ１（アクセッション番号：CY043591；配列番号７）などが挙げられる。
　本発明において、新型インフルエンザウイルスとは、２００９年以降に流行したインフルエンザに起因するＡ型のＨ１Ｎ１亜型のインフルエンザウイルスのうち、従来のインフルエンザウイルスとは異なるインフルエンザウイルスであって、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍと命名されたインフルエンザウイルスをいう。新型インフルエンザウイルス株としては、本願出願当時において、例えば、Ａ－Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ－０４－２００９－Ｈ１Ｎ１（アクセッション番号：FJ969517；配列番号８）が挙げられる。
　本発明において、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスとしては、例えば、Ａ－Ｂｏｓｔｏｎ－１４－２００８Ｈ３Ｎ２（アクセッション番号：CY044494；配列番号１０）、Ａ－Ｂｅｔｈｅｓｄａ－９５６－２００６Ｈ３Ｎ２（アクセッション番号：GU968161；配列番号１２）、Ａ－Ｔｅｘａｓ－１２－２００７Ｈ３Ｎ２（アクセッション番号：FJ445772；配列番号１３）、Ａ－Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ－１３－２００８Ｈ３Ｎ２（アクセッション番号：GQ369891；配列番号１４）、Ａ－Ｔｅｘａｓ－ＡＦ０１－２００７Ｈ３Ｎ２（アクセッション番号：CY044335；配列番号１５）、および、Ａ－Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ－ＰＩＴ３４－２００８Ｈ３Ｎ２（アクセッション番号：CY044359；配列番号１６）などが挙げられる。
　本発明において、オセルタミビルリン酸塩（ＩＵＰＡＣ名：（－）－エチル（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－アセトアミド－５－アミノ－３－エチルプロピル）シクロヘックス－１－エン－カルボキシレート　モノホスフェート）とは、登録商標：タミフルが付されて販売されている抗インフルエンザウイルス剤の原薬をいう。
　本発明において、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子のオセルタミビルリン酸塩耐性変異としては、例えば、Ａ型Ｈ１Ｎ１亜型（新型または季節型を問わない）のＮＡ遺伝子（例えば、配列番号２および９）のＨ２７５Ｙ、Ａ型Ｈ３Ｎ２亜型のＮＡ遺伝子（例えば、配列番号１１）のＥ１１９Ｖ、Ｅ１１９Ｄ、Ｒ２９２Ｋが挙げられる。
　ここで、例えば、「Ｈ２７５Ｙ」とは、Ａ型インフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子がコードするタンパク質の第２７５番目のアミノ酸が野生型のヒスチジン（Ｈ）からチロシン（Ｙ）に変異したことを意味する。「Ｈ」、「Ｙ」などはアミノ酸の１文字表記である。
　Ａ型インフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子のオセルタミビルリン酸塩耐性変異は、上記のような既知の変異に制限されず、未知の変異でもよい。未知の変異を同定する方法は特に制限されない。例えば、オセルタミビルリン酸塩耐性のＡ型インフルエンザウイルスより逆転写ＲＴ－ＰＣＲ法などを用いてＮＡ遺伝子を単離し、該遺伝子の塩基配列を解読し、次いで解読した該遺伝子の塩基配列と野生型のＮＡ遺伝子の塩基配列とを比較することにより変異を同定する方法が挙げられる。なお、本発明において、ＲＴ－ＰＣＲとは、逆転写（ＲＴ：Reverse Transcription）と組み合わせたＰＣＲをいう。具体的には、ＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）を合成し、ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことをいう。
　（プローブ）
　本発明のプローブは、検体中のＡ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うための試験片に用いられる。
　本発明のプローブとしては、（１）新型インフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、他のインフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「新型判定プローブ」という場合がある）、（２）季節型インフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、他のインフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチド（以下、「季節型判定プローブ」という場合がある）、（３－１）Ａ型インフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子のオセルタミビルリン酸塩耐性変異を有する塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、Ａ型インフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「変異型プローブ」という場合がある）が挙げられる。
　また、変異型プローブの代わりとして、（３－２）Ａ型インフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、Ａ型インフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子のオセルタミビルリン酸塩耐性変異を有する塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「野生型プローブ」という場合がある）であってもよい。
　各プローブの長さは、ハイブリダイズさせる条件にもよるが、一般的には１０～３０ヌクレオチド長、好ましくは１２～２６ヌクレオチド長である。また、変異型プローブにおける変異の位置は、変異を確実に識別するために、変異型プローブを構成するオリゴヌクレオチドの中央近辺が好ましい。
　さらに、本発明のプローブとしては、（４）Ａ型Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、他のインフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「Ｈ３Ｎ２亜型判定プローブ」という場合がある）が挙げられる。
　なお、本発明において、変異型プローブおよび野生型プローブに関しては、これら２つのプローブが検出対象とするＮＡ遺伝子の由来をインフルエンザウイルスの亜型まで特に限定していない。本発明の試験片にＨ３Ｎ２亜型判定プローブが固定されていない場合は、検体として新型インフルエンザウイルスおよび季節型インフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子を増幅できるようにＲＴ－ＰＣＲのプライマー対を設定すればよい。本発明の試験片にＨ３Ｎ２亜型判定プローブが固定されている場合は、検体としてＡ型Ｈ３Ｎ２型インフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子も増幅できるようにＲＴ－ＰＣＲのプライマー対を設定すればよい。なお、本発明において、検出対象とするＮＡ遺伝子の由来となるインフルエンザウイルスの亜型が特定されている変異型プローブおよび野生型プローブについては、「亜型」＋「・」＋「変異型／野生型プローブ」というルールで名付けることがある。例えば、検出対象とするＮＡ遺伝子の由来となるインフルエンザウイルスが新型である変異型プローブは、「新型・変異型プローブ」と名付ける。例えば、検出対象とするＮＡ遺伝子の由来となるインフルエンザウイルスがＨ３Ｎ２亜型である野生型プローブは、「Ｈ３Ｎ２亜型・野生型プローブ」と名付ける。
　上記の各プローブは、標準的なプログラムおよびプライマー解析ソフトウェア、例えば、Primer Express（Perkin Elmer社）を用いることにより設計することができ、自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーなどの標準的な方法を用いて合成することができる。
　さらに、各プローブは、以下で詳述するように、試験片に固定するために５’または３’末端のいずれか一方が修飾されていてもよい。
　（試験片）
　本発明の試験片は、少なくとも３つのプローブが異なる位置に固定されている。少なくとも１つのプローブは新型判定プローブであり、少なくとも１つのプローブは季節型判定プローブであり、残る少なくとも１つのプローブは変異型プローブまたは野生型プローブである。
　本発明の試験片は、上記プローブを担体表面に固定して作製することができ、複数のプローブを固定する場合は、プローブ毎に担体表面を区切って固定する。担体としては、例えば、ビニル系ポリマー、ナイロン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ニトロセルロースなどの有機材料；ガラス、シリカなどの無機材料；金、銀などの金属材料が挙げられるが、特に限定されない。成形加工性が容易である点で、有機材料が好ましく、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル類がより好ましい。担体は、以下の判定方法において発色法を用いる場合には、発色を視認しやすくするために白色であることが好ましい。
　プローブを担体表面に固定する方法としては、物理的方法および化学的方法が挙げられる。物理的方法は特に制限されない。例えば、担体表面をポリリジンなどのポリカチオン性の高分子で被覆する方法、担体表面が金などの金属材料である場合には、２－アミノエタンチオールなどのアミノ基を有するチオールまたはジスルフィド化合物などで担体表面を処理する方法が挙げられる。これらの方法は、ポリアニオンであるプローブとの静電相互作用を利用するため、固定効率を上げることができる。さらに、プローブの末端に無関係な塩基配列（ポリチミン鎖など）を付加し、固定されるプローブ自体の分子量を増大させることによって、固定効率を上げることもできる。例えば、ポリチミン付加オリゴヌクレオチドプローブを含む溶液を、ディスペンサを用いてニトロセルロース膜上に吐出し、次いでニトロセルロース膜に紫外線を照射することによって、比較的容易にプローブを固定することができる。具体的には、各プローブを含む溶液をそれぞれ２４ゲージの針を備えたディスペンサに入れ、０．５～１．０μＬ／分の量で吐出させながら、２．５～８．５ｍｍ／秒の塗布速度で、それぞれ一定の間隔をあけてニトロセルロース膜上に塗布すると、各プローブが一定の間隔で並んだ約１～２ｍｍの幅のストライプが形成される。このプローブのストライプが形成されたニトロセルロース膜に紫外線を照射することによって、プローブがニトロセルロース膜表面に固定される。さらに、必要に応じて、これらのストライプを横断するように細く切断すると、各プローブが順に固定された多数の試験片を一挙に得ることができる。
　化学的方法は特に制限されない。例えば、担体の材料がガラス、シリコンなどの無機材料である場合には、プローブの末端をトリメトキシシラン、トリエトキシシランなどのシランカップリング反応が可能な官能基で修飾し、担体を、修飾プローブを含む溶液に２４～４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄する方法が挙げられる。あるいは、担体を、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することにより、担体の表面をアミノ化し、次いで末端にカルボン酸を導入したプローブとアミノカップリング反応させる方法が挙げられる。担体の材料が金、銀などの金属材料である場合には、プローブの末端をチオール基、ジスルフィド基などの金属と結合可能な官能基で修飾し、担体を、修飾プローブを含む溶液に２４～４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄する方法が挙げられる。
　プローブを担体表面に固定する方法としては、合成したプローブを固定する方法以外に、リソグラフィー技術などを利用して、プローブを担体表面上で合成する方法が挙げられる。
　（Ａ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うための方法）
　本発明の方法は、検体中のＡ型インフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子を増幅する工程、増幅したＮＡ遺伝子を上記試験片と接触させて、該試験片に固定された上記プローブとハイブリダイズさせる工程、該増幅したＮＡ遺伝子がハイブリダイズしたプローブを検出する工程、および検出したプローブの位置からＡ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行う工程を含む。
　以下は、本発明の方法について説明する。
　１．検体
　本発明において、検体とは、インフルエンザウイルスを含む物質をいう。検体としては、例えば、鼻腔および咽頭ぬぐい液、ならびにこれらから培養して得られたインフルエンザウイルス自体が挙げられる。検体からのＲＮＡの抽出は適宜実施することができるが、国際感染症研究所のホームページで公表されている「病原体検出マニュアル（ＵＲＬ：http://www.nih.go.jp/niid/reference/pathogen-manual-60.pdf）」を参考にすることができる。
　２．ＲＴ－ＰＣＲ
　次に上記検体中のＡ型インフルエンザウイルスのＲＮＡを出発材料として、ＲＴ－ＰＣＲを実施する。ＲＴ－ＰＣＲでインフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子を増幅するための条件は適宜設定されるが、上記の「病原体検出マニュアル」を参考にすることができる。ＲＴ－ＰＣＲに用いるプライマー対は、目的のＲＮＡから逆転写により合成されたＮＡ遺伝子に対応するｃＤＮＡのほぼ全領域を増幅できるように設計すればよい。新型インフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子を増幅するプライマー対（以下、「新型用プライマー」という場合がある）としては、以下の実施例に記載の配列番号１７および１８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが、季節型インフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子を増幅するプライマー対（以下、「季節型用プライマー」という場合がある）としては、以下の実施例に記載の配列番号１９および２０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子を増幅するプライマー（以下、「Ｈ３Ｎ２亜型用プライマー」という場合がある）としては、以下の実施例に記載の配列番号２１および２２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがそれぞれ挙げられる。これら全てのプライマー対を同時に用いてＲＴ－ＰＣＲを実施すれば、Ａ型インフルエンザウイルスがＨ１Ｎ１亜型またはＨ３Ｎ２亜型であるかを問わず、ＲＴ－ＰＣＲによりＮＡ遺伝子を増幅することができるので好ましい。なお、例えば、配列番号１７～２２全てのプライマー対を同時に用いてＲＴ－ＰＣＲを行い、ＤＮＡが増幅されない場合は、検体中のインフルエンザウイルスはＢ型またはＣ型である可能性が高いということもできる。また、プライマーの配列も、上記のプローブと同様、標準的なプログラムおよびプライマー解析ソフトウェア、例えばPrimer Express（Perkin Elmer社製）を用いることにより得ることができ、自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーなどの標準的な方法を用いて合成することができる。
　３．Ａ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出
　増幅したＮＡ遺伝子を上記試験片と接触させて、試験片に固定されたプローブとハイブリダイズさせる方法は特に制限されない。例えば、増幅したＮＡ遺伝子を含む溶液に試験片を一定時間浸漬する方法が挙げられる。浸漬中の温度などの条件は、非特異的なハイブリダゼーションの抑制などを考慮して適宜設定される。
　増幅したＮＡ遺伝子がハイブリダイズしたプローブを判定する方法は特に制限されない。例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法により増幅する際に、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などの標識物質で修飾したプライマー対を用い、増幅したＮＡ遺伝子に付加されたこれらの標識物質を検出する方法が挙げられる。あるいは、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などの標識物質でプローブを修飾し、これらの標識物質を手がかりに増幅したＮＡ遺伝子がハイブリダイズしたプローブを検出する方法が挙げられる。標識物質を検出する方法は特に制限されない。例えば、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスファターゼ－ｐ－トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）発色法が挙げられる。
　具体的には、ＲＴ－ＰＣＲ法を行う際に、３’または５’末端をビオチンで修飾したプライマー対を用いる。次いで、増幅した末端にビオチンを有する遺伝子を含む溶液に試験片を浸漬する。この工程で、増幅したＮＡ遺伝子は試験片に固定されたプローブとハイブリダイズし得る。次いで、試験片を洗浄し、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを含む溶液に浸漬する。この工程で、試験片に固定されたプローブとハイブリダイズしたＮＡ遺伝子にアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンが結合する。次いで、洗浄した試験片にＮＢＴ／ＢＣＩＰを添加し、アルカリホスファターゼの反応による発色を検出する。この発色は視認可能である。発色の有無をより明確にするために、野生型プローブと変異型プローブとで発色の差異を確認してもよい。
　ＲＴ－ＰＣＲにより増幅したＮＡ遺伝子がハイブリダイズしたプローブの位置から、いずれのプローブとハイブリダイズしたかがわかる。各プローブは新型インフルエンザウイルス、季節型インフルエンザウイルスおよびＡ型Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルス、ならびに該インフルエンザウイルスのオセルタミビルリン酸塩耐性と対応づけられているため、検体中のＡ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うことができる。
　（Ａ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うためのキット）
　本発明のキットは、上記の試験片を含む。好ましくは、検体中のＡ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うために適切な任意の試薬類を含み得る。試薬類としては、例えば、遺伝子増幅用試薬、ハイブリダイズしたプローブの検出用試薬が挙げられる。遺伝子増幅用試薬は、ＲＴ－ＰＣＲの増幅用プライマー対も含み得る。ハイブリダイズしたプローブの検出用試薬としては、例えば、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ発色法の場合、ビオチン、ストレプトアビジン修飾アルカリホスファターゼ、ＮＢＴおよびＢＣＩＰが挙げられる。
　以下に、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
　（実施例１：Ａ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うための試験片の作製）
　１．プローブの合成
　以下に示す、新型判定プローブ、季節型判定プローブおよびＨ３Ｎ２亜型判定プローブを作製する。
　新型判定プローブ　　　　：GAAATGAATGCCCCTAATTA（配列番号２３）
　季節型判定プローブ　　　：GAGTTGAATGCACCCAATTT（配列番号２４）
　Ｈ３Ｎ２亜型判定プローブ：ACATTGTCAGGAAGTGCTCA（配列番号２５）
　また、以下に示す、新型インフルエンザのＲＮＡを出発材料とするＲＴ－ＰＣＲで増幅したＤＮＡ、季節型インフルエンザのＲＮＡを出発材料とするＲＴ－ＰＣＲで増幅したＤＮＡ、および、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザのＲＮＡを出発材料とするＲＴ－ＰＣＲで増幅したＤＮＡに対する、野生型プローブおよび変異型プローブをそれぞれ作製する。
　新型・野生型プローブ　　　　　 ：CCCTAATTATCACTATGAGG（配列番号２６）
　新型・変異型プローブ　　　　　 ：CCCTAATTATTACTATGAGG（配列番号２７）
　季節型・野生型プローブ　　　　 ：ACCCAATTTTCATTATGAGG（配列番号２８）
　季節型・変異型プローブ　　　　 ：ACCCAATTTTTATTATGAGG（配列番号２９）
　Ｈ３Ｎ２亜型・野生型プローブ１ ：TGACAAGAGAACCTTATGTG（配列番号３０）
　Ｈ３Ｎ２亜型・変異型プローブ１a：TGACAAGAGTACCTTATGTG（配列番号３１）
　Ｈ３Ｎ２亜型・変異型プローブ１b：TGACAAGAGACCTTTATGTG（配列番号３２）
　Ｈ３Ｎ２亜型・野生型プローブ２ ：TGACAAGAGAACTTTATGTG（配列番号３３）
　Ｈ３Ｎ２亜型・変異型プローブ２ ：TGACAAGAGACCTTTATGTG（配列番号３４）
　ここで、新型・野生型プローブ、新型・変異型プローブ、季節型・野生型プローブ、および季節型・変異型プローブは、Ｈ１Ｎ１亜型（新型または季節型を問わない）のＮＡ遺伝子のＨ２７５Ｙ変異に対応するプローブである。また、Ｈ３Ｎ２亜型・野生型プローブ１、およびＨ３Ｎ２亜型・変異型プローブ１aは、Ｈ３Ｎ２亜型（新型または季節型を問わない）のＮＡ遺伝子のＥ１１９Ｖ変異に対応するプローブである。また、Ｈ３Ｎ２亜型・野生型プローブ２、およびＨ３Ｎ２亜型・変異型プローブ１bは、Ｈ３Ｎ２亜型のＮＡ遺伝子のＥ１１９Ｄ変異に対応するプローブである。また、Ｈ３Ｎ２亜型・野生型プローブ２、およびＨ３Ｎ２亜型・変異型プローブ２は、Ｈ３Ｎ２亜型のＮＡ遺伝子のＲ２９２Ｋ変異に対応するプローブである。
　２．プローブの固定
　上記各プローブの５’末端にターミナルトランスフェラーゼ（Promega社製）を用いて、ポリチミンの付加を行う。具体的には、ターミナルトランスフェラーゼ（３０ｕｎｉｔ／μＬ）を０．４μＬ、チミジン三リン酸（１０ｐｍｏｌ／μＬ）を２μＬ、オリゴヌクレオチドプローブ（５０ｍＭ）を２μＬ、製品添付の反応緩衝液を２μＬ、および精製水３．６μＬを混合して反応溶液を調製し、３７℃で４時間反応させた後、反応溶液に１０×ＳＳＣ緩衝液９０μＬを添加することにより、ポリチミンが付加されたオリゴヌクレオチドプローブを含む溶液（１ｐｍｏｌ／μＬ）を得る。
　次いで、ポリチミンが付加された各プローブを含む溶液をそれぞれ２４ゲージの針を備えたディスペンサに入れ、０．７μＬ／分の量で吐出させながら、２．５ｍｍ／秒の塗布速度で、２ｍｍの幅のストライプになるようにニトロセルロース膜（縦７５ｍｍ×横１５０ｍｍ：Whatman社製）上に２ｍｍ間隔で縦方向に塗布する。次いで、これらのニトロセルロース膜に３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して、プローブをニトロセルロース膜に固定する。次いで、ニトロセルロース膜を、すべてのストライプを含むように切断して、５ｍｍ×１５０ｍｍの試験片を作製する。
　（実施例２：実施例１の試験片を用いたＡ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出との同時実施）
　１．ＲＴ－ＰＣＲによるＮＡ遺伝子の増幅
　インフルエンザと疑われる患者の鼻腔ぬぐい液を採取する。この検体を、配列番号１７に記載の塩基配列からなる新型用プライマー１、配列番号１８に記載の塩基配列からなりかつ５’末端にビオチンを結合させた新型用プライマー２、配列番号１９に記載の塩基配列からなる季節型用プライマー１、配列番号２０に記載の塩基配列からなりかつ５’末端にビオチンを結合させた季節型用プライマー２、配列番号２１に記載の塩基配列からなるＨ３Ｎ２亜型用プライマー１、配列番号２２に記載の塩基配列からなりかつ５’末端にビオチンを結合させたＨ３Ｎ２亜型用プライマー２、およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いるＰＣＲ法により増幅する。
　新型用プライマー１　　　　：ATGAATCCAAACCAAAAGATAATAA（配列番号１７）
　新型用プライマー２　　　　：AGACCAACCCACAGTGTCACTGTTT（配列番号１８）
　季節型用プライマー１　　　：ATGAACCCAAATCAAAAGATAATAA（配列番号１９）
　季節型用プライマー２　　　：AGACCAGTTTGCAGTATCACTATTA（配列番号２０）
　Ｈ３Ｎ２亜型用プライマー１：ATGAATCCAAATCAAAAGATAATAA（配列番号２１）
　Ｈ３Ｎ２亜型用プライマー２：TGAGCCTGTTCCATATGTACCTGAG（配列番号２２）
　２．ハイブリダイズしたプローブの検出
　増幅した遺伝子を含む溶液１０μＬに、水酸化ナトリウム（５Ｍ）、エチレンジアミン四酢酸（０．０５Ｍ）の溶液（１０μＬ）を添加してよく攪拌し、５分間放置して、増幅した遺伝子を１本鎖に変性する。この溶液に、ドデシル硫酸ナトリウム（０．０１ｗ／ｖ％）、塩化ナトリウム（１．８ｗ／ｖ％）、クエン酸ナトリウム（１．０ｗ／ｖ％）の溶液（１ｍＬ）、および実施例２で作製した試験片を添加し、混合液を６２℃にて３０分間振盪させる。次いで、混合液から試験片を取り出し、洗浄後、試験片にアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを添加し、さらにニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスファターゼ－ｐ－トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を添加して、試験片を発色させる。
　本発明によれば、検体中のＡ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを迅速・簡便に行うことができる。このため、重篤化のリスクが高い新型インフルエンザウイルスに感染した患者や、オセルタミビルリン酸塩耐性のＡ型インフルエンザウイルスに感染した患者を適切に治療することが可能となる。インフルエンザ治療の適切な実施は、患者や医者の負担を軽減するだけでなく、社会全体の医療費の抑制に貢献する。

Claims (6)

  1. 　検体中のＡ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うための試験片であって、
    少なくとも３つのプローブが異なる位置に固定されており、
    　（１）該プローブのうちの少なくとも１つのプローブが、新型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、他のインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドからなり、
    　（２）該プローブのうちの少なくとも１つのプローブが、季節型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、他のインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドからなり、
    　（３）該プローブのうちの少なくとも１つのプローブが、
    　（３－１）Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のオセルタミビルリン酸塩耐性変異を有する塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチド、または
    　（３－２）Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のオセルタミビルリン酸塩耐性変異を有する塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドからなる、
    試験片。
  2. 　さらに、前記少なくとも３つのプローブとは異なるプローブであって、
    　（４）Ａ型Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、他のインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１つのプローブが、前記試験片の該少なくとも３つのプローブとは異なる位置に固定されている、請求項１に記載の試験片。
  3. 　前記Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のオセルタミビルリン酸塩耐性変異が、Ａ型Ｈ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のＨ２７５Ｙ、ならびにＡ型Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のＥ１１９Ｖ、Ｅ１１９ＤおよびＲ２９２Ｋからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１または２に記載の試験片。
  4. 　請求項１から３のいずれかの項に記載の試験片を含む、検体中のＡ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うためのキット。
  5. 　さらに、ハイブリダイズしたプローブの検出用試薬およびＡ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子増幅用プライマー対を含む、請求項４に記載のキット。
  6. 　検体中のＡ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うための方法であって、
    　検体中のＡ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子を増幅する工程、
    　増幅したノイラミニダーゼ遺伝子を請求項１から３のいずれかの項に記載の試験片と接触させて、該試験片に固定された前記プローブとハイブリダイズさせる工程、
    　該増幅したノイラミニダーゼ遺伝子がハイブリダイズしたプローブを検出する工程、および
    　検出したプローブの位置からＡ型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行う工程
    を含む、方法。
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