CN102933224A - 治疗基于毒性转录物的表达的疾病中使用的化合物 - Google Patents

Abstract

治疗基于毒性转录物的表达的疾病中使用的化合物。本发明涉及为了预防和/或治疗病因学是基于包含CUG、CCUG、CGG、CAG和AAG重复的毒性转录物的存在的疾病而设计的肽分子，具体地六肽，所述疾病优选地为：DM1SCA8、DM2、FXTAS、HD和FA。

Description

治疗基于毒性转录物的表达的疾病中使用的化合物

发明领域

本发明涉及包含六肽的化合物，所述化合物用于预防和/或治疗病因学是基于包含CUG、CCUG、CGG、CAG和AAG重复的毒性转录物的表达的疾病，所述疾病分别诸如，例如，1型强直性肌营养不良(DM1)、8型脊髓小脑性共济失调(SCA8)、2型强直性肌营养不良(DM2)、脆性X关联的震颤/共济失调综合征(FXTAS)、亨廷顿氏舞蹈病(HD)和弗里德赖希氏共济失调(FA)。

因此，本发明总体来说可包括在医学领域，并且更具体地，可包括在涉及预防和/或治疗遗传性基因病的领域。

现有技术

DM1、或斯太纳特氏病(DM1，OMIM#160900)是成人群体中肌营养不良的最常见类型，世界范围内的发病率是每8,000人中大约1名患者，并被归类为罕见病。该病是神经肌肉性疾病，具有主要影响肌肉的确定症状，诸如肌强直和肌无力，尽管该病的特征是多系统性的，影响心脏系统(心律失常)、视觉系统(白内障)、内分泌系统(高胰岛素血症)和生殖系统(性腺功能减退症)以及其他器官和系统。

在遗传水平，DM1呈现常染色体显性遗传模式、高外显率和可变表现度。该疾病的根源在于位于19q13.2-q13.3染色体区域的萎缩性肌强直病蛋白激酶基因(DMPK，Entrez#1760)的3’非翻译区(3’UTR)中的动态突变。所述突变由所述DMPK基因的外显子15中CTG三核苷酸的重复的异常扩增组成，其在健康群体中显示5-35拷贝的可变数目，而在患者中这一数目大于50。CTG三联体的数目与症状的严重度和这些症状出现的年龄相关。因此，在重复数目在50和数百之间的情形中，称其为成年发作型DM1，并且最初的临床迹象通常出现在生命的第二个十年内。在重复数目更大、甚至达到数千拷贝的情形中，该病理学从出生时以先天性DM(CDM或汤姆森病)的形式出现，这是该疾病的最严重的变体，具有诸如智力低下、呼吸系统病症和肌肉分化问题以及其他问题的症状。

近年来，关于DM1的病理发生的分子机制提出了许多假设，并且RNA毒性功能获得是其中具有最多共同意见的假设。根据该机制，携带CUG扩增的RNA形成对表达它们的细胞有毒的发夹环，通过掩蔽确定转录物的调节因子导致其可变剪接的变化以及其他变化。Mankodi等人(2000)在转基因小鼠上的工作为这一假设提供了决定性支持。所述小鼠在异源mRNA中表达大约250个CUG三核苷酸重复，并发展DM1典型的肌强直和肌肉缺陷，这证明CUG扩增自身发挥毒性效应，而与其环境无关(Mankodi等人，2000)。随后，在果蝇（Drosophila）中产生的其他模型证实CUG重复的毒性独立于DMPK(Garcia-Lopez等人，2008)。

因为发现具有CUG扩增的RNA可能对细胞有毒，一整套的科学证据支持以下假设：其他RNA中的这些扩增、或相似扩增可导致与DM1相似的遗传性基因病理学。例如，在DM2中，从ZNF9(锌指蛋白9，Entrez#7555)基因转录的RNA的第一内含子中CCUG四核苷酸的扩增触发与DM1非常相似的病理学(OMIM#602668)。事实上，在现有技术中，已知存在在DM1和DM2患者中均呈现改变的水平的与神经功能相关的基因，这支持两种疾病具有共同的病理发生机制的观点。

另一方面，8型脊髓小脑性共济失调(SCA8，OMIM#603680)是由SCA8基因的非编码转录物中的CTG三联体的扩增引起的神经退行性疾病。已观察到该基因的双向转录导致具有CUG扩增的RNA(非翻译的)的表达，该RNA触发与对DM1描述的那些相关的分子变化，和具有CAG扩增的转录物的表达，该转录物被翻译成具有多谷氨酰胺的蛋白质。

在核中，携带CUG扩增的RNA折叠形成发夹环结构，该发夹环结构能够结合和掩蔽RNA-结合因子，形成大的核糖核蛋白包涵体。迄今，已公开了CUG重复干扰越来越多的核蛋白，其中包括转录因子和可变剪接因子。可变剪接因子包括hnRNP F和hnRNP H异源核核糖核蛋白，以及属于MBNL1-3(Muscleblind-样蛋白)家族的蛋白。由于这一掩蔽，患者呈现数百种特异性转录物的可变加工，这导致产生术语“spliceopathy”，其中DM1是描述的第一个实例。还已提出不同微小RNA的活性可能被改变。

核蛋白的掩蔽阻止其在细胞中执行它们的正常功能。已分离并表征了在体外和体内均能够结合双链CUG发夹环的数种蛋白。这些蛋白包括转录因子诸如特异性蛋白1(Sp1)、视黄酸受体γ(RARγ)和信号转导物与转录激活物家族的成员STAT1和STAT3。在培养的DM1细胞中，这些因子可经受高达90%的掩蔽，这阻止它们激活其靶基因的转录，从而降低靶基因的表达。

在DM1中改变的其他转录因子是NKX2-5和MyoD。这些蛋白分别与心脏发育和传导相关以及与成肌细胞的分化相关。NKX2-5的水平在患者中是增加的，而MyoD是降低的。这些转录因子为什么下调的原因、以及它们与CUG发夹环的形成之间的关系是未知的。

迄今，多项研究已证明CUG重复影响许多基因的表达。使用小鼠微阵列，已检测到至少175种肌肉转录物被扩增的CUG转录物的表达改变。此外，在MBNL1敲除小鼠中，至少128种转录物也被下调，这表明MBNL1的掩蔽和随后的功能丧失在疾病中起关键作用。

MBNL1敲除小鼠呈现虹彩型白内障，在肌肉水平患有肌强直和组织学缺陷。MBNL2敲除小鼠也发展DM1典型的肌强直(由于Clcn-1转录物的不正确加工)和其他肌肉变化。此外，MBNL1在表达250个CTG重复的模型小鼠中的过表达逆转了至少4种转录物(Serca1、Clcn1、Tnnt3和ZASP)加工中的缺陷、以及肌强直。在果蝇中，mbl突变体胚胎呈现肌节Z带结构的缺乏、腹部的高收缩和转录物诸如ZASP、肌钙蛋白T(tnT)和α-辅肌动蛋白的可变加工的变化。同样地，MBNL1在表达480个CTG重复的模型果蝇中的过表达抑制了重复引起的表型。所有这些结果使DM1的研究发生了重大变化；此后，Muscleblind(Mbl)蛋白被视为该疾病发展中的决定性因素。

虽然DM最初描述于1909年，但现在仍然没有可用的有效疗法。应用的所有治疗是姑息性的并且作用是抑制症状的发展，而无法阻止其发作或以确定性方式治疗该疾病。目前，没有能够逆转氯传导缺乏来减轻肌强直的化合物。将抑制冲动启动和传播必需的钠进入的一些化合物，诸如mexityl、奎尼丁、苯妥英、普鲁卡因胺或卡马西平，施用给患者来治疗这一症状。偶尔，所述分子反过来被用于治疗心律失常；因此，鉴于它们因为对心脏功能的作用带来的风险，优选避免使用它们作为抗肌强直剂。此外，这些治疗中的许多治疗降低肌肉强度。已在患者中测试了另一钠通道阻断剂，硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)，并且它看起来成功减轻了肌强直和心脏问题，而没有增强肌无力。DHEAS是一种类固醇激素，它丰富地存在于血清中，且其水平随年龄而下降。在患有DM1的患者中，这一激素被降低高达60%。此外，DHEAS的有效剂量非常高；由于这一原因，它必须通过静脉内路径施用，这使得不利于用作长期治疗物。在一些情形中，与DHEAS联合施用肌酸酐来增加肌肉强度。然而，虽然用肌酸酐在患者中的最初临床试验显示可信的结果，但随后的研究不是同样阳性的。测试的用于治疗肌强直的其他药物包括三环抗抑郁剂、苯并二氮卓类、钙离子拮抗剂、牛磺酸或泼尼松，并且具有矛盾的结果。

基于以上描述的疾病的作用机制，该作用机制提出Muscleblind蛋白的掩蔽和随后的功能丧失作为该疾病的主要触发因素，已形成了寻找抑制MBNL1和具有CUG重复的发夹环之间的相互作用的分子的策略。因此，鉴定了能够体外抑制所述相互作用的化合物。具有序列((Quin/Pip)-(Asn/Pro)-Cys-Lys)的分子能够改变MBNL1与重复的结合。此外，抗生素喷他脒和新霉素B，以及溴化乙锭和噻唑橙（thiazole orange）、抑制MBNL1与CUG重复的结合。另外，喷他脒逆转了培养的HeLA细胞中IR和TNNT2转录物的剪接缺陷，并使含有MBNL1的核包涵体的形成降低21%。在DM1模型小鼠中，喷他脒还改善了Clcn-1和Serca1的剪接，尽管是离散地且没有明显的剂量响应。因此，喷他脒是在体外鉴定的在体内具有对CUG重复的潜在治疗效应的分子的第一个实例。然而，该分子可能影响MBNL1的其他靶转录物在不存在重复下的加工，这可能危及其长期治疗价值。现有技术中还基于CTG和/或CUG重复的三维结构开发了靶标是T-T或U-U非配对（unpairing）的分子。虽然能够结合G-G、C-C或A-A的小分子是已经知晓的，迄今没有发现以选择性方式结合T-T或U-U的化合物。因此，已显示与其他序列相比，由三氨基三嗪(其与T-T和U-U相互作用)加吖啶(嵌入剂)形成的配体以特异性方式与CTG和CUG重复结合并具有高亲和力。

此外，现有技术公开了能够与CUG和CAG重复结合和在两种情形下均抑制RNA-MBNL1复合物形成的化合物Hoechst 33258的五聚体的设计。该分子至少在小鼠成肌细胞中是穿透性的和无毒的。与此类似，还开发了对具有两个富含嘧啶的内部非配对的RNA分子具有高亲和力的配体，内部非配对诸如DM2中由CCUG重复形成的那些。该化合物由与类肽骨架结合的三个6'-N-5-己炔酸卡那霉素A模块组成并被四个间隔子单体隔开。将间隔子的数目从四减到二导致该分子变为对CUG重复比对CCUG具有更高的亲和力的配体。

现有技术中存在的这些策略或化合物使得释放MBNL1、从而逆转剪接缺陷是可能的。此外，当核包涵体被分散时，细胞质中将有更多的游离DMPK转录物待翻译。然而，突变体RNA的重新分布可能具有新的毒性效应。虽然心肌细胞的细胞质中CUG和MBNL1的聚集体的形成没有在小鼠中造成缺陷，但是其他蛋白可能短期或长期地受到影响。此外，干扰MBNL1和CUG之间的结合的那些分子还可能抑制MBNL1和核中的其他靶转录物之间的结合，如对喷他脒所发现的，或干扰具有与MBNL1相似的RNA结合机制的其他蛋白。最后，基于MBNL1的任何治疗方法都具有以下限制：不是CUG重复的所有毒性都是由于MBNL1的掩蔽。

大多数神经肌肉疾病的根源在于单基因的突变并因此是开发基因治疗的良好候选对象。然而，在DM1的情况下，涉及的组织主要是有丝分裂后的，这对于大多数病毒载体是不利因素。从这一点考虑，已提出使用诸如反义寡核苷酸(ASO)的分子可能是有利的。反义寡核苷酸不提供基因的副本，而是相反，调节现有基因的产物。目前，基于这一策略的几种分子已经处于临床阶段。一个实例是Duchenne’s肌营养不良(DMD，OMIM#300377)的情形，对于此，AVI Biopharma公司在美国有两种分子处于临床前阶段，其中的一个在英国已经处于1b/2临床阶段(www.avibio.com)。ASO在表达250个CTG重复的模型小鼠、以及在MBNL1敲除小鼠中的使用是现有技术中已知的，并且已研究了其对Clcn-1转录物外显子7a的剪接的效应。在两种模型中，胫骨前肌中的单次注射重新获得了Clcn-1转录物的正常剪接模式持续至少三周，逆转了肌强直。然而由于患者中加工被改变的信使的大数目，应将具有不同靶标的多种ASO组合以有效治疗不同的症状。

组合使用ASO的一个替代方案是使用在DMPK转录物水平起作用的反义寡核苷酸以消除毒性来源。在现有技术中，已经进行旨在使用特异性ASO抑制培养的患者细胞中DMPK的表达的测定。然而，这一方法不能区分突变体转录物和野生型转录物。鉴于DMPK在心脏功能和胰岛素代谢中的重要作用，降低DMPK的总表达可能是同等地致病的。现有技术中的几项工作使用由CAG重复(CAG7或CAG25)构成的ASO来将它们的效应优选地指向具有长的CUG重复的转录物。在培养的成肌细胞和DM1模型小鼠二者中，这些寡核苷酸除了特异地使突变体转录物的水平降低高达50%之外，还逆转Clcn-1的剪接缺陷，可能是由于短CAG重复序列和毒性RNA之间的结合促进了不含非配对的异源双链体的形成；这阻止了嘧啶非配对是其结合必需的结构元件的蛋白的掩蔽，诸如MBNL1。

因此，现有技术中已知的分子的主要作用机制是抑制具有CUG重复的发夹环施加的对MBNL蛋白的掩蔽从而阻止发夹环和MBNL蛋白之间的相互作用，而不是对发夹环的去结构化（destructuration）发挥直接效应

相反，本发明集中于从化学库中筛选药物以鉴定具有治疗病因学是基于包含CUG或CCUG重复的毒性转录物的存在的疾病的相应生物活性的化合物，所述疾病诸如，例如：DM1、DM2和SCA8。本发明的化合物是基于比现有技术中已知的那些机制更有效的机制，因为根据最可能的作用机制，由具有CUG重复的毒性片段构成的双链发夹环被结合和去结构化，或具有扩增的RNA保持单链构型，从而阻止MBNL1和其结合可能导致或加剧病理表型的任何其他分子的异常结合。此外，因为它们不竞争MBNL1和与该蛋白的天然靶标结构非常相似的CUG发夹环之间的异常结合，所以预期它们不会干扰细胞中MBNL1-调节的转录物。在本发明中，使用果蝇作为CTG重复的毒性模型(Garcia-Lopez等人，2008)，在其中测定本发明的化合物并确定它们对CTG重复的毒性的作用机制。在DM1脊椎动物模型中验证它们的效力。

发明描述

在本发明中，我们进行了鉴定具有预防或治疗病因学是基于包含CUG、CCUG、CGG、CAG和AAG重复的毒性转录物的存在的疾病的治疗潜能的化合物的方法，所述疾病诸如，例如：DM1、SCA8、DM2、FXTAS、HD和FA，所述方法包含体内筛选六肽化合物文库，优选地在疾病的果蝇模型中筛选，和选择那些逆转病理状况的化合物。

待用于寻找潜在治疗剂的分子的大小是要考虑的重要方面，这是因为太高的分子量会限制细胞对化合物的吸收。优化分子以产生更具活性的化合物通常伴随着其最终大小的增加。然而，大于1000的分子量通过降低分子的生物利用度降低其治疗潜能，这使得必须从小化合物开始。因此，目前商业化的药物中有80%具有低于450的分子量。氨基酸的平均分子量是约135Da。因此，六肽的近似大小在810Da左右。筛选由氨基酸数目大于6形成的肽文库将导致过大的分子。另一方面，虽然存在二、三、四和五肽的集合，但是增加形成分子的氨基酸的数目导致解卷积（deconvolution）过程中更大量的所限定的肽，从而增加发现活性化合物的概率。

(Garcia-Lopez等人，2008)中描述的果蝇模型表达480个CTG重复(CTG(480))，导致在成熟蛹阶段的致死表型，观察到该模型所展现的表型响应于Mbl的水平并对化合物修饰易感，这使得该模型适合于系统寻找具有预防或治疗病因学是基于包含CUG、CCUG、CGG、CAG和AAG重复的毒性转录物的存在的疾病的治疗潜能的化合物，所述疾病诸如，例如：DM1、SCA8、DM2、FXTAS、HD和FA。

本发明开始于以位置扫描方式筛选组合肽化合物文库。该化合物文库由120个小瓶构成，每个小瓶由在特定位置共有单个氨基酸而在所有剩余位置不同的六肽混合物组成。因此，当检测到阳性小瓶时，在给定位置鉴定了活性氨基酸。测定的每个位置（小瓶）的活性最强的氨基酸的组合称为解卷积。在本发明的优选实施方案中，为了延长肽在体内的平均寿命，本发明中使用的化合物文库的肽由天然氨基酸的D-立体异构体构成，其不被肠蛋白酶识别且较不易于降解。

因此，本发明涉及包含在果蝇和小鼠中具有预防或治疗病因学是基于包含CUG、CCUG、CGG、CAG或AAG重复的毒性转录物的存在的疾病的经验证的体内治疗潜能的六肽的化合物，所述疾病诸如，例如：DM1、SCA8、DM2、FXTAS、HD和FA。本发明的化合物的作用机制比现有技术中已知的化合物发挥的作用机制更加有效，这是因为它们能够结合由具有所述重复的毒性片段形成的双链发夹环并将其去结构化，或维持具有扩增的RNA处于单链构象，从而阻止MBNL和任何其他分子的异常结合或掩蔽，MBNL和任何其他分子与CUG发夹环的结合还可导致或加剧病理表型。

更具体地，本发明测定了包含具有式(I)(A-B-C-D-E-F)的肽或其药学上可接受的立体异构体、混合物、盐或模拟肽的化合物。下面，我们限定了可能是式I的位置A至F中的每个位置的一部分的氨基酸，用三字母代码和常规用于表示天然氨基酸的立体异构体的小写代码两者来表示所述氨基酸：

·A可以是氨基酸cys(c)或pro(p)，

·B可以是氨基酸pro(p)或gln(q)，

·C是氨基酸tyr(y)，

·D可以是氨基酸ala(a)或thr(t)，

·E可以是氨基酸gln(q)或trp(w)；和

·F是氨基酸glu(e)。

在优选的实施方案中，为本发明的肽的一部分的氨基酸是D-氨基酸，其不被肠蛋白酶识别且较不易于降解。然而，如实施例中所示，由L-氨基酸构成的肽也是有活性的。

在本发明中，模拟肽应理解为意指特征在于与具有式(I)的肽的序列互补、同源和/或等同的序列的肽有机分子。本发明的化合物还包含具有通式I的肽的有功能的互补、同源和/或等同的序列。在优选的实施方案中，本发明的化合物包含与具有通式I的肽的序列具有至少80%同一性或同源性的同源序列。此外，本发明的化合物可包含为具有式I的肽的化学类似物、衍生的环状肽、二聚体和/或多聚体的肽。

如本发明中所展示的，包含前述肽的化合物可用于预防或治疗病因学是基于包含CUG、CCUG、CGG、CAG或AAG重复的毒性转录物的存在的疾病，所述疾病诸如，例如：DM1、SCA8、DM2、FXTAS、HD和FA。测试了对应于序列SEQ ID NO：1至16的六肽对所述疾病的治疗，且六肽p10(SEQ ID NO：10)是特别优选的，原因是它在前述果蝇模型中在脑和肌肉两者中均逆转了毒性，两种情况下均以剂量依赖性方式。此外，具有包含处于其逆-反（retro-inverse）构型的p10序列的肽的内源表达在模型果蝇的眼和肌肉中逆转了表型，从而证实了p10和其衍生物对CTG重复的毒性的效应。丙氨酸扫描的结果以及转基因果蝇的产生证实，p10序列中的所有氨基酸对于其活性是必需的，且活性在于其残基的侧链。p10在体外结合CUG重复，展开发夹环。这一键合依赖于肽序列，且在重复数目增加时更大。在DM1模型小鼠中肌内注射p10逆转肌肉转录物的剪接缺陷，以及组织学水平的缺陷。这一效应是系统性的，且在单次注射后保持至少4周。

尽管如上所提及的，p10由于是测试的那些化合物中最有效的而成为本发明的优选化合物，但是本发明还证实包括在式I内的其他化合物，诸如，例如，p11、p5、p12和p15，在毒性CUG转录物存在下也展现不同程度的特异性和效力(参见实施例16和图29)。

因此，本发明的第一方面涉及包含具有式I的六肽、或其模拟肽的化合物，所述化合物将用于预防和/或治疗病因学是基于包含CUG、CCUG、CGG、CAG和AAG重复的毒性转录物的存在的疾病，所述疾病诸如，例如：DM1、SCA8、DM2、FXTAS、HD和FA。

本发明的第二方面涉及所述化合物用于制备设计用于预防和/或治疗病因学是基于包含CUG、CCUG、CGG、CAG和AAG重复的毒性转录物的存在的疾病的药物组合物的用途，所述疾病诸如，例如：DM1、SCA8、DM2FXTAS、HD和FA。

本发明中公开的化合物可用作人类患者或动物中的活性成分，且可根据盖伦开发（galenic development）的现有技术中的知识制备成制剂和/或施用。因此，本发明的第三方面涉及包含至少一种本发明的肽联合至少另一种活性成分的药物组合物。该组合物还可伴随活性成分包含至少一种赋形剂作为无活性物质，例如，该赋形剂促进所述活性成分在体内的吸收或促进其活化。

所述赋形剂可以设计为用于保持组合物的粘合成分，诸如，例如：淀粉、糖类或纤维素；填充剂，诸如，例如：植物纤维素、磷酸氢钙、红花；崩解剂；润滑剂，诸如，例如：滑石、硅胶或甾族脂肪；包衣剂；甜味剂；调味剂；着色剂；等等。

所述组合物可通过用于使活性成分到达其治疗靶标的任何施用路径施用，例如，通过消化路径(口服、舌下、胃肠的或直肠的)、胃肠外路径(皮下、肌内、静脉内、动脉内、脊柱内、腹膜内、真皮内或关节内)、呼吸路径或体表路径（topical route）。

本发明的另一方面涉及预防和/或治疗病因学是基于包含CUG、CCUG、CGG、CAG和AAG重复的毒性转录物的存在的疾病的方法，所述疾病诸如，例如：DM1、SCA8、DM2、FXTAS、HD和FA，所述方法包含向患者施用治疗有效量的包含至少一种本发明的六肽的药物组合物。在本发明中，“治疗有效量”应理解为意指能够预防或治疗与病因学是基于包含CUG、CCUG、CGG、CAG和AAG重复的毒性转录物的存在的疾病相关的病理状况的量，所述疾病诸如，例如：DM1、SCA8、DM2和SCA8。

在本发明中，在DM1的果蝇模型中在大于40μM和低于250μM、优选地70.4μM的p10浓度下观察到了阳性结果。

附图描述

图1.-位置扫描策略。

(B)O1、O2…O6代表20种可能的天然氨基酸的D-立体异构体占据的指定位置，X指20种天然氨基酸的D-立体异构体中的19种的等摩尔混合物(半胱氨酸在X中被省去，但是在指定位置中没有省去)。6个位置乘以20种可能的氨基酸得到120种组合，每种组合代表化合物文库中的一个小瓶。

(A)鉴定到阳性小瓶后，我们研究了哪些氨基酸占据了每个小瓶中的指定位置。产生具有指定序列的肽的阳性氨基酸的组合称为解卷积。

实施例1包括对从图1获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图2.-初步筛选和解卷积的结果。

(A)化合物文库的筛选和随后的统计分析揭示了总共28个阳性小瓶(p-值<0.05)，其数字代码显示在每幅图的X-轴。其中，选择示出的10个氨基酸(对应于具有最大活性的小瓶)进行解卷积。O1XXXXX、XO2XXXX、XXO3XXX、XXXO4XX、XXXXO5X和XXXXXO6分别代表在位置1、2、3、4、5和6具有指定氨基酸的小瓶。

(B)解卷积得到12种指定的六肽。

图的Y轴显示了初步筛选中获得的p-值的倒数作为活性量度。

实施例1包括对从图2获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析

图3.-DM的果蝇模型中的p10剂量响应测定。Y轴代表果蝇模型存活率的增加，X轴代表p10浓度(μM)。p10在80和125μM之间最有效地抑制103Y-Gal4/+;UAS-CTG(480)/+果蝇中的致死表型。这一趋势在浓度增加至250μM后丧失。增加的存活率值对应于([处理的出生雌性]-[对照出生雌性]/n)x100。

实施例1包括对从图3获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图4.-野生型个体中p10毒性的研究。

(A、B)该图显示当将DMSO施用于自制食物中具有OrR基因型(野生基因型)的胚胎(A)或L1幼虫(B)时对DMSO的剂量响应行为。Y轴代表成虫数目，X轴代表DMSO的％。

(C)该图证明p10在OrR个体中没有毒性，因为达到蛹和成虫阶段的L1幼虫的数目在任何浓度下都没有与对照不同。每个测定以每个重复50个体进行三个重复(每种浓度共150个体)。Y轴代表个体数目，X轴代表p10浓度(μM)。在每组的三个柱中，左侧柱代表幼虫数目，中间柱代表蛹数目，右侧柱代表成虫数目。

实施例2包括对从图4获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析

图5.-丙氨酸扫描。

该图证明用丙氨酸置换肽p10的任何残基导致活性的损失。将肽施用于食物中的103Y-Gal4+/+;UAS-CTG(480)/+幼虫。Y轴代表雌性数目，X轴代表测定的本发明的六肽：左侧柱对应于对照(0.1%DMSO)，且接下来的柱从左至右对应于p10肽和包含丙氨酸置换的具有以下序列的肽：ppyawa、ppyaae、ppaawe、payawe、apyawe。条显示平均值及其标准误差。*指示p-值<0.05。

实施例3包括对从图5获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图6.-肽p10抑制CTG(480)在间接飞行肌(IFM)中的毒性。

该图从左至右显示正常果蝇(A)、表达CTG(480)的果蝇(B)和用肽p10口服治疗的在Mhc-Gal4控制下表达CTG(480)的果蝇(C)的IFM的1.5-μm横切片。用肽治疗的果蝇具有比用DMSO处理的对照更大的肌肉组（muscular package）。图像是在10x放大率下采集的。

实施例4包括对从图6获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图7.-IFM对肽p10的剂量响应。

用0.12%DMSO(对照)(A)和用不同浓度的肽p10：62.5μM(B)、125μM(C)、250μM(D)和500μM(E)处理的Mhc-Gal4/+;UAS-(CTG)480/+果蝇的IFM的横切片。(F)的Y轴显示相对肌肉区域(μm)。此外，(F)显示获得的结果，其中第一个柱对应于DMSO，接下来的柱从左至右对应于以下p10浓度：62.5μM、125μM、250μM和500μM。在62.5μM和250μM之间，肽p10导致与对照果蝇(F)相比肌肉区域的显著增加，以及纤维损失的降低(A中的箭头)。在500μM，IFM的区域小于对照果蝇中的。图中的条显示平均值及其标准误差。*指示p-值<0.05，***指示p-值<0.0001。

实施例4包括对从图7获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图8.-p10降低果蝇中包含毒性CUG重复的核糖核聚集体（病灶）的数目并从中释放Mbl。

该图显示用p10进行治疗在测试的所有p10浓度(X轴)下显著降低包含CUG重复的核糖核聚集体（病灶）的数目(Y轴)(A)。此外，显示通过免疫荧光(灰色)在用DMSO(0.12%；对照)(B)或p10(250μM)(C)处理的果蝇的IFM中Mbl的检测。口服施用p10导致Mbl细胞内分布的变化，从以聚集体形式分布(见箭头)(B)变为以分散形式分布(C)。核的染色用DAPI进行。*意指p<0.05和**p<0.0005。这些结果显示体内治疗(在果蝇模型中)和口服摄取化合物(p10)后对降低DM1患者特征性的最明显的分子表型中的两个分子表型的高水平效力。

图9.-为在果蝇中的内源表达设计的肽p10的衍生物。

SEQ ID NO：17-19的肽(p17-p19)的序列以降序显示。显示了初始蛋氨酸、三间隔子甘氨酸和肽p10的直接(→)或逆-反(←)序列。

实施例5包括对从图9获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图10.-包含p10的L-氨基酸肽借助Gal4/UAS系统的内源表达抑制CTG(480)引起的眼睛粗糙。

UAS-p18和p19在19°C和21°C下抑制CTG(480)在眼中的毒性，导致比对照果蝇粗糙度降低的表型和更大的眼睛(B、E对比C、F)。增加温度后，这一现象被逆转，UAS-p18和p19变成该重复的效应增强物(25°C；H对比I)。UAS-p18自身在25°C下不产生粗糙的眼睛(G)。图(A)显示野生的眼睛。(D)使用CTG(480)和MBNL1之间的相互作用作为阳性对照。图像(A-F)在扫描电子显微镜下采集。图像(G-I)在放大镜下采集。

实施例5包括对从图10获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析

图11.-共表达(CTG)480和p10序列的不同变体对眼睛表型的抑制的定量。

对GMR-Gal4UAS-CTG(480)/UAS-p19果蝇的背-腹轴中眼睛的长度的定量显示对照果蝇中眼睛大小的显著增加(GMR-Gal4 UAS-CTG(480)/+；p-值<0.05，T-检验)。这一效应在将温度从19°C增加至21°C后更大。Y轴显示相对于无肽对照的眼睛的相对大小，X轴从左至右显示对照柱、19°C下UAS-p19的柱和21°C下UAS-p19的柱。

实施例5包括对从图11获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析

图12.包含p10的L-氨基酸肽借助Gal4/UAS系统在IFM中的内源表达。在Mhc启动子控制下表达CTG(480)(A)或同时表达CTG(480)和p18(B)的果蝇的胸部横切片(1.5μm)。p18的存在导致肌肉大小的增加(C)。图C在Y轴显示肌肉区域，X轴在左侧柱中代表作为阴性对照的UAS-GFP的效应和在右侧柱中代表UAS-p18的效应。

实施例5包括对从图12获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析

图13.-肽p10对CTG(480)毒性的可能作用机制。

p10可能影响重复的表达(A)、使Mbl从RNA发夹环上转移(B)、毒性发夹环的去稳定(C)或作用于重复的下游(D)。然而，如图中和以下的实施例中所示，p10最可能的作用机制是基于毒性发夹环的去稳定(C)。

实施例6包括对从图13获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析

图14.p10的表达对萤光素酶报告蛋白的表达的效应。

与暴露于相同量的DMSO(0.12%)的果蝇相比，用p10处理没有显著影响Gal4/UAS系统诱导的萤光素酶表达。然而，DMSO自身影响转基因的表达。条显示平均值及其标准误差。**指示p-值<0.01。Y轴显示萤光素酶(CPS)，X轴从左至右显示0%DMSO、0.1%DMSO和250μM的p10的效应。

实施例7包括对从图14获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析

图15.-p10对CTG(480)表达的效应。

(A)琼脂糖凝胶显示用0.12%DMSO(对照)(左侧柱)或用不同浓度的p10(第二柱：62.5μM，第三柱：125μM，第四柱：250μM、第五柱：500μM)的Mhc-Gal4/+；UAS-CTG(480)/+果蝇中借助SV40终止子区域的半定量RT-PCR扩增的CUG(480)转录物的表达水平。Rp49基因转录物用作cDNA模板加载对照。用ImageJ程序定量条带的强度未揭示任何情形下的显著改变(α=0.05，T-检验)。

(B).条显示(A)中获得的结果的平均值和标准误差。DMSO(对照)(左侧柱)或以不同浓度施用的p10(第二柱：62.5μM、第三柱：125μM、第四柱：250μM、第五柱：500μM)。

实施例7包括对从图15获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析

图16.-p10与Muscleblind的第一个锌指部分比对。

按照降序，显示了以下：对应于黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）(第一行)、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）(第二行)、原鸡（Gallusgallus）(第三行)、斑马鱼（Danio Rerio）(第四行)和智人（Homo Sapiens）(第五、第六和第七行：三种人类旁系同源物)的Muscleblind的第一个锌指的序列。p10的反向序列(最后一行)与对该蛋白与RNA结合关键的区域比对。保守氨基酸以黑色显示。

实施例8包括对从图16获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图17.-大肠杆菌（E.coli）中MblZF(Mbl锌指)蛋白的获得。

(A)MblZF在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中的表达。A.I.：用IPTG诱导之前；S：细胞裂解物的上清液(可溶级分)；P：细胞裂解物的沉淀(不溶级分)。该蛋白的大部分发现于可溶级分(S)，如箭头所示的。

(B)通过FPLC以咪唑梯度纯化MblZF蛋白的实例。加入级分10至14以获得蛋白贮液(C)。星号*1和*2显示通过质谱测序以确认MblZF身份的条带(*1)。条带*2证明是大肠杆菌50S蛋白，从而排除了其是MblZF降解产物的可能性。

实施例9包括对从图17获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析

图18.-Muscleblind蛋白的锌指的CD(圆二色性)光谱。

(A)人类MBNL1蛋白(2μM)呈现为203nm的显著的峰和220nm的弱峰，这指示MBNL1ZF(第一对锌指)除了小部分的α螺旋形式外不具有二级结构(与B中的模式相比)。MblZF具有相似模式的行为，具有205nm的显著的峰和222nm的弱峰(C)。(D)MblZF在通过分子排阻柱时作为单峰洗脱。与分子量标准的模式相比，洗脱体积符合单体形式的MblZF的大小。

实施例9包括对从图18获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图19.-荧光偏振测定图。

荧光偏振测定由以下组成：用荧光团(在本发明情形下为与羧基荧光素偶联的CUG重复；A)标记小分子，使得当荧光团与具有更大分子量的分子(诸如MblZF蛋白)结合时，其旋转速率被改变(B)。旋转速率的变化可通过用垂直和水平平面的偏振光束激发分子并测量发射荧光的偏振方向来检测。如果小型的分子(p10)能够抑制MblZF和FAM-CUG23(与羧基荧光素荧光团偶联的23个CUG重复)之间的结合，荧光RNA将再次增加其旋转速率，降低其偏振(C)。

实施例10包括对从图19获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图20.-MblZF和p10结合CUG重复。

MblZF导致FAM-CUG23偏振的增加，这通过两种分子之间的结合产生。如果它与未标记的CUG23RNA竞争，则该结合是可逆的(A)，并与MblZF的量成正比(B)。p10也导致FAM-CUG23的偏振的增加(C)。由于该肽的小尺寸，这一增加很小，并且在增加肽的浓度后没有显著改变(D)。p10没有逆转MblZF对FAM-(CUG)23的效应。*指示p-值<0.05(T-检验)。图A和C的Y轴显示相对偏振，图B和D的Y轴显示偏振的增加。

实施例10包括对从图20获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图21.-借助凝胶阻滞测定研究MblZF与FAM-(CUG)23的结合。

MblZF结合FAM-CUG23，导致复合物在孔中的保留。对于固定的蛋白浓度，这在测定的所有RNA浓度下发生(A)。FAM-(CUG)23和MblZF之间的结合是特异性的，原因是其可与未标记的CUG23RNA(FAM-(CUG)23:CUG23比例1:100；图B，泳道3)竞争，并且如果在与FAM-(CUG)23孵育前通过加热使蛋白变性，则不发生竞争(图B，泳道4)。以和MblZF相同浓度使用的胶原α-3蛋白不与RNA结合(图B，泳道5)(*1：通过加热变性的MblZF，*2：与胶原α-3孵育)。MblZF还与更小的RNA(FAM-(CUG)4)结合，形成保留在凝胶孔中的复合物(C)。

实施例10包括对从图21获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图22.-MblZF的组氨酸尾不影响其与FAM-(CUG)23的结合。

(A)显示用TEV蛋白酶消化以消除MblZF蛋白的6组氨酸的凝胶。使消化产物(MblZF^ΔHis)通过Nickel亲和柱以保留组氨酸和消除TEV，因为后者与MblZF^ΔHis具有不同的洗脱(B)。(C)纯化后的结果。(D)MblZF^ΔHis结合FAM-(CUG)23且此结合与蛋白浓度成正比。

实施例10包括对从图22获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图23.-MblZF/FAM-(CUG)23复合物不向阳极迁移。

(A)在所用的电泳条件下，MblZF蛋白几乎没有进入凝胶(银染，图A左侧)。如果蛋白和RNA-蛋白复合物两者均在孔置于中部的水平凝胶上电泳，则仅观察到向阴极迁移的蛋白。如果电泳缓冲液的pH在MblZF的Ip之上增加一个点，则蛋白继续向阴极迁移(B)。MblZF^ΔHis蛋白也不进入凝胶(B)。通过用FA交联固定RNA-蛋白复合物且将其在变性凝胶(其中SDS赋予蛋白负电荷)上分离没有改变MblZF的行为(C)。

实施例10包括对从图23获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图24.-p10结合CUG重复而不改变MblZF。

(A)p10(1mM)可结合FAM-(CUG)23RNA(60nM)。(B)这一结合与肽的量成正比并从~500μM检测。p10(1mM)以较低亲和力结合短型重复(FAM-(CUG)4，60nM)(C)。肽与FAM-(CUG)23的结合不干扰与MblZF蛋白的相互作用(D)，至少在这一测定中不显著干扰。

实施例10包括对从图24获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图25.-肽p10的特异性。

(A)丙氨酸扫描的五种肽(左侧的第一管是对照，且接下来的五个对应于以下肽：ppyawa、ppyaae、ppaawe、payawe和apyawe)(2.5mM)没有一个显著结合FAM-(CUG)23RNA(60nM)，由此证明对p10描述的相互作用是特异的。(B)p10(1mM)可结合双链(ds)和单链(ss)RNA和DNA(60nM)两者。(C)显示(B)中所示的实验中使用的核酸的二级结构的图。

实施例11包括对从图25获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图26.-p10以较高亲和力结合DMPK-CUG4。

(A)p10(5μM)的色氨酸的荧光消光实验。将肽与不同核酸(2.5μM、5μM、7.5μM、10μM和12.5μM)孵育。荧光消光率（fluorescence extinctionrate）(Y轴代表相对荧光)测量为在将351nm处的荧光发射值关于每个浓度点的游离肽表示后获得的直线的斜率。对于每个点进行至少两次测量。在所有情形中，所述消光率对于DMPK-CUG4较大，而对于CAG·CUG4不显著(B)。

实施例11包括对从图26获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图27.-p10降低CUG重复的组装。

MblZF(A，1μM和1.5μM)和p10(B，0.1μM、0.5μM、1μM、10μM和20μM)二者均改变CUG(60)(1μM)的圆二色性(CD)光谱，与蛋白或肽浓度成正比地将RNA的发射峰降低至~265nm。然而，当将RNA与MblZF和p10联合孵育时，无论加入顺序如何，都不能逆转这一效应(C)。这一改变不是由RNA的降解引起的，同时实验继续(D)且在将CUG60与具有序列ppyawa(E，0.5μM和1μM)和payawe(F，1μM)的丙氨酸扫描六肽孵育时也不发生。

实施例12包括对从图27获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图28.-p10打开由CUG重复形成的发夹环。

相对于游离RNA发射的荧光，在MblZF(0.1μM、1μM、2μM和5μM)(A)或p10(0.1μM、1μM、2μM、5μM和100μM)(B)存在下(CUG)23RNA(1μM)中的2-氨基嘌呤发射的荧光(Y轴)的测量，荧光测量为相对荧光单位(RFU)。p10导致100μM下2-AP荧光的2.9-增加，这指示向单链的改变。当将RNA与DMSO、或与具有序列：ppyawa和payawe的丙氨酸扫描肽(C)孵育时未观察到这一效应。

实施例12包括对从图28获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图29.-本发明的几种肽(p10、p11、p5、p12和p15)去结构化或打开CUG重复形成的发夹环的比较测定。

该图说明使用2-氨基嘌呤测定(与上图相同)来测定从组合肽文库的解卷积获得的除p10以外的4种肽(p11、p5、p12和p15)的实验。结果表明对肽获得的活性(表1)和CUG23探针去结构化二级结构并变成单链的能力之间的相关性。所有情形中使用的浓度是100μM(RNA比p10的比例为1:100)，其中p10显示阳性响应(上图)。因此，这一实验证明，虽然p10因为活性最强而是优选的肽，但是表1中的其余肽，特别是p11、p5、p12和p15也呈现可观的特异性和效力水平。

实施例16包括对从图29获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图30.-本发明的肽(特别是p10)结合不同于CUG重复的重复，诸如，例如，AAG、CGG、CCUG和CAG形成的发夹环的测定。

该图说明了测试p10和其结合不同于CUG重复、但是也参与其中已描述了具有重复扩增的RNA的毒性的疾病的重复的能力的实验。使用了色氨酸消光测定，使用(1)不同RNA浓度(5μM、7.5μM和10μM)的p10+AAG、CGG、CCUG和CAG。AAG用作参考重复(对照)，原因是已公开其不形成二级结构。另一方面，(2)显示相同实验，但使用丙氨酸扫描后获得的肽之一(ppyawa)并显示在使用的最高RNA浓度(10μM)下获得的结果。

实施例16包括对从图30获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图31.-组织病理学分析实施例。

FVB小鼠中肌内注射0.2%DMSO(A)或0.5μg的p10(B)产生小面积的粘液水肿，但在两种情形中都几乎没有任何相关的炎症反应。

实施例13包括对从图31获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图32.-p10逆转DM1模型小鼠中的Serca1和Tnnt3剪接缺陷。

肌内注射2%DMSO(-)或10μgp10(+)增加2和4周p/i时Serca1转录物外显子22的包含百分比(B、C和D)和注射后1、2和4周(p/i；A、B和C)胎儿Tnnt3的外显子F的排除百分比。肽p10没有改变FVB或HSA^SR小鼠中这些转录物的加工，并且也没有影响对照Capzb转录物(A-C)。图(A-C)显示进行的25个循环的RT-PCR的结果。水平线以从左到右的顺序连接同一动物的左肢(注射具有2%DMSO的血清)和右肢(注射10μg的肽)。(D)中的条对应于平均值及其标准误差。p-值使用T-检验确定。

实施例14包括对从图32获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图33.-p10对Serca1可变剪接的系统效应。

10μgp10注射4周后FVB和HSA^SR小鼠中外显子22(Y轴)的包含百分比是100%。这一值在两条腿都注射2%DMSO的HSA^LR动物中是16.8%±10.5。在处理的HSA^LR动物中，包含百分比显示在注射p10的腿中是55.1%±4.9，在同一动物的左腿(注射具有2%DMSO的血清)中是31.5%±9.8。

实施例14包括对从图33获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

图34.-p10减少具有中央核的肌肉细胞的数目。

用苏木精伊红染色的胫骨前肌的冷冻切片显示HSA^LR动物中中央核的存在(A)，而它们在FVB动物中被置于细胞的外周(C)。p10显著降低注射0.5μg和10μg经过4周后HSA^LR小鼠中具有中央核的纤维的百分比(B和D)。(1)指示对照为注射0.2%DMSO的动物。(2)指示对照为注射2%DMSO的动物。

实施例15包括对从图34获得的结论的详细解释，以及对其更深入的分析。

下面我们显示了本发明中进行的实施例以说明所实现的结果，所述实施例不意图限制本发明的范围。

图35.-p10在DM1模型小鼠中肌肉水平的组织学缺陷。

该图代表在疾病的小鼠模型中进行的实验，其中检测了骨骼肌切片中Clcn-1蛋白的定位。Clcn-1是具有DM1的患者的肌肉组织中在剪接水平发生改变的基因之一(A)。观察到施用p10导致在膜水平蛋白恢复到正常水平(B)。肌内注射p10在小鼠的后肢在肌肉水平进行。这一结果扩大了在体内DM1模型中用p10进行治疗以改善在该人类病理学中以异常模式表现的细胞和功能方面的能力(已在图32-34中观察到)。

实施例

实施例1.组合六肽化合物文库的筛选

每个化合物文库小瓶包括在指定位置共有单个氨基酸而在其余位置不同的250万种肽的混合物(图1A)。因此，由可占据6个位置的20种氨基酸定义的6个位置的组合导致构成化合物文库的120个小瓶，加在一起总共5000万种不同的序列。位置扫描组合化合物文库的使用是基于以下原理：与其他位置独立地测定分子的每个位置，使得可以为六肽的六个位置中的每一个位置定义最佳候选氨基酸。因此，通过读取筛选结果，获得了每个位置的活性最强的氨基酸。随后，基于它们的组合，合成了具有确定序列的肽(这称为解卷积)(图1B)，并再次测定这些分子。

以80μM的浓度对由处于103Y-Gal4控制下480CTG表达导致的蛹中的致死表型测定构成化合物文库的120个小瓶。结果的统计分析揭示总共28个阳性小瓶(p<0.05；占全部的23.3%)，其中的每一个代表特定位置的活性氨基酸。因此，对于六肽的位置O1、O2、O3、O4、O5和O6，分别获得了总共六、三、六、四、二和七种活性氨基酸(图2A)。为了进行解卷积，基于生物测定中的活性程度选择这28种氨基酸中的10种(图2A)。最后，在可能的组合中，选择16种序列来进行定义的六肽的合成(图2B)。这16种肽的选择是基于相似位置的活性氨基酸的物理和化学性质之间的冗余性标准。

测定在最高可能浓度下作为溶解它们的DMSO的百分比的函数的16种定义的六肽。与80μM的DMSO浓度的对照相比，p10显示出生的雌性数目的显著增加。表1指示本发明的肽的活性。*指示p-值<0.05。指示对照管和处理管中均没有雌性出生。

表1

为了证实p10的效应，将p10在以下浓度下进行剂量响应测定：20μM、40μM、80μM、125μM、250μM(图3)。p10在20μM和40μM未显示任何活性，而活性在80μM(导致雌性数目为对照的1.43倍)和125μM(雌性数目为对照的1.47倍)增加。借助非线性检验的数据分析揭示对于这一表型，p10的半有效剂量(ED50)是70.4μM。在250μM下，肽的活性降低，可能是用于较高浓度下肽的毒性效应。

实施例2.p10的毒性研究

为了分析p10的毒性，在自制营养培养基中研究了其对具有野生型基因型(OrR)的果蝇的效应。由于未知果蝇在此食物中可耐受的DMSO的最大值，所以进行了第一个实验，该实验由使个体从胚胎期或从L1幼虫期经受增加浓度的该溶剂组成。自制食物中对DMSO的耐受性显示为对来来自供应商Sigma的即用营养培养基确定的耐受性的3-4倍大的量级(0.3-0.4%对比0.1%，图4)。对于从胚胎期用DMSO处理的个体获得的存活结果显示非常高的变异性(图4A)，很可能是由于选择的胚胎中未受精的卵的存在。从幼虫期处理的个体显示均一性大得多的行为(图4B)。因此，决定以增加浓度的p10饲喂L1幼虫并计数到达蛹和成虫期的个体。p10在所测定的任何浓度下在任何阶段中都不具有毒性(67.5μM、125μM、250μM、500μM和1mM；n：每种情形下为150个；图4C)；因此，图3中显示的情形可能是基因型依赖性的毒性效应。

实施例3.肽序列中每种氨基酸的相关性研究

为了确定每个p10残基对于其对CTG(480)的活性的贡献，进行了丙氨酸扫描实验。这些实验是基于将肽的每个氨基酸置换为丙氨酸并保持其他氨基酸不变。丙氨酸是小氨基酸，且一般而言活性不是很强；这也是为什么使用丙氨酸进行这种类型的研究的原因。因为每个丙氨酸置换检查了个体氨基酸的贡献，所以另一方面这一实验使得(在置换增加分子效力的事件中)评估p10是否对优化敏感、或(在置换降低其活性的事件中)确定哪个氨基酸对于其功能是重要的成为可能。p10的序列允许5次置换；为此，合成了5种新的六肽，对其就103Y-Gal4；UAS-CTG(480)/+果蝇和商购食物中的致死表型进行测定。它们均显示比原始分子更低的活性，这指示p10序列中的所有氨基酸对于该肽在此功能测定中的最终活性是必需的(图5)。

实施例4.在其他组织中验证p10的活性。p10改善了CTG(480)在间 接飞行肌中引起的组织学缺陷

因为DM1特征性的主要症状影响肌肉，所以决定研究p10对模型果蝇中的这一组织的效应。处于肌球蛋白重链启动子(Mhc-Gal4系)控制下的CTG(480)表达导致间接飞行肌(IFM)中组织学水平的缺陷，包括肌肉纤维的损失和进行性变性。这些缺陷影响组织的功能，阻止果蝇飞行。使用Benzer开发的落入圆筒（falling into the cylinder）的方法(Benzer，1973)在自制营养培养基中关于不能飞行表型对肽p10进行测定。与用DMSO的对照(n：55)相比，未观察到果蝇飞行能力的改变(测定浓度：62.5μM和125μM；n：分别为117和77)。然而，3-4日龄的模型果蝇胸部的横切片的显微镜分析揭示在组织学水平肌肉的改善(图6)。因为果蝇的飞行能力对于IFM肌节的结构和代谢变化非常敏感，所以后者可能是观察到的组织学改善没有产生功能改善的原因。

为了证实这一观察以及定量所观察到的效应，在以下浓度下对p10进行剂量效应测定：62.5μM、125μM、250μM和500μM，并在10日龄果蝇中进行半薄组织学切片(图7A-E)。对处理的果蝇中肌肉区域的定量揭示显著的剂量依赖性改善(图7F)。这些结果还证明p10的效应独立于组织特异性因素，因为p10在脑和肌肉二者中都有活性。然而，在500μM下，肌肉显示降低的大小和果蝇的存活力下降。

实施例5.包含p10的L-氨基酸肽的内源表达抑制CTG重复引起的表 型

p10的施用抑制CTG(480)引起的至少部分表型。因为在本发明初步进行的实验中p10是添加到食物中的，难以确定有多少分子最终到达细胞。为了能够精确控制p10的施用和确保与CUG(480)转录物在相同的时间存在于相同的组织，使用Gal4/UAS系统产生能够以内源和受控方式表达p10的转基因果蝇。

因此，用SEQ ID NO：17-19(p17-p19)设计了三种不同的转基因，它们编码不同的肽，全部基于对应于p10的序列SEQ ID NO：10(图9)，考虑果蝇中的密码子使用偏好(即在同义位点偏爱使用G且特别是C；Powell&Moriyama，1997)和向序列SEQ ID NO：10添加初始的蛋氨酸以及三个间隔甘氨酸。此外，在ATC起始密码子上游添加包括Kozak序列的果蝇act5C基因5’UTR端的21个核苷酸以增强转基因的表达。

p17含有SEQ ID NO：10的肽的直接序列。如以上所讨论的，六肽化合物文库中的肽包括D-氨基酸。氨基酸的D-形式(右旋物)是L-形式(左旋物)的立体异构体和并且在细胞中仅有L-氨基酸合成和掺入蛋白。因此，如果p10的侧链布置对其功能是重要的，那么当由果蝇从L-aa合成p17时，功能将丢失。为此，决定产生构建体p18，其中SEQ ID NO：10的肽序列被倒置，产生逆-反肽(Chorev&Goodman，1995；P.M.Fischer，2003)。同时，在产生这些转基因时，文献中描述的最小构建体编码具有多于20个氨基酸的肽，这比肽p17和p18(其仅具有十个氨基酸)的大小的两倍更大。为此，产生了p19，其组合了肽p17和p18的构建体，产生具有19个氨基酸的肽。将这三种构建体显微注射到果蝇胚胎种系的前体中，得到每个转基因10个转基因果蝇系。

将获得的转基因果蝇与本发明过程中产生的GMR-Gal4UAS-CTG(480)/CyO和Mhc-Gal4 UAS-CTG(480)/TM6b重组果蝇系杂交，其分别指导CTG重复在眼睛和肌肉中的表达。与sev-Gal4UAS-CTG(480)/+果蝇的情形相同，成体GMR-Gal4UAS-CTG(480)/UAS-GFP果蝇呈现强烈的粗糙眼睛表型。CTG(480)和p18或p19(但不是p17)在19°C和21°C的共表达导致果蝇具有比对照个体的那些粗糙明显降低的眼睛(图11；图10B-C和E-F)。这些结果证实含有逆-反布置的p10序列的L-氨基酸肽能够抑制重复触发的表型，并且表明尽管肽p18和p19的短尺寸，它们被翻译并具有活性，因为其表达改变了CTG(480)的毒性。然而，在25°C和在29°C发生了相反的现象。在25°C，p18或p19的内源表达增强了CTG重复的毒性，产生尺寸更小的眼睛，具有色素沉着丧失和小眼的异常融合(图10H-I)。在29°C，GMR-Gal4UAS-CTG(480)/CyO和UAS-p18或UAS-p19果蝇之间的杂交没有产生不具有CyO平衡器的后代，这指示p10降低GMR-Gal4 UAS-CTG(480)个体在所述温度下的存活力。值得注意的是p18和p19本身在25°C和29°C的表达不产生任何表型(图10G)。鉴于温度的变化以不同方式影响CTG(480)转基因和肽p17-p19的表达，因为后者插入基因组的不同区域，所以肽的量和必须达到的重复的量之间可能存在关联，然后p10变得有毒性。

显著地，测定的所有携带p18转基因(UAS-p18)的系(即5种)和三个携带p19转基因(UAS-p19)的系中的一个改变了GMR-Gal4UAS-CTG(480)果蝇的表型，而测定的构建体p17(UAS-p17)的五个系中没有一个做到。这指示p10氨基酸侧链的方向在其活性中起关键作用。

Mhc-Gal4系中CTG(480)和p18或p19在25°C的共表达还抑制新孵化的成虫中IFM的组织学缺陷，增加了肌肉组的大小(图12)。这证实了p10对CTG(480)的效应。再次地，仅有那些携带p18和p19转基因的系改变了表型。

实施例6.p10作用机制的研究

体内获得的结果证明了p10对CTG重复的毒性的效应。此外，图13显示概括p10如何可以发挥其对细胞的效应的几种假设。在第一方面，p10可能通过干扰Gal4/UAS系统或降低毒性RNA的稳定性影响CUG(480)转录物的水平(图13A)。另一方面，p10可能结合CUG重复，由此释放掩蔽的核因子，诸如Mbl。这样，所述蛋白能够再次执行其正常功能(图13B)。p10还可能结合CUG重复，防止这些折叠形成毒性双链发夹环(图13C)。最后，p10可能作用于位于重复引起的改变的下游的其他蛋白或转录物，抑制例如Mbl的拮抗剂并因此补偿这些蛋白的功能缺失(图13D)。

为了研究提出的每种假设，决定在分子水平和体外进行大量实验，下文详细解释了这些实验。

实施例7.p10不影响CTG(480)的表达水平

为了研究p10是否影响CTG(480)的表达，使用了两种不同的策略。在第一方面，向Mhc-Gal4/+;UAS-萤光素酶/+果蝇饲喂自制营养培养基中250μM的肽。p10导致光发射水平的略微降低。然而，这一差异相对于用DMSO的对照并不显著(α=0.05，T-检验；图14)，这证明该肽不以非特异性方式影响Gal4/UAS系统。然而，对照果蝇的DMSO自身在食物中的存在导致萤光素酶蛋白水平的增加。这些结果表明，溶剂可能影响该转基因的表达，可能是由于描述为抑制位置依赖性上色的效应。

在第二方面，借助RT-PCR确定了p10是否特异地影响CUG(480)转录物的水平，从用不同浓度的p10饲喂Mhc-Gal4/+;UAS-CTG/+果蝇开始。定量PCR反应中获得的条带的强度之后，未在任何浓度检测到CUG(480)水平的显著差异(图15)，这证明p10不影响转录物的量。

实施例8p10和Mbl之间的序列相似性研究

借助生物计算机分析，使用MEGA序列比较程序(www.megasoftware.net)，发现p10的氨基酸与Muscleblind蛋白的第一锌指的保守序列的反向部分比对，第一锌指是该蛋白借以结合RNA的结构域(图16)。在这一比对中，p10的色氨酸与Mbl的苯丙氨酸(一种也是芳香、非极性和疏水的氨基酸)位置一致，其介导该蛋白与CUG重复的结合。鉴于此相似性，决定研究该肽对Mbl与毒性RNA结合的效应。

实施例9.Mbl锌指的表达和纯化

为了验证该肽是否能够与Mbl竞争结合重复，决定进行RNA和蛋白之间的体外结合测定。为了进行此类实验，必须表达和纯化Mbl蛋白。出于多种原因，仅使用了对应于Mbl的锌指的部分(MblZF，氨基酸1-98)。在第一方面，果蝇中存在7种不同的Mbl同种型。除了MblD同种型以外，它们全部共有含有两个锌指(Nt端)的区域并在Ct序列上不同。另一方面，MBNL1和Mbl的锌指均足以结合其靶序列。

在衍生载体中克隆pET-15b商购载体期间，将MblZF蛋白与6组氨酸融合以便于其纯化，以及与TEV(Tobacco Etch Virus，烟草蚀纹病毒)蛋白酶裂解位点融合。为了发现MblZF在大肠杆菌（E.coli）中表达的最优条件，测定了不同因素的组合。在第一方面，我们从三种不同的细菌菌株起始。菌株BL21(DE3)是为基于T7噬菌体启动子的表达设计的菌株。该菌株足以表达非毒性重组蛋白。如果待表达的蛋白有毒性，大肠杆菌BL21pLys(DE3)菌株具有组成型表达低水平T7溶菌酶的优点，T7溶菌酶通过抑制T7 RNA聚合酶的水平降低重组基因的基线表达。最后，菌株BL21pLys(DE3)Codon+含有编码用于人类密码子的tRNA而细菌中的水平非常低的基因。在第二方面，锌指结构域是在其半胱氨酸和组氨酸残基之间结合锌离子的一个原子的核酸结合结构域。锌金属对于此类结构域的稳定性是关键的，因为在不存在锌金属时，锌指展开并失去结合其靶标的能力。为此，在贯穿MblZF蛋白的表达使用的所有培养基中测定了两种不同浓度的ZnCl₂(50μM和100μM)。此外，具有锌指的蛋白往往是非常难溶且不稳定的分子。为此，我们测定两种不同的诱导温度，30°C和16°C。在测试的所有组合中，我们在使用菌株BL21(DE3)、50μM浓度ZnCl₂和16°C的诱导温度以及1mM IPTG时成功获得了高比例的可溶MblZF(图17A)。

通过亲和层析在FPLC系统中进行纯化过程，贯穿纯化过程保持培养基中锌的存在。蛋白的洗脱峰发生在大约300mM咪唑处(图17B)。获得的总蛋白浓度是2.73mg/ml(198μM；图17C)，这意味着1.4mg蛋白/l培养基的收率。在随后的纯化循环中，该值未以显著方式改变。

为了验证纯化的蛋白在纯化后处于其天然构象，分析了其圆二色性(CD)光谱。圆二色性是基于分子对右和左圆偏振光束的差异吸收的电子吸收光谱技术。因为不同的蛋白具有不同的圆二色性光谱，该技术使得能够通过与理论光谱进行比较来鉴定不同分子的构象(图18B)。在磷酸缓冲液中获得的MblZF圆二色性光谱与对于MBNL1的锌指所描述的光谱相似，具有203nm的显著峰，这表示缺乏结构，和220nm的弱峰，这指示α螺旋(图18A)。在MblZF的情形下，这一模式是保守的，尽管值略微向右改变(图18C)。最后，为了确定MblZF是作为在溶液中的单体发现还是形成复合物，我们进行了分子排阻层析(图18D)。分子排阻层析是分子按其分子量的函数分离的柱层析方法。获得的MblZF排阻体积对应于13.4KDa的分子量，等于单体形式的蛋白大小。层析图揭示单一洗脱峰，这证明MblZF在溶液中没有与自身形成复合物，至少在测定条件下如此。

实施例10.在体外p10结合CUG重复但不与MblZF竞争

在体外研究蛋白和核酸之间的相互作用的不同技术中，荧光偏振(FP)测定由于其快速性和灵敏性而是突出的。该技术基于悬浮液中荧光分子的旋转运动的变化。因此，当偏振光束激发与小分子偶联的荧光团时，后者经历比光的发射所需的时间更快的旋转扩散，这造成分子在荧光发射时的随机排列(解偏振)。然而，当介质的粘度或分子体积变化时，分子的旋转变得更慢，增加了发射光的偏振。因此，通过测量分子的偏振变化，可以检测后者和添加到介质中的另一分子之间的结合(图19)。在本发明中，这些分子是p10、MblZF和与羧基荧光素荧光团偶联的23CUG重复(FAM-(CUG)23)。

为了准备FP实验，第一方面测定了FAM-(CUG)23RNA的两种不同浓度(6nM和60nM)。在两种情形中，检测RNA并观察到加入MblZF后荧光偏振值的显著增加(p-值<0.0001)，这指示发生了结合。为了减少探针和蛋白的使用，决定在6nM FAM-(CUG)23浓度进行。观察到的MblZF和FAM-(CUG)23之间的相互作用与蛋白的量成正比(图20B)。结合曲线的统计分析得到900nM的理论IC50。为了核实此结合的特异性，进行了与未标记的RNA(CUG)23(相对于FAM-(CUG)23为1:10、1:100和1:200)的竞争研究。在所有情形中，观察到在测定的所有未标记的探针浓度下的竞争(图20A)。p10还导致FAM-(CUG)23的偏振的略微增加(p-值：0.0176；图20D)。然而，加入增加量的p10没有产生结合曲线，可能是由于p10的小尺寸(图20D)。p10和MblZF向FAM-(CUG)23的共加入导致比单独加入MblZ所导致的RNA偏振的更大增加(p-值：0.0158；图20C)。该结果指示两种分子均可结合RNA而不干扰另一个的结合。然而，共加入MblZF和p10后偏振值的增加低于两者单独导致的增加之和(ΔmP(Mbl)：99.5；ΔmP(p88)：21.75；ΔmP(Mbl+p88)：108.25)，这不排除部分竞争的存在。

FP测定中p10引起的RNA变化很小，可能是由于该分子的低分子量(低于900Da)。为此，决定用凝胶阻滞实验来补充该研究。这些测定是基于稳定的蛋白-核酸复合物和它们的单独组分之间电泳迁移率的差异。因为FAM-(CUG)23RNA是可用的，决定制备荧光凝胶阻滞测定。确定检测的RNA的最优量之后(60nM；图21A)，研究了后者和MblZF之间的结合。所述结合引起凝胶中对应于游离RNA的条带强度的降低和凝胶孔内部信号的出现(结合的RNA)。然而，没有观察到凝胶中的阻滞条带，这指示所有结合后形成的复合物保留在孔中。当结合与未标记的(CUG)23探针(1:100)竞争时，孔内部的信号降低，这证明相互作用的特异性。此外，当将荧光RNA与热变性的MblZF蛋白孵育时，未发生结合，当在FAM-(CUG)23和与MblZF浓度相同的不同的蛋白(胶原α3)之间进行反应时也没发生，再次证实结合的特异性(图21B)。

为了排除FAM-(CUG)23可能结合MblZF的6-组氨酸标签的可能性，借助用TEV蛋白酶消化除去6-组氨酸标签(图22A-C)。没有组氨酸的MblZF蛋白(MblZF^ΔHis)保持RNA-结合能力(图22D)。

MblZF和FAM-(CUG)23之间形成的复合物在孔中的保留可能是由RNA和蛋白之间形成大型聚集体引起的。为了降低所述复合物的大小，我们使用了具有4CUG重复的RNA(FAM-(CUG)4)。MBNL1的锌指可结合最低由4个三联体形成的CUG重复，条件是通过向序列的中部加入4个非互补核苷酸来促进环的形成。如图21C所示，MblZF结合FAM-(CUG)4，但形成的复合物同样保留在孔中。

MblZF的等电点(Ip)是9.5。我们的测定中使用的电泳缓冲液的pH是8.5，这意味着凝胶中MblZF的总电荷是正的。阻滞凝胶是非变性凝胶；因此，介质中不存在向分子赋予负电荷以使其向阳极迁移的SDS。一般而言，这在凝胶阻滞测定中通常不是缺点，因为RNA具有负电荷并能够在电泳过程中拖曳复合物。然而，决定通过使复合物在孔置于中央的水平2.5%琼脂糖凝胶中电泳并用考马斯染色来验证FAM-(CUG)23是否能够移动MblZF(图23A)。在该实验中，MblZF蛋白单独向负极迁移，与蛋白分子量标准的方向相反。当将MblZF与FAM-CUG(23)孵育时，向负极迁移的蛋白(可能未结合的蛋白)的量降低，但是朝向凝胶阳极侧仍然没有出现信号，甚至当在大于MblZF的Ip的pH 10.5进行电泳时也如此(图23B)。

为了赋予必需的负电荷，通过用甲醛(FA)交联固定FAM-(CUG)23-MblZF复合物，并在聚丙烯酰胺凝胶中在变性条件下对反应进行电泳(在SDS存在下；图23C)，或可选地，通过加入Serva Blue G，其赋予蛋白电荷而不将蛋白变性。在任何情形下，都没有复合物穿透到凝胶内部。

为了确定p10是否可以结合CUG RNA分子，决定在肽和FAM-(CUG)23之间进行相似的凝胶阻滞实验。p10结合RNA，部分复合物保留在孔中，如对于MblZF所描述的。然而，在这一情形中，在凝胶内部观察到阻滞条带(图24A)。p10在高肽浓度(500μM和更高，图24B)下结合FAM-(CUG)23，这指示两种分子之间的低亲和力，至少在测定条件下如此。减小重复的大小后该亲和力降低(FAM-(CUG)4，图24C)。为了确定p10是否可以与MblZF竞争结合RNA，将两者都在FAM-(CUG)23存在下孵育。p10不阻止MblZF的结合，因为在这一情形中所有RNA都保留在孔中(图24D)。这可能是由于蛋白和肽之间的协同效应或，如果两者结合不同的RNA位点，由于加成效应。

实施例11.p10以比其他序列更高的亲和力结合CUG重复

为了研究在p10和CUG重复之间观察到的结合的特异性，进行了两个实验。在第一方面，测定了丙氨酸扫描过程中产生的五种六肽。其中没有一个显著结合FAM-(CUG)23(图25A)，这证明所有p10残基对于与RNA的相互作用是必需的。有意思的是，这些肽没有抑制CTG(480)转基因在果蝇中的毒性，这指示p10结合CUG重复的能力是其体内活性必需的。在第二方面，我们研究了p10对双链的和单链的、用羧基荧光素(FAM)荧光标记的其他RNA和DNA序列的作用(图25C)。所述分子包括：(1)来自DMPK基因的3’UTR区域的由19nt构成的单链RNA(ssRNA)，(2)与DMPK的单链序列融合的由4CUG重复构成的RNA(ds+ssRNA)，(3)能够形成完美双链发夹环的包括4CAG·CUG重复的RNA(dsRNA)，(4)由4CTG重复构成的DNA(dsDNA)和(5)对应于DMPK基因的3’UTR区域的相同19nt的DNA。p10在所有情形中均结合(图25B)。此外，具有序列(GUC)4(人类MBNL1蛋白的锌指不与其结合)的未标记的突变的RNA和tRNA改变p10和FAM-(CTG)23之间的结合。总之，这些数据表明p10与RNA的结合是序列特异性的(因为其他六肽显示不同的行为)，并且该肽可以结合不止一种类型的核酸。

然而，p10以不同的亲和力结合所研究的每个序列是可能的。由于凝胶阻滞实验中检测的肽-RNA和肽-DNA复合物保留在孔中，所以无法确定每种相互作用的解离常数(K_d)。为了定量p10和所述核酸之间的结合以及在所有情形中排除肽结合羧基荧光素的可能性，决定准备p10序列中存在的色氨酸的固有荧光消光实验。色氨酸具有在280nm波长的最大吸收和在300和350nm之间的最大发射峰(取决于溶剂极性)。当包含该残基的蛋白的构象被例如结合另一分子改变时，该残基的荧光也改变。因此，将增加量的DMPK-CUG4、DMPK和CAG·CUG4RNA分子、以及CTG4和DMPK DNA与固定量的p10(5μM)孵育，并在351nm测量肽的荧光发射的变化。在所有情形中，信号与介质中加入的RNA或DNA的量成正比地下降，这证实了先前观察到的结合。然而，每种浓度点发射的荧光相对于游离肽的荧光的直线表示导致具有不同斜率的直线，这指示对于不同的核酸荧光消光率(且因此结合亲和力)是不同的(图26)。DMPK-CUG4分子(-0.034±0.003)的曲线斜率显著大于CTG4(-0.019±0.005)和DMPK(RNA：-0.024±0.003和DNA：-0.028±0.002)的曲线斜率(p-值<0.01)。然而，对于CAG·CUG RNA(-0.028±0.003)，这一差异不是统计学显著的(p-值>0.1；图26B)。DMPK-CUG4分子含有在DMPK环境中的CUG重复。总之，这表明肽的部分上存在靶标结合选择性；因此，其在体内优选地结合毒性RNA是可能的。

实施例12.p10引起CUG重复的构象改变

为了研究p10诱导的RNA二级结构的可能变化，第一方面我们使用具有未标记的CUG重复(CUG60)的RNA进行了圆二色性(CD)实验。核酸的圆二色性由构成其序列的碱基的堆叠引起。因此，当分子结合RNA时，影响其结构，因此在其CD光谱中检测到变化。将CUG60RNA(1μM)与MblZF蛋白(1μM和1.5μM)孵育降低了后者发射的信号强度，虽然它没有改变光谱中的峰波长(图27A)，这指示MblZF的结合影响RNA碱基的组装。当我们将RNA与增加浓度的SEQ ID NO：10的肽(0.1μM、0.5μM、1μM、10μM和20μM)孵育时，观察到相似的效应(图27B)。在读数期间，将RNA保持在10°C的二色仪（dichrograph）内部的比色杯中。在每个实验的3个小时期间，RNA可能已被降解；这可能解释了观察到的信号强度的降低。为了排除这一可能性，在0和3h时间测量了CUG60 RNA的CD光谱，并在所有时间下将CUG60 RNA保持在10°C。3小时时，CUG60的光谱未显示相对于0时获得的光谱的任何变化，这证明观察到的效应是特异性的(图27D)。此外，丙氨酸扫描肽p29.1(0.5μM和1μM)和p29.4(1μM)没有改变RNA光谱(图27E和27F)，由此证实结合特异性。最后，当将MblZF(0.5μM)添加到RNA，然后添加p10(0.5μM)时，或反之亦然，没有观察到CD信号的增加，这表明它们中的一个在RNA中产生的变化不是被另一个的随后加入可逆转的。

这些结果证明p10降低RNA碱基的堆叠，并因此影响该分子的二级构象。为了证实所述变化是否导致发夹环结构的丧失，使用包括23CUG重复的RNA进行了实验，其中鸟嘌呤已被置换为其类似物2-氨基嘌呤(2-AP-(CUG)23)。当2-AP处于单链环境时，其发射375nm的荧光。然而，当该分子形成双螺旋的一部分时，所述发射被显著熄灭。在CD和Trp-FQ实验中已检测到结合的低浓度MblZF和p10下(RNA:蛋白≤1:5)，它们没有一个引起2-AP的荧光变化(图28A-B)。然而，在将p10的浓度增加至100μM(RNA:肽1:100)后，2AP-(CUG)23RNA经历构象变化，从双链变成单链，该分子的荧光发射具有2.9-倍增加(图28B)。为了证实这一效应的特异性，进行相同的实验，将丙氨酸扫描肽(payawe和ppyawa)以与p10相同的浓度(100μM)与2-AP-(CUG)23RNA孵育。这些肽没有一个引起荧光发射的改变；DMSO本身也没有(图28C)。因此，这些结果表明p10能够使CUG重复形成的双链去稳定化，并证实MblZF和肽以不同的方式结合RNA。

实施例13.在DM1小鼠模型中验证p10的效应。p10在哺乳动物中的毒 性研究

为了研究p10在哺乳动物中可能的毒性效应并为随后的测定建立最大耐受剂量，将该肽施用给来自FVB野生型株系的小鼠。由于肠壁对肽的低吸收，决定在4-5周龄动物的胫骨前肌中进行肌内注射，使用四种不同的剂量(0.5μg、1μg、10μg和100μg)，每种剂量共6只小鼠(3只雌性和3只雄性)。注射后4周，处死动物并进行目测尸检，联合进行肌肉的组织形态学研究和血液测试(图31)。作为对照，使用注射相同量的DMSO(对于0.5-μg和1-μg剂量为0.2%，对于10-μg和100-μg剂量为2%)的动物。

处理动物的目测尸检和肌肉的组织学分析未揭示相对于DMSO对照的显著差异。在一些情形中，观察到轻微的粘液水肿(液体积累)迹象，并且偶尔观察到轻度炎症，可能是由注射本身引起的(图31)。然而，血液测试确实显示处理动物和对照之间的差异。我们测量了作为肾活性的标志物的血液中胆酸、尿素和肌酸酐的量。肌酸磷酸激酶(CPK)用作骨骼肌和心脏损失标志物，碱性磷酸酶(AP)、γ-谷氨酰基转肽酶(GGT)和谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)用作肝损失标志物。所有动物(包括对照)显示相对于标准值的高尿素和AP值。此外，经受2%DMSO的对照动物显示异常高的GPT和CPK值。这可能是由于DMSO的毒性或由于注射本身造成的。然而，10-μg和100-μg剂量甚至显示比对照更高的血液尿素和GPT值。尿素是蛋白代谢的最终结果。其在肝中形成并在尿中消除。如果肾不能正确行使功能，尿素在血液中积累。GPT是在肝中以高浓度存在而在肾、心脏和肌肉中以较低浓度存在的酶。当这些器官中存在损伤时，该酶被释放到血液中并在测试中显示是高的。此外，值得注意的是用100-μg剂量处理的小鼠中有两只小鼠在注射后(p/i)大约11天死亡，这证实了当p10超出阈值后的毒性。可以在这两只动物临死前从其中一只抽血。该小鼠呈现极高的血液尿素、肌酸酐、CPK和GGT值(例如，CPK值为标准值上限的28倍大并且为DMSO对照的15倍大)。

实施例14.p10逆转HSA ^LR 小鼠中Serca1和Tnnt3转录物的剪接缺陷

p10抑制CTG(480)在果蝇CNS、肌肉和眼睛中的效应并在体外结合CUG重复。为了验证这些结果在DM1哺乳动物模型中的相关性，决定在HSA^LR小鼠中测定p10。这些小鼠在异源转录物人类骨骼肌动蛋白(HSA)中表达250CUG重复并再现DM1的大多数症状，包括转录物可变剪接的缺陷。患者和HSA^LR小鼠二者中剪接改变的最明显的实例之一是Ca⁺²-依赖性ATP酶Serca1转录物的外显子22的剪接改变。在健康群体中，所述外显子在胎儿形式中被排除并包括在成体中。然而，在患者和HSA^LR小鼠二者中，外显子22在整个生命中被排除，并因此在成年个体中维持胎儿模式。Tnnt3蛋白发现于骨骼肌中快速抽搐的肌肉纤维的肌节中。其转录物经历所谓的胎儿外显子F的可变剪接。在健康群体中，所述外显子在成年个体中是不存在的，而在DM1患者和HSA^LR小鼠中，胎儿外显子被维持。

为了确定p10是否可以逆转HSA^LR小鼠中Serca1和Tnnt3的剪接缺陷，施用该肽的两个剂量的肌内注射：0.5μg和10μg。注射后1周、2周和4周处死处理的动物，并解剖右腿(注射p10)和左腿(对于0.5-μg剂量，注射于盐水血清中的0.2%DMSO，对于10-μg剂量，注射于盐水血清中的2%DMSO)二者的胫骨前肌。作为对照，我们使用在两条腿中以相似方式注射的FVB动物和HSA^SR动物(其表达人类骨骼肌动蛋白转录物中的5CUG重复)以及在两个肢体中注射具有DMSO的血清的HSA^LR小鼠。

用0.5μg处理的动物的Serca1和Tnnt3转录物的RT-PCR分析分别未揭示在测定的任何时间外显子22和胎儿F的包括的显著变化(凝胶未显示)。然而，在5只注射10μg的动物中的两只动物中，p10逆转了两种情形下的剪接缺陷(图32A-C)。鉴于对Tnnt3转录物获得的复杂条带模式，我们无法精确定量p10诱导的胎儿外显子F的排除百分比的增加。在Serca1的情形下，p10使外显子22的包含百分比增加1.3%(1周p/i，p-值>0.05)、25.9%(2周p/i，p-值<0.05)和38.3%(4周p/i，p-值<0.01)(图R40D)。最后，p10没有影响Capzb基因的肌肉转录物的剪接，该转录物因为其加工在模型HSA^LR小鼠中不改变而用作特异性对照(图32A-C)。

对4周p/i时同一动物右腿(注射p10)和左腿(注射血清和2%DMSO)中Serca1转录物的加工的分析揭示，在未处理的肢体中，外显子22的包含百分比大于两条腿中注射DMSO的HSA^LR动物显示的百分比(图33)。这指示通过血液到达左侧肢体的胫骨前肌的p10的量足以以系统方式部分逆转剪接缺陷。

实施例15.p10逆转HSA ^LR 小鼠的肌肉中的组织学缺陷

DM1和HSA^LR动物的主要组织学水平特征是肌肉纤维中存在中央核。在这些动物的胫骨前肌中注射0.5μg和10μg与用DMSO处理的HSA^LR动物相比显著降低具有中央核的细胞的百分比，而其在FVB小鼠中不产生任何变化(图34)。在注射后4周这一效应更加显著，这指示它是一个缓慢的过程。

总之，在模型小鼠中获得的结果验证了p10在哺乳动物中的治疗潜能，打开了寻求DM1和DM2和SCA8的治疗的新的研究途径。

实施例16.本发明的几种肽(p10、p11、p5、p12和p15)在去结构化或 打开由不同于CUG重复的重复诸如AAG (对照)、CGG、CCUG和CAG 形成的发夹环中的比较测定

如图29中可观察到的，在这一实施例中，我们使用2-氨基嘌呤测定来测定p10之外的4种肽(p11、p5、p12和p15)，所述肽是从本发明中解释的组合肽文库的解卷积获得的。结果指示对肽(表1)获得的活性和CUG23探针去结构化二级结构并变成单链的能力之间的相关性。所有情形下使用的浓度均是100μM。因此，该实验证明，尽管p10由于活性最强而是优选的肽，表1的其余肽，特别是p11、p5、p12和p15，也呈现显著水平的特异性和效力。

另一方面，如图30中所表示的，本发明的肽(特别是p10)对由不同于CUG重复的重复，诸如，例如AAG、CGG、CCUG和CAG.形成的发夹环具有不同的结合亲和力。在这一实施例中，我们测试了p10和其结合不同于CUG重复、但是也参与其中已描述了具有长重复的RNA的毒性的疾病的重复的能力。使用了色氨酸消光测定，一方面使用p10+AAG、CGG、CCUG和CAG(AAG用作对照，因为其不形成二级结构)，并且，另一方面，相同的实验使用丙氨酸扫描后获得的无活性肽之一(ppyawa)。结果指示p10呈现与对DMPK-CUG4(在其结合p10中是高度特异的)先前观察到的水平相似的结合其他类型重复序列的水平(图26)。这一结合在分别参与FXTAS和DM2疾病的CGG和CCUG重复的存在下更大。使用了三个测定点(3种不同的探针浓度)，每个两次测量。将结果对p10单独提供的信号标准化。与丙氨酸扫描肽之一(ppyawa)(无活性)相比，p10的结果显示对不同RNA重复存在的完全不同的响应。p10在几乎所有类型重复存在下显示的强度的降低在使用肽ppyawa时显著地改变了方向(强度增加)。强度的这一增加而不是降低，也指示探针的结合类型，这表明p10的效力与和不同类型的重复形成的二级结构的相互作用密切相关。显示了一个测定点(10μM的探针)。结果显示为非标准化的以能够包括测试的肽的初始值。

参考书目

·Garcia-Lopez,A.,Monferrer,L.,Garcia-Alcover,I.,Vicente-Crespo,M.,Alvarez-Abril,M.C.,&Artero,R.D.(2008).Genetic andchemical modifiers of a CUG toxicity model in Drosophila.PLoS One,3,e1595.

·Mankodi,A.,Logigian,E.,Callahan,L.,McClain,C.,White,R.,Henderson,D.,et al.(2000).Myotonic dystrophy in transgenic miceexpressing an expanded CUG repeat.Science,289,1769-1773

Claims (11)

1.包含具有式I的六肽的化合物、其药学上可接受的盐、衍生物或立体异构体：

A-B-C-D-E-F

(I)

其中：

A可以是氨基酸c或p中的任一个，

B可以是氨基酸p或q中的任一个，

C是氨基酸y，

D可以是氨基酸a或t中的任一个，

E可以是氨基酸q或w中的任一个，和

F是氨基酸e。

2.根据权利要求1所述的化合物，选自下组：SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:19。

3.根据权利要求1或2所述的化合物，所述化合物由具有序列SEQ IDNO:10的六肽组成。

4.根据权利要求1或2所述的化合物，所述化合物由选自以下的六肽组成：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15。

5.根据权利要求1至4所述的化合物，特征在于形成式I的部分的氨基酸是L-氨基酸、D-氨基酸或其混合物。

6.根据前述权利要求中的任一项所述的化合物，所述化合物包含处于直接或逆-反构型的具有式I的六肽。

7.根据前述权利要求中的任一项所述的化合物，用作药物。

8.根据权利要求1至6中的任一项所述的化合物，所述化合物用于预防和/或治疗病因学是基于包含CUG、CCUG、CGG、CAG和AAG重复的毒性转录物的存在的疾病，所述疾病包括在由以下形成的组中：DM1、SCA8、DM2、FXTAS、HD和FA。

9.至少一种根据权利要求1至6的化合物用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物设计为用于预防和/或治疗病因学是基于包含CUG、CCUG、CGG、CAG和AAG重复的毒性转录物的存在的疾病，所述疾病包括在由以下形成的组中：DM1、SCA8、DM2、FXTAS、HD和FA。

10.包含至少一种根据权利要求1至6的化合物的药物组合物。

11.用于预防和/或治疗病因学是基于包含CUG、CCUG、CGG、CAG和AAG重复的毒性转录物的存在的疾病的方法，所述疾病包括在由以下形成的组中：DM1、SCA8、DM2、FXTAS、HD和FA，所述方法包含向患者施用治疗有效量的至少一种根据权利要求1至6的化合物、或根据权利要求10的组合物。

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