WO2011126174A1 - 알파-시뉴클레인 유래 곱슬 아밀로이드 섬유의 제조방법, 이를 이용한 하이드로젤의 제조 방법 및 그 이용 방법 - Google Patents

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WO2011126174A1
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curly
synuclein
alpha
fibers
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백승렬
박기범
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서울대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing curly amyloid fibers derived from alpha-synuclein and a method for producing a hydrogel using the same, and more particularly, to a method for producing curly amyloid fibers obtained during the fiberization process of alpha-synuclein and using the same It is about a method.
  • suprastructures based on proteins such as alpha-synuclein is an important phenomenon that accompanies a wide range of biological activities, from cell biogenesis to degenerative diseases.
  • Such superstructures are used to produce new biologically suitable materials through in vitro assembly. Therefore, the identification of the molecular assembly mechanism in which the superstructure is formed is very important not only for understanding general biological generation but also for producing biomaterials for application in the field of nano biotechnology.
  • Alpha-synuclein is a pathological component that participates in the formation of Lewy bodies in neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease (PD). Identifying the mechanism by which the superstructure amyloid fiber is formed from this is also necessary to formulate a strategy for the treatment of diseases, but it is also important for the application of protein fiber in future industries.
  • PD Parkinson's disease
  • Amyloid fiber is a protein that is modified through a very specific self-assembly process. It is a very square fibrous protein aggregate known to be stabilized mainly in a cross beta-sheet structure. Amyloid is the result of the conversion of proteins with partially misfolded from chaotic to orderly structures through selective molecular self-assembly processes. Mature amyloid fibers develop polymorphism due to molecular level structural variations of individual amyloid proteins or by changes in internal and external fibrous interactions.
  • Amyloid formation is closely related to neurodegenerative diseases including Parkinson's disease, Alzheimer's disease (AD) and Prion disease, although no toxic cause of cellular degeneration is known. have.
  • Amyloid fibers also have biological activity, such as biofilm formation of enterobacteria, mycelial formation of fungi, egg shell formation of insects, fish, melanin biosynthesis in mammalian melanin forming cells, human body Factors in human hemostasis Activation and the like.
  • Amyloid fibers are considered to be 10-20 nm diameter protein nanofibers with mechanical strength comparable to spider webs. This nanoscale raw material has the potential to produce conductive nanowires, align nanoparticles, and use them as functional templates for enzyme immobilization. Liquid crystal and hydrogel can also be formed. Thus, the exploration of the various methods of amyloid fibrosis is of substantial importance for the production of various functional nanomaterials for applications in biotechnology.
  • a nuclear-dependent fibrillation model As a molecular self-assembly mechanism for amyloid production, a nuclear-dependent fibrillation model is widely known. According to this model, first, thermodynamically unstable nuclei are formed. Thereafter, as the monomer units in the pre-structured or unstructured state complementary to the template are attached to the nucleus, the fibrosis process is accelerated and completed. This process is reflected in the fibrosis kinetics, and it can be confirmed that the fibrosis is carried out through an exponential growth phase of amyloid through a lag phase in the agitated culture of amyloid protein.
  • the above report shows the results of the research carried out with the focus on the possibility of another dual-cooperative fibrosis model compared to the existing nuclear-dependent model as the fibrosis step of alpha-synuclein.
  • the mechanism in which the two fibers are developed and how the fibers formed have a multi-structure, etc. it is necessary to examine closely, and in addition, there is a lack of research on which fields the fibers can be applied to.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a hydrogel using the alpha-synuclein-derived amyloid fiber.
  • the method for preparing alpha-synuclein-derived amyloid fiber of the present invention comprises the steps of culturing alpha-synuclein to produce alpha-synuclein granules, and assembling a plurality of the alpha-synuclein granules to form curly It comprises a step of preparing amyloid fibers.
  • a predetermined stress is applied to the alpha-synuclein granules so as to have a warped structure and / or a teratogenic structure, and a plurality of granules having such warped and / or teratogenic structures are assembled to form the curly amyloid.
  • a predetermined stress is applied to the alpha-synuclein granules so as to have a warped structure and / or a teratogenic structure, and a plurality of granules having such warped and / or teratogenic structures are assembled to form the curly amyloid.
  • the stress is applied by shearing the alpha-synuclein granules or by performing a centrifugal membrane filtration process.
  • the alpha-synuclein granules may be subjected to an organic solvent treatment including hexane to add stress.
  • the alpha-synuclein granules are granular oligomeric species obtained during a retardation step in culture for fibrosis of alpha-synuclein.
  • the curly amyloid fibers comprise more antiparallel beta-screen structures than parallel beta-screen structures. Also in one embodiment, the length of the fiber contour ( C L ; contour length) of the curly amyloid fibers is shorter than the two-dimensional end and end distances ( R 2D ) of the fibers.
  • the curly amyloid fibers have self-propagation properties for the production of acid amyloid, including first-generation and second-generation acid.
  • the present invention provides a step of culturing alpha-synuclein to produce alpha-synuclein granules and assembling a plurality of alpha-synuclein granules to produce curly amyloid fibers. It provides a method for producing a hydrogel using alpha-synuclein-derived curly amyloid fibers prepared according to a method comprising a.
  • the hydrogel is capable of capturing horseradish peroxidase (HRP) enzymes and the average pore size of the fiber network obtained by lyophilizing the hydrogel ranges from 10 to 100 nm.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Another object of the present invention described above is a three-dimensional matrix cell culture for drug delivery, tissue engineering, neuronal regeneration and bone formation using the hydrogel. It is achieved by a method for producing any one of 3D-matrix cell culture, biomolecular entrapment, enzyme entrapment, nano-filter and biomarker.
  • alpha-synuclein-derived curly amyloid fibers can be easily produced according to molecular self-assembly mechanisms, and thus prepared, having flexibility, mechanical strength and morphological specificity. It is possible to apply the curly amyloid fiber in various fields of nano biotechnology.
  • FIG. 1 is a graph illustrating the level of granule formation monitored by incubation time during the preparation of alpha-synuclein granules.
  • 2 is a negative stained TEM image of granules formed by culturing alpha-synuclein.
  • FIG. 3 and 4 are TEM photographs of straight amyloid fibers derived from alpha-synuclein, and FIG. 3 is shown in comparison with a 0.2 ⁇ m scale bar, and FIG. 4 is shown in comparison with a 0.5 ⁇ m scale bar.
  • FIG. 5 and 6 are TEM photographs of the amyloid fibers derived from alpha-synuclein, and FIG. 5 is shown in comparison with a 0.2 ⁇ m scale bar, and FIG. 6 is shown in comparison with a 0.5 ⁇ m scale bar.
  • FIG. 7 and 8 are schematic model diagrams showing the process of amyloid fiber production by molecular self-assembly mechanism, FIG. 7 for straight amyloid fibers, and FIG. 8 for curly amyloid fibers.
  • FIG. 9 and 10 are AFM images of single amyloid fibers, FIG. 9 for curly amyloid fibers, and FIG. 10 for straight amyloid fibers. Tracking images for each amyloid fiber are shown in the lower right inset.
  • FIG 11 is a graph showing the end and end distances of the fiber ( R 2D ) with respect to the length of the amyloid fiber contour ( C L ), where the blocked point ( ⁇ ) is for the curly amyloid fiber, and the open point ( ⁇ ) is the straight amyloid.
  • the average duration ( P av ) of straight amyloid fibers (SAF) and curly amyloid fibers (CAF) is shown in the upper left insertion.
  • FIG. 12 and 13 are TEM images for demonstrating breakage resistance of amyloid fibers against shear stress applied by centrifugal filtration membranes, FIG. 12 for curly amyloid fibers, and FIG. 13 for straight amyloid fibers.
  • FIG. 14 and 15 are graphs showing changes in the length ( C L ) dispersion of fiber contours before and after sonication of amyloid fibers, FIG. 14 for curly amyloid fibers, and FIG. 15 for straight amyloid fibers. AFM images before and after sonication for each fiber are shown in the implantation.
  • FIG. 16 and 17 are ATR-FTIR spectra for the fibrous polymorph of alpha-synuclein, FIG. 16 for straight amyloid fibers, and FIG. 17 for curly amyloid fibers.
  • Figures 18 and 19 schematically show the self-proliferation process for amyloid fibers, Figure 18 for curly amyloid fibers and Figure 19 for straight amyloid fibers.
  • FIG. 20-23 are TEM images of each fiber obtained during the self-proliferation process from hair curly amyloid fibers to second generation dissipated fibers, FIG. 20 for the parent fiber, FIG. 21 for the seed fiber, and FIG. 22 Is for the first generation dissipation fiber, and FIG. 23 is for the second generation dissipation fiber.
  • FIG. 24 to 27 are TEM images of each fiber obtained from the self-proliferation process from the parent straight amyloid fiber to the second generation dissipated fiber, FIG. 24 for the parent fiber, FIG. 25 for the seed fiber, and FIG. 26 Is for the first generation dissipation fiber, and FIG. 27 is for the second generation dissipation fiber.
  • 29 is a photograph for showing the optical transmittance of curly amyloid hydrogel.
  • FIG. 31 is an optical image obtained by observing curly amyloid fibers in hydrogel used in FIG. 30 with an optical microscope.
  • graph "a” is a spectrum showing the TMB oxidation by HRP added before the formation of the hydrogel trapped in the hydrogel
  • graph "b” after the formation of the hydrogel TMB is not oxidized because HRP was not captured by the addition of HRP.
  • Fig. 34 is a spectrum showing repetitive reuse activity of HRP enzyme, graph "a” representing a blocked point ( ⁇ ) shows activity for an enzyme trapped in curly amyloid hydrogel, and a graph representing an open point ( ⁇ ). "b” indicates activity against enzymes entrapped in collagen-based hydrogels.
  • FIG. 35 and 36 are FE-SEM photographs of the pores of the hydrogel, FIG. 35 is for the curly amyloid hydrogel, and FIG. 36 is for the collagen-based hydrogel.
  • FIG. 37 is a spectrum showing TMB absorbance at a particular wavelength to confirm maintenance of HRP activity against heat
  • graph "a” representing a blocked point ( ⁇ ) is TMB oxidation for HRP enzyme trapped in curly amyloid hydrogel
  • the graph “b” showing the absorbance and representing the open point ( ⁇ ) shows the TMB oxidative uptake for the free HRP enzyme without being captured.
  • both models are compared by analyzing the self-proliferating molecular level polymorphism of the 'straight amyloid fibrils (SAF) polymorph and the' curly amyloid fibrils (CAF) fibrous polymorph. It has been shown to act substantially on alpha-synuclein fibrosis process.
  • the two polymorphic amyloid fibers are derived from the same amyloid protein, alpha-synuclein, which is formed by different methods of stirred culture of monomers and centrifugal membrane filtration of granular oligomeric species. Both of these methods follow a nuclear-dependent fibrillation model and a dual-cooperative fibrosis model, respectively.
  • alpha-synuclein can form straight amyloid fibers by stirred culture as observed in vitro amyloid production.
  • Straight amyloid fibers are formed by stirring culture over several hours. That is, when a thermodynamically unstable nucleus is formed, the fiberization process proceeds as the monomer units attach to it. This process is reflected in the fibrotic kinetics, which undergo a rapid growth of amyloid through a fibrosis retardation step in a stirred culture of amyloid protein.
  • the straight amyloid fibers that are formed are interacting at sharp angles when they overlap each other as the amount of fibers increases and maintains relatively little entanglement.
  • Straight amyloid fibers contain more antiparallel beta-fold structures than parallel beta-fold structures, which make up most of them, resulting in structural specificity with structural flexibility and mechanical strength.
  • Curly amyloid fibers have a meandering shape, and as the amount of fibers increases, the overlapping patterns interact with each other at a gentle angle and entangle each other to a considerable degree to form a fiber network.
  • straight amyloid fibers and curly amyloid fibers obtained in different forms according to different fiberization models applied to the two methods showed similar characteristics but completely different characteristics.
  • the accumulation of curly fibers obtained through a dual-cooperative fibrosis model forms amyloid hydrogels that make up a three-dimensional network of protein fibers.
  • This forms a new hierarchical supramolecular body, and the supramolecular body formed in nanomatrix form provides a three-dimensional nano-scale protein fiber network, for example, for horseradish peroxidase enzyme entrapment.
  • Particularly formed nanofiber networks serve to prevent the loss of enzyme activity, for example, against multiple enzyme action (meaning repeated reuse of enzyme reactions) and heat treatment of horseradish peroxidases.
  • the nano-unit fiber network of curly amyloid fibers can be applied to various fields of nanobiotechnology including tissue engineering, drug delivery, and development of biosensors.
  • alpha-synuclein the same amyloid protein
  • curly amyloid fibers are formed mainly through certain stressful treatments, such as centrifugal force membrane filtration, for oligomeric species, which are alpha-synuclein granules, based on a dual-cooperative fibrosis model. Formed by stirring culture on alpha-synuclein in the monomeric state based on the dependent fibrosis model.
  • the antiparallel beta-fold structure which is contained more in curly amyloid fibers, compared to the parallel beta-wind structure, which constitutes most of the straight amyloid fibers, exhibits structural flexibility, mechanical strength, and morphological specificity. Both polymorphs have self-proliferative properties, and it was also confirmed that the seed-dependent fibrosis process inherited the morphological specificity of the first-generation daughter amyloid fibers and the second-generation granddaughter amyloid fibers. .
  • amyloid hydrogels as a three-dimensional network of protein fibers.
  • Hydrogels can be used, for example, as nanomatrices for enzymatic capture. Such hydrogels have the effect of, for example, maintaining stable multiple catalyses of horseradish peroxidases and preventing loss of enzyme activity by heat treatment.
  • Figure 1 is a graph showing the monitoring of the level of formation of granules with incubation time during the preparation of alpha-synuclein granules (granule).
  • Alpha-synuclein fibrosis kinetics were monitored for thioflavin-tee binding fluorescence. 1 mg / ml alpha-synuclein at 37 ° C. was incubated with stirring in 20 mM Mes, pH 6.5. Oligomer granules were obtained during the retardation step, and the portion indicated by the arrow in the figure was confirmed to be about 17 hours as a time point immediately before the retardation step was completed.
  • amyloid fibers is monitored by thioflavin-tee binding fluorescence.
  • the resulting alpha-synuclein fibrosis kinetics can be divided into a lag phase, an exponential grow phase, and a stationary phase of growth. Once the kinetics for these three stages are fully obtained, the delay stage time is determined and granules are obtained at the point just before the delay stage is over. This is because most granules form during the retardation period.
  • FIG. 2 is a negative stained TEM image of granules formed by culturing alpha-synuclein. Scale bars represent 0.5 ⁇ m. It can be seen from the figure that granules were formed.
  • Granules of alpha-synuclein are obtained under continuous stirring conditions in culture for fibrosis.
  • AFM or TEM can be used to observe patterns or populations formed.
  • the step of obtaining the granules appears to contain negligible amounts of alpha-synuclein monomers and allows monitoring for the formation of granules by dynamic light dispersion.
  • size-exclusion chromatography does not allow separation of granules and monomers, which is believed to be due to the return of the granules back to the monomer state. This is believed to be because the granules are in a pseudo-stable state.
  • the average particle diameter is expected to be about 18.9 ⁇ 2.6nm through TEM images.
  • the average weight is about 159 kDa, and since the weight of the alpha-synuclein monomer is about 14.4 kDa, it is predicted that about 11 alpha-synuclein monomers are assembled to form granules.
  • FIG. 3 and 4 are TEM photographs of straight amyloid fibers, and FIG. 3 is shown in comparison with a 0.2 ⁇ m scale bar, and FIG. 4 is shown in comparison with a 0.5 ⁇ m scale bar.
  • 3 and 4 are TEM photographs obtained by stirring and incubating the alpha-synuclein monomer at a temperature of about 37 ° C. at a speed of about 200 rpm for about 100 hours to form amyloid fibers, and negatively staining the obtained fibers. It can be seen that the fibers formed are straight amyloid fibers with an average diameter of 15.2 nm.
  • FIG. 5 and 6 are TEM images of curly amyloid fibers, and FIG. 5 is shown in comparison with a 0.2 ⁇ m scale bar, and FIG. 6 is shown in comparison with a 0.5 ⁇ m scale bar.
  • Granular oligomeric species can be obtained during the retardation phase when subjected to normal stirring culture of soluble alpha-synuclein at a concentration of 1 mg / ml dissolved in 20 mM Mes, pH 6.5 buffer as described with reference to FIG. 1.
  • Curly amyloid fibers can be produced by centrifugal membrane filtration for about 12 minutes using alpha-synuclein granular oligomer species, e.g., by filtering 20 times in two minute cycles to increase the amount of curly amyloid fibers. Interacting at a gentle angle and significantly entangled results in a fiber network as shown in FIG. 6.
  • curly amyloid fibers by centrifugal membrane filtration is thought to be caused by the structural changes in the granules due to the shear stress generated by the solvent flowing through the membrane surface at high speed and due to their self-assembly.
  • the formation of amyloid fibers is thought to be influenced by physical stresses such as stirring, shaking, mechanical stirring and the like.
  • Fibrillation due to structural changes to the granules was caused by a kind of stress, and this structural distortion was found to be performed in the hexane solvent.
  • the cause of structural modifications in hexane requires a closer examination, but it can be seen that granular oligomeric species are very sensitive to physical effects. In any way, the structural modification of the granules is a necessary phenomenon to implement the curly amyloid fibrosis process.
  • FIG. 7 and 8 are schematic model diagrams showing the process of amyloid fiber production, FIG. 7 for straight amyloid fibers, and FIG. 8 for curly amyloid fibers.
  • Nuclear centrosomes are structural changes that serve as a template to which soluble monomeric proteins attach to produce insoluble straight amyloid fibers. That is, the monomer forms a thermodynamically unstable nucleus, and monomer proliferation occurs as the monomer units in the group-structured or amorphous state having complementarity to the template adhere to the nucleus, and the proliferation process is promoted through such proliferation. This process leads to the formation of straight amyloid fibers.
  • FIG. 8 is a schematic model diagram summarizing a dual-cooperative fibrosis model of alpha-synuclein.
  • the monomers are cultured to form granules of oligomeric species, and the resulting granules are stressed to cause structural warpage.
  • Oligomeric species become particulate and sensitive to physical effects such as shear stress. Shear stress applied by centrifugal force filtration causes structural warping of the preformed granular oligomeric species, followed by granulation of the granules, resulting in rapid production of curly amyloid fibers.
  • the biophysical and biochemical properties of curly amyloid fibers compared to straight amyloid fibers were investigated to examine the flexibility / strength, structural characteristics, and self-proliferative properties of the fibers.
  • the flexibility developed for curly amyloid fibers and straight amyloid fibers was evaluated using algorithms developed to measure the length of fiber contours ( C L ) and the two-dimensional end and end distances ( R 2D ) of individual fibers.
  • AFM images of more than 50 amyloid polymorphs on the surface of the mica were analyzed by algorithm to reimage the amyloid according to the fiber shape.
  • FIG. 9 and 10 are AFM images of single amyloid fibers, FIG. 9 for curly amyloid fibers and FIG. 10 for straight amyloid fibers (2.5 ⁇ m ⁇ 2.5 ⁇ m). Tracking images for each amyloid fiber are shown in the lower right inset.
  • FIG 11 is a graph showing the end and end distances ( R 2D ) with respect to the length ( C L ) of the fiber contour of the amyloid fiber, where the closed point ( ⁇ ) is for the curly amyloid fiber, and the open point ( ⁇ ) is the straight amyloid For fiber.
  • the average persistence length ( P av ) of straight amyloid fibers (SAF) and curly amyloid fibers (CAF) is shown in the upper left insertion.
  • FIG. 12 and 13 are TEM images for showing breakage resistance of amyloid fibers against shear stress applied to the centrifugal filtration membrane, FIG. 12 for curly amyloid fibers, and FIG. 13 for straight amyloid fibers. Arrows in the figures indicate before and after performing the filtration step.
  • Amyloid fibers were observed after 30 repeated 5-minute cycles of filtration. As shown in FIG. 12, the final structure of the curly amyloid fibers was generally well maintained when comparing before and after filtration. On the other hand, in the case of straight amyloid fibers as shown in Figure 13 it can be seen that almost all fibers are broken into pieces after filtration when compared with before and after filtration. Scale bars in the photographs represent 0.5 ⁇ m.
  • each amyloid fiber was subjected to sonication and the mechanical strength of the curly amyloid fiber and the straight amyloid fiber was compared before and after the treatment.
  • FIG. 14 and 15 are graphs showing changes in C L dispersion before and after sonication of amyloid fibers, FIG. 14 for curly amyloid fibers, and FIG. 15 for straight amyloid fibers.
  • the sonication was performed with intermittent sonication, with 20 cycles of each start / stop cycle for 3 seconds.
  • the C L of the fibers and pieces before and after sonication were analyzed by the algorithm described above.
  • the upper left insertion shows the AFM form of the fiber / powder (5 ⁇ m ⁇ 5 ⁇ m).
  • the arrows mean before and after performing the ultrasonic grinding process on the amyloid fibers.
  • amyloid fibers were compared using an attenuated total reflectance fourier transformation infrared (ATR-FTIR) spectrometer.
  • ATR-FTIR attenuated total reflectance fourier transformation infrared
  • Figures 16 and 17 are ATR-FTIR spectra for amyloid fibers, Figure 16 for straight amyloid fibers and Figure 17 for curly amyloid fibers. Analysis of the amide I profile (1600-1700 cm ⁇ 1 ) shown in bold curves is the method used to determine the secondary structure of the protein.
  • the straight amyloid fiber spectrum showed a main peak at 1630 cm ⁇ 1 , which corresponds to parallel beta-screen structures, which accounted for 43.3% of the total.
  • Straight amyloid fibers is also anti-parallel beta Just as identified in 1619cm -1 and 1683cm -1 - there comprises a folding structure relative contribution is 19.9% and 3.5%, respectively.
  • This beta structure involves a beta-turn of 19.5% at 1668 cm ⁇ 1 .
  • Other parts consist of alpha-helix structures or random coil structures, observed at 1650 cm ⁇ 1 at a rate of 13.8%.
  • curly amyloid fibers having antiparallel beta-fold structures connected in short loops are liable to bend in shape.
  • the alternative orientation of the N- and C -terminis in the antiparallel beta-fold structure suggests that the curly amyloid fibers are more stable than the straight amyloid fibers.
  • amyloid fibers To characterize the amyloid fibers, the self-proliferative properties of curly amyloid fibers and straight amyloid fiber polymorphs were investigated by incubating the alpha-synuclein monomer with seeds obtained from the two products formed as a result of the amyloid fibrosis process.
  • Figures 18 and 19 schematically show the self-proliferation process for amyloid fibers, Figure 18 for curly amyloid fibers and Figure 19 for straight amyloid fibers.
  • Fragments made by sonicating the parent fibers for both fibers were used as seeds for the growth of the first-generation acidic amyloid.
  • the first-grown first-acid amyloid, grown amyloid was sonicated again to make seeds, which were used as seeds for second-generation acidic amyloid formation in the presence of alpha-synuclein monomer.
  • the quiescent culture in which 5% of the seeds were present it was confirmed that the amount of fibrosis was dramatically improved compared to the monomer protein culture without seeds.
  • the first-generation dissipated fiber in the presence of the ultrasonically crushed hair curly amyloid fiber fragment, the first-generation dissipated fiber inherited the tortuous surface structure of the hair curly amyloid fiber.
  • the curly form of the first-generation dissipated fibers was also transmitted as is to the second-generation dissipated fibers.
  • the first and second generation dissipated fibers inherited the straight fiber form of the parent straight amyloid fibers.
  • seed is a determinant of the shape of mature amyloid fibers in the next generation. That is, it can be confirmed that the self-proliferative properties of the curly amyloid fiber and the straight amyloid fiber polymorph amyloid fiber are expressed as the morphological inheritance of the parent amyloid fiber through the molecular properties are maintained in the dissipative fiber.
  • FIG. 20-23 are TEM images of the fibers at each stage of the self-proliferation process from hair curly amyloid fibers to second-generation dissipated fibers, FIG. 20 for the hair fibers and FIG. 21 for the seed fibers. 22 is for the first-generation dissipation fibers, and FIG. 23 is for the second-generation dissipation fibers.
  • FIG. 24 to 27 are TEM images of the fibers at each stage of the self-proliferation process from the parent straight amyloid fibers to the second generation dissipated fibers, FIG. 24 for the parent fiber and FIG. 25 for the seed fiber.
  • 26 is for the first-generation dissipation fibers
  • FIG. 27 is for the second-generation dissipation fibers.
  • the scale bar shows 0.2 micrometer and the insertion of the lower right part shows the image magnified three times with respect to each fiber.
  • 29 is a photograph for showing the optical transmittance of the hydrogel. In the picture, it can be seen that the symbol of Seoul National University is transmitted through the transparent hydrogel.
  • amyloid fibers in the hydrogels was characterized by thioflavin-T binding fluorescence results and 458 nm excitation using a confocal laser scanning microscope (CLSM) at a bandpass filter (BP) at 475-525 nm. It could be confirmed by imaging. An optical image thereof is shown in FIG. 30.
  • FIG. 31 is an optical image obtained by observing curly amyloid fibers in hydrogel used in FIG. 30 with an optical microscope. That is, the two images shown in FIGS. 30 and 31 coincide with each other to confirm that it is the amyloid fiber constituting the hydrogel.
  • the lyophilized nanoscale fiber network was confirmed by using field emission scanning electron microscopy (FE-SEM).
  • the pore size of the fiber network obtained by freeze-drying the hydrogel is found to be in the range of about 10 to 100 nm, and preferably the average pore size is about 52.9 nm.
  • HRP was entrapped in the hydrogel by mixing 1 ⁇ g of HRP with 2 mg of the first-generation dissipated curly amyloid fiber obtained from the self-proliferation experiment and the solvent was removed by centrifugal filtration using Microcon YM-30. After washing the hydrogel at least 10 times with 20 mM Mes at pH 6.5 to remove uncaptured HRP from the gel, the hydrogel was inflated in fresh fresh buffer for 1 hour. And 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate was added to the hydrogel. Only HRP captured hydrogel was able to confirm that the blue color appeared within 5 seconds. The result of oxidizing TMB was measured by UV / VIS spectrometer.
  • curly amyloid fiber hydrogels with HRP showed maximum absorbance at 660 nm
  • curly amyloid fiber hydrogels with HRP added after hydrogelation as shown in graph "b” showed TMB. No blue product was produced from.
  • the graph “a” means that the HRP captured in the amyloid hydrogel did not escape out of the hydrogel.
  • graph “b” shows that free HRP did not pass through the curly amyloid fiber hydrogel consisting of nano-scale pores.
  • the degree of activity retention of the captured HRP was then assessed by monitoring the formation of the blue product during twenty multiple enzyme actions.
  • FIG. 35 and 36 are FE-SEM photographs of the pores of the hydrogel, FIG. 35 is for the curly amyloid hydrogel, and FIG. 36 is for the collagen-based hydrogel. Scale bars in the figure represent 1 ⁇ m.
  • the large pore size in the collagen gel is 31.5 ⁇ m on average, and it is considered that it is not easy to trap the enzyme in the gel having a pore size of ⁇ m.
  • the amyloid hydrogel has a pore size in nm, and a space having nano-level pores seems to be able to safely and stably hold HRP during multiple enzymatic action.
  • FIG. 37 is a spectrum showing TMB absorbance at a particular wavelength to confirm maintenance of HRP activity against heat
  • graph "a” representing a blocked point ( ⁇ ) is TMB oxidation for HRP enzyme trapped in curly amyloid hydrogel
  • the graph “b” showing the absorbance and representing the open point ( ⁇ ) shows the TMB oxidative uptake for the free HRP enzyme without being captured.
  • amyloid hydrogel can be seen as a suitable nanomatrix as a protein fiber network for enzyme capture and heat inactivation barrier.
  • Intergenic recombinant human alpha-synuclein was prepared according to known methods. Briefly, the human alpha-synuclein gene cloned in the pRK172 plasmid was overexpressed in Escherichia coli BL21 (DE3). Cell lysates were then subjected to heat treatment followed by DEAE-Sephacel (diethylaminoethyl-Sephacel) anion-exchange chromatography, Sephacryl S-200 size exclusion chromatography, and S-Sepharose cation-exchange chromatography processes.
  • DEAE-Sephacel diethylaminoethyl-Sephacel
  • the buffer was changed three times and dialyzed with 6 liters of 20 mM Mes ⁇ 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid ⁇ at pH 6.5, and the fully separated alpha-synuclein was aliquoted and stored at -80 ° C.
  • Two types of amyloid fiber polymorphs were obtained according to the following method.
  • alpha-synuclein granules were repeatedly centrifuged membrane filtered at 37 ° C., 14,000 ⁇ g using Microcon YM-30 (Millipore) and Centrifuge 5415R (Eppendort, Germany). After each filtration was performed for 2 minutes, the filtrate was combined with the original sample and another filtration performed. The resulting curly amyloid fibers were redispersed in the same volume of 20 mM Mes at pH 6.5 and collected via reverse centrifugation. Oligomeric granules of alpha-synuclein were obtained in the retardation phase of the aggregated kinetics obtained by monitoring by thioflavin-T binding fluorescence.
  • Fibrosis was carried out under conventional stirred culture for 1 mg / ml alpha-synuclein. Stirring was performed in 20 mM Mes buffer at pH 6.5 at 37 ° C. and shaken continuously at 200 rpm on an orbit shaker. Alpha-synuclein was incubated under agitated conditions to yield straight amyloid fibers.
  • alpha-synuclein amyloid was examined by AFM (Dimension 3100, Veeco, USA). Alpha-synuclein amyloid was adsorbed onto freshly cleaved mica and the mica debris was washed twice with excess water (Direct-Q, Millipore, USA). Samples completely dried in air were analyzed by tapping mode AFM.
  • the duration of length P is obtained from the statistical relationship between C L and the two-dimensional end and end distance R 2D of the polymer chain. P can be represented by the following formula (1).
  • Attenuated total reflectance fourier transformation infrared (ATR-FTIR) spectrometer Attenuated total reflectance fourier transformation infrared (ATR-FTIR) spectrometer
  • Both curly amyloid fibers and straight amyloid fibers were buffered using 20 mM Mes buffer at pH 6.5. Each amyloid fiber sample is placed on ZnSe ATR crystals. ATR spectra were recorded by Nicolet 6700 FT-IR spectrometer (Theremo Scientific, USA) with a DTGS detector (dueterated triglycine sulfate detector). Data adjustment and curve analysis for the ATR-FTIR spectra were performed using OriginPro 7.5 software (OriginLab).
  • a self-proliferation experiment was performed to obtain first-generation and second-generation dissipation fibers against the parent fibers of amyloid fibers.
  • Seed preparation for fiber growth was performed by ultrasonic grinding of mature amyloid fibers using a micro-tip type sonicator (VCX 750, Sonics & Maerials, Inc., USA). Ultrasonic grinding was performed repeatedly by placing the sample on ice and under the probe. The on and off states were held for 5 seconds each. After each cycle of ultrasonic grinding including five on and four off states, the sample was placed on ice for 1 minute without ultrasonic waves to prevent the sample from moving. After 40 cycles of ultrasonic grinding, the amyloid powder was irradiated with TEM and used as a seed for growth in fiber form.
  • the first generation dissipated fibers were seeded in an alpha-synuclein solution in which 5% of the ultrasonically ground powder was present and grown under quiescent conditions.
  • the first age dissipation fiber was also used in the production of seeds for producing the second age dissipation fiber.
  • Hydrogel samples were prepared by cryofixation for SEM analysis.
  • the expanded and lyophilized hydrogel was coated with gold / palladium by sputtering using Emscope SC 400 (Electron Microscopy Sciences, USA).
  • Emscope SC 400 Electro Microscopy Sciences, USA.
  • the internal and surface structures of the hydrogels were examined with FE-SEM (SUPRA 55VP, Carl Zeiss, Germany) at 2.0 kV.
  • Amyloid hydrogels were prepared by centrifugal membrane filtration processes. A clear hydrogel was obtained on the Microcon YM-30 filtration membrane after about 20 repeated filtrations of alpha-synuclein granules in pH 6.5, 2 mg / ml 20 mM Mes. On the other hand, a hydrogel for capturing the HRP (Sigma, USA) enzyme was made of curly first-generation dissipative fibers. Centrifugal membrane filtration was performed at 14,000 xg until the solution passed through the membrane with a mixture of first-generation dissipated curly amyloid fibers and HRP.
  • HRP-capturing hydrogels were prepared by binding 1 ⁇ g HRP curly amyloid fibers with 2 mg of HRP in 20 mM Mes at pH 6.5. After HRP-hydrogels were collected via reverse centrifugation, the hydrogels were fully expanded for 1 hour in 20 mM Mes at pH 6.5. The HRP-capturing hydrogel was washed 10 times with fresh 20 mM Mes buffer to remove free HRP that was not bound or released from the hydrogel.
  • alpha-synuclein exhibits molecular level polymorphism by forming straight amyloid fibers and curly amyloid fibers, which show differences according to the fiberization process. This is due to the reaction conditions such as pH, temperature and small chemical ligands, which led to fiber polymorphism through molecular assembly instead of affecting the structural properties of each amyloid protein.
  • curly amyloid fibers through membrane filtration in parallel with straight amyloid fibers formed by agitated cultures is an alpha-synuclein amyloid that operates according to a nuclear-dependent fibrosis process model as well as a dual-cooperative fibrosis model involving intergranular granulation. It can support the proposal for creation.
  • Self-proliferating molecular level polymorphisms of alpha-synuclein amyloid fibers provide large amounts of curly amyloid fibers, strong fibers with distinct morphological differences.
  • Curly amyloid fibers enable the formation of new superstructure amyloid hydrogels suitable for enzymatic capture.
  • amyloid hydrogels can be used in three-dimensional matrix cell cultures for drug delivery, skin regeneration, neuronal regeneration and bone formation, Biomolecular entrapment, enzyme entrapment, nano-filter and biomarker development may be used in various fields of nanobiotechnology.
  • curly amyloid fibers are easily self-proliferating and can easily prepare first-generation and second-generation dissipated fibers whose specific characteristics are transmitted through the growth. In other words, it is possible to produce a large amount of mechanically strong curly fibers with a distinct shape difference. Easily produced dissipative fibers are also possible for various applications in the field of nanobiotechnology.

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Abstract

알파-시뉴클레인 유래 아밀로이드 섬유의 제조방법 및 이를 이용하는 방법이 개시되어 있다. 먼저, 알파-시뉴클레인을 배양하여 알파-시뉴클레인 과립체를 제조하도록 한다. 다음에, 상기 알파-시뉴클레인 과립체 다수를 조립하여 곱슬 아밀로이드 섬유를 제조한다. 교반 배양으로 형성되는 곧은 아밀로이드 섬유와 병행하여 막 여과 과정을 통한 곱슬 아밀로이드 섬유의 생성이 용이하며, 형성된 곱슬 아밀로이드 섬유는 나노바이오테크놀로지 분야에서 이를 이용한 다양한 응용이 가능하다.

Description

알파-시뉴클레인 유래 곱슬 아밀로이드 섬유의 제조방법, 이를 이용한 하이드로젤의 제조 방법 및 그 이용 방법
본 발명은 알파-시뉴클레인에서 유래된 곱슬 아밀로이드 섬유의 제조방법 및 이를 이용한 하이드로젤의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 알파-시뉴클레인의 섬유화 과정에서 얻어지는 곱슬 아밀로이드 섬유의 제조방법 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.
알파-시뉴클레인과 같은 단백질에 기반한 초구조체(suprastructure)의 형성은 세포의 생물 발생(biogenesis)에서부터 퇴행성 (degenerative) 질환에 이르기까지 다양한 범위의 생물학적 활성에 수반되는 중요한 현상이다. 이러한 초구조체는 인 비트로(in vitro) 조립을 통해 생물학적으로 적합한 새로운 재료를 생산하는데 이용된다. 따라서 초구조체 형성이 이루어지는 분자적 조립 메카니즘의 규명은 일반적인 생물 발생을 이해하는데 있어서 뿐만 아니라 나노 바이오테크놀로지 분야에의 응용을 위한 생물 재료 생산에 있어서 매우 중요하다.
알파-시뉴클레인은 파킨슨 병(Parkinson's disease; PD)과 같은 신경퇴행성 질병에서 루이체 형성에 참여하는 병리적 구성 성분이다. 이로부터 초구조체인 아밀로이드 섬유가 형성되는 메카니즘을 규명하는 것은 질병의 치료를 위한 전략을 수립하는 데도 필요하지만 단백질 섬유를 미래 산업에 응용하는 면에서도 중요한 일이다.
아밀로이드 섬유는 단백질이 매우 특이적인 자가 조립 과정을 통하여 변형된 것이다. 이는 매우 정연한 섬유 형태의 단백질 응집체로서 주로 교차 베타-병풍(cross β-sheet) 구조로 안정화 되어 있다고 알려져 있다. 아밀로이드는 부분적 오류 접힘(misfolded)을 갖는 단백질이 선택적인 분자 자가 조립 (self-assembly) 과정을 통해 무질서한 상태로부터 질서 정연한 구조로 전환됨으로써 형성되는 결과물이다. 성숙한 아밀로이드 섬유는 개개의 아밀로이드성 단백질의 분자 수준 구조적 이형(variations) 때문에 혹은 내외부 섬유상 상호작용 변화에 의해서 다형성(polymorphism)이 발생한다.
이러한 아밀로이드 형성은 세포 퇴화(cellular degeneration)의 독성 원인이 밝혀지지 않았음에도 불구하고 파킨슨병, 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD) 및 프라이온병(Prion disease)을 포함하는 신경퇴행성 질환과 깊은 관련을 맺고 있다. 아밀로이드 섬유는 생물학적 활성을 갖기도 하는데 예를 들면, 장내 세균(enterobacteria)의 바이오필름(biofilm) 형성, 곰팡이의 균사 형성, 곤충, 물고기 등의 알 외피 형성, 포유류의 멜라닌 형성 세포에서의 멜라닌 생합성, 인체 지혈(human hemostasis)에서 인자
Figure PCTKR2010003025-appb-I000001
의 활성화 등이 가능하게 한다.
아밀로이드 섬유는 거미줄에 버금가는 기계적 강도를 지닌 10-20nm 직경의 단백질 나노 섬유로 간주된다. 이 나노 규모의 생재료는 전도성 나노와이어 생산, 나노파티클의 정렬, 효소 고정화를 위한 기능적 주형으로의 이용 등에 대한 가능성을 갖고 있다. 또한 리퀴드 크리스탈, 하이드로젤 형성이 가능하다. 따라서 아밀로이드 섬유화의 다양한 방법에 대한 탐구는 바이오테크놀로지에서의 응용을 위한 다양한 기능성 나노 재료 생산에 실질적인 중요성이 있다고 할 것이다.
아밀로이드 생성에 대한 분자적 자가-조립 메카니즘으로는 핵-의존성 섬유화 과정 모델(nucleation-dependent fibrillation model)이 널리 알려져 있다. 이 모델에 의하면 먼저, 열역학적으로 불안정한 핵을 형성한다. 그 후, 주형에 대해 상보성을 갖는 기-구조화(pre-structured) 또는 무정형(unstructured) 상태의 모노머 단위체들이 핵에 부착되어감에 따라 섬유화 과정이 촉진되고 완성된다. 이러한 과정은 섬유화 키네틱스에 반영되는데 아밀로이드성 단백질의 교반 배양에서 섬유화 지체 단계(lag phase)를 거쳐 아밀로이드의 급격한 성장 단계(exponential growth phase)를 통하여 섬유화됨을 확인할 수 있다.
최근, 알파-시뉴클레인의 아밀로이드 생성을 극적으로 촉진시키는 실험에 대하여 면밀하게 조사함으로써 핵-의존성 모델과 비교되는 또 다른 이중-협력 섬유화 모델(double-concerted fibrillation model)이 본 발명자 등에 의해 제안되었다(Bhak, G., Lee, J.-H., Hahn, J.-S. & Paik, S. R. Granular assembly of α-synuclein leading to the accelerated amyloid fibril formation with shear stress. PLoS ONE 4, e4177(2009)). 상기 논문에는 이중-협력 섬유화 모델에서, 알파-시뉴클레인 섬유화 과정을 진행하는 중, 지체 단계 중간 지점에서 확보한 과립형 올리고머 종에 전단 스트레스를 가하면 올리고머의 기형성 구조에 미세한 변화가 발생하고, 이 올리고머들이 아밀로이드 섬유 성장 단위체 역할을 수행함으로써 섬유화 과정이 이루어지는 것으로 보고 되어 있다.
상기한 보고에는 알파-시뉴클레인의 섬유화 단계로서 기존의 핵-의존성 모델과 비교되는 또 다른 이중-협력 섬유화 모델도 가능하다는 점에 착안하여 수행된 연구 결과가 나타나 있다. 그런데 두 가지 모델에서 어떠한 메카니즘에 따라 섬유화가 진행되는지 또 형성되는 섬유는 서로 어떻게 다구조를 갖는지 등에 대한 면밀한 검토가 필요하고, 이에 더하여 얻어지는 섬유를 어떤 분야에 응용 가능한지에 대한 연구가 미비한 실정이다.
본 발명의 목적은 이와 같은 섬유 성장의 분자적 조립 메카니즘을 규명하는 것에 의해 확인된 새로운 형태의 알파-시뉴클레인 유래 아밀로이드 섬유의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기한 알파-시뉴클레인 유래 아밀로이드 섬유를 이용한 하이드로젤 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기한 하이드로젤을 다양한 바이오테크놀로지 분야에 적용하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 알파-시뉴클레인 유래 아밀로이드 섬유의 제조 방법은 알파-시뉴클레인을 배양하여 알파-시뉴클레인 과립체를 제조하는 단계 및 상기 알파-시뉴클레인 과립체 다수를 조립하여 곱슬 아밀로이드 섬유를 제조하는 단계를 포함하여 이루어진다.
일 실시예에 있어서, 상기 알파-시뉴클레인 과립체에 소정의 스트레스를 가하여 뒤틀린 구조 및/또는 기형성 구조를 갖도록 하고 이러한 뒤틀린 구조 및/또는 기형성 구조를 갖는 과립체 다수를 조립하여 상기 곱슬 아밀로이드 섬유를 제조한다.
일 실시예에 있어서, 상기 알파-시뉴클레인 과립체에 전단 스트레스를 가하는 것으로 상기 스트레스를 가하거나 원심력 이용 막 여과 공정을 수행하는 것으로 상기 스트레스를 가하도록 한다. 다르게는, 상기 알파-시뉴클레인 과립체에 헥산을 포함하는 유기 용매 처리를 수행하여 스트레스를 가할 수도 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 알파-시뉴클레인 과립체는 알파-시뉴클레인의 섬유화를 위한 배양 중 지체 단계 중에 얻어지는 과립형 올리고머 종이다.
일 실시예에 있어서, 상기 곱슬 아밀로이드 섬유는 평행 베타-병풍 구조 보다 역평행 베타-병풍 구조를 더 많이 포함한다. 또한 일 실시예에 있어서, 상기 곱슬 아밀로이드 섬유의 섬유 윤곽선의 길이(C L ; contour length)는 섬유의 2차원적 끝과 끝 거리(R 2D ; end-to-end distance)에 비해 짧다.
일 실시예에 있어서, 상기 곱슬 아밀로이드 섬유는 제1세 소산 및 제2세 소산을 포함하는 소산 아밀로이드 형성을 위한 자가-증식(self-propagation) 특성을 갖는다.
상기한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 알파-시뉴클레인을 배양하여 알파-시뉴클레인 과립체를 제조하는 단계 및 상기 알파-시뉴클레인 과립체 다수를 조립하여 곱슬 아밀로이드 섬유를 제조하는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조되는 알파-시뉴클레인 유래 곱슬 아밀로이드 섬유를 이용하여 하이드로젤을 제조하는 방법을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 하이드로젤은 HRP(horseradish peroxidase) 효소를 포획 가능한 것이고 상기 하이드로젤을 동결 건조하여 얻어지는 섬유 네트워크의 평균 구멍 크기는 10 내지 100nm 범위이다.
상기한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이드로젤을 이용하여 약물 담체(drug delivery), 조직 공학(tissue engineering), 신경 재생(neuronal regeneration) 및 뼈 생성(bone formation)을 위한 3차원 매트릭스 세포 배양체(3D-matrix cell culture), 바이오 분자 담체(biomolecular entrapment), 효소 담체(enzyme entrapment), 나노 여과체(nano-filter) 및 바이오 마커(biomarker)중 어느 하나를 제조하는 방법에 의해 달성된다.
상술한 바와 같이 본 발명에서는 새로운 모델을 적용하는 것으로 분자적 자가-조립 메카니즘에 따라 알파-시뉴클레인 유래 곱슬 아밀로이드 섬유를 용이하게 생성할 수 있으며, 이렇게 제조되어 유연성, 기계적 강도 및 형태적 특이성을 갖는 상기 곱슬 아밀로이드 섬유를 나노 바이오테크놀로지 분야에서 다양하게 응용하는 것이 가능하다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 구체적으로 설명하고자 한다.
도 1은 알파-시뉴클레인 과립체의 제조 과정에서 배양 시간에 따른 과립체의 형성 수준을 모니터하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 알파-시뉴클레인의 배양에 의해 형성된 과립체에 대한 음성 염색된 TEM 영상이다.
도 3 및 4는 알파-시뉴클레인에서 유도된 곧은 아밀로이드 섬유에 대한 TEM 사진으로서, 도 3은 0.2㎛ 스케일바와 비교하여 나타낸 것이고, 도 4는 0.5㎛ 스케일바와 비교하여 나타낸 것이다.
도 5 및 6은 알파-시뉴클레인에서 유도된 곱슬 아밀로이드 섬유에 대한 TEM 사진으로서, 도 5는 0.2㎛ 스케일바와 비교하여 나타낸 것이고, 도 6은 0.5㎛ 스케일바와 비교하여 나타낸 것이다.
도 7 및 8은 분자 자가-조립 메카니즘에 의한 아밀로이드 섬유 생성 과정을 나타내는 개략적인 모형도로서, 도 7은 곧은 아밀로이드 섬유에 대한 것이고, 도 8은 곱슬 아밀로이드 섬유에 대한 것이다.
도 9 및 10은 단일 아밀로이드 섬유의 AFM 영상으로서, 도 9는 곱슬 아밀로이드 섬유에 대한 것이고, 도 10은 곧은 아밀로이드 섬유에 대한 것이다. 각 아밀로이드 섬유에 대한 추적 영상이 오른쪽 아래 삽입화에 나타나 있다.
도 11은 아밀로이드 섬유 윤곽선의 길이(C L )에 대한 섬유의 끝과 끝 거리(R 2D )를 나타낸 그래프로서, 막힌점(●)은 곱슬 아밀로이드 섬유에 대한 것이고, 열린점(○)은 곧은 아밀로이드 섬유에 대한 것이다. 곧은 아밀로이드 섬유(SAF) 및 곱슬 아밀로이드 섬유(CAF)의 평균 지속 길이(P av )가 왼쪽 윗부분 삽입화에 나타나 있다.
도 12 및 13은 원심 분리 여과막에 의해 가해지는 전단 스트레스에 대한 아밀로이드 섬유의 파손 저항성을 보여주기 위한 TEM 영상으로서, 도 12는 곱슬 아밀로이드 섬유에 대한 것이고, 도 13은 곧은 아밀로이드 섬유에 대한 것이다.
도 14 및 15는 아밀로이드 섬유에 대한 초음파 처리 전후의 섬유 윤곽선의 길이(C L ) 분산도 변화를 나타내는 그래프로서 도 14는 곱슬 아밀로이드 섬유에 대한 것이고, 도 15는 곧은 아밀로이드 섬유에 대한 것이다. 각 섬유에 대한 초음파 처리 전후의 AFM 영상이 삽입화에 나타나 있다.
도 16 및 17은 알파-시뉴클레인의 섬유화 다형체에 대한 ATR-FTIR 스펙트럼으로서, 도 16은 곧은 아밀로이드 섬유에 대한 것이고, 도 17은 곱슬 아밀로이드 섬유에 대한 것이다.
도 18 및 19는 아밀로이드 섬유에 대한 자가-증식 과정을 개략적으로 나타낸 도면으로서, 도 18은 곱슬 아밀로이드 섬유에 대한 것이고, 도 19는 곧은 아밀로이드 섬유에 대한 것이다.
도 20 내지 도 23은 모 곱슬 아밀로이드 섬유로부터 제2세 소산 섬유까지의 자가-증식 과정에서 얻어지는 각 섬유에 대한 TEM 영상으로서 도 20은 모섬유에 대한 것이고, 도 21은 종자 섬유에 대한 것이고, 도 22는 제1세 소산 섬유에 대한 것이고, 도 23은 제2세 소산 섬유에 대한 것이다.
도 24 내지 도 27은 모 곧은 아밀로이드 섬유로부터 제2세 소산 섬유까지의 자가-증식 과정에서 얻어지는 각 섬유에 대한 TEM 영상으로서 도 24는 모섬유에 대한 것이고, 도 25는 종자 섬유에 대한 것이고, 도 26은 제1세 소산 섬유에 대한 것이고, 도 27은 제2세 소산 섬유에 대한 것이다.
도 28은 기울어진 유리 슬라이드 표면상에서 안정화된 곱슬 아밀로이드 하이드로젤 사진이다.
도 29는 곱슬 아밀로이드 하이드로젤의 광학적인 투과도를 보여주기 위한 사진이다.
도 30은 하이드로젤내 곱슬 아밀로이드 섬유의 싸이오플라빈-티 결합 형광을 CLSM으로 가시화한 형광 이미지이다.
도 31은 도 30에서 사용된 하이드로젤내 곱슬 아밀로이드 섬유를 광학 현미경으로 관찰하여 얻어진 광학이미지이다.
도 32는 동결 건조된 곱슬 아밀로이드 하이드로젤을 구성하는 곱슬 아밀로이드 네트워크에 대한 FE-SEM 사진이다.
도 33은 HRP 유무에 따른 TMB 산화 차이를 나타내는 흡수 스펙트럼으로서, 그래프 "a"는 하이드로젤 형성 전에 첨가한 HRP가 하이드로젤내에 포획됨으로써 TMB 산화를 나타내는 스펙트럼이고, 그래프 "b"는 하이드로젤 형성 후 HRP를 첨가하여 HRP가 포획 되지 않았기 때문에 TMB가 산화되지 않은 스펙트럼이다.
도 34는 HRP 효소의 반복 재사용 활성도를 나타내는 스펙트럼으로서, 막힌점(●)을 대표하는 그래프 "a"는 곱슬 아밀로이드 하이드로젤 내에 포획된 효소에 대한 활성도를 나타내고, 열린점(○)을 대표하는 그래프 "b"는 콜라겐계 하이드로젤 내에 포획된 효소에 대한 활성도를 나타낸다.
도 35 및 36은 하이드로젤의 세공에 대한 FE-SEM 사진으로서, 도 35는 곱슬 아밀로이드 하이드로젤에 대한 것이고, 도 36은 콜라겐계 하이드로젤에 대한 것이다.
도 37은 열에 대한 HRP 활성 유지를 확인하기 위한 특정 파장에서의 TMB 흡수도를 나타내는 스펙트럼으로서, 막힌점(●)을 대표하는 그래프 "a"는 곱슬 아밀로이드 하이드로젤 내에 포획된 HRP 효소에 대한 TMB 산화 흡수도를 나타내고, 열린점(○)을 대표하는 그래프 "b"는 포획되지 않고 자유로운 HRP 효소에 대한 TMB 산화 흡수도를 나타낸다.
도 38은 장시간 열에 대한 HRP 효소의 활성도를 나타내는 그래프로서, 막대그래프 "a"는 곱슬 아밀로이드 하이드로젤 내에 포획된 HRP 효소에 대한 활성도를 나타내고, 막대그래프 "b"는 포획되지 않고 자유로운 HRP 효소에 대한 활성도를 나타낸다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예들에 따른 알파-시뉴클레인 유래 아밀로이드 섬유의 제조 방법에 대하여 상세하게 설명한다. 하기에 나타난 실시예는 이 기술에 숙련된 자들이 본 발명을 실시할 수 있게 충분히 상세하게 기술한다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 실시예들을 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "이루어진다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명에서는 '곧은' 아밀로이드 섬유(straight amyloid fibrils; SAF) 다형체와 '곱슬' 아밀로이드(curly amyloid fibrils; CAF) 섬유 다형체가 갖는 자가-증식의 분자 수준 다형성을 비교 분석함으로써 두 가지 모델 모두가 알파-시뉴클레인 섬유화 과정에 실질적으로 작용한다는 것을 확인하였다. 두 가지 다형성 아밀로이드 섬유는 같은 아밀로이드성 단백질인 알파-시뉴클레인으로부터 유도되는데 이들은 각각 서로 다른 방법인 모노머의 교반 배양과 과립형 올리고머 종의 원심력 이용 막 여과(centrifugal membrane filtration) 과정으로 형성된다. 이 두 가지 방법은 각각 핵-의존성 섬유화 모델과 이중-협력 섬유화 모델을 따른다.
즉, 알파-시뉴클레인은 인 비트로 아밀로이드 생성 과정에서 관찰되는 바와 같이 교반 배양에 의해 곧은 아밀로이드 섬유를 형성할 수 있다. 곧은 아밀로이드 섬유는 수시간에 걸친 교반 배양으로 형성된다. 즉, 열역학적으로 불안정한 핵이 형성되면 여기에 모노머 단위체들이 부착해감에 따라 섬유화 과정이 진행된다. 이러한 과정은 섬유화 키네틱스에 반영되는데 아밀로이드성 단백질의 교반 배양에서 섬유화 지체 단계를 거쳐 아밀로이드의 급격한 성장 단계를 거치게 된다. 형성되는 곧은 아밀로이드 섬유들은 섬유의 양이 많아지면서 서로 겹쳐질 때 만나는 양상이 예리한 각도로 상호작용을 하고 상대적으로 적은 뒤엉킴 상태를 유지한다.
한편, 알파-시뉴클레인 과립형 올리고머 종에 원심력 이용 막여과 하거나 헥산 유기 용매 처리를 하는 등 일종의 스트레스를 가하면 올리고머 기형성 구조 내에서 미세한 변화가 발생하고 이들이 아밀로이드 섬유 성장 단위체 역할을 수행함으로써 섬유화 과정이 진행되고 곱슬 아밀로이드 섬유가 형성된다. 과립체인 올리고머 종은 모노머 상태의 가용성 알파-시뉴클레인을 일반 교반 배양했을 때 지체 단계에서 획득할 수 있다.
곧은 아밀로이드 섬유는 대부분을 구성하고 있는 평행 베타-병풍 구조에 비해 곱슬 아밀로이드 섬유는 역평행 베타-병풍 구조를 더 많이 포함하고 있는데, 이에 따라 구조적 유연성 및 기계적 강도와 함께 형태적 특이성을 갖게 된다.
또한 상기 원심력 이용 막여과 공정을 반복적으로 수행하는 것으로 곱슬 아밀로이드 섬유의 양을 증가시킬 수 있다. 곱슬 아밀로이드 섬유는 구불구불한 모양의 특성상 섬유의 양이 많아지면서 서로 겹쳐서 만나는 양상이 부드러운 각도로 상호작용하게 되고 상당한 수준으로 서로 뒤엉킴으로써 섬유 네트워크를 형성하게 되는 것이다.
이와 같이 두 가지 방법에 적용되는 상이한 섬유화 모델에 따라 다른 형태로 얻어지는 곧은 아밀로이드 섬유와 곱슬 아밀로이드 섬유는 유사한 특성을 나타내기도 하지만 전혀 상이한 특성을 나타내는 것도 확인할 수 있었다.
명확한 차이점은 다음과 같다. 즉, 이중-협력 섬유화 모델을 통해 얻어지는 곱슬 섬유의 축적은 단백질 섬유의 삼차원 네트워크를 이루는 아밀로이드 하이드로젤을 형성한다. 이는 새로운 계층적 초분자체를 형성하고, 나노매트릭스 형태로 형성된 초분자체는 예컨대, 호스레디쉬 퍼옥시데이즈 효소 포획(enzyme entrapment)을 위한 삼차원의 나노-스케일 단백질 섬유 네트워크를 제공한다. 특히 형성된 나노 섬유 네트워크는 예컨대, 호스레디쉬 퍼옥시데이즈의 다중 효소 작용(효소 반응을 반복적으로 재사용함을 의미) 및 열처리에 대해 효소 활성 손실을 막아주는 역할을 한다. 결국, 곱슬 아밀로이드 섬유의 나노 단위 섬유 네트워크는 조직 공학, 약물 전달, 바이오 센서의 개발을 포함하는 나노바이오테크놀로지 분야에 다양하게 적용될 수 있음을 확인할 수 있다.
본 발명에 의하면 동일한 아밀로이드성 단백질인 알파-시뉴클레인이 섬유화 과정의 차이에 따라 두 가지 다른 형태의 아밀로이드 섬유인 곱슬 아밀로이드 섬유와 곧은 아밀로이드 섬유로 변환되는 것을 확인할 수 있다. 두 형태의 아밀로이드 섬유 중에서 곱슬 아밀로이드 섬유는 이중-협력 섬유화 모델에 입각하여 알파-시뉴클레인 과립체인 올리고머 종에 대하여 원심력 막 여과와 같은 소정의 스트레스성 처리를 통하여 주로 형성되고, 곧은 아밀로이드 섬유는 주로 핵-의존성 섬유화 모델에 입각하여 모노머 상태의 알파-시뉴클레인에 대한 교반 배양으로 형성된다.
곧은 아밀로이드 섬유의 대부분을 구성하고 있는 평행 베타-병풍 구조에 비해 곱슬 아밀로이드 섬유에 더 많이 포함되어 있는 역평행 베타-병풍 구조는 구조적 유연성, 기계적 강도 및 형태적 특이성을 나타낸다. 두 가지 다형체들은 자가-증식 특성을 가지고 있어서 종자-의존성 섬유화 과정을 통해 제1세 소산(daughter) 아밀로이드 섬유와 제2세 소산(granddaughter) 아밀로이드 섬유에 형태적 특이성이 그대로 유전된다는 것이 또한 확인되었다.
이에 더하여, 곱슬 아밀로이드 섬유가 축적되면 단백질 섬유의 3차원 네트워크로서 아밀로이드 하이드로젤을 형성하게 된다. 하이드로젤은 예를 들어 효소 포획을 위한 나노매트릭스로 사용될 수 있다. 이러한 하이드로젤은 예컨대, 호스레디쉬 퍼옥시데이즈의 다중 효소 작용(multiple catalyses)을 안정되게 유지시켜 주고 열처리에 의한 효소 활성의 손실을 막아 주는 효과가 있다.
이하, 본 발명에 따른 알파-시뉴클레인 유래 아밀로이드 섬유의 제조 과정 및 이를 이용하는 방법에 관하여 첨부된 도면을 참고로 하여 순서대로 설명하기로 한다. 상술한 각종 실험과 분석을 통하여 얻어지는 결과도 첨부된 도면을 참고로 하여 좀 더 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 알파-시뉴클레인 과립체(granule)의 제조 과정에서 배양 시간에 따른 과립체의 형성 수준을 모니터하여 나타낸 그래프이다.
알파-시뉴클레인 섬유화 키네틱스가 싸이오플라빈-티 결합 형광에 대하여 모니터 되었다. 37℃에서 알파-시뉴클레인 1㎎/㎖ 가 20mM Mes (pH 6.5) 내에서 교반하는 중에 배양되었다. 올리고머 과립체가 지체 단계 중에 얻어졌는데, 도면에서 화살표로 나타낸 부분은 지체 단계가 끝나기 직전의 시점으로서 약 17 시간 시점임을 확인할 수 있었다.
통상적으로, 아밀로이드 섬유의 형성 과정은 싸이오플라빈-티 결합 형광으로 모니터하게 된다. 이를 통해 얻어지는 알파-시뉴클레인 섬유화 키네틱스는 지체 단계(lag phase), 급격한 성장 단계 (exponential grow phase) 및 성장이 정체된 단계 (stationary phase)로 구분할 수 있다. 이 세단계에 대한 키네틱스가 완전히 얻어지면 지체 단계 시간이 결정되고 지체 단계가 끝나기 직전의 시점에서 과립체를 수득하게 된다. 과립체는 대부분 지체 기간 동안 형성되기 때문이다.
도 2는 알파-시뉴클레인의 배양에 의해 형성된 과립체에 대하여 음성 염색된 TEM 영상이다. 스케일 바는 0.5㎛를 나타낸다. 도면으로부터 과립체가 형성되었음을 확인할 수 있다.
알파-시뉴클레인의 과립형은 섬유화를 위한 배양 중 지속적인 교반 조건하에서 수득된다. AFM 이나 TEM을 이용하여 형성되는 양상이나 개체수를 관찰할 수 있다. 과립체를 수득한 단계에서는 무시할 수 있는 양의 알파-시뉴클레인 모노머를 포함하는 것으로 보이며 동적인 광분산법에 의해 과립체의 형성에 대한 모니터가 가능하다. 그러나 크기-배제 크로마토그래피로 과립체와 모노머를 분리할 수는 없는데 이는 과립체가 다시 모노머 상태로 되돌아가기 때문인 것으로 생각된다. 이러한 사실은 과립체가 준-안정화 상태(pseudo-stable state) 이기 때문으로 생각된다. TEM 영상을 통하여 평균 입경은 약 18.9±2.6nm 일 것으로 예측된다. 평균 중량은 약 159 kDa 정도로서 알파-시뉴클레인 모노머의 중량이 약 14.4 kDa 이므로 약 11개의 알파-시뉴클레인 모노머가 조립되어 과립체를 형성하는 것으로 예측된다.
도 3 및 4는 곧은 아밀로이드 섬유에 대한 TEM 사진으로서, 도 3은 0.2㎛ 스케일바와 비교하여 나타낸 것이고, 도 4는 0.5㎛ 스케일바와 비교하여 나타낸 것이다.
도 3 및 4는 약 37℃ 온도에서 알파-시뉴클레인 모노머를 약 100 시간 동안 약 200 rpm의 속도로 교반 배양하여 아밀로이드 섬유를 형성하고, 얻어진 섬유를 음성 염색(negatively stained)하여 얻어진 TEM 사진이다. 형성된 섬유는 평균 직경이 15.2nm 인 곧은 아밀로이드 섬유임을 확인할 수 있다.
도 5 및 6은 곱슬 아밀로이드 섬유에 대한 TEM 사진으로서, 도 5는 0.2㎛ 스케일바와 비교하여 나타낸 것이고, 도 6은 0.5㎛ 스케일바와 비교하여 나타낸 것이다.
과립형 올리고머 종은 도 1을 참고로 하여 설명한 바와 같이 20 mM Mes, pH 6.5 버퍼에 녹은 1 ㎎/㎖ 농도의 가용성 알파-시뉴클레인을 일반 교반 배양했을 때 지체 단계 중에 획득할 수 있다. 곱슬 아밀로이드 섬유는 알파-시뉴클레인 과립형 올리고머 종을 약 12 분 동안의 원심력 이용 막여과를 통하여 생산가능하며, 예컨대, 2분 주기로 20번 정도 반복하여 여과하는 것으로 곱슬 아밀로이드 섬유의 양을 증가시키면 이는 부드러운 각도로 상호작용하게 되고 상당히 뒤엉킴으로써 도 6에 나타난 바와 같이 섬유 네트워크가 발생하게 된다.
원심력 막여과에 의한 곱슬 아밀로이드 섬유의 생성은 막 표면을 빠른 속도로 흐르는 용매에 의해 발생되는 전단 스트레스에 의하여 과립체에 구조적 변화가 야기되고 이들의 자기조립으로 인하여 이루어지는 것으로 생각된다. 아밀로이드 섬유의 형성은 이 외에도 교반, 흔듦, 기계적 교반 등과 같은 물리적 스트레스에 의해서도 영향을 받는 것으로 생각된다.
과립체에 대한 구조적 변화에 의한 섬유화는 일종의 스트레스에 의한 것으로서 이러한 구조적 뒤틀림은 헥산 용매 내에서도 이루어지는 것으로 확인되었다. 헥산 내에서 구조적 변형이 일어나는 원인에 대해서는 좀 더 면밀한 검토가 필요하나 과립형의 올리고머 종은 물리적 영향에 매우 민감하다는 것을 알 수 있다. 어떠한 방식이든 과립체의 구조적 변형은 곱슬 아밀로이드 섬유화 과정을 구현하는데 필수적으로 요구되는 현상이다.
도 7 및 8은 아밀로이드 섬유 생성 과정을 나타내는 개략적인 모형도로서, 도 7은 곧은 아밀로이드 섬유에 대한 것이고, 도 8은 곱슬 아밀로이드 섬유에 대한 것이다.
도 7은 알파-시뉴클레인의 핵-의존성 섬유화 모델을 요약하여 나타낸 개략적인 모형도이다. 핵 중심체는 구조적 변화로 가용성 모노머 단백질이 부착하는 주형으로 작용하여 불용성 곧은 아밀로이드 섬유를 생산하는 역할을 한다. 즉, 모노머는 열역학적으로 불안정한 핵을 형성한 후, 주형에 대해 상보성을 갖는 기-구조화 또는 무정형 상태의 모노머 단위체들이 핵에 부착해감에 따라 모노머 증식이 이루어지고 이러한 증식을 통하여 섬유화 과정이 촉진된다. 이러한 과정에 따라 곧은 아밀로이드 섬유가 형성되는 것이다.
도 8은 알파-시뉴클레인의 이중-협력 섬유화 모델을 요약하여 나타낸 개략적인 모형도이다. 모노머를 배양하여 올리고머 종의 과립체를 형성하고, 얻어진 과립체에 스트레스를 가하여 구조적 뒤틀림이 일어나게 한다. 올리고머 종은 미립자 상태로 전단 스트레스와 같은 물리적 영향에 민감하게 된다. 원심력 이용 여과로 가해지는 전단 스트레스로 인하여 기형성(preformed) 과립형(granular) 올리고머 종의 구조적 뒤틀림이 일어난 후 과립체간의 조립이 일어나면서 곱슬 아밀로이드 섬유는 빠르게 생성된다.
곧은 아밀로이드 섬유와 비교하여 곱슬 아밀로이드 섬유의 생물리적 및 생화학적 특성들을 조사하여 섬유의 유연성/강도, 구조적 특징, 자가-증식 특성을 살펴보았다. 섬유 윤곽선의 길이 (C L )와 개개 섬유의 2차원적 끝과 끝 거리 (R 2D ) 측정을 위해 개발한 알고리즘을 이용하여 곱슬 아밀로이드 섬유와 곧은 아밀로이드 섬유에 대한 유연성을 평가하였다. 운모 표면 위의 각 아밀로이드 다형체 50개체 이상에 대한 AFM 이미지를 알고리즘으로 분석하여 섬유 형태에 따라 아밀로이드를 재이미지화 하였다.
도 9 및 10은 단일 아밀로이드 섬유의 AFM 영상으로서, 도 9는 곱슬 아밀로이드 섬유에 대한 것이고, 도 10은 곧은 아밀로이드 섬유에 대한 것이다(2.5㎛ x 2.5㎛). 각 아밀로이드 섬유에 대한 추적 영상이 오른쪽 아래 삽입화에 나타나 있다.
도 11은 아밀로이드 섬유의 섬유 윤곽선의 길이(C L )에 대한 끝과 끝 거리(R 2D )를 나타내는 그래프로서, 막힌점(●)은 곱슬 아밀로이드 섬유에 대한 것이고, 열린점(○)은 곧은 아밀로이드 섬유에 대한 것이다. 곧은 아밀로이드 섬유(SAF) 및 곱슬 아밀로이드 섬유(CAF)의 평균 지속 길이 (average persistence length; P av )가 왼쪽 윗부분 삽입화에 나타나 있다.
그래프에 나타난 바와 같이 성숙 곱슬 아밀로이드 섬유의 최대 C L 은 6.0㎛인 반면 곧은 아밀로이드 섬유의 최대 C L 은 3.2㎛ 정도 이다. 이는 곱슬 아밀로이드 섬유가 곧은 아밀로이드 섬유에 비해 약 두 배 가량 더 길게 형성되었음을 의미한다. 그리고 곧은 아밀로이드 섬유의 C L 과 R 2D 는 거의 동일한데, 이러한 결과는 곧은 아밀로이드 섬유가 주로 곧은 형태로 존재함을 의미한다. 반면에 곱슬 아밀로이드 섬유의 R 2D 수치들은 분산된 분포에도 불구하고 C L 에 비해 매우 짧은데, 이는 곱슬 아밀로이드 섬유가 구부러진 곱슬 형태임을 말해 준다.
C L 과 R 2D 의 수학통계적 분석에 의하면 두 다형체의 평균 지속 길이가 10의 3승 이상 크게 차이가 남을 알 수 있다. 삽입화에서 막힌점(●)에 대응되는 1.7 x 10-1㎛의 P av 값은 곱슬 아밀로이드 섬유가 매우 유연하다는 것을 의미하는 반면에, 열린점(○)에 대응되는 1.4 x 102㎛의 P av 값은 곧은 아밀로이드 섬유가 매우 뻣뻣하다는 것을 의미한다. 곱슬 아밀로이드 섬유의 이러한 유연함은 원심력 이용 막 여과에 의해 가해지는 전단 스트레스에 의해서도 잘 부러지지 않는 우수한 특성을 제공해 준다.
도 12 및 13은 원심 분리 여과막에 가해지는 전단 스트레스에 대한 아밀로이드 섬유의 파손 저항성을 보여주기 위한 TEM 영상으로서, 도 12는 곱슬 아밀로이드 섬유에 대한 것이고, 도 13은 곧은 아밀로이드 섬유에 대한 것이다. 도면에서 화살표는 여과 단계를 수행하기 전후를 나타낸다.
5분 주기의 반복 여과 과정을 30회 수행한 후에 아밀로이드 섬유를 관찰하였다. 도 12에 나타난 바와 같이 여과 전과 여과 후를 비교할 때 곱슬 아밀로이드 섬유의 최종 구조는 대체로 잘 유지가 되었다. 반면, 도 13에 나타난 바와 같이 곧은 아밀로이드 섬유의 경우에는 여과 전과 여과 후를 비교할 때 여과 후에는 거의 모든 섬유가 조각으로 부서짐을 확인할 수 있다. 사진에서 스케일 바는 0.5㎛를 나타낸다. 이러한 결과는 이중-협력 섬유화 모델을 적용할 때 곱슬 아밀로이드 섬유는 여과 과정에서 섬유 형태가 부서지지 않고 따라서 핵-의존성 섬유화 과정을 따르지 않음을 재확인 시켜준다.
다음에는, 각 아밀로이드 섬유에 대하여 초음파 처리를 수행하고 처리 전후 곱슬 아밀로이드 섬유와 곧은 아밀로이드 섬유의 기계적 강도를 비교해 보았다.
도 14 및 15는 아밀로이드 섬유에 대한 초음파 처리 전후의 C L 분산도 변화를 나타내는 그래프로서, 도 14는 곱슬 아밀로이드 섬유에 대한 것이고, 도 15는 곧은 아밀로이드 섬유에 대한 것이다. 초음파 처리는 3초 동안 각각 작동/멈춤 하는 주기를 20회 반복하는 간헐성 초음파 처리로 수행하였다. 초음파 처리 전후에서의 섬유들과 조각들의 C L 를 상술한 알고리즘으로 분석하였다. 왼쪽 윗부분 삽입화에는 섬유/분체의 AFM 형태(5㎛ x 5㎛)가 나타나 있다. 화살표는 아밀로이드 섬유에 대한 초음파 분쇄 공정을 수행하기 전후를 의미한다.
도 14를 참고하면, 초음파 처리 후 곱슬 아밀로이드 섬유의 C L 분포가 다소 넓어지기는 했으나 처리전과 비교할 때 초음파에 의해 크게 영향을 받지 않았음을 확인할 수 있다. 반면에 도 15를 참고하면, 곧은 아밀로이드 섬유는 본래 평균 길이 3.4㎛로부터 초음파 처리 후 약 300nm의 작은 단편으로 분해되었음을 확인할 수 있다. 곱슬 아밀로이드 섬유가 곧은 아밀로이드 섬유보다 월등하게 강하다는 것을 확인할 수 있다.
ATR-FTIR(attenuated total reflectance fourier transformation infrared) 스펙트로미터를 이용하여 아밀로이드 섬유의 구조적 특징을 비교분석하였다.
도 16 및 17은 아밀로이드 섬유에 대한 ATR-FTIR 스펙트럼으로서, 도 16은 곧은 아밀로이드 섬유에 대한 것이고, 도 17은 곱슬 아밀로이드 섬유에 대한 것이다. 굵은 곡선으로 나타난 아마이드 Ⅰ 프로파일 (1600 내지 1700㎝-1)의 분석은 단백질의 2차 구조를 결정하는데 사용되는 방식이다.
도 16 및 17을 참조하면, 곧은 아밀로이드 섬유 및 곱슬 아밀로이드 섬유가 나타내는 구별 가능한 스펙트럼에 대한 보정(deconvolution)은 5개의 요소 1619㎝-1, 1630㎝-1, 1650㎝-1, 1668㎝-1 및 1683㎝-1로 구성되는 뚜렷한 패턴이다. 곧은 아밀로이드 섬유 및 곱슬 아밀로이드 섬유의 종합적인 스펙트럼(굵은선)에 대한 구성 요소와 2차 구조의 상대적인 기여가 표 1에 기재되어 있다.
표 1
Figure PCTKR2010003025-appb-T000001
곧은 아밀로이드 섬유 스펙트럼은 1630㎝-1에서 주피크를 나타내었는데 이는 평행 베타-병풍 구조에 해당하며 이러한 평행 베타-병풍 구조는 전체에서 43.3%를 차지하고 있다. 곧은 아밀로이드 섬유는 또한 1619㎝-1와 1683㎝-1에서 확인되듯이 역평행 베타-병풍 구조를 포함하고 있는데 상대적인 기여는 각각 19.9% 및 3.5% 이다. 이러한 베타 구조는 1668㎝-1에서 19.5%의 베타-턴을 수반한다. 다른 부분들은 알파-헬릭스 구조나 무작위 코일 구조로 이루어져 있는데, 13.8%의 비율로 1650㎝-1에서 관찰된다.
한편, 곧은 아밀로이드 섬유와 비교할 때 곱슬 아밀로이드 섬유의 경우에는 1619㎝-1, 1650㎝-1 및 1683㎝-1의 피크가 각각 29.8%, 21.3% 및 6.1% 로 증가한 반면, 1630㎝-1에서의 주된 피크는 23.9% 수준으로 감소한 것을 알 수 있다. 이러한 데이터는 곧은 아밀로이드 섬유에서 상당량을 차지하고 있는 평행한 베타-병풍 구조가 곱슬 아밀로이드 섬유의 알파-헬릭스/무작위 코일을 동반하는 역평행 베타-병풍 구조로 변했다는 사실을 입증해 준다. 따라서, 2차 구조 변경은 곧은 아밀로이드 섬유와 곱슬 아밀로이드 섬유가 2차 구조상의 차이를 갖는 분자 수준의 다형체임을 의미한다. 이에 더하여, 짧은 루프로 연결된 역평행 베타-병풍 구조를 갖는 곱슬 아밀로이드 섬유는 형태상 휘기 쉽게 된다. 역평행 베타-병풍 구조내의 N-과 C-터미니의 얼터너티브 위치(alternative orientation)는 곧은 아밀로이드 섬유보다 곱슬 아밀로이드 섬유가 더 안정하다는 것을 의미한다.
아밀로이드 섬유들의 특성을 설명하기 위해 아밀로이드 섬유화 과정의 결과 형성되는 생성물 두 가지로부터 얻어진 종자와 알파-시뉴클레인 모노머를 함께 배양함으로써 곱슬 아밀로이드 섬유와 곧은 아밀로이드 섬유 다형체의 자가-증식 특성을 조사하였다.
도 18 및 19는 아밀로이드 섬유에 대한 자가-증식 과정을 개략적으로 나타낸 도면으로서, 도 18은 곱슬 아밀로이드 섬유에 대한 것이고, 도 19는 곧은 아밀로이드 섬유에 대한 것이다.
두 가지 섬유 모두에 대하여 모 섬유를 초음파 처리하여 만든 단편을 제1세 소산 아밀로이드 성장을 위한 종자로 이용하였다. 여기서 성장된 아밀로이드인 제1세 소산 아밀로이드를 다시 초음파 처리하여 종자를 만들고, 이를 알파-시뉴클레인 모노머 존재 하에 제2세 소산 아밀로이드 형성에 대한 종자로 이용하였다. 5%의 종자가 존재하는 일반적 정지(quiescent) 배양에서 종자가 없는 모노머 단백질 배양과 비교하여 섬유화 양이 극적으로 향상됨을 확인할 수 있었다.
도 18을 참고하면, 초음파 분쇄된 모 곱슬 아밀로이드 섬유 단편 존재 하에 제1세 소산 섬유는 모 곱슬 아밀로이드 섬유의 구불구불한 표면 구조를 그대로 물려받았다. 제1세 소산 섬유의 곱슬한 형태는 또한 제2세 소산 섬유에게도 그대로 전달되었다.
도 19를 참고하면, 곧은 아밀로이드 섬유의 경우에도 제1세 및 제2세 소산 섬유들은 모 곧은 아밀로이드 섬유의 곧은 섬유 형태가 그대로 유전되었다.
따라서 종자는 다음 세대에서 성숙된 아밀로이드 섬유의 형태를 결정짓는 요인이라는 것을 확인할 수 있다. 즉, 분자적 특성이 소산 섬유에서도 그대로 유지되는 것을 통하여 곱슬 아밀로이드 섬유 및 곧은 아밀로이드 섬유 다형체 아밀로이드 섬유의 자가 증식 특성이 모 아밀로이드 섬유의 형태적 유전으로 나타나는 것을 확인할 수 있다.
도 20 내지 도 23은 모 곱슬 아밀로이드 섬유로부터 제2세 소산 섬유까지의 자가-증식 과정에 따른 각 단계에서의 섬유에 대한 TEM 영상으로서 도 20은 모섬유에 대한 것이고, 도 21은 종자 섬유에 대한 것이고, 도 22는 제1세 소산 섬유에 대한 것이고, 도 23은 제2세 소산 섬유에 대한 것이다.
도 24 내지 도 27은 모 곧은 아밀로이드 섬유로부터 제2세 소산 섬유까지의 자가-증식 과정에 따른 각 단계에서의 섬유에 대한 TEM 영상으로서 도 24는 모섬유에 대한 것이고, 도 25는 종자 섬유에 대한 것이고, 도 26은 제1세 소산 섬유에 대한 것이고, 도 27은 제2세 소산 섬유에 대한 것이다.
도 20 내지 도 23 및 도 24 내지 도 27에서 스케일 바는 0.2㎛를 나타내고 오른쪽 아래 부분의 삽입화는 각 섬유에 대하여 세배 확대한 영상을 나타낸다.
일반적으로, 새로운 구조를 갖는 섬유로부터는 새로운 특성을 기대하게 된다. 곱슬 아밀로이드 섬유는 실제로 광범위한 3차원적 섬유 메쉬워크(mashwork)를 갖는 새로운 계층적(hierarchical) 초구조의 아밀로이드 하이드로젤로 전환되었다. 이러한 하이드로젤 형성은 알파-시뉴클레인 과립체의 원심력 이용 막 여과에서 나타남을 확인할 수 있었다. 초기에는 2분 주기로 반복 여과를 5회 이상 수행했을 때 작은 조각의 하이드로젤이 관찰되었다. 여과 횟수가 증가할수록 하이드로젤 조각들은 막 위에서 더 큰 하이드로젤 덩어리로 합쳐졌다. 여과 횟수가 많을수록 다량의 하이드로젤을 수득할 수 있으나 필요에 따라 적절히 그 횟수를 조절하도록 한다. 기울어진 유리 슬라이드 상에 하이드로젤을 위치시키는 실험을 통해 하이드로젤의 견고함이 확인되었다.
도 28은 기울어진 유리 슬라이드 표면상에서 안정화된 하이드로젤 사진이다. 유리 슬라이드 상에 하이드로젤이 견고하게 부착되어 있음을 확인할 수 있다.
또한 곱슬 아밀로이드 섬유로부터 얻어지는 하이드로젤의 광학적 투명성을 실험을 통해 확인하였다.
도 29는 하이드로젤의 광학적인 투과도를 보여주기 위한 사진이다. 사진에서 투명한 하이드로젤을 통하여 국립 서울대학교 상징이 투과되어 보임을 확인할 수 있다.
하이드로젤 내 아밀로이드 섬유의 존재는 싸이오플라빈-티 결합 형광(thioflavin-T binding fluorescence) 결과와 458nm의 여기로 대역주파수 필터(bandpass filter; BP) 475-525nm에서 CLSM(confocal laser scanning microscope)를 이용한 이미지화로 확인할 수 있었다. 이에 대한 광학적인 이미지를 도 30에 나타내었다.
도 30은 하이드로젤내 아밀로이드 섬유의 싸이오플라빈-티 결합 형광을 CLSM으로 가시화한 형광 이미지이다. 흑백 화면으로는 확인이 어렵지만 형광 이미지를 통하여 초록색 형광 이미지가 관찰됨을 확인할 수 있었다.
도 31은 도 30에서 사용된 하이드로젤내 곱슬 아밀로이드 섬유를 광학 현미경으로 관찰하여 얻어진 광학이미지이다. 즉, 도 30 및 도 31에 나타난 두 이미지가 서로 일치하는 것을 통하여 하이드로젤을 구성하고 있는 것이 아밀로이드 섬유라는 것을 확인할 수 있다.
한편, 아밀로이드 하이드로젤이 형성하는 망구조의 구멍 크기를 알아보기 위하여 동결건조된 나노스케일 섬유 네트워크를 FE-SEM(field emission scanning electron microscopy)을 이용하여 확인하였다.
도 32는 동결 건조된 아밀로이드 하이드로젤을 구성하는 곱슬 아밀로이드 네트워크에 대한 FE-SEM 사진이다. 스케일바는 0.2㎛를 나타낸다. 도면에서 하이드로젤을 동결 건조하여 얻어지는 섬유 네트워크의 구멍 크기는 약 10 내지 100nm 범위이고, 바람직하게는 평균 구멍 크기가 약 52.9nm인 것으로 확인되었다.
3차원 섬유 네트워크 내 정교한 나노 공간을 이용하는 응용의 예로서 효소 포획을 위한 매트릭스로의 활용 가능성에 대하여 살펴보았다. 실제로 HRP 1㎍과 자가-증식 실험으로부터 얻은 제1세 소산 곱슬 아밀로이드 섬유 2㎎을 혼합함으로써 HRP를 하이드로젤 내에 포획시키고 Microcon YM-30을 이용한 원심력 여과로 용매를 제거하였다. 젤로부터 포획되지 않은 HRP를 제거하기 위해 pH 6.5의 20mM Mes로 하이드로젤을 10번 이상 세척한 후, 하이드로젤을 신선한 새 버퍼에서 1시간 동안 부풀렸다. 그리고 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine; TMB) 기질을 하이드로젤에 첨가시켰다. HRP가 포획된 하이드로젤에서만 5초 내에 파란색이 순간적으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다. TMB가 산화된 결과물을 UV/VIS 스펙트로미터로 측정하였다.
도 33은 HRP 유무에 따른 TMB 산화 차이를 나타내는 흡수 스펙트럼으로서, 그래프 "a"는 하이드로젤 형성 전에 첨가한 HRP가 하이드로젤 내에 포획 됨으로써 TMB 산화를 나타내는 스펙트럼이고, 그래프 "b"는 하이드로젤 형성 후 HRP를 첨가하여 HRP가 포획되지 않았기 때문에 TMB가 산화되지 않은 스펙트럼을 나타낸다.
그래프 "a"에 나타난 바와 같이 HRP가 포함된 곱슬 아밀로이드 섬유 하이드로젤은 660nm에서 최대 흡수도를 나타낸 반면, 그래프 "b"에 나타난 바와 같이 하이드로젤레이션 후 HRP를 첨가한 곱슬 아밀로이드 섬유 하이드로젤은 TMB로부터 파란색 결과물을 생성하지 않았다.
그래프 "a"에 의하면 아밀로이드 하이드로젤에 포획된 HRP는 하이드로젤로부터 밖으로 빠져나가지 못했음을 의미한다. 같은 이유로, 그래프 "b"에 의하면 나노-스케일의 구멍으로 이루어진 곱슬 아밀로이드 섬유 하이드로젤로 자유로운 HRP가 통과해 들어가지 못했음을 나타낸다.
다음, 스무 번의 다발성 효소 작용 동안 파란 결과물의 형성을 모니터링함으로써 포획된 HRP의 활성도 유지 정도를 평가하였다.
도 34는 HRP 효소의 반복 재사용 활성도를 나타내는 스펙트럼으로서, 막힌점(●)을 대표하는 그래프 "a"는 곱슬 아밀로이드 하이드로젤 내에 포획된 HRP 효소에 대한 활성도를 나타내고, 열린점(○)을 대표하는 그래프 "b"는 콜라겐계 하이드로젤 내에 포획된 HRP 효소에 대한 활성도를 나타낸다.
그래프 "a"에 나타난 바와 같이, 아밀로이드 하이드로젤에서는 다발성 전환(multiple turnovers) 동안 효소 활성이 거의 그대로 유지됨을 확인할 수 있다. 그러나 그래프 "b"에 나타난 바와 같이, 콜라겐으로 이루어진 하이드로젤에서는 반복적 효소 반응 동안 HRP의 활성이 유지되지 못하고 저하됨을 확인할 수 있다. 콜라겐 하이드로젤 내에서 HRP에 의한 TMB의 결과물 형성은 두 번째 반응에서 상당량 감소했다. 콜라겐 젤에 비교하여 아밀로이드 하이드로젤 내 HRP 활성의 유지는 동결 건조 FE-SEM 영상에서 나타나듯이 매트릭스 내 구멍 크기의 큰 차이 때문인 것으로 생각된다.
도 35 및 36은 하이드로젤의 세공에 대한 FE-SEM 사진으로서, 도 35는 곱슬 아밀로이드 하이드로젤에 대한 것이고, 도 36은 콜라겐계 하이드로젤에 대한 것이다. 도면에서 스케일 바는 1㎛를 나타낸다.
도 36에 나타난 바와 같이 콜라겐 젤에서 크기가 큰 구멍은 평균 31.5㎛로서, ㎛스케일의 구멍 크기를 갖는 젤내에 효소를 가두기는 용이하지 않을 것으로 생각된다. 그러나 도 35에 나타난 바와 같이 아밀로이드 하이드로젤은 구멍 크기가 nm 수준으로서, 나노 수준의 구멍을 갖는 공간은 다발성 효소 작용 동안 HRP를 안전하고 안정되게 가두어 유지시켜 줄 수 있는 것으로 보인다.
열에 의한 HRP 비활성화에 대한 아밀로이드 하이드로젤의 보호 효과를 알아보기 위해 용액안의 자유로운 HRP 또는 곱슬 아밀로이드 섬유 내에 포획된 HRP를 60℃에서 배양하는 방법으로 효소의 열안정성을 조사하였다.
도 37은 열에 대한 HRP 활성 유지를 확인하기 위한 특정 파장에서의 TMB 흡수도를 나타내는 스펙트럼으로서, 막힌점(●)을 대표하는 그래프 "a"는 곱슬 아밀로이드 하이드로젤 내에 포획된 HRP 효소에 대한 TMB 산화 흡수도를 나타내고, 열린점(○)을 대표하는 그래프 "b"는 포획되지 않고 자유로운 HRP 효소에 대한 TMB 산화 흡수도를 나타낸다.
초기 70분 동안 효소 활성의 변화를 살펴 보면, 그래프 "a"에 나타난 바와 같이 하이드로젤 내에 포획된 HRP의 경우 효소 활성이 12.5% 감소한 반면 하이드로젤 내에 포획되지 않고 자유로운 HRP는 50% 이상 활성을 잃어버린다는 것을 알 수 있다. 이를 통하여 초기 배양에서는 포획된 HRP의 열에 의한 비활성화 저항성이 확인된다.
이에 더하여, 60℃에서 15 시간 동안의 열처리 후 하이드로젤 내의 HRP 효소 활성을 조사해 보았다.
도 38은 장시간 열에 대한 HRP의 활성도를 나타내는 그래프로서, 막대 "a"는 곱슬 아밀로이드 하이드로젤 내에 포획된 HRP 효소에 대한 활성도를 나타내고, 막대 "b"는 포획되지 않고 자유로운 HRP 효소에 대한 활성도를 나타낸다.
막대 그래프 "a"에 나타난 바와 같이 하이드로젤 내의 HRP는 활성을 약 20% 정도 잃어버린 데 그친 반면, 막대 그래프 "b"에 나타난 바와 같이 자유로운 HRP는 활성이 80% 이상 소실되었음을 확인할 수 있다. 결론적으로 효소 활성 유지 측면에서, 아밀로이드 하이드로젤은 효소 포획과 열에 의한 비활성화 방지벽을 위한 단백질 섬유 네트워크로 적당한 나노 매트릭스임을 알 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 실시예를 수행하기 위한 실험 방법과 분석 방법을 기술한다. 각 실험은 비교를 위하여 곱슬 아밀로이드 섬유와 곧은 아밀로이드 섬유 두 가지에 대하여 수행되었으며, 각 단계에서의 데이터를 다음 방식에 따라 비교 분석하였다.
알파-시뉴클레인의 제조
유전자간의 재조합형 인간 알파-시뉴클레인을 알려진 방법에 따라 제조하였다. 간략하게, pRK172 플라스미드에서 복제된 인간 알파-시뉴클레인 유전자가 대장균 BL21(DE3)에서 과발현되었다. 이어서, 세포 용해분리물을 열처리하고 이어서 DEAE-Sephacel(diethylaminoethyl-Sephacel) 음이온-교환 크로마토그래피, Sephacryl S-200 사이즈 배제 크로마토그래피, S-Sepharose 양이온-교환 크로마토그래피 공정을 수행하였다. 완충액을 세 번 바꾸면서 pH 6.5에서 20mM Mes{2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid} 6리터로 투석하고 완전히 분리된 알파-시뉴클레인을 분주하여 영하 80℃에서 보관하였다.
알파-시뉴클레인의 곱슬 및 곧은 아밀로이드 섬유 다형체의 제조
다음 방법에 따라 두 가지 형태의 아밀로이드 섬유 다형체를 수득하였다. 곱슬 아밀로이드 섬유를 제조하기 위하여 알파-시뉴클레인 과립체를 Microcon YM-30 (Millipore) 및 Centrifuge 5415R (Eppendort, Germany)를 사용하여 37℃, 14,000 x g에서 반복적으로 원심분리막 여과하였다. 각 여과를 2분 동안 수행한 후, 여과물을 최초 시료와 합하고 다른 여과를 수행하였다. 얻어지는 곱슬 아밀로이드 섬유를 pH 6.5에서 최초와 동일한 부피의 20mM Mes에 재분산 시킨 후 역원심분리를 통하여 수집하였다. 싸이오플라빈-T 결합 형광으로 모니터링 하여 얻어진 집합 키네틱스의 지체기중에서 알파-시뉴클레인의 올리고머 과립체를 수득하였다.
1㎎/㎖의 알파-시뉴클레인에 대한 통상적인 교반 배양하에서 섬유화가 수행되었다. 교반은 37℃ 조건으로 pH 6.5의 20mM Mes 완충액 내에서 수행되었으며 오르비트 쉐이커(orbit shaker) 상에서 200rpm으로 연속해서 흔들어 주면서 진행되었다. 교반 조건하에서 알파-시뉴클레인을 배양하여 곧은 아밀로이드 섬유를 수득하였다.
TEM(transmission electron microscope)
알파-시뉴클레인의 아밀로이드 섬유를 포함하는 분주를 탄소-코팅된 200-메쉬 구리 그리드(Ted Pella Inc., USA)에 흡착시켰다. 공기 건조된 시료를 2% 우라닐아세테이트로 20초 동안 음성 염색하여 아밀로이드 섬유를 TEM(JEM 1010, Jeol, Japan)으로 볼 수 있도록 하였다.
AFM(atomic force microscope)
알파-시뉴클레인 아밀로이드의 형태를 AFM(Dimension 3100, Veeco, USA)으로 조사하였다. 알파-시뉴클레인 아밀로이드를 새로 쪼갠 운모상에 흡착시키고 운모의 파편을 두 번 증류한 과량의 물로 세정하였다 (Direct-Q, Millipore, USA). 공기 중에서 완전히 건조된 시료를 태핑 모드 AFM으로 분석하였다.
아밀로이드 섬유의 지속 길이에 대한 통계학적 분석
구조적 플럭츄에이션(fluctuation)은 섬유의 기계적 특성을 반영하기 때문에, 준유연성(semiflexible) 폴리머에 대한 벌레형 사슬 모델(worm-like chain model)의 통계적 역학을 도입하여 섬유의 딱딱함을 나타내는 지속 길이를 평가하였다. 지속 길이(P)는 고분자 사슬의 C L 및 이차원적 끝과 끝 거리 R 2D 사이의 통계적 관계로부터 얻어진다. P는 다음 식 (1)에 의해 나타낼 수 있다.
Figure PCTKR2010003025-appb-I000002
(1)
ATR-FTIR(attenuated total reflectance fourier transformation infrared) 스펙트로미터
곱슬 아밀로이드 섬유 및 곧은 아밀로이드 섬유는 모두 pH 6.5에서 20mM Mes 완충액을 사용하여 완충되었다. 각 아밀로이드 섬유 시료는 ZnSe ATR 결정상에 배치된다. DTGS 검출기(dueterated triglycine sulfate detector)를 갖춘 Nicolet 6700 FT-IR 스펙트로미터(Theremo Scientific, USA)에 의해 ATR 스펙트럼이 기록되었다. ATR-FTIR 스펙트럼에 대한 데이터 조정 및 곡선 분석은 OriginPro 7.5 소프트웨어(OriginLab)를 이용하여 수행되었다.
다형 아밀로이드 섬유의 자가-증식 실험
아밀로이드 섬유의 모섬유에 대한 제1세 소산 섬유 및 제2세 소산 섬유를 얻기 위한 자가-증식 실험을 수행하였다. 섬유 성장을 위한 종자 제조는 마이크로-팁 형태의 초음파 처리기(VCX 750, Sonics & Maerials, Inc., USA)를 이용한 성숙 아밀로이드 섬유의 초음파 분쇄로 수행되었다. 초음파 분쇄는 시료를 얼음위에 놓아 탐침 아래에 놓이게 하고 반복적으로 수행되었다. 온 상태와 오프 상태는 각각 5초 동안 유지되었다. 온 상태 5회와 오프 상태 4회를 포함하는 초음파 분쇄 각 주기 후에, 시료가 움직이지 않도록 초음파가 없는 상태에서 얼음 위에 1분 동안 두었다. 초음파 분쇄 총 40주기가 완료된 아밀로이드 분체는 TEM으로 조사되고 섬유 형태로 성장시키기 위한 종자로 사용되었다. 제1세 소산 섬유는 5%의 초음파 분쇄된 분체가 존재하는 알파-시뉴클레인 용액에 종자를 파종하고 정지(quiescent) 조건하에서 성장시켰다. 제1세 소산 섬유는 또한 제2세 소산 섬유를 제조하기 위한 종자의 제조에 사용되었다.
FE-SEM(field-emission scanning electron microscope)
SEM 분석을 위하여 냉동 고정법(cryofixation)에 의하여 하이드로젤 시료가 제조되었다. 팽창되고 동결 건조된 하이드로젤이 Emscope SC 400 (Electron Microscopy Sciences, USA)을 사용한 스퍼터링에 의해 금/팔라듐으로 코팅되었다. 하이드로젤의 내부 및 표면의 구조가 2.0kV에서 FE-SEM(SUPRA 55VP, Carl Zeiss, Germany)으로 조사되었다.
CLSM(confocal laser scanning microscope)
싸이오플라빈-T로 염색된 하이드로젤의 공초점 영상이 CLSM(LSM510, Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 얻어졌다. 하이드로젤 내의 아밀로이드 섬유의 싸이오플라빈-T 결합 형광이 458nm에서 여기되며 BP(bandpass filter) 475-525nm에서 조사되었다.
아밀로이드 하이드로젤의 제조 및 하이드로젤 내로 HRP의 포획
아밀로이드 하이드로젤이 원심분리 막 여과 공정에 의해 제조되었다. pH 6.5, 20mM Mes 2㎎/㎖ 내에서 알파-시뉴클레인 과립의 약 20회에 걸친 반복적인 여과 후에 투명한 하이드로젤이 Microcon YM-30 여과막 상에서 얻어졌다. 한편, HRP(Sigma, USA) 효소 포획을 위한 하이드로젤이 곱슬 제1세 소산 섬유로 제조되었다. 제1세 소산 곱슬 아밀로이드 섬유 및 HRP의 혼합물을 용액이 막을 통과할 때까지 14,000 x g 로 원심분리 막 여과를 수행하였다. pH 6.5에서 20mM Mes 내에서 HRP 1㎍을 사용하여 제1세 소산 곱슬 아밀로이드 섬유 2㎎과 결합시켜 HRP-포획 하이드로젤을 제조하였다. 역원심분리를 통하여 HRP-하이드로젤을 수집한 후, pH 6.5의 20mM Mes 내에서 하이드로젤을 1시간 동안 완전히 팽창시켰다. 결합되지 않거나 하이드로젤로부터 방출된 자유 HRP를 제거하기 위하여 HRP-포획 하이드로젤은 새로운 20mM Mes 완충액으로 10회 이상 세정되었다. 하이드로젤 내에 포획된 HRP의 효소 활성도가 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB, Sigma, USA)과의 반응 중에 UV/Visible 광학분광계(UltrospecTM 2100 pro, Amersham Biosciences, England)로 모니터 되었다.
이상과 같이 섬유화 과정에 따라 차이를 나타내는 곧은 아밀로이드 섬유와 곱슬 아밀로이드 섬유를 형성시키는 것을 통하여 알파-시뉴클레인이 분자 수준의 다형성을 나타냄을 확인할 수 있다. 이는 pH, 온도, 작은 화학 리간드(small chemical ligands)와 같은 반응 조건으로 각 아밀로이드성 단백질의 구조적 특성에 영향을 주는 대신 분자 조립 과정을 통해 섬유 다형성을 이끌어 낸 것이라고 볼 수 있다.
교반 배양으로 형성되는 곧은 아밀로이드 섬유와 병행하여 막 여과 과정을 통한 곱슬 아밀로이드 섬유의 생성은 핵-의존성 섬유화 과정 모델 뿐 아니라 과립체간 조립을 포함하는 이중-협력 섬유화 모델에 따라 작동하는 알파-시뉴클레인 아밀로이드 생성에 대한 제안을 지지해 준다고 할 수 있다.
일단 다형체가 형성되고 나면 자가-증식 메카니즘에 의해 그들의 특유한 특성이 자손에게 전달된다. 알파-시뉴클레인 아밀로이드 섬유의 자가-증식하는 분자 수준의 다형성은 형태상 차이가 뚜렷하면서 강한 섬유인 곱슬 아밀로이드 섬유를 다량으로 제공해 준다.
곱슬 아밀로이드 섬유는 효소 포획에 적합한 새로운 초구조체인 아밀로이드 하이드로젤의 형성을 가능하게 한다. 이러한 점에서, 아밀로이드 하이드로젤은 약물 담체(drug delivery), 피부 재생(tissue regeneration), 신경 재생(neuronal regeneration) 및 뼈 생성(bone formation)을 위한 3차원 매트릭스 세포 배양체(3D-matrix cell culture), 바이오 분자 담체(biomolecular entrapment), 효소 담체(enzyme entrapment), 나노 여과체(nano-filter) 및 바이오 마커(biomarker) 개발을 포함하는 나노바이오테크놀로지 분야에서 다양하게 활용될 수 있을 것이다.
이에 더하여 곱슬 아밀로이드 섬유는 자가-증식이 용이하여 증식을 통하여 그들의 특유한 특성이 그대로 전달된 제1세 소산, 제2세 소산 섬유를 용이하게 제조가능하다. 즉, 형태상 차이가 뚜렷하면서 기계적으로 강한 곱슬 섬유의 다량 생산이 가능한 것이다. 용이하게 제조된 소산 섬유를 또한 나노바이오테크놀로지 분야에 다양하게 응용하는 것이 가능하다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (20)

  1. 알파-시뉴클레인을 배양하여 알파-시뉴클레인 과립체를 제조하는 단계; 및
    상기 알파-시뉴클레인 과립체 다수를 조립하여 곱슬 아밀로이드 섬유를 제조하는 단계를 포함하는 알파-시뉴클레인 유래 곱슬 아밀로이드 섬유의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 알파-시뉴클레인 과립체에 소정의 스트레스를 가하여 뒤틀린 구조 및/또는 기형성 구조를 갖도록 하고 이러한 뒤틀린 구조 및/또는 기형성 구조를 갖는 과립체 다수를 조립하여 상기 곱슬 아밀로이드 섬유를 제조하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 알파-시뉴클레인 과립체에 전단 스트레스(shear stress)를 가하는 것으로 상기 스트레스를 가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 알파-시뉴클레인 과립체에 원심력 이용 막 여과 공정을 수행하는 것으로 상기 스트레스를 가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 알파-시뉴클레인 과립체에 헥산을 포함하는 유기 용매 처리를 수행하여 상기 스트레스를 가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 알파-시뉴클레인 과립체는 알파-시뉴클레인의 섬유화를 위한 배양 중 지체 단계(lag phase) 중에 얻어지는 과립형 올리고머 종인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 곱슬 아밀로이드 섬유는 평행 베타-병풍(parallel β-sheets) 구조 보다 역평행 베타-병풍(antiparallel β-sheets) 구조를 더 많이 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 곱슬 아밀로이드 섬유의 섬유 윤곽선의 길이(C L ;contour length)는 섬유의 2차원적 끝과 끝 거리(R 2D ;end-to-end distance)에 비해 짧은 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 곱슬 아밀로이드 섬유는 제1세 소산 및 제2세 소산을 포함하는 소산 아밀로이드 형성을 위한 자가-증식(self-propagation) 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 알파-시뉴클레인을 배양하여 알파-시뉴클레인 과립체를 제조하는 단계; 및
    상기 알파-시뉴클레인 과립체 다수를 조립하여 곱슬 아밀로이드 섬유를 제조하는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조되는 알파-시뉴클레인 유래 곱슬 아밀로이드 섬유를 이용하여 하이드로젤을 제조하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 알파-시뉴클레인 과립체에 소정의 스트레스를 가하여 뒤틀린 구조 및/또는 기형성 구조를 갖도록 하고 이러한 뒤틀린 구조 및/또는 기형성 구조를 갖는 과립체 다수를 조립하여 상기 곱슬 아밀로이드 섬유를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 알파-시뉴클레인 과립체에 대하여 원심력 막 여과 공정을 수행하는 것으로 상기 스트레스를 인가하여 상기 곱슬 아밀로이드 섬유를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 곱슬 아밀로이드 섬유는 평행 베타-병풍(parallel β-sheets) 구조 보다 역평행 베타-병풍(antiparallel β-sheets) 구조를 더 많이 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 곱슬 아밀로이드 섬유의 섬유 윤곽선의 길이(C L ;contour length)는 섬유의 2차원적 끝과 끝 거리(R 2D ;end-to-end distance)에 비해 짧은 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 원심력 막 여과 공정을 5회 이상 수행하여 상기 곱슬 아밀로이드 섬유가 축적된 형태의 하이드로젤을 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 하이드로젤은 HRP(horseradish peroxidase) 효소를 포획 가능한 것임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 하이드로젤을 동결 건조하여 얻어지는 섬유 네트워크의 평균 구멍 크기는 10 내지 100nm 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제10항에 있어서, 상기 곱슬 아밀로이드 섬유는 제1세 소산 및 제2세 소산을 포함하는 소산 아밀로이드 형성을 위한 자가-증식(self-propagation) 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 곱슬 아밀로이드 섬유의 제1세 소산 및 제2세 소산을 포함하는 소산 아밀로이드 섬유를 이용하여 하이드로젤을 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 알파-시뉴클레인을 배양하여 알파-시뉴클레인 과립체를 제조하는 단계; 및
    상기 알파-시뉴클레인 과립체 다수를 조립하여 곱슬 아밀로이드 섬유를 제조하는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조되는 알파-시뉴클레인 유래 곱슬 아밀로이드 섬유를 이용하여 하이드로젤을 제조하고,
    제조된 하이드로젤을 이용하여 약물 담체(drug delivery), 조직 공학(tissue engineering), 신경 재생(neuronal regeneration) 및 뼈 생성(bone formation)을 위한 3차원 매트릭스 세포 배양체(3D-matrix cell culture), 바이오 분자 담체(biomolecular entrapment), 효소 담체(enzyme entrapment), 나노 여과체(nano-filter) 및 바이오 마커(biomarker)중 어느 하나를 제조하는 방법.
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