WO2011144785A1

WO2011144785A1 - Uso de poloxaminas como inductoras de la diferenciación osteogénica de células mesenquimales

Info

Publication number: WO2011144785A1
Application number: PCT/ES2011/070348
Authority: WO
Inventors: Carmen Alvarez Lorenzo; Ana Rey Rico; Teresa Silva Rivera; José COUCEIRO FOLLENTE; Angel Concheiro Nine
Original assignee: Universidade De Santiago De Compostela
Priority date: 2010-05-18
Filing date: 2011-05-13
Publication date: 2011-11-24
Also published as: US20130156724A1; EP2572719A4; EP2572719A1; ES2370205B2; ES2370205A1

Abstract

En la presente invención se describe por primera vez la actividad de las poloxaminas como inductoras en la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras. En particular, se demuestra que tienen capacidad osteogénica. Por tanto se describe la utilización de una o varias poloxaminas o una composición farmacéutica de las mismas para la preparación de un medicamento para tratar a pacientes que padecen defectos óseos en general. También se describe un método para inducir la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en osteoblastos mediante el contacto de dichas células con una disolución o dispersión acuosa esterilizada de una o varias poloxaminas.

Description

USO DE POLOXAMINAS COMO INDUCTORAS DE LA DIFERENCIACIÓN OSTEOGÉ CA DE CÉLULAS MESENQUIMALES

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se enmarca en el campo de la inducción de diferenciación de células mesenquimales y progenitoras en osteoblastos.

ANTECEDENTES

En situaciones patológicas graves (fracturas complejas, traumatismos, tratamiento de tumores óseos y reemplazamiento de articulaciones o defectos congénitos) el hueso dañado no se forma o regenera espontáneamente. Para restaurar su integridad estructural y funcional, se pueden aplicar autoinjertos o hueso "alogénico" procedente de bancos de tejidos, lo que no está exento de efectos adversos que pueden llegar a ser graves (Bauer y Muschler, Clin. Orthop. 10-27, 2000). Además, la terapia de reparación del hueso se puede suplementar con la estimulación bioquímica de su curación local mediante la administración de factores de crecimiento que promueven la formación de osteoblastos (Lieberman et al., J. Bone Joint Surg. Am. 84A, 1032-1044, 2002; Finkemeier. J. Bone Joint Surg. Am. 84, 454-464, 2002). La aplicación terapéutica de los factores de crecimiento plantea importantes dificultades derivadas de su corta semivida biológica, su deficiente estabilidad, su selectividad tisular y su toxicidad y actividad carcinogénica potenciales. Ello hace que la búsqueda de moléculas sintéticas con capacidad osteogénica, mejor perfil de seguridad/eficacia y más accesibles desde el punto de vista económico constituya un área de investigación muy activa (Chun-Ya E. Han y col. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 1442-1445, 2009). En este sentido, se ha demostrado ya la efectividad osteogénica de la simvastatina (Ayukawa y col, J. Oral Rehab. 37, 123-130, 2010).

En la patente WO 2007/7108689 se reinvindica un método ex vivo que comprende adicionar una poliamina sobre un medio de cultivo que contiene células madre en suspensión. Se concreta que las poliaminas son las moléculas de origen natural espermidina, espermina y sus precursores ornitina y putrescina. La estructura de la putrescina es H₂N-(CH₂)₄-NH₂, la ornitina es un aminoácido de fórmula H₂N-(CH₂)₃- CH(NH₂)-COOH, la espermidina es una triamina H₂N-(CH₂)₄-NH-(CH₂)₃-NH₂ y la espermina es una tetramina H₂N-(CH₂)₃-NH-(CH₂)₄- NH-(CH₂)₃-NH₂. Todas ellas son aminas o poliaminas de bajo peso molecular caracterizadas por presentar grupos amino terminales y una distancia entre grupos amino de 3 ó más átomos de carbono.

Ming Cai y col. (Pharmazie 63, 751-756, 2008) han descrito la actividad osteogénica de CBMIDA (catecol-3,6-bis(ácido metileniminodiacetico)).

Por otra parte, los copolímeros bloque con capacidad de gelificación in situ se han mostrado como excipientes farmacéuticos muy adecuados para la preparación de sistemas inyectables de factores de crecimiento que forman un depot en las inmediaciones de la zona de administración. Los polímeros bloque de poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno), PEO-PPO-PEO, de la familia de los Pluronics han sido ampliamente ensayados como transportadores de factores de crecimiento, que son capaces de retenerlos y de proporcionar una cesión sostenida en el entorno del defecto óseo que se quiere corregir (Clokie y col. Plast. Reconstr. Surg. 105, 628-637, 2000). Los Pluronics por sí solos, en ausencia de factor de diferenciación, carecen de actividad osteogénica aunque sí se ha descrito su capacidad para inducir la formación de adipocitos a partir de células madre mesenquimales (Vashi y col. Biomaterials 29, 573-579, 2008).

Otra familia de copolímeros bloque de PEO y PPO es la de las poloxaminas o Tetronics, que presentan una estructura en estrella con cuatro brazos de PEO-PPO que terminan en grupos hidroxilo, unidos a través de un grupo etilendiamino central. Se encuentran disponibles comercialmente en una amplia variedad de pesos moleculares y relaciones molares EO/PO (Chiappetta y Sosnik. Eur. J. Pharm. Biopharm. 66, 303- 317, 2007). Las poloxaminas se utilizan como agentes solubilizantes y estabilizantes de fármacos, para crear superficies stealth en nanopartículas, como componentes de hidrogeles para cesión controlada de fármacos y como componentes de líquidos de limpieza y conservación de lentes de contacto (Alvarez-Lorenzo y col. Frontiers in Bioscience E2, 424-440, 2010).

También se ha propuesto el uso de poloxaminas como componentes de sistemas de liberación de factores de crecimiento para el tratamiento de defectos óseos. Por ejemplo, Tae y col. (Composite comprising polysaccharide-functionalized nanoparticle and hydrogel matrix, a drug delivery system and a bone defect replacement matrix for sustained reléase comprising the same, and the preparation method thereof. U.S. Pat. Appl. Publ. (2007), Cont.-in-part of U.S. Ser. No. 391,480. CODEN: USXXCO US 2007248675 Al) describe la preparación y el uso de nanopartículas recubiertas con polímeros emulsificantes biocompatibles, entre los que se citan las poloxaminas, para controlar la cesión de factores de crecimiento. Por otra parte, en la solicitud de patente WO 94/25080 describe un método que comprende mezclar un hidrogel con células e implantarlas en un animal. Entre los copolímeros que se citan como componentes de los hidrogeles se encuentran las poloxaminas. En estos sistemas, las poloxaminas sólo actúan como excipientes inertes. Nunca se ha descrito ni considerado la posibilidad de que las propias poloxaminas actúen como sustancias activas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En la presente invención se describe por primera vez la actividad de las poloxaminas como inductoras por sí mismas en la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras. En particular, se demuestra que tienen capacidad osteogénica.

Por tanto se proporcionan métodos para tratar a pacientes que padecen defectos óseos en general, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de poloxaminas. Las poloxaminas son el ingrediente activo en estas composiciones, y por lo tanto, no se requiere de la incorporación de otras sustancias activas.

De este modo, un aspecto de la invención se dirige al uso de una o varias poloxaminas para la preparación de un medicamento; en un aspecto particular se dirige al uso de una o varias poloxaminas para la preparación de un medicamento para inducir diferenciación de células mesenquimales o progenitoras; en un aspecto más particular, para inducir la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en osteoblastos.

En otro aspecto particular, la invención se dirige al uso de una o varias poloxaminas para la preparación de un medicamento para el tratamiento de defectos óseos creados en fracturas conminutas.

En otro aspecto particular se dirige al uso de una o varias poloxaminas para la preparación de un medicamento para el tratamiento de fracturas asociadas a osteopenia. De entre dichas fracturas son típicas las de la zona distal del radio.

En un aspecto particular se dirige al uso de una o varias poloxaminas para la preparación de un medicamento para el tratamiento de pseudoartrosis.

En un aspecto particular se dirige al uso de una o varias poloxaminas para la preparación de un medicamento para el tratamiento de pérdidas de la reserva ósea. Dicha pérdida de la reserva ósea puede ser consecuencia de diversos problemas como por ejemplo la respuesta a ciertos materiales traducida en osteolisis y/o protección de esfuerzos, como ocurre en las prótesis articulares, en quistes oseoesenciales, gangliones intraóseos y fusiones espinales.

En otro aspecto, la invención se dirige a una o varias poloxaminas para su uso en medicina. En otro aspecto la invención se dirige a una o varias poloxaminas para su uso en la inducción de la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras; en un aspecto más particular, para la inducción de la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en osteoblastos. En otro aspecto particular, la invención se dirige a una o varias poloxaminas para su uso en el tratamiento de defectos óseos creados en fracturas conminutas.

En un aspecto particular se dirige a una o varias poloxaminas para su uso en el tratamiento de fracturas asociadas a osteopenia. De entre dichas fracturas son típicas las de la zona distal del radio.

En un aspecto particular se dirige a una o varias poloxaminas para su uso en el tratamiento de pseudoartrosis.

En un aspecto particular se dirige a una o varias poloxaminas para su uso en el tratamiento de pérdidas de la reserva ósea. Dicha pérdida de la reserva ósea puede ser consecuencia de diversos problemas como por ejemplo la respuesta a ciertos materiales traducida en osteolisis y/o protección de esfuerzos, como ocurre en las prótesis articulares, en quistes oseoesenciales, gangliones intraóseos y fusiones espinales.

En otro aspecto particular, la invención se dirige a un método para la inducción de la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en osteoblastos que comprende administrar al paciente en necesidad de dicha inducción una cantidad efectiva de una o varias poloxaminas; en un aspecto más particular a un método para la inducción de la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en osteoblastos que comprende administrar al paciente en necesidad de dicha inducción una cantidad efectiva de una o varias poloxaminas.

En otro aspecto particular, la invención se dirige a un método para el tratamiento de defectos óseos creados en fracturas conminutas que comprende administrar al paciente en necesidad de dicho tratamiento una cantidad efectiva de una o varias poloxaminas. En un aspecto particular se dirige a un método para el tratamiento de fracturas asociadas a osteopenia que comprende administrar al paciente en necesidad de dicho tratamiento una cantidad efectiva de una o varias poloxaminas. De entre dichas fracturas son típicas las de la zona distal del radio.

En un aspecto particular se dirige a un método para el tratamiento de pseudoartrosis que comprende administrar al paciente en necesidad de dicho tratamiento una cantidad efectiva de una o varias poloxaminas.

En un aspecto particular se dirige a un método para el tratamiento de pérdidas de la reserva ósea que comprende administrar al paciente en necesidad de dicho tratmiento una cantidad efectiva de una o varias poloxaminas. Dicha pérdida de la reserva ósea puede ser consecuencia de diversos problemas como por ejemplo la respuesta a ciertos materiales traducida en osteolisis y/o protección de esfuerzos, como ocurre en las prótesis articulares, en quistes oseoesenciales, gangliones intraóseos y fusiones espinales.

Las poloxaminas tienen grandes ventajas frente a las sustancias para las que se ha descrito hasta el momento capacidad osteogénica:

Las poloxaminas, debido a que son polímeros sintéticos, tienen una estructura bien definida y conocida, y se incluyeron en numerosos ensayos para aplicaciones biomédicas, y su uso está autorizado en cosmética y productos de limpieza y conservación de lentes de contacto;

Las poloxaminas son citocompatibles hasta proporciones muy elevadas, lo que hace que su margen de seguridad pueda ser más alto que el de los factores de crecimiento;

No se ha descrito hasta el momento para las poloxaminas ninguna actividad farmacológica, por lo que no es previsible que de su uso se puedan derivar efectos secundarios relevantes;

Se comercializan a precios mucho más bajos que los factores de crecimiento, por lo que ofrecen una mejor relación coste/efectividad;

Son estables frente a la esterilización por procedimientos convencionales;

- En un intervalo de concentración adecuado para ejercer la actividad osteogénica, permiten preparar composiciones que se comportan como implantes inyectables, es decir, como sistemas de gelificación in situ que se pueden aplicar fácilmente por inyección y que permanecen en el lugar de aplicación durante tiempos prolongados.

Una ventaja adicional de la invención es que para la utilización de las poloxaminas como agentes osteoinductores no se requiere la modificación previa de su estructura, ni tampoco se requiere la incorporación de factores de crecimiento o sustancias osteogénicas adicionales.

Para la presente invención, se entiende por "poloxaminas" un copolímero de bloque de poli(óxido de etileno) (PEO) y poli(óxido de propileno) (PPO) que presentan una estructura en estrella con cuatro brazos de PEO-PPO que terminan en grupos hidroxilo; estos cuatro brazos están unidos a través de un grupo etilendiamino central, y se representan por las siguientes fórmulas generales I y II:

donde a tiene un valor entre 1 y 150 y b tiene un valor entre 1 y 150.

Las poloxaminas se encuentran disponibles comercialmente en una amplia variedad de pesos moleculares y relaciones molares EO/PO (catálogo de BASF, The Chemical Company, en la edición de Norte América, sección marcas en la clasificación de productos químicos). Son ejemplos de poloxaminas útiles para la invención, los Tetronic (marca registrada de BASF) 304, 701, 901, 904, 908, 1107, 1301, 1304, 1307, 90R4 y 150R1 caracterizados por las propiedades que se especifican en la tabla 1. Tabla 1.

Otro aspecto de la invención se dirige hacia una composición farmacéuticamente aceptable que consiste en una o varias poloxaminas y uno o más excipientes. En particular, para inducir la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras. En particular, para inducir la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en osteoblastos.

En una realización preferida dicha composición farmacéuticamente aceptable está en forma de disolución o dispersión acuosa.

Otro aspecto de la invención se dirige hacia una composición farmacéutica que consiste en una disolución o dispersión acuosa esterilizada, de una o varias poloxaminas para el tratamiento de defectos óseos creados en fracturas conminutas, fracturas asociadas a osteopenia, pseudoartrosis, y pérdida de la reserva ósea.

En un aspecto particular, la invención se dirige al uso de una o varias poloxaminas para la preparación de dichas composiciones farmacéuticas. En la presente invención, se entiende por "composición farmacéuticamente aceptable" una composición para constituir un medicamento; de forma preferida para su administración parenteral. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse en forma de implante mediante una inyección en la zona específica en la que el paciente sufre la patología, que gelifica a la temperatura corporal y produce sus efectos durante un tiempo continuado en la zona a tratar. Se entiende por composición farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, composición en un estado que permite su aprobación por agencias reguladoras como la FDA o la EMEA.

En la presente invención, se entiende por "excipiente farmacéuticamente aceptable" cualquier sustancia de la composición farmacéutica distinta del ingrediente activo. Dichos excipientes pueden ser líquidos estériles, como por ejemplo agua y aceites, incluyendo aquellos de origen del petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares, disgregantes, agentes humectantes, agentes solubilizantes, antioxidantes, conservantes antimicrobianos, agentes de tonicidad, agentes estabilizantes o de suspensión, o diluyentes. Se describen portadores, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticos adecuados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin.Otro aspecto de la invención se dirige a un gel viscoelástico obtenible mediante un procedimiento que comprende poner en contacto a) una disolución o dispersión acuosa esterilizada de una o varias poloxaminas, con b) células mesenquimales o progenitoras, siendo la concentración total de poloxaminas en la etapa a) superior a la concentración crítica de gelificación a la temperatura del medio en el que se encuentran las células mesenquimales o progenitoras.

Para la presente invención, se entiende por "concentración crítica de gelificación" aquella a la que la disolución de poloxamina experimenta una transición de sol a gel a la temperatura a la que se encuentran las células mesenquimales o progenitoras o a la temperatura corporal.

En una realización particular, cuando la concentración total de poloxaminas supere la concentración crítica de gelificación a la temperatura del medio en el que se encuentran las células mesenquimales o progenitoras, la composición debe conservarse entre 3 y 7°C hasta el momento de la aplicación. Cuando esta aplicación se lleva a cabo empleando una jeringa, el mantenimiento en frío asegura una buena jeringabilidad. Las células mesenquimales o progenitoras pueden encontrarse in vivo o in vitro.

En una realización particular, las células mesenquimales o progenitoras de la etapa b) se encuentran en un medio de cultivo in vitro. Es posible realizar este procedimiento mediante el empleo de una pipeta o jeringa.

De forma preferida, las disoluciones o dispersiones acuosas esterilizadas de una o varias poloxaminas de la invención, presentan una concentración total de poloxaminas comprendida entre el 2 y el 30%. De forma más preferida, la concentración total de poloxaminas está comprendida entre el 10 y el 20%.

En otro aspecto, la invención se dirige a un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica, como se describió anteriormente, que consiste en una disolución o dispersión acuosa esterilizada de una o varias poloxaminas, que comprende a) mezclar una o varias poloxaminas en un medio acuso a pH entre 6.5 y 7.5 y a una temperatura entre 0 y 37°C, y b) esterilización de la mezcla.

En un aspecto particular, el procedimiento comprende una etapa adicional después de la etapa a) y antes de la etapa b), que consiste en añadir un agente isotonizante.

Se entiende por agente isotonizante, cualquier sustancia que incremente la presión osmótica de una disolución acuosa como por ejemplo el cloruro sódico, la glicerina, la glucosa, el manitol o el sorbitol.

La etapa b) de esterilización puede llevarse a cabo mediante procesos conocidos por el experto en la materia, entre ellos, están en la práctica común los que se citan en el siguiente grupo: filtración en condiciones estériles, calor húmedo en el envase definitivo, o radiaciones ionizantes y no ionizantes.

En otro aspecto la invención también se dirige a un método para inducir la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en osteoblastos que comprende poner en contacto a) una disolución o dispersión acuosa esterilizada de una o varias poloxaminas, con b) células mesenquimales o progenitoras.

En un aspecto particular, las células mesenquimales o progenitoras se encuentran en un medio de cultivo y el método se realiza in vitro.

En un aspecto particular, se exceptúan de las células mesenquimales o progenitoras, las células madre procedentes de embriones humanos.

En otro aspecto particular, la disolución o dispersión de la etapa a) se administra a animales o a humanos in vivo, en particular, mediante inyección en la zona donde debe inducir la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en osteoblastos. De este modo, cuando la concentración total de poloxaminas supere la concentración crítica de gelificación a la temperatura corporal, se formará in situ un depot de consistencia semisólida o gel viscoelástico. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Viabilidad celular al cabo de 24 horas de estar en contacto con las disoluciones de poloxaminas (n=3) de distintas concentraciones. 0.01%p/p: columna blanca; 0.1%p/p: gris claro; l%p/p: gris oscuro; 5%: negro.

Figura 2. Módulos elástico (G', símbolos cerrados) y viscoso (G", símbolos abiertos) de disoluciones de Tetronic al 20% en Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM) antes y después de ser autoclavadas.

Figura 3. Actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) de las células cultivadas en presencia de distintas poloxaminas. También se muestran los datos correspondientes a los controles positivo y negativo.

Figura 4. Aumento en la expresión génica de los marcadores osteogénicos inducida por las poloxaminas T908, TI 107 y T1308 y el poloxámero Pluronic F127, tanto en ausencia como en presencia de rhBMP-2. Se observó la expresión génica de los marcadores osteogénicos utilizando RT-PCR a varios días. La expresión de GAPDH se utilizó para normalizar los niveles de expresión génica.

TRADUCCIÓN DEL TEXTO LIBRE QUE APARECE EN LA LISTA DE SECUENCIAS

Los siguientes términos aparecen en inglés en la lista de secuencias. A continuación se presenta su traducción al español:

- Use of poloxamines to induce osteogenic differentiation of mesenchymal cells: uso de poloxaminas como inductoras de la diferenciación osteogénica de células mesenquimales

Sequence listing: lista de secuencias

Primer: cebador

- Artificial sequence: secuencia artificial

Collagen type I: colágeno tipo I EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN

Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invención y no deben interpretarse como limitativos de la misma. Se incluyen ejemplos para ilustrar la citocompatibilidad, capacidad gelificante y capacidad osteoinductora de las poloxaminas en disolución.

Modo de realización de la invención

La poloxamina o combinaciones de varias poloxaminas se disuelven bajo agitación en agua o medio tampón de pH adecuado (entre 6.5 y 7.5), preferentemente pH 7.4. La concentración total en poloxamina puede estar comprendida entre el 2 y el 30%, preferiblemente entre el 10 y el 20%. La temperatura del medio de disolución puede estar comprendida entre 0 y 37°C, preferiblemente entre 4 y 20°C, para evitar la formación de un gel durante la preparación de la disolución. La presión osmótica de la disolución se puede ajustar con NaCl.

La disolución de poloxamina se esteriliza por calor húmedo a 121°C durante 20 minutos.

Ejemplo 1. Citocompatibilidad de las poloxaminas

Se prepararon disoluciones de Tetronic 304, 901, 904, 908, 1170, 1301, 1307, y 150R1 al 10%, disolviendo la cantidad necesaria de cada poloxamina en el volumen adecuado de tampón fosfato pH 7.4. Las disoluciones se filtraron a través de membranas de 0.2 μιη. Se cultivaron células CHO-K1 y Balb/3T3 en medio D-MEM sin rojo fenol, conteniendo suero fetal bovino (10%> p/v) y gentamicina (130 μg/100 mi). Se sembraron 5000 células por pocilio (50 μΐ) en placas de 96 pocilios y se adicionaron 50 μΐ de disolución de poloxamina convenientemente diluida para que la concentración en el pocilio fuese de 0.01, 0.1, 1 ó 5% p/v. Las placas se incubaron 24 h a 37°C en atmósfera 5%>C0₂ humidificada. Las células supervivientes se evaluaron usando un kit de citotoxicidad LDH y la absorbancia se midió a 490 nm. En la Figura 1 se muestran los resultados obtenidos.

Los copolímeros Tetronic 908, 1107, 1301 y 1307 mostraron alta citocompatibilidad. En líneas generales, dichos copolímeros presentaron elevado peso molecular y carácter hidrofílico. Ejemplo 2. Viabilidad de los osteoblastos

Se prepararon disoluciones concentradas de Tetronic 908, 1107, 1301 y 1307 al 20% p/p en medio DMEM sin rojo fenol a 4°C y se filtraron a través de membranas de 0.2 μιη. Se cultivaron células SAOS-2 en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino (10% w/v) y gentamicina (130 μg/100 mi). Se sembraron 200.000 células por pocilio (1.5 mi) en placas de 24 pocilios y se adicionaron 0.5 mi de disolución de poloxamina. Las placas se incubaron 24 h a 37°C en atmósfera 5%C0₂ humidificada. Las células se tripsinizaron y se incubaron a 37°C durante 5 minutos. A continuación, las células se centrifugaron (1400 rpm, 4 min) y se resuspendieron en medio DMEM fresco, se diluyeron alícuotas de 100 μΐ de suspensión de células con 200 μΐ de tampón fosfato de pH 7.4. Se transfirieron a un citospin para fijar las células en un portaobjetos. A continuación, se efectuó una tinción con calceina/yoduro de propidio. Las tinciones revelaron que la viabilidad fue superior al 90%> después de 24 horas de contacto con las disoluciones de poloxamina al 20%.

Ejemplo 3. Capacidad de las poloxaminas para formar geles a temperatura corporal

Se prepararon disoluciones concentradas de Tetronic 908, 1107, 1301 y 1307 al 20%> p/p en tampón fosfato pH 7.4 y DMEM. Se registró la evolución de los módulos elástico (G') y viscoso (G") en función de la temperatura entre 15 y 45°C, a una velocidad de calefacción de 2°C/min, aplicando una velocidad de oscilación de 5 rad/s. Los ensayos se llevaron a cabo con alícuotas de disolución sin autoclavar y con otras esterilizadas en autoclave a 121°C durante 20 min.

A 20°C las disoluciones presentaron una viscosidad muy baja, que corresponde a un sistema fácilmente jeringable. La temperatura de gelificación del Tetronic 908 se situó en 33°C y para los Tetronic 1107, 1301 y 1307 en 25°C (Figura 2). A 37°C todos los sistemas se comportaron como geles con módulo elástico comprendido entre 10³ y 10⁴ Pa y el autoclavado no modificó el comportamiento reo lógico de las disoluciones. Ejemplo 4. Capacidad de osteoinducción

Se cultivaron células madre mesenquimales en medio MesenPRO RS™ adecuadamente suplementado y se sembraron (3- 10⁴ células/pocilio, 1.5 mi) en placas de 6 pocilios. Se añadieron 200 μΐ de disolución de poloxamina al 20%> en tampón fosfato de H 7.4 en el compartimento superior de cada Transwell^®. En total se incorporaron a cada pocilio 40 mg de poloxamina. Como controles negativo y positivo se utilizaron células en medio basal y células en medio de diferenciación osteogénica (10 mM β-glicerofosfato, 100 μΜ dexametasona y 50 μΐ/ml ácido ascórbico), respectivamente. Las placas se incubaron a 37°C en atmósfera de 5% C0₂ humidificada. El medio se reemplazó con medio fresco dos veces a la semana. Para llevar a cabo el ensayo de fosfatasa alcalina (ALP), las células se Usaron al cabo de 3, 7, 14 y 23 días por adición de 150 μΐ de tampón Tris HC1 10 mM de pH 7.5 con 0.1% Tritón X-100. Las muestras se sometieron a tres ciclos de congelación (- 80°C)/descongelación (45 min por ciclo). Los lisados se lavaron por centrifugación a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4°C. Cada muestra (50 μΐ) se incubó con 150 μΐ de sustrato de ALP en placas de 96 pocilios a 37°C durante 30 min. La absorbancia de las muestras se leyó a 405 nm usando un lector de ELISA. Se usó una curva de calibración de p-nitrofenilfosfato para determinar la concentración de ALP. Las medidas de actividad ALP se normalizaron por el contenido en proteína, que se midió por el ensayo de proteína BCA, y los resultados se expresaron como micromoles de ALP por minuto y por mg de proteína.

También se llevaron a cabo dos análisis histoquímicas, visualizando la actividad ALP de la manera siguiente: las células se fijaron con una disolución de paraformaldehído al 4% durante 5 min, se lavaron con tampón fosfato, se incubaron en la oscuridad con naftol ASMX-fosfato al 0.1% y violeta rápido al 0.1% AMPD 56 mM y se observaron al microscopio óptico. Para detectar la mineralización de las células se efectuó una tinción con rojo de alizarina. Las células se fijaron con etanol 70% durante 1 hora y se lavaron con agua dos veces. A continuación, se tiñeron con rojo de alizarina al 2% durante 30 min, se lavaron con agua tres veces y se observaron las células al microscopio.

En la Figura 3 se muestran los perfiles de actividad ALP obtenidos con las poloxaminas Tetronic 908, 1107 y 1307 y con controles negativo y positivo de osteogeneidad. Los controles negativos indican que la actividad ALP se incrementa ligeramente a los 7 días retornando después a los valores básales. La actividad ALP de las células mesenquimales cultivadas en medio osteogénico estándar (control positivo) mostraron un máximo en el día 7, que fue mucho más intenso que el que se observó con el control negativo. Los geles de poloxamina indujeron un crecimiento progresivo de la actividad ALP durante dos o tres semanas.

Los geles de poloxamina dieron lugar a la proliferación de las células mesenquimales durante la primera semana y, a continuación, a la diferenciación a osteoblastos en la segunda y la tercera semana. La tinción de alizarina mostró nodulos de mineralización en los cultivos con las poloxaminas Tetronic 908, 1107 y 1307, al cabo de 23 días.

Ejemplo 5. Análisis de reacción en cadena de la polimerasa-transcripción reversa (RT-PCR)

Se cultivaron células mesenquimales en medio MesenPRO RS™ (Gibco, Invitrogen, España) suplementado con glutamina al 1% y agentes antimicrobianos al 1% (penicilina, streptomicina y anfotericina B) y se sembraron (3-10⁴ células/pocilio, 2,5 mi) en placas de 6 pocilios. Se añadieron 200 μΐ de dispersión de poloxamina al 20%, conteniendo o no rhBMP-2 (0,037 mg/ml) en el compartimento superior de los soportes permeables de la placa de 6 pocilios Transwell^®. Por tanto, se incorporaron a cada pocilio 40 mg y 7,4 μg de copolímero (poloxamina o poloxámero) y rhBMP-2 respectivamente. Como controles negativo y positivo se utilizaron células en medio basal (sin adición de copolímero ni de rhBMP-2) y células en medio de diferenciación osteogénica (β-glicerofosfato 10 mM, dexametasona 100 nM y ácido ascórbico 50 μΜ en el medio de cultivo), respectivamente. Las placas se incubaron a 37°C en atmósfera de 5% C0₂ humidificada. El medio se reemplazó con medio fresco dos veces a la semana. Las células se observaron con microscopía invertida (lOx) para descartar una posible contaminación por bacterias). Cada experimento se realizó por triplicado y se repitió dos veces.

El ARN celular total se extrajo al cabo de 7, 10 y 14 días utilizando TRIzol^® (Invitrogen, España) según el protocolo del fabricante. La separación de fases se realizó utilizando cloroformo y los precipitados de ARN resultantes se lavaron con etanol/agua 70:30 v/v, se secaron con aire y se resuspendieron en agua tratada con DEPC. La absorbancia de los sistemas de ARN se midió a 260 nm utilizando un Biophotometer (Eppendorf, Alemania) y se calculó la concentración de ARN. Se realizó la transcripción reversa de ARN (5 μg) a ADNc utilizando la transcriptasa reversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV) y hexámeros aleatorios (Invitrogen, España). Las condiciones de transcripción reversa (TR) fueron 37 °C durante 50 min, 42 °C durante 15 min y 95 °C durante 5 min. Para evaluar la expresión de ARNm, se utilizó un método de RT-PCR semicuantitativo por evaluación de los productos de PCR durante la fase exponencial de la amplificación de ADNc. El ADNc generado se amplificó utilizando cebadores para CBFA-1, ALP y colágeno tipo I (Li et al, Artif. Organs 2009, 34, 46-54). Se utilizó gliceraldehido-3 -fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control para evaluar la eficiencia del PCR (Li et al., Artif. Organs 2009, 34, 46-54). Los productos del PCR se fraccionaron por tamaño sobre un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidinio. El tamaño de los conjuntos de cebadores y productos de PCR se listan en la Tabla 2.

Tabla 2. Tamaños de conjuntos de cebadores y de productos de PCR.

Células mesenquimales en medio de cultivo (control negativo) mostraron un nivel basal de expresión de CBFA-1.

Células tratadas con geles de T908, TI 107 y T1307 con y sin BMP-2 aumentaron la expresión de ARNm de CBFA-1 de manera dependiente del tiempo (Figura 4). En ausencia de BMP-2, la expresión inducida por TI 107 y T1307 fue evidente al cabo de 7 días, mientras que con T908 la inducción se observó claramente más tarde, al cabo de 10 días. Este descubrimiento concuerda con la elevada proliferación celular causada por T908. En presencia de BMP-2, la expresión de ARNm de CBFA-1 ocurrió más rápido (al cabo de 4 días con las formulaciones de TI 107 y TI 307 y al cabo de 7 días con la formulación de T908).

Es conocido que la acumulación inicial de matriz de colágeno es esencial para la expresión secuencial de las proteínas relacionadas con la diferenciación, como por ejemplo, fosfatasa alcalina, sialoproteína ósea y osteocalcina (Hutmacher, D.W., Sunugan, S.L.C., Bone repair and adult stem cells, en: Stem Cells, from Bench to Bedside, Editores Lee, E.H., World Scientific Publishing Co. Singapore, 2004, pág. 451). Los controles negativos mostraron una expresión moderada del marcador de colágeno tipo I, se registró un efecto inductivo significante para T908 con y sin BMP-2 (particularmente relevante al cabo de 10 días), y para TI 107 con BMP-2 y TI 307 tanto con como sin BMP-2 al cabo de 4 y 7 días. Contrariamente, células cultivadas con Pluronic F 127 no mostraron inducción de estos genes de los marcadores osteogénicos en ningún punto temporal del estudio.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de una o varias poloxaminas para la preparación de un medicamento.

2. Uso de una o varias poloxaminas para la preparación de un medicamento para inducir la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras.

3. Uso de una o varias poloxaminas, según la reivindicación 2, para la preparación de un medicamento inducir la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en osteoblastos.

4. Uso de una o varias poloxaminas para la preparación de un medicamento para el tratamiento de defectos óseos creados en fracturas conminutas.

5. Uso de una o varias poloxaminas para la preparación de un medicamento para el tratamiento de fracturas asociadas a osteopenia.

6. Uso de una o varias poloxaminas para la preparación de un medicamento para el tratamiento de pseudoartrosis.

7. Uso de una o varias poloxaminas para la preparación de un medicamento para el tratamiento de pérdidas de la reserva ósea.

8. Una o varias poloxaminas para su uso en medicina.

9. Una o varias poloxaminas para su uso en la inducción de la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras.

10. Una o varias poloxaminas, según la reivindicación 9, para su uso en la inducción de la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en osteoblastos.

11. Una o varias poloxaminas para su uso en el tratamiento de defectos óseos creados en fracturas conminutas.

12. Una o varias poloxaminas para su uso en el tratamiento de fracturas asociadas a osteopenia.

13. Una o varias poloxaminas para su uso en el tratamiento de pseudoartrosis.

14. Una o varias poloxaminas para su uso en el tratamiento de pérdidas de la reserva ósea.

15. Método para la inducción de la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras que comprende administrar al paciente en necesidad de dicha inducción una cantidad efectiva de una o varias poloxaminas.

16. Método según la reivindicación 15 para la inducción de la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en osteoblastos que comprende administrar al paciente en necesidad de dicha inducción una cantidad efectiva de una o varias poloxaminas.

17. Método para el tratamiento de defectos óseos creados en fracturas conminutas que comprende administrar al paciente en necesidad de dicho tratamiento una cantidad efectiva de una o varias poloxaminas.

18. Método para el tratamiento de fracturas asociadas a osteopenia que comprende administrar al paciente en necesidad de dicho tratamiento una cantidad efectiva de una o varias poloxaminas.

19. Método para el tratamiento de pseudoartrosis que comprende administrar al paciente en necesidad de dicho tratamiento una cantidad efectiva de una o varias poloxaminas.

20. Método para el tratamiento de pérdidas de la reserva ósea que comprende administrar al paciente en necesidad de dicho tratamiento una cantidad efectiva de una o varias poloxaminas.

21. Composición farmacéuticamente aceptable que consiste en una o varias poloxaminas y uno o más excipientes. .

22. Composición según la reivindicación 21 en forma de disolución o dispersión acuosa.

23. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 21 o 22, donde la concentración total de poloxaminas está comprendida entre el 2 y el 30%.

24. Composición farmacéutica según la reivindicación 23, donde la concentración total de poloxaminas está comprendida entre el 10 y el 20%.

25. Procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica, como se ha definido en las reivindicaciones 21 a 24, que comprende a) mezclar una o varias poloxaminas en un medio acuoso a pH entre 6.5 y 7.5 y a una temperatura entre 0 y 37 °C, y b) esterilización de la mezcla.

26. Procedimiento según la reivindicación 25, que comprende una etapa adicional después de la etapa a) y antes de la etapa b), que consiste en añadir un agente isotonizante.

27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 25 o 26, donde el pH es 7.4.

28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 25, 26 o 27, donde la esterilización se lleva a cabo mediante un proceso seleccionado del siguiente grupo: filtración en condiciones estériles, aplicación de calor húmedo en el envase definitivo, y radiaciones ionizantes o no ionizantes.

29. Método in vitro para inducir la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras, excepto células madre embrionarias humanas, en osteoblastos que comprende poner en contacto a) una disolución o dispersión acuosa esterilizada de una o varias poloxaminas, con b) células mesenquimales o progenitoras, excepto células madre embrionarias humanas, que se encuentran en un medio de cultivo.