WO2011140682A1

WO2011140682A1 - （2e）-3-苯基-n-[2，2，2-三氯-1-[[（8-喹啉基氨基）硫代甲基]氨基]乙基]-2-丙烯酰胺及其医药用途

Info

Publication number: WO2011140682A1
Application number: PCT/CN2010/000688
Authority: WO
Inventors: 何昆仑; 李松; 王莉莉; 李鑫; 钟武; 胡国梁; 王捷; 李蕊君; 李春蕾; 肖军海; 龙隆; 李薇
Original assignee: 中国人民解放军总医院
Priority date: 2010-05-14
Filing date: 2010-05-14
Publication date: 2011-11-17
Also published as: EP2589593A4; WO2011140682A8; US8859587B2; EP2589593B1; EP2589593A1; US20130143917A1

Description

( 2E) -3-苯基 -N- [2， 2, 2-三氯 -1 - [ [ (8-喹琳基氨基) 硫代甲基]氨基]乙基] -2-丙烯酰胺及其医药用途技术领域

本发明涉及医药化学领域，具体地，本发明涉及一种新型丙烯酰胺类化合物（ 2E) -3-苯基 -N- [2, 2, 2-三氯 -1- [ [ (8-喹啉基氨基）硫代甲基]氨基]乙基] -2-丙烯酰胺及其药物组合物，本发明还涉及所述化合物及其药物组合物用于抗细胞凋亡，预防或治疗与细胞凋亡有关的疾病或症状的用途，特别是用于保护心肌细胞和预防或治疗与心肌细胞凋亡有关的疾病或症状中的用途。背景技术

细胞凋亡一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡。细胞凋亡普遍存在于生物界，既发生于生理状态下，也发生于病理状态下。对胚胎发育及形态发生、组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用，一直是生物医学研究的热点。

研究表明，有很多重大疾病的发生都与细胞过度凋亡有关，例如在艾滋病的发展过程中， CD4+ T细胞数目的减少；移植排斥反应中，细胞毒性 T细胞介导的细胞死亡；缺血及再灌注损伤，心肌细胞和神经细胞的凋亡；神经系统退化性疾病（如阿尔海默次病、帕金森氏症等）；暴露于电离辐射引起的多种组织细胞凋亡等。

有证据表明，心肌细胞凋亡与许多心脏疾病的发生、发展和预后有着密切的关系。通过研究心肌细胞凋亡发现梗死的心肌死亡不等于心肌坏死，凋亡是心肌梗死的机制之一，而且是梗死早期心肌死亡及缺血 /再灌注所致的心肌死亡的主要方式，此时心肌的大量凋亡，加重了心肌的破坏。 1989年， Nepomniashchikh等观察饥饿性心肌萎缩超微结构时发现，心肌细胞结构蛋白合成降低，细胞数减少，但不伴细胞核相应成比例地减少，由此初步提出饥饿性心肌萎缩是由细胞凋亡所致。 1994 年， Got t l ieb 和 Kawano等采用电镜结合 DNA凝胶电泳方法取得了心肌细胞凋亡的直接证据，前者揭示再灌注损伤诱发兔心肌细胞凋亡，后者证实心肌炎患者伴发心肌细^凋亡。 Tanaka 等培养的乳鼠心肌细胞中，也证明了凋亡的存在。由于方法学的进步和凋亡的研究深入，已在多种心脏病中发现心肌细胞凋亡的病理作用。研究表明，自发性高血压小鼠（SHR)心脏损害与凋亡有关；晚期由肥厚心脏转向心力衰竭为心肌细胞凋亡所致；急性心梗除坏死外，梗塞早期和再灌注损伤也诱发凋亡；心肌细胞凋亡同样见于移植的心脏和右室发育不良性心肌病，缺氧同样诱导心肌细胞凋亡。

凋亡在某种程度上具有可复性，心肌梗死和缺血 /再灌注中的细胞凋亡有其特点和规律，利用其特点可以预防和减少细胞凋亡，为临床预防缺血 /再灌注损伤提供启示；在再灌注过程中，产生收缩带区域（梗死灶周围）的细胞凋亡是由一些诱因诱导产生的，可以利用凋亡的抑制因素如药物等来预防凋亡，治疗凋亡引起的 ϋ>έ ^^。

但目前可供临床应用的用于抗细胞凋亡和保护细胞的药物种类和数量还很少，选择性和靶向性都不高，因此不断研究开发新的安全有效的抗细胞凋亡和保护细胞的药物，尤其是具有全新作用机制的药物具有十分重要的意义。发明内容本发明的目的是寻找并且开发抑制心肌细胞凋亡的小分子化合物，用来预防或治疗心肌细胞凋亡导致的各种病理改变。发明人经过长期、大量的实验研究，发现了一种丙烯酰胺类化合物，其具有抗细胞凋亡，保护心肌细胞的作用，能够用于预防或治疗与心肌细胞凋亡有关的疾病或症状。具体地，

本发明的第一方面涉及式 I 所示的化合物，或其异构体、可药用盐及溶剂化物。

I

式 I 化合物，其化学名称为（2£) -3-苯基 - [2，2，2-三氯 -1- [ [ (8-喹啉基氨基)硫代甲基]氨基]乙基] -2-丙烯酰胺。

本发明另一方面涉及药物组合物，其包含式 I所示化合物，或其异构体、可药用盐及溶剂化物，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

本发明还涉及式 I化合物或其异构体、可药用盐及溶剂化物，用于制备抗细胞凋亡，预防或治疗与细胞凋亡有关的疾病或症状的药物的用途。

本发明还涉及式 I化合物或其异构体、可药用盐及溶剂化物，用于制备保护心肌细胞和预防或治疗与心肌细胞凋亡有关的疾病或症状的药物的用途。

本发明还涉及一种预防和 /或治疗与心肌细胞凋亡有关的疾病或症状的方法，所述方法包括：给予治疗量的上述药物组合物。

本发明还涉及一种保护心肌细胞的方法，所述方法包括给予治疗量的上述药物组合物。

所述与心肌细胞凋亡有关的疾病或症状包括但不限于（ i )饥饿性心肌萎缩，（ Π )心肌炎，（ i i i )心力衰竭，（ iv )原发性高血压引起的心肌损伤，（V)急性心梗早期引起的心肌损伤，（vi ) 急性心梗再灌注引起的心肌损伤，（vi i)心脏移植引起的心肌细胞病变，（vi i i)发育不良性心肌病；或缺氧引起的心肌细胞凋亡，或心血管系统硬化。

本发明的化合物具有治疗慢性心衰的作用。

通过流式细胞检测和经典的 TUNEL凋亡检测方法发现使用式 I 化合物预处理可以显著改善衣霉素诱导的心肌细胞凋亡，且随着浓度增加这种抗凋亡保护作用有增加的趋势，证实式 I化合物对心肌细胞凋亡的保护作用。

本发明选择 caspase-12作为确认细胞凋亡通路的检测对象，发现在衣霉素诱导心肌细胞凋亡的过程中有 caspase-12的表达，而使用式 I化合物可以使 caspase- 12表达减少，这说明式 I化合物干预可以减轻细胞内质网应激和随后的 caspase- 12 的表达，从而减轻细胞凋亡。

另外，本发明证实式 I 化合物在其最大细胞保护浓度时 (TD50>100mM)时，并无细胞毒性作用，且其不保护与内质网应激无关的细胞凋亡刺激。

本发明还涉及预防和 /或治疗心肌细胞凋亡所导致的各种疾病的方法，其包括将预防和 /或治疗有效量的至少一种式 I化合物或其溶剂化物的组合物给予需要上述预防和 /或治疗的患者。

本领域技术人员应该认识到通式 I化合物存在手性中心。当需要通式 I化合物为单一的对映体时，可以使用在所有可能的步骤中均处于单一对映异构体形式的反应物来制备，或者在单一对映异构体形式的试剂或催化剂的存在下进行反应来制备，或者通过常规方法拆分立体异构体混合物来制备。一些优选的方法包括使用微生物进行拆分，拆分与手性酸如扁桃酸、樟脑磺酸、酒石酸、乳酸等任何可使用的酸形成的非对映异构体的盐，或者拆分与手性碱如番木鳖碱（brae ine)、金鸡纳树生物碱及其衍生物等形成的非对映异构体的盐。常用的方法见 Jaques 等人编辑的 "Enant iomers ， Racemates and Resolut ion" (Wi ley Interscience, 1981)。

本领域技术人员应该意识到，本发明化合物也可以以其可药用盐或溶剂化物的形式使用。通式 I化合物的生理学上可接受的盐包括由药学上可接受的无机酸或有机酸或者无机碱或有机碱形成的常规的盐以及季铵的酸加成盐。合适的酸盐的更具体的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、朴酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯曱酸、水杨酸、富马酸、曱苯磺酸、曱磺酸、萘 -2-磺酸、苯磺酸、羟基萘曱酸、氢碘酸、苹果酸、 s teroic、鞣酸等的盐。其它的酸，如草酸，虽然其本身并非药学上可接受的，但可以用于制备用作中间体的盐，以获得本发明化合物及其可药用盐。合适的碱盐的更具体的例子包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、 N，N，-二苄基乙二胺、氯代普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、 N-曱基葡糖胺和普鲁卡因盐。此后涉及到本发明的化合物时，包括通式 I化合物及其可药用盐和溶剂化物。

本发明还包括本发明化合物的前药，该前药一经给药，即通过代谢过程进行化学转化，之后变成具有活性的药物。通常，这类前药是本发明化合物的功能性衍生物，其在体内容易转^成所需的式（I)的化合物。例如，在" Des ign Of Prodrugs", H Bund Saard, El sevier编辑， 1985中描述了选择和制备适宜前药衍生物的常规方法。

本发明也包括本发明化合物的活性代谢物。

本发明的另一个方面涉及药物组合物，其含有本发明化合物的消旋体或旋光异构体和至少一种药学上可接受的载体，其可用于体内治疗并具有生物相容性。所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成备种形式。本发明所提及的化合物也可以被制备成各种药学可接受的盐。

本发明的药物组合物包括有效剂量的本发明通式 I化合物或其可药用盐或水合物和一种或多种适宜的可药用载体。这里的药用载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，緩冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧曱基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂。

本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。

当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶袭、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶袭制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。如果需要，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

当局部用药时，特别是治疗局部外敷容易达到的患面或器官，如眼睛、皮肤或下肠道神经性疾病时，可根据不同的患面或器官将本发明化合物制成不同的局部用药制剂形式，具体说明如下：当眼部局部施用时，本发明化合物可配制成一种微粉化悬浮液或溶液的制剂形式，所使用载体为等渗的一定 pH的无菌盐水，其中可加入也可不加防腐剂如氯化苄基烷醇盐。对于眼用，也可将化合物制成膏剂形式如凡士林膏。

当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软骨、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软骨制剂可使用的栽体包括但不限于：矿物油，液体凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧化乙烯，聚氧化丙烯，乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，吐温 60，十六烷酯蜡，十六碳烯芳醇， 2-辛基十二烷醇，苄醇和水。

本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

另外需要指出，本发明化合物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。发明的有益效果

本发明提供了一种丙烯酰胺类化合物，并证明其是一类强效抗心肌细胞凋亡剂，因此可以用于但不局限于（ i )饥饿性心肌萎缩，（ Π) 心肌炎，（ iii)心力衰竭，（ iv)治疗或緩解原发性高血压引起的心肌损伤，（V) 治疗或緩解急性心梗早期引起的心肌损伤，（vi) 治疗或緩解急性心梗再灌注引起的心肌损伤，， (vii) 治疗或緩解心脏移植引起的心肌细胞病变，（viii) 治疗或緩解发育不良性心肌病；或改善心血管系统硬化的用途，为治疗细胞凋亡引起的疾病或症状，特别是治疗心肌细胞凋亡引起的疾病或症状提供了新的方法和途径。附图说明

图 1 不同浓度式 I化合物对 eIF2o和 P-eIF2o表达的影响图 2 式 I化合物对 TM诱导心肌细胞 caspase-12和 cleaved caspase-12表达的影响具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例 1: 保护心肌细胞内质网应激凋亡的实脸研究

动物：新生 Wistar大鼠，鼠龄 24h内，雌雄不限

心肌细胞的分离和培养: 心肌细胞的分离和培养参照差速贴壁分离的方法（Kreider, A. Messing, H. Doan, S. U. Kim, R. P. Lisak and D. E. Pleasure, Enrichment of Schwann cell cultures from neonatal rat sciatic nerve by differential adhesion, Brain Res 2 (1981) , pp. 433 444. ) ，取 24h内新生的 Wistar乳鼠，获得原代心肌细胞。

MTT法检测不同浓度式 I化合物对心肌细胞存活率的影响将依据上述方法获得的分离的原代培养心肌细胞按照每孔 10⁴个细胞接种到 96孔板，每孔体积 lOOul (边缘孔用无菌 PBS 填充）。在 5%C02， 37 孵箱培养 4d后，分别加入不同浓度的式 I化合物（0.3μ Μ、 1 μΜ、 3μΜ、 10μΜ、 30μΜ、 ΙΟΟμΜ) ，每个浓度设置 3个复孔，同时设置调零孔（培养基、 MTT、 DMSO) ，对照孔（培养液、 DMS0 )。继续孵育处理 48 h后，每孔加入 20ulMTT 溶液（5mg/ml，用 PBS <ρΗ=7· 4>配即 0.5%MTT ) ，继续培养 4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入 150ulDMSO，置摇床上低速振荡 lOmin, 使结晶物充分^:解。在酶联免疫检测仪于波长 55Qnm处测定 ^^孔吸光度（ 0D )值，每孔重复 5次并记录结果。结果见表 1:

MTT法检测式 I化合物对心肌细胞存活率的影响

与对照组相比， ^&P > 0.05；

式 I化合物在 100 μΜ浓度内，和对照组相比心肌细胞存活率无统计学差异。说明式 I化合物对正常心肌细胞的存活率没有影响。

ΜΤΤ法检测不同浓度式 I化合物对衣霉素（Tunicamycin ， TM)诱导的心肌细胞凋亡的影响

将分离的心肌细胞按照每孔 104个细胞接种到 96孔板，每孔体积 lOOul (边缘孔用无菌 PBS填充）。在 5%C02， 37 孵箱培养 4d后，分别给予不同浓度的式 I化合物（5 μΜ、 10μΜ、 20μΜ) 处理后 30min后，加入 TM使其终浓度为 5 g/ml，同时设置终浓度为 5 μ g/ml的 TM组和同容积的 DMS0对照组。每个浓度设置 3 个复孔，同时设置调零孔（培养基、 MTT、 DMS0) ，对照孔（培养液、 DMS0)。继续培养，每孔加入 20ulMTT溶液（5mg/ml，用 PBS <pH=7.4>配即 0.5%MTT) ，继续培养 4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入 150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 0D于波长 49 Onm处测定各孔吸光度（0D)值，每孔重复 3 次并记录结果，按细胞存活率 = (对照组未处理细胞的 A490 - TM处理细胞的 A490 ) /对照组未处理细胞的 A490 x 100%计算每个时间点的细胞存活率，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

结果见表 2: MTT法检测式 I化合物对 TM诱导心肌细胞存活率的影响

与 DMS0组比较， #Ρ <0. 05; 与 ΤΜ组比较， *Ρ <0. 05 ;

结果表明， ΤΜ干预组明显使心肌细胞存活率显著下降

( <0. 05 )，经各浓度式 I化合物预处理的各组细胞存活率同 ΤΜ 组相比均显著增加（ρ<0. 05 ) ,表明式 I化合物能够抗衣霉素（ΤΜ ) 引起的心肌细胞凋亡，对 ΤΜ诱导的心肌细胞凋亡起到了保护作用。实施例 2: Wes tern Blot检测细胞凋亡信号蛋白表达将按照实施例 1原代心肌细胞培养方法差速贴壁获得的心肌细胞按照每孔 10⁶个细胞接种到 6孔板，每孔体积 2ml，在 37 、 5% C02孵箱培养 4d后，按实验设计各组分别加式 I化合物干预，继续置于 37 "C、 5% C02孵箱培养至设计时间点后，用 SDS加样緩冲液裂解细胞， l OO 水浴 l Omin, 离心（ 12000rpm χ l Omin )，收集上清。预先将硝酸纤维素膜浸泡在转移緩沖液中 15 ~ 20min。以 50 μ g蛋白 /泳道上样，经 10%聚丙烯酰胺凝胶 SDS-PAGE电泳分离后，再将凝胶平铺在电转移夹内，从负极到正极依次装有海绵、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸和海绵。恒流 350mA，电转 45min。电转膜至 PVDF膜，取出硝酸纤维素膜， TBST洗膜 2min 后， 5%脱脂奶粉室温封闭 lh，加一抗（1: 1000 ) 4 孵育过夜， TBST洗膜 3次 X 5min，再加 HRP标记的二抗，室温下孵育 1 h， TBST洗膜 3次 X 5min, 以 TSM1和 TSM2分别浸泡 5min和 lOmin, 以显色底物 6.6μ 1 ΝΒΤ和 3.3μ 1 BCIP溶于 lml TSM2显色，至条带清晰后水洗终止反应。显色终止后，扫描或拍照记录保存。

检测结果：

eIF2 ^ P-eIF2 ^^

不同浓度式 I化合物作用 24h Western 印迹法检测显示，经 5%C02, 37 孵箱培养 4d的心肌细胞，分别给予不同浓度的式 I 化合物（1μΜ、 2 μ Μ 5μΜ、 10μΜ、 20μΜ、 40μΜ) 处理 48 h 后，发现各孔 eIF2o蛋白表达水平无显著改变，而 P-eIF2ot蛋白表达水平随式 I化合物浓度增加而逐渐增高（见图 1) 。 caspase-12和 Cleaved caspase-12表达变化

经不同浓度的式 I化合物处理 24h后，各组 Caspase-12表达无明显改变。 Cleaved caspase- 12 在 DMS0 组无表达，在 TM(5 yg/ml)诱导组表达明显，在加用了不同浓度（ 10μΜ、 20μΜ、 40 μΜ) 的各式 I化合物组，随着式 I化合物浓度的增加 Cleaved caspase-12表达逐渐减少。表明 Cleaved caspase-12在 TM诱导的心肌细胞凋亡过程中活化， Cleaved caspase-12 蛋白表达水平随式 I化合物浓度增加呈剂量依赖性下降（见图 2) 。实施例 3: 式 I化合物对 TM诱导的心肌细胞凋亡的影响按照实施例 1原代心肌细胞培养方法培养的原代心肌细胞 4d 开始加衣霉素（TM)进行干预实验。细胞随机分成 5组: 溶剂对照组（ DMSO )， TM千预组（ 5ug/ml )，式 I化合物 +TM干预组（ 10 μ Μ+5 μ g/ml ) ，式 I化合物干预组 ( 20 μ g/ml+5 μ g/ml ) ，式 I 化合物干预组（ 40 μ g/ml+5 μ g/ml ) 。

流式细胞仪检测细胞凋亡：药物干预 24h后，按

AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒方法处理细胞， lh 内用以流式细胞仪（BD ACScalibur, 美国 Becton— Dickinson 公司）检测细胞凋亡情况。每个样本釆集 14000个细胞进行分析，实验重复 3次，结果取平均值。

TUNEL检测: 药物干预 24h后，用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端原位标记（ TUNEL) 法检测凋亡细胞，按试剂盒说明处理细胞。以 0. lmg/ml DNase I处理的细胞爬片作为阳性对照。光镜下随机选取 5个以上的视野，计数细胞中的凋亡细胞（胞核中可见棕黄色颗粒）数目。细胞凋亡率 - (阳性染色细胞核数 /所有细胞核数） XI 00% 。

实猃结果：各组凋亡率比较：

通过流式细胞仪测定，正常培养乳鼠心肌细胞早期凋亡率为 12.72%; 5μg/ml TM诱导 24h后，细胞凋亡达 29.98%; 同 TM组比较， ΙΟμΜ 式 I化合物组、 20μΜ 式 I化合物组、 40μΜ式 I化合物组心肌细胞凋亡率显著下降（Ρ<0.05 ) ，且随剂量增加凋亡率呈下降趋势。见表 3。

式 I化合物对 ΤΜ诱导的心肌细胞凋亡的影响组别流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率（％) 对照组（DMS0) 12.72 ±0.96

ΤΜ千预组 29.98 ±1.22^a

ΤΜ+式 I 10μΜ 22.98 ±1.35^ttb

ΤΜ+式 I 20μΜ 20.13±0.87^ab

ΤΜ+式 I 40μΜ 18.64±0.83^ab 与 DMSO 组相比， ^aP <0.05; 与 TM 组相比 ^bP <0.05 TUNEL检测结果

DMS0组细胞凋亡率为 7.86%，经 5 g/mL TM诱导 24h后干预组细胞凋亡率显著增加（P<0.05)，同 TM干预组相比，加用式 I化合物（10μΜ、 20μΜ、 40 μΜ)组，细胞凋亡率均明显降低（ Ρ <0.05 ) 。式 I化合物 40μΜ组同式 I化合物 10μΜ、 20μΜ组相比细胞凋亡率下降明显（Ρ <0.05) 心肌细胞凋亡率比较（s∑±s，n=6) 组别 TUNEL检测 (%) 溶剂（DMS0)对照组 7.86 ±0. 94

TM干预组 30.84 ±1.26

TM+式 I ΙΟμΜ组 25· 75 ±0.97 ^b ΤΜ+式 I 20μΜ组 24·94±0. 82

ΤΜ+式 I 40μΜ组 21.15±0· 85 与 DMSO 组相比， ^aP <0.05; 与 TM 组相比 ^bP <0.05; 与 TM+ 式 I 10 μΜ 组和 ΤΜ+式 I 20 μΜ 组相比， ^eP <0.05 实施例 4: 式 I化合物对缺氧诱导心肌细胞凋亡的保护作用动物：新生 Wistar大鼠, 鼠龄 24h内，雌雄不限

细胞准备:心肌细胞的分离和培养参照差速贴壁分离的方法，取 24h内新生的 Wistar乳鼠，经碘酒酒精消毒胸腹部皮肤，用剪刀在剑突下正中线稍偏左开胸取心斜开胸取出心脏置于冰预冷 PBS中；用 0.01M 的 PBS轻轻吹打心脏去除血液细胞和其他组织，将心脏剪成 0.5mm3大小的碎块，用 0.01M PBS反复冲洗 2-3次；将碎块置于锥形瓶中，加入 4ml 0.125%胰酶， 1ml 0.1%胶原酶 Π (终浓度分别为 0.1%和 0.02%) 37 水浴震荡 lOmin, 弃上清；再次加入 4ml 0.125%胰酶， 1ml 0.1%胶原酶 Π， 37 水浴震荡消化 lOmin, 吸取上清移至离心管，将上清加入含 10% FBS的 DMEM 终止消化；重复水浴震荡消化步骤 3-4次，直至组织块完全消化为止；将收集的细胞悬液以 lOOOrpm离心 lOmin后，去上清，再加培养基重悬；将重悬的细胞接种到细胞培养瓶中，置于 37 C02孵箱中孵育 1.5h后将培养液吸出，在显微镜下计数后，用含 10% FBS的 DMEM 培养液调整细胞密度，按 1 x 104接种到 96孔板，置于 37" 5%C02孵箱中 24h后半量换液，补加含 0.1% Brdu的培养基；之后每 48h后换液 1次，培养 4天后即可获得原代心肌细胞。

溶液准备 (下述试剂可购于 Invitrogen公司）：

1. 1 X wash buffer: 加 20ml的 10 x wash buff er入 180ml超纯水，总量至 200ml，储存于 4 7天；

2. 固定液：把 7.3ml的 37%曱醛溶液加到 14.7ml的 1 xwash buffer中，使用前预热到 37 (此溶液需临时配制）。

3. l x渗透緩冲液：加 4ml的 10 X渗透緩沖液到 36ml双蒸水中，储存于 4 7天；

4. Mitotracker /Hoechst溶液（-20 保存）：用 94μί的无水 DMS0溶解 Mitotracker制成 ImM的溶液，此溶液能在- 20 干燥避光的条件下保存 6个月。为避免多次冻溶循环，进行单次使用量的分装。把 5.5 浓度为 ImM的 Mitotracker溶液和 11 的 Hoechst染液加到细胞培养基中，得到最终体积为 5.5mL的应用液（此溶液需临时配制）。 5. Alexa Fluor 488 phalloidin Solution: 用 140 μ L 甲醇把 Alexa Fluor 488 phal loidin溶解成制成母液,此溶液可在 -20 °(：干燥避光的条件下保存 12个月。把 27.5 μ L的 Alexa Fluor 488 phalloidin母液加到 5.5ml的 1 wash buffer中制成应用液（需临时配制）。实验步骤：

1.将分离的心肌细胞按照每孔 104个细胞接种到 96孔板，每孔体积 ΙΟΟμ Ι (边缘孔用无菌 PBS填充）。在 5%C02， 37匸孵箱培养 4d后，分别给予不同浓度的式 I ( 5 μΜ、 10μΜ、 20μΜ) 处理后 30min后，置入密闭的缺氧孵箱中（02/C02, 5: 95)继续孵育 16h，同时设置缺氧对照孔，正常对照孔 5%C02， 37 孵箱培养 16h。

2.在完成缺氧孵育前 30min，每孔补加 50 μ 1的培养基和 50 μ 1的 Mitotracker /Hoechst溶液，继续 37tl孵育细胞 30min。

3. 将预热至 37 的固定液 100μ 1分别加入各培养孔，而不吸去培养基，通风处室温孵育 10min。

4.吸净各孔溶液（可以扣板），用 1 xwash buffer ( 100μ 1/孔）洗 1次。操作和洗涤过程中要特别小心，緩慢吸液和加液以保持细胞贴壁和细胞的完整性。

5.吸净 wash buffer (可以扣板），加入 1 χ渗透緩冲液（ 100 μ 1/孔）室温孵育 15min。

6.吸净各孔渗透緩冲液（可以扣板），用 1 xwash buffer ( 100 μ 1/孔）洗 1次。

7. 吸净各孔 wash buffer (可以扣板），每孔加入 50 μ ΐ Alexa Fluor 488 phal loidin溶液, 室温避光孵育 30min_o 8. 吸净各孔 Alexa Fluor 488 pha l loidin溶液（可以扣板），用 1 χ wash buffer ( 100 μ 1/孑 L )洗 2次，再加入 1 χ wash buffer

( 100 μ 1/孔）。

9.用封口膜把板子边缘包上（防止干燥），在 HCS Reader 上检测。

高内涵筛选分析法：

细胞发生凋亡时，通常会出现细胞形态学的显著改变，以及生化和分子标志物等一系列变化。关于细胞凋亡的检测方法很多，但大多只能针对凋亡细胞的凋亡单一指标进行检测。高内涵筛选分析是近年来新出现的一种凋亡检测方法，通过特定的荧光染色对凋亡同时进行多因素分析。主要分析与凋亡过程相关的三个参数：包括核形态学改变，线粒体肿胀和或线粒体膜电位， F-肌动蛋白含量。对于完整的细胞具有高度的特异性和可靠性。

发生凋亡的细胞通常表现出两种类型的核改变，核片段化或核浓缩，在核片段化的过程中，圆形或椭圆形的核变成分叶状，并最终裂解成多个亚核结构。由于细胞核内的常染色体、核仁等结构成份的破坏使核密度增加。 HCS Reader能通过 Hoechs t染色对细胞核的形态学进行观测，并对细胞核面积和核强度进行定量比较。

线粒体内的变化是凋亡重要的形态学改变，线粒体通过外膜释放凋亡基因因子，同时，因为线粒体通透性增加，也可以使线粒体内膜的电化学成份改变，导致膜电位的下降或消失。在凋亡的刺激下，线粒体也扩张变大，引起线粒体体积的增加。线粒体膜电位的下降和线粒体体积的增加，已经被公认为是细胞凋亡早期的标志物，可通过线粒体示踪剂 Mi toTracker® Red来进行定量。

肌动蛋白细胞骨架的变化已经被报道作为一个与凋亡改变有关的重要参数，在早期凋亡时， F-肌动蛋白含量增加。通过 F -肌动蛋白特异的染色剂 Alexa Fluor® 488 Phalloidin (次毒蕈环肽）的染色，可确定 F-肌动蛋白含量，对细胞凋亡的程度进行量化比较。

式 I化合物对缺氧诱导心肌细胞凋亡的保护作用检测结果：

1)核面积检测结果:

组别核面积

对照组 113.86 ± 3.06

缺氧组 98.26 ±1.00

式 I化合物 5 μ M组 109.90 ± 3.97

式 I化合物 ΙΟμΜ组 107.43 ±7.77

式 I化合物 20 μΜ组 111.90±10.76 核强度检测结果：

组别核强度

对照组 122.70士 2.38 缺氧组 118·23±1· 33 式 I化合物 5 μ Μ组 124.90 ±2.25

式 I化合物 ΙΟμΜ组 123.21 ±2.71

式 I化合物 20μΜ组 121.40±2.24 light flux检测结果：

组别 light flux

对照组 1247.52 ±48· 059 缺氧组 1044.91 ± 16.53

式 I化合物 5 μ M组 1201.92 ±29.95

式 I化合物 ΙΟμΜ组 1166.12±91.06

式 I化合物 20μΜ组 1214.09± 107.59 4) 肌动蛋白纤维检测结果:

5) ，线粒体膜电位检测结果:

6) 细胞计数检测结果:

同对照组相比，缺氧组细胞计数下降了 28.49%，而使用了不同浓度的式 I化合物（5μΜ、 10μΜ、 20μΜ)之后，同缺氧组相比细胞计数分别升高了 ( 17. 06%、 26. 52%和 30. 22% ) 。

同对照组相比，缺氧组造成细胞核面积、核强度、光照强度、肌动蛋白纤维、线粒体膜电位和细胞计数等下降，式 I化合物能够明显提高缺氧状态下心肌细胞上述各指标值，高内涵筛选结果表明式 I化合物具有明显改善缺氧引起的心肌细胞凋亡作用。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

权利要求

1. 式 I的化合物，或其异构体、可用盐及溶剂化物,

I

2. 药物组合物，其包含式 I的化合物，或其异构体、可药用盐及溶剂化物，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀幹剂。

3. 权利要求 1所述的化合物或其异构体、可药用盐及溶剂化物，用于制备抗细胞凋亡，预防或治疗与细胞凋亡有关的疾病或症状的药物的用途。

4. 权利要求 1所述的化合物或其异构体、可药用盐及溶剂化物，用于制备保护心肌细胞和预防或治疗与心肌细胞凋亡有关的疾病或症状的药物的用途。

5. 一种预防和 /或治疗与心肌细胞凋亡有关的疾病或症状的方法，所述方法包括：给予治疗量的权利要求 2所述的药物组合物。

6. 一种保护心肌细胞的方法，所述方法包括给予治疗量的权利要求 2所述的药物组合物。

7. 权利要求 3- 5任一项所述的与心肌细胞凋亡有关的疾病或症状，包括：饥饿性心肌萎缩，心肌炎，心力衰竭，原发性高血压引起的心肌损伤，急性心梗早期引起的心肌损伤，急性心梗再灌注引起的心肌损伤，心脏移植引起的心肌细胞病变，发育不良性心肌病；缺氧引起的心肌细胞凋亡或心血管系统硬化。