WO2011115103A1 - アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物のスクリーニング方法 - Google Patents

アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物のスクリーニング方法 Download PDF

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門脇　孝
山内　敏正
真人 岩部
美紀 岩部
和成 東原
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Definitions

  • the present invention relates to a method for screening an agonist candidate compound for adiponectin receptor 1.
  • Adiponectin encoded by Adipoq is an adipokine having anti-diabetic and anti-atherogenic effects.
  • Plasma adiponectin levels have been reported to be decreased in obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes (Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20, 1595-1599 (2000)).
  • Administration of adiponectin causes hypoglycemic action and improves insulin resistance in mice (Proc.
  • adiponectin-deficient mice show insulin resistance and diabetes (J. Biol. Chem. 277, 25863-25866 (2002); Nature Med. 8, 731-737 (2002) ).
  • the action of adiponectin to increase insulin sensitivity is AMP-activated protein kinase (AMPK) (Nature Med. 8, 1288-1295 (2002); Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 16309-16313 (2002); Cell Metab.
  • AMPK AMP-activated protein kinase
  • AdipoR1 adiponectin receptor 1
  • AdipoR2 adiponectin receptor 2
  • AdipoR1 adiponectin receptor 1
  • AdipoR2 adiponectin receptor 2
  • AdipoR1 is highly expressed in skeletal muscle and liver
  • AdipoR2 is mainly expressed in liver.
  • Both receptors contain seven transmembrane domains (Nature 423, 762-769 (2003)), but are expected to be structurally and functionally distinct from G protein-coupled receptors (FASEB J 11, 346-354 (1997); Nature 387, 620-624 (1997); EMBO J. 15, 3566-3578 (1996)).
  • Adiponectin receptors are also considered to constitute a new receptor family.
  • AdipoR1 and AdipoR2 act as major receptors for adiponectin in vivo and have important roles in regulating glucose and lipid metabolism, inflammation and oxidative stress in vivo (Nature Med. 13, 332-339 (2007)).
  • AdipoR1 activates the AMPK pathway and AdipoR2 activates the PPAR ⁇ pathway (Nature Med. 13, 332-339 (2007)).
  • insulin resistance has been reported to be associated with mitochondrial dysfunction (N. Engl. J. Med. 350, 664-671- (2004)), the exact cause of mitochondrial dysfunction is It has not been confirmed yet.
  • a decrease in adiponectin / AdipoR1 signaling may be related to mitochondrial dysfunction, details of adiponectin / AdipoR1 signaling have not been elucidated.
  • compounds acting as agonists for AdipoR1 may be able to exert glucose and lipid metabolism, inflammation, regulation of oxidative stress, hypoglycemia, and insulin resistance improving action, etc. Usefulness as an active ingredient is expected.
  • a method for efficiently screening candidate compounds that are agonists for AdipoR1 has not been developed.
  • An object of the present invention is to provide a method for screening an agonist candidate compound for adiponectin receptor 1.
  • the present inventors have found that the various physiological activities induced by the binding of adiponectin to adiponectin receptor 1 are caused by calcium ions entering skeletal muscle cells that are initially produced by adiponectin binding to adiponectin receptor 1. Based on this finding, it was found that a compound having an agonistic effect on adiponectin receptor 1 can be screened using calcium ion uptake into skeletal muscle cells as an indicator. .
  • a screening method a method in which the test compound is contacted with skeletal muscle cells and then the calcium ion uptake is examined by, for example, confirming an electrical signal, or AdipoR1-expressing cells and AdipoR1-expressing cells are examined.
  • each test compound is contacted to check calcium ion uptake by, for example, confirming an electrical signal, and these methods are combined as primary screening and secondary screening, respectively. It was also found that screening with high accuracy can be performed.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • a method comprising a step of selecting a test compound that causes intracellular inflow of ions as an agonist candidate compound for adiponectin receptor 1.
  • the above method wherein the cell is a skeletal muscle cell; the above method wherein the cell is a Xenopus oocyte injected with AdipoR1-complementary RNA; and the step of measuring intracellular calcium ion concentration
  • a method for measuring intracellular calcium ion concentration by fluorescence intensity using a calcium ion fluorescent reagent a method for measuring intracellular calcium ion concentration electrophysiologically; adiponectin receptor as a cell
  • the above method using a cell expressing 1;
  • the above method wherein the cell expressing adiponectin receptor 1 is an oocyte.
  • a test compound is contacted with each of a cell that is deficient in AdipoR1 expression and an AdipoR1-expressing cell to determine whether intracellular calcium ion influx occurs, and deficient in AdipoR1 expression. Selecting a test compound that does not substantially cause extracellular calcium ion influx in the induced cells and that causes extracellular calcium ion influx in AdipoR1-expressing cells as an agonist candidate compound for adiponectin receptor 1 Is provided.
  • a method for screening an agonist candidate compound for adiponectin receptor 1 comprising the following steps: (a) Determine whether intracellular calcium ion inflow occurs when a test compound is brought into contact with a cell, and test compounds that cause extracellular calcium ion inflow into the cell are candidate agonists for adiponectin receptor 1 Selecting as a compound; and (b) The candidate agonist compound selected in the above step (a) is brought into contact with AdipoR1-expressing cells and AdipoR1-expressing cells to determine whether intracellular calcium ion influx occurs.
  • An agonist candidate compound for adiponectin receptor 1 that does not substantially cause extracellular calcium ion influx in cells deficient in AdipoR1 expression and causes extracellular calcium ion influx in AdipoR1-expressing cells.
  • a method is provided that includes selecting as an agonist compound.
  • the above method wherein the cell is a skeletal muscle cell; the above method comprising a step of measuring the intracellular calcium ion concentration; the intracellular calcium ion concentration is measured using a calcium ion fluorescent reagent; The above method of measuring by intensity is provided.
  • an agonist candidate compound for adiponectin receptor 1 can be screened extremely simply and with high accuracy.
  • An agonist compound for adiponectin receptor 1 is expected as an active ingredient of a medicament for the treatment and / or prevention of obesity and the treatment and / or prevention of diabetes.
  • adiponectin receptor 1 binds to adiponectin to cause extracellular calcium ions to flow into cells in skeletal muscle cells, and Is involved in regulation of calcium ion signaling, regulation of glucose and lipid metabolism, regulation of exercise tolerance, regulation of PGC-1 ⁇ expression and activation by AMPK / SIRT1, regulation of mitochondrial function and oxidative stress Therefore, an agonist compound for adiponectin receptor 1 can induce the same physiological action by binding to adiponectin receptor 1, and is expected to be useful as an active ingredient of various drugs.
  • these physiological changes induced after calcium ion influx in skeletal muscle cells are substantially the same as those in skeletal muscle cells after exercise, and therefore agonist compounds for adiponectin receptor 1 It can be used as an active ingredient of a medicine that produces a simulated exercise effect.
  • agonist compounds for adiponectin receptor 1 It can be used as an active ingredient of a medicine that produces a simulated exercise effect.
  • exercise therapy or assisting exercise therapy for diabetics such as elderly people who are difficult to apply exercise therapy or those who have difficulty walking. It can be applied as a typical medicine.
  • (a) to (f) are (a, b) during oral glucose tolerance test (OGTT) (1.5 g glucose / kg body weight) in high insulin- normoglycemic clamp experiments in control and muscle-R1KO mice (A, c) plasma glucose and (b) plasma insulin, (d) endogenous glucose production (EGP), (e) glucose in (c) during the insulin tolerance test (ITT) (0.25 U insulin / kg body weight)
  • OGTT oral glucose tolerance test
  • GTP endogenous glucose production
  • ITT insulin tolerance test
  • Rd disappearance rate
  • GIR glucose infusion rate
  • (g) to (l) are (g) in skeletal muscle treated with insulin (0.3 U / kg body weight) for 7.5 minutes in control and muscle-R1KO mice after 5 hours of fasting or untreated skeletal muscle Tyrosine phosphorylation in IRS-1 (pTyr), (k) phosphorylation of Ser ⁇ 302 in IRS-1, and (l) phosphorylation of Ser 636/639 in IRS-1, (h) phosphorylation of Akt Oxidation and amount, (i) phosphorylation and amount of S6K1, and (j) phosphorylation and amount of JNK.
  • IB indicates immunoblotting and IP indicates immunoprecipitation. All values are expressed as mean ⁇ s.e.m.
  • the lower trace shows the mean calcium response of C2C12 myocytes to adiponectin stimulation for 1 minute, including when 5 mM EGTA was administered (black bar).
  • the shaded area around the trace represents sem.
  • bd Adipor1 mRNA levels in C2C12 myocytes transfected with irrelevant siRNA duplex or AdipoR1 siRNA duplex (b), fura-2 calcium response (c), and 30 ⁇ gml -1 adiponectin stimulation for 1 minute
  • the strength (d) of is shown.
  • a, b, C2C12 myocytes pre-incubated with 5 mM EGTA for 20 minutes or unincubated and then treated with adiponectin (30 ⁇ gml ⁇ 1 ) or ionomycin (1 ⁇ M) for 5 minutes or with AICAR (1 mM) for 1 hour (a ) Or phosphorylated and amount of AMPK in C2C12 myocytes (b) transfected with the indicated siRNA duplexes and then treated with 30 ⁇ gml ⁇ 1 adiponectin for 5 min.
  • trace shows the calcium response of the soleus muscle in the area shown in d.
  • Adiponectin was administered at the times indicated.
  • e is a conceptual diagram illustrating signal transmission of adiponectin / AdipoR1 in muscle cells. Both CaMKK ⁇ and LKB1 are required for maximal activation of AMPK induced by adiponectin. AMPK and SIRT1 are required for adiponectin / AdipoR1-induced PGC-1 ⁇ activation.
  • Activation of CaMKK ⁇ by adipoR1-induced adiponectin-induced calcium ion influx is required for increased adiponectin-induced PGC-1 ⁇ expression.
  • PGC-1 ⁇ is required for mitochondrial biosynthesis stimulated by adiponectin / AdipoR1. From these data, the inventors concluded that adiponectin and AdipoR1 increase calcium ion signaling and PGK-1 ⁇ expression and activity by AMPK and SIRT1, leading to increased mitochondrial biogenesis. The inventors have obtained direct evidence in both gain-of-function and loss-of-function experiments in vitro and in vivo (but other researchers have already increased PGC-1 ⁇ expression).
  • FIG. 6 shows that muscle-specific destruction of AdipoR1 results in a reduction in adiponectin action in skeletal muscle. Phosphorylation and amount of AMPK in skeletal muscle (a) and liver (b) treated with a, b, adiponectin (30 ⁇ g per 10 g body weight) for 10 minutes or untreated.
  • FIG. 5 shows mRNA expression in C2C12 cells transfected with siRNA duplexes. a-h, C2C12 myocytes were transfected with siRNA duplexes.
  • a as assessed by mitochondrial DNA copy number in C2C12 myocytes preincubated with AraA (0.5 ⁇ mM) for 1 hour or STO-609 (1 ⁇ g / ml) for 6 hours and then treated with 10 ⁇ g / ml adiponectin for 48 hours Mitochondrial content.
  • C2C12 myocytes were treated with 10 ⁇ g / ml adiponectin for 48 hours, and then 100 nM MitoTracker Green FM was added and incubated for 30 minutes.
  • ** indicates P ⁇ 0.01 when compared as shown. It is the figure which showed NAD + and NADH content in C2C12 myocyte and skeletal muscle. ad, NAD + (a, c) and NADH (b, d) content in C2C12 myocytes (a, b) and skeletal muscle (c, d) treated with adiponectin for the indicated times. Skeletal muscle was obtained from control mice or muscle-R1KO mice. All values are expressed as mean ⁇ sem (n 8-10). * And ** indicate P ⁇ 0.05 and P ⁇ 0.01, respectively, when compared to the control or when compared as indicated.
  • Ppar ⁇ in skeletal muscle of muscle-R1KO mice illustrates Aco and Slc2a4 mRNA levels, and oxygen (O 2) consumed and respiratory quotient (RQ).
  • PPAR ⁇ (Ppara) (a) and Aco (Acox1) (b) mRNA levels in skeletal muscles of a, b, control mice and muscle-R1KO mice were analyzed by RT-qPCR.
  • c, d 24-hour average values of oxygen (O 2 ) consumption (c) and respiratory quotient (RQ) (d) in control and muscle-R1KO mice.
  • Ad, control and muscle-R1KO mice were treated with 0.25 ⁇ M Bay-K 8644, a calcium channel opener, or untreated.
  • control mice and muscle-R1KO mice were treated with vehicle or AICAR (500 mg / kg body weight per day, 2 weeks).
  • a Relative ratio of CaMKI phosphorylation in skeletal muscle of muscle-R1KO mice treated or untreated with 0.25 ⁇ M Bay-K 8644.
  • b Phosphorylation and amount of Akt (Ser 473) in skeletal muscle treated or untreated with 0.25 ⁇ M Bay-K 8644.
  • c, h Mitochondrial content in skeletal muscle as assessed by mitochondrial DNA copy number. Skeletal muscle was obtained from muscle-R1KO mice. Citrate synthase enzyme activity in skeletal muscle of d, i, control and muscle-R1KO mice.
  • e Phosphorylation and amount of AMPK in skeletal muscle treated or untreated with AICAR (500 mg / kg body weight for 2 hours).
  • f Insulin resistance index. The insulin resistance index was calculated from the product of the area of glucose and insulin in the glucose tolerance test ⁇ 10 ⁇ 2 . Results are expressed as a percentage of the control litter value.
  • Ad control and muscle-R1KO mice were treated with vehicle or resveratrol (400 mg / kg body weight per day, 2 weeks).
  • ei control mice and muscle-R1KO mice were treated with vehicle or antioxidant MnTBAP (10 mg / kg body weight per day, 2 weeks).
  • a, f insulin resistance index. The insulin resistance index was calculated from the product of the area of glucose and insulin in the glucose tolerance test ⁇ 10 ⁇ 2 . Results are expressed as a percentage of the control litter value.
  • b g, area under the curve (AUC) of plasma glucose levels during the insulin tolerance test (ITT).
  • c, h Mitochondrial content in skeletal muscle as assessed by mitochondrial DNA copy number. Skeletal muscle was obtained from control mice or muscle-R1KO mice.
  • FIG. 3 shows the amount of Akt insulin-induced phosphorylation in C2C12 myocytes, FOXO1 phosphorylation in skeletal muscle, and PGC-1 ⁇ acetylation in C2C12 myocytes.
  • FIG. 3 shows adiponectin-induced inward current response by AdipoR1 in C2C12 myocytes and Xenopus oocytes.
  • a Inward current response of whole cells to 30 second stimulation with 30 ⁇ g / ml adiponectin for C2C12 myocytes transfected with irrelevant siRNA duplex (upper trace) and AdipoR1 siRNA duplex (lower trace). The holding potential was -60 mV.
  • b Effect of AdipoR1 knockdown on the inward current response of whole cells to adiponectin.
  • c Representative current traces in oocytes injected (top) or uninjected (bottom) with AdipoR1 cRNA against adiponectin recorded at a holding potential of -80 mV. Adiponectin (30 ⁇ g / ml) was administered for 30 seconds at the time indicated by the squares.
  • d Intensity of an inward current response to adiponectin (30 ⁇ g / ml) when 5 mM EGTA was used or not used in oocytes injected or not injected with AdipoR1 cRNA.
  • C2C12 myocytes are pre-incubated with or without EGTA (5) mM) for 20 minutes, then with or without EGTA (5 mM) and with or without adiponectin (30 ⁇ g / ml) Treated for 0, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 minutes.
  • b Densitometric quantification of immunoblot (a) phosphorylation and amount of CaMKI (upper panel), AMPK (middle panel) and HDAC5 (lower panel) levels.
  • c Densitometric quantification of immunoblot (a) phosphorylation and amount of CaMKI (upper panel), AMPK (middle panel) and HDAC5 (lower panel) levels.
  • FIG. 6 shows creation and characterization of muscle-R1KO mice.
  • a A schematic of the Adipor1 gene targeting strategy. Muscle-R1KO mice were generated by mating mice with floxed Adipor1 alleles to animals that transformed and expressed cre recombinase under the control of the MCK promoter (MCK-Cre).
  • b Southern blot analysis of genomic DNA from liver, SKM (skeletal muscle), WAT (white adipose tissue) and BAT (brown adipose tissue) of C57B1 / 6 background control and muscle-R1KO mice.
  • Mouse genomic DNA cut with XbaI was hybridized with the probe indicated by a.
  • c Northern blot analysis of Adipor1 mRNA expressed in liver, SKM, WAT and BAT of C57B1 / 6 background control mice and muscle-R1KO mice.
  • the method of the present invention is a method for screening an agonist candidate compound for adiponectin receptor 1, wherein it is determined whether or not an extracellular inflow of extracellular calcium ion occurs by bringing a test compound into contact with a cell.
  • the method includes a step of selecting a test compound that causes intracellular inflow of ions as an agonist candidate compound for adiponectin receptor 1.
  • agonist compound for adiponectin receptor 1 means that when this agonist compound binds to adiponectin receptor 1, adiponectin which is an in vivo ligand of adiponectin receptor 1 binds to adiponectin receptor 1 It means a compound capable of inducing all or part of various physiological effects caused in some cases and exhibiting physiological actions similar to adiponectin.
  • An “agonist candidate compound” is a compound having at least the potential as an agonist compound.
  • test compound is not particularly limited, and any compound such as oligopeptides, polypeptides, nucleic acids, saccharides, and lipids can be used for screening in addition to low-molecular organic compounds. Since many compound libraries in which many compounds are integrated are constructed, it is efficient to use a large number of compounds registered in such libraries for screening.
  • the type of cell to which the test compound is contacted is not particularly limited, and any somatic cell can be used as long as it is a cell in which AdipoR1 is expressed.
  • a cell in which AdipoR1 is expressed in a large amount for example, skeletal muscle Cells can be used.
  • a cell in which AdipoR1 is expressed by introducing a gene encoding AdipoR1 can also be used. In such a case, it is also preferable to use, for example, an oocyte.
  • the cells are not limited to skeletal muscle cells or oocytes.
  • a general technique such as placing the cells in a medium adjusted to a predetermined calcium ion concentration and adding a solution of the test compound adjusted to the predetermined concentration can be employed.
  • a general technique such as placing the cells in a medium adjusted to a predetermined calcium ion concentration and adding a solution of the test compound adjusted to the predetermined concentration can be employed.
  • it is not limited to this method.
  • the intracellular inflow of extracellular calcium ions can be detected by measuring the intracellular calcium ion concentration increased by the inflow of calcium ions.
  • the detection means for example, a method of detecting by fluorescence intensity using a calcium ion fluorescent reagent (calcium ion fluorescent probe) that captures calcium ions and emits fluorescence, or a current generated due to intracellular inflow of calcium ions is used. Examples of the detection method include electrophysiological detection, and a combination thereof may be used, but the method is not limited to these specific means.
  • Examples of calcium ion fluorescent reagents include Fluo 4-AM, Fluo 3, Fluo 3-AM, Fura 2, Fura 2-AM, Indo 1, Indo 1-AM, Quin 2, Rhod 2, Rhod 2-AM, etc. Since it is commercially available, it can be appropriately selected and used according to the type of cell, the type of test compound, and the like. For example, Fura 2-AM is hydrolyzed after being rapidly taken into the cell due to the presence of a fat-soluble acetoxymethyl group, and then becomes Fura 2, which binds to calcium ions and emits high-intensity fluorescence. It can be suitably used for measurement of intracellular calcium ion concentration. Regarding the fluorescent reagent for measuring intracellular calcium concentration, for example, Pharmacia, 26, pp. 544-546 (1990) can be referred to.
  • the calcium ion flowing into the cell and the calcium ion fluorescent reagent combine to obtain a fluorescence intensity that depends on the calcium ion concentration.
  • the fluorescence intensity can be measured using any method such as observation or imaging with a normal fluorescence microscope. Generally, an increase in intracellular calcium concentration is detected from the increase in fluorescence intensity using a calibration curve. can do.
  • Electrophysiological measurement using an electrical signal as an indicator can detect a large amount of cell signals at once, and can detect an electrical signal at high speed using an inexpensive device. Is suitable.
  • a cell expressing adiponectin receptor 1 as the cell.
  • a cell in which a gene encoding adiponectin receptor 1 is introduced and expressed in a cell such as an oocyte is used.
  • the type of cell and the means for introducing the gene are not particularly limited.
  • the test compound when a test compound that causes intracellular calcium ion influx is found among the test compounds, the test compound can be selected as an agonist candidate compound for adiponectin receptor 1. .
  • this candidate compound binds to adiponectin receptor 1, all or part of various physiological effects caused when adiponectin, which is an in vivo ligand of adiponectin receptor 1, binds to adiponectin receptor 1 It is a compound that has the possibility of triggering.
  • a test compound is contacted with each of a cell deficient in AdipoR1 expression and an AdipoR1-expressing cell to determine whether intracellular calcium ion influx occurs, and the expression of AdipoR1 is determined.
  • a test compound that does not substantially cause extracellular calcium ion influx in the deficient cell but causes extracellular calcium ion influx in AdipoR1-expressing cells is selected as an agonist candidate compound for adiponectin receptor 1 It is characterized by including a process.
  • a cell deficient in the expression of AdipoR1 in skeletal muscle cells can be preferably used.
  • muscle according to the method specifically shown in the examples of the present specification can be used.
  • An animal (muscle-R1KO animal) that specifically knocks out AdipoR1 can be prepared, and muscle tissue and muscle cells can be isolated and collected from this animal for use.
  • the method for preparing cells deficient in the expression of AdipoR1 is not limited to the specific method described above, and it goes without saying that desired cells can be prepared by any method available to those skilled in the art.
  • a test compound that does not substantially cause an intracellular influx of extracellular calcium ions in a cell deficient in AdipoR1 expression and causes an intracellular influx of extracellular calcium ions in AdipoR1-expressing cells.
  • it can be selected as an agonist candidate compound for adiponectin receptor 1
  • the agonist candidate compound selected by this method is very likely to act as an agonist compound.
  • a compound since this method has high accuracy, the agonist candidate compound selected by this method is very likely to act as an agonist compound.
  • Example 1 Method Mice used were 8-10 weeks old at the time of the experiment.
  • the treadmill exercise test regimen was set at 20 minutes and 15 m / min, and the exercise tolerance was 20 minutes as the number of times the mouse could not avoid electrical stimulation.
  • Plasmids encoding PGC-1 ⁇ and PGC-1 ⁇ -2A mutants were obtained from Dr. BM Spiegelman and are all described in the literature (Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 12017-12022 (2007)). Plasmids encoding PGC-1 ⁇ -R13 mutants were obtained from Dr. P. Puigserver and are all described in the literature (Nature 434, 113-118 (2005)). The results of statistical analysis are shown as mean ⁇ sem. Differences between the two groups were assessed using an unpaired two-tailed t test. Data containing more than two groups were evaluated by analysis of variance (ANOVA). Details of the method will be described below.
  • mice Male chimeric mice were crossed with C57Bl / 6 female mice to create heterozygous (Adipor1 lox / + ) mice, and F1 offspring from two separately created male chimeric mice were crossed with C57Bl / 6 female mice, F2 mice were obtained. Both mouse strains showed the same phenotype throughout all experiments conducted in this study. Thereafter, the present inventors performed backcrossing of Adipor1 lox / + mice (C57B1 / 6 and 129 / sv background) and C57B1 / 6 mice more than 5 times.
  • Adipor1 lox / + mice were cross-bred with MCK-Cre mice to produce MCK-Cre Adipor1 lox / + mice.
  • MCK-Cre Adipor1 lox / + mice are mated with Adipor1 lox / lox mice, and Adipor1 lox / + , MCK-Cre Adipor1 lox / + , Adipor1 lox / lox and MCK-Cre Adipor1 lox / lox (muscle-R1KO) mice Respectively.
  • MCK-Cre and Adipor1 lox / lox mice were phenotypically indistinguishable; Adipor1 lox / lox mice were used as controls. All experiments in this study were conducted with male litters.
  • mice were placed in cages and reared on a 12 hour light / dark cycle.
  • a standard feed (CE-2, CLEA Japan) with the following composition was used as feed: 25.6% (wt / wt) protein, 3.8% fiber, 6.9% ash, 50.5% Carbohydrate, 4% fat and 9.2% water (Nature Med., 13, 332-339 (2007)).
  • Genotyping Mice were genotyped using PCR. Two primers were used for AdipoR1 genotyping: 5'-ACA GGC ACA TAA CAT CTA AGG CA -3 'as forward primer and 5'-AGC ATG ATA CTG AGT TGG CCA CA-3' as reverse primer . 5′-CGG TGT TGA CGA GGC GTC CGA AG-3 ′ and 5′-GGT CTT CGG GAT GTT CTT CCT G-3 ′ were used as two primers in the detection of floxed AdipoR1 gene.
  • Primers used for detection of Cre were 5'-CGC CGC ATA ACC AGT GAA AC -3 ', 5'-ATG TCC AAT TTA CTG ACC G-3', 5'-ACA GCG TGA ATT TTG GAG TCA GAA-3 'And 5'-GCT TTG CTC AGC CTC GCT AT-3'.
  • mice were intravenously injected with 30 ⁇ g of recombinant murine adiponectin per 10 g body weight using a inferior vena cava catheter (Nature Med. 8, 1288-1295 (2002)). This increased plasma adiponectin levels to approximately 30 ⁇ g / ml; this indicates that the adiponectin dose used in this study was comparable to endogenous adiponectin levels.
  • Mouse full-length adiponectin was prepared by the method described in the following literature (Nature Med. 8, 1288-1295 (2002); Nature Med. 7, 941-946 (2001); Nature 423, 762-769 (2003)).
  • Southern blotting was carried out according to the method described in the literature (Nature Med. 13, 332-339 (2007); J. Biol. Chem. 281, 26602-26614 (2006)).
  • Mouse genomic DNA cut with XbaI was hybridized using a probe.
  • AdipoR1 cDNA probe template was prepared by RT-PCR using specific primers. The forward primer was 5′-TGTCCACCATCACAGGAAGA′-3, and the reverse primer was 5′-GCTTGCCCTTCTCCTCCA -3 ′.
  • C2C12 cells Mouse C2C12 myogenic cells were cultured in 90% Dulbecco's modified high glucose / Eagle medium containing 10% (v / v) fetal calf serum. When cells reach 80% confluence, myoblasts are replaced by medium for induction of low serum differentiation (98% Dulbecco's modified high glucose eagle medium, 2.5% (v / v) horse serum). Was induced to differentiate into muscle cells. The medium was changed every day. C2C12 cells were transfected using Pofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions.
  • the supernatant was used for the assay.
  • the level of lipid peroxidation in tissue homogenate and plasma was measured by the amount of TBARS using LPO test (Wako Pure Chemical Industries). All other materials, including chemicals, can be found in the references (Nature Med. 8, 1288-1295 (2002); Nature Med. 7, 941-946 (2001); Nature 423, 762-769 (2003); J. Biol Chem. 281, 26602-26614 (2006); J. Biol. Chem. 281, 8748-8755 (2006); J. Biol. Chem. 279, 30817-30822 (2004)). obtained.
  • RNA interference Two pairs of siRNAs were chemically synthesized, annealed and transfected into C2C12 myocytes using Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) (J. Biol. Chem. 278, 2461-2468 ( 2003)).
  • the sequence of the sense siRNAs is as follows: Mouse AdipoR1: GAGACUGGCAACAUCUGGACATT; Mouse AdipoR2: GCUUAGAGACACCUGUUUGUUTT.
  • AMPK ⁇ 1, AMPK ⁇ 2, CaMKK ⁇ , PGC-1 ⁇ , SIRT1 and LKB1 siRNA were purchased from Applied Biosystems. Cells transfected with non-functional jumbled siRNA (not relevant) (Applied Biosystems) were used as a negative control. Cells were lysed 48 hours after transfection.
  • NAD + / NADH measurement NAD + and NADH nucleotides were directly measured by a method described in the literature (Nature 458, 1056-1060 (2009)).
  • Whole skeletal muscle or two 10 cm dish C2C12 myocytes were homogenized in 200 ⁇ l acid extraction buffer to measure NAD + concentration, or NADH concentration was measured by 200 ⁇ l alkaline extraction.
  • the homogenate was neutralized, and a cyclic reaction with an enzyme was performed using 5 ⁇ l of the sample, and then the nucleotide concentration was measured by a fluorescence method. Values for both nucleotides were detected within the linear range.
  • the NAD + / NADH ratio was calculated by comparing the ratios obtained from parallel cell dishes in each animal or experiment.
  • EGTA solution 140 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 5 mM HEPES, 2.0 mM pyruvate sodium salt, 1.25 mM KH 2 PO 4 , 2.0 mM MgCl 2 , 5.0 mM EGTA-2Na, 9.4 mM D -Glucose (pH 7.4) was used as the bath solution.
  • the fura-2 fluorescence ratio was converted to a calcium ion signal.
  • Injected oocytes were bathed in 10 ⁇ g / ml penicillin and streptomycin (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.3 mM Ca (NO 3 ) 2 , 0.4 mM CaCl 2 , 0.8 mM MgSO 4 , 2.4 mM NaHCO 3 , 15 mM HEPES, pH 7.6) and cultured at 18 ° C. for 3 days.
  • Total cell current was recorded with a 2-electrode voltage clamp method.
  • An intracellular glass electrode was filled with 3M KCl.
  • the signal was amplified with an OC-725C amplifier (Warner Instruments), passed through a 50 Hz low pass filter and digitized at 1 kHz.
  • the control bath solution contained 115 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.8 mM CaCl 2 and 10 mM HEPES and was titrated to pH 7.2 with NaOH.
  • a solution containing 1.8 mM BaCl 2 instead of CaCl 2 was used as a calcium ion-free solution. Inward current was monitored at a holding potential of -80 mV.
  • Ligand perfusion Ringer solution was supplied by (150 mM NaCl, 4 mM KCl, 2.0 mM CaCl 2, 1.0 mM MgCl 2, 30 mM D- glucose, 5 mM HEPES (pH 7.4) ).
  • Citrate synthase activity was determined according to the method described in the literature (Cell Metab. 4, 75-87 (2006); Eur. J. Biochem. 10, 198-206 (1969); Obes Res 13, 574 -581 (2005)) from a homogenate using a spectrophotometer. Citrate synthase activity was measured at 37 ° C. in 0.1 M Tris-HCl (pH 8.3) assay buffer containing 0.12 mM 5,5′-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) and 0.6 mM oxaloacetate. After recording the absorbance at 412 nm in the first 2 minutes, 3 mM acetyl-CoA was added to start the reaction, and the change in absorbance was measured every 10 seconds for 7 minutes.
  • Oxygen consumption Oxygen consumption was measured every 3 minutes for 24 hours in animals under fasting conditions using the O 2 / CO 2 metabolism measurement system (model MK-5000; Muromachi Kikai, Tokyo, Japan) . Mice were placed in closed chambers (560 ml volume) each supplied with 0.5 l / min airflow at room temperature. The oxygen consumption was converted to milliliters / minute by multiplying it by the flow rate.
  • Mitochondrial function was evaluated by measuring enzyme activities of Cox (FIG. 8a) and succinate dehydrogenase (SDH) (FIG. 8b). Staining treatment of soleus muscle sections revealed that the number of Cox- and SDH-positive muscle fibers was small in muscle-R1KO mice, and the staining intensity of Cox and SDH was reduced (Fig. 8a, b). ).
  • PGC-1 ⁇ is activated via phosphorylation by AMPK (Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 12017-12022 (2007)) or by deacetylation by SIRT1 activation (Nature 434, 113-118 (2005)) It has been reported that Therefore, we investigated the possibility that AMPK activated by adiponectin and AdipoR1 regulates PGC-1 ⁇ activity. Treatment of C2C12 myocytes with adiponectin decreased PGC-1 ⁇ acetylation after 2 hours of treatment (FIG. 3c).
  • SIRT1 deacetylase activity has been reported to be dependent on NAD + levels (Nature 434, 113-118 (2005); Nature 444, 868-874 (2006)).
  • Adiponectin increased the NAD + / NADH ratio in C2C12 myocytes (FIG. 3g).
  • Muscle-R1KO mice also showed an increase in PGC-1 ⁇ acetylation (FIG. 3h) and a decrease in the NAD + / NADH ratio upon adiponectin stimulation in vivo (FIG. 3i).
  • Adiponectin induces calcium ion influx by AdipoR1
  • treatment of C2C12 myocytes with adiponectin increased the intracellular calcium ion concentration measured by fura-2-based fluorescence imaging (FIG. 4a).
  • C2C12 myocytes showed a dose-dependent response to adiponectin.
  • extracellular extracellular calcium ions were removed by EGTA, the adiponectin-induced calcium ion response almost completely disappeared (FIG. 4a), but EGTA had no effect on ATP-induced intracellular calcium ion release.
  • siRNA was used to suppress AdipoR1 expression (FIG.
  • AdipoR1 was expressed in Xenopus oocytes (FIG. 4e).
  • muscle-R1KO reduces adiponectin action in skeletal muscle.
  • Muscle-R1KO showed decreased phosphorylation of AMPK (FIG. 1a) and its intracellular substrate acetyl-CoA carboxylase (ACC) (FIG. 14a). It showed a decrease in muscle-R1KO mitochondria-specific gomori staining (FIG. 15a).
  • Type I fiber differentiated muscle cell enhancer factor 2C (Mef2c) (EMBO J. 19, 1963-1973 (2000)) (Fig.1b and Fig.16a) together with I Type fiber marker myosin heavy chain (MHC) isoform I (FIG. 15b), troponin I (slow) (Tnni1) (FIGS. 1e and 15c) and myoglobin (Mb) (Physiol. Rev. 80, 1215-1265 (2000) )) ( Figure 15d) showed a decrease in the molecules involved. These results were consistent with histological analysis (FIGS. 1f, g and FIG. 15e). In the soleus muscle of muscle-R1KO mice, type I fibers were reduced by 20% (FIGS. 1g and 15e).
  • NAD + and NADH content in C2C12 myocytes and skeletal muscle Adiponectin increased the NAD + / NADH ratio, NAD + and NADH content in C2C12 myocytes ( Figure 3g and Figure 18a, b) .
  • muscle-R1KO also showed reduced NAD + / NADH ratio, NAD + and NADH content in vivo (FIGS. 3i and 18c, d).
  • Oxygen (O 2 ) consumption and respiratory quotient (RQ) in muscle-R1KO mice Disruption of AdipoR1 in a muscle-specific manner significantly reduced O 2 consumption (FIG. 19c), but RQ had no significant effect (FIG. 19d).
  • MnTBAP (Nature 440, 944-948 (2006)) actually significantly reduced ROS like H 2 O 2 (Fig. 21e), but MnTBAP alone improved insulin resistance in muscle muscle R1KO mice Did not significantly increase functions such as mitochondrial content and citrate synthase activity (FIGS. 21e-i). These results indicate that anti-oxidative stress-independent pathways such as S6K1 inhibition and tissue triglyceride accumulation by AMPK, together with anti-oxidative stress-dependent pathways, contribute to the increased insulin sensitivity of adiponectin / AdipoR1 in muscle. This suggests the possibility of a significant contribution.
  • Antioxidant stress-independent pathways such as the increase in NRF-1 ( Figure 1b) and mtTFA ( Figure 1b) by AMPK / SIRT1, contribute significantly to mitochondrial biosynthesis by adiponectin / AdipoR1 in muscle. Conceivable.
  • AICAR significantly but partially recovered AdipoR1 loss in muscle (Fig. 20f-i), but exercise significantly and almost completely recovered (Fig. 6a-d). These results can be explained by several mechanisms. First, exercise was able to activate AMPK more efficiently than AICAR. In skeletal muscle, AMPK can be activated through two distinct pathways: LKB1-dependent and CaMKK ⁇ -dependent phosphorylation. AICAR activates LKB1-dependent phosphorylation and activation of AMPK as an AMP mimic that induces structural changes in AMPK that allow efficient phosphorylation by structurally activated LKB1 However, AICAR does not increase intracellular calcium ion concentration and therefore does not stimulate CaMKK ⁇ -dependent phosphorylation and activation.
  • exercise has been shown to increase both intracellular AMP and calcium ion concentrations, and thus can stimulate both LKB1-dependent and CaMKK ⁇ -dependent phosphorylation and activation of AMPK.
  • exercise is dependent on intracellular calcium ion concentration, such as activation of CaMK members, but is independent of AMPK, followed by exercise-regulated muscle genes (especially PGCs).
  • -1 ⁇ has been shown to stimulate increased expression (Nature 454, 463-4692008 (2008)), which may also contribute to the recovery of AdipoR1 loss in muscle, but these are Is not seen.
  • BAPTA-AM Bis- (o-aminophenoxy) ethane-N, N, N9, N9-tetra-acetic acid tetraacetoxymethyl ester
  • HDAC histone deacetylase
  • Adiponectin treatment of C2C12 myocytes increased HDAC5 phosphorylation in a continuous and partial manner dependent on extracellular calcium ion influx ( Figure 25a, bottom panel of Figure 25b, Figure 25c) .
  • Incubation for 20-40 minutes without adding adiponectin in calcium ion-free medium supplemented with EGTA (corresponding control) had no significant effect on CaMKI, AMPK and HDAC5 phosphorylation in C2C12 myocytes ( Figure 25a-c).
  • PGC-1 ⁇ Differences between PGC-1 ⁇ and adiponectin / AdipoR1 in regulating insulin sensitivity
  • PGC-1 ⁇ is an important regulator of oxidative metabolism in skeletal muscle. Reduced PGC-1 ⁇ and OXPHOS levels are associated with insulin resistance and type 2 diabetes in humans (Nature Genet. 34, 267-273 (2003)) and mice (FIGS. 14a-c). However, muscle-specific PGC-1 ⁇ -knockout mice did not show insulin resistance (J. Clin. Invest. 117, 3463-3474 (2007)). Therefore, PGC-1 ⁇ -independent pathways such as inhibition of S6K1 by AMPK are also considered to contribute to the effect of adiponectin / AdipoR1 in the insulin to increase insulin sensitivity.
  • PGC-1 ⁇ is an important regulator of mitochondrial content and function. It has been reported that the expression of PGC-1 ⁇ is regulated in several physiological situations.For example, in skeletal muscle, calcium ion signaling by molecules such as CaMK and CREB is partially responsive to exercise. It is adjusted by increasing (Nature 454, 463-469 (2008)). PGC-1 ⁇ activity is, for example, phosphorylated by AMPK (Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 12017-12022 (2007)) and deacetylated by AMPK and SIRT1 (Nature 434, 113-118 (2005)).
  • AMPK and SIRT1 could also be activated by exercise. It was also demonstrated that muscle-R1KO mice show a decrease in PGC-1 ⁇ expression as well as a decrease in PGC-1 ⁇ deacetylation. Consistent with this, adiponectin induces calcium ion influx by AdipoR1, thereby activating CaMKK ⁇ , which leads to increased PGC-1 ⁇ expression, and adiponectin / AdipoR1 activates AMPK and SIRT1, which It has also been demonstrated to induce deacetylation of PGC-1 ⁇ . These data indicate that adiponectin and AdipoR1 promote both increased expression and activation of PGC-1 ⁇ in a manner similar to exercise (FIG. 6e).
  • AdipoR1 and PGC-1 ⁇ are similar to those in obese diabetic db / db mice (FIGS. 12a-c) (Nature Genet. 34, 267-273). 2003)) and those with high risk of developing diabetes due to family history (Proc. Natl Acad. Sci. USA 100, 8466-8471 (2003)). These data indicate that adiponectin / AdipoR1 reduction may cause PGC-1 ⁇ dysregulation and mitochondrial dysfunction in pathophysiological situations such as obesity.
  • AdipoR1 is involved in the regulation of insulin sensitivity by several mechanisms (Fig. 13). The first is the activation of S6K1, which is reported to increase insulin phosphorylation of Ser 636/639 of IRS-1 (Nature 431, 200-205 (2004)), which can lead to insulin resistance. ing. S6K1 is critically inhibited by AMPK (J. Biol. Chem. 282, 7991-7996 (2007)). In skeletal muscle of muscle-R1KO mice, AMPK activation was decreased, but S6K1 activation and IRS-1 phosphorylation of Ser39636 / 639 were actually increased.
  • the second is increased oxidative stress, which has been linked to the cause of insulin resistance due to increased phosphorylation of Ser 302 in IRS-1 due to JNK activation (Nature 444, 860-867 2006 (2006)) ( Nature 440, 944-948 (2006)).
  • oxidative stress detoxification genes are critically regulated by AMPK and PGC-1 ⁇ (Cell 127, 397-408 (2006)), and the expression levels of these genes such as Sod2 and cat are reduced. However, it was associated with increased TBARS in skeletal muscle of muscle-R1KO mice.
  • the third is an increase in triglyceride content, which is related to insulin resistance due to increased phosphorylation of Ser 302 in IRS-1 by JNK activation (Nature 444, 860-867 (2006)).
  • Molecules involved in fatty acid oxidation are critically regulated by AMPK and PGC-1 ⁇ , and the expression levels of these genes such as Mcad were reduced, but it contains triglycerides in skeletal muscle of muscle-R1KO mice It is related to the increase in quantity. Consistent with the increase in TBARS and triglyceride content, JNK activation and phosphorylation of Ser ⁇ 302 in IRS-1 were actually increased.
  • AdipoR1 has a critical role in the physiological and pathophysiological importance of adiponectin in muscle, including calcium ion signaling, PGC-1 ⁇ expression and activation, mitochondrial function and oxidative stress, glucose and It is involved in the regulation of lipid metabolism and exercise tolerance.

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Abstract

　アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物のスクリーニング方法であって、被験化合物を細胞に接触させることにより細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じるか否かを判定し、細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じさせる被験化合物をアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物として選抜する工程を含む方法。

Description

アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物のスクリーニング方法
　アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物のスクリーニング方法に関する。
　Adipoqによりコードされるアディポネクチン(J. Biol. Chem. 270, 26746-26749 (1995); J. Biol. Chem. 271, 10697-10703 (1996); Biochem. Biophys. Res. Commun. 221, 286-289 (1996); J. Biochem. 120, 803-812 (1996))は抗糖尿病作用と抗アテローム形成作用を有するアディポカインである。血漿アディポネクチン濃度は肥満、インスリン抵抗性、及び2型糖尿病において減少していることが報告されている(Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20, 1595-1599 (2000))。アディポネクチンの投与はマウスにおいて血糖降下作用を引き起こし、インスリン抵抗性を改善するが(Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 2005-2010 (2001); Nature Med. 7, 941-946 (2001); Nature Med. 7, 947-953 (2001))、アディポネクチン欠損マウスではインスリン抵抗性及び糖尿病を示す(J. Biol. Chem. 277, 25863-25866 (2002); Nature Med. 8, 731-737 (2002))。アディポネクチンのインスリン感受性増加作用は、AMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK) (Nature Med. 8, 1288-1295 (2002); Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 16309-16313 (2002); Cell Metab. 1, 15-25 (2005))の活性化、及びさらにペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α(PPARα) (Nature 405, 421-424 (2000); J. Biol. Chem. 278, 2461-2468 (2003))による脂肪酸酸化の増加によるものと考えられる。
　アディポネクチン受容体1(以下、「AdipoR1」と略す場合がある)及びアディポネクチン受容体2(以下、「AdipoR2」と略す場合がある)をコードする相補的DNA (Adipor1及びAdipor2)のクローニングが報告されている(Nature 423, 762-769 (2003))。AdipoR1は骨格筋と肝臓中において多く発現され、一方、AdipoR2は肝臓中で主に発現される。両方の受容体とも7回膜貫通型ドメインを含むが(Nature 423, 762-769 (2003))、Gタンパク質共役型受容体とは構造的及び機能的に異なるものと予想されている(FASEB J. 11, 346-354 (1997); Nature 387, 620-624 (1997); EMBO J. 15, 3566-3578 (1996))。アディポネクチン受容体は新しい受容体ファミリーを構成するものとも考えられる。
　Adipor1及び/又はAdipor2ノックアウトマウスを用い、AdipoR1とAdipoR2がin vivoでアディポネクチンの主要な受容体として作用すること、及びin vivoにおけるブドウ糖と脂質の代謝、炎症及び酸化ストレスの調節において重要な役割を有することが示されている(Nature Med. 13, 332-339 (2007))。肝臓では、AdipoR1はAMPK経路を活性化し、AdipoR2はPPARα経路を活性化する(Nature Med. 13, 332-339 (2007))。一方、インスリン抵抗性はミトコンドリアの機能不全と関係していることが報告されているが(N. Engl. J. Med. 350, 664-671 (2004))、ミトコンドリアの機能不全の正確な原因はまだ確認されていない。アディポネクチン/AdipoR1信号伝達の低下がミトコンドリアの機能不全に関係している可能性もあるが、アディポネクチン/AdipoR1信号伝達の詳細は解明されていない。
　このような背景にあって、AdipoR1に対するアゴニストとなる化合物はブドウ糖と脂質の代謝、炎症、酸化ストレスの調節、血糖降下、及びインスリン抵抗性の改善作用などを発揮できる可能性があることから、医薬の有効成分としての有用性が期待される。しかしながら、従来、AdipoR1に対するアゴニストとなる候補化合物を効率的にスクリーニングする方法は開発されていない。
J. Biol. Chem. 270, 26746-26749 (1995) J. Biol. Chem. 271, 10697-10703 (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 221, 286-289 (1996) J. Biochem. 120, 803-812 (1996) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20, 1595-1599 (2000) Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 2005-2010 (2001) Nature Med. 7, 941-946 (2001) Nature Med. 7, 947-953 (2001) J. Biol. Chem. 277, 25863-25866 (2002) Nature Med. 8, 731-737 (2002) Nature Med. 8, 1288-1295 (2002) Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 16309-16313 (2002) Cell Metab. 1, 15-25 (2005) Nature 405, 421-424 (2000) J. Biol. Chem. 278, 2461-2468 (2003) Nature 423, 762-769 (2003) Nature 423, 762-769 (2003) FASEB J. 11, 346-354 (1997) Nature 387, 620-624 (1997) EMBO J. 15, 3566-3578 (1996) Nature Med. 13, 332-339 (2007) Nature Med. 13, 332-339 (2007) N. Engl. J. Med. 350, 664-671 (2004)
　本発明の課題は、アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物のスクリーニング方法を提供することにある。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、アディポネクチンがアディポネクチン受容体1に結合すると骨格筋細胞内へのカルシウムイオン(Ca2+)の取り込みが誘導されることを見出した。アディポネクチンがAdipoR1に結合することにより生じるカルシウムイオンの骨格筋細胞内への流入は、その後に引き起こされる筋細胞内でのアディポネクチンによるカルシウムイオン/カルモジュリン依存性のプロテインキナーゼキナーゼβ(CaMKKβ)の活性化、AMPK及びSIRT1の活性化、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター1α(PGC-1α)の発現増加及びアセチル化減少、並びにミトコンドリアの増加に必須であることも見出した。一方、アディポネクチン受容体1を筋特異的に破壊すると、細胞内でのアディポネクチンによるカルシウムイオン濃度増加が抑制され、CaMKK、AMPK及びSIRT1の活性化が低下すること、並びにAdipoR1を抑制した場合には、PGC-1αの発現及び脱アセチル化の低下、ミトコンドリア含有量及び酵素の減少、酸化的なＩ型筋繊維の減少、骨格筋内での酸化ストレス解毒酵素の減少が生じることも確認した。
　従って、本発明者らは、アディポネクチンとアディポネクチン受容体1との結合により誘導される種々の生理活性は、アディポネクチンがアディポネクチン受容体1に結合することにより最初に生じる骨格筋細胞内へのカルシウムイオンの取り込みにより誘導されることを明らかにしたが、この知見を基にして、アディポネクチン受容体1に対してアゴニスト作用を有する化合物を骨格筋細胞内へのカルシウムイオンの取り込みを指標としてスクリーニングできることを見出した。また、そのスクリーニング手段として、被験化合物を骨格筋細胞に接触させた後にカルシウムイオンの取り込みを例えば電気的な信号を確認することにより調べる手法や、AdipoR1の発現を欠損させた細胞とAdipoR1発現細胞にそれぞれ被験化合物を接触させてカルシウムイオンの取り込みを例えば電気的な信号を確認することにより調べる手法などを採用することができ、これらの手法をそれぞれ1次スクリーニング及び2次スクリーニングとして組み合わせることにより高速で、かつ精度の高いスクリーニングを行うことができることも見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
　すなわち、本発明により、アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物のスクリーニング方法であって、被験化合物を細胞に接触させることにより細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じるか否かを判定し、細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じさせる被験化合物をアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物として選抜する工程を含む方法が提供される。
　上記発明の好ましい態様によれば、細胞が骨格筋細胞である上記の方法；細胞がAdipoR1相補的RNAを注入したツメガエル卵母細胞である上記の方法；細胞内カルシウムイオン濃度の測定工程を含む上記の方法；細胞内カルシウムイオン濃度の測定をカルシウムイオン蛍光試薬を用いて蛍光強度により測定する上記の方法；細胞内カルシウムイオン濃度の測定を電気生理学的に測定する上記の方法；細胞としてアディポネクチン受容体1を発現させた細胞を用いる上記の方法；アディポネクチン受容体1を発現させた細胞が卵母細胞である上記の方法が提供される。
　さらに好ましい態様によれば、AdipoR1の発現を欠損させた細胞とAdipoR1発現細胞とにそれぞれ被験化合物を接触させて細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じるか否かを判定し、AdipoR1の発現を欠損させた細胞において細胞外カルシウムイオンの細胞内流入を実質的に生じさせず、AdipoR1発現細胞において細胞外カルシウムイオンの細胞内流入を生じさせる被験化合物をアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物として選抜する工程を含む方法が提供される。
　また、アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物のスクリーニング方法であって、下記の工程：
(a)被験化合物を細胞に接触させることにより細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じるか否かを判定し、細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じさせる被験化合物をアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物として選抜する工程；及び
(b)上記工程(a)で選抜されたアゴニスト候補化合物をAdipoR1の発現を欠損させた細胞とAdipoR1発現細胞とにそれぞれ接触させて細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じるか否かを判定し、AdipoR1の発現を欠損させた細胞において細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が実質的に生じさせず、AdipoR1発現細胞において細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じさせるアゴニスト候補化合物をアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト化合物として選抜する工程
を含む方法が提供される。
　上記発明の好ましい態様によれば、細胞が骨格筋細胞である上記の方法；細胞内カルシウムイオン濃度の測定工程を含む上記の方法；細胞内カルシウムイオン濃度の測定をカルシウムイオン蛍光試薬を用いて蛍光強度により測定する上記の方法が提供される。
　本発明の方法により、アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物を極めて簡便かつ高精度にスクリーニングすることができる。アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト化合物は、肥満の治療及び／又は予防、糖尿病の治療及び／又は予防のための医薬の有効成分として期待される。また、本明細書の実施例に詳細かつ具体的に説明されているように、アディポネクチン受容体1は、アディポネクチンと結合することにより骨格筋細胞において細胞外カルシウムイオンを細胞内に流入させるとともに、それによりカルシウムイオン信号伝達の調節、ブドウ糖と脂質の代謝調節、運動耐容能の調節、並びにAMPK/SIRT1によるPGC-1α発現及び活性化の調節やミトコンドリアの機能と酸化ストレスの調節に関与していることから、アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト化合物はアディポネクチン受容体1と結合することにより同様の生理作用を惹起することができ、各種の医薬の有効成分としての有用性が期待される。
　例えば、骨格筋細胞内でカルシウムイオン流入後に惹起されるこれらの生理学的な一連の変化は、運動後の骨格筋細胞における変化と実質的に同じであることから、アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト化合物を擬似的な運動効果をもたらす医薬の有効成分として利用することができ、例えば、運動療法の適用が難しい高齢者や歩行困難者などの糖尿病患者に対して運動療法に代えて、あるいは運動療法の補助的な医薬として適用することができる。
muscle-R1KOマウスの骨格筋におけるミトコンドリア、酸化的I型筋繊維及び運動能力の減少を示した図である。(a)から(k)は 5時間の絶食後の対照又はmuscle-R1ノックアウト(KO)から得られた骨格筋(a-g, i-k)における結果を示し、(a)AMPKのリン酸化及び量、(b)Ppargc1a、Esrra、Nrf1、Tfam、Cycs、mt-Co2、Mef2c、Acadm、Sod2、Cat及びSlc2a4のmRNAレベル、(c)PGC-1αタンパク質レベル、(d)ミトコンドリアDNAコピー数により評価したミトコンドリア含有量、(e)トロポニンI(slow)タンパクの量、(f) ヒラメ筋のATPase(pH 4.3、I型繊維) 染色(スケールバー：100μm)、(g)繊維型分析(f)に基づいたI型繊維の定量化、(h)運動耐容能、(i)β酸化、(j)トリグリセリド含有量、及び(k)TBARSの結果を示す。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=5-12)。*及び**は対照マウスと比較してそれぞれP＜0.05及びP＜0.01であることを示す。 muscle-R1KOマウスにおける異常なブドウ糖及びインスリンのホメオスタシスのメカニズムを示した図である。(a)から(f)は、対照及びmuscle-R1KOマウスでの高インスリン－正常血糖クランプ実験において、経口ブドウ糖負荷試験(OGTT)(1.5gのブドウ糖/ kg体重)の間(a,b)又はインスリン負荷試験(ITT)(0.25Uインスリン/kg体重)の間(c)における(a,c)血漿ブドウ糖及び(b)血漿インスリン、(d)内因性のブドウ糖生産(EGP)、(e)ブドウ糖消失率(Rd)、及び(f)ブドウ糖注入率(GIR)の結果を示す。　(g)から(l)は、5時間の絶食後の対照及びmuscle-R1KOマウスにおいて7.5分間にわたりインスリン(0.3U/kg体重)で処理した骨格筋、又は処理していない骨格筋における(g) IRS-1中のチロシンのリン酸化(pTyr)、(k) IRS-1中のSer 302のリン酸化、及び(l) IRS-1中のSer 636/639のリン酸化、(h) Aktのリン酸化及び量、(i) S6K1のリン酸化及び量、及び(j) JNKのリン酸化及び量を示す。IBは免疫ブロット法を示し、IPは免疫沈降を示す。値はすべてmean±s.e.mで示した。*及び**は3-5回の別個の実験(n=6-15)において、対照又は表示のものと比較してそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示し、NSは有意差なしを示す。 C2C12筋細胞においてアディポネクチン/AdipoR1がPGC-1αの発現と活性、及びミトコンドリアの生合成を増加させる結果を示した図である。(a)から(i)は、表示の時間アディポネクチンで処理したC2C12筋細胞(g)における、10μgml-1アディポネクチンで48時間(a,e,f)、あるいは1.5時間(b)又は2時間(c,d)処理し、表示のsiRNA二本鎖でトランスフェクトしたC2C12筋細胞(a-c)における、PGC-1αの野生型又は2A変異体型でトランスフェクトしたC2C12筋細胞(d,e)における、又はPGC-1αのR13変異体型でトランスフェクトしたC2C12筋細胞(f)における、又はアディポネクチンで処理した、あるいは未処理の対照又はmuscle-R1KOマウスからの骨格筋(h,i)におけるミトコンドリアDNAコピー数によって評価されるミトコンドリア含有量(a,e,f)、Ppargc1a mRNAレベル(b)、及びPGC-1αについて調べたアセチルリジン(Ac-Lys)レベル又はフラグ免疫沈降(c,d,h)、NAD+/NADH比(g, i)を示す。　上清をGAPDHに対するインプット対照としてブロットした(c, d, h)。C2C12筋細胞はすべての実験において筋原性分化の後に使用した。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=5-10)。*及び**は対照又は無関係なsiRNAと比較するか、あるいは表示のように比較した場合にそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示す。 C2C12筋細胞及びツメガエル卵母細胞におけるAdipoR1によるアディポネクチン誘導性カルシウムイオン流入を示した図である。a, アディポネクチン(30μgml-1)刺激の前及び1分後のfura-2の変化を示す画像である。赤は最大反応に相当する。下のトレースには、アディポネクチンの1分間刺激に対するC2C12筋細胞の平均カルシウム反応を、5mM EGTAを投与した時(黒バー)を含めて示した。トレースの周辺の影の部分はs.e.mを表わす。b-d, 1分間の30μgml-1アディポネクチン刺激に対する、無関係なsiRNA二本鎖又はAdipoR1 siRNA二本鎖でトランスフェクトしたC2C12筋細胞におけるAdipor1 mRNAレベル(b)、fura-2カルシウム反応(c)、及びそれらの強度(d)を示す。e-g, アディポネクチン(30μgml-1)に対応するAdipor1 cRNAを注入したか又は未注入の、あるいは5mM EGTA を加えたか又は無添加のツメガエル卵母細胞(脱分極パルスは+100mV)におけるAdipoR1蛋白の量(e)、アディポネクチン投与前(左)と投与30秒後(右)のカルシウムイオン活性化されたCl-電流の代表的なトレース(f)、及びそれらの強度(g)を示す。　[カルシウムイオン]i及び[カルシウムイオン]eは、細胞内及び細胞外のカルシウムイオン濃度をそれぞれ意味する。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=6-14)。*及び**は、無関係なsiRNA細胞又は対照と比較するか、あるいは表示のように比較した場合にそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示す。 アディポネクチン誘導性カルシウムイオン流入が、CaMKK及びAMPKの活性化、並びにPGC-1αの発現には必要であることを示した図である。a,b、5mM EGTAで20分間プレインキュベートするか又はインキュベートせずに、次いでアディポネクチン(30μgml-1)又はイオノマイシン(1μM)で5分間、あるいはAICAR(1mM)で1時間処理したC2C12筋細胞(a)における、又は表示のsiRNA二本鎖でトランスフェクトし、次いで30μgml-1アディポネクチンで5分間処理したC2C12筋細胞(b)における、AMPK のリン酸化及び量を示す。c、AraA(0.5 mM)で1時間、又はSTO-609(1μgml-1)で6時間、あるいはEGTA(5 mM)で20分間プレインキュベートし、次いでアディポネクチン(10μgml-1)で1.5時間処理したか又は無処理のC2C12筋細胞におけるPpargc1a mRNAの量を示す。d、対照マウス(上)及びmuscle-R1KOマウス(下)からのヒラメ筋におけるアディポネクチン(30μgml-1)刺激の前及び5分後のfura-2カルシウム反応の変化の代表的な画像。赤は最大反応に相当し、スケールバーは100μmを示す。e、トレースはdに示した領域のヒラメ筋のカルシウム反応を示す。アディポネクチンを表示の時間に投与した。f、ヒラメ筋に対する160秒間のアディポネクチン刺激によるfura-2カルシウム反応信号の強度を示し、ΔF比はアディポネクチン投与後の蛍光比の変化を示す。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=5-10)。*及び**は、対照又は無関係なsiRNA細胞と比較するか、あるいは表示のように比較した場合にそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示す。 muscle-R1KOマウスでの運動の効果を示した図である。a-d、2週間運動した後の対照及びmuscle-R1KOマウスの骨格筋におけるインスリン抵抗性指数(a)、ITTの間の血漿ブドウ糖レベルの血中濃度曲線下面積(AUC) (b)、ミトコンドリアDNAコピー数で評価したミトコンドリア含有量(c)、及びクエン酸シンターゼ(CS)酵素活性(d)を示す。結果は対照同腹子の値に対するパーセンテージで表示した(a, b)。e、筋肉細胞中におけるアディポネクチン/AdipoR1の信号伝達を説明した概念図である。CaMKKβとLKB1の両方がアディポネクチンが誘導するAMPKの最大活性化に必要である。AMPKとSIRT1はアディポネクチン/ AdipoR1誘導性のPGC-1α活性化に必要である。AdipoR1によるアディポネクチン誘導性カルシウムイオン流入によるCaMKKβ活性化はアディポネクチン誘導性のPGC-1α発現の増加に必要である。PGC-1αはアディポネクチン/AdipoR1で刺激されるミトコンドリア生合成に必要である。これらのデータから、本発明者らは、アディポネクチンとAdipoR1がカルシウムイオン信号伝達及びAMPKとSIRT1によるPGC-1αの発現と活性を増加させ、それがミトコンドリア生合成の増加に結びつくものと結論した。本発明者らは、in vitro及びin vivoでの機能獲得実験及び機能消失実験の両方で直接的な証拠を得ている分子(ただし、他の研究者によってPGC-1α発現を増加させることが既に報告されているCaMK ((Nature 454, 463-469 (2008)))を除く)に注目した。AC：アセチル化を示し、値はすべてmean±s.e.mで示した(n=5-8)。*及び**は、対照マウスと比較するか又は表示のように比較した場合にそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示す。 AdipoR1の筋特異的な破壊が骨格筋中のアディポネクチン作用の縮小を結果として招くことを示した図である。a, b、アディポネクチン(体重10gあたり30μg)で10分間処理した、又は無処理の骨格筋(a)及び肝臓(b)におけるAMPKのリン酸化及び量。c、アディポネクチン(体重10gあたり30μg)で10分間処理した、又は無処理の骨格筋におけるPGC-1α(Ppargc1a)mRNAレベル。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=5-8)。*及び**は対照マウスと比較した場合にそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示す。 muscle-R1KOマウスの骨格筋におけるミトコンドリア含有量と機能、及びII型繊維の減少を示した図である。a, b、ヒラメ筋の横断面をCox活性(a)及びSDH活性(b)に対して染色した。スケールバー：100μm。骨格筋は対照マウス又はmuscle-R1KOマウスから得た。c-e、骨格筋中のMHC IIa(c)、MHC IIx(d)及びMHC IIb(e)mRNAレベルを、RT-qPCRにより分析した。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=5-8)。*及び**は対照と比較した場合にそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示す。 siRNA二本鎖でトランスフェクトしたC2C12細胞におけるmRNA発現を示した図である。a-h、C2C12筋細胞をsiRNA二本鎖でトランスフェクトした。AdipoR1(Adipor1)(a)、CaMKKβ(Camkk2)(b)、AMPKα1(Prkaa1)(c)、AMPKα2(Prkaa2)(d)、PGC-1α(Ppargc1a)(e)、AdipoR2(Adipor2)(f)、SIRT1(Sirt1)(g)及びLKB1(Stk11)(h)mRNAレベルをRT-qPCRにより分析した。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=8-10)。**は無関係なsiRNA細胞と比較した場合にP<0.01であることを示す。 骨格筋におけるPGC-1αの総活性を示した図である。PGC-1αの発現と相対的な脱アセチルを掛け合わせて評価される総活性を示す。骨格筋は対照又はmuscle-R1KOマウスから得た。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=8-10)。*及び**は対照と比較した場合に、又は表示のように比較した場合にそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示す。 骨格筋におけるアディポネクチンで刺激されたCaMKIのリン酸化を示した図である。対照及びmuscle-R1KOマウスのアディポネクチン(体重10gあたり30μg)で5分間処理した、又は無処理の骨格筋におけるCaMKIのリン酸化及び量を示す。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=3-6)。*及び**は対照と比較して、又は表示のように比較した場合にそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示す。 db/dbマウスの骨格筋におけるミトコンドリア含有量の減少を示した図である。a,b、野生型 (WT)とdb/dbマウスの骨格筋におけるAdipor1(a)及びPpargc1a(b)mRNAレベルをRT-qPCRによって分析した。c、ミトコンドリアDNAコピー数によって評価されるミトコンドリア含有量。骨格筋はWTマウス又はdb/dbマウスから得た。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=5-10)。**はWTマウスと比較した場合にP<0.01であることを示す。 骨格筋におけるアディポネクチン/AdipoR1の作用を説明した概念図である。アディポネクチン/AdipoR1は、AMPKのリン酸化、PGC-1αの量及び活性、ミトコンドリアの生合成、I型筋繊維及びインスリン感受性を増加させた。 AdipoR1の筋特異的な破壊が骨格筋中のアディポネクチン作用の縮小を引き起こすことを示した図である。muscle-R1KOマウスの骨格筋におけるACCのリン酸化及び量。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=5)。**は対照マウスと比較した場合にP<0.01であることを示す。 muscle-R1KOマウスの骨格筋におけるミトコンドリア含有量及びI型繊維の減少を示した図である。a、改良Gomoriトリクローム染色。スケールバー：100μm。骨格筋は対照マウス又はmuscle-R1KOマウスから得た。b-e、骨格筋中のMHC I(b)、トロポニンI(slow)(Tnni1)(c)及びミオグロビン(Mb)(d)mRNAレベルをRT-qPCRによって分析した。e、図1fで分析した繊維型に基づいた繊維型分布の定量化。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=5-8)。*及び**は対照と比較した場合にそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示す。 muscle-R1KOマウスの骨格筋にとって重要なタンパクの発現レベルの減少を示した図である。a-e、骨格筋中のMEF2(a)、MCAD(b)、SOD2(c)、カタラーゼ(d)及びGlut4(e)タンパク。骨格筋は対照マウス又はmuscle-R1KOマウスから得た。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=4-8)。**は対照マウスと比較した場合にP<0.01であることを示す。 アディポネクチン処理したC2C12筋細胞におけるミトコンドリア量の増加を示した図である。a、AraA(0.5 mM)で1時間、又はSTO-609(1μg/ml)で6時間プレインキュベートし、次いで10μg/mlアディポネクチンで48時間処理したC2C12筋細胞における、ミトコンドリアDNAコピー数によって評価されるミトコンドリア含有量。b、C2C12筋細胞を10μg/mlアディポネクチンで48時間処理した後、100 nM MitoTrackerグリーンFMを加えて30分間インキュベートした。c、ミトコンドリア量は緑色蛍光で示されている。ミトコンドリア含有量はMitoTrackerグリーンを使用して測定した。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=5-8)。**は表示のように比較した場合にP<0.01であることを示す。 C2C12筋細胞及び骨格筋におけるNAD+及びNADH含有量を示した図である。a-d、表示した時間にわたりアディポネクチンで処理したC2C12筋細胞(a,b)及び骨格筋(c,d)におけるNAD+(a,c)及びNADH(b,d)含有量。骨格筋は対照マウス又はmuscle-R1KOマウスから得た。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=8-10)。*及び**は対照と比較して、又は表示のように比較した場合にそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示す。 muscle-R1KOマウスの骨格筋におけるPparα、Aco及びSlc2a4 mRNAレベル、並びに酸素(O2)消費及び呼吸商(RQ)を示した図である。a,b、対照マウス及びmuscle-R1KOマウスの骨格筋におけるPPARα(Ppara)(a)及びAco(Acox1)(b)mRNAレベルをRT-qPCRによって分析した。c,d、対照マウス及びmuscle-R1KOマウスにおける酸素(O2)消費(c)及び呼吸商(RQ)(d)の24時間平均値。e,f、対照マウス及びmuscle-R1KOマウスの腓腹筋(e)及びヒラメ筋(f)におけるGlut4(Slc2a4)mRNAレベルをRT-qPCRによって分析した。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=6-14)。*及び**は対照マウスと比較した場合にそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示す。 muscle-R1KOマウスの筋肉におけるカルシウム流入及びAICARの増加の効果を示した図である。a-d、対照マウス及びmuscle-R1KOマウスをカルシウムチャネルオープナーである0.25μM Bay-K 8644で処理し、又は無処理とした。f-i、対照マウス及びmuscle-R1KOマウスを溶媒又はAICAR(1日に体重1 kgあたり500mg、2週間)で処理した。a、muscle-R1KOマウスの、0.25μM Bay-K 8644で処理、又は無処理の骨格筋におけるCaMKIリン酸化の相対比。b、0.25μM Bay-K 8644で処理、又は無処理の骨格筋におけるAkt(Ser 473)のリン酸化及び量。c,h、ミトコンドリアDNAコピー数によって評価される、骨格筋中のミトコンドリア含有量。骨格筋はmuscle-R1KOマウスから得た。d,i、対照マウス及びmuscle-R1KOマウスの骨格筋におけるクエン酸シンターゼ酵素活性。e、AICAR(体重1 kgあたり500mgを2時間)で処理、又は無処理の骨格筋におけるAMPKのリン酸化及び量。f、インスリン抵抗性指数。インスリン抵抗性指数は、ブドウ糖負荷試験でのブドウ糖とインスリンの面積の積×10-2から計算した。結果は対照同腹子の値に対するパーセンテージで示した。g、インスリン負荷試験(ITT)の間の血漿ブドウ糖レベルの曲線下面積(AUC)。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=5-8)。*及び**は対照マウスと比較した場合にそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示す。 muscle-R1KOマウスにおけるレスベラトロール及び抗酸化剤MnTBAPの効果を示した図である。a-d、対照マウス及びmuscle-R1KOマウスを溶媒又はレスベラトロール(1日に体重1 kgあたり400mg、2週間)で処理した。e-i、対照マウス及びmuscle-R1KOマウスを溶媒又は抗酸化剤MnTBAP(1日に体重1 kgあたり10mg、2週間)で処理した。a,f、インスリン抵抗性指数。インスリン抵抗性指数は、ブドウ糖負荷試験でのブドウ糖とインスリンの面積の積×10-2から計算した。結果は対照同腹子の値に対するパーセンテージで示した。b,g、インスリン負荷試験(ITT)の間の血漿ブドウ糖レベルの曲線下面積(AUC)。c,h、ミトコンドリアDNAコピー数によって評価される骨格筋中のミトコンドリア含有量。骨格筋は対照マウス又はmuscle-R1KOマウスから得た。d,i、対照マウス及びmuscle-R1KOマウスの骨格筋におけるクエン酸シンターゼ酵素活性。e、溶媒又は抗酸化剤MnTBAP(1日に体重1 kgあたり10mg、2週間)で処理した対照マウス及びmuscle-R1KOマウスの骨格筋における活性酸素種(ROS)であるH2O2の生産。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=5-8)。*及び**は対照マウスと比較して、又は表示のように比較した場合にそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示す。 C2C12筋細胞におけるAktのインスリン誘導性リン酸化、骨格筋におけるFOXO1リン酸化、及びC2C12筋細胞におけるPGC-1αアセチル化の量を示した図である。a、10μg/mlアディポネクチンで48時間処理、又は無処理にて、次いで10 nMインスリンで10分間処理、又は無処理の場合におけるC2C12筋細胞におけるAktのリン酸化(Ser 473)及び量。b、インスリン(体重1 kg当たり0.3 U)で7.5分間処理、又は無処理のmuscle-R1KOマウス骨格筋のFOXO1のリン酸化(Thr 24及びSer 253)及び量。c、C2C12筋細胞をSIRT1 siRNA二本鎖でトランスフェクトし、その後、アディポネクチン(10μg/ml)で2時間処理、又は無処理でアセチルリジンレベルをPGC-1α免疫沈降(IP)で調べた。上清をGAPDHに対するインプット対照としてブロットした。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=6-10)。*及び**は対照と比較して、又は表示のように比較した場合にそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示す。 C2C12筋細胞及びツメガエル卵母細胞におけるAdipoR1によるアディポネクチン誘導性の内向き電流反応を示した図である。a、無関係なsiRNA二本鎖(上トレース)及びAdipoR1 siRNA二本鎖(下トレース)でトランスフェクトしたC2C12筋細胞についての、30μg/mlアディポネクチンによる30秒間の刺激に対する全細胞の内向き電流反応。保持電位は-60mVとした。b、アディポネクチンに対する全細胞の内向き電流反応におけるAdipoR1ノックダウンの効果。c、-80mVの保持電位で記録されたアディポネクチンに対する、AdipoR1 cRNAを注入(上)した、又は無注入(下)の卵母細胞における代表的な電流トレース。アディポネクチン(30μg/ml)は四角で示されている時点に30秒間で投与した。d、AdipoR1 cRNAを注入した、又は無注入の卵母細胞に、5 mM EGTAも使用した、あるいは無使用の場合におけるアディポネクチン(30μg/ml)に対する内向き電流反応の強度。[カルシウムイオン]e：外部のカルシウムイオン濃度。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=6-14)。*及び**は無関係なsiRNA細胞と比較して、又は表示のように比較した場合にそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示す。 BAPTA-AM又はU73122の存在下でアディポネクチンで刺激されたAMPKのリン酸化を示した図である。a,b、C2C12筋細胞におけるAMPKのリン酸化及び量。C2C12筋細胞に50μM BAPTA-AMを加えて30分間、又は5 mM EGTAを加えて20分間プレインキュベートし、アディポネクチン(30μg/ml)で5分間処理した(a)。C2C12筋細胞に10μM  U73122を加えて30分間、又は5 mM EGTAを加えて20分間プレインキュベートし、アディポネクチン(30μg/ml)で5分間処理した(b)。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=3-6)。*及び**は対照と比較して、又は表示のように比較した場合にそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示す。 EGTAの存在下でアディポネクチンに刺激されたCaMKI、AMPK及びHDAC5のリン酸化を示した図である。a、C2C12筋細胞におけるCaMKI、AMPK、HDAC5のリン酸化及び量。C2C12筋細胞にEGTA(5 mM)を加えて、又は無添加で20分間プレインキュベートし、次いでEGTA(5 mM)を添加し、又は無添加で、アディポネクチン(30μg/ml)を添加又は無添加で0、0.5、1、2、5、10、20分間処理した。b、CaMKI(上パネル)、AMPK(中パネル)及びHDAC5(下パネル)レベルのリン酸化及び量の、免疫ブロット(a)のデンシトメトリーによる定量。c、CaMKI(上パネル)、AMPK(中パネル)及びHDAC5(下パネル)レベルのリン酸化及び量の、免疫ブロット(a)のデンシトメトリーによる定量。各時点の結果をアディポネクチンを加えていない（対応対照）カルシウムイオンフリーの培地中でのインキュベーション間の基底状態での変化について補正した。値はすべてmean±s.e.mで示した(n=3-8)。*及び**は対照と比較して、又は表示のように比較した場合にそれぞれP<0.05及びP<0.01であることを示す。 muscle-R1KOマウスの作成及び特性決定を示した図である。a、Adipor1遺伝子ターゲティング戦略の略図。muscle-R1KOマウスは、形質転換してMCKプロモーター(MCK-Cre)の調節下でcreレコンビナーゼを発現する動物に対してfloxed Adipor1対立遺伝子を持つマウスを交配することにより作成した。b、C57Bl/6バックグラウンドの対照マウス及びmuscle-R1KOマウスの肝臓、SKM(骨格筋)、WAT(白色脂肪組織)及びBAT(褐色脂肪組織)からのゲノムDNAのサザンブロット分析。XbaIで切断したマウス・ゲノムDNAをaで示したプローブでハイブリダイズした。c、C57Bl/6バックグラウンドの対照マウス及びmuscle-R1KOマウスの肝臓、SKM、WAT及びBAT中に発現したAdipor1 mRNAのノーザンブロット解析。
　本発明の方法は、アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物のスクリーニング方法であって、被験化合物を細胞に接触させることにより細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じるか否かを判定し、細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じさせる被験化合物をアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物として選抜する工程を含むことを特徴としている。
　本明細書において「アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト化合物」の用語は、このアゴニスト化合物がアディポネクチン受容体1に結合した際に、アディポネクチン受容体1の生体内リガンドであるアディポネクチンがアディポネクチン受容体1に結合した場合に引き起こされる種々の生理作用の全て、又はその一部を惹起することができ、アディポネクチンと同様の生理作用を発揮できる化合物を意味している。「アゴニスト候補化合物」とはアゴニスト化合物としての可能性を少なくとも有している化合物のことである。
　被験化合物の種類は特に限定されず、低分子有機化合物のほか、オリゴペプチドやポリペプチド類、核酸類、糖類、脂質類など、任意の化合物をスクリーニングに供することができる。多くの化合物を集積した化合物ライブラリーが多数構築されているので、そのようなライブラリーに登録された多数の化合物をスクリーニングに供することが効率的である。
　被験化合物を接触させる細胞の種類は特に限定されず、AdipoR1が発現されている細胞であれば任意の体細胞を用いることができるが、好ましくはAdipoR1が多量に発現されている細胞、例えば骨格筋細胞を用いることができる。また、AdipoR1をコードする遺伝子を導入することによりAdipoR1を発現させた細胞を用いることもできる。このような場合には、例えば卵母細胞などを用いることも好ましい。もっとも、細胞は骨格筋細胞や卵母細胞に限定されることはない。
　被験化合物を細胞に接触させるにあたっては、所定濃度のカルシウムイオン濃度に調整した培地中に細胞を入れ、所定濃度に調整した被験化合物の溶液を添加するなどの一般的な手法を採用することができるが、この手法に限定されることはない。
　細胞外カルシウムイオンの細胞内流入を検出する手法としては当業者に利用可能な任意の方法を利用することができる。一般的には、カルシウムイオンの流入により増加した細胞内カルシウムイオン濃度を測定することにより細胞外カルシウムイオンの細胞内流入を検出することができる。検出手段としては、例えば、カルシウムイオンを捕捉して蛍光を発するカルシウムイオン蛍光試薬(カルシウムイオン蛍光プローブ)を用いて蛍光強度により検出する方法、又はカルシウムイオンの細胞内流入に起因して生じる電流を電気生理学的に検出する方法などを挙げることができ、これらを組み合わせて用いることもできるが、これらの特定の手段に限定されることはない。
　カルシウムイオン蛍光試薬としては、例えば、Fluo 4-AM、Fluo 3、Fluo 3-AM、Fura 2、Fura 2-AM、Indo 1、Indo 1-AM、Quin 2、Rhod 2、Rhod 2-AMなどが市販されているので、細胞の種類や被験化合物の種類などに応じて適宜選択して使用することができる。例えばFura 2-AMなどは脂溶性のアセトキシメチル基の存在により細胞外から速やかに細胞内に取り込まれた後に加水分解を受けてFura 2となりカルシウムイオンと結合して高強度の蛍光を発するので、細胞内のカルシウムイオン濃度測定に好適に使用することができる。細胞内カルシウム濃度測定用の蛍光試薬に関しては、例えば、ファルマシア,26, pp.544-546  (1990)などを参照することができる。
　カルシウムイオン蛍光試薬を用いる場合には、細胞内に流入したカルシウムイオンとカルシウムイオン蛍光試薬とが結合することによりカルシウムイオン濃度に依存した蛍光強度が得られるので、蛍光強度を指標として細胞内カルシウム濃度を測定することができる。蛍光強度の測定には、通常の蛍光顕微鏡での観察やイメージングなどの任意の手法を採用することができ、一般的には検量線を用いて蛍光強度の増加分から細胞内カルシウム濃度の増加を検出することができる。
　細胞内カルシウムイオン濃度の測定を電気生理学的に測定する方法としては、例えば、本明細書の実施例に具体的に示したように、例えばアディポネクチン受容体1を発現させた細胞を用いて、カルシウムイオンの流入に起因して生じる電流(例えばカルシウムイオンの流入により活性化された塩素イオンによる電流など)を一般的な電気生理学的測定手段により検出することができる。電気生理学的に電気シグナルを指標として測定を行う方法は、一度に大量の細胞のシグナルを検出することができ、安価な装置を用いて電気信号を高速に検出することができることからハイスループットスクリーニングに適している。
　細胞内カルシウムイオン濃度の測定を測定するにあたり、例えば、細胞としてアディポネクチン受容体1を発現させた細胞を用いることも好ましい。このような目的には、例えば本明細書の実施例に具体的に説明したように、例えば卵母細胞などの細胞にアディポネクチン受容体1をコードする遺伝子を導入して発現させた細胞を用いることができる。もっとも、細胞の種類や遺伝子の導入手段などは特に限定されることはない。
　このようにして、被験化合物のなかから細胞外カルシウムイオンの細胞内流入を生じさせる被験化合物が見出された場合には、その被験化合物をアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物として選抜することができる。この候補化合物は、アディポネクチン受容体1に結合した際に、アディポネクチン受容体1の生体内リガンドであるアディポネクチンがアディポネクチン受容体1に結合した場合に引き起こされる種々の生理作用の全て、又はその一部を惹起できる可能性を有する化合物である。
　本発明のさらに好ましい態様では、AdipoR1の発現を欠損させた細胞とAdipoR1発現細胞とにそれぞれ被験化合物を接触させて細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じるか否かを判定し、AdipoR1の発現を欠損させた細胞において細胞外カルシウムイオンの細胞内流入を実質的に生じさせず、AdipoR1発現細胞において細胞外カルシウムイオンの細胞内流入を生じさせる被験化合物をアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物として選抜する工程を含むことを特徴としている。
　AdipoR1の発現を欠損させた細胞としては、好ましくは骨格筋細胞においてAdipoR1の発現を欠損させた細胞を用いることができるが、例えば、本明細書の実施例に具体的に示された方法に従って筋肉特異的にAdipoR1をノックアウトした動物(muscle-R1KO動物)を作製して、この動物から筋肉組織や筋肉細胞を分離・採取して使用することができる。もっとも、AdipoR1の発現を欠損させた細胞の調製方法は上記の特定の方法に限定されることはなく、当業者に利用可能な任意の方法により所望の細胞を調製できることは言うまでもない。
　上記の好ましい態様により、AdipoR1の発現を欠損させた細胞において細胞外カルシウムイオンの細胞内流入を実質的に生じさせず、かつAdipoR1発現細胞において細胞外カルシウムイオンの細胞内流入を生じさせる被験化合物をアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物として選抜することができるが、この方法は高い精度を有していることから、この方法により選抜されたアゴニスト候補化合物はアゴニスト化合物として作用できる可能性が非常に高い化合物である。
　本発明のさらに好ましい態様では、被験化合物を細胞に接触させることにより細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じるか否かを判定する工程を一次スクリーニングとして採用し、そのスクリーニングにより選抜された候補化合物をAdipoR1の発現を欠損させた細胞とAdipoR1発現細胞とにそれぞれ接触させて細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じるか否かを判定する工程を二次スクリーニングとして採用することにより、さらに効率的かつ高精度なスクリーニングを達成することができる。多数の被験化合物を含むライブラリーからアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト化合物を効率的に選抜するために上記の二段階スクリーニングは極めて有用である。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
A.方法
　マウスとしては実験時に8-10週齢のものを用いた。muscle-R1KOマウスの運動能力の測定については、トレッドミル運動負荷試験のレジメを20分間及び15 m/分とし、運動耐容能は20分をマウスが電気刺激を回避することができなかった回数で割ることにより評価した。C2C12細胞による筋原性分化の誘導は文献記載の方法(Nature Med. 8, 1288-1295 (2002))により行った。5日目までに細胞は多核収縮筋細胞に分化していた。C2C12筋細胞はすべての実験において筋原性分化の後に使用した。
　PGC-1α及びPGC-1α-2A変異体をコードするプラスミドは、B.M. Spiegelman博士から入手し、すべて文献記載のとおりである(Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 12017-12022 (2007))。PGC-1α-R13変異体をコードするプラスミドは、P.Puigserver博士から入手し、すべて文献記載のとおりである(Nature 434, 113-118 (2005))。統計分析の結果はmean±s.e.mで示した。2つのグループ間の差異は不対両側t検定を用いて評価した。2個より多いグループを含むデータは分散分析(ANOVA)により評価した。
　以下、方法の詳細について説明する。
(1)muscle-R1KOマウスの作成
　第三のloxPサイトがAdipor1遺伝子のイントロン2に導入され、floxed(loxPが導入された)ネオマイシン耐性遺伝子(neoR)がAdipor1遺伝子のイントロン5へ導入されたAdipor1のための標的ベクターを構築した(図20a)。培養、J1胚性幹(ES)細胞(129/Sv)のエレクトロポレーション及び相同組換クローン用スクリーニングの方法は、J. Biol. Chem. 277, 25863-25866 (2002)に記載の方法に若干の変更を加えた。雄のキメラマウスをC57Bl/6雌マウスと掛け合せてヘテロ(Adipor1lox/+)マウスを作成し、別個に作成した2匹の雄のキメラマウスからのF1子孫をC57Bl/6雌マウスと掛け合せて、F2マウスを得た。両方のマウス系とも本研究で行った全実験を通じて同一の表現型を示した。その後、本発明者らはAdipor1lox/+マウス (C57Bl/6及び129/svバックグラウンド)とC57Bl/6マウスの5回を超える回数の戻し交配を行った。
　形質転換されて筋肉クレアチンキナーゼプロモーター(MCK-Cre)の調節下でcreレコンビナーゼを発現する動物は、ジョスリン糖尿病センター（ボストン(MA)、アメリカ）のC.R.Kahn博士から入手した。この動物とC57Bl/6マウスの5回を超える回数の戻し交配を行った。
　Adipor1lox/+マウスをMCK-Creマウスと異種交配させてMCK-Cre Adipor1lox/+マウスを作成した。MCK-Cre Adipor1lox/+マウスはAdipor1lox/loxマウスと交配させて、Adipor1lox/+、MCK-Cre Adipor1lox/+、Adipor1lox/lox及びMCK-Cre Adipor1lox/lox(muscle-R1KO)マウスをそれぞれ得た。MCK-Cre及びAdipor1lox/loxマウスは表現型としては判別不能だった;Adipor1lox/loxマウスは対照として使用した。この研究の実験はすべて雄の同腹子で行った。
　マウスはケージに入れて、12時間の明暗サイクルで飼育した。すべての実験において、飼料として以下の組成の標準飼料(CE-2、CLEAジャパン社)を使用した：25.6%(wt/wt)のタンパク質、3.8%の繊維質、6.9%の灰分、50.5%の炭水化物、4%の脂肪及び9.2%の水分(Nature Med., 13, 332-339 (2007))。
(2)muscle-R1KOマウスにおけるAdipoR1及びAdipoR2の発現レベル。
　floxed AdipoR1対立遺伝子を有する動物と、形質転換により筋肉クレアチンキナーゼプロモーター(MCK-Cre)の調節下でcreレコンビナーゼを発現するマウス(Mol. Cell, 2, 559-569 (1998)とを交配させることによってmuscle-R1KOマウスを作成した(図26a,b)。ノーザンブロッティング(図26c)及びリアルタイムPCR(データ非表示)から、muscle-R1KOマウスの腓腹筋及びヒラメ筋ではAdipoR1 mRNA発現が対照マウスで見られたそれの約5%にまで劇的に縮小されていることが明らかになった(図26c)。肝臓や脂肪組織のようなAdipoR1を発現することが知られている他の組織も検査したが、AdipoR1転写レベルの著しい変化はいずれにも見られなかった(図26c)。AdipoR1発現は心臓では約70%に減少したが、非筋肉組織では変化せず、このことはAdipoR1の筋肉特異的なノックアウトが筋肉において成功しており、また特異的であることを示していた。重要なことに、これらの組織のいずれもAdipoR2レベルの代償性のいかなる増加調節も示さず、また血漿アディポネクチンレベルの有意な変化はなかった。
(3)遺伝子型決定
　PCRを用いてマウスの遺伝子型決定を行った。AdipoR1遺伝子型決定に2つのプライマーを使用した：フォワードプライマーとして5'-ACA GGC ACA TAA CAT CTA AGG CA -3'及びリバースプライマーとして5'-AGC ATG ATA CTG AGT TGG CCA CA-3'を用いた。floxed AdipoR1遺伝子の検出における2個のプライマーとしては、5'-CGG TGT TGA CGA GGC GTC CGA AG -3'及び5'-GGT CTT CGG GAT GTT CTT CCT G -3'を用いた。Creの検出に用いたプライマーは、5'-CGC CGC ATA ACC AGT GAA AC -3'、5'-ATG TCC AAT TTA CTG ACC G-3'、5'-ACA GCG TGA ATT TTG GAG TCA GAA-3'及び5'-GCT TTG CTC AGC CTC GCT AT -3'とした。
(4)in vivoでのAMPKリン酸化
　in vivoでのAMPKリン酸化を研究するために、下大静脈カテーテルによりマウスに体重10gあたり30μgの組み換えネズミ・アディポネクチンを静脈内注射した(Nature Med. 8, 1288-1295 (2002))。それにより血漿アディポネクチンレベルがおよそ30μg/mlに増加した；このことは、本研究で使用したアディポネクチン用量が内因性のアディポネクチンレベルに匹敵したことを示している。マウスの全長アディポネクチンは以下の文献記載の方法により作成した(Nature Med. 8, 1288-1295 (2002); Nature Med. 7, 941-946 (2001); Nature 423, 762-769 (2003))。
(5)サザンブロット、ノーザンブロット、リアルタイムPCR及び免疫ブロッティング
　ノーザンブロットは文献記載の方法に従って行った(Nature Med. 13, 332 - 339 (2007); Nature 423, 762-769 (2003))。全RNAはメーカーの説明書に従ってTrizol (Invitrogen)を用いて細胞又は組織から調製した。AdipoR1のcDNAプローブテンプレートは特異的プライマーを用いるRT-PCRよって調製した。フォワードプライマーとしては5'-GCTGAGGAAGATCAAGCATGCCCGGTG -3'、リバースプライマーとしては5'-TTGGAAAAAGTCCGAGAGACCTTCTCTG -3'を用いた。
　サザンブロットは文献記載の方法に従って行った(Nature Med. 13, 332 - 339 (2007); J. Biol. Chem. 281, 26602-26614 (2006))。XbaIで切断したマウスのゲノムDNAをプローブを用いてハイブリダイズした。AdipoR1のcDNAプローブテンプレートは特異的プライマーを用いるRT-PCRよって調製した。フォワードプライマーは5'-TGTCCACCATCACAGGAAGA'-3であり、リバースプライマーは5'-GCTTGCCCTTCTCCTCCA -3'とした。
　リアルタイムPCRは文献記載の方法に従って行った(Nature Med. 13, 332 - 339 (2007); Nature 423, 762-769 (2003); J. Biol. Chem. 281, 8748-8755 (2006))。全RNAはメーカーの説明書に従ってTrizol (Invitrogen)を用いて細胞又は組織から調製した。mRNAの定量はリアルタイムPCR方法(Nature 423, 762-769 (2003))に若干の変更を加えて行った。免疫ブロッティングに使用した手順は文献記載のものである(Nature Med. 7, 941-946 (2001); J. Biol. Chem. 281, 26602-26614 (2006); J. Biol. Chem. 281, 8748-8755 (2006))。肝臓又は筋肉はin situで液体窒素で凍結固定した(Nature Med. 7, 941-946 (2001); J. Biol. Chem. 281, 26602-26614 (2006); J. Biol. Chem. 281, 8748-8755 (2006))。
AMPKα、PGC-1α、トロポニンI、IRS-1、Akt、S6K1、JNK、CaMKI、MEF2、MCAD、SOD2、カタラーゼ、Glut4、HDAC5及びFOXO1のリン酸化及び/又はタンパク質レベルは文献記載の方法により測定した(EMBO J. 19, 989-996 (2000); Nature Med. 7, 941-946 (2001); J. Biol. Chem. 281, 26602-26614 (2006); J. Biol. Chem. 281, 8748-8755 (2006); Nature 458, 1056-1060 (2009); Cell Metab. 4, 75-87 (2006); Nature 444, 860-867 (2006); Steroids 72, 422-428 (2007))。3-5-非依存性実験の1つからの代表的なデータを示す。
(6)C2C12細胞
　マウスC2C12筋原細胞を10%(v/v)ウシ胎児血清を含む90%ダルベッコ改良・高グルコース・イーグル培地中で培養した。細胞が80%コンフルエントに達した時点で、培地を低血清分化誘導用培地(98%ダルベッコ改良・高グルコース・イーグル培地、2.5%(v/v)のウマ血清)に置き換えることにより、筋原細胞を筋細胞に分化するように誘導した。培地は毎日交換した。C2C12細胞は、ポフェクタミン2000(Invitrogen)を使用し、メーカーの説明書に従ってトランスフェクトした。
(7)ミトコンドリア含有量分析
　ミトコンドリア含有量の分析は文献記載の方法(Cell Metab. 4, 75-87 (2006))に若干の変更を加えて行った。ミトコンドリア含有量の定量は、文献記載の方法(Obes. Res. 13, 574-581 (2005))により mtDNA及びMitoTrackerグリーンプローブ(Molecular Probes)を用いて行った。MitoTrackerグリーンプローブは、ミトコンドリアの膜電位にかかわらずミトコンドリア内に優先的に蓄積し、ミトコンドリア質量の正確な評価を行うことができる。細胞をPBSで洗浄し、100nM MitoTrackerグリーンFM(Molecular Probes)を加えて37℃で30分間培養した。トリプシン/EDTAを用いて細胞を回収し、PBSに再懸濁した。蛍光強度を490及び516nmの励起波長及び発光波長をそれぞれ用いて検出し、測定値は全タンパク質(mg/ml)に対応するように補正した。
(8)組織学的分析
　光学顕微鏡及び組織化学的分析法を用いて、muscle-R1KOマウスの骨格筋(ヒラメ筋)におけるI型繊維遺伝子発現の変化と実際の筋繊維形態の間の関係を調べた。I型及びII型繊維の間の識別は種々のpH値でのミオシンATPase染色によって行うことができる。特に、pH 4.3ではI型繊維はよく染まるが、II型繊維は染まらない(Physiol. Rev. 80, 1215-1265 (2000))。筋肉サンプルは液体窒素で冷却したイソペンタン中に冷凍し、横方向の連続切片を改良Gomori トリクロームで染色した(J. Neurol. Sci. 26, 479-488 (1975))。シトクロムcオキシダーゼ(COX)( J. Cell Biol. 38, 1-14 (1968))及びコハク酸デヒドロゲナーゼ(SDH)活性(A Modern Approach,Muscle Biopsy. (Saunders, London, 1973))を酵素組織化学的に分析して評価した。
(9)H2O2測定
　血漿H2O2レベルはAmplex Red過酸化水素アッセイキット(Invitrogen)( J. Clin. Invest. 118, 789-800 (2008))を用いて測定した。ミトコンドリアのH2O2レベルはAmplex redホースラディッシュペルオキシダーゼ法(Molecular Probes)( Anal. Biochem. 253, 162-168 (1997))により測定した。
(10)脂質代謝、脂質過酸化反応及び他の材料
　骨格筋ホモジネートを抽出し、組織トリグリセリド含有量を文献記載の方法(Nature Med. 8, 1288-1295 (2002); Nature Med. 7, 941-946 (2001); J. Biol. Chem. 278, 2461-2468 (2003))に若干の変更を加えて測定した。酸化ストレスが増加したかどうかを調べるために、文献記載の方法に従って血漿チオバルビツル酸反応性物質(TBARS)に代表されるような酸化的損傷のマーカーによって脂質過酸化反応を測定した(J. Biol. Chem. 278, 2461-2468 (2003))。組織サンプルを50mM Tris-HCl(pH 7.4)及び1.15%KClを含む緩衝液中でホモジナイズした後、遠心分離にかけた。上清をアッセイに使用した。組織ホモジネート及び血漿中の脂質過酸化反応のレベルをLPOテスト(和光純薬工業)を使用してTBARSの量で測定した。化学物質を含む他の全ての材料は参考文献(Nature Med. 8, 1288-1295 (2002); Nature Med. 7, 941-946 (2001); Nature 423, 762-769 (2003); J. Biol. Chem. 281, 26602-26614 (2006); J. Biol. Chem. 281, 8748-8755 (2006); J. Biol. Chem. 279, 30817-30822 (2004))中に記載される供給元から入手した。
(11)血液サンプルのアッセイ
　血漿ブドウ糖レベルはグルコースBテスト(和光純薬工業)を使用して測定した。血漿インスリンはインスリンイムノアッセイ(Shibayagi)により測定した。
(12)高インスリン－正常血糖クランプ実験
　クランプ実験は文献記載の方法(J. Biol. Chem. 281, 26602-26614 (2006); J. Biol. Chem. 281, 8748-8755 (2006))に若干の変更を加えて行った。実験の2-3日前にペントバルビタールナトリウムによる全身麻酔下で右頚静脈中に注入カテーテルを挿入した。実験は6時間の絶食の後、覚醒してストレスの無い条件下のマウスで行った。インスリンのprimed continuous infusion法(Humulin R, Lilly)を行い(3.0 ミリユニット/kg/min)、ブドウ糖投与( [6,6-2H2]ブドウ糖で20%に濃縮した10mlあたり5gのブドウ糖(シグマ))により血中ブドウ糖濃度を5分毎にモニターして120分間120mg/dlに維持した。血液は尾部先端から90、105及び120分後にサンプリングしてブドウ糖消失率(Rd)を測定した。Rdは非定常状態方程式によって計算し、内因性ブドウ糖生産(EGP)をRdと外因性ブドウ糖注入率との間の差として求めた(J. Biol. Chem. 281, 26602-26614 (2006); J. Biol. Chem. 281, 8748-8755 (2006))。
(13)運動療法
　使用したトレッドミル運動試験のレジメは2週間、1日当たり30分間、15m//分とした。
(14)RNA干渉
　2対のsiRNAsを、リポフェクタミンRNAiMAX(Invitrogen)を使用して、化学的に合成しアニリーングしてC2C12筋細胞中にトランスフェクトした(J. Biol. Chem. 278, 2461-2468 (2003))。センスsiRNAsの配列は以下のとおりである、
マウスAdipoR1：GAGACUGGCAACAUCUGGACATT；
マウスAdipoR2：GCUUAGAGACACCUGUUUGUUTT。
AMPKα1、AMPKα2、CaMKKβ、PGC-1α、SIRT1及びLKB1 siRNAは、アプライド・バイオシステムズから購入した。非機能性jumbled siRNA(関連性なし)(アプライド・バイオシステムズ)でトランスフェクトした細胞を陰性対照として使用した。トランスフェクションの48時間後に、細胞を溶解した。
(15)NAD+/NADH測定
　NAD+及びNADHヌクレオチドは文献記載の方法(Nature 458, 1056-1060 (2009))により直接測定した。全体骨格筋又は2枚の10cmデッシュのC2C12筋細胞を200μlの酸抽出バッファー中でホモジナイズしてNAD+濃度を測定するか、あるいは200μl のアルカリ抽出によりNADH濃度を測定した。次に、ホモジネートを中和し、サンプル5μlを使用して酵素による循環反応を行った後に蛍光法でヌクレオチド濃度を測定した。両方のヌクレオチドに対する値は線形範囲内に検知された。各動物又は各実験中の平行細胞デッシュから得られた比率の比較により、NAD+/NADH比を計算した。
(16)C2C12筋細胞中のカルシウム画像
　ガラスベースデッシュ(IWAKI)上で培養されたC2C12筋細胞を2.5μM fura-2/AMで30分間処理した。Aquacosmosカルシウム画像システム(浜松フォトニクス)で蛍光を測定した。リガンドは、灌流リンゲル溶液(140 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 5mM HEPES, 2.0 mMピルビン酸ナトリウム塩, 1.25 mM KH2PO4, 2.0 mM CaCl2, 2.0 mM MgCl2, 9.4 mM D-グルコース(pH 7.4))によって供給した。カルシウムキレート化実験については、EGTA溶液(140 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 5 mM HEPES, 2.0 mMピルビン酸ナトリウム塩, 1.25 mM KH2PO4, 2.0 mM MgCl2, 5.0 mM EGTA-2Na, 9.4 mM D-グルコース (pH 7.4))を槽溶液として用いた。fura-2蛍光比をカルシウムイオン信号に換算した。
(17)ツメガエル卵母細胞における遺伝子発現及び電気生理学的記録
　V期ないしVII期の卵母細胞を、室温で1ないし2時間、カルシウムイオンフリーの食塩水(82.5 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2及び5 mM HEPES, pH 7.5)中で2 mg/mlコラゲナーゼS-1(新田ゼラチン)で処理した。次いで、mAdipoR1用の50 ngのcRNAを卵母細胞に微量注入した。cRNAは線形修飾pSPUTKから合成した。注入処理した卵母細胞を10μg/mlのペニシリン及びストレプトマイシンを添加した浴槽溶液(88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.3 mM Ca(NO3)2, 0.4 mM CaCl2, 0.8 mM MgSO4, 2.4 mM NaHCO3, 15 mM HEPES, pH 7.6)中、18℃で3日間培養した。
　全細胞電流を2-電極電圧クランプ法で記録した。細胞内ガラス電極に3M KClを充填した。信号をOC-725C増幅器(Warner Instruments)で増幅し、50Hzのローパスフィルタにかけ、1 kHzでデジタル化した。対照の槽溶液は、115 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2及び10 mM HEPESを含み、NaOHでpH 7.2に滴定した。カルシウムイオンフリーの溶液として、CaCl2の代わりに1.8 mM BaCl2を含む溶液を用いた。内向き電流は-80mVの保持電位でモニターした。-80mVの保持電位から+100 mV及び+50 mVの500-msec脱分極パルスを加えることによりカルシウムイオン活性化Cl-電流をモニターした。アディポネクチンはコンピューター制御のソレノイドバルブに接続したシリコン・チューブを経て灌流槽溶液中に供給した。データ収集と分析はDigidata 1322A及びpCLAMPソフトウェアを使用して行った。
(18)骨格筋中のカルシウム画像
　マウスのヒラメ筋の切片を8-10週齢マウスから切り出した。標本を0.1%のクレモフォア EL(Sigma)の存在下で5μM fura-2/AMで15分間処理した。蛍光画像は、冷却電荷結合素子(CCD)カメラ(iXon、アンドール)及び乾燥対物レンズ(10x、NA=0.3、オリンパス)を装備した倒立蛍光顕微鏡(IX71、オリンパス)を使用して、327-353 nm及び369-391nmの励起フィルタ、409nmのダイクロイックミラー及び515-560nmの蛍光フィルタから成るフィルターセットにより得た。リガンドは、灌流リンゲル溶液(150のmM NaCl, 4 mM KCl, 2.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgCl2, 30 mM D-グルコース, 5 mM HEPES (pH 7.4))によって供給した。
(19)インスリン抵抗性指数
　経口ブドウ糖負荷試験(OGTT)及びインスリン耐性試験(ITT)は文献記載の方法(Nature Med. 8, 1288-1295 (2002); Nature Med. 7, 941-946 (2001))に若干の変更を加えて行った。ブドウ糖とインスリン曲線の面積は、それぞれブドウ糖値(1 mg/ml=1cm)及びインスリン値(1 ng/ml=1cm)の累積平均高に時間(60min=1cm)を掛けることにより計算した(Nature Med. 13, 332 - 339 (2007); Nature Med. 7, 941-946 (2001))。インスリン抵抗性指数は、ブドウ糖負荷試験でのブドウ糖とインスリンの面積の積×10-2から計算した。結果は対照同腹子の値に対するパーセンテージで表わした。
(20)クエン酸シンターゼ活性
　クエン酸シンターゼ活性は、文献記載の方法(Cell Metab. 4, 75-87 (2006); Eur. J. Biochem. 10, 198-206 (1969); Obes Res 13, 574-581 (2005))を使用してホモジネートから分光光度計で測定した。クエン酸シンターゼ活性は0.12 mM 5,5'-ジチオ-ビス(2-ニトロ安息香酸)及び0.6 mMオキサロ酢酸塩を含む0.1M Tris-HCl(pH 8.3)アッセイバッファー中で37℃で測定した。最初の2分間に412 nmでの吸光度を記録した後、3 mMアセチル-CoAを加えて反応を開始し、吸光度の変化を7分間、10秒毎に測定した。
(21)酸素消費量
　酸素消費量は、絶食条件下の動物でO2/CO2代謝測定システムを用いて24時間、3分毎に測定した(モデルMK-5000; 室町機械、東京、日本)。マウスをそれぞれ室温で0.5 l/minの気流が供給されている密閉チャンバー(560 ml容積)中に入れた。酸素消費量はそれに流量を掛けることによりミリリットル／分に換算した。
(22)カルシウム流入増加実験
 文献記載の方法(J. Control Release 64, 133-142 (2000))によってゼラチン水溶液をグルタルアルデヒドで架橋することによりヒドロゲルを調製した。ゼラチンヒドロゲル中にBay-K 8644を取り込むために、20μlのBay-K 8644 (0.25μM)を20 mgの凍結乾燥ヒドロゲル上に滴下し、4℃で一晩放置した。麻酔下で、Bay-K 8644を取り込んだゼラチンヒドロゲルを皮下に移植した。その後、皮膚を4-0ナイロンモノフィラメントで注意深く縫合した。
(23)パッチクランプ試験
　全細胞電流はパッチクランプ増幅器(CEZ-2400；日本光電工業)で増幅し、PowerLabディジタイザ(AD Instruments)でデジタル化した。細胞外溶液にはリンゲル液を使用した。電極溶液は140 mM KCl, 10 mM HEPES, 5 mM EGTA-2K及び10 mM D-グルコースを含んだ(pH 7.4)。データは2 kHzのローパスフィルタにかけ、20 kHzでサンプリングした。リンゲル液に溶かしたリガンドを、自作の加圧放出システムで、2連ガラスキャピラリーを通じて少なくとも2回供給した。
B.結果
(1)muscle-R1KOマウスにおけるPGC-1αとミトコンドリアの減少
　muscle-R1KOマウスはAMPKリン酸化の低下を示した(図1a)。さらに、アディポネクチンの投与により、対照である同腹子の筋肉中のAMPKリン酸化は増加したが、muscle-R1KOマウスでは増加しなかった(図7a)。一方、アディポネクチンは両方の遺伝子型において肝臓中のAMPKのリン酸化を増加させた(図7b)。muscle-R1KOマウスではさらにPGC1-αのようなミトコンドリア生合成に関与する分子(Cell 98, 115-124 (1999))も、メッセンジャーRNA(Ppargc1a)(図1b)及びタンパク質レベル(図1c)の両方で減少していた。アディポネクチンは、対照である同腹子の筋肉中のPpargc1aの発現レベルを増加させたが、muscle-R1KOマウスでは増加させなかった(図7c)。
　muscle-R1KOマウスでは、エストロゲン関連受容体α(Esrra) (Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 6570-6575 (2004))のようなミトコンドリア生合成に関与する分子、核呼吸因子1(Nrf1)のような転写に関与する分子、及びミトコンドリア転写因子A(Tfam)のようなミトコンドリアDNA複製／翻訳に関与する分子の減少が認められた(図1b)。さらに、muscle-R1KOマウスではいくつかの酸化的リン酸化及び他のミトコンドリア遺伝子の発現レベルが著しく低く、それらにはシトクロムc(Cycs)及びシトクロムcオキシダーゼサブユニットII(mt-Co2)が含まれていた(図1b)。また、muscle-R1KOマウスはミトコンドリアDNA含有量が減少していた(図1d)。
　ミトコンドリアの機能を、Cox(図8a)及びコハク酸デヒドロゲナーゼ(SDH)(図8b)の酵素活性を測定することにより評価した。ヒラメ筋切片の染色処理により、muscle-R1KOマウスではCox-及びSDH陽性の筋繊維の数が少ないこと、及びCoxとSDHの染色強度が低下していることが明らかになった(図8a,b)。
(2)muscle-R1KOにおけるI型繊維の減少及び運動能力の低下
　muscle-R1KOマウスではI型繊維(Physiol. Rev. 80, 1215-1265 (2000)) 分化筋細胞エンハンサー因子2C(Mef2c) (EMBO J. 19, 1963-1973 (2000)) (図1b)に関与する分子も減少しており、I型繊維マーカー・トロポニンI (slow)も減少していた(図1e)。対照的に、muscle-R1KOマウスでMHCIIa、MHCIIx及びMHCIIbの発現レベルは対照マウスに見られたものとほぼ同レベルであり(図8c-e)、このことはmuscle-R1KOマウスにおける酸化的高耐久性繊維が減少していることを示してる。これらの知見は、組織学的分析(図1f,g)と一致した。muscle-R1KOマウスのヒラメ筋では、I型繊維は20%減少していた(図1g)。
　無傷動物での骨格筋機能に対するAdipor1除去の影響を調べるために、トレッドミルランニングによる不髄意運動を評価する筋持久力試験を対照及びmuscle-R1KOマウスに行った。muscle-R1KOマウスの筋持久力は、対照マウスより著しくより低かった(図1h)。次に代謝系遺伝子の発現を調べたところ、中鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ(Acadm)のような脂肪酸酸化に関与する分子がmuscle-R1KOマウスで著しく減少していることを見出した(図1b)。それには骨格筋におけるβ酸化の減少(図1i)及びトリグリセリド含有量の増加(図1j)が関係していた。
　muscle-R1KOマウスでは、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ(Sod2)(図1b)やカタラーゼ(Cat)(図1b)のようなミトコンドリア及び細胞質の酸化ストレスを解毒する遺伝子の発現レベルがそれぞれ低下しており、チオバルビツル酸反応物質(TBARS)のような酸化ストレスが筋肉中に増加していることが示された(図1k)。インスリン感受性ブドウ糖輸送体4(Slc2a4)の発現はmuscle-R1KOマウスでは低下していた(図1b)。
(3)muscle-R1KOマウスにおけるインスリン抵抗性
　ブドウ糖投与の後のブドウ糖及びインスリンの血漿レベルは、対照マウスよりもmuscle-R1KOマウスにおいて著しく高かった(図2a,b)。対照マウスと比較してmuscle-R1KOマウスがインスリン摂取後に血漿ブドウ糖レベルを調整する能力は著しく低下していた(図2c)。高インスリン－正常血糖クランプ実験を行なったところ、筋肉中のAdipor1を破壊しても内因性のブドウ糖生産が有意に変化することはなかったが、ブドウ糖消失率とブドウ糖注入率は著しく低下した。このことは筋肉中のインスリン感受性の低下を示している(図2d-f)。
　高インスリン－正常血糖クランプから得られたデータに合致して、muscle-R1KOマウスの骨格筋においてインスリン刺激によるIRS-1のチロシンリン酸化の減少(図2g)及びAkt中のSer 473のリン酸化の減少(図2h)が認められ、このことはS6K1(図2i)及びJNK(図2j)のリン酸化の増加と関係しているものと考えられる。マウスIRS-1のSer 302はJNKによってリン酸化されることが報告されており(Nature 444, 860-867 (2006))、Ser 636/639のリン酸化にはmTOR及びS6K1 経路が介在することが報告されている(Nature 431, 200-205 (2004))が、それらは両方とも結果としてインスリン信号伝達の阻害をもたらすことになる。IRS-1におけるSer 302及びSer 636/639リン酸化の量はmuscle-R1KOマウスの骨格筋では増加していた(図2k,l)。
(4)CaMKKβはアディポネクチン/ AdipoR1誘導PGC-1αに必要である
　次に、muscle-R1KOマウスが先に述べたこれらの表現型を示す分子メカニズムを調べた。C2C12筋細胞に30μg/mlアディポネクチンを加えてインキュベートしたところミトコンドリアDNA含有量が増加した(図3a)。AMPK活性は、AMPKキナーゼ(AMPKK) (Cell Metab. 1, 15-25 (2005); J. Biol. Chem. 271, 27879-27887 (1996))による活性化ループ中においてAMPKα(Thr 172)のリン酸化に依存している。LKB1とCaMKKβは様々な組織及び細胞中に存在する2つの主要なAMPKKであることが知られている(Cell Metab. 1, 15-25 (2005); Cell Metab. 2, 9-19 (2005); Cell Metab. 2, 21-33 (2005))。AdipoR1又はCaMKKβを抑制すると、あるいはAMPKα1、及びAMPKα2又はPGC-1αの両方の発現をそれぞれに特異的な短分子干渉RNA(siRNA)により抑制すると(図9a-e)、アディポネクチンにより誘導されるミトコンドリアDNA含有量の増加が顕著に縮小した(図3a)。対照的に、特異的なsiRNAによりAdipoR2発現を抑制(図9f)しても、アディポネクチンにより誘導されるミトコンドリア生合成が有意に減少することはなかった(図3a)。
　個々の特異的siRNAによるAdipoR1又はCaMKKβ発現の抑制(図9a,b)は、アディポネクチンにより誘導されるPGC-1α発現の増加を大幅に縮小した(図3b)。興味深いことに、個々の特異的siRNAによるAMPKα1及びAMPKα2発現の抑制(図9c,d)によって、アディポネクチンにより誘導されるPGC-1α発現が有意に縮小することはなく(図3b)、このことはPGC-1α発現がAdipoR1-及びCaMKKβ-依存性であるが、AMPK-非依存性の経路を通じてアディポネクチンによって誘導されたことを示唆している。
　PGC-1αはAMPKによるリン酸化を経て(Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 12017-12022 (2007))、又はSIRT1活性化による脱アセチルによって(Nature 434, 113-118 (2005))活性化されることが報告されている。そこで、アディポネクチンとAdipoR1によって活性化されたAMPKがPGC-1α活性を調節する可能性について検討した。C2C12筋細胞をアディポネクチンで処理すると2時間の処理の後、PGC-1αのアセチル化が減少した(図3c)。それぞれに特異的なsiRNAによりAdipoR1、又はAMPKα1とAMPKα2の両方、あるいはSIRT1の発現を抑制すると(図9a,c,d,g)、アディポネクチンにより誘導されるPGC-1αアセチル化の減少が大きく縮小した(図3c)。2個のAMPKリン酸化部位を欠くPGC-1α-2A突然変異体(Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 12017-12022 (2007))は、アディポネクチンによるPGC-1α脱アセチル化及びミトコンドリア生合成に顕著な減少を示した(図3d,e)。
　リジンのアセチル化可能部位のうち13位がアルギニンに変異したPGC-1α-R13を発現するC2C12筋細胞では(Nature 434, 113-118 (2005))、アディポネクチンはミトコンドリア生合成をさらに誘導することができなかった(図3f)。PGC-1α-R13変異体ではアセチル化を受ける能力が失われているために、これらのデータはアディポネクチンがPGC-1αを活性化する際に、PGC-1αのSIRT11介在性脱アセチル化反応に依存しているという事情に合致している。
　SIRT1 デアセチラーゼ活性はNAD+レベルにより左右されることが報告されている(Nature 434, 113-118 (2005); Nature 444, 868-874 (2006))。アディポネクチンは、C2C12筋細胞中のNAD+/NADH比を増加させた(図3g)。muscle-R1KOマウスではさらに、PGC-1αアセチル化の増加(図3h)と、in vivoでのアディポネクチン刺激時のNAD+/NADH比の低下(図3i)が見られた。これらのデータは、PGC-1αの発現と脱アセチルを掛け合わせて評価される総活性がmuscle-R1KOマウスでは顕著に縮小されていることを示した(図10)。
(5)アディポネクチンはAdipoR1によりカルシウムイオン流入を誘導する
　興味深いことに、C2C12筋細胞をアディポネクチンで処理すると、fura-2-ベースの蛍光イメージングで測定した細胞内カルシウムイオン濃度が増加した(図4a)。C2C12筋細胞はアディポネクチンに対して用量依存的な応答を示した。EGTAにより細胞外の遊離カルシウムイオンを除去すると、アディポネクチン誘導性のカルシウムイオン応答はほとんど完全に消失したが(図4a)、EGTAはATP誘導性の細胞内カルシウムイオン放出に効果を示さなかった。特異的なsiRNAを用いてAdipoR1発現を抑制すると(図4b)、C2C12筋細胞のアディポネクチンに対するカルシウム応答は大幅に縮小した(図4c,d)。これらの結果は、C2C12筋細胞のアディポネクチン処理後の細胞外カルシウムイオンの流入にAdipoR1が介在することを示している。
　機能獲得実験系においてアディポネクチン誘導性カルシウムイオン応答におけるAdipoR1の重要性をさらに研究するために、ツメガエル卵母細胞中にAdipoR1を発現させた(図4e)。アディポネクチン刺激による細胞内のカルシウムレベルの増加を、AdipoR1相補的RNAを注入した卵母細胞中のカルシウムイオン活性化Cl-電流をモニタリングすることにより検出した(図4f,g)。応答は対照の卵母細胞では観察されなかった(図4g)。AdipoR1を発現するツメガエル卵母細胞において、アディポネクチンへのカルシウムイオン活性化Cl-電流応答に対するEGTAによる細胞外遊離カルシウムイオン除去の影響を調べたところ、EGTAにより細胞外の遊離カルシウムイオンを除去すると、AdipoR1を発現するツメガエル卵母細胞におけるアディポネクチンへのカルシウムイオン活性化Cl-電流応答がほとんど完全に消失することを見出し(図4g)、それはこれらの応答が細胞外のカルシウムイオンに依存していたことを示した。
(6)アディポネクチンが誘導するカルシウムイオン流入は作用発現に重要である
　C2C12筋細胞にアディポネクチンを加えてインキュベートするとThr 172におけるAMPKα-のサブユニットのリン酸化が増加し、EGTAはアディポネクチン誘導によるAMPKリン酸化の増加を部分的に抑制した(図5a)。EGTAはAMPKのイオノマイシン依存性リン酸化をほとんど完全に消失させたが、EGTAはC2C12筋細胞におけるAMPKの5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミド-1-β-D-リボシド(AICAR)誘導によるリン酸化に影響を及ぼさなかった(図5a)。
　個々の特異的siRNAによるCaMKKβ又はLKB1発現の抑制(図9b,h)は、アディポネクチンにより誘導されるAMPKのリン酸化の増加を著しく縮小させた(図5b)。AMPK阻害剤であるAraAはアディポネクチン誘導によるPGC-1α発現を低下させる傾向にあるだけだが、細胞外カルシウムイオンの除去がアディポネクチンによって誘発されるカルシウムイオン信号を効果的に消失させるように(図4a)、EGTAによるカルシウムイオン除去又は選択的阻害薬であるSTO-609(J. Biol. Chem. 277, 15813-15818 (2002))によるCaMKKβの阻害は効果的かつ、ほぼ完全にC2C12筋細胞におけるアディポネクチン刺激によるPGC-1α発現の増加を消失させた(図5c)。
　in vivoイメージングにより、アディポネクチン誘導による骨格筋中へのカルシウムイオン流入がmuscle-R1KOマウスで減少しているかどうかを調べた(Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 275, H1652-H1662 (1998); J. Biol. Chem. 281, 1547-1554 (2006))。アディポネクチンでヒラメ筋を処理すると対照マウスではfura-2-ベースの蛍光イメージングによる測定で細胞内カルシウムイオン濃度が増加した。一方、muscle-R1KOマウスではアディポネクチンに対するヒラメ筋のカルシウム応答はほとんど完全に消失していた(図5d-f)。これらの結果は、in vivoの骨格筋においてアディポネクチンがAdipoR1によって、CaMKKβの細胞内基質であるCaMKI37,38のリン酸化を著しく増加させたという観察に一致している(図11)。
さらに、運動によるカルシウムイオン信号伝達経路及びAMPK/SIRT1経路の同時活性化がAdipoR1とは無関係にmuscle-R1KOマウスにおける表現型を回復させるかどうか調べたところ、2週間の運動によりmuscle-R1KOマウス(図6a-d)の筋肉においてインスリン抵抗性が著しく改善し、ミトコンドリアの含有量及びクエン酸シンターゼ活性のような機能が増加していた。
　以下に結果の詳細を述べる。
(7)muscle-R1KOは骨格筋におけるアディポネクチン作用を低下させる
　muscle-R1KOはAMPK (図1a)とその細胞内基質であるアセチルCoAカルボキシラーゼ(ACC)(図14a)のリン酸化の減少を示した。muscle-R1KOミトコンドリア特異的ゴモリ染色の減少を示した(図15a)。
(8)muscle-R1KOにおけるI型繊維の減少
　muscle-R1KOはI型繊維分化筋細胞エンハンサー因子2C(Mef2c) (EMBO J. 19, 1963-1973 (2000)) (図1b及び図16a)と共にI型繊維マーカー・ミオシン重鎖(MHC)アイソフォームI(図15b)、トロポニンI(slow) (Tnni1) (図1e及び図15c)及びミオグロビン(Mb) (Physiol. Rev. 80, 1215-1265 (2000)) (図15d)に関与する分子の減少を示した。これらの結果は、組織学的分析と一致した(図1f,g及び図15e)。muscle-R1KOマウスのヒラメ筋では、I型繊維は20%減少していた(図1g及び図15e)。
(9)muscle-R1KOマウスの筋肉中のMEF2、MCAD、SOD2、カタラーゼ及びGlut4のタンパク質発現レベル
　muscle-R1KOマウスの筋肉中のMEF2、MCAD、SOD2、カタラーゼ及びGlut4のタンパク質発現レベルは対照マウスで見られるものと比較して著しく減少していた(図16)。これらの結果は、muscle-R1KOマウスが筋肉中においてI型繊維の減少、組織トリグリセリド含有量の増加、及び酸化ストレスの増加を示したという結果に合致していた。
(10)アディポネクチンで処理したC2C12筋細胞中におけるミトコンドリア量の増加
　30μg/mlアディポネクチンを加えてC2C12筋細胞をインキュベートすると、MitoTrackerグリーンを用いての評価ではミトコンドリアDNA含有量及びミトコンドリア量が増加した(図17a-c)。AMPK阻害剤であるAraAは単独で、ミトコンドリア生合成の増加に対するアディポネクチンの効果をほとんど完全に消失させた(図17a,c)。CaMKK阻害剤であるSTO-609 (J. Biol. Chem. 277, 15813-15818 (2002))は単独で、ミトコンドリア生合成の増加に対するアディポネクチンの効果をほとんど完全に消失させた(図17a,c)。
(11)C2C12筋細胞及び骨格筋中のNAD+及びNADH含有量
　アディポネクチンはC2C12筋細胞中のNAD+/NADH比、NAD+及びNADHの含有量を増加させた(図3g及び図18a,b)。muscle-R1KOもin vivoでNAD+/NADH比、NAD+及びNADH含有量の減少を示した(図3i及び図18c,d)。これらの結果は、PGC-1αの発現と脱アセチルを掛け合わせて評価される総活性がmuscle-R1KOマウスでは顕著に縮小されていることを示唆している(図10)。
(12)muscle-R1KOマウスの骨格筋中のPPARαレベル及び活性
　AdipoR1を筋特異的に破壊してもPPARα(Ppara)レベルに有意な効果はなかったが (図19a)、その結果として、筋肉中のACO(Acox1)のようなPPARα標的遺伝子の発現レベルは著しく低下した(図19b)。この結果はPGC-1α活性の低下を示唆している。また、これらの結果は、muscle-R1KOマウスが筋肉中にPPAR補活性化因子としてのPGC-1α活性の低下を示すという結果と一致していた。
(13)muscle-R1KOマウスの酸素(O2)消費及び呼吸商(RQ)
　AdipoR1を筋特異的に破壊するとO2消費が著しく減少したが(図19c)、RQには有意な効果はなかった(図19d)。これらの結果は、AdipoR1の筋特異的な破壊が結果としてブドウ糖と脂肪酸の酸化を両方とも減少させることを示唆している。
(14)腓腹筋とヒラメ筋中のGlut4のmRNAレベル
　Glut4(Slc2a4)の発現レベルは、ヒラメ筋のようなI型繊維が豊富な筋肉やmuscle-R1KOの腓腹筋のようなタイプIIに富んだ筋肉においても、対照マウスのそれと比較して著しく減少していた(図19e,f)。これらの結果はmuscle-R1KOマウスの筋肉中に観察されたGlut4の低下が単に繊維状組成物の変質による二次的なものではないという考えと一致している。
(15)muscle-R1KOマウスの筋肉におけるカルシウム流入増加の効果
　カルシウムイオン-チャネルオープナー(Nature 303, 535-537 (1983); Am. J. Physiol. 258, R462-468 (1990))であるBay-K 8644 を0.25μM加えたことによるCaMKKβ活性の増加(図20a)は、muscle-R1KOマウスの筋肉においてAktのインスリン刺激によるリン酸化を著しく増強し(図20b)、ミトコンドリアの含有量(図20c)やクエン酸シンターゼ活性のような機能(図20d)を増大させた。これらの結果は、AdipoR1によるアディポネクチン誘導性の細胞外カルシウムイオンの流入が筋肉中のミトコンドリア生合成のアディポネクチン誘導性の増加にとって重要であるという結論と一致している。
(16)muscle-R1KOマウスでの運動、AICAR、レスベラトロール及び抗酸化剤MnTBAPの効果
　AICAR(Am. J. Physiol. 273, E1107-1112 (1997))の投与は、muscle-R1KOマウスの筋肉におけるAMPKのリン酸化を著しく増加させた(図20e)。AICARによるAMPKの活性化(Diabetologia 45, 56-65 (2002); Cell 134, 405-415 (2008))及びレスベラトロールによるSIRT1活性化(Cell 127, 1109-1122 (2006))はmuscle-R1KOマウスの筋肉中でインスリン抵抗性を著しく改善し、ミトコンドリア含有量及びクエン酸シンターゼ活性のような機能を増大させた(図20f-i及び図21a-d)。これらの結果は、AdipoR1による、アディポネクチンに刺激されたAMPK及びSIRT1の活性化が筋肉中のインスリン感受性及びミトコンドリア生合成のアディポネクチン誘導性の増加にとって重要であるという結論と一致している。
　MnTBAP (Nature 440, 944-948 (2006))はH2O2のようなROSを実際に著しく減少させたが(図21e)、muscle-R1KOマウスの筋肉中においてMnTBAP単独ではインスリン抵抗性は改善する傾向があり、ミトコンドリアの含有量及びクエン酸シンターゼ活性のような機能を有意に増加させることはなかった(図21e-i)。これらの結果は、AMPKによるS6K1の阻害や組織トリグリセリド蓄積の阻害のような抗酸化的ストレス非依存性経路が、抗酸化的ストレス依存性経路とともに、筋肉中におけるアディポネクチン/AdipoR1のインスリン感受性増加作用に大きく寄与しているという可能性を示唆するものである。AMPK/SIRT1によるNRF-1(図1b)及びmtTFA(図1b)の増加のような抗酸化的ストレス非依存性経路は、筋肉中のアディポネクチン/AdipoR1によるミトコンドリア生合成に大きく寄与しているものと考えられる。
　AICARは筋肉中のAdipoR1損失を有意であるが部分的に回復させたが(図20f-i)、運動はこれを有意かつほとんど完全に回復させた(図6a-d)。これらの結果はいくつかのメカニズムによって説明できると考えられる。第一に、運動はAMPKをAICARより効率的に活性化することができた。骨格筋では、AMPKは2つの別個の経路、すなわちLKB1依存性及びCaMKKβ依存性リン酸化を通じて活性化することができる。AICARは通常構造的に活性化されているLKB1による効率的なリン酸化が可能になるようなAMPKの構造変化を誘導するAMP模倣物として、AMPKのLKB1依存性のリン酸化及び活性化を活性化することが示されているが、AICARは細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させないのでCaMKKβ依存性のリン酸化及び活性化を刺激することはない。一方、運動は細胞内のAMP及びカルシウムイオン濃度の両方を上昇させることが示されており、そのためAMPKのLKB1依存性及びCaMKKβ依存性の両方のリン酸化及び活性化を刺激することができる。第二に、運動はCaMKのメンバーの活性化のような細胞内カルシウムイオン濃度依存性であるがAMPKには非依存性の経路の増進、そしてそれに続く、運動に調節される筋肉遺伝子（とりわけPGC-1α）の発現の増加を刺激することが示されており(Nature 454, 463-469 (2008))、これらも筋肉中のAdipoR1の損失の回復に寄与するものと考えられるが、これらはAICARには見られない。
(17)ミトコンドリアの能力及びインスリン信号伝達
　特異的siRNAによるAdipor1の抑制(図9a)はアディポネクチンによるミトコンドリア含有量の増加を顕著に縮小し(図3a)、同時にAkt中のSer 473のインスリン刺激性のリン酸化の増加を顕著に縮小した(図22a)。これらのデータは、特にアディポネクチンによるミトコンドリア能力の活性化が筋細胞中のインスリン信号伝達の増加に関係しているという考えと一致している。
(18)muscle-R1KOマウスの骨格筋中のFOXO1リン酸化
　Foxo中のThr 24及びSer 253のインスリン刺激性のリン酸化(EMBO J. 19, 989-996 (2000))は、muscle-R1KOマウスの骨格筋中では対照マウスにおけるそれと比較して著しく減少していた(図22b)。これらの結果は、1型 筋繊維の減少、不十分な血糖調節及び身体的な運動能力の低さのような筋肉におけるAdipoR1ノックアウトの影響の多くが、Foxo 活性化の影響(J. Biol. Chem. 279, 41114-41123 (2004))に類似しているという考えと一致している。
(19)デアセチラーゼSIRT1ノックダウン処理を行ったC2C12筋細胞にアディポネクチン刺激を行った際のPGC-1αアセチル化の量
　デアセチラーゼSIRT1ノックダウン処理を行ったC2C12筋細胞にアディポネクチン刺激を行った際のPGC-1αアセチル化の量は、アディポネクチン刺激を行っていないC2C12筋細胞におけるものとほとんど同じであった。これらの結果は、6時間の絶食のような本発明者らの条件下ではアディポネクチン刺激が無いとC2C12筋細胞中でデアセチラーゼSIRT1は十分に活性化されないという可能性を示している(図22c)。
(20)アディポネクチンに対する内向き電流反応
　アディポネクチンに対する内向き電流反応を、-60mVの保持電位でC2C12筋細胞の全細胞パッチクランプ記録によって観察した(図23a)。また、特異的siRNAによりAdipoR1発現を抑制すると(図4b)、C2C12筋細胞のアディポネクチンに対する全細胞の電流反応は著しく縮小した(図23a,b)。これらの結果は、C2C12筋細胞のアディポネクチン処理における電流発生にはAdipoR1が介在することを示唆している。
　AdipoR1を発現する卵母細胞をアディポネクチンで刺激すると内向き電流反応が誘導された(図23c,d)。AdipoR1を発現するツメガエル卵母細胞のアディポネクチンに対する内向き電流反応に対するEGTAによる細胞外遊離カルシウムイオンの除去の影響を調べたところ、EGTAにより細胞外遊離カルシウムイオンを除去すると、AdipoR1を発現するツメガエル卵母細胞のアディポネクチンに対するアディポネクチン誘導性内向き電流反応がほとんど完全に消失する(図23d)。上記の結果はこれらの反応が細胞外カルシウムイオンに依存していたことを示す。
(21)BAPTA-AMあるいはU73122の存在下のアディポネクチンで刺激されたAMPKのリン酸化
　ビス-(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N9,N9-テトラ-酢酸テトラアセトキシメチルエステル(BAPTA-AM)(細胞内カルシウムキレート剤)はアディポネクチン誘導性のAMPKのリン酸化の増加をEGTAとほぼ同程度に部分的に抑制したが(図24a)、U73122(PLC阻害剤)はC2C12筋細胞におけるAMPKのアディポネクチン誘導性のリン酸化にほとんど効果を示さなかった(図24b)。
(22)CaMKI、AMPK、HDAC5の連続的リン酸化及びそれらの細胞外カルシウムイオン流入依存性
　C2C12筋細胞のアディポネクチン処理により、CaMKI リン酸化(J. Biol. Chem. 273, 31880-31889 (1998); Trends Biochem. Sci. 24, 232-236 (1999))に短時間のうちに、一時的な強い増加が生じた(図25a、図25bの上パネル、図25c)。EGTAで細胞外カルシウムイオンを除去するとアディポネクチン刺激によるCaMKIリン酸化の増加はほとんど完全に消失した (図25a、図25bの上パネル、図25c)。これらのデータは、おそらくCaMKKβ活性化によるアディポネクチン誘導性のCaMKIリン酸化はほぼ完全にカルシウムイオンの進入に依存することを示している。CaMKIのリン酸化に続いて、アディポネクチンは連続的であって、かつ部分的な細胞外カルシウムイオンの流入に依存した様式でAMPKリン酸化をさらに増加させた(図25a、図25bの中央パネル、図25c)。
　次に、アディポネクチンがCaMKI (Nature 408, 106-111 (2000))とAMPK (Diabetes 57, 860-867 (2008))の活性化に続いてヒストンデアセチラーゼ(HDAC)5のリン酸化を刺激するかどうかを調べた。CaMK及び/又はAMPK信号伝達はMEF2-HDAC複合体の形成を妨げ、この転写レプレッサーのリン酸化によりHDAC5の核外輸送を誘導する(Nature 408, 106-111 (2000); Diabetes 57, 860-867 (2008))。これらの信号伝達経路は、CaMK及び/又はAMPKが筋細胞中のMEF2によってPGC-1α発現を増加させるメカニズムの可能性があると考えられる。C2C12筋細胞のアディポネクチン処理により、連続的であって、かつ部分的な細胞外カルシウムイオンの流入に依存した様式でのHDAC5のリン酸化が増加した(図25a、図25bの下パネル、図25c)。カルシウムイオンフリーでEGTAを加えた培地中にアディポネクチンを加えずに（対応の対照）20-40分間インキュベートしたところ、C2C12筋細胞中のCaMKI、AMPK及びHDAC5のリン酸化量に有意な効果はなかった(図25a-c)。
(23)昆虫の嗅覚受容体とAdipoR1の間の比較
　昆虫の嗅覚受容体もGPCRとの相同性を欠き、アミノ末端が細胞内に位置する反対型7回膜貫通型のトポロジーを有し、細胞外のカルシウムイオンの流入を誘導することが報告されている(Nature 452, 1002-1006 (2008))。従って、AdipoR1による信号伝達は昆虫嗅覚受容体の信号伝達と共通する可能性がある。さらに上記に示した結果から、AdipoR1を分子ターゲットとする新しい抗糖尿病薬及び抗アテローム形成薬を開発できるものと考えられる。
(24)インスリン感受性の調節におけるPGC-1αとアディポネクチン/AdipoR1の間の相違
　PGC-1αは骨格筋における酸化的代謝の重要な調節因子である。PGC-1αと OXPHOSレベルの低下は、ヒト(Nature Genet. 34, 267-273 (2003))及びマウスにおいてインスリン抵抗性と2型糖尿病に関係している(図14a-c)。しかしながら、筋肉特異的なPGC-1α-ノックアウトマウスはインスリン抵抗性(J. Clin. Invest. 117, 3463-3474 (2007))を示さなかった。したがって、AMPKによるS6K1の阻害のようなPGC-1α-非依存性の経路も筋肉中のアディポネクチン/AdipoR1のインスリン感受性増加作用に寄与しているものと考えられる。
(25)総括
　以上のように、muscle-R1KOマウスがミトコンドリア含有量及び酵素の減少を示すことが示された。PGC-1αはミトコンドリアの含有量及び機能の重要な調節因子である。PGC-1αの発現がいくつかの生理的な状況において調整されていることが報告されており、例えば骨格筋では運動に部分的に反応してCaMKやCREBのような分子によるカルシウムイオン信号伝達が増加することにより調整されている(Nature 454, 463-469 (2008))。PGC-1α活性は、例えばAMPKによるリン酸化(Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 12017-12022 (2007))、及びAMPKとSIRT1による脱アセチル化(Nature 434, 113-118 (2005))のようないくつかの種類のPGC-1α修飾によって調整されることも報告されている。AMPKとSIRT1は運動によっても活性化することができた。muscle-R1KOマウスがPGC-1αの脱アセチルの減少と同様にPGC-1α発現の減少も示すことも証明された。これと一致して、アディポネクチンがAdipoR1によるカルシウムイオン流入を誘導し、それによりCaMKKβを活性化し、それがPGC-1α発現の増加を導くこと、並びにアディポネクチン/AdipoR1がAMPKとSIRT1を活性化し、それがPGC-1αの脱アセチル化を誘導することも証明された。これらのデータは、アディポネクチンとAdipoR1が運動と同様の様式で、PGC-1αの発現及び活性化の両方の増加を促すことを示している(図6e)。
　muscle-R1KOマウスでのPGC-1α発現の減少程度はおよそ40%だったが、ミトコンドリア生合成と運動耐容能の低下の度合いは筋肉特異的なPGC-1α-ノックアウトマウスで観察されたものに匹敵する(J. Biol. Chem. 282, 30014-30021 (2007))。これはアディポネクチンとAdipoR1がPGC-1α発現だけでなくPGC-1α活性も増加させるという知見によって説明できるものと考えられる(図6e)。
　AdipoR1及びPGC-1αの発現の減少、並びにミトコンドリアDNA含有量の減少は、肥満糖尿病性db/dbマウス(図12a-c)と同様に、2型糖尿病患者(Nature Genet. 34, 267-273 (2003))及び家族歴のために糖尿病発症リスクの高い人(Proc. Natl Acad. Sci. USA 100, 8466-8471 (2003))においても観察された。これらのデータは、肥満のような病態生理学的な状況において、アディポネクチン/AdipoR1の減少がPGC-1α調節異常及びミトコンドリアの機能不全が生じる原因となる可能性があることを示している。
　骨格筋において、AdipoR1はいくつかのメカニズムによってインスリン感受性の調節に関与している(図13)。第一はS6K1の活性化であり、これによりIRS-1(Nature 431, 200-205 (2004))のSer 636/639のリン酸化が増加することでインスリン抵抗性をもたらすことができると報告されている。S6K1はAMPKにより決定的な阻害を受ける(J. Biol. Chem. 282, 7991-7996 (2007))。muscle-R1KOマウスの骨格筋では、AMPK活性化は低下していたが、S6K1の活性化、及びIRS-1のSer 636/639のリン酸化は実際に増加していた。第二は酸化ストレス増加であり、これはJNK 活性化によるIRS-1中のSer 302のリン酸化の増加(Nature 444, 860-867 (2006))によるインスリン抵抗性の原因として関連付けられている(Nature 440, 944-948 (2006))。いくつかの酸化ストレス解毒遺伝子は、AMPK及びPGC-1αによって決定的に調節されており(Cell 127, 397-408 (2006))、Sod2やcatのようなこれらの遺伝子の発現レベルは低下していたが、それはmuscle-R1KOマウスの骨格筋中のTBARSの増加に関係していた。第三はトリグリセリド含有量の増加であり、これはJNK活性化によるIRS-1中のSer 302のリン酸化の増加によるインスリン抵抗性に関係している(Nature 444, 860-867 (2006))。脂肪酸酸化に関与する分子はAMPK及びPGC-1αにより決定的に調節されており、Mcadのようなこれらの遺伝子の発現レベルは低下していたが、それはmuscle-R1KOマウスの骨格筋中のトリグリセリド含有量の増加に関係している。TBARS及びトリグリセリド含有量の増加と一致して、JNK活性化及びIRS-1中のSer 302のリン酸化は実際に増加した。
　運動は長寿と生活習慣病に、また同時にカルシウムイオン、AMPK、SIRT1及びPGC-1α経路を活性化させるために有益な作用があることが報告されている(Nature 454, 463-469 (2008))。アディポネクチンとAdipoR1がカルシウムイオン及びAMPK/SIRT1によってPGC-1α及びミトコンドリアを調節していることが示されたが、筋肉中のAdipoR1を増加させる戦略とともにAdipoR1の受容体活性化作用が擬似的な運動効果となると結論することができる。
　結論として、AdipoR1は筋肉中のアディポネクチンの生理的・病態生理学的な重要性において決定的な役割を有し、カルシウムイオン信号伝達、PGC-1α発現及び活性化、ミトコンドリアの機能と酸化ストレス、ブドウ糖と脂質の代謝、並びに運動耐容能の調節に関与している。以上の結果は、筋肉中のAdipoR1を増加させる戦略と同様にAdipoR1の受容体活性化作用がミトコンドリア機能不全、インスリン抵抗性、及び肥満に関連付けられる2型糖尿病に対して新たな治療法となることを示すものである。

Claims (9)

  1. アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物のスクリーニング方法であって、被験化合物を細胞に接触させることにより細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じるか否かを判定し、細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じさせる被験化合物をアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物として選抜する工程を含む方法。
  2. AdipoR1の発現を欠損させた細胞とAdipoR1発現細胞とにそれぞれ被験化合物を接触させて細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じるか否かを判定し、AdipoR1の発現を欠損させた細胞において細胞外カルシウムイオンの細胞内流入を実質的に生じさせず、AdipoR1発現細胞において細胞外カルシウムイオンの細胞内流入を生じさせる被験化合物をアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物として選抜する工程を含む請求項１に記載の方法。
  3. アディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物のスクリーニング方法であって、下記の工程：
    (a)被験化合物を細胞に接触させることにより細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じるか否かを判定し、細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じさせる被験化合物をアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト候補化合物として選抜する工程；及び
    (b)上記工程(a)で選抜されたアゴニスト候補化合物をAdipoR1の発現を欠損させた細胞とAdipoR1発現細胞とにそれぞれ接触させて細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じるか否かを判定し、AdipoR1の発現を欠損させた細胞において細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が実質的に生じさせず、AdipoR1発現細胞において細胞外カルシウムイオンの細胞内流入が生じさせるアゴニスト候補化合物をアディポネクチン受容体1に対するアゴニスト化合物として選抜する工程
    を含む方法。
  4. 細胞が骨格筋細胞である請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 細胞がAdipoR1相補的RNAを注入したツメガエル卵母細胞である請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  6. 細胞内カルシウムイオン濃度の測定工程を含む請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 細胞内カルシウムイオン濃度の測定をカルシウムイオン蛍光試薬を用いて蛍光強度により測定する請求項６に記載の方法。
  8. 細胞内へのカルシウムイオン濃度の流入を電気生理学的に測定する請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  9. 細胞としてアディポネクチン受容体1を発現させた細胞を用いる請求項８に記載の方法。
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