WO2011117448A1 - Compuestos para ser usados en el tratamiento de enfermedades basadas en la expresión de transcritos tóxicos - Google Patents

Compuestos para ser usados en el tratamiento de enfermedades basadas en la expresión de transcritos tóxicos Download PDF

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Ruben Darío ARTERO ALLEPUZ
Amparo GARCÍA LÓPEZ
María del Mar ORZÁEZ CALATAYUD
María Beatriz LLAMUSÍ TROISI
Enrique PÉREZ PAYÁ
Manuel PÉREZ ALONSO
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Universitat De Valencia
Fundación De La Comunidad Valenciana Centro De Investigacion Principe Felipe
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Definitions

  • the present invention refers to compounds comprising hexapeptides, to be used in the prevention and / or treatment of diseases whose etiology is based on the expression of toxic transcripts comprising CUG, CCUG, CGG, CAG and AAG repeats as , for example, Type 1 Myotonic Dystrophy (DM1), Type 8 spinocerebellar ataxia (SCA8), Type 2 Myotonic Dystrophy (DM2), Fragile X-associated tremor / ataxia syndrome (FXTAS), Huntington's disease (HD) and Ataxia of Friedreich (FA), respectively.
  • DM1 Myotonic Dystrophy
  • SCA8 spinocerebellar ataxia
  • DM2 Type 2 Myotonic Dystrophy
  • FXTAS Fragile X-associated tremor / ataxia syndrome
  • HD Huntington's disease
  • FA Ataxia of Friedreich
  • the present invention can be encompassed in the field of medicine in general and more specifically in the field related to the prevention and / or treatment of genetic diseases of hereditary nature.
  • DM1 or Steinert's disease is the most frequent type of muscular dystrophy in the adult population with a worldwide prevalence of approximately 1 patient per 8000 people, being classified as a rare disease. It is a neuromuscular disease, with defining symptoms that mainly affect the muscle, such as myotonia and muscle weakness, although the cardiac system (cardiac arrhythmias), the ocular (cataracts), the endocrine (hyperinsulinemia) are characteristically affected among other organs and systems. ) and the reproductive system (hypogonadism).
  • DM1 has an autosomal dominant inheritance pattern, high penetrance and variable expressivity.
  • the origin of the disease is in a dynamic mutation in the 3 'untranslated region (3' UTR) of the myotonic dystrophy protein kinase gene (DMPK, Entrez # 1760), located in chromosomal region 19ql3.2-ql3.3 .
  • Said mutation consists of an abnormal expansion of CTG trinucleotide repeats in exon 15 of said DMPK gene, which in the healthy population it appears in a variable number of between 5-35 copies, while in patients it is in a number greater than 50.
  • the number of CTG triplets correlates with the severity of the symptoms and age at which they appear.
  • mice express approximately 250 repetitions of the CUG trinucleotide in a heterologous mRNA developing myotonia and muscle defects typical of DM1, demonstrating that CUG expansions exert a toxic effect on their own regardless of the context in which they are (Mankodi et al., 2000) . Subsequently, other models generated in Drosophila confirmed the toxicity of CUG repeats independently of DMPK (Garcia-Lopez et al, 2008). Since the discovery that RNAs with CUG expansions can be toxic to cells, a whole series of scientific evidences support that these expansions, or similar expansions, in other RNAs, can cause hereditary genetic pathologies similar to DM1.
  • DM2 CCUG tetranucleotide expansions in the first intron of the transcribed RNAs of the ZNF9 gene (zinc finger protein 9, Entrez # 7555) trigger a pathology very similar to DM1 (OMIM # 602668).
  • OMIM # 602668 a pathology very similar to DM1
  • spinocerebellar ataxia type 8 (SCA8, OMIM # 603680) is a neurodegenerative disease caused by the expansion of CTG triplets in a non-coding transcript of the SCA8 gene. It has been seen that bidirectional transcription of this gene leads both to the expression of RNAs with CUG expansions (not translated), which trigger molecular alterations related to those described for DM1, as well as to transcripts with CAG expansions that translate into polyglutamine proteins .
  • RNAs carrying CUG expansions fold forming a hairpin structure capable of joining and sequestering RNA binding factors, forming large ribonucleoprotic inclusions.
  • CUG repeats interfere with the activity of an increasing number of nuclear proteins, which include transcription factors and alternative splicing factors. Among the latter are the heterogeneous nuclear ribonucleoproteins hnRNP F and hnRNP H, as well as the proteins of the MBNL1-3 family (Muscleblind-like proteins). Due to this kidnapping, the patients present alterations in the alternative processing of hundreds of specific transcripts, which led to the coining of the term of splenic disease, for which DM1 is the first example described. It has also been proposed that the activity of different micro RNAs could be altered.
  • NKX2-5 and MyoD transcription factors altered in DM1 are NKX2-5 and MyoD. These proteins are related to the development and cardiac conduction, and to the differentiation of myoblasts, respectively. NKX2-5 levels are increased in patients, while MyoD is reduced. The reason why the levels of these transcription factors are deregulated, as well as their relationship with the formation of CUG hairpins, is unknown.
  • CUG repeats affect the expression of a large number of genes.
  • mouse microarrays at least 175 muscle transcripts altered by the expression of expanded CUG transcripts have been detected.
  • at least 128 transcripts are also deregulated in MBNLl knockout mice, suggesting that the kidnapping and subsequent loss of MBNLl function plays a crucial role in the disease.
  • MBNL l knockout mice have iridescent cataracts, suffer myotonia and histological defects at the muscular level. MBNL2 knockout mice also develop myotonia (due to incorrect processing of Clcn-1 transcripts) and other muscle disorders typical of DM1. In addition, the overexpression of MBNLl in model mice expressing 250 CTG repeats reverses the defects in the processing of at least 4 transcripts (Sercal, Clcnl, Tnnt3 and ZASP), as well as myotonia.
  • mbl mutant embryos show disorganization of the Z bands of the sarcomeres, hypercontraction of the abdomen and alterations in the alternative processing of transcripts such as ZASP, troponin T (tnT) and a-actinine.
  • transcripts such as ZASP, troponin T (tnT) and a-actinine.
  • overexpression of MBNLl in model flies expressing 480 repetitions CTG suppresses phenotypes caused by the repetitions. All these results were an important change in the study of DM1, from which Muscleblind (Mbl) proteins have been considered a determining element in the development of the disease.
  • DM was first described in 1909, effective therapy is not yet available. All the treatments that are applied are palliative and help to stop the development of symptoms, but in no case prevent their appearance or treat the disease definitively. At present there is no compound capable of reversing the lack of conductance to chlorine to reduce myotonia.
  • Some Compounds, such as mexitil, quinidine, phenytoin, procainamide or carbamazepine, which inhibit the entry of sodium necessary for the onset and spread of impulses, are administered to patients in order to treat this symptom. Sometimes, these molecules are in turn used as a treatment for cardiac arrhythmias, so given the risk involved by their effect on cardiac function it is preferable to avoid their use as antimiotonics.
  • DHEAS dehydroepiandrosterone sulfate
  • pentamidine is the first example of a molecule identified in vitro with a potential therapeutic effect on CUG repeats in vivo.
  • RNA-MBNL1 complexes in both cases is disclosed in the prior art.
  • This molecule was permeable and nontoxic at least in mouse myoblasts.
  • a ligand with high affinity for RNA molecules with two internal mismatches rich in pyrimidines was also developed in parallel, such as those formed by CCUG repeats in DM2.
  • This compound consisted of three modules of 6'-N-5-kanamycin A hexinoate attached to a peptoid skeleton and separated from each other by four spacer monomers. Reducing the number of spacers from four to two made this molecule a ligand with greater affinity for CUG repeats than CCUG.
  • ONAs An alternative to the combined use of ONAs is to use antisense oligonucleotides that act at the level of DMPK transcripts in order to eliminate the source of toxicity.
  • tests directed to the inhibition of DMPK expression in cells of patients in culture using specific ONAs have already been carried out. However, this approach did not discriminate between mutant transcripts and wild transcripts. Decreasing the total expression of DMPK could be equally pathological given the importance of DMPK in cardiac function and insulin metabolism.
  • ONAs formed by CAG repetitions CAG7 or CAG25
  • these oligonucleotides reversed the defects of splicing of Clcn-1, in addition to reducing up to 50% levels of the mutant transcript in a specific way, probably because the binding of short sequences of CAG repeats to toxic ARs promotes the formation of heteroduplex without mismatches, which prevents the sequestration of proteins such as MBNLl, for which the mismatches between pyrimidines are essential structural elements for binding.
  • the molecules known in the state of the art have as their main mechanism of action the inhibition of the sequestration exerted by the forks with CUG repeats on the MBNL proteins, avoiding the interaction between the forks and the MBNL proteins, without exerting a direct effect on Destructuring the forks.
  • the present invention focuses on the screening of drugs from chemical libraries in order to identify compounds with relevant biological activity to treat diseases whose etiology is based on the presence of toxic transcripts comprising CUG or CCUG repeats such as, for example : DM1, DM2 and SCA8.
  • the compounds of the present invention are based on a more effective mechanism of action than those known in the state of the art since, according to the most probable mechanism of action, the double-chain forks formed by the toxic fragments with CUG repeats, or maintains the RNA with the expansions in a single chain conformation, thus avoiding aberrant binding of MBNL1 and any other molecule whose binding could also cause or worsen the pathological phenotype.
  • the Drosophila fly was used as a toxicity model for CTG repeats (Garcia-Lopez et al, 2008), where the compounds of the invention were tested and their mechanism of action on the toxicity of CTG repeats was determined. Subsequently, its efficacy was validated in vertebrate models of DM1. DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • a procedure was carried out for the identification of compounds with therapeutic potential to prevent or treat diseases whose etiology is based on the presence of toxic transcripts comprising CUG, CCUG, CGG, CAG and AAG repeats, such as: DM1, SCA8, DM2, FXTAS, HD and FA, which comprises the screening of hexapeptide chemists in vivo, preferably in a disease model in Drosophila, and the selection of those compounds that reverse the pathological state.
  • toxic transcripts comprising CUG, CCUG, CGG, CAG and AAG repeats, such as: DM1, SCA8, DM2, FXTAS, HD and FA, which comprises the screening of hexapeptide chemists in vivo, preferably in a disease model in Drosophila, and the selection of those compounds that reverse the pathological state.
  • the size of the molecules to be used for the search for potentially therapeutic agents is an important aspect to consider, since a too high molecular weight limits the absorption of the compound by the cells.
  • the optimization of molecules to give rise to more active compounds is usually accompanied by an increase in their final size.
  • a molecular weight greater than 1000 reduces the therapeutic potential of the molecules by decreasing their bioavailability, which makes it necessary to start from small compounds.
  • 80% of currently marketed drugs have a molecular weight below 450.
  • the average molecular weight of an amino acid is about 135 Da.
  • the approximate size of a hexapeptide therefore, varies around 810 Da. Tracking libraries of peptides formed by an amino acid number greater than 6 would result in too large molecules.
  • the present invention begins with the screening of a combinatorial peptide library in positional tracking format.
  • This library was made up of 120 vials, each consisting of a mixture of hexapeptides that share a single amino acid in a specific position and differ in the rest. In this way, detecting a positive vial identifies an active amino acid in a given position.
  • the combination of the most active amino acids in each of the positions tested (vials) is what is known as deconvolution.
  • the peptides of the library used in the present invention were composed of the stereoisomers D of the natural amino acids, which are not recognized by proteases in the intestine and are less susceptible to degradation.
  • the present invention refers to compounds comprising hexapeptides with proven therapeutic potential in vivo in Drosophila and mouse for the prevention and / or treatment of diseases whose etiology is based on the presence of toxic transcripts comprising CUG, CCUG, CGG repeats, CAG or AAG, such as: DM1, SCA8, DM2, FXTAS, HD and FA.
  • the mechanism of action of the compounds of the present invention is more effective than that exerted by the compounds known in the state of the art since they are capable of joining and unstructuring the double chain forks formed by the toxic fragments with said repetitions, or keeping the RNA with the expansions in a single chain conformation, avoiding both aberrant binding or sequestration of MBNL, as well as any other molecule whose binding to CUG hairpins could also cause or worsen the pathological phenotype. More specifically, compounds comprising peptides of Formula (I) (ABCDEF) or stereoisomers, mixtures, pharmaceutically acceptable salts or mimetic peptides thereof were tested in the present invention.
  • ABCDEF peptides of Formula (I)
  • amino acids that can be part of each of the positions A to F of Formula I are defined below, using to name said amino acids both the three-letter code and the code of a lowercase letter with which by convention usually represent the stereoisomers of natural amino acids: • A can be the amino acids cys (c) or pro (p),
  • B can be the amino acids pro (p) or gln (q),
  • D can be the amino acids ala (a) or thr (t),
  • ⁇ E can be the amino acids gln (q) or trp (w); Y
  • amino acids that are part of the peptides of the invention are D-amino acids, which are not recognized by proteases in the intestine and are less susceptible to degradation.
  • peptides formed by L-amino acids are also active.
  • mimetic peptide is understood as an organic peptide molecule characterized by a complementary sequence, homologous and / or equivalent to that of the peptides of Formula (I).
  • the compounds of the present invention also comprise complementary, homologous and / or functional equivalent sequences of the peptides of General Formula I.
  • the compounds of the present invention comprise a homologous sequence which has at least 80% identity or homology with the peptide sequence of general formula I.
  • the compounds of the present invention may comprise peptides that are chemical analogs of those of Formula I, derived cyclic peptides, dimers and / or multimers.
  • the compounds comprising the aforementioned peptides can be used in the prevention and / or treatment of diseases whose etiology is based on the presence of toxic transcripts comprising CUG, CCUG, CGG, CAG repeats. or AAG, for example: DM1, SCA8, DM2, FXTAS, HD and FA.
  • the hexapeptides corresponding to the sequences SEQ ID NO: 1 to 16 were tested in the treatment of said diseases, the hexapeptide plO (SEQ ID No: 10) which reversed toxicity in the above-mentioned Drosophila model, especially in brain, being especially preferred , as in muscle, in a dose-dependent manner in both cases.
  • plO is the preferred compound of the present invention because it is the most effective of those tested
  • the present invention also demonstrates that other compounds comprised within Formula I, such as pl 1, p5, pl2 and pl5, also present different degrees of specificity and efficacy in the presence of toxic CUG transcripts (see Example 16 and Figure 29)
  • the present invention relates in a first aspect to compounds comprising the hexapeptides of Formula I, or mimetics thereof, to be used in the prevention and / or treatment of diseases whose etiology is based on the presence of toxic transcripts.
  • compounds comprising CUG, CCUG, CGG, CAG and AAG repetitions, such as: DM1, SCA8, DM2 FXTAS, HD and FA.
  • a second aspect of the present invention refers to the use of said compounds for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the prevention and / or treatment of diseases whose etiology is based on the presence of toxic transcripts comprising repetitions CUG, CCUG, CGG, CAG, and AAG such as: DM1, SCA8, DM2 FXTAS, HD and FA.
  • a third aspect of the present invention refers to pharmaceutical compositions comprising at least one of the peptides of the invention in combination with at least one other active ingredient.
  • the composition could also comprise at least one excipient as an inactive substance accompanying the active substance that, for example, helps the absorption of said active substance in the body or its activation.
  • excipients could be intended for the maintenance of the joined ingredients of the composition such as: starches, sugars or celluloses; fillers such as: vegetable cellulose, dibasic calcium phosphate, safflower flower; disintegrants; lubricants, such as: talc, silica or steroid fats; coaters; sweeteners; flavorings; dyes; etc.
  • Said composition may be administered by any route of administration useful for bringing the active substance to its therapeutic target, for example, by digestive route (oral, sublingual, gastro enteric or rectal), parenteral route (subcutaneous, intramuscular, intravenous, intraarterial, intrarachid, intraperitoneal, intradermal or intraarticular), respiratory or topical.
  • digestive route oral, sublingual, gastro enteric or rectal
  • parenteral route subcutaneous, intramuscular, intravenous, intraarterial, intrarachid, intraperitoneal, intradermal or intraarticular
  • respiratory or topical for example, by digestive route (oral, sublingual, gastro enteric or rectal), parenteral route (subcutaneous, intramuscular, intravenous, intraarterial, intrarachid, intraperitoneal, intradermal or intraarticular), respiratory or topical.
  • Another aspect of the present invention refers to a method for the prevention and / or treatment of diseases whose etiology is based on the presence of toxic transcripts comprising CUG, CCUG, CGG, CAG and AAG repeats such as, for example: DM1, SCA8 , DM2, FXTAS, HD and FA, which comprises administering to the patient a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one of the hexapeptides of the invention.
  • therapeutically effective amount is understood as that capable of preventing or treating the pathological state associated with diseases whose etiology is based on the presence of toxic transcripts comprising repetitions CUG, CCUG, CGG, CAG and AAG as, for example: DM1, SCA8, DM2 and SCA8.
  • (B) 01, 02 ... 06 represent defined positions occupied by the 20 stereoisomers D of the possible natural amino acids and the X refers to an equimolar mixture of 19 of the 20 stereoisomers D of the natural amino acids (the cistern is omitted in the X, but not in the defined positions).
  • the 6 positions for the 20 possible amino acids give rise to 120 combinations, each of which represents a vial in the library.
  • FIG. 4 Study of the toxicity of plO in wild individuals.
  • A, B This figure shows the dose-response behavior against DMSO when it is administered in homemade food to embryos (A) or LL (B) larvae of OrR genotype (wild genotype). The number of adults is represented on the ordinate axis and the% DMSO is represented on the abscissa axis.
  • FIG. 5 Tracking of Alanines. This figure demonstrates that alanine substitution of any of the plO peptide residues causes a loss of activity.
  • the peptides were administered in the food to larvae 103Y-Gal4 + / +; UAS-CTG (480) / +.
  • the ordinate axis the number of females is represented and in the abscissa the hexapeptides of the invention tested: the left column corresponds to the control (0.1% DMSO) and the following, from left to right, with the plO peptides and peptides comprising alanine substitutions with sequences: ppyawa, ppyaae, ppaawe, payawe, apyawe.
  • the bars show average values with their standard error. * indicates p-value ⁇ 0.05.
  • the plO peptide suppresses the toxicity of CTG (480) in indirect flight muscles (IFMs).
  • the figure shows from left to right 1.5 ⁇ cross sections of the IFMs of normal flies (A), flies expressing CTG (480) (B) and flies expressing CTG (480) under the control of orally treated Mhc-Gal4 with the peptide plO (C). Peptide treated flies had larger muscle packs than the DMSO control. The images were taken at an increase in 10x.
  • FIG. 8 p l O reduces the number of ribonuclear aggregates (foci) that comprise toxic CUG repeats in Drosophila and releases Mbl therefrom.
  • This figure shows that treatment with plO dramatically reduces the number of ribonuclear aggregates (foci) comprising CUG repeats (ordinate axis) at all concentrations of tested plO (abscissa axis) (A).
  • the detection by immuno fluorescence of Mbl is shown in the MFIs of flies treated with DMSO (0.12%; control) (B) or with plO (250 ⁇ ) (C).
  • Oral administration of plO caused a change in the cellular distribution of Mbl from a distribution in the form of aggregates (see arrows) (B), to a distribution in dispersed form (C). Staining of the nucleus was performed with DAPI. * means p ⁇ 0.05 and ** p ⁇ 0.0005.
  • the sequence of the peptides of SEQ ID NO: 17-19 (pl7-p l 9) is shown downstream.
  • the initial Methionine, the three spacer Glycins and the sequence of the direct ( ⁇ ) or retro-reverse ( ⁇ -) plO peptide itself are shown.
  • FIG. 11 Quantification of the suppression of an eye phenotype by co-expression of (CTG) 480 and different variants of plO sequence. Quantification of the length of the eye in the dorso-ventral axis of GMR-Gal4 flies UAS-CTG (480) / UAS-pl9 showed a significant increase relative to the size of the eye in control flies (GMR-GaU UAS-CTG (480 ) / +; p-value ⁇ 0.05, t test). This effect was greater when the temperature increased from 19 ° C to 21 ° C.
  • Figure 13 Possible mechanisms of action of the plO peptide on the toxicity of CTG (480). plO could affect the expression of the repetitions (A), displace Mbl from the RNA forks (B), destabilize the toxic forks (C) or act downstream of the repetitions (D). However, as demonstrated in the following figures and examples, the most likely mechanism of action of plO is based on the destabilization of toxic forks (C). A detailed explanation about the conclusions obtained from Figure 13 can be found in Example 6, as well as a deeper analysis of it. Figure 14. Effect of the expression of plO on the expression of the luciferase reporter protein.
  • FIG. 1 DC spectrum (Circular Dichroism) of the zinc fingers of Muscleblind proteins.
  • Fluorescence polarization assays consist of labeling a small molecule with a fluorophore (CUG repeats conjugated to carboxyfluorescein in the case of the present invention; A), so that when this is attached to a molecule of greater molecular weight (such as protein MblZF) change its rotation speed (B). Changes in the rotation speed can be detected by exciting the molecule with polarized light beams in the vertical and horizontal planes and measuring the direction of polarization of the emitted fluorescence.
  • a fluorophore CCG repeats conjugated to carboxyfluorescein in the case of the present invention
  • MblZF and plO join CUG repeats.
  • MblZF caused an increase in FAM-CUG23 polarization caused by the union between both molecules. This binding is reversible if it competes with an unlabeled CUG23 RNA (A) and is proportional to the amount of MblZF (B).
  • plO also causes an increase in the polarization of FAM-CUG23 (C). This increase is discrete due to the small size of the peptide and does not change significantly increase your concentration (D).
  • pl O does not reverse the effect of MblZF on FAM- (CUG) 23. * indicates p-value ⁇ 0.05 (t test).
  • FIG 21 Study of the binding of MblZF to FAM- (CUG) 23 by gel delay tests. MblZF binds to FAM-CUG23 causing retention of the complex in the well. This occurs at all AR concentrations tested for a fixed protein concentration (A).
  • the union between FAM- (CUG) 23 and MblZF is specific since it can compete with an unlabeled CUG23 RNA (FAM- (CUG) ratio 23: CUG23 1: 100; Fig B, run 3), and does not occur if the Protein is heat denatured before incubating with FAM- (CUG) 23 ( Figure B, run 4).
  • FIG 23 The MblZF / FAM- (CUG) 23 complex does not migrate to the positive pole.
  • A Under the electrophoresis conditions used, the MblZF protein barely entered the gel (silver staining, Figure A left). If both the protein and the AR-protein complex are run in a horizontal gel with the wells placed in the center, only protein migrating towards the negative pole was observed. If the pH of the electrophoresis buffer is raised one point above the pl of MblZF, the protein continued to migrate to the negative pole (B). The MblZF AHls protein also did not enter the gel (B). Fixing the RNA-protein complex by crosslinking with FA and resolving it in a denaturing gel (in which the SDS confers a negative charge on the protein) did not change the behavior of MblZF (C).
  • plO (1 mM) can bind to FAM- RNA (CUG) 23 (60 nM).
  • This binding is proportional to the amount of peptide and is detected from -500 ⁇ .
  • plO (1 mM) binds with lower affinity to short-sized repeats (FAM- (CUG) 4, 60 nM)
  • C Peptide binding to FAM- (CUG) 23 does not interfere with the interaction of the MblZF (D) protein, at least significantly in this assay.
  • Figure 25 Specificity of the plO peptide.
  • FIG. 26 plO binds with greater affinity to DMPK-CUG4.
  • A Tryptophan fluorescence extinction experiment of plO (5 ⁇ ). The peptide was incubated with different nucleic acids (2.5 ⁇ , 5 ⁇ , 7.5 ⁇ , 10 ⁇ and 12.5 ⁇ ). The fluorescence extinction rate (relative fluorescence is represented on the ordinate axis) was measured as the slope of the straight lines obtained by representing the fluorescence emission values at 351 nm relative to the free peptide for each concentration point. At least two measurements were made per point. In all cases, this rate was higher for DMPK-CUG4, although not significantly for CAG CUG4 (B).
  • DC circular dichroism spectrum
  • RNA Measures of emitted fluorescence (ordinate axis), measured as relative fluorescence units (URF), by 2-amino purine in an RNA (CUG) 23 (1 ⁇ ) in the presence of MblZF (0.1 ⁇ , 1 ⁇ , 2 ⁇ , and 5 ⁇ ) (A) or plO (0.1 ⁇ , 1 ⁇ , 2 ⁇ , 5 ⁇ and 100 ⁇ ) ( ⁇ ) relative to the fluorescence emitted by free RNA.
  • plO caused a 2.9-increase in fluorescence from 2-AP to 100 ⁇ , indicating a shift to a single chain.
  • Figure 29 Comparative test of several peptides of the invention (plO, pll, p5, pl2 and pl5) in the destructuring or opening of the CUG repetition forks.
  • This figure illustrates an experiment where the 2-amino purine test (as in the previous figure) is used to test 4 more peptides (pl l, p5, pl2 and pl5), in addition to plO, obtained from the deconvolution of the combinatorial peptide library.
  • the results indicate a correlation between the activity obtained with the peptides (Table 1) and the ability to deconstruct secondary structures and pass to the single chain of the CUG23 probe.
  • the concentration used in all cases is ⁇ (1: 100 ratio of RNA vs. plO), where plO had shown a positive response (previous figure). Therefore, this experiment shows that although plO is the preferred peptide being the most active, the rest of the peptides in Table 1, particularly pl l, p5, pl2 and pl5, also show appreciable levels of specificity and efficacy.
  • Figure 30 Assay of the peptides of the invention (particularly plO) in fork binding of different CUG repeats, such as AAG, CGG, CCUG and CAG.
  • This figure illustrates an experiment in which plO was tested and its ability to bind to different repeats of CUG but which are also involved in diseases where toxicity of ARs with repeat expansion has been described. Tryptophan extinction assay was used using (1) plO + AAG, CGG, CCUG and CAG at different RNA concentrations (5 ⁇ , 7.5 ⁇ and 10 ⁇ ). AAG is used as a reference repetition (control) because it is described that it does not form secondary structures. On the other hand in (2) the same experiment is shown but using one of the peptides obtained after the alanine tracing (ppyawa) and showing the results at the highest concentration (10 ⁇ ) of RNA used.
  • Intramuscular injection of 2% DMSO (-) or 10 ⁇ plO (+) increased the percentage of inclusion of exon 22 of Sercal transcripts 2 and 4 weeks later d / i (B, C and D) and exclusion of exon Fetal F of Tnnt3 1, 2 and 4 weeks after injection (d / i; A, B and C).
  • the plO peptide did not alter the processing of these transcripts in FVB or HSA SR mice, nor did it affect the Capzb (AC) control transcripts.
  • the figures (AC) show RT-PCR results carried out for 25 cycles. The horizontal lines join the left limb (injected with serum with 2% DMSO) and right (injected with 10 ig peptide) of the same animal, in that order.
  • the bars in (D) correspond to average values with their standard error. The p-values were found using a t-test.
  • the percentage of inclusion of exon 22 (ordinate axis) in FVB and HSA SR mice 4 weeks after the injection of 10 ⁇ g of plO was 100%. This value was 16.8% ⁇ 10.5 in the HSA LR animals injected with 2% DMSO in both legs. In the treated HSA LR animals, the inclusion percentage was 55.1% ⁇ 4.9 in the leg injected with plO and 31.5% ⁇ 9.8 in the left leg of the same animal (injected with serum with 2% DMSO).
  • HSA LR mice Anterior tibial muscle cryosections stained with hematoxylin eosin showing the presence of central nuclei in HSA LR (A) animals, while these are they have FVB (C) in the periphery of the cells.
  • plO reduced the percentage of fibers with central nuclei in HSA LR mice significantly after 4 weeks after injection of both 0.5 ⁇ g and 10 ⁇ g (B and D).
  • (1) Indicates animals whose control was injected with 0.2% DMSO.
  • Clcn-1 is one of the altered genes at the level of splicing in the musculature of patients with DM1 (A). It is observed that with the administration of plO normal levels of protein are restored at the membrane level (B). Intramuscular injection of plO was carried out at the level of the muscles of the back limbs of the mouse
  • Each vial of the library is formed by a mixture of 2.5 million peptides that share a single amino acid in a defined position and differ in the rest ( Figure 1A).
  • Figure 1A The principle on which the use of combinatorial chemical libraries in positional tracking format is based is that each of the positions of the molecule is tested independently of the others, so that it is possible to define which is the best candidate amino acid for each of the six positions of the hexapeptide.
  • the most active amino acids for each position were obtained. Based on combinations of these, peptides of defined sequence (what is known as deconvo luci n) were then synthesized (Figure IB) and these molecules were retested.
  • the 16 defined hexapeptides were tested at the highest possible concentration based on the percentage of DMSO in which they were dissolved. plO showed a significant increase in the number of females born compared to the control with DMSO at a concentration of 80 ⁇ .
  • Table 1 indicates the activity of the peptides of the invention. * indicates p-value ⁇ 0.05. - indicates that females were not born, both in control and treated tubes. Table 1
  • plO In order to confirm the effect of plO, it was subjected to dose-response tests at the following concentrations: 20 ⁇ , 40 ⁇ , 80 ⁇ , 125 ⁇ , 250 ⁇ (Figure 3).
  • plO showed no activity at 20 ⁇ and 40 ⁇ , while this increased to 80 ⁇ (resulting in a number of females 1.43 times greater than the control) and 125 ⁇ (with a number of females 1.47 times greater than the control).
  • ED50 effective dose 50
  • the peptide activity decreased, possibly due to a toxic effect of the peptide at higher concentrations.
  • plO was not toxic in any of the stages at any of the concentrations tested (67.5 ⁇ , 125 ⁇ , 250 ⁇ , 500 ⁇ and 1 mM; n: 150 in each case; Figure 4C), thus being able to exist a dependent toxic effect of genotype in the case shown in Figure 3.
  • the plO sequence allows 5 substitutions, so 5 new hexapeptides were synthesized that were tested on the phenotype of lethality in flies 103Y-Gal4; UAS-CTG (480) / + and commercial food. All of them showed less activity than the original molecule, indicating that all amino acids in the plO sequence are necessary for the final activity of the peptide in this functional assay (Figure 5).
  • Example 4 Validation of the activity of plO in other tissues. plO improves histological defects caused by CTG (480) in the indirect muscles of the flight.
  • plO The administration of plO suppressed at least part of the phenotypes caused by CTG (480). Since in the experimentation initially carried out in the present invention plO is added to the food, it was not possible to know how many molecules finally reached the cells. In order to accurately control the administration of plO and ensure the presence of the peptide in the same tissues and at the same time as the CUG transcripts (480), transgenic flies capable of expressing plO were generated endogenously and controlled using the Gal4 / UAS system.
  • pl7 contained the direct sequence of the peptide of SEQ ID NO: 10.
  • the peptides of the hexapeptide library are formed by D-amino acids.
  • D-forms (dextrogyras) of amino acids are stereoisomers of L-forms (levogyras) and only L-amino acids are synthesized in cells and incorporated into proteins. Therefore, if the arrangement of the plO side chains was important for their function, this would be lost as pl7 synthesized from L-aa by Drosophila.
  • the three constructs were micro injected into the precursors of the germline of embryos of Drosophila giving rise to 10 lines of transgenic flies for each transgene.
  • the obtained transgenic flies were crossed with the GMR-GaU UAS-CTG (480) / CyO and Mhc-GaU UAS-CTG (480) / TM6b recombinant fly lines generated during this invention, which directed the expression of CTG repeats in eye and muscle, respectively.
  • GMR-GaU UAS-CTG (480) / CyO and Mhc-GaU UAS-CTG (480) / TM6b recombinant fly lines generated during this invention which directed the expression of CTG repeats in eye and muscle, respectively.
  • GMR-Gal4 UAS-CTG (480) / + flies adults GMR-Gal4 UAS-CTG (480) / UAS-GFP had a strong rough eye phenotype.
  • Example 6 Study of the mechanism of action of plO. The results obtained in vivo demonstrated an effect of plO on the toxicity of CTG repeats.
  • Figure 13 shows several hypotheses that summarize how plO could exert its effect on cells.
  • plO could affect CUG transcript levels (480), either by interfering with the Gal4 / UAS system or by decreasing the stability of toxic ARs (Figure 13A).
  • plO could join CUG repeats by releasing nuclear factors sequestered by them, such as Mbl. In this way these proteins could perform their normal functions again (Figure 13B).
  • plO could also join CUG repetitions by preventing them from folding into toxic double-strand forks ( Figure 13C).
  • p l O could be acting on other proteins or transcripts downstream of the alterations caused by repetitions inhibiting, for example, Mbl antagonists and thereby compensating for the lack of function of these proteins ( Figure 13D).
  • plO affected the expression of CTG (480).
  • Mhc-Gal4 / +; UAS-luciferase / + flies were fed with the 250 mM peptide in homemade nutrient medium.
  • plO produced a slight decrease in the levels of light emission.
  • the presence of DMSO alone in the food of control flies caused an increase in luciferase protein levels.
  • Example 8 Study of the similarity between the sequences of plO and Mbl.
  • the amino acids of plO partially align with the reverse of a conserved sequence of the first zinc finger of the Muscleblind proteins, domain through the which proteins bind to RNA ( Figure 16).
  • the Tryptophan of plO coincides with the position of an Mbl phenylalanine (also aromatic, apolar and hydrophobic amino acid), which mediates the protein binding to CUG repeats. Given this similarity, it was decided to study the effect of the peptide on the binding of Mbl to toxic RNAs.
  • MblZF zinc fingers
  • MblZF protein was fused to 6 Histidines to facilitate its purification, as well as to the TEV protease cleavage site (Tobacco Etch Virus).
  • TEV protease cleavage site Tobacco Etch Virus
  • strain BL21 DE3 is a strain designed for expression systems based on the bacteriophage T7 promoter. This strain is suitable for the expression of non-toxic recombinant proteins.
  • E.coli strain BL21 pLys (DE3) has the advantage of constitutively expressing low levels of lysozyme T7, which reduces the basal expression of recombinant genes by inhibiting levels of AR polymerase T7.
  • the strain BL21 pLys (DE3) Codon + contains genes that encode tRNAs for human codons and that the bacteria have at very low levels.
  • zinc finger domains are nucleic acid binding domains that bind a zinc ion atom between their Cysteine and Histidine residues. Zinc metal is crucial for the stability of this type of domains since in its absence the zinc fingers unfold and lose the ability to join their targets.
  • the purification process was carried out by affinity chromatography in an FPLC system, along which the presence of zinc in the medium was maintained.
  • the protein elution peak occurred at approximately 300 mM imidazole ( Figure 17B).
  • the total protein concentration obtained was 2.73 mg / mL (198 ⁇ ; Figure 17C), which represents a yield of 1.4 mg of protein / L of culture. In subsequent batches of purification this value did not change significantly.
  • Circular dichroism is an electronic absorption spectroscopy technique based on the differential absorption of light beams circularly polarized to the right and left, by a molecule. Because different proteins have a different circular dichroism spectrum, this technique allows to identify the conformation of different molecules compared to a theoretical spectrum ( Figure 18B).
  • the circular dichroism spectrum obtained for MblZF in phosphate buffer resembles that described for MBNL1 zinc fingers, with a pronounced peak at 203 nm, which denoted lack of structure, and a weak peak at 220 nm, alpha helix indicator ( Figure 18A).
  • fluorescence polarization assays stand out for their speed and sensitivity. This technique is based on changes in the rotational movement of fluorescent molecules in suspension.
  • a polarized beam of light excites a fluorophore conjugated to a small molecule, it undergoes rotational diffusion faster than the time necessary for the emission of light to occur, resulting in a random arrangement of the molecule at the time. of fluorescence emission (depolarization).
  • the rotation of the molecule becomes slower when the viscosity of the medium or the molecular volume changes, increasing the polarization of the emitted light.
  • RNA produced by plO in the FP assay are small, probably due to the low molecular weight of the molecule (less than 900 Da). For this reason, it was decided to complement the study with gel delay experiments. These tests are based on the differences in electrophoretic mobility between Stable protein-nucleic acid complexes and their components separately. Because FAM- (CUG) 23 RNA was available, it was decided to carry out a fluorescent gel delay test. After determining the optimal amount of RNA for detection (60 nM; Figure 21 A), the link between it and MblZF was studied. This binding caused both a decrease in the intensity of the band corresponding to the free RNA in the gel and the appearance of a signal inside the well of the gels (bound RNA).
  • RNA of 4 repetitions CUG FAM- (CUG) 4
  • the zinc finger can join MBNL1 CUG repeats consist of a minimum of four triplets provided loop formation or 'loop' 'adding 4 nucleotides not complementary to half of the sequence is provided.
  • MblZF joined FAM- (CUG) 4 but the complex formed was also retained in the well.
  • the isoelectric point (pl) of MblZF is 9.5.
  • the pH of the electrophoresis buffer used in our tests is 8.5, which means that the total charge of MblZF in the gel is positive.
  • Delay gels are non-denaturing gels, so there is no SDS present in the medium that confers a negative charge on the molecule so that it Migrate to the positive pole. In general, in gel retardation tests this is not usually an inconvenience, since the RNA has a negative charge and is capable of dragging the complex during electrophoresis.
  • the FAM- (CUG) 23-MblZF crosslinking complex with formaldehyde (FA) was fixed and the reaction was run on a polyacrylamide gel under denaturing conditions (in the presence of SDS; Figure 23C) or, alternatively, adding Serva Blue G which confers load on the proteins without denaturing them. In no case do we get the complex to penetrate inside the gel.
  • plO In order to determine if plO could compete with MblZF for RNA binding, both were incubated in the presence of FAM- (CUG) 23. plO did not prevent the binding of MblZF, since in this case all the RNA was retained in the well ( Figure 24D). This could be due either to a synergistic effect between the protein and the peptide or to an additive effect if both bind to sites other than RNA.
  • CUG FAM-
  • RNAs a single stranded RNA formed by 19 nt of the 3'UTR region of the DMPK gene
  • dsRNA + cs an RNA formed of 4 CUG repeats fused to the single stranded DMPK sequence
  • dsRNA + cs an RNA capable of forming a perfect double strand fork formed by 4 CAG CUG repeats
  • dsDNA a DNA formed by 4 CTG repeats
  • Tryptophan has a maximum absorption at a wavelength of 280 nm and a maximum emission peak between 300 and 350 nm (depending on the polarity of the solvent). The fluorescence of this residue changes when the conformation of the protein in which it is found is modified by, for example, its binding to another molecule.
  • the slope of the curve was significantly greater for the DMPK-CUG4 molecule (-0.034 ⁇ 0.003) than for CTG4 (-0.019 ⁇ 0.005) and DMPK (RNA: -0.024 ⁇ 0.003 and DNA: -0.028 ⁇ 0.002) (p- value ⁇ 0.01).
  • RNA -0.024 ⁇ 0.003
  • DNA -0.028 ⁇ 0.002
  • p- value ⁇ 0.01 p-value>0.1; Figure 26B.
  • the DMPK-CUG4 molecule contained the CUG repeats in its DMPK environment. Overall, this indicated that there was binding selectivity on the part of the peptide to its targets, because it was possible that in vivo it preferentially bound toxic toxins.
  • mice of the wild strain FVB mice of the wild strain FVB. Due to the low absorption of the peptides through the walls of the intestine, it was decided to perform intramuscular injections in the anterior tibial muscle of animals 4-5 weeks of age using four different doses (0.5 ⁇ g, 1 ⁇ g, 10 ⁇ g and 100 ⁇ g ) with a total of 6 mice per dose (3 females and 3 males). After 4 weeks after the injection, the animals were sacrificed and a visual autopsy was performed, as well as a logical histomorphic study of the muscle and blood tests ( Figure 31). Injected animals with the same amount of DMSO were used as a control (0.2% for doses 0.5 ⁇ g and 1 ⁇ g and 2% for doses 10 ⁇ g and 100
  • mice treated with the 100 ⁇ g dose died approximately 11 days after injection (d / i), confirming the toxicity of plO from a threshold point. From one of these two animals blood could be drawn just before his death. This mouse had extremely high values of urea, creatinine, CPK and GGT in blood (eg, a value 28 times greater for CPK than the upper limit of standard values and 15 times greater than its control with DMSO).
  • Example 14 plO reversed the splicing defects of the Sercal and Tnnt3 transcripts in HSA LR plO mice suppressed the effect of CTG (480) on the CNS, muscle and eye of Drosophila and joined CUG repeats in vitro.
  • CTG 480
  • CTG 480
  • HSA human skeletal actin
  • exon In the healthy population, such exon is excluded in fetal forms and is included in the adult. However, in both patients and HSA LR mice, exon 22 is excluded throughout life, thus maintaining a fetal pattern in adult individuals. Tnnt3 protein is found in the sarcomeres of rapid muscle fibers in skeletal muscle. Its transcripts undergo alternative splicing of the so-called fetal exon F. In the healthy population this exon is absent in adult individuals, while in patients with DM1 and HSA LR mice the fetal exon is maintained.
  • HSA LR mice In order to determine if plO could reverse Sercal and Tnnt3 splicing defects in HSA LR mice, intramuscular injections of the peptide were carried out at two doses: 0.5 ⁇ g and 10 ⁇ g. The treated animals were sacrificed 1 week, 2 weeks and 4 weeks after the injection, and the anterior tibial muscle was dissected from both the right leg (injected with p 10) and the left (injected with saline serum with 0.2% DMSO for the 0.5 ⁇ g dose and 2% for the 10 ⁇ g dose). As control, FVB animals and HSA SR animals were used (which express 5 CUG repeats in human skeletal actin transcripts) injected in both legs similarly, as well as HSA LR mice in which serum was injected with DMSO in both limbs .
  • plO increased the percentage of inclusion of exon 22 by 1.3% (1 week d / i, p-value> 0.05), 25.9%> (2 weeks d / i, p-value ⁇ 0.05) and 38.3% (4 weeks d / i, p- value ⁇ 0.01) ( Figure R40D).
  • plO did not affect the splicing of the muscle transcripts of the Capzb gene, which were used as a specificity control since their processing is not altered in the HSA LR model mice ( Figure 32A-C).
  • the main histological feature of both DM1 and HSA LR animals is the presence of central nuclei in muscle fibers. Injection of 0.5 ⁇ and 10 ⁇ in the anterior tibial muscle of these animals significantly reduced the percentage of cells with central nuclei compared to the HSA LR animals treated with DMSO, while producing no changes in FVB mice ( Figure 34) . This effect was more pronounced after 4 weeks after injection, indicating that it was a slow process.
  • mice validate the therapeutic potential of plO in mammals, opening new avenues of study in the search for treatments for DM1 and DM2 and SCA8.
  • Example 16 Comparative test of several peptides of the invention (plO, pll, p5, pl2 and pl5) in the destructuring or opening of the different CUG repetition forks such as AAG (control), CGG, CCUG and CAG.
  • the 2- aminopurine assay is used to test 4 more peptides (pl l, p5, pl2 and pl5), in addition to plO, obtained from the deconvolution of the peptide combinatorial library explained in this invention.
  • the results indicate a correlation between the activity obtained with the peptides (Table 1) and the ability to deconstruct secondary structures and pass to the single chain of the CUG23 probe.
  • the concentration used in all cases is ⁇ .

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Abstract

Compuestos para ser usados en el tratamiento de enfermedades basadas en la expresión de transcritos tóxicos.La presente invención hace referencia a moléculas peptídicas, concretamente hexapéptidos, para la prevención y/o tratamiento de enfermedades cuya etiología se basa en la presencia de transcritos tóxicos que comprenden repeticiones CUG, CCUG, CGG, CAG y AAG, preferentemente: DM SCA8, DM2, FXTAS, HD y FA.

Description

COMPUESTOS PARA SER USADOS EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES BASADAS EN LA EXPRESIÓN DE TRANSCRITOS
TÓXICOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención hace referencia a compuestos que comprenden hexapéptidos, para ser usados en la prevención y/o tratamiento de enfermedades cuya etiología se basa en la expresión de transcritos tóxicos que comprenden repeticiones CUG, CCUG, CGG, CAG y AAG como, por ejemplo, Distrofia Miotónica tipo 1 (DM1), Ataxia spinocerebellar de tipo 8 (SCA8), Distrofia Miotónica tipo 2 (DM2), Síndrome de temblor/ataxia asociado a X Frágil (FXTAS), enfermedad de Huntington (HD) y Ataxia de Friedreich (FA), respectivamente.
Por lo tanto la presente invención puede ser englobada en el campo de la medicina en general y más específicamente en el campo relacionado con la prevención y/o tratamiento de enfermedades genéticas de carácter hereditario. ESTADO DE LA TÉCNICA
La DM1 o enfermedad de Steinert (DM1, OMIM #160900) es el tipo de distrofia muscular más frecuente en la población adulta con una prevalencia mundial de aproximadamente 1 paciente cada 8000 personas, siendo clasificada como enfermedad rara. Es una enfermedad neuromuscular, con síntomas definitorios que afectan principalmente al músculo, tales como miotonía y debilidad muscular, aunque es característicamente multisistémica viéndose afectados entre otros órganos y sistemas el sistema cardiaco (arritmias cardiacas), el ocular (cataratas), el endocrino (hiperinsulinemia) y el sistema reproductor (hipogonadismo).
A nivel genético la DM1 presenta un patrón de herencia autosómico dominante, penetrancia alta y expresividad variable. El origen de la enfermedad está en una mutación dinámica en la región 3 ' no traducida (3 'UTR) del gen proteína quinasa de la distrofia miotónica (DMPK, Entrez #1760), localizada en la región cromosómica 19ql3.2-ql3.3. Dicha mutación consiste en una expansión anormal de repeticiones del trinucleótido CTG en el exón 15 de dicho gen DMPK, que en la población sana aparece en número variable de entre 5-35 copias, mientras que en los pacientes se encuentra en número mayor de 50. El número de tripletes CTG correlaciona con la gravedad de los síntomas y edad a la que éstos aparecen. Así, para los casos en los que el número de repeticiones oscila entre 50 y unos pocos cientos se habla de DM1 de inicio adulto, donde las primeras manifestaciones clínicas suelen aparecer en la segunda década de vida. Para los casos en los que el número de repeticiones es mayor, alcanzando incluso los miles de copias, la patología se manifiesta ya desde el nacimiento en forma de DM congénita (DMC o enfermedad de Thomsen), siendo ésta la variante más grave de la enfermedad, con síntomas como retraso mental, trastornos respiratorios y problemas en la diferenciación muscular, entre otros.
En los últimos años, se han propuesto una serie de hipótesis en relación a mecanismos moleculares relacionados con la patogénesis de la DM1, siendo uno de los más consensuados la ganancia de función tóxica del ARN. Según este mecanismo los ARNs portadores de expansiones CUG forman horquillas que resultan tóxicas para las células que las expresan provocando, entre otras alteraciones moleculares, cambios en el splicing alternativo de transcritos definidos, por secuestro de factores reguladores del mismo. Un apoyo decisivo para esta hipótesis proviene del trabajo de Mankodi et al. (2000) en ratones transgénicos. Dichos ratones expresan aproximadamente 250 repeticiones del trinucleótido CUG en un ARNm heterólogo desarrollando miotonía y defectos musculares típicos de la DM1, demostrando que las expansiones CUG ejercen un efecto tóxico por sí mismas independientemente del contexto en el que estén (Mankodi et al., 2000). Posteriormente, otros modelos generados en Drosophila confirmaron la toxicidad de las repeticiones CUG independientemente de DMPK (Garcia-Lopez et al, 2008). Desde el descubrimiento de que ARNs con expansiones CUG pueden resultar tóxicos para las células, toda una serie de evidencias científicas apoyan que estas expansiones, o expansiones parecidas, en otros ARNs, pueden originar patologías genéticas hereditarias semejantes a la DM1. Por ejemplo, en la DM2, las expansiones del tetranucleótido CCUG en el primer intrón de los ARNs transcritos del gen ZNF9 (proteína de dedos de zinc 9, Entrez #7555) desencadenan una patología muy semejante a la DM1 (OMIM #602668). De hecho en el estado de la técnica es conocida la existencia de genes relacionados con la función nerviosa que presentan niveles alterados tanto en pacientes de DM1 como de DM2, lo cual apoya la idea de un mecanismo de patogénesis común a ambas enfermedades.
Por su parte, la ataxia espinocerebelar tipo 8 (SCA8, OMIM #603680) es una enfermedad neurodegenerativa causada por la expansión de tripletes CTG en un transcrito no codificante del gen SCA8. Se ha visto que la transcripción bidireccional de este gen conduce tanto a la expresión de ARNs con expansiones CUG (no traducidos), que desencadenan alteraciones moleculares relacionadas con las descritas para la DM1, como a transcritos con expansiones CAG que se traducen en proteínas con poliglutaminas.
En el núcleo, los ARNs portadores de expansiones CUG se pliegan formando una estructura en horquilla capaz de unir y secuestrar factores de unión al ARN, formando grandes inclusiones ribonucleoproteicas. Hasta la fecha, se ha descrito que las repeticiones CUG interfieren con la actividad de un número creciente de proteínas nucleares, las cuales incluyen factores de transcripción y factores de splicing alternativo. Entre éstos últimos se encuentran las ribonucleoproteínas heterogéneas nucleares hnRNP F y hnRNP H, así como las proteínas de la familia MBNL1-3 (Muscleblind-like proteins). Debido a este secuestro, los pacientes presentan alteraciones en el procesado alternativo de centenares de transcritos específicos, lo que llevó a acuñar el término de espliceopatía, para la cual la DM1 es el primer ejemplo descrito. También se ha propuesto que la actividad de distintos micro ARNs podría verse alterada.
El secuestro de proteínas nucleares impide a las mismas realizar sus funciones normales en la célula. Se han aislado y caracterizado varias proteínas capaces de unirse a horquillas CUG de doble cadena tanto in vitro como in vivo. Entre ellas destacan factores de transcripción como la proteína de especificidad 1 (Spl), el receptor gamma del ácido retinoico (RARy) o los miembros de la familia de transductores de señal y activadores de la transcripción STAT1 y STAT3. Algunos de estos factores pueden llegar a sufrir un secuestro de hasta el 90% en células DM1 en cultivo, lo cual les impide activar la transcripción de sus genes diana, disminuyendo así su expresión. Otros factores de transcripción alterados en la DM1 son NKX2-5 y MyoD. Estas proteínas están relacionadas con el desarrollo y conducción cardíaca, y con la diferenciación de mioblastos, respectivamente. Los niveles de NKX2-5 están aumentados en los pacientes, mientras que MyoD está reducida. El motivo por el cual los niveles de estos factores de transcripción están desregulados, así como su relación con la formación de horquillas CUG, se desconoce.
Hasta la fecha varios trabajos han demostrado que las repeticiones CUG afectan a la expresión de un gran número de genes. Utilizando microarrays de ratón, se han detectado al menos 175 transcritos musculares alterados por la expresión de transcritos CUG expandidos. Además, al menos 128 transcritos están también desregulados en ratones knockout de MBNLl, sugiriendo que el secuestro y subsiguiente pérdida de función de MBNLl juega un papel crucial en la enfermedad.
Los ratones knockout de MBNL l presentan cataratas del tipo iridiscente, sufren miotonía y defectos histológicos a nivel muscular. Los ratones knockout de MBNL2 también desarrollan miotonía (por un procesado incorrecto de los transcritos Clcn-1) y otras alteraciones musculares típicas de la DM1. Además, la sobreexpresión de MBNLl en ratones modelo que expresan 250 repeticiones CTG revierte los defectos en el procesado de al menos 4 transcritos (Sercal, Clcnl, Tnnt3 y ZASP), así como la miotonía. En Drosophila, los embriones mutantes mbl presentan desorganización de las bandas Z de los sarcómeros, hipercontracción del abdomen y alteraciones en el procesado alternativo de transcritos como ZASP, troponina T (tnT) y la a-actinina. Del mismo modo, la sobreexpresión de MBNLl en moscas modelo que expresan 480 repeticiones CTG suprime fenotipos provocados por las repeticiones. Todos estos resultados supusieron un importante cambio en el estudio de la DM1, a partir del cual las proteínas Muscleblind (Mbl) se han considerado un elemento determinante en el desarrollo de la enfermedad.
A pesar de que la DM fue descrita por primera vez en 1909, todavía no se dispone de una terapia eficaz. Todos los tratamientos que se aplican son paliativos y ayudan a frenar el desarrollo de síntomas, pero en ningún caso evitan su aparición o tratan la enfermedad de forma definitiva. En la actualidad no existe ningún compuesto capaz de revertir la falta de la conductancia al cloro para reducir la miotonía. Algunos compuestos, como el mexitil, quinidina, fenitoína, procainamida o carbamazepina, que inhiben la entrada de sodio necesario para el inicio y propagación de impulsos, se administran a los pacientes con el fin de tratar este síntoma. En ocasiones, dichas moléculas se utilizan a su vez como tratamiento para las arritmias cardíacas, por lo que dado el riesgo que implican por su efecto sobre la función cardíaca es preferible evitar su uso como antimiotónicos. Además, muchos de estos tratamientos disminuyen la fuerza muscular . Otro inhibidor de canales de sodio , el sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEAS), se ha ensayado en pacientes en los que parece disminuir con éxito la miotonía y los problemas cardíacos, sin potenciar la debilidad muscular. El DHEAS es una hormona esteroidea presente de manera abundante en el suero y cuyos niveles disminuyen con la edad. En los pacientes de DM1, esta hormona está reducida hasta un 60%. Además, la dosis efectiva del DHEAS es muy alta, por lo que ha de administrarse por vía intravenosa, lo cual supone un inconveniente para su uso como tratamiento crónico. En algunos casos se administra creatinina junto con DHEAS para incrementar la fuerza muscular. Sin embargo, a pesar de que los primeros ensayos clínicos con creatinina en pacientes mostraron resultados prometedores, los estudios posteriores no son tan positivos. Otros fármacos ensayados para tratar la miotonía comprenden antidepresivos tricíclicos, benzodiazepinas, antagonistas del ión calcio, taurina o prednisona, con resultados contradictorios. En base al anterior mecanismo de acción de la enfermedad que propone al secuestro y subsiguiente pérdida de función de las proteínas Muscleblind como el principal desencadenante de la enfermedad, se han desarrollado estrategias para encontrar moléculas que inhiban la interacción entre MBNL1 y las horquillas con repeticiones CUG. Así, se han identificado compuestos capaces de inhibir dicha interacción in vitro. Las moléculas de secuencia ((Quin/Pip)-(Asn/Pro)-Cys-Lys) fueron capaces de desplazar a MBNL1 en la unión a las repeticiones. Además, los antibióticos pentamidina y neomicina B, así como el bromuro de etidio y el naranja de tiazol, inhibieron la unión de MBNL1 a las repeticiones CUG. Además, la pentamidina revertía los defectos de splicing de los transcritos IR y TNNT2 en células HeLa en cultivo, y reducía en un 21% la formación de inclusiones nucleares que contenían MBNL1. En ratones modelo de DM1 , la pentamidina también mejoró el splicing del Clcn-1 y Sercal, aunque de manera discreta y sin una respuesta a dosis clara. De este modo, la pentamidina es el primer ejemplo de molécula identificada in vitro con un efecto terapéutico potencial sobre las repeticiones CUG in vivo. No obstante, esta molécula podía afectar al procesado de otros transcritos diana de MBNLl en ausencia de repeticiones, lo que podría contrarrestar su valor terapéutico a largo plazo. También se ha desarrollado en el estado de la técnica una molécula basada en la estructura tridimensional de las repeticiones CTG y/o CUG, cuya diana fuesen los desapareamientos T-T o U-U. A pesar de que ya se conocían moléculas pequeñas capaces de unirse a G-G, C-C o A-A, hasta la fecha no se había encontrado ningún compuesto que se uniese a T-T o U-U de manera selectiva. Así, se evidenció que el ligando formado por triaminotriazina (que interacciona con T-T y U-U) más acridina (agente intercalante) se unía a repeticiones CTG y CUG de manera específica y con alta afinidad respecto a otras secuencias.
Además, en el estado de la técnica se divulga el diseño de un pentámero del compuesto Hoechst 33258 capaz de unirse a repeticiones CUG y CAG e inhibir la formación de complejos ARN-MBNL1 en ambos casos. Esta molécula era permeable y no tóxica al menos en mioblastos de ratón. También se desarrolló en paralelo un ligando con alta afinidad por moléculas de ARN con dos desapareamientos internos ricos en pirimidinas, como los formados por las repeticiones CCUG en la DM2. Este compuesto consistía en tres módulos de 6'-N-5-hexinoato de kanamicina A unidos a un esqueleto peptoide y separados entre sí por cuatro monómeros espaciadores. Reducir el número de espaciadores de cuatro a dos convertía a esta molécula en un ligando con mayor afinidad por repeticiones CUG que CCUG.
Estas estrategias o compuestos presentes en el estado de la técnica consiguen que MBNL l se libere revirtiendo defectos de splicing. Además, al disiparse las inclusiones nucleares habría más transcritos DMPK libres en el citoplasma para traducirse. Sin embargo, la redistribución de los ARN mutantes podría tener un nuevo efecto tóxico. Aunque la formación de agregados de CUG y MBNLl en el citoplasma de cardiomiocitos no causa defectos en ratones, otras proteínas podrían verse afectadas a corto o largo plazo. Además, las moléculas que interfieren con la unión entre MBNLl y CUG podrían también inhibir la unión de MBNLl a otros transcritos diana en el núcleo, tal como se ha encontrado para la pentamidina, o interferir con otras proteínas con un mecanismo de unión al AR similar a MBNL1. Por último, cualquier aproximación terapéutica basada en MBNL1 presenta la limitación de que no toda la toxicidad de las repeticiones CUG se debe al secuestro de MBNL1.
La mayoría de enfermedades neuromusculares tienen su origen en mutaciones en un único gen y son, por tanto, buenas candidatas para el desarrollo de terapias génicas. Sin embargo, en el caso de la DM1 los tejidos involucrados son principalmente post- mitóticos, lo que supone un inconveniente frente a la mayoría de vectores virales. En este sentido, se ha propuesto que utilizar moléculas como los oligonucleótidos antisentido (ONAs) podría resultar ventajoso. Los oligonucleótidos antisentido no aportan una copia del gen, sino que modulan los productos de un gen existente. En la actualidad, varias moléculas basadas en esta estrategia se encuentran ya en fase clínica. Un ejemplo es el caso de la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD, OMIM #300377), para la cual la empresa AVI Biopharma posee dos moléculas en fase preclínica en los Estados Unidos, una de las cuales está ya en fase clínica lb/2 en el Reino Unido (www.avibio.com). En el estado de la técnica se conoce el uso de ONAs en ratones modelo que expresan 250 repeticiones CTG, así como en ratones knockout de MBNL1, y se ha estudiado su efecto sobre el splicing del exón 7a de los transcritos Clcn-1. En ambos modelos una sola inyección en el músculo tibial anterior recuperó el patrón de splicing normal de los transcritos Clcn-1 durante al menos tres semanas, revirtiendo la miotonía. Sin embargo, debido al amplio número de mensajeros cuyo procesado se encuentra alterado en los pacientes, deberían combinarse varios ONAs con dianas diferentes para tratar los distintos síntomas de una manera eficaz.
Una alternativa al uso combinado de ONAs es utilizar oligonucleótidos antisentido que actúen a nivel de los transcritos DMPK con el fin de eliminar la fuente de toxicidad. En el estado de la técnica ya se han realizado ensayos dirigidos a la inhibición de la expresión de DMPK en células de pacientes en cultivo utilizando ONAs específicos. Sin embargo, esta aproximación no discriminaba entre transcritos mutantes y transcritos salvajes. Disminuir la expresión total de DMPK podría resultar igualmente patológico dada la importancia de DMPK en la función cardíaca y el metabolismo de la insulina. Varios trabajos presentes en el estado de la técnica han utilizado ONAs formados por repeticiones CAG (CAG7 o CAG25) con el fin de dirigir su efecto preferentemente sobre los transcritos con repeticiones CUG largas. Tanto en mioblastos en cultivo como en ratones modelo de DM1, estos oligonucleótidos revirtieron los defectos de splicing del Clcn-1, además de reducir hasta un 50% los niveles del transcrito muíante de manera específica, probablemente debido a que la unión de secuencias cortas de repeticiones CAG a los AR s tóxicos promueve la formación de heteroduplex sin desemparejamientos, lo cual evita el secuestro de proteínas como MBNLl, para las cuales los desemparejamientos entre pirimidinas son elementos estructurales esenciales para la unión.
Así, las moléculas conocidas en el estado de la técnica tienen como mecanismo principal de actuación la inhibición del secuestro ejercido por las horquillas con repeticiones CUG sobre las proteínas MBNL, evitando la interacción entre las horquillas y las proteínas MBNL, sin ejercer un efecto directo en la desestructuración de las horquillas.
En cambio, la presente invención se focaliza en el rastreo de fármacos a partir de quimiotecas con el fin de identificar compuestos con actividad biológica relevante para tratar enfermedades cuya etiología se basa en la presencia de transcritos tóxicos que comprenden repeticiones CUG o CCUG como, por ejemplo: DM1, DM2 y SCA8. Los compuestos de la presente invención se basan en un mecanismo de acción más efectivo que los conocidos en el estado de la técnica ya que, según el mecanismo de acción más probable, se unen y desestructuran las horquillas de doble cadena formadas por los fragmentos tóxicos con repeticiones CUG, o mantiene el ARN con las expansiones en una conformación de cadena sencilla, evitando por tanto la unión aberrante de MBNLl y de cualquier otra molécula cuya unión también pudiera causar o empeorar el fenotipo patológico. Además, al no competir con la unión aberrante de MBNLl a horquillas CUG, las cuales son muy semejantes estructuralmente con las dianas naturales de la proteína, no se espera que interfiera con los transcritos regulados por MBNLl en la célula. En la presente invención se empleó la mosca Drosophila como modelo de toxicidad de las repeticiones CTG (Garcia-Lopez et al, 2008), donde se ensayaron los compuestos de la invención y se determinó su mecanismo de acción sobre la toxicidad de repeticiones CTG. Posteriormente se validó su eficacia en modelos vertebrados de DM1. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En la presente invención se llevó a cabo un procedimiento para la identificación de compuestos con potencial terapéutico para prevenir o tratar enfermedades cuya etiología se basa en la presencia de transcritos tóxicos que comprenden repeticiones CUG, CCUG, CGG, CAG y AAG como, por ejemplo: DM1, SCA8, DM2, FXTAS, HD y FA, que comprende el rastreo de quimiotecas de hexapéptidos in vivo, preferentemente en un modelo de la enfermedad en Drosophila, y la selección de aquellos compuestos que revierten el estado patológico.
El tamaño de las moléculas a utilizar para la búsqueda de agentes potencialmente terapéuticos es un aspecto importante a considerar, ya que un peso molecular demasiado alto limita la absorción del compuesto por parte de las células. La optimización de moléculas para dar lugar a compuestos más activos suele venir acompañada de un incremento en el tamaño final de los mismos. Sin embargo, un peso molecular mayor de 1000 reduce el potencial terapéutico de las moléculas al disminuir su bio disponibilidad, lo cual hace necesario partir de compuestos pequeños. De esta manera, el 80% de los fármacos comercializados en la actualidad tiene un peso molecular por debajo de 450. El peso molecular medio de un aminoácido es de unos 135 Da. El tamaño aproximado de un hexapéptido, por tanto, varía entorno a 810 Da. Rastrear librerías de péptidos formados por un número de aminoácidos mayor de 6 daría lugar a moléculas demasiado grandes. Por otro lado, a pesar de que existen colecciones de di, tri, tetra y pentapéptidos, el aumentar el número de aminoácidos que forman la molécula da lugar a una mayor cantidad de péptidos definidos durante la deconvo lució n, incrementando la probabilidad de encontrar un compuesto activo.
Se observó que el fenotipo exhibido por el modelo de Drosophila descrito en (Garcia- López et al, 2008), que expresa 480 repeticiones CTG (CTG(480)) originando un fenotipo de letalidad en el estadio de pupa madura, responde a niveles de Mbl y es susceptible de modificación química, lo cual convierte a este modelo en adecuado para la búsqueda sistemática de compuestos con potencial terapéutico para prevenir o tratar enfermedades cuya etiología se basa en la presencia de transcritos tóxicos que comprenden repeticiones CUG, CCUG, CGG, CAG y AAG como, por ejemplo: DM1, SCA8, DM2, FXTAS, HD y FA. La presente invención comienza con el rastreo de una quimioteca combinatoria de péptidos en formato de rastreo posicional. Esta quimioteca estaba formada por 120 viales, cada uno de los cuales consistía en una mezcla de hexapéptidos que comparten un único aminoácido en una posición concreta y difieren en el resto. De esta manera, al detectar un vial positivo se identifica un aminoácido activo en una posición determinada. La combinación de los aminoácidos más activos en cada una de las posiciones ensayadas (viales) es lo que se conoce como deconvolución. En una realización preferida de la invención, con el objetivo de prolongar la vida media de los péptidos en el organismo, los péptidos de la quimioteca utilizada en la presente invención se compusieron de los estereoisómeros D de los aminoácidos naturales, los cuales no son reconocidos por las proteasas en el intestino y son menos susceptibles a degradación.
Así, la presente invención hace referencia a compuestos que comprenden hexapéptidos con contrastado potencial terapéutico in vivo en Drosophila y ratón para la prevención y/o tratamiento de enfermedades cuya etiología se basa en la presencia de transcritos tóxicos que comprenden repeticiones CUG, CCUG, CGG, CAG o AAG como, por ejemplo: DM1 , SCA8, DM2, FXTAS, HD y FA. El mecanismo de acción de los compuestos de la presente invención es más efectivo que el ejercido por los compuestos conocidos en el estado de la técnica ya que son capaces de unirse y desestructurar las horquillas de doble cadena formadas por los fragmentos tóxicos con dichas repeticiones, o mantener el ARN con las expansiones en una conformación de cadena sencilla, evitando tanto la unión aberrante o secuestro de MBNL, como de cualquier otra molécula cuya unión a horquillas CUG también pudiera causar o empeorar el fenotipo patológico. Más específicamente, en la presente invención se ensayaron compuestos que comprenden péptidos de Fórmula (I) (A-B-C-D-E-F) o estereoisómeros, mezclas, sales farmacéuticamente aceptables o péptidos miméticos de los mismos. A continuación se definen los aminoácidos que pueden formar parte de cada una de las posiciones A a F de la Fórmula I, utilizando para nombrar a dichos aminoácidos tanto el código de tres letras como el código de una letra minúscula con la que por convención se suelen representar los estereoisómeros de los aminoácidos naturales: • A puede ser los aminoácidos cys (c) ó pro (p),
• B puede ser los aminoácidos pro (p) ó gln (q),
• C es el aminoácido tyr (y),
• D puede ser los aminoácidos ala (a) ó thr (t),
· E puede ser los aminoácidos gln (q) ó trp (w); y
• F es el aminoácido glu (e),
En una realización preferida los aminoácidos que forman parte de los péptidos de la invención son D-aminoácidos, los cuales no son reconocidos por las proteasas en el intestino y son menos susceptibles a degradación. Sin embargo, tal y como se demuestra en los ejemplos, los péptidos formados por L-aminoácidos también son activos.
En la presente invención se entiende por péptido mimético a una molécula orgánica de carácter peptídico caracterizada por una secuencia complementaria, homologa y/o equivalente a la de los péptidos de la Fórmula (I). Los compuestos de la presente invención también comprenden secuencias complementarias, homologas y/o equivalentes funcionales de los péptidos de Fórmula general I. En una realización preferida, los compuestos de la presente invención comprenden una secuencia homologa la cual tiene al menos un 80% de identidad u homología con la secuencia del péptido de fórmula general I. Además, los compuestos de la presente invención pueden comprender péptidos que sean análogos químicos de los de la Fórmula I, péptidos cíclicos derivados, dímeros y/o multímeros.
Tal y como se evidencia en la presente invención, los compuestos que comprenden los péptidos arriba citados pueden ser usados en la prevención y/o tratamiento de enfermedades cuya etiología se basa en la presencia de transcritos tóxicos que comprenden repeticiones CUG, CCUG, CGG, CAG o AAG como, por ejemplo: DM1, SCA8, DM2, FXTAS, HD y FA. Los hexapéptidos correspondientes a las secuencias SEQ ID NO : 1 a 16 fueron ensayados en el tratamiento de dichas enfermedades, siendo especialmente preferido el hexapéptido plO (SEQ ID No: 10) que revirtió la toxicidad en el modelo de Drosophila arriba citado, tanto en cerebro, como en músculo, de manera dependiente de dosis en ambos casos. Además, la expresión endógena de un péptido de secuencia que comprende plO, en su configuración retroinversa, revirtió fenotipos en ojo y músculo de las moscas modelo confirmando el efecto de plO y de derivados suyos sobre la toxicidad de las repeticiones CTG. Los resultados del rastreo de alaninas, así como de la generación de moscas transgénicas, demostraron que todos los aminoácidos de la secuencia de plO son necesarios para su actividad y que ésta reside en las cadenas laterales de sus residuos. plO se une a repeticiones CUG in vitro desplegando la horquilla. Esta unión depende de la secuencia del péptido y es mayor cuando el número de repeticiones aumenta. La inyección intramuscular de plO en ratones modelo de la DM1 revirtió los defectos de splicing de los transcritos musculares, así como defectos a nivel histológico. Este efecto es sistémico y se mantuvo durante al menos 4 semanas tras una sola inyección.
Aunque, tal y como se cita más arriba, plO es el compuesto preferido de la presente invención debido a que es el más eficaz de los ensayados, la presente invención también demuestra que otros compuestos comprendidos dentro de la Fórmula I, como por ejemplo, pl 1, p5, pl2 y pl5, también presentan diferentes grados de especificidad y eficacia en presencia de transcritos tóxicos CUG (ver Ejemplo 16 y Figura 29)
Por lo tanto la presente invención se refiere en un primer aspecto a compuestos que comprenden los hexapéptidos de Fórmula I, o miméticos de los mismos, para ser usados en la prevención y/o tratamiento de enfermedades cuya etiología se basa en la presencia de transcritos tóxicos que comprenden repeticiones CUG, CCUG, CGG, CAG y AAG como, por ejemplo: DM1, SCA8, DM2 FXTAS, HD y FA.
Un segundo aspecto de la presente invención hace referencia al uso de dichos compuestos para la elaboración de una composición farmacéutica destinada a la prevención y/o tratamiento de enfermedades cuya etiología se basa en la presencia de transcritos tóxicos que comprenden repeticiones CUG, CCUG, CGG, CAG, y AAG como, por ejemplo: DM1, SCA8, DM2 FXTAS, HD y FA.
Los compuestos descritos en la presente invención pueden utilizarse como principios activos en pacientes humanos o en animales pudiendo ser preparados en formulaciones y/o administrados, de acuerdo a los conocimientos existentes en el estado la técnica del desarrollo galénico. Así, un tercer aspecto de la presente invención hace referencia a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos uno de los péptidos de la invención en combinación con al menos otro principio activo. La composición también podría comprender al menos un excipiente como sustancia inactiva acompañante del principio activo que, por ejemplo, ayude a la absorción de dicho principio activo en el cuerpo o a su activación.
Dichos excipientes podrían estar destinados al mantenimiento de los ingredientes de la composición unidos como por ejemplo: almidones, azúcares o celulosas; rellenos como por ejemplo: celulosa vegetal, fosfato de calcio dibásico, flor de cártamo; desintegrantes; lubricantes, como por ejemplo : talco, silica o grasas esteroides; recubridores; edulcorantes; saborizantes; colorantes; etc.
Dicha composición puede ser administrada por cualquier vía de administración útil para hacer llegar al principio activo a su diana terapéutica, por ejemplo, por vía digestiva (oral, sublingual, gastro entérica o rectal), vía parenteral (subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraraquídea, intraperitoneal, intradérmica o intraarticular), vía respiratoria o vía tópica.
Otro aspecto de la presente invención hace referencia a un método para la prevención y/o tratamiento de enfermedades cuya etiología se basa en la presencia de transcritos tóxicos que comprenden repeticiones CUG, CCUG, CGG, CAG y AAG como, por ejemplo: DM1, SCA8, DM2, FXTAS, HD y FA, que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprenda al menos uno de los hexapéptidos de la invención. En la presente invención se entiende por "cantidad terapéuticamente eficaz" a aquella capaz de prevenir o tratar el estado patológico asociado a las enfermedades cuya etiología se basa en la presencia de transcritos tóxicos que comprenden repeticiones CUG, CCUG, CGG, CAG y AAG como, por ejemplo: DM1, SCA8, DM2 y SCA8.
En la presente invención se observaron resultados positivos a concentraciones de plO mayores de 40 μΜ y menores de 250 μΜ, preferentemente 70,4 μΜ, en un modelo de DM1 Qn Drosophila. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Estrategia de rastreo posicional.
(B) 01, 02...06 representan posiciones definidas ocupadas por los 20 estereoisómeros D de los aminoácidos naturales posibles y las X hacen referencia a una mezcla equimolar de 19 de los 20 estereoisómeros D de los aminoácidos naturales (la cisterna se omite en las X, pero no en las posiciones definidas). Las 6 posiciones por los 20 aminoácidos posibles dan lugar a 120 combinaciones cada una de las cuales representa un vial en la quimioteca.
(A) Una vez identificados los viales positivos, se estudió qué aminoácido ocupa la posición definida en cada uno de ellos. La combinación de los aminoácidos positivos para dar lugar a péptidos de secuencia definida es lo que se conoce como deconvolución.
En el Ejemplo 1 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 1, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 2. Resultado del rastreo primario y deconvolución.
(A) El rastreo de la quimioteca y su posterior análisis estadístico revelaron un total de 28 viales positivos (p-valor<0.05) cuyo código numérico se señala en el eje de abscisas de cada gráfica . D e entre ésto s, lo s 1 0 amino ácido s señalados (correspondientes a los viales con mayor actividad) se seleccionaron para llevar a cabo la deconvolución. OIXXXXX, X02XXXX, XX03XXX, XXX04XX, XXXX05X y XXXXX06 representan viales con aminoácidos definidos para las posiciones 1, 2, 3, 4, 5 y 6, respectivamente.
(B) La deconvolución dio lugar a 12 hexapéptidos definidos. Las gráficas muestran en el eje de ordenadas la inversa del p-valor obtenido en el rastreo primario como medida de actividad. En el Ejemplo 1 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 2, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 3. Ensayo dosis-respuesta de plO en un modelo de DM en Drosophila. En el eje de ordenadas se representa el incremento de la supervivencia de los modelos de mosca y en el eje de abscisas se representa la concentración de plO (μΜ). plO suprimió el fenotipo de letalidad en moscas 103Y-Gal4/+;UAS-CTG(480)/+ de manera más eficaz entre 80 y 125 μΜ. Esta tendencia se perdió al aumentar la concentración a 250 μΜ. El valor Incremento de supervivencia corresponde a ([hembras nacidas tratadas] -[hembras nacidas contra l]/n)xl 00.
En el Ejemplo 1 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 3, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 4. Estudio de la toxicidad de plO en individuos silvestres. (A, B) Esta figura muestra el comportamiento dosis-respuesta frente al DMSO cuando éste es administrado en comida casera a embriones (A) o larvas Ll (B) de genotipo OrR (genotipo silvestre). En el eje de ordenadas se representa el número de adultos y en el eje de abscisas se representa el % de DMSO.
(C) Esta figura demuestra que plO no es tóxico en individuos OrR ya que el número de larvas Ll que alcanza los estadios de pupa y adulto no difirieron respecto al control a ninguna concentración. Cada ensayo se llevó a cabo por triplicado con 50 individuos por réplica (150 individuos en total para cada concentración). En el eje de ordenadas se representa el número de individuos y en el eje de abscisas se representa la concentración de plO (μΜ). De cada grupo de tres columnas, la columna de la izquierda representa el número de larvas, la columna del medio el número de pupas y la columna de la derecha el número de adultos. En el Ejemplo 2 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 4, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 5. Rastreo de Alaninas. Esta figura demuestra que la sustitución por alanina de cualquiera de los residuos del péptido plO causa una pérdida de actividad. Los péptidos fueron administrados en la comida a larvas 103Y-Gal4+/+;UAS-CTG(480)/+. En el eje de ordenadas se representa el número de hembras y en el de abscisas los hexapéptidos de la invención ensayados: la columna de la izquierda corresponde con el control (0,1% DMSO) y las siguientes, de izquierda a derecha, con los péptidos plO y los péptidos comprendiendo sustituciones de alanina con secuencias: ppyawa, ppyaae, ppaawe, payawe, apyawe. Las barras muestran valores promedio con su error estándar. * indica p-valor<0.05.
En el Ejemplo 3 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 5, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 6. El péptido plO suprime la toxicidad de CTG(480) en los músculos indirectos del vuelo (IFMs).
La figura muestra de izquierda a derecha secciones transversales de 1.5 μιη de los IFMs de moscas normales (A), moscas que expresaban CTG(480) (B) y de moscas que expresaban CTG(480) bajo el control de Mhc-Gal4 tratadas oralmente con el péptido plO (C). Las moscas tratadas con péptido tenían paquetes musculares de mayor tamaño que el control con DMSO. Las imágenes fueron tomadas a un aumento de lOx.
En el Ejemplo 4 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 6, así como un análisis más profundo de la misma. Figura 7. Respuesta a dosis del péptido plO en los IFMs.
Secciones transversales de los IFMs de moscas Mhc-Gal4/+;UAS-(CTG)480/+ tratadas con 0.12% DMSO (control) (A) y con el péptido plO a distintas concentraciones: 62.5 μΜ (B), 125 μΜ (C), 250 μΜ (D) y 500 μΜ (E). En el eje de ordenadas de (F) se muestra el área muscular relativa (μιη). Además en (F) se muestran los resultados obtenidos siendo, de izquierda a derecha, la primera columna correspondiente a DMSO, y las siguientes correspondientes a concentraciones de plO de: 62.5 μΜ, 125 μΜ, 250 μΜ y 500 μΜ. Entre 62.5 μΜ y 250 μΜ el péptido plO causó un incremento significativo en el área muscular respecto a las moscas control (F), así como una disminución en la pérdida de fibras (cabeza de flecha en A). A 500 μΜ el área de los IFMs fue menor que en las moscas control. Las barras en la gráfica muestran valores promedio con su error estándar. * indica p-valor<0.05, *** indica p- valor <0.0001.
En el Ejemplo 4 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 7, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 8. p l O reduce el número de agregados ribonucleares (foci) que comprenden repeticiones tóxicas de CUG en Drosophila y libera Mbl de los mismos. Esta figura muestra que el tratamiento con plO reduce drásticamente el número agregados ribonucleares (foci) que comprenden repeticiones CUG (eje de ordenadas) a todas las concentraciones de plO testadas (eje de abscisas) (A). Además se muestra la detección por inmuno fluorescencia de Mbl (gris) en los IFM de las moscas tratadas con DMSO (0.12%; control) (B) o con plO (250 μΜ) (C). La administración oral de plO causó un cambio en la distribución celular de Mbl desde una distribución en forma de agregados (ver flechas) (B), hasta una distribución en forma dispersa (C). La tinción del núcleo fue realizada con DAPI. * significa p<0.05 y ** p<0.0005.
Estos resultados muestran un elevado nivel de eficacia en la reducción de dos de los fenotipos moleculares más evidentes característicos en enfermos de DM1, tras un tratamiento in vivo (en el modelo de Drosophila) e ingesta oral del compuesto (plO). Figura 9. Derivados del péptido plO diseñados para su expresión endógena en Drosophila.
En sentido descendente se muestra la secuencia de los péptidos de SEQ ID NO: 17-19 (pl7-p l 9). Se muestra la Metionina inicial, las tres Glicinas espaciadoras y la secuencia del propio péptido plO directa (→) o retro inversa (<— ).
En el Ejemplo 5 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 9, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 10. La expresión endógena de un péptido de L-aminoácidos que comprende a plO mediante el sistema Gal4/UAS suprime la rugosidad causada por CTG(480) en el ojo.
UAS-pl8 y p-19 suprimieron la toxicidad de CTG(480) en ojo a 19°C y 21°C, dando lugar a un fenotipo menos rugoso y tamaño del ojo mayor que las moscas control (B, E vs C, F). Al aumentar la temperatura este fenómeno se invirtió y UAS-p-18 y pl9 se convirtieron en potenciadores del efecto de las repeticiones (25°C; H vs I). UAS-plS por sí solo no produjo ojo rugoso a 25°C (G). La figura (A) muestra un ojo silvestre. (D) La interacción de CTG(480) y MBNL1 se utilizó como control positivo. Las imágenes (A-F) fueron tomadas bajo el microscopio electrónico de barrido. Las imágenes (G-I) se tomaron bajo la lupa. En el Ejemplo 5 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 10, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 11. Cuantifícación de la supresión de un fenotipo en ojo por co-expresión de (CTG)480 y distintas variantes de secuencia de plO. La cuantifícación de la longitud del ojo en el eje dorso-ventral de moscas GMR-Gal4 UAS-CTG(480)/UAS-pl9 mostró un aumento significativo relativo al tamaño del ojo en las moscas control (GMR-GaU UAS-CTG(480)/+; p-valor<0.05, test t). Este efecto era mayor al aumentar la temperatura de 19°C a 21°C. En el eje de ordenadas se muestra el tamaño relativo del ojo respecto del control sin péptido y en el eje de abscisas, de izquierda a derecha, la columna control, la columna UAS-pl9 a 19°C y UAS-pl9 a 21°C.
En el Ejemplo 5 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 11, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 12. Expresión endógena de un péptido de L-aminoácidos que comprende a plO en los IFMs mediante el sistema Gal4/UAS.
Secciones transversales de tórax (1.5 μιη) de moscas que expresan CTG(480) (A) o CTG(480) y pl8 simultáneamente (B) bajo el control del promotor Mhc. La presencia de pl8 causó un aumento del tamaño de los músculos (C). La figura C muestra el área muscular en el eje de ordenadas y en el eje de abscisas representa el efecto de UAS- GFP, como control negativo, en la columna de la izquierda y el efecto de UAS-pl8 en la columna de la derecha. En el Ejemplo 5 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 12, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 13. Posibles mecanismos de acción del péptido plO sobre la toxicidad de CTG(480). plO podría afectar a la expresión de las repeticiones (A), desplazar a Mbl de las horquillas de ARN (B), desestabilizar las horquillas tóxicas (C) o actuar aguas abajo de las repeticiones (D). Sin embargo, tal y como se demuestra en las figuras y ejemplos sucesivos, el mecanismo de acción más probable de plO se basa en la desestabilización de las horquillas tóxicas (C). En el Ejemplo 6 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 13, así como un análisis más profundo de la misma. Figura 14. Efecto de la expresión de plO sobre la expresión de la proteína reportera luciferasa.
El tratamiento con plO no afecta de manera significativa a la expresión de luciferasa inducida por el sistema Gal4/UAS comparada con moscas expuestas a la misma cantidad de DMSO (0.12%). Sin embargo, el DMSO por sí sólo afectaba a la expresión del transgén. Las barras muestran valores promedio y su error estándar. ** indica p-valor<0.01. En el eje de ordenadas se muestra la luciferasa (CPS) y en el eje de abscisas, de izquierda a derecha, los efectos de 0%> de DMSO, 0,1 % de DMSO y 250 μΜ άε ρΙΟ. En el Ejemplo 7 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 14, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 15. Efecto de plO sobre la expresión de CTG(480).
(A) Gel de agarosa que muestra los niveles de expresión de transcritos CUG(480) en moscas Mhc-Gal4/+; UAS-CTG(480)/+ tratadas con 0.12% DMSO (control) (columna de la izquierda) o con plO a distintas concentraciones (segunda columna: 62.5 μΜ, tercera columna: 125 μΜ, cuarta columna: 250 μΜ, quinta columna 500 μΜ) amplificados mediante RT-PCR semicuantitativa de una región del terminador SV40. Los transcritos del gen Rp49 se utilizaron como control de carga del cDNA molde. La cuantificación de la intensidad de las bandas con el programa ImageJ no reveló cambios significativos en ningún caso (a=0.05, test t).
(B) . Las barras muestran promedios y su desviación típica de los resultados obtenidos en (A). DMSO (control) (columna de la izquierda) o plO administrado a distintas concentraciones (segunda columna: 62.5 μΜ, tercera columna: 125 μΜ, cuarta columna: 250 μΜ, quinta columna 500 μΜ).
En el Ejemplo 7 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 15, así como un análisis más profundo de la misma. Figura 16. plO alinea parcialmente con el primer dedo de zinc de Muscleblind.
En sentido descendente se muestran las secuencias del primer dedo de zinc de Muscleblind correspondient e s a Drosophila melanogaster (primera fila), Caenorhabditis elegans (segunda fila), Gallus gallus (tercera fila), Danio Rerio (cuarta fila) y Homo Sapiens (quinta, sexta y séptima fila: tres parálogos humanos). La secuencia reversa de plO (última fila) alinea con una región crítica para la unión de la proteína al AR . En negro se muestran aminoácidos conservados.
En el Ejemplo 8 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 16, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 17. Obtención de la proteína MblZF (dedos de zinc de Mbl) en E. coli.
(A) Expresión de MblZF en la cepa BL21(DE3) de E.coli. A.I.: antes de la inducción con IPTG; S: sobrenadante del lisado de las células (fracción soluble); P: pellet del lisado de las células (fracción insoluble). La mayor parte de la proteína se encuentra en la fracción soluble (S), tal y como se señala en la flecha.
(B) Ejemplo de purificación de la proteína MblZF en gradiente de imidazol por FPLC. Las fracciones 10 a 14 se sumaron para obtener un stock de proteína (C). Los asteriscos * 1 y *2 muestran bandas secuenciadas por espectrometría de masas con el fin de confirmar la identidad de MblZF (* 1). La banda *2 resultó ser la proteína 50S de E.coli, descartando que se tratase de un producto de degradación de MblZF.
En el Ejemplo 9 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 17, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 18. Espectro de DC (Dicroísmo Circular) de los dedos de zinc de las proteínas Muscleblind.
(A) La proteína humana MBNLl (2 μΜ) presenta un pico pronunciado a 203 nm, y un pico débil a 220 nm, indicando que MBNLl ZF (primer par de dedos de zinc) no posee estructura secundaria a excepción de una pequeña porción en forma de hélice alfa (comparar con patrón en B). MblZF se comportó de manera similar, con un pico pronunciado a 205 nm y otro débil a 222 nm (C). (D) MblZF eluyó como un solo pico al pasar por una columna de exclusión molecular. El volumen de elución, comparado con un patrón de marcadores de peso molecular, coincide con el tamaño de MblZF en forma de monómero.
En el Ejemplo 9 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 18, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 19. Esquema de un ensayo de polarización de fluorescencia. Los ensayos de polarización de fluorescencia consisten en marcar una molécula pequeña con un fluoróforo (repeticiones CUG conjugadas con carboxifiuoresceína en el caso de la presente invención; A), de forma que cuando ésta se una a una molécula de peso molecular mayor (como la proteína MblZF) se modifique su velocidad de rotación (B). Los cambios en la velocidad de rotación se pueden detectar excitando la molécula con haces de luz polarizada en los planos vertical y horizontal y midiendo la dirección de polarización de la fluorescencia emitida. Si una molécula de pequeño tamaño (plO) fuese capaz de inhibir la unión entre MblZF y FAM-CU23 (23 repeticiones de CUG conjugadas con fluoróforo carboxifiuoresceína), el ARN fluorescente incrementaría de nuevo su velocidad de rotación, reduciendo su polarización (C).
En el Ejemplo 10 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 19, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 20. MblZF y plO se unen a repeticiones CUG. MblZF causó un incremento en la polarización de FAM-CUG23 provocado por la unión entre ambas moléculas. Esta unión es reversible si se compite con un ARN CUG23 no marcado (A) y es proporcional a la cantidad de MblZF (B). plO también causa un incremento de la polarización de FAM-CUG23 (C). Este incremento es discreto debido al reducido tamaño del péptido y no cambia de manera considerable al aumentar su concentración (D). pl O no revierte el efecto de MblZF sobre FAM- (CUG)23. * indica p-valor<0.05 (test t). En el eje de ordenadas de las figuras A y C se muestra la polarización relativa y en el eje de ordenadas de las figuras B y D se muestra el incremento de polarización. En el Ejemplo 10 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 20, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 21. Estudio de la unión de MblZF a FAM-(CUG)23 mediante ensayos de retardo en gel. MblZF se une a FAM-CUG23 causando la retención del complejo en el pocilio. Esto ocurre a todas las concentraciones de AR ensayadas para una concentración de proteína fija (A). La unión entre FAM-(CUG)23 y MblZF es específica ya que se puede competir con un ARN CUG23 no marcado (proporción FAM-(CUG)23:CUG23 1 : 100; Fig B, carrera 3), y no ocurre si la proteína se desnaturaliza por calor antes de incubar con FAM-(CUG)23 (Figura B, carrera 4). La proteína colágeno alfa-3 utilizada a la misma concentración que MblZF no se une al ARN (Figura B, carrera 5) (* 1 : MblZF desnaturalizada por calor, *2: incubado con colágeno alfa 3). MblZF también se une a ARNs de menor tamaño (FAM-(CUG)4) formando complejos que quedan retenidos en el pocilio del gel (C). En el Ejemplo 10 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 21, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 22. La cola de Histidinas de MblZF no afecta a su unión a FAM-(CUG)23.
(A) Gel que muestra la digestión con la proteasa TEV para eliminar las 6 Histidinas de la proteína MblZF. El producto de la digestión (MblZFAHls) se pasó por una columna de afinidad de Níquel para retener las Histidinas y eliminar TEV, al eluir ésta de manera diferente a MblZFAHis (B). (C) Resultado tras la purificación. (D) MblZFAHis se une a FAM-(CUG)23 y esta unión es proporcional a la concentración de proteína. En el Ejemplo 10 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 22, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 23. El complejo MblZF/FAM-(CUG)23 no migra hacia el polo positivo. (A) En las condiciones de electroforesis utilizadas, la proteína MblZF apenas entraba en el gel (tinción de plata, Figura A izquierda). Si se corre tanto la proteína como el complejo AR -proteína en un gel horizontal con los pocilios colocados en el centro sólo se observaba proteína migrando hacia el polo negativo. Si se sube el pH del tampón de electroforesis un punto por encima del pl de MblZF la proteína seguía migrando hacia el polo negativo (B). La proteína MblZFAHls tampoco entraba en el gel (B). Fijar el complejo ARN-proteína por entrecruzamiento con FA y resolverlo en un gel desnaturalizante (en el que el SDS confiere carga negativa a la proteína) no cambió el comportamiento de MblZF (C).
En el Ejemplo 10 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 23, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 24. plO se une a repeticiones CUG sin desplazar a MblZF.
(A) plO (1 mM) puede unirse al ARN FAM-(CUG)23 (60 nM). (B) Esta unión es proporcional a la cantidad de péptido y se detecta a partir de -500 μΜ. plO (1 mM) se une con menor afinidad a repeticiones de tamaño corto (FAM-(CUG)4, 60 nM) (C). La unión del péptido a FAM-(CUG)23 no interfiere con la interacción de la proteína MblZF (D), al menos de forma significativa en este ensayo.
En el Ejemplo 10 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 24, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 25. Especificidad del péptido plO.
(A) Ninguno de los cinco péptidos del rastreo de alaninas (el primer tubo de la izquierda es el control y los cinco siguientes corresponden a los péptidos: ppyawa, ppyaae, ppaawe, payawe y apyawe) (2.5 mM) se unió al AR FAM-(CUG)23 (60 nM) de manera significativa, demostrando que la interacción descrita para plO es específica. (B) plO (1 mM) puede unirse tanto a ARN como ADN de doble cadena (de) y cadena sencilla (es) (60 nM). (C) Esquema que muestra la estructura secundaria de los ácidos nucleicos empleados en el experimento mostrado en (B).
En el Ejemplo 11 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 25, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 26. plO se une con mayor afinidad a DMPK-CUG4. (A) Experimento de extinción de la fluorescencia del triptófano de plO (5 μΜ). El péptido se incubó con distintos ácidos nucleicos (2.5 μΜ, 5 μΜ, 7.5 μΜ, 10 μΜ y 12.5 μΜ). La tasa de extinción de fluorescencia (en el eje de ordenadas se representa la fluorescencia relativa) se midió como la pendiente de las rectas obtenidas al representar los valores de emisión de fluorescencia a 351 nm relativos al péptido libre para cada punto de concentración. Se realizaron al menos dos medidas por punto. En todos los casos dicha tasa era mayor para DMPK-CUG4, aunque no de manera significativa para CAG CUG4 (B).
En el Ejemplo 11 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 26, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 27. plO disminuye el empaquetamiento de las repeticiones CUG.
Tanto MblZF (A, 1 μΜ y 1.5 μΜ) como plO (B, 0.1 μΜ, 0.5 μΜ, 1 μΜ, 10 μΜ y 20 μΜ) cambiaron el espectro de dicroismo circular (DC) de CUG(60) (1 μΜ), reduciendo el pico de emisión del ARN a -265 nm de manera proporcional a la concentración de proteína o péptido. Sin embargo, este efecto no se revirtió cuando se incubó el ARN con MblZF y plO conjuntamente, independientemente del orden de adición (C). Este cambio no se debía a degradación del ARN durante el tiempo que duró el experimento (D) y tampoco ocurría cuando CUG60 se incubaba con los hexapéptidos del rastreo de alaninas de secuencias ppyawa (E, 0.5 μΜ y 1 μΜ) y payawe (F, 1 μΜ).
En el Ejemplo 12 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 27, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 28. plO abre las horquillas de repeticiones CUG.
Medidas de la fluorescencia emitida (eje de ordenadas), medida como unidades relativas de fluorescencia (URF), por la 2-amino purina en un ARN (CUG)23 (1 μΜ) en presencia de MblZF (0.1 μΜ, 1 μΜ, 2 μΜ, y 5 μΜ) (A) o plO (0.1 μΜ, 1 μΜ, 2 μΜ, 5 μΜ y 100 μΜ) (Β) relativa a la fluorescencia emitida por el ARN libre. plO causó un incremento de 2.9 en la fluorescencia de 2-AP a 100 μΜ, indicando un cambio hacia cadena sencilla. Este efecto no se observó al incubar el ARN con DMSO, o con los péptidos del rastreo de alaninas con secuencias: ppyawa y payawe (C). En el Ejemplo 12 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 28, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 29. Ensayo comparativo de varios péptidos de la invención (plO, pll, p5, pl2 y pl5) en la desestructuración o apertura de las horquillas de repeticiones CUG.
Esta figura ilustra un experimento donde se utiliza el ensayo de la 2-amino purina (al igual que en la figura anterior) para ensayar 4 péptidos más (pl l, p5, pl2 y pl5), además de plO, obtenidos de la deconvolución de la librería combinatoria peptídica. Los resultados indican una correlación entre la actividad obtenida con los péptidos (Tabla 1) y la capacidad de desestructurar estructuras secundarias y pasar a cadena sencilla de la sonda CUG23. La concentración utilizada en todos los casos es ΙΟΟμΜ (proporción 1 : 100 de ARN vs. plO), donde plO había mostrado una respuesta positiva (figura anterior). Por lo tanto, este experimento evidencia que aunque plO es el péptido preferido al ser el más activo, el resto de los péptidos de la Tabla 1, particularmente pl l, p5, pl2 y pl5, también presentan niveles apreciables de especificidad y eficacia.
En el Ejemplo 16 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 29, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 30. Ensayo de los péptidos de la invención (particularmente plO) en la unión a horquillas de repeticiones diferentes de CUG, como por ejemplo AAG, CGG, CCUG y CAG.
Esta figura ilustra un experimento en el que se testó plO y su capacidad de unión a repeticiones diferentes de CUG pero que también están implicadas en enfermedades donde se ha descrito toxicidad de AR s con expansión de repeticiones. Se utilizó el ensayo de la extinción del triptófano utilizando (1) plO + AAG, CGG, CCUG y CAG a diferentes concentraciones de ARN (5μΜ, 7.5 μΜ y 10 μΜ). AAG se utiliza como repetición de referencia (control) porque está descrito que no forma estructuras secundarias. Por otro lado en (2) se muestra el mismo experimento pero utilizando uno de los péptidos obtenidos tras el rastreo de alaninas (ppyawa) y mostrando los resultados a la concentración más alta (10 μΜ) de ARN utilizado.
En el Ejemplo 16 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 30, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 31. Ejemplo de análisis histopatológico.
La inyección intramuscular de 0.2% DMSO (A) ó 0.5 μ de plO (B) en ratones FVB generó una zona pequeña mixedematosa sin apenas reacción inflamatoria relevante asociada en ambos casos. En el Ejemplo 13 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 31, así como un análisis más profundo de la misma. Figura 32. plO revierte defectos de splicing de Sercal y Tnnt3 en ratones modelo de DM1.
La inyección intramuscular de 2% DMSO (-) o 10 μ plO (+) aumentó el porcentaje de inclusión del exón 22 de los transcritos de Sercal 2 y 4 semanas después d/i (B, C y D) y de exclusión del exón fetal F de Tnnt3 1, 2 y 4 semanas después de la inyección (d/i; A, B y C). El péptido plO no alteró el procesado de estos transcritos en ratones FVB ni HSASR, y tampoco afectó los transcritos controles Capzb (A-C). Las figuras (A-C) muestran resultados de RT-PCR llevadas a cabo durante 25 ciclos. Las líneas horizontales unen la extremidad izquierda (inyectada con suero con 2% DMSO) y derecha (inyectada con 10 ig péptido) del mismo animal, en ese orden. Las barras en (D) corresponden a valores promedio con su error estándar. Los p-valores se hallaron utilizando un test t.
En el Ejemplo 14 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 32, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 33. Efecto sistémico de plO sobre el splicing alternativo de Sercal.
El porcentaje de inclusión del exón 22 (eje de ordenadas) en ratones FVB y HSASR 4 semanas después de la inyección de 10 μg de plO era del 100%. Este valor era del 16.8% ± 10.5 en los animales HSALR inyectados con 2% DMSO en ambas patas. En los animales HSALR tratados el porcentaje de inclusión resultó del 55.1% ± 4.9 en la pata inyectada con plO y del 31.5% ± 9.8 en la pata izquierda del mismo animal (inyectada com suero con 2% DMSO).
En el Ejemplo 14 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 33, así como un análisis más profundo de la misma.
Figura 34. plO disminuye el número de células musculares con núcleo central.
Criosecciones del músculo tibial anterior teñidas con hematoxilina eosina mostrando la presencia de núcleos centrales en los animales HSALR (A), mientras que éstos se disponen en la periferia de las células en los animales FVB (C). plO redujo el porcentaje de fibras con núcleos centrales en los ratones HSALR de manera significativa transcurridas 4 semanas tras la inyección tanto de 0.5 μg como de 10 μg (B y D). (1) Indica animales cuyo control se inyectó con 0.2% de DMSO. (2) Indica animales cuyo control se inyectó con 2% de DMSO.
En el Ejemplo 15 puede encontrarse una explicación detallada acerca de las conclusiones obtenidas de la Figura 34, así como un análisis más profundo de la misma.
A continuación se muestran los ejemplos llevados a cabo en la presente invención para ilustrar los resultados conseguidos, sin pretender limitar el alcance de la invención.
Figura 35. plO suprime defectos histológicos a nivel muscular en ratones modelo para DM1.
Esta figura representa un experimento realizado en el modelo de ratón para la enfermedad, donde se detecta la localización de la proteína Clcn-1 en secciones de músculo esquelético. Clcn-1 es uno de los genes alterados a nivel de splicing en la musculatura de pacientes con DM1 (A). Se observa que con la administración de plO se reinstauran niveles normales de proteína a nivel de membrana (B). La inyección intramuscular de plO se llevó a cabo a nivel de los músculos de los miembros traseros del ratón
Este resultado extiende la capacidad (ya observada en Figuras 32-34) de un tratamiento con plO en un modelo in vivo de DM1 de mejorar aspectos celulares y funcionales expresadas de manera aberrante en esta patología humana.
EJEMPLOS Ejemplo 1. Rastreo de una quimioteca combinatoria de hexapéptidos.
Cada vial de la quimioteca está formado por una mezcla de 2.5 millones de péptidos que comparten un único aminoácido en una posición definida y difieren en el resto (Figura 1A). Así, la combinación de las 6 posiciones definidas por los 20 aminoácidos posibles para ocuparlas da lugar a los 120 viales que componen la quimioteca, sumando un total de 50 millones de secuencias distintas. El principio en el que se basa el uso de quimiotecas combinatorias en formato de rastreo posicional es que cada una de las posiciones de la molécula se ensaya independientemente de las demás, de forma que sea posible definir cuál es el mejor aminoácido candidato para cada una de las seis posiciones del hexapéptido. Así, a partir de la lectura de los resultados del rastreo se obtuvieron los aminoácidos más activos para cada posición. Basándose en combinaciones de éstos, se sintetizaron a continuación péptidos de secuencia definida (lo que se conoce como deconvo lució n) (Figura IB) y estas moléculas se ensayaron de nuevo.
Los 120 viales que constituyen la quimioteca se ensayaron de manera individual sobre el fenotipo de letalidad en pupa por expresión de 480 CTG bajo el control de 103Y- Gal4 a una concentración de 80 μΜ. El análisis estadístico de los resultados reveló un total de 28 viales positivos (p<0.05; 23.3% del total), cada uno de los cuales representa un aminoácido activo en una posición concreta. Así, para las posiciones OI, 02, 03, 04, 05 y 06 del hexapéptido se obtuvieron un total de seis, tres, seis, cuatro, dos y siete aminoácidos activos respectivamente (Figura 2A). Para llevar a cabo la deconvo lución, se seleccionaron 10 de estos 28 aminoácidos, atendiendo a su grado de actividad en el ensayo biológico (Figura 2A). Finalmente, de las combinaciones posibles se seleccionaron 16 secuencias para llevar a cabo la síntesis de los hexapéptidos definidos (Figura 2B). La selección de estos 16 péptidos atendió a criterios de redundancia entre las propiedades físicas y químicas de aminoácidos activos en posiciones similares.
Los 16 hexapéptidos definidos fueron ensayados a la mayor concentración posible en función del porcentaje de DMSO en el que se encontrasen disueltos. plO mostró un aumento significativo en el número de hembras nacidas respecto al control con DMSO a una concentración de 80 μΜ. La Tabla 1 indica la actividad de los péptidos de la invención. * indica p-valor<0.05. - indica que no nacieron hembras, tanto en los tubos control como en los tratados. Tabla 1
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Con el fin de confirmar el efecto de plO, éste fue sometido a ensayos de dosis- respuesta a las siguientes concentraciones: 20 μΜ, 40 μΜ, 80 μΜ, 125 μΜ, 250 μΜ (Figura 3). plO no mostró actividad a 20 μΜ y 40 μΜ, mientras que ésta aumentó a 80 μΜ (dando lugar a un número de hembras 1.43 veces mayor que el control) y 125 μΜ (con un número de hembras 1.47 veces mayor que el control). El análisis de los datos mediante un test no lineal reveló que la dosis efectiva 50 (DE50) de plO es 70.4 μΜ para este fenotipo. A 250 μΜ la actividad del péptido disminuyó, posiblemente debido a un efecto tóxico del péptido a concentraciones más altas. Ejemplo 2. Estudio de la toxicidad de plO.
Con el fin de analizar la toxicidad de plO se estudió su efecto sobre moscas de genotipo salvaje (OrR) en medio nutritivo casero. Al desconocerse el valor máximo de DMSO tolerable por las moscas en esta comida, se realizó un primer experimento sometiendo a los individuos a concentraciones crecientes del disolvente, bien desde estadios embrionarios o desde fase de larva Ll . La tolerancia al DMSO en comida casera resultó ser de un orden de 3-4 veces mayor que la determinada para el medio nutritivo instantáneo del proveedor Sigma (0.3-0.4% vs 0.1%, Figura 4). Los resultados de supervivencia obtenidos para los individuos tratados con DMSO desde el embrión mostraron una variabilidad muy alta (Figura 4A), probablemente debido a la presencia de huevos sin fecundar entre los embriones seleccionados. Los individuos tratados desde estadio larvario mostraron un comportamiento mucho más homogéneo (Figura 4B). Por tanto, se decidió alimentar a larvas Ll con concentraciones crecientes de plO y se contó el número de individuos que llegaban a fase de pupa y adulto. plO no resultó tóxico en ninguno de los estadios a ninguna de las concentraciones ensayadas (67.5 μΜ, 125 μΜ, 250 μΜ, 500 μΜ y 1 mM; n: 150 en cada caso; Figura 4C), pudiendo por tanto existir un efecto tóxico dependiente de genotipo en el caso mostrado en la Figura 3.
Ejemplo 3. Estudio de la relevancia de cada aminoácido en la secuencia peptídica.
Con el fin de determinar la contribución de cada uno de los residuos de plO a su actividad sobre CTG(480), se realizó un experimento de rastreo de alaninas. Estos experimentos se basan en sustituir cada uno de los aminoácidos del péptido por alanina manteniendo los demás. La alanina es un aminoácido pequeño y en general poco activo, razón por la cual es utilizado para este tipo de estudios. Ya que cada sustitución por alanina examina la contribución de un aminoácido individual, este experimento permite, por un lado, evaluar si plO es susceptible de optimización (en caso de que una sustitución aumente la eficacia de la molécula), o determinar qué aminoácidos son importantes para su función (en caso de que una sustitución disminuya su actividad). La secuencia de plO permite 5 sustituciones, por lo que se sintetizaron 5 hexapéptidos nuevos que fueron ensayados sobre el fenotipo de letalidad en moscas 103Y-Gal4; UAS-CTG(480)/+ y comida comercial. Todos ellos mostraron una actividad menor que la molécula original, indicando que todos los aminoácidos de la secuencia de plO son necesarios para la actividad final del péptido en este ensayo funcional (Figura 5). Ejemplo 4. Validación de la actividad de plO en otros tejidos. plO mejora defectos histológicos causados por CTG(480) en los músculos indirectos del vuelo.
Puesto que los principales síntomas característicos de la DM1 afectan al músculo, se decidió estudiar el efecto de plO sobre este tejido en las moscas modelo. La expresión de CTG(480) bajo el control del promotor de la cadena pesada de la Miosina (línea Mhc-Gal4) provoca defectos a nivel histológico en los músculos indirectos del vuelo (IFM, del inglés indirect flight muscles), los cuales incluyen pérdida de fibras musculares y degeneración progresiva. Estos defectos afectan a su función, impidiendo a las moscas volar. El péptido plO se ensayó sobre el fenotipo de falta de vuelo utilizando el método de caída en cilindro desarrollado por Benzer (Benzer, 1973) y en medio nutritivo casero. No se observaron cambios en la capacidad de vuelo de las moscas (concentraciones ensayadas: 62.5 μΜ y 125 μΜ; n: 117 y 77 respectivamente) respecto al control con DMSO (n: 55). No obstante, el análisis al microscopio de secciones transversales de tórax de moscas modelo de 3-4 días de edad reveló una mejora de los músculos a nivel histológico (Figura 6). Puesto que la capacidad de vuelo de las moscas es muy sensible a cambios estructurales y metabólicos en los sarcómeros de los IFMs, es posible que ésta fuese la causa de que la mejora histológica observada no diese lugar a una mejora funcional.
Para confirmar esta observación, así como cuantificar el efecto observado, se sometió a plO a un ensayo de dosis-respuesta a las siguientes concentraciones: 62.5 iM, 125 iM, 250 iM y 500 iM, y se realizaron cortes histológicos semifinos en moscas de 10 días de edad (Figura 7 A-E). La cuantificación del área muscular en las moscas tratadas reveló una mejora significativa dependiente de dosis (Figura 7F). Estos resultados también demostraron que el efecto de plO es independiente de factores específicos de tejido, ya que plO es activo tanto en el cerebro como en el músculo. A 500 μΜ, sin embargo, los músculos mostraban un tamaño reducido y la viabilidad de las moscas disminuyó. Ejemplo 5. La expresión endógena de un péptido de L-aminoácidos que comprende a plO suprime fenotipos provocados por repeticiones CTG.
La administración de plO suprimió al menos parte de los fenotipos provocados por CTG(480). Ya que en la experimentación llevada a cabo inicialmente en la presente invención plO se añade a la comida, no se podía saber cuántas moléculas llegaban finalmente a las células. Con el fin de poder controlar de manera precisa la administración de plO y asegurar la presencia del péptido en los mismos tejidos y en el mismo momento que los transcritos CUG(480), se generaron moscas transgénicas capaces de expresar plO de manera endógena y controlada utilizando el sistema Gal4/UAS.
Así se diseñaron tres transgenes diferentes con SEQ ID NO: 17-19 (pl7-pl9) que codificaban distintos péptidos basados todos ellos en la secuencia SEQ ID NO: 10 correspondiente a plO (Figura 9), teniendo en cuenta el sesgo en el uso de codones en Drosophila (es decir favoreciendo el uso de G y, sobre todo, de C en los sitios sinónimos; Powell & Moriyama, 1997) y añadiendo a la secuencia SEQ ID NO: 10 una Metionina inicial, así como tres Glicinas espaciadoras. Además, aguas arriba del codón de inicio ATG se añadieron 21 nucleótidos del extremo 5'UTR del gen act5C de Drosophila que incluían la secuencia Kozak, con el fin de potenciar la expresión de los transgenes. pl7 contenía la secuencia directa del péptido de SEQ ID NO: 10. Como se ha comentado, los péptidos de la quimioteca de hexapéptidos están formados por D- aminoácidos. Las formas D (dextrógiras) de los aminoácidos son estereoisómeros de las formas L (levógiras) y sólo los L-aminoácidos se sintetizan en las células y se incorporan a las proteínas. Por lo tanto, si la disposición de las cadenas laterales de plO era importante para su función, ésta se perdería al ser pl7 sintetizado a partir de L-aa por Drosophila. Por esta razón, se decidió generar la construcción p 18, en la cual se invirtió la secuencia del péptido de SEQ ID NO: 10, dando lugar así a un péptido retroinverso (Chorev & Goodman, 1995; P. M. Fischer, 2003). En el momento en que estos transgenes fueron generados, las construcciones más pequeñas descritas en la literatura codificaban péptidos de más de 20 aminoácidos, lo que suponía más del doble del tamaño del los péptidos pl7 y pl8 (de tan sólo diez aminoácidos). Por esta razón, se generó la construcción p 19, la cual combinaba las construcciones del péptido pl7 y pl8, dando lugar a un péptido de 19 aminoácidos. Las tres construcciones fueron micro inyectadas en los precursores de la línea germinal de embriones de Drosophila dando lugar a 10 líneas de moscas transgénicas para cada transgén. Las moscas transgénicas obtenidas se cruzaron con las líneas de moscas recombinantes GMR-GaU UAS-CTG(480)/CyO y Mhc-GaU UAS-CTG(480)/TM6b generadas durante esta invención, las cuales dirigían la expresión de las repeticiones CTG en ojo y músculo, respectivamente. Al igual que las moscas sev-Gal4 UAS- CTG(480)/+, los adultos GMR-Gal4 UAS-CTG(480)/UAS-GFP presentaban un fuerte fenotipo de ojo rugoso. La coexpresión de CTG(480) y pl8 ó pl9 (pero no pl7) a 19°C y 21°C dio lugar a moscas con ojos visiblemente menos rugosos que los individuos control (Figura 11; Figura 10B-C y E-F). Estos resultados confirman que péptidos de L-aminoácidos que contienen la secuencia de p l O en su disposición retroinversa son capaces de suprimir fenotipos desencadenados por las repeticiones e indican que los péptidos pl8 y pl9 se traducían y eran activos a pesar de su corto tamaño, ya que su expresión modificaba la toxicidad de CTG(480). No obstante, el fenómeno contrario ocurría a 25°C y a 29°C. A 25°C la expresión endógena de pl8 o pl9 potenciaba la toxicidad de las repeticiones CTG dando lugar a un ojo de menor tamaño, con pérdida de pigmentación y dramática fusión de omatidios (Figura 10H- I). A 29°C el cruce entre moscas GMR-Gal4 UAS-CTG(480)/CyO y UAS-pl8 o UAS- pl9 no produjo descendencia sin el balanceador CyO, indicando que plO reducía la viabilidad de los individuos GMR-Gal4 UAS-CTG(480) a dicha temperatura. Cabe destacar que la expresión de pl8 y pl9 por sí sola a 25°C y 29°C no causó ningún fenotipo (Figura 10G). Debido a que los cambios de temperatura afectan de manera diferente a la expresión de los transgenes CTG(480) y péptidos pl7-pl9 al estar éstos insertados en regiones distintas del genoma, es posible que exista una relación entre la cantidad de péptido y repeticiones que sea necesario alcanzar, superada la cual plO se volvía tóxico.
De manera importante, todas las líneas portadoras del transgén pl8 (UAS-pl8) ensayadas (es decir, 5) y una de las tres las líneas portadoras del transgén pl9 (UAS- pl9) modificaron el fenotipo de las moscas GMR-Gal4 UAS-CTG(480), mientras que ninguna de las cinco líneas ensayadas de la construcción pl7 (UAS-pl 7) lo hacía. Esto indica que la orientación de las cadenas laterales de los aminoácidos de plO juega un papel esencial en su actividad.
La coexpresión de CTG(480) y pl8 o pl9 con la línea Mhc-Gal4 a 25°C también suprimió los defectos histológicos de los IFMs en adultos recién eclosionados, aumentando el tamaño de los paquetes musculares (Figura 12). Esto confirma el efecto de plO sobre CTG(480). De nuevo, tan sólo líneas portadoras de los transgenes pl8 y pl9 modificaron el fenotipo.
Ejemplo 6. Estudio del mecanismo de acción de plO. Los resultados obtenidos in vivo demostraron un efecto de plO sobre la toxicidad de las repeticiones CTG. Además la Figura 13 muestra varias hipótesis que resumen cómo plO podría ejercer su efecto en las células. En primer lugar, plO podría afectar a los niveles de transcritos CUG(480), bien interfiriendo con el sistema Gal4/UAS o disminuyendo la estabilidad de los AR s tóxicos (Figura 13A). Por otro lado, plO podría unirse a las repeticiones CUG liberando factores nucleares secuestrados por éstas, como Mbl. De esta manera dichas proteínas podrían desempeñar de nuevo sus funciones normales (Figura 13B). plO podría también unirse a las repeticiones CUG impidiendo que éstas se plieguen formando horquillas tóxicas de doble cadena (Figura 13C). Por último, p l O podría estar actuando sobre otras proteínas o transcritos aguas abajo de las alteraciones provocadas por las repeticiones inhibiendo, por ejemplo, antagonistas de Mbl y con ello compensando la falta de función de estas proteínas (Figura 13D).
Con el fin de estudiar cada una de las hipótesis propuestas, se decidió llevar a cabo una serie de experimentos a nivel molecular e in vitro, los cuales se detallan a continuación.
Ejemplo 7. plO no afecta a los niveles de expresión de CTG(480).
Para estudiar si plO afectaba a la expresión de CTG(480) se utilizaron dos estrategias diferentes. En primer lugar, se alimentaron moscas Mhc-Gal4/+ ;UAS-luciferasa/+ con el péptido a 250 iM en medio nutritivo casero. plO produjo una leve disminución en los niveles de emisión de luz. Sin embargo, esta diferencia no era significativa respecto al control con DMSO (a=0.05, test t; Figura 14), demostrando que el péptido no afectaba al sistema Gal4/UAS de forma inespecífica. Sin embargo, la presencia por sí sola de DMSO en la comida de las moscas control causó un incremento en los niveles de proteína luciferasa. Estos resultados indican que el disolvente podría afectar a la expresión de este transgén, posiblemente por un efecto descrito como supresor de la variegación dependiente de posición.
En segundo lugar, se determinó si plO afectaba específicamente a los niveles de transcritos CUG(480) mediante RT-PCR a partir de moscas Mhc-Gal4/+;UAS-CTG/+ alimentadas con plO a diferentes concentraciones. Tras cuantificar la intensidad de las bandas obtenidas en la reacción de PCR no se detectaron diferencias significativas en los niveles de CUG(480) a ninguna concentración (Figura 15), demostrando que plO no afectaba a la cantidad de transcritos.
Ejemplo 8. Estudio de la similitud existente entre las secuencias de plO y Mbl. Mediante un análisis bio informático utilizando el programa de comparación de secuencias MEGA (www.megasoftware.net) se encontró que los aminoácidos de plO alinean parcialmente con el reverso de una secuencia conservada del primer dedo de zinc de las proteínas Muscleblind, dominio a través del cual las proteínas se unen al ARN (Figura 16). En este alineamiento el Triptófano de plO coincide con la posición de una Fenilalanina de Mbl (aminoácido también aromático, apolar e hidrofóbico), la cual media la unión de la proteína a las repeticiones CUG. Dada esta similitud, se decidió estudiar el efecto del péptido sobre la unión de Mbl a los ARNs tóxicos.
Ejemplo 9. Expresión y purificación de los dedos de Zinc de Mbl.
Para comprobar si el péptido era capaz de competir con Mbl en su unión a las repeticiones, se decidió llevar a cabo ensayos de unión entre ARN y proteína in vitro. Para realizar tales experimentos era necesario expresar y purificar la proteína Mbl. Se trabajó tan sólo con la porción de Mbl correspondiente a sus dedos de zinc (MblZF, aminoácidos 1-98) por diversos motivos. En primer lugar, en Drosophila existen 7 isoformas Mbl distintas. A excepción de la isoforma MblD, todas ellas comparten la región que contiene los dos dedos de zinc (extremo Nt) y difieren en sus secuencias Ct. Por otra parte, tanto los dedos de zinc de MBNL1 como de Mbl son suficientes para unirse a sus secuencias diana.
Durante la clonación en un vector derivado del vector comercial pET-15b, la proteína MblZF se fusionó a 6 Histidinas para facilitar su purificación, así como al sitio de corte de la proteasa TEV (del inglés Tobacco Etch Virus). Con el fin de encontrar las condiciones óptimas de expresión de MblZF en E. coli se ensayaron combinaciones de diversos factores. En primer lugar, se partió de tres cepas diferentes de bacterias. La cepa BL21 (DE3) es una cepa diseñada para sistemas de expresión basados en el promotor del bacteriófago T7. Esta cepa es adecuada para la expresión de proteínas recombinantes no tóxicas. En caso de que la proteína a expresar resulte tóxica, la cepa BL21 pLys (DE3) de E.coli presenta la ventaja de expresar de manera constitutiva bajos niveles de la lisozima T7, lo cual reduce la expresión basal de genes recombinantes al inhibir los niveles de AR polimerasa T7. Por último, la cepa BL21 pLys (DE3) Codon + contiene genes que codifican tARNs para codones humanos y que las bacterias tienen en niveles muy bajos. En segundo lugar, los dominios de dedos de zinc son dominios de unión a ácidos nucleicos que unen un átomo del ión zinc entre sus residuos de Cisteína e Histidina. El metal zinc es crucial para la estabilidad de este tipo de dominios ya que en su ausencia los dedos de zinc se despliegan y pierden la capacidad de unirse a sus dianas. Por ello, se ensayaron dos concentraciones distintas de ZnCl2 en todos los medios de cultivo empleados a lo largo de la expresión de la proteína MblZF (50 μΜ y 100 μΜ). Las proteínas con dedos de zinc suelen ser, además, moléculas bastante insolubles e inestables. Por esta razón ensayamos dos temperaturas distintas de inducción, 30°C y 16°C. De entre todas las combinaciones testadas conseguimos obtener una alta proporción de MblZF soluble al utilizar la cepa BL21 (DE3), una concentración de ZnCl2 de 50 μΜ y una temperatura de inducción de 16°C con 1 mM de IPTG (Figura 17A).
El proceso de purificación se llevó a cabo por cromatografía de afinidad en un sistema FPLC, a lo largo del cual se mantuvo la presencia de zinc en el medio. El pico de elución de la proteína se produjo a aproximadamente 300 mM de imidazol (Figura 17B). La concentración de proteína total obtenida fue de 2.73 mg/mL (198 μΜ; Figura 17C), lo que supone un rendimiento de 1.4 mg de proteína/L de cultivo. En posteriores tandas de purificación este valor no cambió de manera considerable.
Para comprobar que la proteína purificada se encontraba en su conformación nativa tras la purificación se analizó su espectro de dicroísmo circular (DC). El dicroísmo circular es una técnica de espectroscopia de absorción electrónica basada en la absorción diferencial de haces de luz circularmente polarizados a derecha e izquierda, por parte de una molécula. Debido a que proteínas diferentes poseen un espectro de dicroísmo circular distinto, esta técnica permite identificar la conformación de distintas moléculas comparando con un espectro teórico (Figura 18B). El espectro de dicroísmo circular obtenido para MblZF en tampón fosfato se asemeja al descrito para los dedos de zinc de MBNL1, con pico pronunciado a 203 nm, el cual denotaba falta de estructura, y un pico débil a 220 nm, indicador de hélice alfa (Figura 18A). En el caso de MblZF, este patrón se conservaba aunque los valores se encontraban ligeramente desplazados a la derecha (Figura 18C). Por último, con el fin de determinar si MblZF se encontraba como monómero en solución o formando complejos llevamos a cabo cromatografía de exclusión molecular (Figura 18D). La cromatografía de exclusión molecular es un método de cromatografía en columna por el cual las moléculas se separan según su peso molecular. El volumen de exclusión obtenido para MblZF correspondía con un peso molecular de 13.4 KDa, equivalente al tamaño de la proteína en forma de monómero. El cromatograma reveló un único pico de elución, lo cual demuestra que MblZF no forma complejos consigo mismo en solución, al menos en las condiciones del ensayo.
Ejemplo 10. plO se une a repeticiones CUG in vitro pero no compite con MblZF.
De entre las diferentes técnicas para el estudio in vitro de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos destacan por su rapidez y sensibilidad los ensayos de polarización de fluorescencia (FP). Esta técnica se basa en los cambios en el movimiento rotacional de moléculas fluorescentes en suspensión. Así, cuando un haz de luz polarizada excita a un fluoróforo conjugado a una molécula pequeña, ésta sufre difusión rotacional más rápido que el tiempo necesario para que ocurra la emisión de luz, lo que resulta en una disposición al azar de la molécula en el momento de emisión de fluorescencia (despolarización). Sin embargo, la rotación de la molécula se vuelve más lenta cuando la viscosidad del medio o el volumen molecular cambian, aumentando la polarización de la luz emitida. De esta manera, midiendo los cambios en la polarización de una molécula se puede detectar la unión entre ésta y otra añadida al medio (Figura 19). En la presente invención, estas moléculas eran plO, MblZF y 23 repeticiones CUG conjugadas al fluoróforo carboxifluoresceína (FAM-(CUG)23).
Para poner a punto el experimento de FP se ensayaron en primer lugar dos concentraciones distintas del ARN FAM-(CUG)23 (6 nM y 60 nM). En ambos casos se pudo detectar el ARN y se observó un incremento significativo en los valores de polarización de fluorescencia al añadir MblZF (p-valor<0.0001), indicando que se había producido unión. Con el fin de reducir tanto el gasto de sonda como de proteína se decidió trabajar a una concentración de FAM-(CUG)23 de 6 nM. La interacción observada entre MblZF y FAM-(CUG)23 era proporcional a la cantidad de proteína (Figura 20B). El análisis estadístico de la curva de unión dio lugar a una IC50 teórica de 900 nM. Con el fin de comprobar la especificidad de esta unión se llevaron a cabo estudios de competencia con un ARN no marcado, (CUG)23 (1 : 10, 1 : 100 y 1 :200 respecto a FAM-(CUG)23). En todos los casos se observó competencia a todas las concentraciones de sonda no marcada ensayadas (Figura 20 A). plO también causó un leve incremento en la polarización de FAM-(CUG)23 (p-valor: 0.0176; Figura 20D). Sin embargo, la adición de cantidades crecientes de plO no dio lugar a una curva de unión, posiblemente debido al pequeño tamaño de plO (Figura 20D). La coadición de plO y MblZF a FAM-(CUG)23 causó un incremento en la polarización del ARN mayor que el provocado por la adición de MblZF sólo (p-valor: 0.0158; Figura 20C). Este resultado indica que ambas moléculas pueden unirse al ARN sin interferir con la unión de la otra. No obstante, el incremento en los valores de polarización tras la coadición de MblZF y de plO era menor que la suma de incrementos causados por ambos por separado (AmP(Mbl): 99.5; ΔητΡ(ρ88): 21.75; AmP(Mbl+p88): 108.25), lo que no descarta que exista competencia parcial.
Los cambios sobre el ARN producidos por plO en el ensayo de FP son pequeños, probablemente debido al bajo peso molecular de la molécula (inferior a 900 Da). Por esta razón, se decidió complementar el estudio con experimentos de retardo en gel. Estos ensayos se basan en las diferencias en la movilidad electroforética entre complejos estables proteína-ácido nucleico y sus componentes por separado. Debido a que se disponía del ARN FAM-(CUG)23 se decidió poner a punto un ensayo de retardo en gel fluorescente. Tras determinar la cantidad de ARN óptima para la detección (60 nM; Figura 21 A) se estudió la unión entre éste y MblZF. Dicha unión provocó tanto una disminución en la intensidad de la banda correspondiente al ARN libre en el gel como la aparición de señal en el interior del pocilio de los geles (ARN unido). Sin embargo, no se observaron bandas de retardo en el gel, indicando que todos los complejos formados tras la unión quedaban retenidos en el pocilio. La señal en el interior del pocilio disminuía al competir la unión con sonda (CUG)23 no marcada (1 : 100) demostrando la especificidad de la interacción. Además, la unión no tenía lugar si el ARN fluorescente se incubaba con la proteína MblZF desnaturalizada por calor, ni si la reacción se llevaba a cabo entre FAM-(CUG)23 y una proteína distinta (colágeno a3) a la misma concentración que MblZF, de nuevo confirmando la especificidad de la unión (Figura 21B). Con el fin de descartar que FAM-(CUG)23 pudiese unirse a una etiqueta de 6 Histidinas de MblZF, se eliminaron éstas mediante digestión con la proteasa TEV (Figura 22A-C). La proteína MblZF sin Histidinas (MblZFAHls) mantenía la capacidad de unión al ARN (Figura 22D).
La retención de los complejos formados entre MblZF y FAM-(CUG)23 en el pocilio podría deberse a la formación de agregados de gran tamaño entre el ARN y la proteína. Con el fin de disminuir el tamaño de dichos complejos utilizamos un ARN de 4 repeticiones CUG (FAM-(CUG)4). Los dedos de zinc de MBNL1 pueden unirse a repeticiones CUG formadas por un mínimo de 4 tripletes siempre y cuando se facilite la formación del lazo o 'loop'' añadiendo 4 nucleótidos no complementarios hacia la mitad de la secuencia. Tal y como se muestra en la Figura 21C, MblZF se unió a FAM-(CUG)4 pero el complejo formado quedó igualmente retenido en el pocilio.
El punto isoeléctrico (pl) de MblZF es 9.5. El pH del tampón de electroforesis utilizado en nuestros ensayos es de 8.5, lo que significa que la carga total de MblZF en el gel es positiva. Los geles de retardo son geles no desnaturalizantes, por lo que no hay SDS presente en el medio que confiera carga negativa a la molécula para que ésta migre hacia el polo positivo. En general, en los ensayos de retardo en gel esto no suele ser un inconveniente, ya que el ARN tiene carga negativa y es capaz de arrastrar al complejo durante la electroforesis. No obstante, se decidió comprobar que FAM- (CUG)23 podía movilizar a MblZF corriendo el complejo en un gel horizontal de agarosa al 2.5% con los pocilios colocados en medio y tiñéndolo con Coomassie (Figura 23 A). En este experimento la proteína MblZF sola migró hacia el polo negativo, en dirección contraria al marcador de peso molecular de proteínas. Cuando MblZF se incubó con FAM-CUG(23), la cantidad de proteína que migraba hacia el polo negativo (probablemente proteína no unida) disminuyó, pero seguía sin aparecer señal hacia el lado positivo del gel, incluso si la electroforesis se llevaba a cabo a un pH de 10.5, superior al pl de MblZF (Figura 23B).
Con el fin de otorgar la carga negativa necesaria, se fijó el complejo FAM-(CUG)23- MblZF entrecruzamiento con formaldehído (FA) y se corrió la reacción en un gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (en presencia de SDS; Figura 23C) o, alternativamente, añadiendo Serva Blue G el cual confiere carga a las proteínas sin desnaturalizarlas. En ningún caso conseguimos que el complejo penetrase en el interior del gel.
Con el fin de determinar si plO podía unirse a moléculas de ARN CUG, se decidió llevar a cabo un experimento de retardo en gel similar entre el péptido y FAM- (CUG)23. plO se unió al ARN quedando parte del complejo retenido en el pocilio, tal y como se ha descrito para MblZF. No obstante, en este caso se pudo observar una banda de retardo en el interior del gel (Figura 24A). plO se unía a FAM-(CUG)23 a concentraciones de péptido elevadas (500 μΜ en adelante, Figura 24B), indicando una baja afinidad entre ambas moléculas, al menos en las condiciones del ensayo. Esta afinidad se reducía al disminuir el tamaño de las repeticiones (FAM-(CUG)4, Figura 24C). Con el objetivo de determinar si plO podía competir con MblZF por la unión al ARN, se incubaron ambos en presencia de FAM-(CUG)23. plO no impidió la unión de MblZF, ya que en este caso todo el ARN quedó retenido en el pocilio (Figura 24D). Esto podría deberse bien a un efecto sinérgico entre la proteína y el péptido o a un efecto aditivo si ambos se uniesen a sitios diferentes del ARN. Ejemplo 11. plO se une a repeticiones CUG con mayor afinidad que a otras secuencias.
Con el fin estudiar la especificidad de la unión observada entre p 10 y las repeticiones CUG se llevaron a cabo dos experimentos. En primer lugar, se ensayaron los cinco hexapéptidos generados durante el rastreo de alaninas. Ninguno de ellos se unió de manera significativa a FAM-(CUG)23 (Figura 25A), demostrando que todos los residuos de plO son necesarios para su interacción con al ARN. De manera interesante, estos péptidos no suprimieron la toxicidad del transgén CTG(480) en Drosophila, indicando que la capacidad de unión de plO a repeticiones CUG es necesaria para su actividad in vivo. En segundo lugar, se estudió el efecto de plO sobre otras secuencias de ARN y ADN, tanto de doble cadena como de cadena sencilla, marcadas fluorescentemente con carboxifluoresceína (FAM) (Figura 25C). Dichas moléculas incluían (1) un ARN de cadena sencilla formado por 19 nt de la región 3'UTR del gen DMPK (ARNcs), (2) un ARN formado por 4 repeticiones CUG fusionadas a la secuencia de cadena sencilla de DMPK (ARNdc+cs), (3) un ARN capaz de formar un horquilla de doble cadena perfecta formada por 4 repeticiones CAG CUG (ARNdc), (4) un ADN formado por 4 repeticiones CTG (ADNdc) y (5) un ADN correspondiente a los mismos 19 nt de la región 3 'UTR del gen DMPK. plO se unió en todos los casos (Figura 25B). Además, un ARN mutado no marcado de secuencia (GUC)4 (al cual los dedos de Zinc de la proteína MBNL1 humana no se unen) y ARNt desplazaron la unión entre plO y FAM-(CTG)23. En conjunto, estos datos indican que la unión de plO al ARN era específica de secuencia (ya que otros hexapéptidos mostraban un comportamiento diferente) y que el péptido podía unirse a más de un solo tipo de ácido nucleico. Sin embargo, era posible que plO se uniese con afinidad diferente a cada una de las secuencias estudiadas. Debido a que los complejos péptido-ARN y péptido-ADN detectados en los experimentos de retardo en gel quedaban retenidos en el pocilio, la determinación de constantes de disociación (Ka) para cada interacción no fue posible. Con el fin de cuantificar la unión entre p l O y dichos ácidos nucleicos, así como descartar que el péptido se estuviese uniendo a la carboxifluoresceína en todos los casos, se decidió poner a punto un experimento de extinción de la fluorescencia intrínseca del Triptófano presente en la secuencia de plO. El Triptófano tiene un máximo de absorción a una longitud de onda de 280 nm y un pico de emisión máximo entre 300 y 350 nm (en función de la polaridad del solvente). La fluorescencia de este residuo cambia cuando la conformación de la proteína en la que se encuentra se ve modificada por, por ejemplo, su unión a otra molécula. Así, se incubaron cantidades crecientes de las moléculas de AR DMPK-CUG4, DMPK y CAG CUG4, así como los ADNs CTG4 y DMPK con una cantidad fija de plO (5 μΜ), y se midieron cambios en la emisión de fluorescencia del péptido a 351 nm. En todos los casos la señal disminuyó de manera proporcional a la cantidad de ARN o ADN añadida al medio, confirmando la unión observada anteriormente. Sin embargo, la representación en una recta de la fluorescencia emitida para cada punto de concentración relativa a la fluorescencia del péptido libre dio lugar a rectas con pendientes diferentes, indicando que la tasa de extinción de fluorescencia (y con ello la afinidad de la unión) era distinta entre los distintos ácidos nucleicos (Figura 26). La pendiente de la curva era significativamente mayor para la molécula DMPK-CUG4 (-0.034 ± 0.003) que para CTG4 (-0.019 ± 0.005) y DMPK (ARN: -0.024 ± 0.003 y ADN: -0.028 ± 0.002) (p- valor<0.01). Sin embargo para el ARN CAG CUG (-0.028 ± 0.003) esta diferencia no era estadísticamente significativa (p-valor>0.1; Figura 26B). La molécula DMPK- CUG4 contenía las repeticiones CUG en su entorno de DMPK. En conjunto, esto indicaba que existía selectividad de unión por parte del péptido a sus dianas, por que era posible que in vivo se uniese de manera preferente a los ARN tóxicos.
Ejemplo 12. plO provoca un cambio conformacional en las repeticiones CUG.
Con el fin de estudiar posibles cambios en la estructura secundaría del ARN inducidos por plO, se llevó a cabo en primer lugar un experimento de dicroísmo circular (DC) utilizando un ARN con repeticiones CUG no marcadas (CUG60). El dicroísmo circular de los ácidos nucleicos viene dado por el apilamiento de las bases que conforman su secuencia. Por lo tanto, cuando una molécula se une al ARN, afectando a su estructura, se detecta un cambio en su espectro de DC. Incubar el ARN CUG60 (1 μΜ) con la proteína MblZF (1 μΜ y 1.5 μΜ) redujo la intensidad de la señal emitida por éste, aunque no desplazó el valor de longitud de onda del pico en el espectro (Figura 27A), indicando que la unión de MblZF afectaba al empaquetamiendo de las bases del ARN. Cuando incubamos el ARN con concentraciones crecientes del péptido de SEQ ID NO: 10 (0.1 μΜ, 0.5 μΜ, 1 μΜ, 10 μΜ y 20 μΜ) se observó un efecto similar (Figura 27B). Durante las lecturas, el ARN se mantuvo en la cubeta en el interior del dicrógrafo a 10°C. A lo largo de las 3 horas que dura cada experimento era posible que el ARN se hubiese degradado, explicando esto la disminución en la intensidad de la señal observada. Para descartar esta posibilidad, se midió el espectro de DC del ARN CUG60 a tiempos 0 y 3 h, habiéndose mantenido éste a 10°C en todo momento. A las 3 horas el espectro de CUG60 no mostró cambios respecto al espectro obtenido a tiempo 0, demostrando que los efectos observados eran específicos (Figura 27D). Además, los péptidos p29.1 (0.5 μΜ y 1 μΜ) y p29.4 (1 μΜ) del rastreo de alaninas no cambiaron el espectro del ARN (Figura 27E y 27F), confirmando la especificidad de la unión. Por último, cuando se añadió MblZF (0.5 μΜ) seguido de plO (0.5 μΜ), o viceversa, al ARN no se observó un incremento en la señal de DC, lo que sugiere que los cambios producidos en el ARN por uno de ellos no son reversibles por la adición posterior del otro.
Estos resultados demuestran que plO disminuye el apilamiento de las bases del ARN y, por tanto, afectaba a la conformación secundaria de la molécula. Con el fin de confirmar si dichos cambios causan una pérdida de la estructura en horquilla se llevó a cabo un experimento utilizando un ARN formado por 23 repeticiones CUG en el que una guanina había sido sustituida por su análogo 2-amino purina (2-AP-(CUG)23). Cuando la 2-AP se encuentra en un entorno de cadena sencilla emite fluorescencia a 375 nm. Sin embargo, dicha emisión se extingue significativamente cuando la molécula se encuentra formando parte de una doble hélice. A concentraciones bajas de MblZF y de plO, para las cuales se había detectado unión en los experimentos de DC y Trp-FQ (ARN:proteína < 1 :5), ninguno de los dos produjo cambios en la fluorescencia de la 2-AP (Figura 28A-B). Sin embargo, al aumentar la concentración de plO a 100 μΜ (ARN:péptido 1 : 100) el ARN 2AP-(CUG)23 sufrió un cambio conformacional de doble cadena a cadena sencilla, con un incremento de 2.9 veces en la emisión de fluorescencia de la molécula (Figura 28B). Con el fin de confirmar la especificad de este efecto, se llevó a cabo el mismo experimento incubando los péptidos del rastreo de alaninas (payawe y ppyawa) con el ARN 2-AP-(CUG)23 a la misma concentración que plO (100 μΜ). Ninguno de estos péptidos produjo cambios en la emisión de fluorescencia, así como tampoco lo hizo el DMSO por sí sólo (Figura 28C). Por tanto, estos resultados indican que plO es capaz de desestabilizar la doble hebra formada por las repeticiones CUG y confirman que MblZF y el péptido se unen de manera diferente al AR . Ejemplo 13. Validación del efecto de plO en un modelo de DM1 en ratón. Estudio de la toxicidad de plO en mamíferos.
Con el fin de estudiar el posible efecto tóxico de plO en mamíferos y establecer la dosis máxima tolerable para posteriores ensayos, se administró el péptido a ratones de la cepa salvaje FVB. Debido a la baja absorción de los péptidos por las paredes del intestino se decidió llevar a cabo inyecciones intramusculares en el músculo tibial anterior de animales de 4-5 semanas de edad utilizando cuatro dosis diferentes (0.5 μg, 1 μg, 10 μg y 100 μg) con un total de 6 ratones por dosis (3 hembras y 3 machos). Pasadas 4 semanas tras la inyección, los animales se sacrificaron y se llevó a cabo una autopsia visual, así como un estudio histomorfo lógico del músculo y análisis de sangre (Figura 31). Como control se utilizaron animales inyectados con la misma cantidad de DMSO (0.2% para las dosis 0.5 μg y 1 μg y 2% para los dosis 10 μg y 100
La autopsia visual y el análisis histológico de los músculos de los animales tratados no revelaron diferencias significativas respecto a los controles con DMSO. En algunos casos se observaron signos de mixedematosis leve (acumulación de líquido) y, en ocasiones, una ligera inflamación, probablemente causados por la propia inyección (Figura 31). Los análisis de sangre, no obstante, sí que mostraron diferencias entre los animales tratados y el control. Como marcador de actividad renal se midió la cantidad de ácidos biliares, urea y creatinina en sangre. El enzima creatinafosfoquinasa (CPK) se usó como marcador de daño en músculo esquelético y corazón, y la fosfatasa alcalina (FA), la gama glutamil transpeptidasa (GGT) y la glutamato piruvato transaminasa (GPT) como marcadores de daño hepático. Todos los animales (incluido el control) mostraban valores de urea y FA elevados respecto a los valores estándar. Además, los animales control sometidos a DMSO al 2% presentaban valores de GPT y CPK anormalmente altos. Esto podría deberse a la toxicidad del DMSO o a la propia inyección. No obstante, las dosis 10 μg y 100 μg mostraron valores aún mayores de urea y GPT en sangre que sus controles. La urea es el resultado final del metabolismo de las proteínas. Esta se forma en el hígado y se elimina en la orina. Si el riñon no funciona correctamente la urea se acumula en la sangre. La GPT es una enzima presente en gran concentración en el hígado y en menor medida en los ríñones, corazón y músculos. Cuando existe una lesión de estos órganos, la enzima es liberada a la sangre y aparece elevada en los análisis. Además, cabe destacar que dos de los ratones tratados con la dosis 100 μg murieron aproximadamente 11 días después de la inyección (d/i), confirmando la toxicidad de de plO a partir de un punto umbral. De uno de estos dos animales pudo extraerse sangre momentos antes de su muerte. Este ratón presentaba valores extremadamente altos de urea, creatinina, CPK y GGT en sangre (p.e., un valor 28 veces mayor para la CPK que el límite superior de los valores estándar y 15 veces mayor que su control con DMSO).
Ejemplo 14. plO revierte los defectos de splicing de los transcritos Sercal y Tnnt3 en ratones HSALR plO suprimía el efecto de CTG(480) en el SNC, músculo y ojo de Drosophila y se unía a repeticiones CUG in vitro. Para validar la relevancia de estos resultados en modelos de DM1 en mamíferos, se decidió ensayar plO en ratones HSALR. Estos ratones expresan 250 repeticiones CUG en un transcrito heterólogo, la actina esquelética humana (human skeletal actin, HSA) y reproducen la mayoría de síntomas de la DM1, incluyendo defectos en el splicing alternativo de transcritos. Uno de los ejemplos más claros de splicing alterado tanto en pacientes como en ratones HSALR es el del exón 22 de los transcritos de la ATPasa dependiente de Ca+2 Sercal. En la población sana, dicho exón se excluye en las formas fetales y se incluye en el adulto. Sin embargo, tanto en los pacientes como en los ratones HSALR el exón 22 se excluye a lo largo de toda la vida, manteniéndose así un patrón fetal en los individuos adultos. La proteína Tnnt3 se encuentra en los sarcómeros de las fibras musculares rápidas en el músculo esquelético. Sus transcritos sufren splicing alternativo del denominado exón fetal F. En la población sana este exón está ausente en los individuos adultos, mientras que en los pacientes de DM1 y ratones HSALR el exón fetal se mantiene. Con el fin de determinar si plO podía revertir los defectos de splicing de Sercal y Tnnt3 en los ratones HSALR, se llevaron a cabo inyecciones intramusculares del péptido a dos dosis: 0.5 μg y 10 μg. Los animales tratados se sacrificaron 1 semana, 2 semanas y 4 semanas después de la inyección, y se diseccionó el músculo tibial anterior tanto de la pata derecha (inyectada con p 10) como de la izquierda (inyectada con suero salino con DMSO al 0.2% para la dosis 0.5 μg y al 2% para la dosis 10 μg). Como control se utilizaron animales FVB y animales HSASR (los cuales expresan 5 repeticiones CUG en transcritos de la actina esquelética humana) inyectados en ambas patas de manera similar, así como ratones HSALR en los que se inyectó suero con DMSO en las dos extremidades.
El análisis mediante RT-PCR de los transcritos de Sercal y Tnnt3 de animales tratados con 0.5 μg no reveló cambios significativos en la inclusión de los exones 22 y fetal F respectivamente, a ninguno de los tiempos ensayados (geles no mostrados). Sin embargo, en 2 de 5 los animales inyectados con 10 μg, plO revirtió los defectos de splicing en ambos casos (Figura 32A-C). Debido al complejo patrón de bandas obtenido para los transcritos de Tnnt3 no pudimos cuantificar de forma precisa el incremento en el porcentaje de exclusión del exón fetal F inducido por plO. En el caso de Sercal, plO aumentó el porcentaje de inclusión del exón 22 en un 1.3% (1 semana d/i, p-valor>0.05), 25.9%> (2 semanas d/i, p-valor<0.05) y 38.3% (4 semanas d/i, p- valor<0.01) (Figura R40D). Por último, plO no afectó al splicing de los transcritos musculares del gen Capzb, los cuales se utilizaron como control de especificidad ya que su procesado no está alterado en los ratones modelo HSALR (Figura 32A-C).
El análisis del procesado de los transcritos de Sercal en las patas derecha (inyectada con p 10) e izquierda (inyectada con suero y 2%> DMSO) procedentes de un mismo animal a las 4 semanas d/i, reveló que en la extremidad no tratada el porcentaje de inclusión del exón 22 era mayor con respecto al mostrado por los animales HSALR inyectados con DMSO en ambas patas (Figura 33). Esto indica que la cantidad de plO que llegaba al músculo tibial anterior de la extremidad izquierda a través de la sangre era suficiente para revertir parcialmente los defectos de splicing de manera sistémica. Ejemplo 15. plO revierte defectos histológicos en el músculo de ratones HSALR
La principal característica a nivel histológico tanto de la DM1 como de los animales HSALR es la presencia de núcleos centrales en las fibras musculares. La inyección de 0.5 μ y 10 μ en el músculo tibial anterior de estos animales redujo de manera significativa el porcentaje de células con núcleos centrales respecto a los animales HSALR tratados con DMSO, mientras que no produjo cambios en los ratones FVB (Figura 34). Este efecto era más pronunciado transcurridas 4 semanas tras la inyección, indicando que se trataba de un proceso lento.
En conjunto, los resultados obtenidos en los ratones modelo validan el potencial terapéutico de plO en mamíferos, abriendo nuevas vías de estudio en la búsqueda de tratamientos para la DM1 y DM2 y SCA8.
Ejemplo 16. Ensayo comparativo de varios péptidos de la invención (plO, pll, p5, pl2 y pl5) en la desestructuración o apertura de las horquillas de repeticiones diferentes a CUG como AAG (control), CGG, CCUG y CAG. Tal y como se observa en la Figura 29 en este ejemplo se utiliza el ensayo de la 2- aminopurina para ensayar 4 péptidos más (pl l, p5, pl2 y pl5), además de plO, obtenidos de la deconvolución de la librería combinatoria peptídica explicada en esta invención. Los resultados indican una correlación entre la actividad obtenida con los péptidos (Tabla 1) y la capacidad de desestructurar estructuras secundarias y pasar a cadena sencilla de la sonda CUG23. La concentración utilizada en todos los casos es ΙΟΟμΜ. Por lo tanto, este experimento evidencia que aunque plO es el péptido preferido al ser el más activo, el resto de los péptidos de la Tabla 1, particularmente pl l, p5, pl2 y pl5, también presentan niveles significativos de especificidad y eficacia. Por otro lado, tal y como se representa en la Figura 30, los péptidos de la invención (particularmente plO) tienen diferentes afinidades de unión a horquillas de repeticiones diferentes de CUG, como por ejemplo AAG, CGG, CCUG y CAG. En este ejemplo se testó plO y su capacidad de unión a repeticiones diferentes de CUG pero que también están implicadas en enfermedades donde se ha descrito toxicidad de ARNs con largas repeticiones. Se utilizó el ensayo de la extinción del triptófano utilizando por un lado p l O + AAG, CGG, CCUG y CAG (AAG se utiliza como control porque no forma estructuras secundarias) y por otro lado el mismo experimento pero utilizando uno de los péptidos obtenidos tras el rastreo de alaninas (ppyawa) que no es activo. Los resultados indican que plO presenta unos niveles de unión a otros tipos de secuencias repetitivas similares a los observados anteriormente con DMPK-CUG4 (altamente específico en su unión con plO) (Figura 26). Esta unión era mayor en presencia de repeticiones CGG y CCUG implicadas en las enfermedades FXTAS y DM2, respectivamente. Se utilizaron tres puntos de ensayo (3 concentraciones diferentes de sonda) con dos medidas en cada uno de ellos. Los resultados fueron normalizados a la señal ofrecida por plO a solas. Los resultados de plO respecto a uno de los péptidos (ppyawa) del rastreo de alaninas (sin actividad) mostraron una respuesta completamente diferente a la presencia de diferentes ARN repetidos. La disminución de intensidad mostrada por plO en presencia de casi todos los tipos de repetición cambia drásticamente de sentido (aumento de intensidad) cuando se utiliza el péptido ppyawa. Este aumento de intensidad, en vez de disminución, también es indicativo del tipo de unión con las sondas, lo que sugiere que la eficacia de plO estaría estrechamente ligada al tipo de interacción con las estructuras secundarias formadas por distintos tipos de repeticiones. Se representa un solo punto de ensayo (sonda a 10 μΜ). Los resultados son mostrados sin normalizar para poder incluir el valor inicial de los péptidos testados.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuesto que comprende un hexapéptido de Fórmula I, sales, derivados, o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables del mismo:
A-B-C-D-E-F
(I) donde:
A puede ser cualquiera de los aminoácidos c ó p, B puede ser cualquiera de los aminoácidos p ó q, C es el aminoácido y,
D puede ser cualquiera de los aminoácidos a ó t, E puede ser cualquiera de los aminoácidos q ó w, y F es el aminoácido e.
2. Compuesto, según la reivindicación 1, seleccionado del grupo: SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 19.
3. Compuesto, según la reivindicaciones 1 ó 2, que consiste en un hexapéptido de secuencia SEQ ID NO: 10.
4. Compuesto, según las reivindicaciones 1 ó 2, que consiste en un hexapéptido seleccionado entre: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 15.
5. Compuesto, según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los aminoácidos que forman parte de la Fórmula I son L-aminoácidos, D- aminoácidos o mezclas de los mismos.
6. Compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un hexapéptido de Fórmula I en configuración directa o retro inversa.
7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para ser usado como medicamento.
8. Compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para ser usado en la prevención y/o tratamiento de enfermedades cuya etiología se basa en la presencia de transcritos tóxicos que comprenden repeticiones CUG, CCUG, CGG, CAG y AAG comprendidas en el grupo: DM1, SCA8, DM2, FXTAS, HD y FA.
9. Uso de al menos un compuesto de las reivindicaciones 1 a 6 para la elaboración de una composición farmacéutica destinada a la prevención y/o tratamiento de enfermedades cuya etiología se basa en la presencia de transcritos tóxicos que comprenden repeticiones CUG, CCUG, CGG, CAG y AAG, comprendidas en el grupo: DM1, SCA8, DM2, FXTAS, HD y FA.
10. Composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de las reivindicaciones 1 a 6.
11. Método para la prevención y/o tratamiento de enfermedades cuya etiología se basa en la presencia de transcritos tóxicos que comprenden repeticiones CUG, CCUG, CGG, CAG y AAG, comprendidas en el grupo: DM1, SCA8, DM2, FXTAS, HD y FA que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un compuesto de las reivindicaciones 1 a 6, o de la composición de la reivindicación 10.
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