WO2012011660A2 - 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 및 분석용 마이크로 챔버 프레이트의 제조 방법, 분석용 마이크로 챔버 플레이트 및 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 장치 셋 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a micro-chamber plate, and more particularly cross-contamination of a plurality of reaction solutions including primers or probes that selectively react with each nucleic acid to analyze a biological sample solution containing a large number of nucleic acids.
  • the present invention relates to an analytical chamber plate capable of reacting without and allowing fluorescence values to be measured and analyzed in real time.
  • the present invention also relates to a method for producing the analytical chamber plate.
  • the present invention also relates to a method for producing a sample-embedded microchamber plate used in the production of the analytical chamber plate.
  • the present invention also relates to a device set for manufacturing the sample embedded microchamber plate.
  • a microchamber is a container in which microscopic reactions of several microliters or less occur, and may be formed of silicon wafer, glass, metal, ceramic, or plastic.
  • the microchamber plate is a plate in which the microchambers are two-dimensionally arranged. Generally, one side has a structure in which a sample can be injected and sealed.
  • PCR Real-time polymerase chain reaction
  • Real-Time real-time polymerase chain reaction
  • the real-time polymerase chain reaction method measures the fluorescence value generated from the polymerase chain reaction product for each cycle as the polymerase chain reaction is performed, and confirms the cycle of generating a predetermined amount or more of the fluorescence value by initial initial concentration of a specific gene in the sample. Can be analyzed quantitatively.
  • the real-time polymerase chain reaction method does not require an electrophoresis process after the polymerase chain reaction, and performs a polymerase chain reaction and quantitatively measures the reacted product to determine a gene having a specific base sequence in each sample.
  • concentrations in the range of 10 9 and above ("AZ of Quantitative PCR” edited by Stephen A. Bustin 2004-2006 International University, "Realtime PCR” edited by M. Tevfik Dorak 2006 Taylor & Francis Group)
  • Various types of real-time polymerase chain reaction apparatuses for performing the real-time polymerase chain reaction method have been proposed.
  • a real-time polymerase chain reaction apparatus capable of analyzing a plurality of samples 96 pieces using standard 96well and 384well plates are used.
  • a device that can analyze 384 genes has been proposed (Roche Light Cycler 480, ABI 7500, 7900).
  • the Roche's real-time polymerase chain reaction device has a problem that the amount of the reaction sample is 10 to 50 ⁇ l, which requires a relatively large amount of sample and fails to analyze a large number of genes.
  • the method of using a microchamber array plate may be composed of three steps: injecting a reaction sample into the microchamber, sealing a reaction solution between the microchambers, and reacting and analyzing.
  • a semipermeable membrane is covered with a transparent cell culture microchamber plate to isolate the microchamber, and one cell is incubated in each microchamber to remove the culture solution, followed by adding a Taqman reaction solution.
  • a microchamber array plate has been proposed which measures the fluorescence value at the bottom of the plate while sealing it with a transparent oil and performing temperature cycling. (YASUDA, Kenji EP 1,541,678 A1, JP 2002245900 )
  • the reactor used a microscope slide cover glass to prevent evaporation of the polymerase chain reaction solution.
  • a water-repellent film was sandwiched between the cover glass and the wafer.
  • the cover glass was removed, and then the reaction solution was dried.
  • the water-repellent membrane was removed and analyzed, and there was a problem that it could not be used for real-time gene quantification.
  • a mineral oil was added to the upper portion of the chip to completely cover the microchamber, and then the polymerase chain reaction solution was dropped onto the mineral oil in the reactor using a nanojet dispenser.
  • This method produces 1,248 microchamber array chips with a volume of 50 nanoliters (0.65 ⁇ 0.65 ⁇ 0.2 mm) by photolithography and chemical angles on a 1-inch by 3-inch silicon wafer. (Taqman) probe solution was added dropwise with a nanoliter dispenser and dried, and the whole was coated with mineral oil to isolate and seal each microchamber.
  • the microchamber array fabricated using the third method was successfully prepared by spraying a mixture of Taq DNA polymerase and sample DNA from the upper layer of mineral oil and dispensing each microchamber using a nanoliter dispenser.
  • Each reactive component has the advantage of performing polymerase chain reaction without cross contamination.
  • the method requires a separate microliter dispensing equipment for injecting a solution, takes a long time to dispense, and there is a risk of cross-contamination between the reaction liquids due to the flow of mineral oil during plate movement. There is a high problem.
  • the bubble is generated at high temperature during the temperature cycling reaction and the aqueous solution becomes spherical due to the hydrophobic effect of the oil and aqueous solution, which causes the lens effect. There is this.
  • PicoTiterPlate has been developed as a microchamber manufactured by the chemical etching method as described above, but capable of a much larger number of reactions than the third method (John H. Leamon et al. , A massively parallel PicoTiter Plate based platform for discrete pico-liter-scale polymerase chain reactions.Electrophoresis 2003, 24, 3769-3777)
  • the fourth method has a form capable of performing 300,000 independent polymerase chain reactions in an amount of 39.5 pl, but requires a carrier immobilized primers / probes, so that it can be applied to a real-time quantitative polymerase chain reaction requiring uniform optical properties. Can't.
  • the film reactor is composed of three layers of very thin film, specifically, the lower layer forms the bottom of the reactor, the middle layer forms the side of the reactor, and the upper layer forms the sample inlet.
  • the reaction inlet After injecting the trace sample solution into the film reactor through the pipette, the reaction inlet should be completely sealed for the reaction, but if it is not completely sealed, there is a problem that all the reaction solutions evaporate during the polymerase chain reaction.
  • the reactor is too structurally complex to handle thousands of samples, making it practically impossible to manufacture.
  • the sixth method uses a container that forms a plurality of through holes in the plate, forms a plurality of reaction containers by fusion of a transparent film having a low fluorescent amount, contains a sample therein, and seals with a transparent film to perform the reaction. Way.
  • the reaction plate has an advantage that the upper and lower surfaces are formed transparently, apply excitation light at one side, and measure fluorescence at the other side.
  • the sixth method also requires different primers and probes for each microchamber in order to analyze a large number of genes.
  • Plates for analyzing a large number of samples require thousands of different solutions to be put in a microchamber.
  • a special dispensing equipment such as a conventional nanoliter dispenser is required, and it takes a lot of time, but still has a problem that a defect occurs during sample injection.
  • due to the problem of not being able to completely fill the solution in the microchamber when bubbles are generated and warmed, there is a problem in that water vapor is formed on the top of the microchamber, which interferes with optical measurement by scattering.
  • PCT / KR2008 / 005635 PCT / KR2008 / 005635
  • the seventh method forms a plurality of perforated holes in the plate, forms a plurality of reaction vessels by fusing a transparent film having a small amount of fluorescent light on one side, and contains a sample therein, and then the sample solution is injected into the other side. It is a method of using the container which performs sealing by sealing with a film
  • the reaction plate is a method of dropping and sealing mineral oil on the injection surface after injection of a sample solution through a porous membrane, and applying and measuring excitation light with an optical measuring unit formed on the other side.
  • the instillation portion of the mineral oil can be directed downward for the reaction and measurement, there is also a problem that the mineral oil having a relatively low density compared to the sample is introduced into the micro chamber to cause the scattering.
  • the eighth method has a structure in which a sample for injection is directly applied to the porous membrane, so that 1) a sample injection method using a vacuum is used; When vacuum is applied, centrifugal force is applied to prevent boiling of the sample. At this time, the discharge of gas through the pores of the porous membrane is disturbed by the surface tension and the centrifugal force of the sample, and 2) the gas in the microchamber is compressed and compressed by the centrifugal force.
  • the injection is reduced, there is a problem in that it does not receive buoyancy enough to escape through the membrane and remains in a small bubble form and expands again at atmospheric pressure to hinder the measurement.
  • microchamber plate capable of easily injecting a sample into a plurality of microchambers and measuring the light generated from the sample in real time without cross contamination between each reaction solution and without the possibility of contamination by the sample of the optical measuring unit. It is becoming.
  • the present invention prevents the solution from evaporating inside a plurality of microchambers required for real-time polymerase chain reaction, calm enzyme reaction, or LCR (Ligase Chain Reaction), and easily injects the solution to dramatically reduce the time required for the injection step. It is possible to reduce the solution, to prevent the solution from mixing between the microchambers, and to integrate the injection unit and the optical measuring unit, and the structure is simple, and microbubbles are not generated in the optical measuring unit so that the fluorescence value can be measured more accurately. It is to provide a micro chamber plate and a method of manufacturing the same that can increase the.
  • the present invention is a micro-chamber plate settling step (S20) for placing the micro-chamber plate 100 for sample injection in the micro-chamber plate receiving portion 200, the upper opening is formed;
  • the micro-chamber plate accommodating part cover 310 including the auxiliary cover part 314 formed in contact with the temporary storage part 312 and the temporary storage part 312 and having the auxiliary cover part through hole 314-1 is provided.
  • a cover part disposing step (S30) disposed to cover the upper opening of the micro chamber plate accommodating part 200;
  • the microchamber plate accommodating part 200 in which the micro chamber plate accommodating part 310 is disposed is placed in a vacuum-applicable centrifuge to apply the centrifugal force to communicate with the microchamber plate accommodating part 200.
  • the present invention provides a microchamber plate accommodating part including an auxiliary cover part 1314 formed by being connected to the temporary storage part 1312 and the temporary storage part 1312 and having an auxiliary cover part through hole 1314-1.
  • the sample chamber microimmune plate 100 and the microchamber plate accommodating part cover 1310 which are in close contact with each other to form the sample solution storage space, are placed in a vacuum-applicable centrifuge and the centrifugal force is applied to the temporary reservoir 1312.
  • sample embedded micro-chamber plate manufacturing step to manufacture S300
  • the sample-embedded micro-chamber plate manufacturing step (S40, S300), the vacuum and centrifugal force applying step of applying a vacuum to the centrifuge, generating a first centrifugal force in a vacuum applied state in the centrifuge;
  • a vacuum releasing and centrifugal force applying step of releasing the vacuum in the centrifuge and injecting the sample solution into the micro chamber plate for sample injection while generating a second centrifugal force greater than the first centrifugal force by the centrifuge;
  • the first centrifugal force may include a centrifugal force capable of suppressing bumping of the sample solution in a vacuum applied state in the centrifuge, and the container communication part may be opened by an external force.
  • Incision lines 312-1 and 1312-1 formed at 312 and 1312, and the second centrifugal force may be centrifugal force of a size capable of opening the incision lines 312-1 and 1312-1.
  • the present invention is a method for manufacturing a microchamber plate for analysis using a sample-embedded microchamber plate manufactured by any one of the above methods, after removing the sample-embedded microchamber plate (100A) from the centrifuge, the sample-embedded An analytical microchamber plate manufacturing step (S50) of manufacturing an analytical microchamber plate which seals the separator 130 of the microchamber plate 100A; It relates to an analytical microchamber plate manufacturing method comprising a.
  • the present invention is the body sealing portion 120 is formed on the lower side, the separation membrane is formed on the upper side, the specific component for nucleic acid analysis 140 and the number of unit containing the sample solution containing the nucleic acid
  • the body sealing part 120 is formed of a material that reflects light, and the sealed separator is coated with a polymeric oil with a separator 130 of porous material.
  • the optical transparency of the surface of the separator 130 of the porous material is increased and relates to an analytical microchamber plate, characterized in that the sealing.
  • the present invention micro-chamber plate receiving portion 200 is formed with an upper opening; Opening and closing and formed in contact with the temporary storage unit 312 and the temporary storage unit 312 formed in the container communication portion communicating with the micro-chamber plate receiving portion 200 when opening the auxiliary cover portion through hole (314-1)
  • the auxiliary cover part through-hole 314-1 may be exposed to the outside and may include a temporary storage part cover 320 for sealing a part of the temporary storage part 312, the temporary storage part A lower side of the 312 is introduced into the micro chamber plate accommodating part 200, and an upper end of the temporary storage part 312 and the auxiliary cover part 314 are connected to an upper end of the micro chamber plate accommodating part 200. It may be disposed, and includes a temporary storage cover 320 to cover the top of the auxiliary cover through hole 314-1 and the top of the temporary storage 312, the temporary storage cover 320 is Gas may pass through, and the sample solution may not pass through, and the container communication unit may be an incision 312-1 that is opened by an external force.
  • the present invention includes a secondary cover portion 1314 is formed in contact with the temporary storage portion 1312 and the temporary storage portion 1312, the auxiliary cover portion through hole (1314-1), the sample injection micro
  • the microchamber plate accommodating part cover 1310 whose lower end is in close contact with the upper surface of the micro chamber plate 100 for sample injection by a fastening means so that the sample solution storage space S is formed between the chamber plate 100 and the upper surface.
  • the temporary storage unit 1312 relates to a sample built-in micro-chamber plate manufacturing apparatus set, characterized in that the container communication portion which is openable and open and communicates with the sample solution storage space when opened.
  • the fastening means may include a microchamber plate receiving portion 1200 in which the microchamber plate 100 for sample injection is placed; A case through hole 1424 for communicating the auxiliary cover part through hole 1314-1 and the temporary storage part 1312 with the outside is formed on an upper surface of the micro chamber plate accommodating part cover 1310.
  • a fastening case 1400 fastened to the microchamber plate receiving part 1200 may include, the container communication portion may be an incision line (1312-1) is opened by an external force, the fastening case 1400, the auxiliary cover part through hole (1314-1) is exposed to the outside and the temporary And a case cover 1500 covering the case through hole 1424 to seal a portion of the storage 1312, and the fastening case 1400 includes a case cover 1500 covering the case through hole 1424. ) Is attached, but the case cover 1500 may be a membrane filter that allows gas to pass but does not pass the sample solution.
  • the separation membrane which is the injection portion of the sample solution containing the nucleic acid, is used as the optical measuring unit, so that the structure is simple, does not cause an error in measurement of the optical measuring unit due to contamination, and the size of the analytical microchamber plate can be reduced. It is easy to control the temperature, and accordingly there is an advantage that can significantly reduce the time required for analysis.
  • the gas inside the chamber hole is first removed by vacuum, and then injected through the separator, thereby allowing complete injection without remaining gas within a short time. It is possible to prevent the optical measurement value from being measured correctly by the residual gas, and to seal the separator with mineral oil or silicone oil, which is a polymer oil, By avoiding cross-contamination problems, there is an advantage to increase the accuracy of the analysis.
  • the present invention has a merit that a plurality of analytical microchamber plates can be integrally formed to significantly shorten the time required for analysis by simultaneously analyzing and comparing different types of samples.
  • the analytical microchamber plate of the present invention can be formed integrally with the analytical microchamber plate on the back surface of the separation membrane and the optical measuring unit, which can be manufactured by a method such as aluminum compression molding, thereby dramatically reducing the production process and manufacturing cost. There is an advantage to this.
  • Figure 2 is a perspective view of a sample chamber micro-chamber plate prepared in the step of preparing a micro-chamber plate for sample injection of Figure 1;
  • FIG. 3 is a cross-sectional view taken along line AA ′ of FIG. 2;
  • FIG. 4 is an exploded perspective view of the main part of FIG. 2;
  • FIG. 5 is a perspective view of the origin microchamber body manufactured in the origin microchamber body fabrication step of FIG. 1; FIG.
  • FIG. 6 is a cross sectional view of the original microchamber body of FIG. 5; FIG.
  • FIG. 7 is a sectional view for explaining a coating step and a coupling step of FIG. 1;
  • FIG. 8 is a sectional view for explaining a step of attaching the body sealing part of FIG. 1;
  • FIG. 9 is a cross-sectional view for explaining a specific component injection step of FIG.
  • FIG. 10 is an exploded perspective view for explaining a microchamber plate settling step, a lid arrangement step, and a sample-embedded microchamber plate manufacturing step of FIG.
  • FIG. 11 is a perspective view of the combination of FIG.
  • Fig. 12 is a sectional view taken along line BB 'in Fig. 11 with the microchamber plate for sample injection therein.
  • Figure 13 is an enlarged view of the microchamber plate receiving cover of Figure 10;
  • FIG. 14 is an enlarged view of the temporary storage cover of FIG. 10; FIG.
  • FIG. 15 is a perspective view of a cover part in which the microchamber plate accommodation cover and the temporary storage cover of FIG.
  • Figure 16 is an enlarged view of the microchamber plate receiver of Figure 10;
  • Fig. 17 is a sectional view of a sample embedded microchamber plate corresponding to Fig. 3;
  • FIG. 18 is a flowchart of Embodiment 5.
  • FIG. 19 is an exploded perspective view illustrating the sample solution storage space forming step and the sample-embedded microchamber plate manufacturing step of FIG. 18; FIG.
  • FIG. 20 is a perspective view of the combination of FIG.
  • FIG. 21 is a sectional view taken along AA 'of FIG. 20;
  • chamber hole 120 body seal
  • micro chamber plate accommodating part 300 cover part
  • Microchamber plate receptacle cover 1312 Temporary reservoir
  • Example 1 relates to a method for producing an analytical microchamber plate according to the present invention.
  • Example 1 is a micro-chamber plate manufacturing step (S10), a sample injection micro-chamber plate set-up step (S20), a cover portion arrangement step (S30), a sample embedded microchamber plate manufacturing step (S40) And an analytical microchamber plate manufacturing step (S50).
  • the sample injection microchamber plate manufacturing step (S10) includes a sample injection microchamber plate 100 having a specific component 140 for nucleic acid analysis including a primer or a probe.
  • the micro chamber plate 100 for sample injection includes a micro chamber body 110, a body sealing part 120, and a separator 130.
  • the micro chamber plate manufacturing step (S10) for sample injection may be performed on the lower side of the micro chamber body manufacturing step (S11) and the micro chamber body 110 for manufacturing the micro chamber body 110.
  • Body sealing part attaching step (S12) forming the body sealing part 120, the specific component injection step (S13) for injecting the specific component 140 and the separator 130 is formed on the upper side of the micro-chamber body (110) It comprises a separator attachment step (S14).
  • the microchamber body manufacturing step S11 includes an original microchamber body manufacturing step S11-1, a coating step S11-2, and a coupling step S11-3. .
  • the original microchamber body in which the number of original chamber holes 110-1H is formed is formed.
  • 110-1 is manufactured.
  • the original microchamber body 110-1 is preferably made of a material that is durable against heat applied in polymerase chain reaction (PCR) or other analytical reactions, particularly at 0 ° C. to 100 ° C. It is preferred to be made of a material that does not occur.
  • the origin microchamber body 110-1 may be aluminum, silicon wafer, glass, metal, or plastic.
  • the origin (origin) micro-chamber body (110-1) is interconnected by a joint piece (not shown) may be formed in plurality.
  • Reference numeral 110-1S denotes an original microchamber body set formed by connecting several original microchamber bodies 110-1.
  • the microchamber body 110 is manufactured by performing the coating step (S11-2) and the coupling step (S11-3), and the microchamber body 110 includes an original chamber having a unit number of units.
  • a unit number of chamber holes 112 corresponding to the holes 110-1H is formed.
  • the chamber hole 112 has a width of 0.3 to 3 mm and may be formed to have a depth of 0.5 to 5 mm.
  • the plurality of chamber holes 112 are formed in one microchamber body 110, a large number of nucleic acids can be quantitatively analyzed at the same time, and the depth of the chamber holes 112 is shallow so that the thermal conductivity is good. As a result, the analysis time can be shortened and the accuracy of the analysis can be improved.
  • the surface of the original microchamber body 110-1 and the number of units are dipped by dipping the original microchamber body 110-1 into a polymer solution.
  • the polymer coating layer 110-2 is formed on the inner surface of the origin chamber hole 110-1H (see FIG. 6).
  • the inventor of the present application is a polyester resin of the base Korea Co., Ltd. product name ES-120s (copolymer polyester obtained by the reaction of complex aromatic dicarboxylic acid and complex aliphatic diol) resin is toluene (4, toluene) and M
  • the resin solution diluted to 50% in K (1, MEK) was diluted to 5-20 vol% with toluene to adjust the viscosity, and then changed the number of dippings from 1 to 3 times to change the original micro
  • the chamber body 110-1 was coated.
  • the inventors of the present application was the most suitable for the viscosity of forming the uniform polymer coating layer 110-2 without the original chamber hole (110-1H) clogged, 5 vol% to 10 vol%, dipping (dipping) The number of times was confirmed that the best two times.
  • the surface of the original microchamber body 110-1 may be white anodized before performing the coating step S11-2. It is desirable to perform a white anodizing step of white anodizing.
  • the surface of the polymer coating layer 110-2 is coupled. Coupling is for removing carboxylic acid, which is a functional group present in the polyester resin.
  • the inventors of the present application performed coupling in ethanol solvent using 1-Ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) and 4-dimethylaminopyridine (DMAP).
  • EDC 1-Ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • the polyester-based resin used in the present invention was very excellent in adhesion to the aluminum surface to form a stable polymer coating layer (110-2), colorless transparent was evaluated as being very suitable for use.
  • the body sealing part 120 is attached to the polymer coating layer 110-2 by contacting the polymer coating layer 110-2 and being pressed in a high temperature state in the body sealing part attaching step S12.
  • the body sealing part 120 is formed of a material that reflects light toward the separation membrane 130 (see FIG. 17) so that the irradiation light and the excitation light from the sample can be easily measured during optical measurement through the separation membrane 130 (see FIG. 17). Can be.
  • the body sealing part 120 is a film of reflective material attached to the outside of the film of the transparent material in addition to the film of the transparent material. It may further include.
  • a reflective layer may be further formed on a surface to be positioned in the lower opening direction of the chamber hole 112.
  • the body sealing portion 120 uses a material that can block the outflow of the sample solution containing the nucleic acid.
  • the inventors of the present application used a transparent or opaque white polymer film type product as the body sealing part 120, and a transparent film having a thickness of 40 ⁇ m of polyethylene terephthalate (PET) material of KM Industry Co., Ltd. All white films (product name: ST-DF 50W) were used. Through this, the inventors of the present application confirmed that more accurate optical measurements can be obtained.
  • PET polyethylene terephthalate
  • the specific component for nucleic acid analysis in which the lower opening is included in each of the chamber holes 112 of the unit number closed by the body sealing part 120 includes a primer or a probe ( 140).
  • the specific component 140 is mixed with the nucleic acid amplification enzyme, DNA constituent compound (dNTP), buffer or stabilizer (reaction solution, primer, enzyme, etc.) to stabilize the container As a material that serves to reduce the adsorption inside, polyols, carbohydrates, small albumin, PEG and the like may be further included.).
  • the specific component 140 is used in a dry, semi-dry, or liquid state depending on its composition.
  • the separator 130 is attached to the upper side of the microchamber body 110. That is, in the membrane attachment step (S14), the membrane 130 is attached to the upper end of the chamber hole 112 of the unit number to cover the upper opening of the chamber hole 112 of the unit number in which the specific component 140 is injected. do.
  • the separation membrane 130 is formed so as not to pass the specific component 140 and to allow the sample solution containing the nucleic acid to pass therethrough. Accordingly, the specific component 140 does not flow out from the chamber hole 112 to the outside through the separator 130, and the sample solution including the nucleic acid passes through the separator hole 130 from the outside of the chamber groove 112. 112).
  • the separator 130 may be formed of a porous material that does not pass the specific component 140 and allows the sample solution containing the nucleic acid to pass therethrough.
  • the optical transparency of the separator 130 may be increased by being coated with a polymer oil to seal the sample in the chamber hole 112.
  • the polymer oil may be mineral oil, silicone oil, hydrocarbon oil or paraffin wax.
  • the separator 130 of the porous material may be in the form of a micropore, a mesh, or a nonwoven fabric, and the pore size of the porous material is preferably within 0.1 to 100 ⁇ m.
  • the separator 130 of porous material may be a polymer membrane.
  • the separator 130 is in contact with the polymer coating layer (110-2) is pressed in a high temperature state is attached to the polymer coating layer (110-2).
  • the inventor of the present application used a porous material having a myriad of predetermined diameter pores as the separator 130. More specifically, Whatman was selected from a polycarbonate (PC) material having a pore size of 12 ⁇ m. This is because the pore size is easy to inject the sample, and the optical measurement is possible because it is completely transparent by the mineral oil, which is a polymer oil.
  • PC polycarbonate
  • the separator 130 may be a perforated film.
  • the separator in the form of a film may be made of Teflon, polypropylene, polyethylene, polyester, or polyvinyl chloride, and may have 1 to 10 hollow parts per chamber hole 112, and have a built-in specific component 140.
  • the width of the perforated portion is formed within 10 ⁇ m to 1 mm, and may be 100 to 500 ⁇ m.
  • the separator in the form of a film may be one that can be optically measured with good optical transparency.
  • Reference numeral 200S denotes a microchamber plate receiver set in which a plurality of microchamber plate receivers 200 are interconnected.
  • cover step (S30) is a micro-chamber plate receiving cover cover manufacturing step (S31), temporary storage cover manufacturing step (S32), temporary storage cover attaching step (S33) and the sample solution temporary storage step (S34).
  • a microchamber plate accommodating part cover 310 in which the temporary storage part 312 and the auxiliary cover part 314 are integrally manufactured is manufactured.
  • Reference numeral 310S denotes a microchamber plate receiver lid set in which a plurality of microchamber plate receiver lids 310 are interconnected to each other.
  • the temporary storage part 312 is a container in which a sample solution containing nucleic acid is temporarily stored, and a container communication part is formed on a lower side thereof.
  • the container communication unit may be an incision line 312-1 that is opened by an external force. Therefore, when no external force acts on the lower side of the temporary storage unit 312, the sample solution including the nucleic acid temporarily stored in the temporary storage unit 312 is external to the temporary storage unit 312 through the incision line 312-1. It will not leak out.
  • the temporary storage unit 312 may be formed of a silicon material.
  • the auxiliary cover part 314 is a plate shape which is formed in a horizontal direction in contact with an upper end of the peripheral surface of the temporary storage part 312.
  • An auxiliary cover part through hole 314-1 penetrating the upper and lower surfaces is formed in the auxiliary cover part 314.
  • a temporary storage cover 320 having a temporary storage cover through hole 324 penetrating the upper and lower surfaces is manufactured.
  • the temporary storage cover 320 may have a thin film shape.
  • Reference numeral 320S denotes a temporary storage cover set, in which a plurality of temporary storage cover 320 are interconnected.
  • the temporary storage cover 320 exposes the auxiliary cover through hole 314-1 to the outside when the temporary storage cover 320 is attached to the top of the micro chamber plate accommodation cover 310. It is formed to seal a portion of the upper end. In this case, the rest of the upper end of the temporary storage unit 312 is exposed to the outside through the temporary storage cover through hole 324.
  • the temporary storage part cover 320 is attached to the upper end of the micro chamber plate accommodating part cover 310.
  • An adhesive may be previously attached to the microchamber plate accommodating cover 310 to attach the temporary storage cover 320.
  • the adhesive may be a polymer adhesive or a double-sided tape. Therefore, a part of the upper end of the temporary storage unit 312 is sealed, and the rest of the upper end of the auxiliary cover part through hole 314-1 and the temporary storage part 312 is externally stored through the temporary storage part through hole 324. Is exposed to.
  • the cover part 300 is formed by performing the temporary storage part cover attaching step S33.
  • the cover 300 covers the upper opening of the microchamber plate receiver 200 and the microchamber plate receiver ( 200) is seated on top.
  • the cover part 300 when the cover part 300 is seated on the upper end of the microchamber plate accommodating part 200, the lower side of the temporary storage part 312 is inserted into the microchamber plate accommodating part 200, and the temporary storage part ( An upper end of the 312 and the auxiliary cover 314 is disposed on the upper end of the micro chamber plate accommodating part 200.
  • the cover part 300 when the cover part 300 is seated on the top of the microchamber plate accommodating part 200, the inside of the microchamber plate accommodating part 200 has an auxiliary cover part through hole 314-1 and a temporary storage part cover.
  • the through hole 324 communicates with the outside, and the temporary storage unit 312 communicates with the outside through the temporary storage cover through hole 324.
  • the sample solution including the nucleic acid is temporarily stored in the temporary storage unit 312 through the temporary storage cover through hole 324.
  • the sample-embedded microchamber plate manufacturing step S40 includes a vacuum and centrifugal force applying step S41 and a vacuum releasing and centrifugal force applying step S42.
  • the micro chamber plate accommodating part 200 in which the cover part 300 is disposed is placed inside the centrifuge capable of applying vacuum.
  • the temporary storage cover through hole 324 faces upward
  • the temporary storage cover 320 faces the rotation center direction of the centrifuge
  • the lower side of the micro chamber plate accommodation part 200 To face the direction of rotation of the centrifuge.
  • a vacuum is applied to the centrifuge and the centrifuge is operated so that the first centrifugal force acts on the micro chamber plate accommodating part 200 in which the cover part 300 is disposed.
  • the first centrifugal force is a centrifugal force in which bumping of the sample solution is suppressed while a vacuum is applied in the centrifuge.
  • the first centrifugal force is a centrifugal force of a size where the incision line 312-1 does not open. This is to prevent the incision line 312-1 from being opened so that the sample solution contacts the separator 130.
  • the centrifugal force generated by the centrifuge is a second centrifugal force larger than the first centrifugal force so that the incision 312-1 is opened.
  • the vacuum in the centrifuge is released to inject the sample solution into the microchamber plate 100 for sample injection through the incision 312-1 and the separator 130.
  • the sample solution is injected into the chamber hole 112 to prepare a sample-embedded microchamber plate 100A mixed with the specific component 140 (see FIG. 3).
  • Reference numeral 150 denotes a mixed solution of the specific component 140 (see FIG. 3) and the sample solution.
  • the inventor of the present application was to suppress the bumping (bumping) of the sample solution while the first centrifugal force to 42g or less in the vacuum and centrifugal force applying step (S41).
  • the centrifugal force was gradually increased to maintain the second centrifugal force at 242 g or more, and the vacuum was released to inject the sample solution into the sample chamber micro-injection plate 100 for 1 minute. Through this method, the sample solution was completely injected into the chamber hole 112.
  • the sample-embedded microchamber plate 100A (see FIG. 17) is taken out from the centrifuge. Subsequently, in order to prevent the sample solution embedded in the sample-embedded microchamber plate 100A (see FIG. 17) during the analysis reaction including the polymerase chain reaction (PCR), the sample-embedded microchamber plate 100A (see FIG. 17) does not flow out. )
  • sealing of the surface of the separator 130 is performed to increase the optical transparency of the separator 130 so that the optical measurement of the sample inside the chamber hole 112 through the separator 130 can be facilitated.
  • an analytical microchamber plate that can be used for analytical reactions including polymerase chain reaction (PCR) is prepared.
  • the analytical microchamber plate according to Example 1 may be used for real-time polymerase chain reaction (PCR) by embedding a specific component 140 including a primer or a probe, and in addition to the constant temperature enzyme reaction, or LCR (Ligase Chain). Reaction) can be used, and can be used in addition to this by changing the specific component 140, etc. that are embedded therein.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the separator 130 is a porous material, the surface of the separator 130 of the sample-embedded microchamber plate 100A is coated with a polymer oil and sealed.
  • the polymeric oil may be mineral oil, silicone oil, hydrocarbon oil or paraffin wax and the like.
  • the separator 130 may be coated with a mineral oil and sealed.
  • the separator 130 formed of a poly polypropylene membrane When the separator 130 formed of a poly polypropylene membrane is coated with a mineral oil and sealed, it is infiltrated into the hydrophobic polypropylene membrane by a hydrophilic-hydrophobic effect. Hydrophobic mineral oils are pushed out and infiltrated into samples containing water.
  • the mineral oil is relatively similar in density to the polypropylene membrane, so that the optical transparency of the separator 130 is increased to facilitate optical measurement of the sample inside the chamber hole 112, poly polypropylene membrane (Poly polypropylene membrane) The pores of the are sealed by the mineral oil, so that the outflow and evaporation of the sample inside the chamber hole 112 is prevented.
  • the sealing of the surface of the separator 130 of the sample-embedded microchamber plate 100A may be performed by using an adhesive film (tape). Can be performed.
  • the temporary storage cover 320 may be a membrane filter that allows gas to pass but does not pass the sample solution.
  • An adhesive may be previously attached to the microchamber plate receiver cover 310 to attach the membrane filter, which is the temporary storage cover 320, and the adhesive may be a polymer adhesive or a double-sided tape.
  • the temporary storage part cover 320 is formed to cover the upper end of the auxiliary cover part through hole 314-1 and the upper end of the temporary storage part 312 when attached to the top of the micro chamber plate accommodating part cover 310. .
  • the sample solution temporary storage step S34 is performed before performing the temporary storage cover attaching step S33.
  • the temporary storage part cover manufacturing step S32 and the temporary storage part cover attaching step S33 may not be included.
  • the cover part 300 may be a micro chamber plate accommodating part cover 310. Therefore, before the centrifugal force applying step S41 is performed, the bottom surface of the temporary storage part 312 faces downward (gravity action direction) so that the sample solution does not flow out through the open upper side of the temporary storage part 312. To face. As the centrifugal force applying step (S41) is performed, the open upper side of the temporary storage unit 312 faces the rotation center direction of the centrifuge, and the lower side of the temporary storage unit 312, that is, the incision line 312-1. This formed face is directed toward the opposite direction of the center of rotation of the centrifuge.
  • the temporary storage part cover 320 may be formed to cover the auxiliary cover part through hole 314-1 and the temporary storage part 312, respectively.
  • the temporary storage cover 320 is formed of a membrane filter that allows gas to pass but does not pass the sample solution.
  • the temporary storage part cover through hole 324 is not formed in the temporary storage part cover 320.
  • Example 2 relates to a method for producing a sample embedded microchamber plate according to the present invention.
  • Example 2 is a micro-chamber plate manufacturing step (S10), a sample injection micro-chamber plate set-up step (S20), a cover portion arrangement step (S30) and a sample embedded microchamber plate manufacturing step (S40) described in Example 1 ).
  • Example 3 relates to an analytical microchamber plate according to the invention.
  • the analytical microchamber plate (not shown) is the same except for the sample-embedded microchamber plate 100A (see FIG. 17) and the separator 130, and will be described with reference to FIG. 17.
  • Embodiment 3 has an origin micro chamber body 110-1 in which a unit number of origin chamber holes 110-1H penetrates up and down.
  • the polymer coating layer 110-2 is formed on the surface of the original microchamber body 110-1 and the inner surface of the original chamber hole 110-1H (see FIG. 6). Is formed.
  • the unit number of chamber holes 112 corresponding to the unit number of original chamber holes 110-1H (see FIG. 6) is generated.
  • a body sealing part 120 is formed on the lower side of the microchamber body 110 to seal the lower openings of the number of chamber holes 112.
  • Body seal 120 is to block the outflow of the sample solution containing the nucleic acid.
  • the body sealing portion 120 is formed of a material that reflects light, it may be formed of polyethylene terephthalate (PET).
  • a sealed separator (not shown) is formed on an upper surface of the microchamber body 110 to cover an upper opening of a unit number of chamber holes 112.
  • the sealed separator (not shown) is formed by coating the porous membrane 130 with a polymeric oil and sealing it.
  • the polymer oil may be mineral oil, silicone oil, hydrocarbon oil or paraffin wax.
  • the separator 130 of the porous material may be a poly polypropylene membrane (Poly polypropylene membrane) that can be sealed by increasing the optical transparency by applying to the mineral oil (mineral oil).
  • each chamber hole 112 includes a specific component 140 for nucleic acid analysis including a primer or a probe and a sample solution including nucleic acids.
  • Reference numeral 150 designates these mixed liquids.
  • Example 4 relates to a sample embedded microchamber plate manufacturing apparatus set according to the present invention.
  • the fourth embodiment has a micro chamber plate accommodating part 200 in which the micro chamber plate 100 for sample injection can be placed.
  • An upper opening for placing the micro chamber plate 100 for sample injection is formed at the upper end of the micro chamber plate accommodating part 200.
  • a microchamber plate accommodating part cover 310 covering an upper opening of the microchamber plate accommodating part 200 is placed on the microchamber plate accommodating part 200.
  • the microchamber plate accommodating part cover 310 is a plate-shaped auxiliary formed in contact with a temporary storage part 312 capable of temporarily storing the sample solution and a peripheral surface of the temporary storage part 312.
  • the cover part 314 is included.
  • the lower surface of the temporary storage unit 312 is formed with a container communication unit.
  • the container communication unit may be an incision line 312-1 that is opened by an external force.
  • the auxiliary cover portion 314 is formed with an auxiliary cover portion through hole 314-1 penetrating the upper and lower surfaces.
  • the lower side of the temporary storage part 312 is introduced into the microchamber plate receiving part 200, and the top and the auxiliary cover part 314 of the temporary storage part 312 are accommodated in the microchamber plate. It is disposed on the top of the portion 200.
  • a temporary storage cover 320 is attached to an upper end of the micro chamber plate accommodating cover 310.
  • the temporary storage part cover 320 seals a portion of the upper end of the temporary storage part 312, and the auxiliary cover part through hole 314-1 and the temporary storage part 312 through the temporary storage part through hole 324.
  • the upper end of the is attached to expose the rest to the outside.
  • Example 5 relates to a method for producing an analytical microchamber plate according to the invention.
  • Example 5 is a micro-chamber plate manufacturing step (S100), a sample solution storage space forming step (S200), a sample-embedded microchamber plate manufacturing step (S300) and an analysis microchamber plate manufacturing step (S100) S400).
  • microchamber plate manufacturing step (S100) and the analytical microchamber plate manufacturing step (S400) for sample injection are as described in Example 1.
  • the sample solution storage space forming step (S200) is a micro-chamber plate accommodating part manufacturing step (S210), micro-chamber plate accommodating part cover manufacturing step (S220), fastening case manufacturing step (S230), case fastening step ( S240) and the case cover attaching step (S250).
  • a microchamber plate accommodating part 1200 is formed.
  • the micro chamber plate accommodating part 1200 may be formed in a flat plate shape.
  • the micro chamber plate accommodating part 1200 is for placing the micro chamber plate 100 for sample injection.
  • Reference numeral 1200S denotes a microchamber plate receiver set in which a plurality of microchamber plate receivers 1200 are integrally formed.
  • the receiving chamber fastening protrusion (1200S-1) is formed on the side of the micro chamber plate receiving portion set (1200S).
  • microchamber plate accommodating part cover manufacturing step (S220) in the microchamber plate accommodating part cover manufacturing step (S220), the microchamber plate accommodating part cover 1310 in which the temporary storage part 1312 and the auxiliary cover part 1314 are integrally formed is manufactured.
  • a reference numeral 1310S of FIG. 19 denotes a microchamber plate receiver cover set in which a plurality of microchamber plate receiver covers 1310 are interconnected.
  • the temporary storage part 1312 is a container in which a sample solution containing nucleic acid is temporarily stored, and a container communication part is formed on a lower side thereof.
  • the container communication unit may be an incision line 1312-1 that is opened by an external force. The description of the incision line 1312-1 is as described in the first embodiment.
  • the auxiliary cover part 1314 is formed in a horizontal direction in contact with the circumferential surface of the temporary storage part 1312, and may be a protrusion shape or a plate shape as in the first embodiment.
  • An auxiliary cover part through hole 1314-1 penetrating the upper and lower surfaces is formed in the auxiliary cover part 1314.
  • a ring-shaped cover support 1316 protrudes from the lower edge of the microchamber plate accommodating cover 1310.
  • the lid support part 1316 is formed such that the lower end of the auxiliary lid part through hole 1314-1 is positioned inside the lid support part 1316.
  • a fastening case 1400 having a case through hole 1424 is formed in the manufacturing of the fastening case (S230).
  • the case through hole 1424 is formed to communicate with the auxiliary cover part through hole 1314-1 and the temporary storage part 1312 when the fastening case 1400 is seated on the top of the micro chamber plate accommodating part cover 1310.
  • 1400S of FIG. 19 illustrates a plurality of fastening case sets in which fastening cases 1400 are connected to each other.
  • the side of the fastening case set (1400S) is formed with a case fastening groove (1400S-1) is fitted with the receiving portion fastening protrusion (1200S-1).
  • the fastening case 1400 is pressed onto the microchamber plate accommodating part cover 1310 and fastened to the microchamber plate accommodating part 1200.
  • the fastening case 1400 and the microchamber plate accommodating part 1200 may be fastened by inserting the accommodating part fastening protrusion 1200S-1 into the case fastening groove 1400S-1.
  • the fastening case 1400 is fastened to the microchamber plate accommodating part 1200, the lower end of the lid support part 1316 is in close contact with the upper surface of the microchamber plate 100 for sample injection, and thus the microchamber plate accommodating part cover 1310.
  • a sample solution storage space S is formed between the sample chamber and the upper surface of the micro chamber plate 100.
  • the lower end of the auxiliary cover part through hole 1314-1 communicates with the sample solution storage space S, and the case through hole 1424 is formed through the auxiliary cover part through hole 1334-4. 1) and temporary storage 1312, respectively.
  • the case cover 1500 is attached to the fastening case 1400.
  • An adhesive may be attached to the fastening case 1400 in advance to attach the case cover 1500.
  • the adhesive may be a polymer adhesive or a double-sided tape.
  • the case cover 1500 is provided with a case cover through hole 1524 penetrating the upper and lower surfaces.
  • the case cover attaching step (S250) may be performed such that the case cover through hole 1524 exposes the auxiliary cover part through hole 1314-1 to the outside and a part of the temporary storage part 1312 is sealed.
  • 1500S of FIG. 19 illustrates a case cover set in which a plurality of case covers 1500 are interconnected to each other.
  • a sample solution containing nucleic acid is temporarily stored in the temporary storage unit 1312 through the case cover through hole 1524.
  • the sample-embedded microchamber plate manufacturing step (S300) includes a vacuum and centrifugal force applying step and a vacuum release and centrifugal force applying step as in Example 1.
  • the micro-chamber plate 100 and the micro-chamber plate accommodating part cover 1310 which are in close contact with each other are placed in a centrifuge capable of applying a vacuum.
  • the case cover through hole 1524 faces upward
  • the case cover 1500 faces the rotation center direction of the centrifuge
  • the bottom surface of the temporary storage part 312 rotates the centrifuge. Face away from center.
  • Other matters are as described in Example 1.
  • a case cover 1500 that covers the case through hole 1424 is attached to the fastening case 1400.
  • the case cover 1500 is formed of a membrane filter that allows gas to pass but does not pass the sample solution.
  • the case through hole 1424 is not formed in the case cover 1500.
  • an adhesive may be attached to the fastening case 1400 in advance to attach the membrane filter, which is the case cover 1500, and the adhesive may be a polymer adhesive or a double-sided tape.
  • case cover 1500 may not be attached to the fastening case 1400.
  • Example 6 relates to a method for producing a sample embedded microchamber plate according to the present invention.
  • Example 6 includes a sample injection microchamber plate manufacturing step (S100), a sample solution storage space forming step (S200) and a sample embedded microchamber plate manufacturing step (S300) described in Example 5.
  • Example 7 relates to a sample embedded microchamber plate manufacturing apparatus set according to the present invention.
  • Embodiment 7 includes a microchamber plate receiver 1200.
  • the micro chamber plate accommodating part 1200 may be formed in a flat plate shape.
  • the micro chamber plate accommodating part 1200 is for placing the micro chamber plate 100 for sample injection.
  • Reference numeral 1200S denotes a microchamber plate receiver set in which a plurality of microchamber plate receivers 1200 are integrally formed.
  • the receiving chamber fastening protrusion (1200S-1) is formed on the side of the micro chamber plate receiving portion set (1200S).
  • Embodiment 7 includes a microchamber plate accommodating cover 1310 in which a temporary storage 1312 and an auxiliary cover 1314 are integrally formed.
  • a reference numeral 1310S of FIG. 19 denotes a microchamber plate receiver cover set in which a plurality of microchamber plate receiver covers 1310 are interconnected.
  • the temporary storage part 1312 is a container in which a sample solution containing nucleic acid is temporarily stored, and a container communication part is formed on a lower side thereof.
  • the container communication unit may be an incision line 1312-1 that is opened by an external force. The description of the incision line 1312-1 is as described in the first embodiment.
  • the auxiliary cover part 314 is formed in a horizontal direction in contact with the peripheral surface of the temporary storage part 312, and may be a protrusion shape or a plate shape as in the first embodiment.
  • An auxiliary cover part through hole 1314-1 penetrating the upper and lower surfaces is formed in the auxiliary cover part 314.
  • a ring-shaped cover support 1316 protrudes from the lower edge of the microchamber plate accommodating cover 1310.
  • the lid support part 1316 is formed such that the lower end of the auxiliary lid part through hole 1314-1 is positioned inside the lid support part 1316.
  • Embodiment 7 includes a fastening case 1400.
  • the fastening case 1400 is provided with a case through hole 1424 penetrating the upper and lower surfaces.
  • the case through hole 1424 is formed to communicate with the auxiliary cover part through hole 1314-1 and the temporary storage part 1312 when the fastening case 1400 is seated on the top of the micro chamber plate accommodating part cover 1310.
  • 1400S of FIG. 19 illustrates a plurality of fastening case sets in which fastening cases 1400 are connected to each other.
  • the side of the fastening case set (1400S) is formed with a case fastening groove (1400S-1) is fitted with the receiving portion fastening protrusion (1200S-1).
  • the fastening case 1400 is pressed onto the microchamber plate accommodating cover 1310 and fastened to the microchamber plate accommodating portion 1200.
  • the fastening case 1400 and the microchamber plate accommodating part 1200 may be fastened by inserting the accommodating part fastening protrusion 1200S-1 into the case fastening groove 1400S-1.
  • the fastening case 1400 is fastened to the microchamber plate accommodating part 1200, the lower end of the lid support part 1316 is in close contact with the upper surface of the microchamber plate 100 for sample injection, and thus the microchamber plate accommodating part cover 1310.
  • a sample solution storage space S is formed between the sample chamber and the upper surface of the micro chamber plate 100.
  • the fastening case 1400 As the fastening case 1400 is fastened to the micro chamber plate accommodating part 1200, the lower end of the auxiliary cover part through hole 1314-1 communicates with the sample solution storage space S, and the case through hole 1424 is The auxiliary cover part through hole 1314-1 and the temporary storage part 1312 communicate with each other.
  • a case cover 1500 is attached to the fastening case 1400.
  • the case cover 1500 is provided with a case cover through hole 1524 penetrating the upper and lower surfaces.
  • the case cover through hole 1524 is formed so that the auxiliary cover part through hole 1314-1 is exposed to the outside and a part of the temporary storage part 1312 is sealed when the case cover 1500 is attached to the fastening case 1400.
  • 1500S of FIG. 19 illustrates a case cover set in which a plurality of case covers 1500 are interconnected to each other.

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Abstract

본 발명은 마이크로 챔버 플레이트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 많은 수의 핵산을 포함하고 있는 생물학적 시료 용액을 분석하기 위하여 각각의 핵산에 선택적으로 반응하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 다수의 반응액들이 교차오염없이 반응하여 형광값을 실시간으로 측정 및 분석할 수 있도록 하는 분석용 챔버 플레이트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 분석용 챔버 플레이트의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 분석용 챔버 플레이트의 제조에 사용되는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트를 제조하는 장치 셋에 관한 것이다.

Description

시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 및 분석용 마이크로 챔버 프레이트의 제조 방법, 분석용 마이크로 챔버 플레이트 및 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 장치 셋
본 발명은 마이크로 챔버 플레이트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 많은 수의 핵산을 포함하고 있는 생물학적 시료 용액을 분석하기 위하여 각각의 핵산에 선택적으로 반응하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 다수의 반응액들이 교차오염없이 반응하여 형광값을 실시간으로 측정 및 분석할 수 있도록 하는 분석용 챔버 플레이트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 분석용 챔버 플레이트의 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 분석용 챔버 플레이트의 제조에 사용되는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트의 제조 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트를 제조하는 장치 셋에 관한 것이다.
마이크로 챔버란 수 마이크로 리터 이하의 미세한 반응이 일어나는 용기로서, 실리콘웨이퍼, 유리, 금속, 세라믹 또는 플라스틱 등으로 형성될 수 있으며, 상기 마이크로 챔버 플레이트란, 상기 마이크로 챔버가 2차원적으로 배열되어 이루어진 플레이트로서 일반적으로 일측 면은 시료가 주입되고 밀봉될 수 있는 구조로 이루어진다.
한편, 유전자의 양을 측정하는 방법으로서 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction)을 수행하면서 실시간으로 유전자의 양에 비례하여 증가되는 형광값을 측정할 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR) 방법이 개발되었다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응 방법은 중합효소연쇄반응을 수행함에 따라 중합효소연쇄반응 산물로부터 발생되는 형광값을 각 사이클마다 측정하고, 일정량 이상의 형광값이 발생되는 사이클을 확인함으로써 시료의 특정유전자 초기 농도를 정량적으로 분석할 수 있다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응 방법은 상기 중합효소연쇄반응 후에 전기영동과정이 필요하지 않고, 중합효소연쇄반응을 수행함과 동시에 반응된 산물을 정량적으로 측정하여 시료 내부의 각각의 특정염기배열을 가진 유전자의 농도를 109 이상의 범위에서 결정할 수 있는 이점이 있다.("A-Z of Quantitative PCR" edited by Stephen A. Bustin 2004-2006 International University, "Realtime PCR" edited by M. Tevfik Dorak 2006 Taylor & Francis Group)
상기 실시간 중합효소연쇄반응 방법을 수행하는 실시간 중합효소연쇄반응 기기는 다양한 형태가 제안된 바 있으며, 다수의 시료를 분석할 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응 기기로서 표준 96well, 384well 플레이트를 사용하여 96개 또는 384개의 유전자들을 분석할 수 있는 기기가 제안된 바 있다.(Roche 사의 Light cycler 480, ABI 7500, 7900)
상기 Roche사의 실시간 중합효소연쇄반응 기기는 반응 시료의 양이 10 내지 50㎕의 것으로, 비교적 많은 양의 시료가 소요되고 많은 수의 유전자를 분석하지 못하는 문제점이 있다.
상기 문제점을 해결하기 위해 MEMS(Micro Electro Mechanical Systems) 기술을 이용하여 반응 시료의 양을 줄임으로써 빠른 시간 내에 많은 시료를 동시에 분석하기 위한 다양한 방법들이 제시된 바 있으며, 이에 따라 마이크로 챔버 어레이 플레이트를 이용한 방법 역시 제안된 바 있다.
마이크로 챔버 어레이 플레이트를 사용하는 방법은 크게 상기 마이크로 챔버에 반응시료를 주입하는 단계, 마이크로 챔버간의 반응용액을 밀봉시키는 단계, 반응 및 분석단계의 3단계로 구성될 수 있으며, 첫 번째로 개별적으로 상기 마이크로 챔버에 시료용액을 가하는 방법으로서, 투명한 세포배양용 마이크로 챔버 플레이트에 반투과성 막을 덮어 마이크로 챔버를 격리시키고 각각의 마이크로 챔버에 하나의 세포를 배양하여 배양액을 제거한 후, 택맨(Taqman) 반응용액을 가하고 증발방지를 위해 투명 오일로 밀봉하여 온도사이클링을 하면서 플레이트의 바닥에서 형광값을 측정하는 마이크로 챔버 어레이 플레이트가 제안된 바 있다.(YASUDA, Kenji EP 1,541,678 A1, JP 2002245900 NUCLEIC ACID ANALYSIS CHIP AND NUCLEIC ACID ANALYZER)
상기 방식은 각각의 마이크로 챔버에 각기 다른 용액을 마이크로 피펫으로 흡입하고 가해 주어야하므로 시간이 많이 걸리고 특히, 1,536개 이상의 마이크로 챔버에 시료를 주입하기 위해서 미세자동분주기를 사용해야 하는데 각각 다른 용액을 가하기전에 세척하는 과정에 많은 시간이 걸려 현실적으로 384 플레이트 이상은 사용이 어려운 문제점이 있다.
두 번째로, 첫 번째 방법을 해결하기 위해 실리콘 웨이퍼를 포토리소그래피와 화학식각 방식으로 마이크로 챔버 어레이를 구성한 반응기가 E. Tamiya 교수그룹의 Hidenori Nagai 등에 의해 제시된 바 있다.(Anal. Chem. 2001 73, 1043-1047, Development of a Microchamber Array for Picoliter PCR)
상기 반응기는 중합효소연쇄반응 용액의 증발을 방지하기 위해 현미경 슬라이드 커버 글라스를 이용하였으나, 상기 커버글라스를 덮을 때와 떼어낼 때 반응액의 교차오염이 유발됨에 따라 발수성 막을 커버글라스와 웨이퍼 사이에 끼워서 먼저 상기 커버글라스를 제거한 후 반응용액을 건조시킨 후에 발수성 막을 제거하고 분석해야하는 번거로움이 있었으며, 실시간 유전자 정량증폭에 사용할 수 없는 문제점이 있었다.
세 번째로, 정량증폭 문제점을 해결하기 위해서 같은 연구실에서 Y. Matsubara 등은 웨이퍼 상의 오목한 마이크로 챔버에 각각의 프라이머를 마이크로어레이 장비를 이용하여 가한 후 건조시킨 마이크로 챔버 어레이를 개발하였다.(7th International Conference on Miniaturized Chemical and Biochemical Analysis Systems October 5-9, 2003, Squaw Valley California USA)
상기 마이크로 챔버 어레이는 칩의 상부에 미네랄 오일을 가하여 마이크로 챔버를 완전히 덮은 다음 여기에 중합효소연쇄반응 반응액을 나노제트 분주기를 이용하여 반응기의 미네랄 오일 위에서 점적하는 방법을 사용하였다. 이 방법은 1인치 × 3인치의 실리콘 웨이퍼를 포토리소그래피와 화학식각 방식으로 50 나노 리터의 부피( 0.65 × 0.65 × 0.2 mm)를 가지는 1,248개의 마이크로 챔버 어레이 칩을 제조한 후 마이크로 챔버에 프라이머와 택맨(Taqman) 프로브 용액을 나노 리터 분주기로 점적하여 이것을 건조시키고, 전체를 미네랄 오일로 코팅을 하여 각각의 마이크로 챔버를 격리 밀봉하였다.
상기 세 번째 방법을 이용하여 제조된 마이크로 챔버 어레이는 나노 리터 분주기를 이용하여 Taq DNA 중합효소와 시료 DNA의 혼합액을 미네랄 오일의 상층부에서 분사하여 각각의 마이크로 챔버에 분주하여 줌으로서 성공적으로 마이크로 챔버에서 각각의 반응성분들이 교차오염이 없이 중합효소연쇄반응을 수행할 수 있는 장점이 있다.
그러나 상기 방법은 용액을 주입할 때 별도의 마이크로어레이용 나노 리터 분주장비가 필요하고, 분주를 하기 위한 시간이 오래 소요되며, 플레이트 이동 시에 미네랄오일의 유동으로 반응액 상호간의 교차오염의 위험성이 높은 문제점이 있다. 또한, 온도 사이클링 반응 시 고온에서 버블이 발생되고 오일과 수용액의 소수성효과로 인해 수용액이 구형형태로 되어 렌즈효과를 일으킴에 따라 광학 측정 시 여기광과 발광이 산란, 분산되어 측정오차를 크게 만드는 문제점이 있다.
네 번째로, 상기 세 번째와 같은 화학적인 식각방식에 의해 제조된 마이크로 챔버이지만 상기 세 번째 방식보다 훨씬 많은 수의 반응을 시킬 수 있는 것으로 PicoTiterPlate 가 개발된 바 있다.(John H. Leamon et al., A massively parallel PicoTiterPlate based platform for discrete pico-liter-scale polymerase chain reactions. Electrophoresis 2003, 24, 3769-3777)
상기 네 번째 방식은 39.5 pl의 양으로 300,000 개의 독립적인 중합효소연쇄반응을 시킬 수 있는 형태가 있으나 프라이머/프로브들을 고정화한 담체가 있어야 하므로 균일한 광학 특성이 요구되는 실시간 정량 중합효소연쇄반응에 적용될 수 없다.
다섯 번째로, 미량시료를 반응시키기 위해서 미국특허 제 5948673호에는 '필름 반응기(또는 DNA 카드)'라 하는 반응기가 제시된 바 있다.
상기 필름 반응기는 3층의 매우 얇은 필름으로 되어 있으며, 구체적으로, 하층 필름은 반응기의 밑면을 형성하고, 중층 필름은 반응기의 측면을 형성하며, 상층 필름은 시료주입구를 형성한다. 상기 필름 반응기에 파이펫을 통하여 미량 시료용액을 주입한 후에 반응을 위해서는 반응주입구를 완전하게 밀봉하여야 하는데, 완벽히 밀봉되지 않을 경우 중합효소연쇄반응 시 반응용액이 모두 증발되게 되는 문제점이 있으며, 상기 필름 반응기는 수천 개의 시료를 다루기 위해서는 구조적으로 너무 복잡해지므로 현실적으로 제조가 불가능하다.
여섯 번째로 표준 ELISA 플레이트 크기로 1,536 형광분석 반응을 수행할 수 있는 반응플레이트가 WO 02/40158과 US 6,232,114에 개시된 바 있다.
상기 여섯 번째 방법은 플레이트에 다수의 관통된 구멍을 형성하고, 형광양이 적은 투명한 필름을 융착하여 다수의 반응용기를 형성하고 여기에 시료를 담은 후 투명필름으로 밀봉하여 반응을 수행하는 용기를 이용하는 방법이다. 상기 반응 플레이트는 상면 및 하면이 투명하게 형성되고, 일측 면에서 여기광을 가해주고 다른 한쪽에서 형광을 측정할 수 있는 장점이 있다.
그러나 상기 여섯 번째 방법 역시, 많은 수의 유전자를 분석하기 위해서는 각각의 마이크로 챔버마다 각각 다른 프라이머와 프로브가 들어가야 하는데 많은 수의 시료를 분석하는 플레이트는 수천 개의 다른 용액을 미세한 마이크로 챔버에 넣어 주어야 하므로, 이를 위해 종래의 나노 리터 분주기와 같은 특수한 분주장비가 필요하고, 많은 시간이 걸리는 작업이면서도 시료 주입 시 불량이 발생하는 문제점을 그대로 가지고 있게 된다. 또한, 마이크로 챔버 내에 용액을 완전히 채울 수 없는 문제로 인하여, 기포가 생기고 가온될 경우 마이크로 챔버 상부에 수증기가 맺히게 되어 스케터링에 의해 광학 측정을 방해하는 문제점도 있다.
일곱 번째로 일측 면에 시료 주입을 위한 다공성 막이 형성되고 타측 면에 광학 측정부가 형성된 마이크로 챔버 플레이트를 이용한 반응플레이트를 본 발명자 등이 PCT 출원(PCT/KR2008/005635)한 바 있다.
상기 일곱 번째 방법은 플레이트에 다수의 관통된 구멍을 형성하고, 일측 면에 형광양이 적은 투명한 필름을 융착하여 다수의 반응용기를 형성하고 여기에 시료를 담은 후 타측 면에 시료용액 주입이 가능한 다공성 막으로 밀봉하여 반응을 수행하는 용기를 이용하는 방법이다. 상기 반응 플레이트는 다공성 막을 통해 시료용액 주입 후 주입면에 미네랄 오일을 점적하여 밀봉하고, 타측 면에 형성된 광학 측정부로 여기광 인가 및 측정하는 방법이다.
그러나 상기 일곱 번째 방법은, 주입부와 광학 측정부가 별도로 형성되어 있어 구조가 복잡하고, 주입부에 형성된 미네랄 오일층이 투명해져 바닥면의 얼룩 상태에 따라 측정 결과의 편차 문제가 있을 수 있다. 또한, 반응 및 측정을 위해 미네랄 오일 점적된 주입부가 하측으로 향할 수 있는데 이때 시료에 비해 상대적으로 밀도가 낮은 미네랄 오일이 마이크로 챔버 내부로 유입되어 스케터링을 유발하는 문제점도 있다.
여덟 번째로 국제출원된 "THE MICRO-CHAMBER PLATE, MANUFACTURING METHOD THEREOF;국제출원번호 : PCT/KR2008/005635"가 공개된 바 있다.
그러나 상기 여덟 번째 방법은, 주입을 위한 시료를 다공성 막에 직접 인가하는 구조로 되어 있어, 1)진공에 의한 시료 주입 방법을 사용할 경우; 진공 인가시 시료의 끓음을 방지하기 위해서 원심력을 가해 주게 되는데 이때 다공성 막의 기공을 통한 기체의 배출이 시료의 표면 장력과 원심력에 의해 방해받게 되고, 2)원심력에 의해 마이크로 챔버내의 기체가 압착되어 부피가 축소됨으로써 주입 과정 중에 막을 통해 빠져나갈 수 있을 정도의 부력을 받지 못하고 작은 기포 형태로 잔존하다가 대기압 상태의 측정 조건에서 다시 팽창되어 측정을 방해하는 문제점이 있다.
따라서, 다수의 마이크로 챔버에 간편하게 시료를 주입하고 각 반응액 간의 교차 오염이 일어나지 않고, 광학측정부의 시료 등에 의한 오염 가능성이 없이 시료로부터 발생되는 광을 실시간으로 정확하게 측정할 수 있는 마이크로 챔버 플레이트가 요구되고 있다.
본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응, 정온 효소반응, 또는 LCR(Ligase Chain Reaction)에 요구되는 다수개의 마이크로 챔버 내부에 용액이 증발됨을 방지하고, 용액을 용이하게 주입하여 주입 단계에 소요되는 시간을 획기적으로 줄일 수 있으며, 마이크로 챔버 간에 용액이 혼입되지 않도록 하며, 주입부와 광학 측정부를 일체화하여 구조가 간단하고 광학 측정부에 미세기포가 발생되지 않음으로써 형광값을 더욱 정확히 측정할 수 있어 분석의 정확도를 높일 수 있는 마이크로 챔버 플레이트 및 이의 제조 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상측 개방구가 형성된 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)에 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)를 안치시키는 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트 안치 단계(S20); 임시 저장부(312)와 상기 임시 저장부(312)에 연접하여 형성되어 보조 덮개부 관통공(314-1)이 형성된 보조 덮개부(314)를 포함하는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(310)가 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)의 상측 개방구를 덮도록 배치하는 덮개부 배치 단계(S30); 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(310)가 배치된 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)를 진공인가가 가능한 원심분리기에 넣고 원심력을 가하여 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)에 연통되도록 상기 임시 저장부(312)에 형성된 용기 연통부를 통하여 상기 임시 저장부(312)에 임시 저장된 시료 용액을 상기 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)에 주입시켜 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트(100A)를 제조하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S40); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법에 관한 것이다.
한편, 본 발명은 임시 저장부(1312)와 상기 임시 저장부(1312)에 연접하여 형성되며 보조 덮개부 관통공(1314-1)이 형성된 보조 덮개부(1314)를 포함하는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310)의 하측단을 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100) 상면에 밀착시켜, 상기 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100) 상면과의 사이에 시료 용액 저장 공간을 형성하는 시료 용액 저장 공간 형성 단계(S200); 상기 시료 용액 저장 공간이 형성되도록 상호 밀착된 상기 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100) 및 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310)를 진공인가가 가능한 원심분리기에 넣고 원심력을 가하여 상기 임시 저장부(1312)에 임시 저장된 시료 용액을 상기 시료 용액 저장 공간에 연통되도록 상기 임시 저장부(1312)에 형성된 용기 연통부를 통하여 상기 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)에 주입시켜 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트(100A)를 제조하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S300); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S40, S300)는, 상기 원심분리기에 진공을 인가하고, 상기 원심분리기 내의 진공 인가 상태에서 제1 원심력을 발생시키는 진공 및 원심력 인가 단계; 상기 원심분리기에 의하여 상기 제1 원심력보다 큰 제2 원심력을 발생시킨 상태에서 상기 원심분리기 내의 진공을 해제하여 상기 시료 용액을 상기 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트에 주입시키는 진공 해제 및 원심력 인가 단계; 를 포함할 수 있는데, 상기 제1 원심력은 상기 원심분리기 내의 진공 인가 상태에서 상기 시료 용액의 범핑(bumping)을 억제시킬 수 있는 원심력일 수 있고, 상기 용기 연통부는 외력에 의하여 벌어지도록 상기 임시 저장부(312, 1312)에 형성된 절개선(312-1, 1312-1)이고, 상기 제2 원심력은 상기 절개선(312-1, 1312-1)을 벌릴 수 있는 크기의 원심력일 수 있다.
한편, 본 발명은 상기 어느 하나의 방법에 의하여 제조된 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트를 이용한 분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법으로서, 상기 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트(100A)를 상기 원심분리기로부터 꺼낸 뒤, 상기 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트(100A)의 분리막(130)을 밀봉한 분석용 마이크로 챔버 플레이트를 제조하는 분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S50); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법에 관한 것이다.
한편, 본 발명은 하측면에 몸체 밀폐부(120)가 형성되고, 상측면에 밀봉된 분리막이 형성되며, 핵산 분석을 위한 특이 성분(140) 및 핵산을 포함하는 시료 용액이 내장된 단위 개수의 챔버 홀(112)이 형성된 분석용 마이크로 챔버 플레이트에 있어서, 상기 몸체 밀폐부(120)는 빛을 반사하는 재질로 형성되고, 상기 밀봉된 분리막은 다공성 재질의 분리막(130)이 고분자성 오일로 도포되어 상기 다공성 재질의 분리막(130) 표면의 광학 투명도가 증가되며 밀봉된 것을 특징으로 하는 분석용 마이크로 챔버 플레이트에 관한 것이다.
한편, 본 발명은 상측 개방구가 형성된 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200); 개폐 가능하며 개방시 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)에 연통되는 용기 연통부가 형성된 임시 저장부(312)와 상기 임시 저장부(312)에 연접하여 형성되어 보조 덮개부 관통공(314-1)이 형성된 보조 덮개부(314)를 포함하며, 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)의 상측 개방구를 덮는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(310); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 장치 셋에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 보조 덮개부 관통공(314-1)을 외부에 노출시키며 상기 임시 저장부(312)의 일부를 밀폐하는 임시 저장부 덮개(320)를 포함할 수 있고, 상기 임시 저장부(312)의 하측면은 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)에 인입되고, 상기 임시 저장부(312)의 상단 및 상기 보조 덮개부(314)는 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)의 상단에 배치될 수 있고, 상기 보조 덮개부 관통공(314-1)의 상단 및 상기 임시 저장부(312)의 상단을 덮는 임시 저장부 덮개(320)를 포함하되, 상기 임시 저장부 덮개(320)는 기체는 통과시키고, 상기 시료 용액은 통과시키지 않는 멤브레인 필터일 수 있고, 상기 용기 연통부는 외력에 의하여 벌어지는 절개선(312-1)일 수 있다.
한편, 본 발명은 임시 저장부(1312)와 상기 임시 저장부(1312)에 연접하여 형성되어 보조 덮개부 관통공(1314-1)이 형성된 보조 덮개부(1314)를 포함하며, 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100) 상면과의 사이에 시료 용액 저장 공간(S)이 형성되도록 체결수단에 의하여 하측단이 상기 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100) 상면에 밀착되는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310); 를 포함하되, 상기 임시 저장부(1312)에는 개폐 가능하며 개방시 상기 시료 용액 저장 공간에 연통되는 용기 연통부가 형성되는 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 장치 셋에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 체결수단은, 상기 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)가 안치되는 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200); 상면에 상기 보조 덮개부 관통공(1314-1) 및 상기 임시 저장부(1312)를 외부와 연통시키는 케이스 관통공(1424)이 형성되고, 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310) 상단을 압착하며 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200)에 체결되는 체결 케이스(1400); 를 포함할 수 있고, 상기 용기 연통부는 외력에 의하여 벌어지는 절개선(1312-1)일 수 있고, 상기 체결 케이스(1400)에는 상기 보조 덮개부 관통공(1314-1)은 외부에 노출시키고 상기 임시 저장부(1312)의 일부를 밀폐하도록 상기 케이스 관통공(1424)을 덮는 케이스 덮개(1500)를 포함할 수 있고, 상기 체결 케이스(1400)에는 상기 케이스 관통공(1424)을 덮는 케이스 덮개(1500)가 부착되되, 상기 케이스 덮개(1500)는 기체는 통과시키고, 상기 시료 용액은 통과시키지 않는 멤브레인 필터일 수 있다.
본 발명은 핵산을 포함하는 시료 용액의 주입부인 분리막을 광학 측정부로 사용함으로써 구조가 간단하고, 오염에 의한 광학 측정부의 측정의 오차를 발생시키지 않으며, 분석용 마이크로 챔버 플레이트의 크기를 작게 할 수 있어 온도조절이 용이하고, 이에 따라 분석에 소요되는 시간을 획기적으로 줄일 수 있는 장점이 있다.
본 발명은 챔버 홀 내부로 핵산을 포함하는 시료 용액을 주입하는 경우 진공에 의해 챔버 홀 내부의 기체를 먼저 제거한 후 분리막을 통해 주입이 이루어 짐으로써 단시간 내 잔존 기체 없이 완전한 주입이 가능하여 챔버 홀의 내부 잔류 기체에 의해 광학 측정값이 올바로 측정되지 않는 문제를 방지할 수 있고, 분리막을 고분자성 오일인 미네랄 오일(mineral oil) 또는 실리콘 오일(silicone oil) 등으로 밀봉함으로써 챔버 홀 간의 용액의 혼입에 따른 교차 오염 문제를 방지함에 따라 분석의 정확도를 높일 수 있는 장점이 있다.
본 발명은 복수개의 분석용 마이크로 챔버 플레이트가 일체로 형성 가능하여 여러 종류의 시료를 동시에 분석 및 비교함으로써 분석에 소요되는 시간을 획기적으로 단축할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 분석용 마이크로 챔버 플레이트는 분리막 및 광학 측정부의 이면이 분석용 마이크로 챔버 플레이트와 일체로 형성 가능함으로써, 알루미늄 압축성형 등의 방법으로 제작이 가능하여 생산 공정 및 제작비용을 획기적으로 단축할 수 있는 장점이 있다.
도1은 실시예1의 흐름도.
도2는 도1의 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계에서 제조되는 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트의 사시도.
도3은 도2의 AA'의 단면도.
도4는 도2의 주요부의 분해 사시도.
도5는 도1의 원(origin) 마이크로 챔버 몸체 제조 단계에서 제조되는 원(origin) 마이크로 챔버 몸체의 사시도.
도6은 도5의 원(origin) 마이크로 챔버 몸체의 단면도.
도7은 도1의 코팅 단계 및 커플링 단계를 설명하기 위한 단면도.
도8은 도1의 몸체 밀폐부 부착 단계를 설명하기 위한 단면도.
도9는 도1의 특이 성분 주입 단계를 설명하기 위한 단면도.
도10은 도1의 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트 안치 단계, 덮개부 배치 단계 및 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계를 설명하기 위한 분해 사시도.
도11은 도10의 결합 사시도.
도12는 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트가 안치된 도11의 BB'의 단면도.
도13은 도10의 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개의 확대도.
도14는 도10의 임시 저장부 덮개의 확대도.
도15는 도10의 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개와 임시 저장부 덮개가 상호 결합 형성된 덮개부의 사시도.
도16은 도10의 마이크로 챔버 플레이트 수용부의 확대도.
도17은 도3에 대응하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트의 단면도.
도18은 실시예5의 흐름도.
도19는 도18의 시료 용액 저장 공간 형성 단계 및 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계를 설명하기 위한 분해 사시도.
도20은 도19의 결합 사시도.
도21은 도20의 AA'의 단면도.
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>
100:시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트
100A:시료 내장 마이크로 챔버 플레이트
112:챔버 홀 120:몸체 밀폐부
130:분리막 140:특이 성분
200:마이크로 챔버 플레이트 수용부 300:덮개부
310:마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개
312:임시 저장부 312-1:절개선
314:보조 덮개부 314-1:보조 덮개부 관통공
320:임시 저장부 덮개
1200:마이크로 챔버 플레이트 수용부
1310:마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개 1312:임시 저장부
1312-1:절개선
1314:보조 덮개부 1314-1:보조 덮개부 관통공
1400:체결 케이스 1424:케이스 관통공
1500:케이스 덮개
S:시료 용액 저장 공간
이하, 도면을 참조하며 본 발명의 일실시예에 대하여 상세히 설명한다.
실시예1
실시예1은 본 발명에 따른 분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법에 관한 것이다.
도1을 참조하면 실시예1은 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S10), 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트 안치 단계(S20), 덮개부 배치 단계(S30), 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S40) 및 분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S50)를 포함한다.
1. 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S10)
도2 내지 도4를 참조하면 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S10)에서는 프라이머나 프로브가 포함된 핵산 분석을 위한 특이 성분(140)이 내장되는 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)가 제조된다. 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)는 마이크로 챔버 몸체(110), 몸체 밀폐부(120) 및 분리막(130)을 포함한다.
따라서, 도1 내지 도4를 참조하면 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S10)는 마이크로 챔버 몸체(110)를 제조하는 마이크로 챔버 몸체 제조 단계(S11), 마이크로 챔버 몸체(110)의 하측면에 몸체 밀폐부(120)를 형성하는 몸체 밀폐부 부착 단계(S12), 특이 성분(140)을 주입하는 특이 성분 주입 단계(S13) 및 마이크로 챔버 몸체(110)의 상측면에 분리막(130)을 형성하는 분리막 부착 단계(S14)를 포함한다.
한편, 도1을 참조하면 마이크로 챔버 몸체 제조 단계(S11)는 원(origin) 마이크로 챔버 몸체 제조 단계(S11-1), 코팅 단계(S11-2) 및 커플링 단계(S11-3)를 포함한다.
도5 및 도6을 참조하면 원(origin) 마이크로 챔버 몸체 제조 단계(S11-1)에서는 상하면을 관통하는 단위 개수의 원(origin) 챔버 홀(110-1H)이 형성된 원(origin) 마이크로 챔버 몸체(110-1)가 제조된다. 원(origin) 마이크로 챔버 몸체(110-1)는 중합효소연쇄반응(PCR)이나 기타의 분석 반응에서 가해지는 열에 대하여 내구성을 가진 재료로 제조되는 것이 바람직한데, 특히 0℃ 내지 100℃ 에서 변형이 일어나지 않는 재료로 제조되는 것이 바람직하다. 따라서, 원(origin) 마이크로 챔버 몸체(110-1)는 알루미늄, 실리콘웨이퍼, 유리, 금속, 또는 플라스틱일 수 있다. 한편, 원(origin) 마이크로 챔버 몸체(110-1)는 이음편(도면 부호 미부여)에 의하여 상호 연결되며 다수개 형성될 수 있다. 도면 부호 110-1S는 원(origin) 마이크로 챔버 몸체(110-1)가 여러개 연결되어 형성된 원(origin) 마이크로 챔버 몸체 셋(set)을 나타낸다.
도7을 참조하면 코팅 단계(S11-2) 및 커플링 단계(S11-3)를 수행함에 따라 마이크로 챔버 몸체(110)가 제조되는데, 마이크로 챔버 몸체(110)에는 단위 개수의 원(origin) 챔버 홀(110-1H)에 대응하는 단위 개수의 챔버 홀(112)이 형성된다. 챔버 홀(112)은 0.3 내지 3 mm 의 폭을 가지며, 0.5 내지 5 mm 의 깊이를 갖도록 형성될 수 있다. 실시예1의 경우 챔버 홀(112)은 하나의 마이크로 챔버 몸체(110)에 복수 개 형성되므로 동시에 많은 수의 핵산을 정량적으로 분석할 수 있고, 챔버 홀(112)의 깊이가 얕아 열전도 성능이 좋으며, 분석시간을 줄이고 분석의 정확도를 높일 수 있다.
도7을 참조하면 코팅 단계(S11-2)에서는 원(origin) 마이크로 챔버 몸체(110-1)를 고분자 용액에 디핑(dipping)하여 원(origin) 마이크로 챔버 몸체(110-1) 표면 및 단위 개수의 원(origin) 챔버 홀(110-1H, 도6 참조) 내면에 고분자 코팅층(110-2)을 형성하게 된다.
본 출원의 발명자는 (주)베이스코리아의 폴리에스터계 수지인 제품명 ES-120s(복합 방향족 디카르복실산과 복합 지방족 디올과의 반응으로 얻어진 공중합 폴리에스터) 수지가 톨루엔(4, toluene)과 엠이케이(1, MEK)에 50%로 희석된 수지 용액을 톨루엔을 이용하여 5 ~ 20 vol%로 희석하여 점도를 조절한 후 1회에서 3회까지 디핑(dipping) 횟수를 바꾸어 원(origin) 마이크로 챔버 몸체(110-1)를 코팅하였다. 본 출원의 발명자는 원(origin) 챔버 홀(110-1H)이 막히지 않고 균일한 고분자 코팅층(110-2)을 형성하는 점도로는 5 vol%에서 10 vol%가 가장 적합하였고, 디핑(dipping) 횟수는 2회가 가장 적합함을 확인하였다. 한편, 원(origin) 마이크로 챔버 몸체(110-1)의 재질이 알루미늄인 경우에는 코팅 단계(S11-2) 수행 전 원(origin) 마이크로 챔버 몸체(110-1)의 표면을 화이트 애노다이징(white anodizing)하는 화이트 애노다이징(white anodizing) 단계를 수행하는 것이 바람직하다.
도7을 참조하면 커플링 단계(S11-3)에서는 고분자 코팅층(110-2) 표면을 커플링(coupling)하게 된다. 커플링(coupling)은 폴리에스터계 수지 내에 존재하는 작용기인 카르복실산을 제거하기 위한 것이다.
본 출원의 발명자는 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride(EDC)와 4-Dimethylaminopyridine(DMAP)을 사용하여 에탄올 용매하에서 커플링(coupling)을 수행하였다. 먼저 0.25M 농도의 EDC와 DMAP를 각각 제조하고, 이를 각각 50ml와 9ml씩 혼합하여 상온에서 12시간 이상 반응시켰다. 후에 에탄올과 증류수로 3회씩 세척 후 건조하여 커플링(coupling)을 완료하였다.
본 발명에서 사용된 폴리에스터계 수지는 알루미늄 표면에 접착성이 매우 우수하여 안정된 고분자 코팅층(110-2)을 형성하고, 무색 투명하여 사용에 매우 적합한 것으로 평가되었다.
도8을 참조하면 몸체 밀폐부 부착 단계(S12)에서는 커플링 단계(S11-3) 수행 후 단위 개수의 챔버 홀(112)의 하측 개방구를 각각 몸체 밀폐부(120)에 의하여 밀폐시키게 된다. 몸체 밀폐부(120)는 몸체 밀폐부 부착 단계(S12)에서 고분자 코팅층(110-2)에 접촉되어 고온 상태에서 가압됨으로써 고분자 코팅층(110-2)에 부착된다. 몸체 밀폐부(120)는 분리막(130, 도17 참조)을 통한 광학측정 시 조사광과 시료로부터의 여기광 측정이 용이하도록, 분리막(130, 도17 참조) 방향으로 빛을 반사하는 재질로 형성될 수 있다. 따라서, 단위 개수의 챔버 홀(112)의 하측 개방구가 투명 재질의 필름으로 밀폐되는 경우에는 몸체 밀폐부(120)는 상기 투명 재질의 필름 외에 상기 투명 재질의 필름 외측에 부착되는 반사 재질의 필름을 추가로 포함할 수 있다. 한편, 몸체 밀폐부(120)가 투명한 재질의 필름이거나 빛을 반사하는 재질이 아닌 재질의 필름인 경우에는 챔버 홀(112)의 하측 개방구 방향에 위치할 면에 반사층을 더 형성할 수 있다. 한편, 몸체 밀폐부(120)는 핵산을 포함하는 시료 용액의 유출을 차단할 수 있는 재질의 것을 사용한다.
본 출원의 발명자는 몸체 밀폐부(120)로 투명하거나 불투명한 흰색의 고분자 필름 형태의 제품을 사용하였는데, (주)케이엠산업의 폴리에틸렌테레프탈레이트 (PET) 재질의 두께 40㎛의 투명한 필름과 불투명한 흰색 필름(제품명 : ST-DF 50W)을 모두 사용하였다. 이를 통해, 본 출원의 발명자는 더욱 정확한 광학 측정값을 얻을 수 있음을 확인하였다.
도9를 참조하면 특이 성분 주입 단계(S13)에서는 하측 개방구가 몸체 밀폐부(120)에 의하여 밀폐된 단위 개수의 챔버 홀(112) 각각에 프라이머나 프로브가 포함된 핵산 분석을 위한 특이 성분(140)을 주입하게 된다. 특이 성분(140)은 핵산분석을 위한 형광분석시약 및 필요에 따라 핵산증폭효소, DNA구성 화합물(dNTP), 버퍼 또는 안정화제(반응용액, 프라이머, 효소 등과 분자적으로 잘 혼합되어 이들을 안정화시키고 용기내의 흡착을 줄여주는 역할을 하는 물질로서, 폴리올, 탄수화물, 소알부민, PEG 등을 예로 들 수 있다.)를 더 포함할 수 있다. 특이 성분(140)은 그 조성에 따라 건조, 반건조, 또는 액상의 상태로 이용된다.
도3을 참조하면 분리막 부착 단계(S14)에서는 마이크로 챔버 몸체(110)의 상측면에 분리막(130)을 부착하게 된다. 즉, 분리막 부착 단계(S14)에서는 분리막(130)이 단위 개수의 챔버 홀(112)의 상측단에 부착되어 특이 성분(140)이 주입된 단위 개수의 챔버 홀(112)의 상측 개방구를 덮게 된다. 분리막(130)은 특이성분(140)은 통과시키지 않고, 핵산을 포함하는 시료 용액은 통과시킬 수 있도록 형성된다. 따라서, 특이 성분(140)은 챔버 홀(112) 내부로부터 분리막(130)을 통하여 외부로 유출되지 않고, 핵산을 포함하는 시료 용액은 챔버 홈(112) 외부로부터 분리막(130)을 통하여 챔버 홀(112)로 유입될 수 있다. 따라서, 분리막(130)은 특이성분(140)은 통과시키지 않고, 핵산을 포함하는 시료 용액은 통과시킬 수 있는 다공성 재질로 형성될 수 있다. 분리막(130)이 다공성 재질인 경우 고분자성 오일로 도포되어 밀봉됨으로써 분리막(130)의 광학 투명도가 증가되어 챔버 홀(112) 내부의 시료에 대한 광학 측정이 용이해질 수 있다. 상기 고분자성 오일은 미네랄 오일(mineral oil), 실리콘 오일(silicone oil), 하이드로 카본 오일 또는 파라핀 왁스 등일 수 있다. 다공성 재질의 분리막(130)은 마이크로포아(Micropore) 형태이거나, 메시(mesh) 형태이거나, 부직포 형태일 수 있으며, 다공성 재질의 포아 크기는 0.1 내지 100 ㎛ 이내인 것이 바람직하다. 다공성 재질의 분리막(130)은 고분자 재질 멤브레인(membrane)일 수 있다. 한편, 분리막(130)은 고분자 코팅층(110-2)에 접촉되어 고온 상태에서 가압됨으로써 고분자 코팅층(110-2)에 부착된다.
본 출원의 발명자는 분리막(130)으로서 무수히 많은 일정 직경의 기공을 갖는 다공성 재질을 사용하였다. 보다 구체적으로는 pore size 12㎛의 폴리카보네이트(PC)재질의 Whatman사 제품을 선택하였다. 이는 pore size가 커 시료의 주입이 용이하며, 고분자성 오일인 미네랄 오일(mineral oil)에 의해 완전 투명해져 광학 측정이 가능하기 때문이다.
한편, 다른 일실시예의 경우 분리막(130)은 천공 가능한 필름일 수 있다. 상기 필름 형태의 분리막은 테플론, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 또는 폴리염화비닐로 이루어질 수 있으며, 챔버 홀(112) 하나 당 1 내지 10 개의 중공된 부분을 가질 수 있고, 내장된 특이성분(140)의 이탈을 방지하고, 핵산을 포함하는 시료 용액의 주입은 용이하도록 상기 천공된 부분의 폭은 10 ㎛ 내지 1 mm 이내로 형성하는데, 100 내지 500 ㎛ 일 수 있다. 한편, 상기 필름 형태의 분리막은 광학 투명도가 좋아 광학측정이 가능한 것일 수 있다.
2. 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트 안치 단계(S20)
도10 내지 도12를 참조하면 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트 안치 단계(S20)에서는 상측 개방구가 형성된 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)에 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)가 안치된다. 도면 부호 200S는 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)가 상호 연결되어 다수개 형성된 마이크로 챔버 플레이트 수용부 셋(set)을 나타낸다.
3. 덮개부 배치 단계(S30)
도1을 참조하면 덮개부 배치 단계(S30)는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개 제조 단계(S31), 임시 저장부 덮개 제조 단계(S32), 임시 저장부 덮개 부착 단계(S33) 및 시료 용액 임시 저장 단계(S34)를 포함한다.
도13을 참조하면 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개 제조 단계(S31)에서는 임시 저장부(312)와 보조 덮개부(314)가 일체로 형성된 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(310)가 제조된다. 도면 부호 310S는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(310)가 상호 연결되어 다수개 형성된 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개 셋(set)을 나타낸다.
도13을 참조하면 임시 저장부(312)는 핵산을 포함하는 시료 용액이 임시 저장되는 용기로서, 그 하측면에 용기 연통부가 형성된다. 용기 연통부는 외력에 의하여 벌어지는 절개선(312-1)일 수 있다. 따라서, 임시 저장부(312)의 하측면에 외력이 작용하지 않는 경우 임시 저장부(312)에 임시 저장된 핵산을 포함하는 시료 용액은 절개선(312-1)을 통하여 임시 저장부(312) 외부로 유출되지 않게 된다. 임시 저장부(312)는 실리콘 재질로 형성될 수 있다. 한편, 절개선(312-1)의 형상은 "＋" 형상이거나, "＜" 형상이거나, "＝" 형상이거나, "×" 형상일 수 있다.
도13을 참조하면 보조 덮개부(314)는 임시 저장부(312)의 둘레면 상측단에 연접하여 수평방향으로 형성되는 판 형상이다. 보조 덮개부(314)에는 상하면을 관통하는 보조 덮개부 관통공(314-1)이 형성된다.
도14를 참조하면 임시 저장부 덮개 제조 단계(S32)에서는 상하면을 관통하는 임시 저장부 덮개 관통공(324)이 형성된 임시 저장부 덮개(320)가 제조된다. 임시 저장부 덮개(320)는 얇은 필름 형상일 수 있다. 도면 부호 320S는 임시 저장부 덮개(320)가 상호 연결되어 다수개 형성된 임시 저장부 덮개 셋(set)을 나타낸다.
도15를 참조하면 임시 저장부 덮개(320)는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(310)의 상단에 부착된 경우 보조 덮개부 관통공(314-1)을 외부에 노출시키며 임시 저장부(312)의 상측단 일부를 밀폐하도록 형성된다. 이 경우 임시 저장부(312)의 상측단 나머지는 임시 저장부 덮개 관통공(324)을 통하여 외부에 노출된다.
도15를 참조하면 임시 저장부 덮개 부착 단계(S33)에서는 임시 저장부 덮개(320)가 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(310) 상측단에 부착된다. 임시 저장부 덮개(320)의 부착을 위하여 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(310)에 접착제가 미리 부착될 수 있는데, 접착제는 고분자성 접착제 또는 양면 테이프 등일 수 있다. 따라서, 임시 저장부(312)의 상측단 일부는 밀폐되고, 보조 덮개부 관통공(314-1) 및 임시 저장부(312)의 상측단 나머지는 임시 저장부 덮개 관통공(324)을 통하여 외부에 노출된다. 임시 저장부 덮개 부착 단계(S33)가 수행됨으로써 덮개부(300)가 형성된다.
도11, 도15 및 도16을 참조하면 임시 저장부 덮개 부착 단계(S33)가 수행되면 덮개부(300)가 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)의 상측 개방구를 덮으면서 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)의 상단에 안착된다.
도12를 참조하면 덮개부(300)가 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)의 상단에 안착되면 임시 저장부(312)의 하측면은 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)에 인입되고, 임시 저장부(312)의 상단 및 상기 보조 덮개부(314)는 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)의 상단에 배치된다.
도12를 참조하면 덮개부(300)가 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)의 상단에 안착되면 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)의 내측은 보조 덮개부 관통공(314-1) 및 임시 저장부 덮개 관통공(324)을 통하여 외부와 연통되고, 임시 저장부(312)는 임시 저장부 덮개 관통공(324)을 통하여 외부와 연통된다.
도12를 참조하면 시료 용액 임시 저장 단계(S34)에서는 임시 저장부 덮개 관통공(324)을 통하여 임시 저장부(312)에 핵산을 포함하는 시료 용액이 임시 저장된다.
4. 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S40)
도1을 참조하면 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S40)는 진공 및 원심력 인가 단계(S41)와, 진공 해제 및 원심력 인가 단계(S42)를 포함한다.
진공 및 원심력 인가 단계(S41)에서는 먼저, 덮개부(300)가 배치된 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)를 진공인가가 가능한 원심분리기 내부에 안치시킨다. 이 경우 도11을 참조하면 임시 저장부 덮개 관통공(324)이 상부를 향하고, 임시 저장부 덮개(320)가 상기 원심분리기의 회전 중심 방향을 향하고, 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)의 하측면이 상기 원심분리기의 회전 중심의 반대 방향을 향하도록 한다. 이어서, 상기 원심분리기에 진공을 인가하고, 상기 원심분리기를 작동하여 덮개부(300)가 배치된 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)에 제1 원심력이 작용하도록 한다. 진공 인가 상태에서 원심력을 가하지 않게 되면 핵산을 포함하는 시료 용액의 끓는점(b.p)이 낮아져 범핑(bumping) 현상이 발생함으로써 오염을 유발시키게 된다. 따라서, 상기 제1 원심력은 상기 원심분리기 내에 진공이 인가된 상태에서 상기 시료 용액의 범핑(bumping)이 억제되는 원심력이다. 또한 상기 제1 원심력은 절개선(312-1)이 벌어지지 않는 크기의 원심력이다. 이는 절개선(312-1)이 벌어져 상기 시료 용액이 분리막(130)과 접촉하는 방지하기 위한 것이다.
진공 해제 및 원심력 인가 단계(S42)에서는 절개선(312-1)이 벌어지도록 상기 원심분리기에 의해 발생하는 원심력이 상기 제1 원심력보다 큰 제2 원심력이 되도록 한다. 이어서, 상기 원심분리기 내의 진공을 해제하여 상기 시료 용액을 절개선(312-1) 및 분리막(130)을 통하여 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)에 주입시킨다. 도17을 참조하면 이에 따라 챔버 홀(112)에 상기 시료 용액이 주입되어 특이 성분(140, 도3 참조)과 혼합된 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트(100A)가 제조된다. 도면 부호 150은 특이 성분(140, 도3 참조)과 상기 시료 용액의 혼합 용액을 나타낸다.
본 출원의 발명자는 진공 및 원심력 인가 단계(S41)에서 상기 제1 원심력을 42g 이하로 하면서 시료 용액의 범핑(bumping)이 억제되도록 하였다.
진공 해제 및 원심력 인가 단계(S42)에서는 원심력을 서서히 증가시켜 상기 제2 원심력을 242g 이상으로 유지하며 진공을 해제하여 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)에 상기 시료 용액을 1분간 주입하였다. 이와 같은 방법을 통하여 챔버 홀(112) 내부로 시료 용액을 완벽하게 주입하였다.
진공 해제 후 시료 용액을 주입하는 방법이 효과적인 이유는 진공 인가 시에 시료 용액과 분리막(130)이 접촉하게 되면 분리막(130)의 특성상 완벽한 주입이 불가능한 문제가 있기 때문이다.
5. 분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S50)
분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S50)에서는 먼저, 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트(100A, 도17 참조)를 상기 원심분리기로부터 꺼내게 된다. 이어서, 중합효소연쇄반응(PCR)을 포함한 분석 반응 시 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트(100A, 도17 참조)에 내장된 상기 시료 용액이 외부로 유출되지 않도록, 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트(100A, 도17 참조)의 분리막(130) 표면을 밀봉하게 된다. 또한, 분리막(130) 표면의 밀봉은 분리막(130)의 광학 투명도를 증가시킴으로써 분리막(130)을 통하여 챔버 홀(112) 내부의 시료에 대한 광학 측정이 용이하게 될 수 있도록 수행된다. 분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S50)가 수행됨에 따라 중합효소연쇄반응(PCR)을 포함한 분석 반응에 사용할 수 있는 분석용 마이크로 챔버 플레이트가 제조된다.
실시예1에 의한 분석용 마이크로 챔버 플레이트는 프라이머 또는 프로브가 포함된 특이성분(140)이 내장됨으로써 실시간 중합효소연쇄반응(PCR)에 이용될 수 있으며, 이 외에도 정온 효소반응, 또는 LCR(Ligase Chain Reaction)과 같은 반응에 이용될 수 있으며, 내부에 내장되는 특이 성분(140) 등을 변경함으로써 이 외에도 다양하게 이용될 수 있다.
실시예1의 경우 분리막(130)이 다공성 재질이므로 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트(100A)의 분리막(130) 표면을 고분자성 오일로 도포하여 밀봉한다. 고분자성 오일은 미네랄 오일(mineral oil), 실리콘 오일(silicone oil), 하이드로 카본 오일 또는 파라핀 왁스 등일 수 있다. 분리막(130)이 폴리프로필렌 멤브레인(Poly polypropylene membrane)인 경우, 미네랄 오일(mineral oil)로 도포되어 밀봉될 수 있다.
폴리프로필렌 멤브레인(Poly polypropylene membrane)으로 형성된 분리막(130)이 미네랄 오일(mineral oil)로 도포되어 밀봉되면, 친수-소수 효과(Hydrophobicity)에 의해 소수성인 폴리프로필렌 멤브레인(Poly polypropylene membrane)에 침투되어 있던 물을 포함한 시료들을 소수성을 띠는 미네랄 오일이 밀어내고 그 자리에 침투하게 된다. 한편, 미네랄 오일은 상대적으로 폴리프로필렌 멤브레인과 밀도가 유사하므로 분리막(130)의 광학 투명도가 증가되어 챔버 홀(112) 내부의 시료에 대한 광학 측정이 용이하게 되고, 폴리프로필렌 멤브레인(Poly polypropylene membrane)의 기공들이 미네랄 오일에 의해 밀봉되므로 챔버 홀(112) 내부의 시료의 유출과 증발이 방지된다.
한편, 다른 일실시예에 있어서, 분리막(130)으로서 천공 가능한 필름을 이용한 경우 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트(100A, 도17 참조)의 분리막(130) 표면의 밀봉은 접착성 필름(테이프)을 이용하여 수행될 수 있다.
한편, 다른 일실시예의 경우 임시 저장부 덮개(320)는 기체는 통과시키고, 상기 시료 용액은 통과시키지 않는 멤브레인 필터일 수 있다. 임시 저장부 덮개(320)인 멤브레인 필터의 부착을 위하여 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(310)에 접착제가 미리 부착될 수 있는데, 접착제는 고분자성 접착제 또는 양면 테이프 등일 수 있다. 임시 저장부 덮개(320)는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(310)의 상단에 부착된 경우 보조 덮개부 관통공(314-1)의 상단 및 임시 저장부(312)의 상측단을 덮도록 형성된다. 이 경우 시료 용액 임시 저장 단계(S34)는 임시 저장부 덮개 부착 단계(S33) 수행 전에 수행된다.
한편, 다른 일실시예의 경우 임시 저장부 덮개 제조 단계(S32) 및 임시 저장부 덮개 부착 단계(S33)를 포함하지 않을 수 있다. 이 경우 덮개부(300)는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(310)일 수 있다. 따라서, 원심력 인가 단계(S41)가 수행되기 전에는 임시 저장부(312)의 개방된 상측을 통하여 상기 시료 용액이 유출되지 않도록, 임시 저장부(312)의 바닥면이 하방향(중력 작용방향)을 향하도록 한다. 원심력 인가 단계(S41)가 수행됨에 따라 임시 저장부(312)의 개방된 상측면이 상기 원심분리기의 회전 중심 방향을 향하고, 임시 저장부(312)의 하측면, 즉 절개선(312-1)이 형성된 면이 상기 원심분리기의 회전 중심의 반대 방향을 향하도록 한다.
한편, 다른 일실시예의 경우 임시 저장부 덮개(320)는 보조 덮개부 관통공(314-1) 및 임시 저장부(312)를 각각 덮도록 형성될 수 있다. 이 경우 임시 저장부 덮개(320)는 기체는 통과시키고, 상기 시료 용액은 통과시키지 않는 멤브레인 필터로 형성된다. 이 경우 임시 저장부 덮개(320)에는 임시 저장부 덮개 관통공(324)이 형성되지 않는다.
실시예2
실시예2는 본 발명에 따른 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트의 제조 방법에 관한 것이다.
실시예2는 실시예1에서 설명한 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S10), 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트 안치 단계(S20), 덮개부 배치 단계(S30) 및 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S40)를 포함한다.
이들에 대한 설명은 실시예1에서 설명한 바에 준한다.
실시예3
실시예3은 본 발명에 따른 분석용 마이크로 챔버 플레이트에 관한 것이다. 분석용 마이크로 챔버 플레이트(도면 미도시)는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트(100A, 도17 참조)와 분리막(130) 부분을 제외하고는 동일하므로 도17을 참조하며 설명한다.
도17 및 도6을 참조하면 실시예3은 단위 개수의 원(origin) 챔버 홀(110-1H)이 상하로 관통 형성되는 원(origin) 마이크로 챔버 몸체(110-1)를 가진다.
도17 및 도7을 참조하면 원(origin) 마이크로 챔버 몸체(110-1)의 표면 및 단위 개수의 원(origin) 챔버 홀(110-1H, 도6 참조) 내면에는 고분자 코팅층(110-2)이 형성된다. 고분자 코팅층(110-2)에 의하여 단위 개수의 원(origin) 챔버 홀(110-1H, 도6 참조)에 대응하는 단위 개수의 챔버 홀(112)이 생성된다.
도17 및 도8을 참조하면 마이크로 챔버 몸체(110)의 하측면에는 단위 개수의 챔버 홀(112)의 하측 개방구를 밀폐하도록 몸체 밀폐부(120)가 형성된다. 몸체 밀폐부(120)는 핵산을 포함하는 시료 용액의 유출을 차단하기 위한 것이다. 한편, 몸체 밀폐부(120)는 빛을 반사하는 재질로 형성되는데, 폴리에틸렌테레프탈레이트(Polyethylene terephthalate; PET)로 형성될 수 있다.
도17을 참조하면 마이크로 챔버 몸체(110)의 상측면에는 단위 개수의 챔버 홀(112)의 상측 개방구를 덮는 밀봉된 분리막(도면 미도시)이 형성된다. 상기 밀봉된 분리막(도면 미도시)은 다공성 재질의 분리막(130)이 고분자성 오일로 도포되어 밀봉됨으로써 형성된다. 상기 고분자성 오일은 미네랄 오일(mineral oil), 실리콘 오일(silicone oil) , 하이드로 카본 오일 또는 파라핀 왁스 등일 수 있다. 한편, 다공성 재질의 분리막(130)은 미네랄 오일(mineral oil)에 도포됨으로써 광학 투명도가 증가되며 밀봉될 수 있는 폴리프로필렌 멤브레인(Poly polypropylene membrane)일 수 있다.
도17을 단위 개수의 챔버 홀(112) 각각에는 프라이머나 프로브가 포함된 핵산 분석을 위한 특이 성분(140)과 핵산을 포함하는 시료 용액이 내장된다. 도면 부호 150은 이들의 혼합액을 지시한다.
기타, 설명하지 않은 사항은 실시예1에서 설명한 바에 준한다.
실시예4
실시예4는 본 발명에 따른 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 장치 셋(set)에 관한 것이다.
도10 및 도12를 참조하면 실시예4는 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)가 안치 가능한 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)를 가진다. 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)의 상단에는 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)를 안치하기 위한 상측 개방구가 형성된다.
도10 및 도12를 참조하면 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)의 상부에는 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)의 상측 개방구를 덮는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(310)가 안치된다.
도12 및 도15를 참조하면 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(310)는 상기 시료 용액이 임시 저장 가능한 임시 저장부(312)와, 임시 저장부(312)의 둘레면에 연접하여 형성되는 판상의 보조 덮개부(314)를 포함한다.
도13을 참조하면 임시 저장부(312)의 하측면에는 용기 연통부가 형성된다. 용기 연통부는 외력에 의하여 벌어지는 절개선(312-1)일 수 있다. 한편, 보조 덮개부(314)에는 상하면을 관통하는 보조 덮개부 관통공(314-1)이 형성된다.
도11 및 도12를 참조하면 임시 저장부(312)의 하측면은 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)에 인입되고, 임시 저장부(312)의 상단 및 보조 덮개부(314)는 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)의 상단에 배치된다.
도12 및 도15를 참조하면 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(310)의 상측단에는 임시 저장부 덮개(320)가 부착된다. 임시 저장부 덮개(320)는 임시 저장부(312)의 상측단 일부는 밀폐하고, 임시 저장부 덮개 관통공(324)을 통하여 보조 덮개부 관통공(314-1) 및 임시 저장부(312)의 상측단 나머지를 외부에 노출시키도록 부착된다.
기타, 설명하지 않은 사항은 실시예1에서 설명한 바에 준한다.
실시예5
실시예5는 본 발명에 따른 분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법에 관한 것이다.
도18을 참조하면 실시예5는 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S100), 시료 용액 저장 공간 형성 단계(S200), 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S300) 및 분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S400)를 포함한다.
이들 중 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S100) 및 분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S400)는 실시예1에서 설명한 바에 준한다.
1. 시료 용액 저장 공간 형성 단계(S200)
도18을 참조하면 시료 용액 저장 공간 형성 단계(S200)는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 제조 단계(S210), 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개 제조 단계(S220), 체결 케이스 제조 단계(S230), 케이스 체결 단계(S240) 및 케이스 덮개 부착 단계(S250)를 포함한다.
도19 및 도21을 참조하면 마이크로 챔버 플레이트 수용부 제조 단계(S210)에서는 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200)가 형성된다. 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200)는 평평한 판상으로 형성될 수 있다. 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200)는 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)를 안치시키기 위한 것이다. 도면부호 1200S는 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200)가 다수개 일체로 형성된 마이크로 챔버 플레이트 수용부 셋(set)을 나타낸다. 한편, 마이크로 챔버 플레이트 수용부 셋(1200S)의 측면에는 수용부 체결돌기(1200S-1)가 돌출 형성된다.
도19 및 도21을 참조하면 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개 제조 단계(S220)에서는 임시 저장부(1312)와 보조 덮개부(1314)가 일체로 형성된 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310)가 제조된다. 도19의 도면 부호 1310S는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310)가 상호 연결되어 다수개 형성된 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개 셋(set)을 나타낸다.
도19 및 도21을 참조하면 임시 저장부(1312)는 핵산을 포함하는 시료 용액이 임시 저장되는 용기로서, 그 하측면에 용기 연통부가 형성된다. 용기 연통부는 외력에 의하여 벌어지는 절개선(1312-1)일 수 있다. 절개선(1312-1)에 대한 설명은 실시예1에서 설명한 바에 준한다.
도19 및 도21을 참조하면 보조 덮개부(1314)는 임시 저장부(1312)의 둘레면에 연접하여 수평방향으로 형성되는데, 돌기 형상이거나 실시예1에서와 같이 판 형상일 수 있다. 보조 덮개부(1314)에는 상하면을 관통하는 보조 덮개부 관통공(1314-1)이 형성된다.
도19 및 도21을 참조하면 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310)의 하측가장자리에는 링 형상의 덮개 지지부(1316)가 돌출 형성된다. 덮개 지지부(1316)는 보조 덮개부 관통공(1314-1)의 하측단이 덮개 지지부(1316)의 내측에 위치하도록 형성된다.
도19 및 도21을 참조하면 체결 케이스 제조 단계(S230)에서는 케이스 관통공(1424)이 형성된 체결 케이스(1400)가 형성된다. 케이스 관통공(1424)은 체결 케이스(1400)가 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310) 상단에 안착된 경우 보조 덮개부 관통공(1314-1) 및 임시 저장부(1312)와 각각 연통되도록 형성된다. 도19의 1400S는 체결 케이스(1400)가 상호 연결되어 다수개 형성된 체결 케이스 셋(set)을 나타낸다. 한편, 체결 케이스 셋(1400S)의 측면에는 수용부 체결돌기(1200S-1)가 끼워지는 케이스 체결홈(1400S-1)이 형성된다.
도19 및 도21을 참조하면 케이스 체결 단계(S240)에서는 체결 케이스(1400)가 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310) 상단을 압착하며 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200)에 체결된다. 체결 케이스(1400)와 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200)와의 체결은 수용부 체결돌기(1200S-1)가 케이스 체결홈(1400S-1)에 끼워짐으로써 이루어진다. 체결 케이스(1400)가 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200)에 체결됨으로써 덮개 지지부(1316)의 하측단이 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100) 상면에 밀착되고, 이에 따라 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310)와 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100) 상면 사이에 시료 용액 저장 공간(S)이 형성된다. 케이스 체결 단계(S240)가 수행됨에 따라 보조 덮개부 관통공(1314-1)의 하측단은 시료 용액 저장 공간(S)에 연통되고, 케이스 관통공(1424)은 보조 덮개부 관통공(1314-1) 및 임시 저장부(1312)와 각각 연통된다.
도19 및 도21을 참조하면 케이스 덮개 부착 단계(S250)에서는 케이스 덮개(1500)가 체결 케이스(1400)에 부착된다. 케이스 덮개(1500)의 부착을 위하여 체결 케이스(1400)에는 접착제가 미리 부착될 수 있는데, 접착제는 고분자성 접착제 또는 양면 테이프 등일 수 있다. 케이스 덮개(1500)에는 상하면을 관통하는 케이스 덮개 관통공(1524)이 형성된다. 케이스 덮개 부착 단계(S250)는 케이스 덮개 관통공(1524)이 보조 덮개부 관통공(1314-1)은 외부에 노출시키고 임시 저장부(1312)의 일부는 밀폐하도록 수행된다. 도19의 1500S는 케이스 덮개(1500)가 상호 연결되어 다수개 형성된 케이스 덮개 셋(set)을 나타낸다.
한편, 케이스 덮개 부착 단계(S250) 수행 후에는 케이스 덮개 관통공(1524)을 통하여 임시 저장부(1312)에 핵산을 포함하는 시료 용액이 임시 저장된다.
2. 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S300)
시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S300)는 실시예1에서와 마찬가지로 진공 및 원심력 인가 단계와, 진공 해제 및 원심력 인가 단계를 포함한다.
진공 및 원심력 인가 단계에서는 먼저, 상호 밀착된 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100) 및 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310)를 진공인가가 가능한 원심분리기 내부에 안치시킨다. 이 경우 도21을 참조하면 케이스 덮개 관통공(1524)이 상부를 향하고, 케이스 덮개(1500)가 상기 원심분리기의 회전 중심 방향을 향하고, 임시 저장부(312)의 바닥면이 상기 원심분리기의 회전 중심의 반대 방향을 향하도록 한다. 기타의 사항은 실시예1에서 설명한 바에 준한다.
한편, 다른 일실시예의 경우 체결 케이스(1400)에는 케이스 관통공(1424)을 덮는 케이스 덮개(1500)가 부착된다. 케이스 덮개(1500)는 기체는 통과시키고, 상기 시료 용액은 통과시키지 않는 멤브레인 필터로 형성된다. 이 경우 케이스 덮개(1500)에는 케이스 관통공(1424)이 형성되지 않는다. 또한 케이스 덮개(1500)인 멤브레인 필터의 부착을 위하여 체결 케이스(1400)에는 접착제가 미리 부착될 수 있는데, 접착제는 고분자성 접착제 또는 양면 테이프 등일 수 있다.
한편, 다른 일실시예의 경우 체결 케이스(1400)에는 케이스 덮개(1500)가 부착되지 않을 수 있다.
기타의 사항은 실시예1에서 설명한 바에 준한다.
실시예6
실시예6은 본 발명에 따른 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트의 제조 방법에 관한 것이다.
실시예6은 실시예5에서 설명한 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S100), 시료 용액 저장 공간 형성 단계(S200) 및 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S300)를 포함한다.
이들에 대한 설명은 실시예5에서 설명한 바에 준한다.
실시예7
실시예7은 본 발명에 따른 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 장치 셋(set)에 관한 것이다.
도19 및 도21을 참조하면 실시예7은 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200) 를 포함한다. 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200)는 평평한 판상으로 형성될 수 있다. 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200)는 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)를 안치시키기 위한 것이다. 도면부호 1200S는 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200)가 다수개 일체로 형성된 마이크로 챔버 플레이트 수용부 셋(set)을 나타낸다. 한편, 마이크로 챔버 플레이트 수용부 셋(1200S)의 측면에는 수용부 체결돌기(1200S-1)가 돌출 형성된다.
도19 및 도21을 참조하면 실시예7은 임시 저장부(1312)와 보조 덮개부(1314)가 일체로 형성된 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310)를 포함한다. 도19의 도면 부호 1310S는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310)가 상호 연결되어 다수개 형성된 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개 셋(set)을 나타낸다.
도19 및 도21을 참조하면 임시 저장부(1312)는 핵산을 포함하는 시료 용액이 임시 저장되는 용기로서, 그 하측면에 용기 연통부가 형성된다. 용기 연통부는 외력에 의하여 벌어지는 절개선(1312-1)일 수 있다. 절개선(1312-1)에 대한 설명은 실시예1에서 설명한 바에 준한다.
도19 및 도21을 참조하면 보조 덮개부(314)는 임시 저장부(312)의 둘레면에 연접하여 수평방향으로 형성되는데, 돌기 형상이거나 실시예1에서와 같이 판 형상일 수 있다. 보조 덮개부(314)에는 상하면을 관통하는 보조 덮개부 관통공(1314-1)이 형성된다.
도19 및 도21을 참조하면 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310)의 하측가장자리에는 링 형상의 덮개 지지부(1316)가 돌출 형성된다. 덮개 지지부(1316)는 보조 덮개부 관통공(1314-1)의 하측단이 덮개 지지부(1316)의 내측에 위치하도록 형성된다.
도19 및 도21을 참조하면 실시예7은 체결 케이스(1400)를 포함한다. 체결 케이스(1400)에는 상하면을 관통하는 케이스 관통공(1424)이 형성된다. 케이스 관통공(1424)은 체결 케이스(1400)가 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310) 상단에 안착된 경우 보조 덮개부 관통공(1314-1) 및 임시 저장부(1312)와 각각 연통되도록 형성된다. 도19의 1400S는 체결 케이스(1400)가 상호 연결되어 다수개 형성된 체결 케이스 셋(set)을 나타낸다. 한편, 체결 케이스 셋(1400S)의 측면에는 수용부 체결돌기(1200S-1)가 끼워지는 케이스 체결홈(1400S-1)이 형성된다.
도19 및 도21을 참조하면 체결 케이스(1400)는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310) 상단을 압착하며 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200)에 체결된다. 체결 케이스(1400)와 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200)와의 체결은 수용부 체결돌기(1200S-1)가 케이스 체결홈(1400S-1)에 끼워짐으로써 이루어진다. 체결 케이스(1400)가 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200)에 체결됨으로써 덮개 지지부(1316)의 하측단이 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100) 상면에 밀착되고, 이에 따라 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310)와 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100) 상면 사이에 시료 용액 저장 공간(S)이 형성된다. 체결 케이스(1400)가 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200)와 체결됨에 따라 보조 덮개부 관통공(1314-1)의 하측단은 시료 용액 저장 공간(S)에 연통되고, 케이스 관통공(1424)은 보조 덮개부 관통공(1314-1) 및 임시 저장부(1312)와 각각 연통된다.
도19 및 도21을 참조하면 체결 케이스(1400)에는 케이스 덮개(1500)가 부착된다. 케이스 덮개(1500)에는 상하면을 관통하는 케이스 덮개 관통공(1524)이 형성된다. 케이스 덮개 관통공(1524)은 케이스 덮개(1500)가 체결 케이스(1400)에 부착된 경우 보조 덮개부 관통공(1314-1)은 외부에 노출시키고 임시 저장부(1312)의 일부는 밀폐하도록 형성된다. 도19의 1500S는 케이스 덮개(1500)가 상호 연결되어 다수개 형성된 케이스 덮개 셋(set)을 나타낸다.
기타 설명하지 않은 사항은 실시예5에서 설명한 바에 준한다.

Claims (21)

  1. 상측 개방구가 형성된 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)에 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)를 안치시키는 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트 안치 단계(S20);
    임시 저장부(312)와 상기 임시 저장부(312)에 연접하여 형성되어 보조 덮개부 관통공(314-1)이 형성된 보조 덮개부(314)를 포함하는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(310)가 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)의 상측 개방구를 덮도록 배치하는 덮개부 배치 단계(S30);
    상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(310)가 배치된 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)를 진공인가가 가능한 원심분리기에 넣고 원심력을 가하여 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)에 연통되도록 상기 임시 저장부(312)에 형성된 용기 연통부를 통하여 상기 임시 저장부(312)에 임시 저장된 시료 용액을 상기 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)에 주입시켜 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트(100A)를 제조하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S40);
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S40)는,
    상기 원심분리기에 진공을 인가하고, 상기 원심분리기 내의 진공 인가 상태에서 제1 원심력을 발생시키는 진공 및 원심력 인가 단계(S41);
    상기 원심분리기에 의하여 상기 제1 원심력보다 큰 제2 원심력을 발생시킨 상태에서 상기 원심분리기 내의 진공을 해제하여 상기 시료 용액을 상기 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)에 주입시키는 진공 해제 및 원심력 인가 단계(S42);
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1 원심력은 상기 원심분리기 내의 진공 인가 상태에서 상기 시료 용액의 범핑(bumping)을 억제시킬 수 있는 원심력인 것을 특징으로 하는 분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 용기 연통부는 외력에 의하여 벌어지도록 상기 임시 저장부(1312)에 형성된 절개선(312-1)이고,
    상기 제2 원심력은 상기 절개선(312-1)을 벌릴 수 있는 크기의 원심력인 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 의하여 제조된 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트를 이용한 분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법으로서,
    상기 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트(100A)를 상기 원심분리기로부터 꺼낸 뒤, 상기 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트(100A)의 분리막(130)을 밀봉한 분석용 마이크로 챔버 플레이트를 제조하는 분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S50);
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법.
  6. 임시 저장부(1312)와 상기 임시 저장부(1312)에 연접하여 형성되며 보조 덮개부 관통공(1314-1)이 형성된 보조 덮개부(1314)를 포함하는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310)의 하측단을 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100) 상면에 밀착시켜, 상기 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100) 상면과의 사이에 시료 용액 저장 공간을 형성하는 시료 용액 저장 공간 형성 단계(S200);
    상기 시료 용액 저장 공간이 형성되도록 상호 밀착된 상기 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100) 및 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310)를 진공인가가 가능한 원심분리기에 넣고 원심력을 가하여 상기 임시 저장부(1312)에 임시 저장된 시료 용액을 상기 시료 용액 저장 공간에 연통되도록 상기 임시 저장부(1312)에 형성된 용기 연통부를 통하여 상기 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)에 주입시켜 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트(100A)를 제조하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S300);
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S300)는,
    상기 원심분리기에 진공을 인가하고, 상기 원심분리기 내의 진공 인가 상태에서 제1 원심력을 발생시키는 진공 및 원심력 인가 단계;
    상기 원심분리기에 의하여 상기 제1 원심력보다 큰 제2 원심력을 발생시킨 상태에서 상기 원심분리기 내의 진공을 해제하여 상기 시료 용액을 상기 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)에 주입시키는 진공 해제 및 원심력 인가 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 제1 원심력은 상기 원심분리기 내의 진공 인가 상태에서 상기 시료 용액의 범핑(bumping)을 억제시킬 수 있는 원심력인 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 용기 연통부는 외력에 의하여 벌어지도록 상기 임시 저장부(1312)에 형성된 절개선(1312-1)이고,
    상기 제2 원심력은 상기 절개선(1312-1)을 벌릴 수 있는 크기의 원심력인 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 의하여 제조된 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트를 이용한 분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법으로서,
    상기 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트(100A)를 상기 원심분리기로부터 꺼낸 뒤, 상기 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트(100A)의 분리막(130)을 밀봉한 분석용 마이크로 챔버 플레이트를 제조하는 분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 단계(S50);
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석용 마이크로 챔버 플레이트 제조 방법.
  11. 하측면에 몸체 밀폐부(120)가 형성되고, 상측면에 밀봉된 분리막이 형성되며, 핵산 분석을 위한 특이 성분(140) 및 핵산을 포함하는 시료 용액이 내장된 단위 개수의 챔버 홀(112)이 형성된 분석용 마이크로 챔버 플레이트에 있어서,
    상기 몸체 밀폐부(120)는 빛을 반사하는 재질로 형성되고,
    상기 밀봉된 분리막은 다공성 재질의 분리막(130)이 고분자성 오일로 도포되어 상기 다공성 재질의 분리막(130) 표면의 광학 투명도가 증가되며 밀봉된 것을 특징으로 하는 분석용 마이크로 챔버 플레이트.
  12. 상측 개방구가 형성된 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200);
    개폐 가능하며 개방시 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)에 연통되는 용기 연통부가 형성된 임시 저장부(312)와 상기 임시 저장부(312)에 연접하여 형성되어 보조 덮개부 관통공(314-1)이 형성된 보조 덮개부(314)를 포함하며, 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)의 상측 개방구를 덮는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(310);
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 장치 셋.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 보조 덮개부 관통공(314-1)을 외부에 노출시키며 상기 임시 저장부(312)의 일부를 밀폐하는 임시 저장부 덮개(320)를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 장치 셋.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 임시 저장부(312)의 하측면은 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)에 인입되고,
    상기 임시 저장부(312)의 상단 및 상기 보조 덮개부(314)는 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부(200)의 상단에 배치되는 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 장치 셋.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 보조 덮개부 관통공(314-1)의 상단 및 상기 임시 저장부(312)의 상단을 덮는 임시 저장부 덮개(320)를 포함하되,
    상기 임시 저장부 덮개(320)는 기체는 통과시키고, 상기 시료 용액은 통과시키지 않는 멤브레인 필터인 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 장치 셋.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기 연통부는 외력에 의하여 벌어지는 절개선(312-1)인 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 장치 셋.
  17. 임시 저장부(1312)와 상기 임시 저장부(1312)에 연접하여 형성되어 보조 덮개부 관통공(1314-1)이 형성된 보조 덮개부(1314)를 포함하며, 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100) 상면과의 사이에 시료 용액 저장 공간(S)이 형성되도록 체결수단에 의하여 하측단이 상기 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100) 상면에 밀착되는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310);
    를 포함하되,
    상기 임시 저장부(1312)에는 개폐 가능하며 개방시 상기 시료 용액 저장 공간에 연통되는 용기 연통부가 형성되는 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 장치 셋.
  18. 제17항에 있어서, 상기 체결수단은,
    상기 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(100)가 안치되는 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200);
    상면에 상기 보조 덮개부 관통공(1314-1) 및 상기 임시 저장부(1312)를 외부와 연통시키는 케이스 관통공(1424)이 형성되고, 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(1310) 상단을 압착하며 상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부(1200)에 체결되는 체결 케이스(1400);
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 장치 셋.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    상기 용기 연통부는 외력에 의하여 벌어지는 절개선(1312-1)인 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 장치 셋.
  20. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    상기 체결 케이스(1400)에는 상기 보조 덮개부 관통공(1314-1)은 외부에 노출시키고 상기 임시 저장부(1312)의 일부를 밀폐하도록 상기 케이스 관통공(1424)을 덮는 케이스 덮개(1500)를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 장치 셋.
  21. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    상기 체결 케이스(1400)에는 상기 케이스 관통공(1424)을 덮는 케이스 덮개(1500)가 부착되되,
    상기 케이스 덮개(1500)는 기체는 통과시키고, 상기 시료 용액은 통과시키지 않는 멤브레인 필터인 것을 특징으로 하는 시료 내장 마이크로 챔버 플레이트 제조 장치 셋.
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