WO2011111771A1 - 動物細胞培養用培地 - Google Patents

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cells
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貴康 本山
将彦 佐本
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Fuji Oil Co Ltd (fka Fuji Oil Holdings Inc)
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Fuji Oil Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0043—Medium free of human- or animal-derived components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/76—Undefined extracts from plants

Definitions

  • the present invention relates to an animal cell culture medium.
  • bovine serum or protein components separated from bovine serum For the purpose of increasing the cell growth rate, it is common to add bovine serum or protein components separated from bovine serum to the medium. However, in recent years, it is not preferable to mix unnecessary substances mixed in serum such as bovine-derived antibodies, viruses, pathogenic prions, etc., and development of serum-free media has been promoted. And in patent document 1, adding a soybean protein hydrolyzate and a yeast extract to a serum-free culture medium is proposed to raise a cell growth rate.
  • An object of the present invention is to provide a factor that can increase the growth rate of animal cells when added to a serum medium or a serum-free medium.
  • the present inventor has found that culturing animal cells in a medium in which a hydrolyzate of soybean ⁇ -conglycinin concentrate is added to a serum medium or a serum-free medium can increase the cell growth rate, and thus completes the present invention. It came.
  • the present invention provides the following (1) to (8).
  • a method for culturing animal cells wherein the animal cells are cultured in the medium described in (1) or (2) above.
  • the proliferation rate of animal cells can be increased.
  • useful substances can be efficiently produced, and the efficiency of regenerative medicine can be increased.
  • Proteins contained in general soybean contain various globulins of 2S, 7S, 11S, and 15S from the sedimentation coefficient by ultracentrifugation analysis. Of these, 7S globulin and 11S globulin are the major acid-precipitating constituent protein components.
  • ⁇ -conglycinin corresponds to 7S globulin
  • ⁇ -conglycinin concentrate refers to a product in which the proportion of ⁇ -conglycinin in the protein is increased.
  • glycinin corresponds to 11S globulin.
  • soy protein Furthermore, in addition to the above-mentioned globulins, there are acid-precipitating soy protein groups in soy protein, and these are accompanied by a large amount of polar lipids such as lecithin and glycolipids, so comprehensively, lipophilic protein (LP) (Refer to Patent Document 2).
  • LP lipophilic protein
  • the nitrogen source added to the animal cell culture medium of the present invention is not a hydrolyzate prepared from ordinary soybean powder or isolated soybean protein, but the animal cell culture medium exhibits excellent cell growth promoting activity.
  • a hydrolyzate of ⁇ -conglycinin concentrate is essential.
  • the ⁇ -conglycinin content in the concentrate is preferably 40% by weight or more, more preferably 50% by weight or more based on the crude protein.
  • Methods for preparing a ⁇ -conglycinin concentrate from soybean are well known, and a method of fractionating ⁇ -conglycinin from a product obtained by extracting or concentrating proteins from soybeans of a general composition in general classification, There is a method of extracting or concentrating proteins from soybeans enriched with ⁇ -conglycinin by a conversion technique.
  • examples of the former include methods described in Non-Patent Document 1, Patent Document 2, and Patent Document 3.
  • Examples of the latter include the methods described in Patent Document 4 and Patent Document 5.
  • the content of ⁇ -conglycinin in the ⁇ -conglycinin concentrate can be 60% by weight or more or 80% by weight or more based on the crude protein.
  • the hydrolyzate of ⁇ -conglycinin concentrate according to the present invention is a peptide mixture obtained by subjecting the ⁇ -conglycinin concentrate to protease treatment.
  • the hydrolyzate of the ⁇ -conglycinin concentrate preferably has a higher degree of degradation, and in particular, the proportion of dipeptides and tripeptides in the total amount of peptides and free amino acids in the hydrolyzate is preferably high.
  • the proportion of dipeptide and tripeptide in the total amount of peptide and free amino acid is preferably 60% by weight or more, and more preferably 64% by weight or more.
  • dipeptides and tripeptides are defined as a fraction obtained by removing free amino acids from a fraction having a molecular weight of 500 or less. Therefore, the ratio of dipeptide and tripeptide in the total amount of peptide and free amino acid was measured by amino acid analysis after measuring the ratio of peptide fraction having a molecular weight of 500 or less in hydrolyzate by gel filtration chromatography for peptides. It can be calculated by subtracting the free amino acid content in the hydrolyzate.
  • the free amino acid content in the protein is preferably 10% by weight or less, and more preferably 5% by weight or less.
  • the proportion of the fraction having a molecular weight of 500 or more in the total amount of peptide and free amino acid in the hydrolyzate is preferably 40% by weight or less, More preferably, it is less than or equal to weight percent.
  • protease used to obtain the hydrolyzate is classified as “metal protease”, “acidic protease”, “thiol protease”, “serine protease” in the classification of protease, regardless of animal origin, plant origin or microbial origin.
  • Protease preferably selected from proteases classified as “metal protease”, “thiol protease”, and “serine protease”.
  • a degradation method in which enzymes belonging to two or more, or three or more different categories are sequentially or simultaneously acted is preferable because the ratio of peptides having a relatively low molecular weight such as dipeptides and tripeptides can be increased.
  • protease is a classification method based on the type of amino acid at the active center, which is usually performed in the field of enzyme science.
  • metal protease includes Bacillus neutral protease, Streptomyces neutral protease, Aspergillus neutral protease, samoyase, etc.
  • acid protease includes pepsin, Aspergillus acid protease, Sumitum AP, etc.
  • seerine protease such as bromelain, papain and the like include trypsin, chymotrypsin, subtilisin, Streptomyces alkaline protease, alcalase, biopase and the like.
  • the classification can be confirmed by the action pH and the reactivity with inhibitors. Since the site of action on the substrate is greatly different between enzymes having different active centers, it is possible to reduce “uncut residue” and efficiently obtain an enzyme degradation product. In addition, enzymatic degradation products can be produced more efficiently by using enzymes of different origins (origin organisms) together. Even in the same classification, if the origin is different, the site of action on the protein that is the substrate is also different, and as a result, the proportion of dipeptides and tripeptides can be increased. These proteases preferably have low exo activity.
  • the reaction pH and reaction temperature of the protease treatment may be set in accordance with the characteristics of the protease to be used. Usually, the reaction pH is carried out near the optimum pH, and the reaction temperature may be carried out around the optimum temperature. In general, the reaction temperature is 20 to 80 ° C., preferably 40 to 60 ° C. After the reaction, the enzyme is heated to a temperature sufficient to inactivate the enzyme (about 60 to 170 ° C.) to inactivate the residual enzyme activity.
  • the reaction solution after the protease treatment can be used as it is or after being concentrated, but is usually sterilized, spray-dried, freeze-dried, etc. and used in the form of a dry powder.
  • Sterilization is preferably heat sterilization, and the heating temperature is preferably 110 to 170 ° C, more preferably 130 to 170 ° C.
  • the heating time is preferably 3 to 20 seconds.
  • the reaction solution may be adjusted to an arbitrary pH, and precipitates and suspensions generated during pH adjustment may be removed by centrifugation, filtration, or the like. Furthermore, you may refine
  • the animal cell culture medium of the present invention can be produced by adding the hydrolyzate of the ⁇ -conglycinin concentrate thus obtained to the animal cell culture medium.
  • the basic medium to which the hydrolyzate of ⁇ -conglycinin concentrate is added may be a serum-containing medium or a serum-free medium, and the type of the basic medium is not particularly limited, and a commercially available medium is used. be able to.
  • the preferred basic medium varies depending on the type of animal cell to be cultured, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the addition amount of the hydrolyzate of ⁇ -conglycinin concentrate varies depending on the type of animal cells to be cultured, but is desirably 0.001 to 5% by weight as the dried hydrolyzate per animal cell culture medium, preferably A high effect can be obtained at a concentration of 0.01 to 2% by weight.
  • animal cell growth promoting effect and useful substance production promoting effect When animal cells are cultured in the animal cell culture medium of the present invention, cell growth of animal cells is promoted by the hydrolyzate of ⁇ -conglycinin concentrate. Thereby, when the animal cell whose growth is promoted is of a kind that produces a substance useful for the human body, the production of the useful substance by the animal cell can also be promoted. For example, when animal cells to be cultured are antibody-producing cells, antibody production is promoted by the action of a hydrolyzate of ⁇ -conglycinin concentrate. Therefore, useful substances can be efficiently produced by culturing animal cells in the animal cell culture medium of the present invention to produce useful substances and isolating them from the medium by a conventional method.
  • Various useful substances produced from animal cells include antibodies, enzymes and hormones.
  • the type of animal cell cultured in the animal cell culture medium of the present invention is not particularly limited.
  • useful substances such as antibodies, enzymes (urokinase, etc.), hormones (insulin, etc.), cytokines (interferon, interleukin, tumor necrosis factor, colony stimulating factor, growth factor, etc.), other physiologically active proteins and peptides
  • non-transformed cells such as skin cells, chondrocytes, hepatocytes, pancreatic cells, kidney cells, and genes involved in the biosynthesis of encoded genes and useful substances.
  • a transformed cell into which is introduced is exemplified. Examples of transformed cells include antibody-producing cells such as mouse myeloma cells and Chinese hamster ovary cells.
  • animal cells can be cultured to produce useful substances efficiently. Further, by culturing skin cells, chondrocytes, hepatocytes, pancreatic cells, ES cells, iPS cells and the like and efficiently proliferating them, they can be used in the field of regenerative medicine.
  • ⁇ -conglycinin content was quantified by ELISA.
  • 0.1 g of a sample was precisely weighed and placed in a 50 ml stoppered Erlenmeyer flask, and 2.5 ml of 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 8.2) and 7.5 ml of 8 M Urea-DTT buffer were added. Extraction was performed at 100 ° C. for 1 hour. After extraction, the cells were re-associated with a 0.4 M NaCl solution (pH 9.0) containing cystine, and the volume was adjusted to 100 ml, and the filtrate was used as an ELISA sample.
  • a 96-well EIA microplate for ELISA (manufactured by IWAKI Co., Ltd.) was immobilized by storing the sample and ⁇ -conglycinin for calibration curve (manufactured by Fuji Oil Co., Ltd.) at 4 ° C. for 1 day, respectively. 200 ⁇ l of Nippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. was added and incubated at 37 ° C. for 2 hours for blocking. After blocking, it was washed 3 times with 50 mM phosphate buffer (pH 7.2).
  • TMB Micowell Peroxidase Substrate manufactured by KPL
  • 1N sulfuric acid was added to stop the color reaction
  • the absorbance was measured at a wavelength of 450 nm.
  • a calibration curve was prepared using the absorbance of ⁇ -conglycinin for the calibration curve, the ⁇ -conglycinin content of the sample was calculated, and the ratio to the total protein calculated by the Kjeldahl method was determined.
  • the molecular weight distribution of the hydrolyzate of the soy protein fraction was measured by the HPLC method using the following gel filtration column.
  • An HPLC system using a gel filtration column for peptides was assembled, a known peptide serving as a molecular weight marker was charged, and a calibration curve was obtained in relation to the molecular weight and the retention time.
  • the molecular weight markers are [ ⁇ -Asp] -Angiotensin II ⁇ -Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (molecular weight 1046) as octapeptide and Angiotensin IV Val-Tyr- as hexapeptide.
  • the ratio (%) of the peptide fraction having a molecular weight of 500 or less to the total amount of peptides and free amino acids in the hydrolyzate is represented by the ratio of the area of the molecular weight in the range of 500 or less (time range) to the total absorbance chart area. Determined (use column: Superdex Peptide 7.5 / 300GL (manufactured by GE Healthcare Japan), solvent: 1% SDS / 10 mM phosphate buffer, pH 8.0, column temperature 25 ° C., flow rate 0.25 ml / min, Detection wavelength: 220 nm). Next, the free amino acid content in the hydrolyzate of the soy protein fraction was measured by amino acid analysis.
  • Hydrolyzate (4 mg / ml) was added to an equal volume of 3% sulfosalicylic acid and shaken for 15 minutes at room temperature. Centrifugation was performed at 10,000 rpm for 10 minutes, and the resulting supernatant was filtered with a 0.45 ⁇ m filter, and free amino acids were measured with an amino acid analyzer (JLC500V manufactured by JEOL Ltd.). The free amino acid content in the protein was calculated as a ratio to the protein content obtained by the Kjeldahl method. The value obtained by subtracting “free amino acid content” from the “ratio of peptide fraction having a molecular weight of 500 or less” obtained as described above was defined as “dipeptide / tripeptide content” in the hydrolyzate.
  • This fraction is a concentrate of “glycinin” which is 11S globulin.
  • the pH of the remaining supernatant was adjusted to 5.0, allowed to stand at 55 ° C. for 10 minutes, then adjusted to pH 5.5, and then the precipitated card fraction was collected with a centrifuge.
  • This fraction is a “concentrate of“ LP ”which is a lipophilic protein.
  • the pH of the remaining supernatant was adjusted to 4.5, and the precipitated card was collected with a centrifuge.
  • This fraction is a concentrate of “ ⁇ -conglycinin” which is 7S globulin. (5) Each obtained fraction was neutralized and heat sterilized.
  • separation soybean protein was prepared from the low modified
  • protease is as follows: The hydrolyzate by was prepared. 2% Samoaase (origin; Bacillus thermoproteolyticus, metal protease, Yamato Kasei) was added to the 3% soy protein solution and allowed to act at pH 9.0 and 58 ° C. for 60 minutes.
  • Samoaase oil; Bacillus thermoproteolyticus, metal protease, Yamato Kasei
  • biopulase oil; Bacillus sp., Serine protease, Nagase Chemtech
  • biopulase oil
  • protease a protein-derived protein
  • Sumitum FP source: Aspergillus sp., Metal protease, Shin Nippon Chemical Industry
  • the reaction was stopped at 90 ° C. for 20 minutes, and then used as a sample for Examples 1 and 2 below.
  • Example 1 Effect of each protein hydrolyzate in a bovine serum-containing medium The effects of promoting the growth and the antibody production of each protein hydrolyzate obtained in Production Example 3 on animal cells, particularly antibody-producing cells are confirmed. Therefore, a mouse antibody-producing hybridoma was cultured in accordance with the following method.
  • the cells used were antibody-producing hybridoma cells (manufactured by Frontier Laboratories, Inc.), RPMI-1690 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as the basic medium, and bovine serum (FBS) was added to a final concentration of 10%. This was added to obtain a control medium.
  • FBS bovine serum
  • 5% FBS was added to the basic medium RPMI-1690, and 0.25% soybean protein hydrolyzate was added to obtain a sample evaluation medium.
  • antibody-producing cells were thawed at 37 ° C., transferred to a 15 mL centrifuge tube, and 10 mL washing medium (RPMI-1690: FBS-free) was added and stirred. After stirring, the mixture was centrifuged (4 ° C., 800 g, 10 minutes) and washed. After washing, 5 mL of medium was added to the cells to prepare a cell suspension. The prepared cell suspension was precultured (37 ⁇ 0.5 ° C., CO2 concentration 5%) for 3-7 days.
  • washing medium RPMI-1690: FBS-free
  • the cell suspension is collected, washed after centrifugation (800 g, 10 minutes), a medium containing soy protein hydrolyzate is added to the obtained cell pellet and suspended, and then 1 ⁇ 10 5 cells.
  • the cell suspension prepared to / mL was added to 0.5 mL / well and 3 wells each, and cultured for 3 days (37 ⁇ 0.5 ° C., CO 2 concentration 5%).
  • FIG. 1 is a diagram showing the effect of soy protein hydrolyzate in a bovine serum-containing medium on cell growth
  • FIG. 2 is a diagram showing the effect of soy protein hydrolyzate in a bovine serum-containing medium on antibody production. It is.
  • isoflavone since isoflavone has an antioxidant action, a cytoprotective action is expected.
  • the isoflavone content of ⁇ -conglycinin concentrate is the lowest, so the increase in cell number and the ability to produce antibodies are independent of the action of isoflavone, and such an effect is -It is thought to be derived from a hydrolyzate of conglycinin concentrate.
  • Example 2 Effect of each protein hydrolyzate in serum-free medium From the results of Example 1, in the bovine serum-containing medium, the ⁇ -conglycinin concentrate hydrolyzate has the effect of promoting the growth of antibody-producing hybridoma and the promotion of antibody production. Since the effect was recognized, a ⁇ -conglycinin concentrate hydrolyzate or a separated soy protein hydrolyzate was added to two types of commercially available serum-free media, and it was verified whether the same effect could be obtained.
  • Example 2 The same cells as in Example 1 were used, and Cosmediumu005 (manufactured by Cosmo Bio) and Hybridoma SFM (manufactured by Invitrogen) were used as basal media as serum-free media.
  • Cosmediumu005 manufactured by Cosmo Bio
  • Hybridoma SFM manufactured by Invitrogen
  • 0.5% of each hydrolyzate was added to each serum-free medium to obtain a sample evaluation medium.
  • a control medium was prepared by adding bovine serum (FBS) to RPMI-1690 to a final concentration of 10%.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of soy protein hydrolyzate on cell growth in a serum-free medium.
  • FIG. 4 is a diagram showing the effect of soy protein hydrolyzate on the amount of antibody produced in a serum-free medium.
  • the hydrolyzate of ⁇ -conglycinin concentrate improved the number of cells and the antibody-producing ability of the antibody-producing hybridoma as compared with the isolated soybean protein hydrolyzate. It was.
  • the intensity of the effect depends on the type of serum-free medium used, but at least with respect to the number of cells, the serum-free medium to which the hydrolyzate of ⁇ -conglycinin concentrate is added is compared with the case where the hydrolyzate is not added. There was a tendency to increase.
  • a hydrolyzate of ⁇ -conglycinin concentrate was added to the serum-free medium Cosmedium005, cell proliferation ability and antibody production ability were higher than that of the bovine serum-containing medium.

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Abstract

　血清培地又は無血清培地に添加することで、動物細胞の増殖率を高めることがで きる因子を提供すること。　β－コングリシニン濃縮物の加水分解物は動物細胞の増殖促進活性を示す。

Description

動物細胞培養用培地
　本発明は、動物細胞培養用培地に関する。
　動物細胞、特に哺乳動物細胞を培養する際に、細胞を効率的に増殖させることは重要である。例えば、抗体、酵素、ホルモンなどの有用物質を産生する細胞であれば、細胞の増殖率を高めることで、有用物質を効率よく製造することが可能である。あるいは、皮膚細胞、軟骨細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞といった細胞の増殖率を高めることで、効率のよい再生医療が行われることが期待できる。
　細胞増殖率を高めることを目的として、培地にウシ血清やウシ血清から分離した蛋白質成分を添加することがよく行われている。しかしながら近年では、血清中に混入する不要物、例えば、ウシ由来の抗体、ウイルス、病原性プリオンなどが混入することは好ましくなく、無血清培地の開発が進められている。そして、特許文献１では、大豆蛋白質加水分解物及び酵母抽出物を無血清培地に添加して、細胞増殖率を高めることが提案されている。
特表２００２－５２００１４号公報 国際公開第２００６／１２９６４７号パンフレット 国際公開第２００２／０２８１９８号パンフレット 国際公開第９８／４４８０７号パンフレット 国際公開第２００９／０３５８５２号パンフレット 国際公開第２００６／１３４７５２号パンフレット
M.Samotoら，Food Chemistry，102巻，317-322頁，2007年 S.Kudouら，Agric.Biol.Chem.，５５巻，2227-2233頁、1991年
　本発明は、血清培地又は無血清培地に添加することで、動物細胞の増殖率を高めることができる因子を提供することを目的とする。
　本発明者は、大豆β－コングリシニン濃縮物の加水分解物を血清培地又は無血清培地に添加した培地で動物細胞を培養すると、細胞増殖率を高めることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（８）を提供する。
（１）β－コングリシニン濃縮物の加水分解物を含む動物細胞培養用培地。
（２）無血清培地である、上記（１）に記載の培地。
（３）β－コングリシニン濃縮物の加水分解物からなる動物細胞増殖促進剤。
（４）β－コングリシニン濃縮物の加水分解物からなる抗体産生促進剤。
（５）上記（１）又は（２）に記載の培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の培養方法。
（６）上記（１）又は（２）に記載の培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の増殖を促進する方法。
（７）動物細胞培養用培地にβ－コングリシニン濃縮物の加水分解物を添加する、上記（１）又は（２）に記載の培地の製造方法。
（８）上記（１）又は（２）に記載の培地中で動物細胞を培養し、動物細胞から産生される有用物質を培地から単離する、有用物質の製造方法。
　本発明によれば、動物細胞の増殖率を高めることができ、その結果、有用物質を効率よく製造することができ、また、再生医療の効率を高めることができる。
ウシ血清含有培地における大豆蛋白質加水分解物が細胞増殖に及ぼす効果を表す図である。 ウシ血清含有培地における大豆蛋白質加水分解物が抗体産生量に及ぼす効果を表す図である。 無血清培地における大豆蛋白質加水分解物が細胞増殖に及ぼす効果を表す図である。 無血清培地における大豆蛋白質加水分解物が抗体産生量に及ぼす効果を表す図である。
　以下、本発明をより詳細に説明する。
（大豆蛋白質）
　一般の大豆に含まれる蛋白質は、超遠心分析による沈降係数から、２Ｓ、７Ｓ、１１Ｓ及び１５Ｓの各種グロブリンが含まれている。このうち、７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンは主要な酸沈殿生の構成蛋白質成分である。本発明におけるβ－コングリシニンは７Ｓグロブリンに相当するものであり、β－コングリシニン濃縮物は蛋白質中のβ－コングリシニンの割合が高められたものをいう。一方、グリシニンは１１Ｓグロブリンに相当するものである。さらに、大豆蛋白質中には上記グロブリン以外にも酸沈殿性大豆蛋白質群が存在し、これらはレシチンや糖脂質などの極性脂質を多く随伴するために、包括的に、脂質親和性蛋白質（ＬＰ）と呼ばれている（特許文献２参照）。
（β－コングリシニンの濃縮）
　本発明の動物細胞培養用培地に添加される窒素源としては、通常の大豆粉末や分離大豆蛋白質から調製された加水分解物ではなく、動物細胞用培地が優れた細胞増殖促進活性を発揮するために、β－コングリシニン濃縮物の加水分解物が必須である。該濃縮物中のβ－コングリシニン含量は、粗蛋白質に対して４０重量％以上含まれていることが好ましく、５０重量％以上含まれていることがより好ましい。大豆からβ－コングリシニン濃縮物を調製する方法は公知であり、大きく類別して一般的な組成の大豆から蛋白質を抽出又は濃縮したものからβ－コングリシニンを分画する方法と、予め育種や遺伝子組換技術によりβ－コングリシニンを濃縮させた大豆から蛋白質を抽出又は濃縮する方法がある。例えば、前者の例としては非特許文献１、特許文献２及び特許文献３などに記載の方法が挙げられる。また後者の例としては特許文献４や特許文献５などに記載の方法が挙げられる。これらの調製方法によれば、β－コングリシニン濃縮物におけるβ－コングリシニンの含量を、粗蛋白質に対して６０重量％以上あるいは８０重量％以上とすることが可能である。
（β－コングリシニン濃縮物の加水分解）
　本発明に係るβ－コングリシニン濃縮物の加水分解物は、上記β－コングリシニン濃縮物をプロテアーゼ処理することによって得られるペプチド混合物である。β－コングリシニン濃縮物の加水分解物は分解度がより高いことが好ましく、特に加水分解物中におけるペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占めるジペプチド及びトリペプチドの割合が高いことが好ましい。具体的には、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占めるジペプチド及びトリペプチドの割合が６０重量％以上であることが好ましく、６４重量％以上であることがより好ましい。なお本願では、ジペプチド及びトリペプチドを、分子量５００以下の画分から遊離アミノ酸を除いた画分と規定した。したがって、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占めるジペプチド及びトリペプチドの割合は、ペプチド用ゲルろ過クロマトグラフィーにより加水分解物中の分子量５００以下のペプチド画分の割合を測定した後、アミノ酸分析により測定した加水分解物中の遊離アミノ酸含量を差し引くことにより算出することが可能である。蛋白質中の遊離アミノ酸含量は１０重量％以下であることが好ましく、５重量％以下であることがより好ましい。さらに、ペプチド体はより低分子であることが望ましいことから、加水分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占める分子量５００以上の画分の割合は４０重量％以下であることが好ましく、３５重量％以下であることがより好ましい。
　加水分解物を得るために使用するプロテアーゼは、動物起源、植物起源又は微生物起源を問わず、プロテアーゼの分類において「金属プロテアーゼ」、「酸性プロテアーゼ」、「チオールプロテアーゼ」、「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼ、好ましくは「金属プロテアーゼ」、「チオールプロテアーゼ」、「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼの中から適宜選択することができる。特に２種類以上、あるいは３種類以上の異なった分類に属する酵素を、順次若しくは同時に作用させる分解方法がジペプチドやトリペプチド等の比較的分子量の低いペプチドの割合を増加させることができ好ましい。
　このプロテアーゼの分類は、酵素科学の分野において通常行なわれている活性中心のアミノ酸の種類による分類方法である。各々の代表として「金属プロテアーゼ」にはBacillus中性プロテアーゼ、Streptomyces中性プロテアーゼ、Aspergillus中性プロテアーゼ、サモアーゼ等、「酸性プロテアーゼ」にはペプシン、Aspergillus酸性プロテアーゼ、スミチュームＡＰ等、「チオールプロテアーゼ」にはブロメライン、パパイン等、「セリンプロテアーゼ」にはトリプシン、キモトリプシン、ズブチリシン、Streptomycesアルカリプロテアーゼ、アルカラーゼ、ビオプラーゼ等が挙げられる。これら以外の酵素でも作用ｐＨや阻害剤との反応性により、その分類を確認することができる。活性中心が異なる酵素間では、基質への作用部位が大きく異なるため、「切れ残り」を減らし、効率よく酵素分解物を得ることができる。また、異なった起源の（起源生物）の酵素を併用することで、更に効率よく酵素分解物を製造することができる。同分類でも起源が異なれば、基質である蛋白質への作用部位も異なり、結果としてジペプチドやトリペプチドの割合を増やすことができる。これらプロテアーゼはエキソ活性が少ないことが好ましい。
　プロテアーゼ処理の反応ｐＨや反応温度は、用いるプロテアーゼの特性に合わせて設定すれば良く、通常、反応ｐＨは至適ｐＨ付近で行い、反応温度は至適温度付近で行なえば良い。概ね反応温度は２０～８０℃、好ましくは４０～６０℃である。反応後は酵素を失活させるのに十分な温度（６０～１７０℃程度）まで加熱し、残存酵素活性を失活させる。
　プロテアーゼ処理後の反応液は、そのまま又は濃縮して用いることもできるが、通常、殺菌し、噴霧乾燥、凍結乾燥等して乾燥粉末の状態で利用する。殺菌は、加熱殺菌が好ましく、加熱温度は１１０～１７０℃が好ましく、１３０～１７０℃が更に好ましい。加熱時間は３～２０秒間が好ましい。また、反応液を任意のｐＨに調整してもよく、またｐＨ調整時に発生する沈殿物や懸濁物を遠心分離やろ過等により除去してもよい。更に活性炭や吸着樹脂により精製してもよい。
（動物細胞培養用培地への利用）
　このようにして得られたβ－コングリシニン濃縮物の加水分解物を動物細胞培養用培地に添加することで、本発明の動物細胞培養用培地を製造することができる。β－コングリシニン濃縮物の加水分解物を添加する基本培地は、血清含有培地であってもよく無血清培地であってもよく、基本培地の種類は特に限定されず市販されている培地を使用することができる。好ましい基本培地は培養する動物細胞の種類によって異なり、当業者が適宜選択することができる。β－コングリシニン濃縮物の加水分解物の添加量は、培養する動物細胞の種類によって異なるが、望ましくは動物細胞培養用培地当たり、乾燥させた加水分解物として０．００１～５重量％、好ましくは０．０１～２重量％の濃度にて高い効果を得ることができる。
（動物細胞の増殖促進効果及び有用物質の産生促進効果）
　本発明の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養すると、β－コングリシニン濃縮物の加水分解物により動物細胞の細胞増殖が促進される。これにより、増殖が促進される動物細胞がヒトの生体に有用な物質を産生する種類のものである場合は、動物細胞による該有用物質の産生も促進されうる。例えば、培養する動物細胞が抗体産生細胞の場合は、β－コングリシニン濃縮物の加水分解物の作用により抗体産生が促進される。したがって、本発明の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養して有用物質を産生させ、これを培地から常法により単離することにより、有用物質を効率的に製造することができる。動物細胞から産生される各種有用物質としては抗体の他、酵素やホルモン等が挙げられる。
　本発明の動物細胞培養用培地で培養する動物細胞の種類は特に限定されない。具体的には、抗体、酵素（ウロキナーゼ等）、ホルモン（インシュリン等）、サイトカイン（インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、成長因子等）、その他の生理活性蛋白質・ペプチドなどの有用物質を産生する動物細胞が挙げられ、かかる動物細胞としては、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、腎細胞等の非形質転換細胞や、コードする遺伝子や有用物質の生合成に関与する遺伝子を導入した形質転換細胞が例示される。形質転換細胞の例としては、マウスミエローマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの抗体産生細胞などが挙げられる。これらの動物細胞を培養して有用物質を効率的に製造することができる。また、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などを培養し、効率的に増殖させることにより、これらを再生医療の分野にも利用することができる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
　実施例で用いた測定方法について以下にまとめる。
（蛋白質含量）
　１０５℃、１２時間乾燥した大豆蛋白質画分の重量に対して、ケルダール法により測定した蛋白質量の重量を、乾燥物中の蛋白質含量として重量％で表した。なお、窒素換算係数は６．２５とした。
（β―コングリシニン含量）
　β－コングリシニンはELISA法により定量を行った。サンプル０．１ｇを精秤し、５０ｍｌ栓付三角フラスコ中に入れ、０．０５Ｍ　Tris-HCl緩衝液（ｐＨ８．２）２．５ｍｌ及び８Ｍ　Urea-DTT緩衝液７．５ｍｌを添加した。１００℃で１時間抽出した。抽出後シスチンを含む０．４Ｍ　NaCl溶液（ｐＨ９．０）で再会合させた後、１００ｍｌに定容し、ろ過液をELISA用サンプルとした。ELISA用９６ウェルEIAマイクロプレート（IWAKI（株）製）にサンプル及び検量線用β－コングリシニン（不二製油（株）製）をそれぞれ４℃で１日間保存することで固定化し、ブロッキング液（大日本住友製薬（株）製）を２００μｌ加え３７℃で２時間インキュベートしブロッキングした。ブロッキング後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で３回洗浄した。次に、１次抗体として０．５μｇ／ｍｌの抗β－コングリシニンウサギポリクロナール抗体（タカラバイオ（株）製）を１００μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；０．１％Tween20含有）で３回洗浄した。その後、２次抗体として０．１μｇ／ｍｌのペルオキダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ（株）製）を１００μｌ添加し３７℃で１時間インキュベートした。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；０．１％Tween20含有）で３回洗浄した。洗浄後、TMB Micowell Peroxidase Substrate（KPL（株）製）を１００μｌ加え５分間発色させた。１Ｎ硫酸を１００μｌ加え発色反応を停止後、波長４５０ｎｍで吸光度を測定した。測定後、検量線用β－コングリシニンの吸光度を用いて検量線を作成し、サンプルのβ－コングリシニン含量を算出し、ケルダール法で算出した全蛋白質に対する比率を求めた。
（ジペプチド・トリペプチド含量）
　大豆蛋白質画分の加水分解物の分子量分布を、以下のゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣ法により測定した。ペプチド用ゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣシステムを組み、分子量マーカーとなる既知のペプチドをチャージし、分子量と保持時間の関係において検量線を求めた。なお、分子量マーカーは、オクタペプチドとして[β-Asp]-Angiotensin IIのβ-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe（分子量１０４６）、ヘキサペプチドとしてAngiotensin IVのVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe（分子量７７５）、ペンタペプチドとしてLeu-EnkephalinのTyr-Gly-Gly-Phe-Leu（分子量５５５）、トリペプチドとしてGlu-Glu-Glu（分子量４０５）、遊離アミノ酸としてPro（分子量１１５）を用いた。加水分解物（１％）を１０，０００ｒｐｍ、１０分で遠心分離した上清を、ゲルろ過用溶媒で２倍に希釈し、その５μlをＨＰＬＣにアプライした。加水分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占める分子量５００以下のペプチド画分の割合（％）を、全体の吸光度のチャート面積に対する、分子量５００以下の範囲（時間範囲）の面積の割合によって求めた（使用カラム：Superdex Peptide 7.5/300GL（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）、溶媒：１％ＳＤＳ／１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、カラム温度２５℃、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２２０ｎｍ）。
　次に、アミノ酸分析により大豆蛋白質画分の加水分解物中の遊離アミノ酸含量の測定を行った。加水分解物（４ｍｇ／ｍｌ）を等量の３％スルホサリチル酸に加え、室温で１５分間振とうした。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上澄みを０．４５μｍフィルターでろ過し、アミノ酸分析器（日本電子製　JLC500V）にて、遊離アミノ酸を測定した。蛋白質中の遊離アミノ酸含量はケルダール法にて得られた蛋白質含量に対する割合として算出した。
　以上より得られた、「分子量５００以下のペプチド画分の割合」から「遊離アミノ酸含量」を差し引いた値を、加水分解物中の「ジペプチド・トリペプチド含量」とした。
（イソフラボン含量）
　大豆イソフラボンとして１～１０ｍｇに相当する量の試料を定量し、７０％エタノールにて１００ｍｌに定容した。そして０．４５μｍＰＶＤＦフィルターにて濾過したものを試験溶液とした。標準品は１２種類、すなわちダイジン、ゲニスチン、グリシチン、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、マロニルダイジン、マロニルゲニスチン、マロニルグリシチン、アセチルダイジン、アセチルゲネスチン、アセチルグリシチン（和光純薬工業株式会社）を用いた。ＨＰＬＣの条件については非特許文献３に記載の条件に準拠した。定量にはダイゼイン標準品を用い、各換算値を用いて算出した。
（製造例１）各種大豆蛋白質画分の調製
　非特許文献１に記載の方法に準じて以下の通り、β―コングリシニン濃縮物、グリシニン濃縮物及びＬＰ濃縮物の各大豆蛋白質画分を調製した。
（１）低変性脱脂大豆に加熱処理を施してＮＳＩ（水溶性窒素指数、ＡＯＣＳ公式分析法ＢＡ－１１－６５　ＮＳＩによる）を低下させた脱脂大豆（ＮＳＩ７０％）の温水抽出スラリーを遠心分離機にてオカラ画分を除き脱脂豆乳とした。
（２）次に脱脂豆乳のｐＨを５．８に調整して遠心分離機にて沈殿カード画分を回収した。この画分が１１Ｓグロブリンである「グリシニン」の濃縮物である。
（３）次に、残りの上清のｐＨを５．０に調整し、５５℃で１０分間放置後、次いでｐＨ５．５に調整後、遠心分離機にて沈殿カード画分を回収した。この画分が、脂質親和性蛋白質である「ＬＰ」の濃縮物」である。
（４）次に、残りの上清のｐＨを４．５に調整し、遠心分離機にて沈殿カードを回収した。この画分が７Ｓグロブリンである「β－コングリシニン」の濃縮物である。
（５）得られた各画分を中和して、加熱殺菌した。
（製造例２）分離大豆蛋白の調製
　別途、低変性脱脂大豆から以下のように分離大豆蛋白質を調製した。
（１）低変性脱脂大豆の温水抽出スラリーを遠心分離機にてオカラ画分を除き脱脂豆乳とした。
（２）得られた脱脂豆乳のｐＨを４．５に調整して等電点沈殿し、遠心分離機にて酸沈殿カードを得て中和した。
（３）得られた各画分を中和して、加熱殺菌した。
（製造例３）　加水分解物の調製
　製造例１及び２で得られたβ－コングリシニン濃縮物、グリシニン濃縮物、ＬＰ濃縮物及び分離大豆蛋白質から特許文献６を参考にして、以下のようにプロテアーゼによる加水分解物を調製した。３％大豆蛋白質溶液に対して、サモアーゼ（起源；Bacillus thermoproteolyticus、金属プロテアーゼ、大和化成）を蛋白質当たり２％加え、ｐＨ９．０、５８℃で６０分間作用させた。次にビオプラーゼ（起源；Bacillus sp.，セリンプロテアーゼ、ナガセケムテック）を蛋白質当たり１％加え、ｐＨ７．５、５８℃で６０分間作用させた。次にスミチュームＦＰ（起源；Aspergillus sp.，金属プロテアーゼ、新日本化学工業）を蛋白質当たり１％加え、ｐＨ７．５、５８℃で６０分間作用させた。以上の処理の後、９０℃、２０分間で反応を停止した後、以下の実施例１及び２に用いる試料とした。
　製造例１、２で得られた各種大豆蛋白質画分及び分離大豆蛋白質の蛋白質含量と、製造例３で得られたそれらの加水分解物中の各種物質の含有量を測定し、以下の表１にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例１）ウシ血清含有培地における各蛋白質加水分解物の効果
　製造例３で得られた各蛋白質加水分解物の動物細胞、特に抗体産生細胞への増殖促進効果及び抗体産生促進効果を確認するために、以下の方法に従いマウス抗体産生ハイブリドーマの培養実験を行なった。
　細胞は抗体産生ハイブリドーマ細胞（株式会社フロンティア研究所製）を使用し、基本培地としてRPMI-1690（和光純薬社製）を用い、これに終濃度１０％となるようにウシ血清（ＦＢＳ）を添加し、コントロール用培地とした。一方、大豆蛋白質加水分解物を評価する際には、基本培地RPMI-1690にＦＢＳを５％添加し、大豆蛋白質加水分解物を０．２５％添加しサンプル評価用培地とした。
　培養は、抗体産生細胞を３７℃にて解凍後、１５ｍＬの遠心管に移し、１０ｍＬ洗浄培地（RPMI-1690：ＦＢＳ非含有）を加え攪拌した。攪拌後、遠心分離（４℃，８００ｇ，１０分間）を行い、洗浄した。洗浄後、５ｍＬの培地を細胞に加え細胞浮遊液を調製した。調製後の細胞浮遊液を３－７日間前培養（３７±０．５℃，ＣＯ２濃度５％）した。前培養後、細胞浮遊液を回収し、遠心洗浄（８００ｇ、１０分間）の後、得られた細胞ペレットに、大豆蛋白質加水分解物を含有する培地を添加し懸濁後、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞浮遊液を０．５ｍＬ／ｗｅｌｌ、各３ｗｅｌｌに添加し、３日間培養（３７±０．５℃，ＣＯ２濃度５％）した。
　３日間培養後、培養上清を回収し、Mouse IgG ELISA Quantitation Kit（Bethyl Laboratories社製）の操作手順に従って、抗体産生量の測定、細胞数の計測を行い、３ｗｅｌｌ間の平均値及び標準偏差を求めた。
　結果を図１及び図２にまとめた。図１は、ウシ血清含有培地における大豆蛋白質加水分解物が細胞増殖に及ぼす効果を表す図であり、図２は、ウシ血清含有培地における大豆蛋白質加水分解物が抗体産生量に及ぼす効果を表す図である。
　図１及び図２から明らかなように、他の大豆蛋白質加水分解物を添加した場合と比較して、β－コングリシニン濃縮物の加水分解物のみが抗体産生ハイブリドーマの細胞数及び抗体産生能を増加させていることが認められた。グリシニン濃縮物の加水分解物及びＬＰ濃縮物の加水分解物では細胞数及び抗体産生能の増加が認められなかったことは、β－コングリシニン濃縮物の加水分解物中に細胞増殖及び抗体産生能を促す因子が含まれている可能性を示唆している。さらに、ＦＢＳを１０％添加しているコントロールと比較しても高くなっていることから、ウシ血清中に含まれている細胞増殖因子及び抗体産生能向上因子よりも強い効果を持っていると考えられた。
　なお、イソフラボンは抗酸化作用を有するため、細胞保護作用が期待される。しかしながら、表１から分かるように、β－コングリシニン濃縮物のイソフラボン含量が一番低く、したがって、細胞数の増加及び抗体産生能の増加はイソフラボンの作用とは無関係であり、このような効果はβ－コングリシニン濃縮物の加水分解物に由来すると考えられる。　
（実施例２）　無血清培地における各蛋白質加水分解物の効果
　実施例１の結果より、ウシ血清含有培地において、β－コングリシニン濃縮物の加水分解物に抗体産生ハイブリドーマの増殖促進効果及び抗体産生促進効果が認められたことから、市販の無血清培地２種類にβ－コングリシニン濃縮物の加水分解物又は分離大豆蛋白質加水分解物を加え、同様の効果が得られるか検証した。
　実施例１と同じ細胞を使用し、無血清培地としてCosmediumu005（コスモバイオ社製）、HybridomaSFM（Invitrogen社製）をそれぞれ基本培地として使用した。一方、β－コングリシニン濃縮物の加水分解物及び分離大豆蛋白質加水分解物を評価する際には、各無血清培地に、各加水分解物を０．５％添加しサンプル評価用培地とした。また、RPMI-1690に終濃度１０％となるようにウシ血清（ＦＢＳ）を添加したものをコントロール用培地とした。
　培養及び評価は実施例１に記載の方法と同じ方法で行なった。
　結果を図３及び４にまとめた。図３は、無血清培地における大豆蛋白質加水分解物が細胞増殖に及ぼす効果を表す図である。図４は、無血清培地における大豆蛋白質加水分解物が抗体産生量に及ぼす効果を表す図である。
　図３及び４から明らかなように、分離大豆蛋白質加水分解物と比較して、β－コングリシニン濃縮物の加水分解物は抗体産生ハイブリドーマの細胞数及び抗体産生能を向上させていることが確認された。効果の強度は、使用する無血清培地の種類に依存するが、少なくとも細胞数に関しては、β－コングリシニン濃縮物の加水分解物を添加した無血清培地では該加水分解物を添加しない場合と比較して増加する傾向が見られた。更に、無血清培地Cosmedium005にβ－コングリシニン濃縮物の加水分解物を添加した場合にはウシ血清含有培地と比較しても高い細胞増殖能と抗体産生能を示すことが確認された。

Claims (8)

  1. 　β－コングリシニン濃縮物の加水分解物を含む動物細胞培養用培地。
  2. 　無血清培地である、請求項１に記載の培地。
  3. 　β－コングリシニン濃縮物の加水分解物からなる動物細胞増殖促進剤。
  4. 　β－コングリシニン濃縮物の加水分解物からなる抗体産生促進剤。
  5. 　請求項１又は２に記載の培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の培養方法。
  6. 　請求項１又は２に記載の培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の増殖を促進する方法。
  7. 　動物細胞培養用培地にβ－コングリシニン濃縮物の加水分解物を添加する、請求項１又は２に記載の培地の製造方法。
  8. 　請求項１又は２に記載の培地中で動物細胞を培養し、動物細胞から産生される有用物質を培地から単離する、有用物質の製造方法。
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