WO2011111253A1 - 複数の金属ナノ粒子とヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質との複合体 - Google Patents

複数の金属ナノ粒子とヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質との複合体 Download PDF

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WO2011111253A1
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nanoparticles
heme
group
metal nanoparticles
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PCT/JP2010/065625
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林高史
小野田晃
植屋佑一
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国立大学法人大阪大学
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings

Definitions

  • the present invention relates to a complex of a plurality of metal nanoparticles and an apoprotein derived from a heme protein dimer.
  • Metal nanoparticles are attracting attention as wiring materials, pigments, and sensors. This complex of metal nanoparticles and protein can be widely applied to sensing, imaging, protein activity control, etc., and is attracting attention as a new biomaterial. It has been reported that a complex of a metal nanoparticle and a protein is produced from the metal nanoparticle and a protein by electrostatic interaction (for example, Non-Patent Document 1).
  • an object of the present invention is to provide a complex of a metal nanoparticle and a protein in which the distance between the metal nanoparticles is kept specific via a heme protein.
  • the present invention is a complex of a plurality of metal nanoparticles and an apoprotein derived from a hemoprotein dimer,
  • the metal nanoparticles are modified at least one place by a group represented by formula (I) and / or formula (II), By binding the heme contained in the group represented by the formula (I) and / or the formula (II) modified with the metal nanoparticles to the apoprotein derived from the heme protein dimer from which heme has been removed.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 each independently represents a hydrogen atom, a lower alkyl group or a lower alkenyl group
  • Y is a group represented by -Z1-Y1-Z2-Y2- or -Z1-Y1-, wherein Z1 means a group bonded to -CO- in formula (I) and formula (II).
  • Y1 and Y2 are independently — (CH 2 ) n1 —, — (C 6 H 4 ) n5 —, — (CH 2 ) n1 — (C 6 H 4 ) n5 —, — (C 6 H 4 ) n5 — (CH 2 ) n1 —, — (CH 2 ) n1 — (C 6 H 4 ) n5 — (CH 2 ) n2 —, — (CH 2 ) n1 —O— (CH 2 ) n2 —, — (CH 2 N1 —O— (CH 2 ) n2 —O— (CH 2 ) n3 — or — (CH 2 ) n1 —O— (CH 2 ) n2 —O— (CH 2 ) n3 —O— (CH 2 ) n4
  • n1, n2, n3, n4 and n5 each independently represents an integer of 1 to 20,
  • the complex of the present invention is a complex of a metal nanoparticle and a protein in which the distance between the metal nanoparticles is kept specific via a heme protein.
  • FIG. 1 is a UV-vis spectrum of gold nanoparticles modified with citric acid prepared in Example 1 (2).
  • FIG. 2 is a transmission electron micrograph of gold nanoparticles modified with citric acid produced in Example 1 (2).
  • FIG. 3 is a UV-vis spectrum of gold nanoparticles modified with Compound 1 produced in Example 1 (2).
  • FIG. 4 is a transmission electron micrograph of gold nanoparticles modified with Compound 1 produced in Example 1 (2).
  • FIG. 5 is a UV-vis spectrum for quantifying Compound 1 contained in the modified gold nanoparticles produced in Example 1 (2).
  • FIG. 6 is a size exclusion chromatography chart of a dimer of cytochrome b 562 mutant produced in Example 1 (3).
  • FIG. 7 is a UV-vis spectrum of an apoprotein obtained by removing heme from a dimer of cytochrome b 562 mutant produced in Example 1 (3).
  • FIG. 8 shows the agarose gel electricity of the composite obtained in Example 1 (4), the composite obtained in Comparative Example 1, and the gold nanoparticles modified with Compound 1 produced in Example 1 (2). Migration.
  • FIG. 9A is a TEM photograph of the composite obtained in Example 1 (4).
  • FIG. 9B is a TEM photograph of the composite obtained in Example 1 (4).
  • FIG. 9 (c) is a TEM photograph of the composite obtained in Example 1 (4).
  • FIG.9 (d) is the TEM photograph of the composite_body
  • FIG. 10A is a TEM photograph of the composite obtained in Comparative Example 1.
  • FIG. 10B is a TEM photograph of the composite obtained in Comparative Example 1.
  • FIG. 10C is a TEM photograph of the composite obtained in Comparative Example 1.
  • FIG. 11 is an SEM photograph of the composite obtained in Example 1 (4).
  • FIG. 12 is an SEM photograph of the composite obtained in Comparative Example 1.
  • FIG. 13 shows the complex obtained in Example 2 (3), the complex obtained in Comparative Example 1, the gold nanoparticles modified with Compound 1 produced in Example 1 (2), and lipoic acid. Agarose gel electrophoresis of modified gold nanoparticles.
  • FIG. 14 is a TEM photograph of the composite obtained in Example 2 (3).
  • FIG. 15A shows the measurement results of dynamic light scattering (DLS) of gold nanoparticles modified with lipoic acid.
  • FIG. 15B shows the measurement result of dynamic light scattering (DLS) of the composite obtained in Comparative Example 1.
  • FIG. 15C shows the measurement result of dynamic light scattering (DLS) of the composite obtained in Example 2 (3).
  • FIG. 16 is a UV-vis spectrum of cytochrome b 562 polymer (III-3).
  • FIG. 17 is a UV-vis spectrum of silver nanoparticles modified with citric acid prepared in Example 3 (1).
  • FIG. 18 is a transmission electron micrograph of silver nanoparticles modified with citric acid produced in Example 3 (1).
  • FIG. 19 is a transmission electron micrograph of silver nanoparticles modified with Compound 1 produced in Example 3 (1).
  • FIG. 20 is a UV-vis spectrum for confirming the presence of Compound 1 contained in the modified silver nanoparticles produced in Example 3 (1).
  • FIG. 21 (a) is a TEM photograph of the composite obtained in Example 3 (2).
  • FIG. 21 (b) is a TEM photograph of the composite obtained in Example 3 (2).
  • FIG. 22 is a TEM photograph of the composite obtained in Comparative Example 2.
  • the present invention is a complex of a plurality of metal nanoparticles and an apoprotein derived from a heme protein dimer, wherein the metal nanoparticles are represented by formula (I) and / or formula (II): Heme contained in the group represented by formula (I) and / or formula (II) modified with one or more sites by the group represented and modified with the metal nanoparticles, and the amount of heme protein from which heme has been removed It is a complex in which a plurality of the metal nanoparticles and the protein are bound by binding to apoprotein derived from the body.
  • the hemoprotein dimer is preferably a dimer of cytochrome, hemoglobin, myoglobin, or peroxidase.
  • the metal nanoparticles include gold nanoparticles, silver nanoparticles, platinum nanoparticles, palladium nanoparticles, cadmium sulfide (CdS) nanoparticles, cadmium selenide (CdSe) nanoparticles, cadmium telluride (CdTe).
  • CdS cadmium sulfide
  • CdSe cadmium selenide
  • CdTe cadmium telluride
  • the present invention also provides a method for producing the composite of the present invention,
  • a group represented by formula (I) and / or formula (II) is obtained by reacting a plurality of metal nanoparticles with a disulfide represented by formula (I ′) and / or formula (II ′).
  • a disulfide represented by formula (I ′) and / or formula (II ′) is obtained by reacting a plurality of metal nanoparticles with a disulfide represented by formula (I ′) and / or formula (II ′).
  • a disulfide represented by formula (I ′) and / or formula (II ′ To modify one or more places A plurality of the modified metal nanoparticles are reacted with apoprotein derived from a heme protein dimer from which heme has been removed, and the metal nanoparticles are modified by the formula (I) and / or the formula (II).
  • the group represented by the formula (I) and / or the formula (II) may modify the metal nanoparticles at one or more positions.
  • all types are groups represented by formula (I)
  • all types are groups represented by formula (II)
  • formula (I) It may be a mixture of the group represented by the group represented by the formula (II).
  • lower means 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms, unless otherwise specified.
  • lower alkyl group a linear or branched alkane having 1 to 6 carbon atoms such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, neopentyl, hexyl, etc.
  • Preferable examples of the lower alkyl group include alkyl having 1 to 5 carbon atoms.
  • Preferable alkyl having 1 to 5 carbon atoms includes methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tertiary butyl, pentyl, neopentyl and the like.
  • lower alkenyl group includes vinyl, allyl, isopropenyl, 1-, 2- or 3-butenyl, 1-, 2-, 3- or 4-pentenyl, 1-, 2-, 3-, 4- or Examples thereof include straight-chain or branched alkenyl groups having 2 to 6 carbon atoms such as 5-hexenyl.
  • Preferred lower alkenyl groups include vinyl.
  • R ⁇ 1 >, R ⁇ 2 >, R ⁇ 3 > and R ⁇ 4 > respectively independently mean a lower alkyl group or a lower alkenyl group
  • Y is a group represented by -Z1-Y1-Z2-Y2- or -Z1-Y1-, wherein Z1 means a group bonded to -CO- in formula (I) and formula (II).
  • Y1 and Y2 independently represent — (CH 2 ) n1 —, — (CH 2 ) n1 —O— (CH 2 ) n2 —O— (CH 2 ) n3 — or — (CH 2 ) n1 —O— ( CH 2 ) n2 —O— (CH 2 ) n3 —O— (CH 2 ) n4 —, wherein n1, n2, n3 and n4 each independently represents an integer of 1 to 20
  • Means Z1 is selected from the group consisting of O, NH and S;
  • Z2 is selected from the group consisting of NHCO, CONH and NH;
  • M is selected from the group consisting of Fe 2+ , Fe 3+ , Zn 2+ , Co 2+ , Co 3+ , Mn 2+ and Mn 3+
  • the hemoprotein dimer is preferably a mutant in which one amino acid residue is replaced with a cysteine residue in the amino acid sequence
  • the complex in the present invention may take the form of a solvate, which is also included in the scope of the present invention.
  • Preferred solvates include hydrates, ethanol solvates, dimethyl sulfide solvates, dimethylformamide solvates and pyridine solvates.
  • the “apoprotein derived from a heme protein dimer” is a mutant in which one amino acid residue is replaced with a cysteine residue in the amino acid sequence of a natural heme protein.
  • the natural heme protein is not particularly limited as long as it is a protein having one or more heme, and examples thereof include cytochrome, hemoglobin, myoglobin, and peroxidase.
  • examples of the cytochrome include cytochrome b 562 , cytochrome b 5 and cytochrome P450 CAM , and among them, cytochrome b 562 is preferable.
  • the hemoglobin include hemoglobin (human), hemoglobin (bovine), hemoglobin (equine), and hemoglobin (rat).
  • hemoglobin human
  • myoglobin examples include myoglobin (sus scrofa), myoglobin (equine), myoglobin (human), and myoglobin (sperm whale).
  • myoglobin sperm whale
  • myoglobin sperm whale
  • myoglobin sperm whale
  • peroxidase examples include horseradish peroxidase, chloroperoxidase, and catalase. Among them, horseradish peroxidase is preferable.
  • a mutant in which one amino acid residue is replaced with a cysteine residue in the amino acid sequence of the natural heme protein is, for example, cytochrome (a) one of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 A protein comprising an amino acid sequence in which an amino acid is substituted with cysteine; (b) one or two amino acids in the amino acid sequence in which one amino acid of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with cysteine, A protein consisting of an added amino acid sequence and functioning as cytochrome.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of natural cytochrome b 562 .
  • the amino acid sequence of natural cytochrome b 562 is not limited to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and an appropriate one may be selected in the Protein Data Bank. Specific examples include ID number 1QPU (June 2, 1999), and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 corresponds to that of ID number 1QPU.
  • the one amino acid residue that is replaced by cysteine is preferably an amino acid residue that is located outside the structure when the cytochrome takes a three-dimensional structure. Moreover, it is necessary that the replacement with a cysteine residue does not affect the structure of the heme contained in the cytochrome.
  • the first to 106th amino acid residues preferably 60, 62, 63, 66, 67, 70, 73, 74, 76, 78
  • the 89th, 90th, 96th, 99th and 100th amino acid residues more preferably the 60th, 63rd, 66th, 67th and 100th amino acid residues can be replaced with cysteine residues.
  • such a hemoprotein variant is (a) a protein comprising an amino acid sequence in which one amino acid of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 is substituted with cysteine, ( b) an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence in which one amino acid of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 10 is substituted with cysteine, and hemoglobin A protein that functions as (human).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is the amino acid sequence of the natural hemoglobin ⁇ subunit
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence of the ⁇ subunit of natural hemoglobin.
  • the amino acid sequence of natural hemoglobin is not limited to the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, and an appropriate one may be selected in Protein Data Bank. Specific examples include those with ID number 1GZX (July 8, 2002), and the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 correspond to those with ID number 1GZX.
  • the one amino acid residue that can be replaced with cysteine is preferably an amino acid residue that is located outside the structure when the hemoglobin takes a three-dimensional structure. Moreover, it is necessary that the replacement with a cysteine residue does not affect the structure of the heme contained in the hemoglobin.
  • such a variant of heme protein is (a) a protein comprising an amino acid sequence in which one amino acid of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is substituted with cysteine, and (b) SEQ ID NO: It means an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence in which one amino acid of the amino acid sequence represented by 2 is substituted with cysteine, and which functions as myoglobin.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of wild-type myoglobin (sperm whale).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 further includes Met as an amino acid residue before the first amino acid residue Val of the natural amino acid sequence (the amino acid sequence of the protein actually extracted from whale). . Furthermore, aspartic acid, which is the 122nd amino acid residue in the natural amino acid sequence, corresponds to the 123rd amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but the amino acid residue is replaced by asparagine. Yes.
  • the amino acid sequence of wild-type myoglobin is not limited to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and an appropriate one may be selected in Protein Data Bank. Specific examples include those with ID number 2 MBW (June 20, 1996), and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 corresponds to that with ID number 2 MBW.
  • the one amino acid residue that can be replaced by cysteine is preferably an amino acid residue that is located outside the structure when the myoglobin takes a three-dimensional structure. Moreover, it is necessary that the replacement with a cysteine residue does not affect the structure of the heme contained in the myoglobin.
  • amino acid residues 1 to 154 preferably 9, 13, 17, 54, 103, 107, 114, 118, 122, 126
  • the 127th, 134th, 141st and 148th amino acid residues more preferably the 126th and 134th amino acid residues can be replaced with cysteine residues.
  • such a variant of heme protein is (a) a protein comprising an amino acid sequence in which one amino acid of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is substituted with cysteine, (b) A protein comprising an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence in which one amino acid of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with cysteine, and having horseradish peroxidase activity Means.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of natural horseradish peroxidase.
  • the amino acid sequence of natural horseradish peroxidase is not limited to that represented by SEQ ID NO: 3, and an appropriate one may be selected in Protein Data Bank. Specific examples include those with ID number 1ATJ (February 4, 1998), and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 corresponds to that with ID number 1ATJ.
  • the one amino acid residue to be replaced with cysteine is preferably an amino acid residue that is located outside the structure when the horseradish peroxidase takes a three-dimensional structure. Moreover, it is necessary that the replacement with a cysteine residue does not affect the structure of heme contained in the horseradish peroxidase.
  • the hemoprotein dimer is preferably a cytochrome, hemoglobin, myoglobin, or peroxidase dimer, and is a cytochrome having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. More preferably, the one amino acid residue is the 63rd histidine or myoglobin having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the one amino acid residue is the 126th alanine. .
  • metal nanoparticles commercially available ones may be used, or they may be manufactured and obtained with reference to literature. Examples of such documents include G. Frens, Nature (London) Phys. Sci. 1973, 241, and 20.
  • the metal nanoparticles include gold nanoparticles, silver nanoparticles, platinum nanoparticles, palladium nanoparticles, cadmium sulfide (CdS) nanoparticles, cadmium selenide (CdSe) nanoparticles, cadmium telluride (CdTe).
  • CdS cadmium sulfide
  • CdSe cadmium selenide
  • CdTe cadmium telluride
  • the particle size of the metal nanoparticles is, for example, 1 nm to 2500 nm, preferably 1 nm to 100 nm, more preferably 1 nm to 20 nm.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 in the formula (I) and / or formula (II) each independently represents a lower alkyl group or a lower alkenyl group.
  • Y is a group represented by the formula —NH— (CH 2 ) n1 —NH—CO— (CH 2 ) n2 —, wherein n1 and n2 each independently represents an integer of 1 to 20
  • —NH— means a group that binds to —CO— in formula (I) and / or formula (II), wherein the hemoprotein dimer is a dimer of cytochrome or myoglobin, and the metal nano More preferably, the particles are gold nanoparticles or silver nanoparticles.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 in the formula (I) and / or formula (II) each independently represents a lower alkyl group or a lower alkenyl group.
  • Y is a group represented by the formula —NH— (CH 2 ) n1 —NH—CO— (CH 2 ) n2 —, wherein n1 and n2 each independently represents an integer of 1 to 20
  • —NH— means a group that binds to —CO— in formula (I) and / or formula (II)
  • the heme protein dimer is cytochrome having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the composite of the present invention is obtained by reacting (a) a plurality of metal nanoparticles with a disulfide represented by the formula (I ′) and / or the formula (II ′) to form metal nanoparticles.
  • a solution of a plurality of metal nanoparticles for example, a metal nanoparticle protected with citric acid, is made alkaline, and an excessive amount of a disulfide compound represented by formula (I ′) and / or formula (II ′) is added thereto.
  • a disulfide compound represented by formula (I ′) and / or formula (II ′) is added thereto.
  • the unreacted disulfide compound represented by the formula (I ′) and / or the formula (II ′) and the unreacted lipoic acid are removed, and the metal nanoparticles are converted into the formula (I) and / or the formula ( It can be modified at one or more positions by the group represented by II).
  • the reaction between the metal nanoparticles and the disulfide represented by the formula (I ′) and / or the formula (II ′) is carried out in a solvent under an inert gas (eg, argon, nitrogen, etc.) atmosphere. Can be done.
  • an inert gas eg, argon, nitrogen, etc.
  • the reaction solvent is not limited.
  • polar solvents such as alcohols (eg, methanol, ethanol, etc.), water, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, etc., buffer solutions (eg, Tris-HCl buffer solution, phosphorus Acid buffer, borate buffer, carbonate buffer) and the like.
  • the reaction temperature is not limited, but is, for example, 0 ° C. to 100 ° C., preferably 4 ° C. to 40 ° C., more preferably 4 ° C. to 10 ° C.
  • the reaction time is not limited, but is, for example, 1 minute to 60 hours, preferably 1 hour to 12 hours, more preferably 6 hours to 10 hours.
  • the metal nanoparticle is used instead of the lipoic acid.
  • Other protective agents that can modify the particles may be used. Examples of such a protective agent include alkanethiol and mercaptopropionic acid.
  • the disulfide compound represented by the formula (I ′) and / or the formula (II ′) used in the step (a) can be produced, for example, as follows. For simplification, only an example of the disulfide compound represented by the formula (I ′) is shown, but the disulfide compound represented by the formula (II ′) which is a positional isomer can be produced in the same manner.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 each independently represents a hydrogen atom, a lower alkyl group or a lower alkenyl group
  • Y is a group represented by -Z1-Y1-Z2-Y2- or -Z1-Y1-, wherein Z1 means a group bonded to -CO- in formula (I) and formula (II).
  • Y1 and Y2 are independently — (CH 2 ) n1 —, — (C 6 H 4 ) n5 —, — (CH 2 ) n1 — (C 6 H 4 ) n5 —, — (C 6 H 4 ) n5 — (CH 2 ) n1 —, — (CH 2 ) n1 — (C 6 H 4 ) n5 — (CH 2 ) n2 —, — (CH 2 ) n1 —O— (CH 2 ) n2 —, — (CH 2 N1 —O— (CH 2 ) n2 —O— (CH 2 ) n3 — or — (CH 2 ) n1 —O— (CH 2 ) n2 —O— (CH 2 ) n3 —O— (CH 2 ) n4
  • n1, n2, n3, n4 and n5 each independently represents an integer of 1 to 20,
  • the compound represented by the formula (V) is obtained by coupling the heme body represented by the formula (III) and the disulfide body (IV). From this compound of formula (V), O (P) can be deprotected, and then M can be introduced into heme to obtain the disulfide represented by formula (I ').
  • the mutant gene in which one amino acid residue is replaced with a cysteine residue in the amino acid sequence of a natural heme protein is based on the base sequence of the gene of the natural heme protein, using guinea pig total RNA or the like.
  • Cloning may be performed, or DNA may be chemically synthesized using the phosphoramidite method.
  • the cloning method is not particularly limited, and can be performed using, for example, a commercially available cloning kit.
  • the mutant gene may be introduced into a host cell.
  • Examples of the host cell include animal cells, plant cells, insect cells, yeasts, bacteria, and the like.
  • Examples of the gene introduction method include a lithium acetate method, a calcium phosphate method, a method using a liposome, electroporation, a method using a viral vector, a micropipette injection method, and the like.
  • it may be introduced using an integration type into a host chromosome or an artificial chromosome or plasmid type capable of autonomous replication / distribution.
  • the gene to be introduced into the host cell is operably linked to necessary regulatory sequences so that it is constitutively or arbitrarily expressed in the host cell.
  • the regulatory sequence is a base sequence necessary for expression of the gene operably linked in a host cell.
  • examples of regulatory sequences suitable for eukaryotic cells include promoters, polyadenylation signals, enhancers. Etc. Said operatively connected means that the components are juxtaposed so that they can perform their functions.
  • the composite of the present invention When the composite of the present invention was observed with a transmission electron microscope (TEM), it was spread two-dimensionally (see FIG. 9 (d)). From observation by this TEM, it can be estimated that the composite of the present invention has, for example, the following network structure.
  • TEM transmission electron microscope
  • the composite of the present invention has a two-dimensionally expanded structure as described above, for example, when it is placed on a substrate, it may be thinly and two-dimensionally expanded.
  • protein is removed by baking, plasma irradiation, washing with acidic aqueous solution, etc.
  • positioned Such a substrate has a large metal surface area and can save the amount of metal when used as a catalyst.
  • the composite on the substrate is expected to have conductivity, and application to molecular diodes, molecular circuits and the like is also expected.
  • the composite on the substrate has metal nanoparticles arranged at intervals (preferably at equal intervals), cadmium sulfide (CdS) nanoparticles, zinc sulfide (ZnS) nanoparticles, etc. are used as metal nanoparticles.
  • CdS cadmium sulfide
  • ZnS zinc sulfide
  • semiconductor ultrafine particles quantum dots
  • the present invention may also be a complex of metal nanoparticles and apoprotein derived from heme protein.
  • the metal nanoparticle is modified at least one place by a group represented by formula (I) and / or formula (II),
  • the metal nanoparticle is formed by binding the heme contained in the group represented by the formula (I) and / or the formula (II) modified with the metal nanoparticle and the apoprotein derived from the heme protein from which heme has been removed.
  • a complex of heme protein-derived apoprotein is
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 each independently represents a hydrogen atom, a lower alkyl group or a lower alkenyl group
  • Y is a group represented by -Z1-Y1-Z2-Y2- or -Z1-Y1-, wherein Z1 means a group bonded to -CO- in formula (I) and formula (II).
  • Y1 and Y2 are independently — (CH 2 ) n1 —, — (C 6 H 4 ) n5 —, — (CH 2 ) n1 — (C 6 H 4 ) n5 —, — (C 6 H 4 ) n5 — (CH 2 ) n1 —, — (CH 2 ) n1 — (C 6 H 4 ) n5 — (CH 2 ) n2 —, — (CH 2 ) n1 —O— (CH 2 ) n2 —, — (CH 2 N1 —O— (CH 2 ) n2 —O— (CH 2 ) n3 — or — (CH 2 ) n1 —O— (CH 2 ) n2 —O— (CH 2 ) n3 —O— (CH 2 ) n4
  • n1, n2, n3, n4 and n5 each independently represents an integer of 1 to 20,
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , Y and the metal nanoparticles in formula (I) and / or formula (II) This is the same as R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , Y and the metal nanoparticles in the complex of the metal nanoparticles and the apoprotein derived from the hemoprotein dimer.
  • the “hemoprotein-derived apoprotein” is the same as the “hemoprotein dimer-derived apoprotein”.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently Y represents a lower alkyl group or a lower alkenyl group, and Y is a group represented by the formula —NH— (CH 2 ) n1 —NH—CO— (CH 2 ) n2 —, wherein n1 and n2 are each independently
  • —NH— means a group that binds to —CO—
  • the heme protein is cytochrome or myoglobin
  • the metal nanoparticles are gold nanoparticles or silver nanoparticles.
  • R 1 , R 2 , R 3, and R 4 in the formula (I) and / or formula (II) are each independently A lower alkyl group or a lower alkenyl group, wherein Y is a group represented by the formula —NH— (CH 2 ) n1 —NH—CO— (CH 2 ) n2 —, wherein n1 and n2 are Each independently represents an integer of 1 to 20, and —NH— means a group bonded to —CO— in formula (I) and / or formula (II), and the hemoprotein is represented by SEQ ID NO: 1.
  • the complex of the metal nanoparticles and the apoprotein derived from heme protein is (A) A plurality of metal nanoparticles are reacted with a disulfide compound represented by the formula (I ′) and / or the formula (II ′) to express the metal nanoparticles by the formula (I) and / or the formula (II).
  • Apoproteins derived from heme proteins from which heme has been removed can be obtained by methods known in the literature, such as Teale, F. W. J. Biochim. Biophys. Acta.1959, 35, 543. and E. Itagaki, and L. P. According to the method described in Hager, J. Biol. Chem. 1966, 241, 3687.
  • the complex of the metal nanoparticle and the heme protein polymer having an apoprotein derived from a heme protein at the end is at least one site depending on the group represented by the formula (I) and / or the formula (II).
  • Heme protein which is modified and is modified with the metal nanoparticles modified by the group represented by the formula (I) and / or the formula (II), and the heme protein from which the heme has been removed and the apoprotein derived from the heme protein It is a complex in which a metal nanoparticle and a heme protein polymer having an apoprotein derived from a heme protein are bonded to each other by binding to the polymer.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 each independently represents a hydrogen atom, a lower alkyl group or a lower alkenyl group
  • Y is a group represented by -Z1-Y1-Z2-Y2- or -Z1-Y1-, wherein Z1 means a group bonded to -CO- in formula (I) and formula (II).
  • Y1 and Y2 are independently — (CH 2 ) n1 —, — (C 6 H 4 ) n5 —, — (CH 2 ) n1 — (C 6 H 4 ) n5 —, — (C 6 H 4 ) n5 — (CH 2 ) n1 —, — (CH 2 ) n1 — (C 6 H 4 ) n5 — (CH 2 ) n2 —, — (CH 2 ) n1 —O— (CH 2 ) n2 —, — (CH 2 N1 —O— (CH 2 ) n2 —O— (CH 2 ) n3 — or — (CH 2 ) n1 —O— (CH 2 ) n2 —O— (CH 2 ) n3 —O— (CH 2 ) n4
  • n1, n2, n3, n4 and n5 each independently represents an integer of 1 to 20,
  • the metal nanoparticles are the same as R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , Y and metal nanoparticles in a complex of a plurality of metal nanoparticles and an apoprotein derived from a hemoprotein dimer.
  • examples of the “hemoprotein polymer having an apoprotein derived from heme protein at the end” include a protein polymer having the following formula.
  • R 11 , R 12 , R 13 and R 14 each independently represents a hydrogen atom, a lower alkyl group or a lower alkenyl group
  • Z is a group represented by —Y11—Y12—, wherein Y11 means a group bonded to —CO— in formula (IA) and formula (IB);
  • Y11 is selected from the group consisting of O, NH and S;
  • Y12 represents the formula — (CH 2 ) n1 —, — (C 6 H 4 ) n5 —, — (CH 2 ) n1 — (C 6 H 4 ) n5 —, — (C 6 H 4 ) n5 — (CH 2 N1 ⁇ , — (CH 2 ) n1 — (C 6 H 4 ) n5 — (CH 2 ) n2 —, — (CH 2 ) n1 —O— (CH 2 ) n2 —
  • the mutant is obtained by replacing one amino acid residue with a cysteine residue in the amino acid sequence of a natural heme protein.
  • —SH means a side chain thiol group of the cysteine residue
  • Heme means natural heme
  • formula HS-X 1 means an apo form of the mutant.
  • the protein polymers represented by the general formulas (IA) and (IB) include both random copolymers and block copolymers, and are not limited to either one.
  • Examples of the complex of the metal nanoparticle and the hemoprotein polymer having an apoprotein derived from hemoprotein at the end include R 1 , R 2 , R 3 and R 4 in the formula (I) and / or formula (II). Each independently represents a lower alkyl group or a lower alkenyl group, and Y is a group represented by the formula —NH— (CH 2 ) n1 —NH—CO— (CH 2 ) n2 —, n1 and n2 each independently represents an integer of 1 to 20, and —NH— represents a group bonded to —CO— in Formula (I) and / or Formula (II);
  • a heme protein polymer having a terminal apoprotein derived from heme protein is a polymer represented by the formula (IA), In the formula (IA), R 11 , R 12 , R 13 and R 14 each independently represents a lower alkyl group or a lower alkenyl group, and Y 11 is selected from the group consisting of O,
  • R 1 , R 2 , R 3 and Each R 4 independently represents a lower alkyl group or a lower alkenyl group
  • Y is a group represented by the formula —NH— (CH 2 ) n1 —NH—CO— (CH 2 ) n2 —;
  • n1 and n2 each independently represents an integer of 1 to 20, and —NH— represents a group bonded to —CO— in formula (I) and / or formula (II)
  • a heme protein polymer having a terminal apoprotein derived from heme protein is a polymer represented by the formula (IA),
  • R 11 , R 12 , R 13 and R 14 each independently represent a lower alkyl group or a lower alkenyl group
  • Y 11 is O or NH
  • a complex of the metal nanoparticles and a heme protein polymer having an apoprotein derived from heme protein at its end (A) A plurality of metal nanoparticles are reacted with a disulfide compound represented by the formula (I ′) and / or the formula (II ′) to express the metal nanoparticles by the formula (I) and / or the formula (II).
  • a heme protein polymer having a terminal apoprotein derived from a heme protein from which heme has been removed is prepared according to a method known in the literature, for example, the method described in Angew. Chem., Int. Ed., 48, 1271-1274 (2009). Can be manufactured.
  • the complex of the metal nanoparticles and the heme protein-derived apoprotein has a structure in which the cofactor heme serving as the active site of the hemoprotein is close to the metal nanoparticles. Therefore, this complex can efficiently transfer electrons to the metal nanoparticles by utilizing the electron transfer function of the hemoprotein.
  • This complex is a bioelectrode that combines the functions of heme proteins and their variants (binding to gas molecules such as oxygen molecules, electron transfer, catalytic reactions including oxidation reactions) and the characteristics of metal nanoparticles. Application in the field of materials is conceivable.
  • the complex of the metal nanoparticle and the hemoprotein polymer having an apoprotein derived from hemoprotein at the end has a loosely assembled structure.
  • the composite has an arrangement in which the distance between the metal nanoparticles is relatively long.
  • the metal nanoparticles may spread two-dimensionally at an appropriate distance.
  • Such a substrate can save the amount of metal when the metal nanoparticles are arranged in a wide area and used as a catalyst.
  • the present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the scope of the present invention is not limited by the following examples.
  • Various spectra were measured using the following instrument.
  • the nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum was measured using a Bruker DPX-400 nuclear magnetic resonance apparatus (400 MHz), and the residual signal of the measurement solvent was used as an internal standard.
  • Electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry (ESI-TOF-MS) was measured using an Applied Biosystems Mariner API-TOF workstation (Workstation).
  • the UV-visible absorption spectrum was measured using a self-recording spectrophotometer UV-2550 or UV-3150 manufactured by Shimadzu Corporation.
  • the pH of the aqueous solution was measured using a pH meter F-52 manufactured by Horiba.
  • a pH meter F-52 manufactured by Horiba.
  • SEC size exclusion chromatography
  • AKTA FPLC system exclusion limit: 1.0 ⁇ 10 5 Da
  • UPC-900 detector was used for detection.
  • electrophoresis measurement measurement was performed using a fully automated electrophoresis system Phassystem manufactured by GE Healthcare.
  • the transmission electron microscope (TEM) was measured using Hitachi H-7650 ZeroA manufactured by Hitachi.
  • each “positional isomer” is as follows.
  • the positional isomer of Compound 6 is Compound 6 ′
  • the positional isomer of Compound 7 is Compound 7 ′ and Compound 7 ′′
  • the positional isomer of Compound 8 is Compound 8 ′ and Compound 8 ′′
  • the positional isomer of Compound 1 is Compound 1 ′ and Compound 1 ′′.
  • Formation of gold nanoparticles was confirmed by obtaining a UV-vis spectrum having an absorption maximum near 520 nm, which is characteristic of surface plasmons (FIG. 1). Moreover, the production
  • FIG. 3 shows a UV-vis spectrum
  • FIG. 4 shows a transmission electron micrograph of gold nanoparticles modified with the obtained compound 1 and its positional isomer.
  • Quantification of Compound 1 and its regioisomer on the modified gold nanoparticles was performed by UV-vis measurement.
  • potassium cyanide is added to the modified gold nanoparticle solution, the gold nanoparticles are decomposed into K [Au (CN) 4 ], and strong absorption derived from surface plasmons disappears.
  • 1M aqueous potassium cyanide solution (30 ⁇ L) was added to the modified gold nanoparticle solution (30 ⁇ L) and incubated for 2 minutes to complete the reaction.
  • Cytochrome b 562 mutant is Takara (TaKaRa) Co.
  • the PCR was performed by polymerase chain reaction (PCR) using an LA PCR in vitro mutagenesis kit according to the attached protocol.
  • Escherichia coli TG1 having an expression plasmid (pUC118) of wild-type cytochrome b 562 (hereinafter abbreviated as b 562 ) was mass-cultured to prepare a plasmid, which was used as a template for preparing an H63C mutant.
  • Mutation site introduction primer SEQ ID NO: 5
  • M13 primer M4 (SEQ ID NO: 6) (5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3 ′), or M13 primer RV SEQ ID NO: 7 (5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ′) and MUT4 primer SEQ ID NO: 8 ( 5'-GGCCAGTGCCTAGCTTACAT-3 '), and the first stage DNA amplification by PCR was performed in each system.
  • a hetero double-stranded DNA was prepared from these two first-stage PCR products, and the second-stage amplification by PCR of the hetero double-stranded DNA was performed using M13 primer RV and M13 primer M4.
  • a DNA fragment having the base sequence of the b562 mutant was excised with restriction enzymes EcoRI and HindIII and specifically ligated to the EcoRI / HindIII sites of the pUC118 vector. Thereafter, Escherichia coli strain TG1 was transformed with the obtained expression plasmid. The base sequence of the H63C mutant was confirmed by DNA sequencing (SEQ ID NO: 4). At that time, a mutation was also observed at the position of Ala37, but this mutation was unchanged (GCC was mutated to GCG).
  • Variant protein using the E. coli strain TG1 literature (Y. Kawamata, S. Machida, T. Ogawa, K. Horie, T. Nagamune, J. Lumin.
  • Example 1 [Physical properties of the composite obtained in Example 1 (4) and the composite obtained in Comparative Example 1]
  • Agarose gel electrophoresis The complex obtained in Example 1 (4) was confirmed by agarose gel electrophoresis. Glycerol was added 10% to the solution containing the complex and added to 1.5% agarose in TBE buffer. Electrophoresis was performed at 100 V and 80 mA for 30 minutes. The obtained electrophoresis gel is shown in FIG. In FIG. 8, lane 1 is a gold nanoparticle modified with compound 1 and its positional isomer (Example 1 (2)), lane 2 is a composite obtained in Comparative Example 1, and lane 3 is Example 1 ( It is an electrophoresis of the complex obtained in 4). From FIG. 8, it was confirmed that the complex of the present invention was a complex of gold nanoparticles and apoprotein obtained by removing heme from the dimer of cytochrome b 562 mutant.
  • Example 2 (2) Measurement by Transmission Electron Microscope (TEM) The solution of the composite obtained in Example 1 (4) was dropped on a copper grid carrying a collodion support film and dried sufficiently. Ultrapure water was dropped on the grid and absorbed with filter paper. This operation was repeated twice to remove the salt. This grid was set in a TEM measuring device and measured at an acceleration voltage of 100 kV. The obtained TEM photographs are shown in FIGS. 9 (a) to 9 (d).
  • FIG. 10 is a TEM photograph of the composite obtained in Comparative Example 1. From FIG. 9, since the gold nanoparticles were associated by the apo body of the heme protein dimer and a gap of 2-5 nm was observed between the gold nanoparticles, it was mediated through the heme protein dimer. It was confirmed to be a gold nanoparticle aggregate.
  • Example 1 (3) Measurement by Scanning Electron Microscope (SEM) The solution of the composite obtained in Example 1 (4) was dropped onto a copper grid carrying an elastic carbon support film and sufficiently dried. Ultrapure water was dropped on the grid and absorbed with filter paper. This operation was repeated twice to remove the salt.
  • This grid was set in an SEM measuring apparatus (JEOL JSM-6701F) and measured at an acceleration voltage of 5.0 kV.
  • the obtained SEM photograph is shown in FIG.
  • FIG. 12 is an SEM photograph of the composite obtained in Comparative Example 1. From FIG. 11, it was confirmed that in the case where the apoprotein of the hemoprotein dimer is present, the gold nanoparticles are aggregated, whereas in the case of the non-dimer, the aggregation is hardly observed.
  • the mutant (VII-2) is a cytochrome b 562 mutant (H63C, produced in Example 1 (3) (i)).
  • —SH means a side chain thiol group of the cysteine residue
  • Heme means natural heme
  • formula HS-X ′′ means an apo form of the mutant.
  • each “positional isomer” is as follows.
  • the positional isomer of Compound 1 (8) is Compound 1 (8) ′
  • the positional isomer of Compound (I-4) is Compound (I-4) ′
  • the positional isomer of Compound (II-4) is Compound (II). -4) '.
  • the polymer (III-3) is represented by the following formula.
  • n and n are integers, and m + n is 10.
  • Example 2 (2) Measurement by transmission electron microscope (TEM) The solution of the composite obtained in Example 2 (3) was dropped on a copper grid on which a collodion support film was supported and sufficiently dried. Ultrapure water was dropped on the grid and absorbed with filter paper. This operation was repeated twice to remove the salt. This grid was set in a TEM measuring device and measured at an acceleration voltage of 100 kV. The obtained TEM photograph is shown in FIG. From FIG. 14, it was confirmed that the cytochrome b 562 polymer was bonded to the gold nanoparticles and maintained an interval of several tens of nm or more without association between the gold nanoparticles.
  • TEM transmission electron microscope
  • the reaction mixture was allowed to cool at room temperature to obtain citric acid-protected silver nanoparticles. Formation of silver nanoparticles was confirmed by obtaining a UV-vis spectrum having an absorption maximum near 396 nm, which is characteristic of surface plasmons (FIG. 17). Moreover, the production
  • FIG. 19 shows a transmission electron micrograph of the obtained silver nanoparticles modified with Compound 1 and its positional isomer.
  • FIG. 21 (a) and 21 (b) are TEM photographs of a complex of heme protein obtained in Comparative Example 2 with an aposome. In FIG. 22, formation of silver nanoparticle aggregates could not be confirmed.
  • FIG. 21 (a) and FIG. 21 (b) since the silver nanoparticles are associated by a heme protein dimer, and a gap of 2-5 nm was observed between the silver nanoparticles, It was confirmed to be an aggregate of silver nanoparticles via heme protein.
  • the composite of the present invention can be disposed on a substrate and used as a catalyst.

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Abstract

金属ナノ粒子間の距離を特定に保った金属ナノ粒子とタンパク質との複合体を提供する。複数の金属ナノ粒子とヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質との複合体であって、　前記金属ナノ粒子は、式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基により１箇所以上修飾され、前記金属ナノ粒子を修飾した式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基に含まれるヘムと、ヘムが除去された前記ヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質とが結合することにより、複数の前記金属ナノ粒子と前記タンパク質とが結合した複合体。 前記式（Ｉ）中、　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｍ、Ｙは、明細書中で定義のとおり。

Description

複数の金属ナノ粒子とヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質との複合体
　本発明は、複数の金属ナノ粒子とヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質との複合体に関する。
　金属ナノ粒子は、配線材料、色素、センサーとして注目を集めている。この金属ナノ粒子とタンパク質との複合体は、センシングやイメージング、タンパク質の活性制御などの幅広い応用が可能であり、新しいバイオマテリアルとして注目されている。金属ナノ粒子とタンパク質との複合体は、金属ナノ粒子とタンパク質から静電相互作用によって製造されることが報告されている（例えば、非特許文献１）。
　しかしながら、ヘムタンパク質を介して金属ナノ粒子間の距離を特定に保った複合体については、知られていなかった。
著者：林高史ら, 論文タイトル："金ナノ粒子－ヘムタンパク質ポリマー複合体の創製", 雑誌名：第２４回生体機能関連シンポジウム・第１２回バイオテクノロジー部会シンポジウム　講演要旨集, ２００９年、p.２０２
　そこで、本発明は、ヘムタンパク質を介して金属ナノ粒子間の距離を特定に保った金属ナノ粒子とタンパク質との複合体の提供を目的とする。
　本発明は、複数の金属ナノ粒子とヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質との複合体であって、
　前記金属ナノ粒子は、式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基により１箇所以上修飾され、
　前記金属ナノ粒子を修飾した式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基に含まれるヘムと、ヘムが除去された前記ヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質とが結合することにより、複数の前記金属ナノ粒子と前記タンパク質とが結合した複合体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  
前記式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
　Ｙは、－Ｚ１－Ｙ１－Ｚ２－Ｙ２－または－Ｚ１－Ｙ１－で表される基であり、ただし、Ｚ１は式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、－ＣＯ－と結合する基を意味し、
　Ｙ１およびＹ２は、独立に、－（ＣＨ２）ｎ１－、－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－、－（ＣＨ２）ｎ１－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－、－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－（ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２）ｎ１－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－（ＣＨ２）ｎ２－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－または－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ４－で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立して１～２０の整数を意味し、
　Ｚ１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
　Ｚ２は、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨおよびＮＨからなる群から選択され、
　Ｍは、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋およびＭｎ３＋からなる群から選択され、
　前記ヘムタンパク質２量体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えた変異体である。
　本発明の複合体は、ヘムタンパク質を介して金属ナノ粒子間の距離を特定に保った金属ナノ粒子とタンパク質との複合体である。
図１は、実施例１（２）において製造したクエン酸で修飾された金ナノ粒子のＵＶ－ｖｉｓスペクトルである。 図２は、実施例１（２）において製造したクエン酸で修飾された金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真である。 図３は、実施例１（２）において製造した化合物１で修飾された金ナノ粒子のＵＶ－ｖｉｓスペクトルである。 図４は、実施例１（２）において製造した化合物１で修飾された金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真である。 図５は、実施例１（２）において製造した修飾された金ナノ粒子中に含まれる化合物１を定量するためのＵＶ－ｖｉｓスペクトルである。 図６は、実施例１（３）において製造したシトクロムｂ５６２変異体の２量体のサイズ排除クロマトグラフィーのチャートである。 図７は、実施例１（３）において製造したシトクロムｂ５６２変異体の２量体からヘムが除去されたアポタンパク質のＵＶ－ｖｉｓスペクトルである。 図８は、実施例１（４）で得られた複合体と、比較例１で得られた複合体、実施例１（２）において製造した化合物１で修飾された金ナノ粒子のアガロースゲル電気泳動である。 図９（ａ）は、実施例１（４）で得られた複合体のＴＥＭ写真である。 図９（ｂ）は、実施例１（４）で得られた複合体のＴＥＭ写真である。 図９（ｃ）は、実施例１（４）で得られた複合体のＴＥＭ写真である。 図９（ｄ）は、実施例１（４）で得られた複合体のＴＥＭ写真である。 図１０（ａ）は、比較例１で得られた複合体のＴＥＭ写真である。 図１０（ｂ）は、比較例１で得られた複合体のＴＥＭ写真である。 図１０（ｃ）は、比較例１で得られた複合体のＴＥＭ写真である。 図１１は、実施例１（４）で得られた複合体のＳＥＭ写真である。 図１２は、比較例１で得られた複合体のＳＥＭ写真である。 図１３は、実施例２（３）で得られた複合体と、比較例１で得られた複合体、実施例１（２）において製造した化合物１で修飾された金ナノ粒子、リポ酸で修飾した金ナノ粒子のアガロースゲル電気泳動である。 図１４は、実施例２（３）で得られた複合体のＴＥＭ写真である。 図１５（ａ）は、リポ酸で修飾した金ナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）の測定結果である。 図１５（ｂ）は、比較例１で得られた複合体の動的光散乱（ＤＬＳ）の測定結果である。 図１５（ｃ）は、実施例２（３）で得られた複合体の動的光散乱（ＤＬＳ）の測定結果である。 図１６は、シトクロムｂ５６２ポリマー（ＩＩＩ－３）のＵＶ－ｖｉｓスペクトルである。 図１７は、実施例３（１）において製造したクエン酸で修飾された銀ナノ粒子のＵＶ－ｖｉｓスペクトルである。 図１８は、実施例３（１）において製造したクエン酸で修飾された銀ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真である。 図１９は、実施例３（１）において製造した化合物１で修飾された銀ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真である。 図２０は、実施例３（１）において製造した修飾された銀ナノ粒子中に含まれる化合物１の存在を確認するためのＵＶ－ｖｉｓスペクトルである。 図２１（ａ）は、実施例３（２）で得られた複合体のＴＥＭ写真である。 図２１（ｂ）は、実施例３（２）で得られた複合体のＴＥＭ写真である。 図２２は、比較例２で得られた複合体のＴＥＭ写真である。
　本発明は、前記のように、複数の金属ナノ粒子とヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質との複合体であって、前記金属ナノ粒子は、式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基により１箇所以上修飾され、前記金属ナノ粒子を修飾した式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基に含まれるヘムと、ヘムが除去された前記ヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質とが結合することにより、複数の前記金属ナノ粒子と前記タンパク質とが結合した複合体である。
　また、本発明において、前記ヘムタンパク質２量体は、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビンまたはペルオキシダーゼの２量体であるのが好ましい。
　また、本発明において、前記金属ナノ粒子は、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、白金ナノ粒子、パラジウムナノ粒子、硫化カドミウム（ＣｄＳ）ナノ粒子、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）ナノ粒子、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）ナノ粒子、硫化亜鉛（ＺｎＳ）ナノ粒子、セレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）ナノ粒子、もしくはテルル化亜鉛（ＺｎＴｅ）ナノ粒子または、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）、セレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）およびテルル化亜鉛（ＺｎＴｅ）からなる群から選択される２種類から構成されるコア／シェル型のナノ粒子であるのが好ましい。
　また、本発明は、本発明の複合体の製造方法であって、
　複数の金属ナノ粒子と式（Ｉ’）および／または式（ＩＩ’）で表されるジスルフィド体と反応させて、金属ナノ粒子を式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基により１箇所以上修飾し、
　複数の前記修飾された金属ナノ粒子と、ヘムが除去されたヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質とを反応させ、前記金属ナノ粒子を修飾した式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基に含まれるヘムと、ヘムが除去された前記ヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質とが結合することにより、複数の前記金属ナノ粒子と前記タンパク質とが結合した複合体を得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  
　式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基は、１箇所以上、金属ナノ粒子を修飾してもよい。前記基で２箇所以上金属ナノ粒子を修飾する場合、全ての種類が式（Ｉ）で表される基、または全ての種類が式（ＩＩ）で表される基、または、式（Ｉ）で表される基と式（ＩＩ）で表される基の混合物であってもよい。
　本発明において、「低級」は特に指示がなければ、炭素原子が１～６個、好ましくは炭素原子１～４個を意味する。
　「低級アルキル基」としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等のような直鎖状もしくは分岐鎖状の炭素数１～６のアルカンの残基を意味する。低級アルキル基の好ましい例としては、炭素数１～５のアルキルが挙げられる。好ましい炭素数１～５のアルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ペンチル、ネオペンチル等が挙げられる。
　「低級アルケニル基」としては、ビニル、アリル、イソプロペニル、１－、２－もしくは３－ブテニル、１－、２－、３－もしくは４－ペンテニル、１－、２－、３－、４－もしくは５－へキセニル等の炭素数２～６個を有する直鎖または分枝鎖アルケニル基が挙げられる。好ましい低級アルケニル基としては、ビニルが挙げられる。
　前記複合体としては、前記式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、Ｙが－Ｚ１－Ｙ１－Ｚ２－Ｙ２－で表される場合、Ｙとしては、例えば、以下の表で表されるＮｏ．１～Ｎｏ．２７の式が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　Ｙが－Ｚ１－Ｙ１－Ｚ２－Ｙ２－で表される場合、前記表１中のＮｏ．１、２、３、１０、１１、１２、１９、２０、２１の式で表される基が好ましく、Ｎｏ．１、２、３の式で表される基がより好ましい。
　前記複合体としては、前記式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、Ｙが－Ｚ１－Ｙ１－で表される場合、Ｙとしては、例えば、以下の表で表されるＮｏ．３０～Ｎｏ．３５の式が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
　Ｙが－Ｚ１－Ｙ１－で表される場合、前記表２中のＮｏ３０、３１の式で表される基が好ましく、Ｎｏ．３０の式で表される基がより好ましい。
　また、前記複合体としては、前記式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
　Ｙは、－Ｚ１－Ｙ１－Ｚ２－Ｙ２－または－Ｚ１－Ｙ１－で表される基であり、ただし、Ｚ１は式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、－ＣＯ－と結合する基を意味し、
　Ｙ１およびＹ２は、独立に、－（ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－または－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ４－で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、およびｎ４は、それぞれ独立して１～２０の整数を意味し、
　Ｚ１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
　Ｚ２は、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨおよびＮＨからなる群から選択され、
　Ｍは、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋およびＭｎ３＋からなる群から選択され、
　前記ヘムタンパク質２量体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えた変異体が好ましい。
　本発明における複合体は、溶媒和物の形をとることもありうるが、これも本発明の範囲に含まれる。溶媒和物としては、好ましくは、水和物、エタノール和物、ジメチルスルフィド和物、ジメチルホルムアミド和物、ピリジン和物が挙げられる。
　前記「ヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質」は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えた変異体である。この天然のヘムタンパク質は、ヘムを１以上有するタンパク質であれば特に限定されないが、例えば、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビン、またはペルオキシダーゼが挙げられる。前記シトクロムとしては、例えばシトクロムｂ５６２、シトクロムｂ５、シトクロムＰ４５０CAMが挙げられ、中でもシトクロムｂ５６２が好ましい。前記ヘモグロビンとしては、例えばヘモグロビン（human）、ヘモグロビン（bovine）、ヘモグロビン(equine)、ヘモグロビン(rat)が挙げられ、中でもヘモグロビン（human）が好ましい。前記ミオグロビンとしては、例えばミオグロビン(sus scrofa)、ミオグロビン(equine)、ミオグロビン(human)、ミオグロビン（sperm whale）が挙げられ、中でもミオグロビン（sperm whale）およびミオグロビン(sus scrofa)が好ましい。前記ペルオキシダーゼとしては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、クロロペルオキシダーゼ、カタラーゼが挙げられ、中でも西洋ワサビペルオキシダーゼが好ましい。
　本発明において、前記天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えた変異体は、例えば、シトクロムの場合、（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつシトクロムとして機能するタンパク質を意味する。なお、前記配列番号１で表わされるアミノ酸配列は、天然のシトクロムb５６２のアミノ酸配列である。天然のシトクロムb５６２のアミノ酸配列は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列に限定されず、Protein Data Bankにおいて、適切なものを選択すればよい。具体的には、ＩＤ番号1QPU（１９９９年６月２日付）のものが挙げられ、前記配列番号１で表わされるアミノ酸配列は、ＩＤ番号1QPUのものに対応する。システインに置き換えられる前記１つのアミノ酸残基は、前記シトクロムが立体構造をとる際、構造の外側に配置されるようなアミノ酸残基が好ましい。また、システイン残基に置き換えられたことにより、前記シトクロムに含まれるヘムの構造に影響を与えない必要がある。このような置換を行うため、例えば配列番号１のアミノ酸配列において、第１～１０６番目のアミノ酸残基、好ましくは第６０、６２、６３、６６、６７、７０、７３、７４、７６、７８、８９、９０、９６、９９および１００番目のアミノ酸残基、より好ましくは第６０、第６３、第６６、第６７および第１００番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えることができる。
　また、このようなヘムタンパク質の変異体は、例えば、ヘモグロビンの場合、（ａ）配列番号９または配列番号１０で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号９または配列番号１０で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘモグロビン（human）として機能するタンパク質を意味する。なお、前記配列番号９で表わされるアミノ酸配列は、天然のヘモグロビンαサブユニットのアミノ酸配列であり、前記配列番号１０で表わされるアミノ酸配列は、天然のヘモグロビンのβサブユニットのアミノ酸配列である。天然のヘモグロビンのアミノ酸配列は、配列番号９および配列番号１０で表わされるアミノ酸配列に限定されず、Protein Data Bankにおいて、適切なものを選択すればよい。具体的には、ＩＤ番号1GZX（２００２年７月８日付）のものが挙げられ、前記配列番号９および配列番号１０で表わされるアミノ酸配列は、ＩＤ番号1GZXのものに対応する。システインに置き換えらえる前記１つのアミノ酸残基は、前記ヘモグロビンが立体構造をとる際、構造の外側に配置されるようなアミノ酸残基が好ましい。また、システイン残基に置き換えられたことにより、前記ヘモグロビンに含まれるヘムの構造に影響を与えない必要がある。
　また、このようなヘムタンパク質の変異体は、例えば、ミオグロビンの場合、（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつミオグロビンとして機能するタンパク質を意味する。なお、前記配列番号２で表わされるアミノ酸配列は、野生型のミオグロビン（sperm whale）のアミノ酸配列である。前記配列番号２で表わされるアミノ酸配列は、天然型のアミノ酸配列（実際に鯨から抽出したタンパク質のアミノ酸配列）の第１番目のアミノ酸残基Ｖａｌの前に、アミノ酸残基としてＭｅｔをさらに含むものである。さらに、天然型のアミノ酸配列の第１２２番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸は、前記配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第１２３番目に対応するが、そのアミノ酸残基は、アスパラギンに置き換えられている。野生型のミオグロビンのアミノ酸配列は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列に限定されず、Protein Data Bankにおいて、適切なものを選択すればよい。具体的には、ＩＤ番号2MBW（１９９６年６月２０日付）のものが挙げられ、前記配列番号２で表わされるアミノ酸配列は、ＩＤ番号2MBWのものに対応する。システインに置き換えらえる前記１つのアミノ酸残基は、前記ミオグロビンが立体構造をとる際、構造の外側に配置されるようなアミノ酸残基が好ましい。また、システイン残基に置き換えられたことにより、前記ミオグロビンに含まれるヘムの構造に影響を与えない必要がある。このような置換を行うため、例えば配列番号２のアミノ酸配列において、第１～１５４番目のアミノ酸残基、好ましくは第９、１３、１７、５４，１０３，１０７，１１４、１１８、１２２、１２６、１２７、１３４、１４１および１４８番目のアミノ酸残基、より好ましくは第１２６および第１３４番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えることができる。
　また、このようなヘムタンパク質の変異体は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、（ａ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質を意味する。なお、前記配列番号３で表わされるアミノ酸配列は、天然の西洋ワサビペルオキシダーゼのアミノ酸配列である。天然の西洋ワサビペルオキシダーゼのアミノ酸配列は、配列番号３で表わされるものに限定されず、Protein Data Bankにおいて、適切なものを選択すればよい。具体的には、ＩＤ番号1ATJ（１９９８年２月４日付）のものが挙げられ、前記配列番号３で表わされるアミノ酸配列は、ＩＤ番号1ATJのものに対応する。システインに置き換えられる前記１つのアミノ酸残基は、前記西洋ワサビペルオキシダーゼが立体構造をとる際、構造の外側に配置されるようなアミノ酸残基が好ましい。また、システイン残基に置き換えられたことにより、前記西洋ワサビペルオキシダーゼに含まれるヘムの構造に影響を与えない必要がある。
　前記複合体としては、前記のように、前記ヘムタンパク質２量体が、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビンまたはペルオキシダーゼの２量体であるのが好ましく、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるか、または、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有するミオグロビンであり、前記１つのアミノ酸残基が第１２６番目のアラニンであるのがより好ましい。
　前記金属ナノ粒子としては、市販のものを使用してもよいし、文献を参考にして製造して入手してもよい。そのような文献としては、例えばG. Frens, Nature (London) Phys. Sci. 1973, 241, 20が挙げられる。
　前記複合体としては、前記金属ナノ粒子が、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、白金ナノ粒子、パラジウムナノ粒子、硫化カドミウム（ＣｄＳ）ナノ粒子、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）ナノ粒子、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）ナノ粒子、硫化亜鉛（ＺｎＳ）ナノ粒子、セレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）ナノ粒子、もしくはテルル化亜鉛（ＺｎＴｅ）ナノ粒子または、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）、セレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）およびテルル化亜鉛（ＺｎＴｅ）からなる群から選択される２種類から構成されるコア／シェル型のナノ粒子であるのが好ましい。
　前記金属ナノ粒子の粒径は、例えば１ｎｍ～２５００ｎｍ、好ましくは１ｎｍ～１００ｎｍ、より好ましくは１ｎｍ～２０ｎｍである。
　また、前記複合体としては、前記式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、Ｙは、式－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ２－で表わされる基であり、ここでｎ１およびｎ２は、それぞれ独立して１～２０の整数を意味し、－ＮＨ－は式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）中、－ＣＯ－と結合する基を意味し、前記ヘムタンパク質２量体が、シトクロムまたはミオグロビンの２量体であり、前記金属ナノ粒子が、金ナノ粒子または銀ナノ粒子であるのがより好ましい。
　また、前記複合体としては、前記式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、Ｙは、式－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ２－で表わされる基であり、ここでｎ１およびｎ２は、それぞれ独立して１～２０の整数を意味し、－ＮＨ－は式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）中、－ＣＯ－と結合する基を意味し、前記ヘムタンパク質２量体が、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるか、または、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有するミオグロビンであり、前記１つのアミノ酸残基が第１２６番目のアラニンである２量体であり、前記金属ナノ粒子が、金ナノ粒子または銀ナノ粒子であるのがさらに好ましい。
　次に、本発明の複合体の製造方法の一例を説明する。
　前記のように、本発明の複合体は、（ａ）複数の金属ナノ粒子と式（Ｉ’）および／または式（ＩＩ’）で表されるジスルフィド体と反応させて、金属ナノ粒子を式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基により１箇所以上修飾し、（ｂ）複数の前記修飾された金属ナノ粒子と、ヘムが除去されたヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質とを反応させ、前記金属ナノ粒子を修飾した式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基に含まれるヘムと、ヘムが除去された前記ヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質とが結合することにより、複数の前記金属ナノ粒子と前記タンパク質とが結合した複合体を得ることができる。
　前記（ａ）複数の金属ナノ粒子と式（Ｉ’）および／または式（ＩＩ’）で表されるジスルフィド体と反応させて、金属ナノ粒子を式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基により１箇所以上修飾する工程は、例えば、以下のようにして行うことができる。
　まず、複数の金属ナノ粒子、例えばクエン酸で保護された金属ナノ粒子の溶液をアルカリ性にし、そこへ、過剰量の式（Ｉ’）および／または式（ＩＩ’）で表されるジスルフィド体と、過剰量のリポ酸とを混合して、インキュベートする。その後、未反応の式（Ｉ’）および／または式（ＩＩ’）で表されるジスルフィド体と、未反応のリポ酸とを除去して、金属ナノ粒子を式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基により１箇所以上修飾することができる。これは、金属ナノ粒子とジスルフィド化合物（ジスルフィド体やリポ酸）とを混合すると、ジスルフィド結合が切断され、「－Ｓ－」結合を介して金属ナノ粒子とリポ酸とが結合することが知られていることに基づく。
　前記（ａ）工程において、金属ナノ粒子と式（Ｉ’）および／または式（ＩＩ’）で表されるジスルフィド体との反応は、不活性ガス（例えばアルゴン、窒素等）雰囲気下に溶媒中で行うことができる。
　前記（ａ）工程において、反応溶媒は限定されないが、例えば、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール等）、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液）等が挙げられる。
　前記（ａ）工程において、反応温度は限定されないが、例えば０℃～１００℃、好ましくは４℃～４０℃、より好ましくは４℃～１０℃である。前記（ａ）工程において、反応時間は限定されないが、例えば１分～６０時間、好ましくは１時間～１２時間、より好ましくは６時間～１０時間である。
　前記（ａ）工程において、過剰量の式（Ｉ’）および／または式（ＩＩ’）で表されるジスルフィド体と、過剰量のリポ酸とを混合する際、リポ酸の代わりに、金属ナノ粒子を修飾することが可能な他の保護剤を用いてもよい。そのような保護剤として、例えば、アルカンチオール、メルカプトプロピオン酸等が挙げられる。
　前記（ａ）工程において用いられる式（Ｉ’）および／または式（ＩＩ’）で表されるジスルフィド体は、例えば以下のようにして製造することができる。簡便化のため、式（Ｉ’）で表されるジスルフィド体の例のみ示すが、位置異性体である式（ＩＩ’）で表されるジスルフィド体の場合にも、同様にして製造できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  
　前記式中、
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
　Ｙは、－Ｚ１－Ｙ１－Ｚ２－Ｙ２－または－Ｚ１－Ｙ１－で表される基であり、ただし、Ｚ１は式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、－ＣＯ－と結合する基を意味し、
　Ｙ１およびＹ２は、独立に、－（ＣＨ２）ｎ１－、－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－、－（ＣＨ２）ｎ１－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－、－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－（ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２）ｎ１－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－（ＣＨ２）ｎ２－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－または－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ４－で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立して１～２０の整数を意味し、
　Ｚ１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
　Ｚ２は、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨおよびＮＨからなる群から選択され、
　Ｍは、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋およびＭｎ３＋からなる群から選択され、
　－Ｏ（Ｐ）は、カルボキシル基の保護基である。
　式（ＩＩＩ）で表されるヘム体とジスルフィド体（ＩＶ）とをカップリングさせて式（Ｖ）で表される化合物を得る。この式（Ｖ）の化合物からＯ（Ｐ）を脱保護し、ついでＭをヘムに導入して式（Ｉ’）で表されるジスルフィドを得ることができる。
　天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えた前記変異体の遺伝子は、天然のヘムタンパク質の遺伝子の塩基配列に基づいて、モルモットのトータルＲＮＡ等を利用してクローニングしてもよく、また、ホスホロアミダイト法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して行える。また、前記変異体の遺伝子を宿主細胞内に導入すればよい。
　前記宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌等が挙げられる。前記遺伝子導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポソームを用いた方法、エレクトロポレーション、ウイルスベクターを用いる方法、マイクロピペットインジェクション法等があげられる。または、宿主染色体への組込み型もしくは自律複製・分配可能な人工染色体もしくはプラスミド型を用いて、それを導入してよい。
　前記宿主細胞内に導入する遺伝子は、宿主細胞内で恒常的または任意に発現するように、必要な調節配列と作動的に連結されていることが好ましい。前記調節配列とは、宿主細胞内において、作動的に連結された前記遺伝子の発現に必要な塩基配列であって、例えば、真核細胞に適した調節配列としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー等があげられる。前記作動的に連結とは、各構成要素が機能を果たすことができるように並置していることを意味する。
　本発明の複合体は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察したところ、２次元的に広がっていた（図９（ｄ）参照）。このＴＥＭによる観察から、本発明の複合体は、例えば、以下のような網目構造をとっていることが推測できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  
　本発明の複合体は、前記のように２次元的に広がった構造をとることから、例えば基板上に載せた場合、薄く２次元的に広がる可能性がある。基板上の複合体を焼成、プラズマ照射、酸性水溶液による洗浄等の処理によりタンパク質を除去すると、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、白金ナノ粒子、パラジウムナノ粒子、硫化カドミウム（ＣｄＳ）ナノ粒子、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）ナノ粒子、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）ナノ粒子、硫化亜鉛（ＺｎＳ）ナノ粒子、セレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）ナノ粒子、もしくはテルル化亜鉛（ＺｎＴｅ）ナノ粒子または、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）、セレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）およびテルル化亜鉛（ＺｎＴｅ）からなる群から選択される２種類から構成されるコア／シェル型のナノ粒子などの金属ナノ粒子のみが基板上に残る。そうすると、間隔を空けて配置された金属ナノ粒子が配置された基板を得ることが可能である。このような基板は、金属の表面積が大きく、触媒として用いる場合に金属の量を節約することが可能である。
　また、基板上の複合体は導電性を有することが期待され、分子ダイオード、分子回路等への応用も期待される。
　さらに、基板上の複合体は、金属ナノ粒子が間隔（好ましくは等間隔）を空けて配置されていることから、金属ナノ粒子として硫化カドミウム（ＣｄＳ）ナノ粒子、硫化亜鉛（ＺｎＳ）ナノ粒子等を用いた場合、半導体超微粒子（量子ドット）への応用も期待される。
　また、本発明は、金属ナノ粒子とヘムタンパク質由来のアポタンパク質との複合体であってもよい。具体的には、金属ナノ粒子とヘムタンパク質由来のアポタンパク質との複合体は、前記金属ナノ粒子が式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基により１箇所以上修飾され、前記金属ナノ粒子を修飾した式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基に含まれるヘムと、ヘムが除去された前記ヘムタンパク質由来のアポタンパク質とが結合することにより、金属ナノ粒子とヘムタンパク質由来のアポタンパク質とが結合した複合体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
  
　前記式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
　Ｙは、－Ｚ１－Ｙ１－Ｚ２－Ｙ２－または－Ｚ１－Ｙ１－で表される基であり、ただし、Ｚ１は式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、－ＣＯ－と結合する基を意味し、
　Ｙ１およびＹ２は、独立に、－（ＣＨ２）ｎ１－、－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－、－（ＣＨ２）ｎ１－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－、－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－（ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２）ｎ１－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－（ＣＨ２）ｎ２－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－または－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ４－で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立して１～２０の整数を意味し、
　Ｚ１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
　Ｚ２は、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨおよびＮＨからなる群から選択され、
　Ｍは、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋およびＭｎ３＋からなる群から選択される。
　前記金属ナノ粒子とヘムタンパク質由来のアポタンパク質との複合体において、式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｙおよび金属ナノ粒子については、複数の金属ナノ粒子とヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質との複合体におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｙおよび金属ナノ粒子と同様である。また、「ヘムタンパク質由来のアポタンパク質」については、前記「ヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質」と同様である。
　前記金属ナノ粒子とヘムタンパク質由来のアポタンパク質との複合体としては、前記式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、Ｙは、式－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ２－で表わされる基であり、ここでｎ１およびｎ２は、それぞれ独立して１～２０の整数を意味し、－ＮＨ－は式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）中、－ＣＯ－と結合する基を意味し、前記ヘムタンパク質が、シトクロムまたはミオグロビンであり、前記金属ナノ粒子が、金ナノ粒子または銀ナノ粒子であるのがより好ましい。
　また、前記金属ナノ粒子とヘムタンパク質由来のアポタンパク質との複合体としては、前記式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、Ｙは、式－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ２－で表わされる基であり、ここでｎ１およびｎ２は、それぞれ独立して１～２０の整数を意味し、－ＮＨ－は式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）中、－ＣＯ－と結合する基を意味し、前記ヘムタンパク質が、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるか、または、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有するミオグロビンであり、前記１つのアミノ酸残基が第１２６番目のアラニンであり、前記金属ナノ粒子が、金ナノ粒子または銀ナノ粒子であるのがさらに好ましい。
　次に、前記金属ナノ粒子とヘムタンパク質由来のアポタンパク質との複合体の製造方法の一例を説明する。
　前記金属ナノ粒子とヘムタンパク質由来のアポタンパク質との複合体は、
（ａ）複数の金属ナノ粒子と式（Ｉ’）および／または式（ＩＩ’）で表されるジスルフィド体と反応させて、金属ナノ粒子を式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基により１箇所以上修飾し、（ｂ）複数の前記修飾された金属ナノ粒子と、ヘムが除去されたヘムタンパク質由来のアポタンパク質とを反応させ、前記金属ナノ粒子を修飾した式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基に含まれるヘムと、ヘムが除去された前記ヘムタンパク質由来のアポタンパク質とが結合することにより、前記金属ナノ粒子と前記タンパク質とが結合した複合体を得ることができる。
　ヘムが除去されたヘムタンパク質由来のアポタンパク質は、文献公知の方法、例えば、Teale, F. W. J. Biochim. Biophys. Acta.1959, 35, 543.やE. Itagaki, and L. P. Hager, J. Biol. Chem. 1966, 241, 3687.に記載の方法に従い、製造することができる。
　また、金属ナノ粒子とヘムタンパク質由来のアポタンパク質を末端にもつヘムタンパク質ポリマーとの複合体は、前記金属ナノ粒子が式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基により１箇所以上修飾され、前記金属ナノ粒子を修飾した式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基に含まれるヘムと、ヘムが除去された前記ヘムタンパク質由来のアポタンパク質を末端にもつヘムタンパク質ポリマーとが結合することにより、金属ナノ粒子とヘムタンパク質由来のアポタンパク質を末端にもつヘムタンパク質ポリマーとが結合した複合体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
  
　前記式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
　Ｙは、－Ｚ１－Ｙ１－Ｚ２－Ｙ２－または－Ｚ１－Ｙ１－で表される基であり、ただし、Ｚ１は式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、－ＣＯ－と結合する基を意味し、
　Ｙ１およびＹ２は、独立に、－（ＣＨ２）ｎ１－、－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－、－（ＣＨ２）ｎ１－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－、－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－（ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２）ｎ１－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－（ＣＨ２）ｎ２－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－または－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ４－で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立して１～２０の整数を意味し、
　Ｚ１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
　Ｚ２は、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨおよびＮＨからなる群から選択され、
　Ｍは、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋およびＭｎ３＋からなる群から選択される。
　前記金属ナノ粒子とヘムタンパク質由来のアポタンパク質を末端にもつヘムタンパク質ポリマーとの複合体において、式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｙおよび金属ナノ粒子については、複数の金属ナノ粒子とヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質との複合体におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｙおよび金属ナノ粒子と同様である。また、「ヘムタンパク質由来のアポタンパク質を末端にもつヘムタンパク質ポリマー」は、例えば、以下の式を有するタンパク質ポリマーが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
  
　前記式（ＩＡ）および（ＩＢ）中、
　Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、低級アルケニル基を意味し、
　Ｚは、－Ｙ１１－Ｙ１２－で表される基であり、ただし、Ｙ１１は、式（ＩＡ）および式（ＩＢ）中、－ＣＯ－と結合する基を意味し、
　Ｙ１１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
　Ｙ１２は、式－（ＣＨ２）ｎ１－、－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－、－（ＣＨ２）ｎ１－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－、－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－（ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２）ｎ１－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－（ＣＨ２）ｎ２－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－または－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ４－で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立して１～２０の整数を意味し、
　Ｍ１は、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋およびＭｎ３＋からなる群から選択され、
　ｍおよびｎはそれぞれ整数であり、１≦ｍ＋ｎ≦１０００であり、
　Ｘ１は、ヘムタンパク質の変異体中のタンパク質部分を意味し、前記ヘムタンパク質の変異体は式（ＶＩＩ）で表わされ、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
  
　前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、－ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、前記Hemeは、天然ヘムを意味し、式ＨＳ－Ｘ１は、前記変異体のアポ体を意味する。
　本発明において、一般式（ＩＡ）および（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーは、ランダム共重合体およびブロック共重合体のいずれも含み、いずれか一方に限定されない。
　前記金属ナノ粒子とヘムタンパク質由来のアポタンパク質を末端にもつヘムタンパク質ポリマーとの複合体としては、前記式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、Ｙは、式－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ２－で表わされる基であり、ここでｎ１およびｎ２は、それぞれ独立して１～２０の整数を意味し、－ＮＨ－は式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）中、－ＣＯ－と結合する基を意味し、
ヘムタンパク質由来のアポタンパク質を末端にもつヘムタンパク質ポリマーが、式（ＩＡ）で表されるポリマーであり、
前記式（ＩＡ）中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、Ｙ１１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
Ｙ１２は、式－（ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－または－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ４－で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１～２０の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質が、シトクロムまたはミオグロビンであり、前記金属ナノ粒子が、金ナノ粒子または銀ナノ粒子であるのがより好ましい。
　また、前記金属ナノ粒子とヘムタンパク質由来のアポタンパク質を末端にもつヘムタンパク質ポリマーとの複合体としては、前記式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、Ｙは、式－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ２－で表わされる基であり、ここでｎ１およびｎ２は、それぞれ独立して１～２０の整数を意味し、－ＮＨ－は式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）中、－ＣＯ－と結合する基を意味し、
ヘムタンパク質由来のアポタンパク質を末端にもつヘムタンパク質ポリマーが、式（ＩＡ）で表されるポリマーであり、
前記式（ＩＡ）中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、Ｙ１１は、ＯまたはＮＨであり、Ｙ１２は、式－（ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－または－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ４－で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１～２０の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質が、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるか、または、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有するミオグロビンであり、前記１つのアミノ酸残基が第１２６番目のアラニンであり、前記金属ナノ粒子が、金ナノ粒子または銀ナノ粒子であるのがさらに好ましい。
　次に、前記金属ナノ粒子とヘムタンパク質由来のアポタンパク質を末端にもつヘムタンパク質ポリマーとの複合体の製造方法の一例を説明する。
　前記金属ナノ粒子とヘムタンパク質由来のアポタンパク質を末端にもつヘムタンパク質ポリマーとの複合体は、
（ａ）複数の金属ナノ粒子と式（Ｉ’）および／または式（ＩＩ’）で表されるジスルフィド体と反応させて、金属ナノ粒子を式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基により１箇所以上修飾し、（ｂ）複数の前記修飾された金属ナノ粒子と、ヘムが除去されたヘムタンパク質由来のアポタンパク質を末端にもつヘムタンパク質ポリマーとを反応させ、前記金属ナノ粒子を修飾した式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基に含まれるヘムと、ヘムが除去された前記ヘムタンパク質由来のアポタンパク質を末端にもつヘムタンパク質ポリマーとが結合することにより、前記金属ナノ粒子と前記アポタンパク質を末端にもつヘムタンパク質ポリマーとが結合した複合体を得ることができる。
　ヘムが除去されたヘムタンパク質由来のアポタンパク質を末端にもつヘムタンパク質ポリマーは、文献公知の方法、例えば、Angew. Chem., Int. Ed., 48, 1271-1274（2009)に記載の方法に従い、製造することができる。
　前記金属ナノ粒子とヘムタンパク質由来のアポタンパク質との複合体は、ヘムタンパク質の活性部位となる補因子ヘムが金属ナノ粒子と近接した構造をとる。したがってこの複合体は、ヘムタンパク質がもつ電子伝達の機能を利用して効率よく金属ナノ粒子への電子移動を行うことが可能である。また、この複合体は、ヘムタンパク質とその変異体が有する機能（酸素分子など気体分子との結合、電子伝達、酸化反応をはじめとする触媒反応）と金属ナノ粒子の特性を複合化したバイオ電極材料の分野での適用が考えられる。
　前記金属ナノ粒子とヘムタンパク質由来のアポタンパク質を末端にもつヘムタンパク質ポリマーとの複合体は、緩く集合した構造をとる。換言すれば、この複合体は、金属ナノ粒子同士の距離が比較的遠い配置をとる。例えばこの複合体を基板上に載せた場合、金属ナノ粒子が適度な距離を保って２次元的に広がる可能性がある。基板上の複合体を焼成、プラズマ照射、酸性水溶液による洗浄等の処理によりタンパク質を除去すると、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、白金ナノ粒子、パラジウムナノ粒子、硫化カドミウム（ＣｄＳ）ナノ粒子、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）ナノ粒子、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）ナノ粒子、硫化亜鉛（ＺｎＳ）ナノ粒子、セレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）ナノ粒子、もしくはテルル化亜鉛（ＺｎＴｅ）ナノ粒子または、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）、セレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）およびテルル化亜鉛（ＺｎＴｅ）からなる群から選択される２種類から構成されるコア／シェル型のナノ粒子などの金属ナノ粒子のみが基板上に残る。そうすると、数十ｎｍから１００ｎｍ程度の幅広い間隔を空けて金属ナノ粒子が配置された基板を得ることが可能である。このような基板は、金属ナノ粒子を広い部分に配置して、触媒として用いる場合に金属の量を節約することが可能である。
　以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、以下の実施例により限定されない。
　種々のスペクトルは、以下の機器を用いて測定した。
　核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルはBruker DPX-400核磁気共鳴装置（４００ＭＨｚ）を用いて測定し、測定溶媒の残存シグナルを内部基準として使用した。エレクトロスプレーイオン化法による飛行時間型質量分析（ＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）はアプライド・バイオシステム・マリナー（Applied Biosystems Mariner）ＡＰＩ－ＴＯＦワークステーション（Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）を用いて測定した。紫外可視吸収スペクトルは島津製作所製自記分光光度計ＵＶ－２５５０もしくはＵＶ－３１５０を用いて測定した。水溶液のｐＨは堀場製作所製ｐＨメーターＦ－５２を用いて測定した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）はＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡＦＰＬＣシステム（排除限界１．０×１０５Ｄａ）を接続し、検出にはＵＰＣ－９００検出器を用いて測定した。電気泳動測定には、ＧＥヘルスケア社製全自動電気泳動システムＰｈａｓｔｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）は、日立製日立Ｈ－７６５０　ＺｅｒｏＡ　を用いて測定した。
　また、出発原料は、以下の文献を参考にして製造した。
プロトポルフィリンＩＸモノｔ－ブチルエステル２：T. Matsuo, T. Hayashi, Y. Hisaeda, J. Am. Chem. Soc. 124, 11234 (2002)。
その他の一般試薬は市販品をそのまま用いた。
　（１）式１で表す化合物およびその位置異性体の製造
　式１で表す化合物およびその位置異性体は、以下のスキーム２に従い製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　　　　　　　　　　　　　　　　　 
　スキーム２中、それぞれの「位置異性体」は、以下のとおり。化合物６の位置異性体は化合物６’、化合物７の位置異性体は化合物７’および化合物７’’、化合物８の位置異性体は化合物８’および化合物８’’、化合物１の位置異性体は化合物１’および化合物１’’である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
  
　（ｉ）化合物２およびその位置異性体の合成
　R. Schneider, F. Schmitt, C. Frochot, Y. Fort, N. Lourette, F. Guillemin, J.-F. Mueller, M. Barberi-Heyob, Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 2799-2808に従い、化合物２を合成した。
　（ｉｉ）化合物３およびその位置異性体の合成
　B. Danieli, A. Giardini, G. Lesma, D. Passarella, B. Peretto, A. Sacchetti, A. Silvani, G. Pratesi, F. Zunino, J. Org. Chem. 2006, 71, 2848-2853に従い、化合物３を合成した。
　（ｉｉｉ）化合物４およびその位置異性体の合成
　窒素雰囲気下、化合物２およびその位置異性体（１５２ｍｇ，９．５１ｘ１０－４ｍｏｌ）、化合物３およびその位置異性体（１００ｍｇ，４．７６ｘ１０－４ｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１７０μＬ，９．７６ｘ１０－４ｍｏｌ）を塩化メチレン（２０ｍＬ）に溶解させた。その溶液を氷浴によって冷却し、そこへ１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１８２ｍｇ，９．５１ｘ１０－４ｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（２０ｍＬ）を加えた。この溶液を室温にて、１８時間攪拌した。この溶液を１０％クエン酸水溶液（５０ｍＬ）で５回、炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で５回、水（５０ｍＬ）で５回洗浄した。有機層を分離後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を減圧留去して化合物４およびその位置異性体を得た（１４０ｍｇ，６０％、無色、固体）。
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.91 (s, 2H), 6.75 (s, 2H), 3.03 (m, 4H), 2.95 (m, 4H), 2.86 (t, 4H, J = 5.94 Hz), 2.43 (t, 4H, J = 5.94 Hz)。
　（ｉｖ）化合物５およびその位置異性体の合成
　窒素雰囲気下、化合物４およびその位置異性体（１００ｍｇ，２．０２ｘ１０－４ｍｏｌ）を塩化メチレン（３５ｍＬ）に溶解させ、トリフルオロ酢酸（６ｍＬ）を加えた。この溶液を室温にて３０分間攪拌した。この溶液から溶媒を減圧留去して化合物５およびその位置異性体を得た。
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.12 (s, 2H), 7.74 (s, 6H), 3.26 (m, 4H), 2.88 (m, 4H), 2.85 (t, 4H, J = 7.39 Hz), 2.45 (t, 4H, J = 7.39 Hz)。
　（ｖ）化合物６およびその位置異性体の合成
　T. Matsuo, T. Hayashi, Y. Hisaeda, J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 11234-11235に従い、化合物６およびその位置異性体を合成した。
　（ｖｉ）化合物７およびその位置異性体の合成
　窒素雰囲気下、化合物６（４２ｍｇ，８．１０ｘ１０－５ｍｏｌ）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（１２３ｍｇ，３．２４ｘ１０－４ｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１２０μＬ，６．８９ｘ１０－４ｍｏｌ）および１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（４３ｍｇ，３．２４ｘ１０－４ｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解させた。その溶液を氷浴によって冷却し、そこへ化合物５およびその位置異性体（４２ｍｇ，８．１０ｘ１０－５ｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）を滴下して加えた。この溶液を室温にて１８時間攪拌した。この溶液を塩化メチレンにより希釈し、５％クエン酸水溶液（５０ｍＬ）で３回、炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で３回、水（５０ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を分離後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝４０／１）によって精製し、化合物７およびその位置異性体を得た（４０ｍｇ，３３％、紫色、固体）。
　1H NMR (400 MHz, ピリジン-d5) δ10.2-10.7 (m, 8H), 8.40-8.21 (m, 4H), 6.40-6.21 (m, 4H), 6.18-6.10 (m, 4H), 4.40-4.31 (m, 8H), 3.65-3.25 (m, 40H), 2.78-2.70 (m, 4H), 2.20-2.10 (m, 4H), 1.24 (s, 18H), －3.85　(br, 4H)。
　（ｖｉｉ）化合物８およびその位置異性体の合成　
　化合物７（４０ｍｇ，２．６７ｘ１０－５ｍｏｌ）を塩化メチレン（２０ｍＬ）に溶解させ、そこへトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）を加えた。この溶液を室温にて７時間攪拌した。この溶液から溶媒を減圧留去し、得られた残渣をエーテルで洗浄して化合物８およびその位置異性体を得た（２９ｍｇ，８０％、紫色、固体）。
　1H NMR (400 MHz, ピリジン-d5) δ10.0-9.82 (m, 8H), 8.33-8.28 (m, 4H), 6.36-6.28 (m, 4H), 6.11-6.08 (m, 4H), 4.37-4.33 (m, 8H), 3.60-3.28 (m, 40H), 2.81-2.80 (m, 4H), 2.20-2.15 (m, 4H), -3.85　(br, 4H);
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸光度) 628 (0.0077), 577 (0.015), 540 (0.020), 508 (0.024), 404 (0.30)。
　（ｖｉｉｉ）化合物１およびその位置異性体の合成
　化合物８およびその位置異性体（２９ｍｇ，２．１０ｘ１０－４ｍｏｌ）、塩化鉄（ＩＩ）一水和物（１５０ｍｇ，７．５４ｘ１０－４ｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（１０ｍｇ）を窒素飽和にしたクロロホルムとメタノールの混合溶媒（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝２／１、４０ｍＬ）に溶解させ、加熱還流を行った。３時間後、反応混合物を室温まで冷却し、溶媒を減圧留去した。残渣を０．１Ｍ塩酸で洗浄した後、エーテルで洗浄して化合物１およびその位置異性体を得た（２５ｍｇ，８０％、紫色、固体）。
　ESI-TOF MS (positive mode) m/z 1490.33 (M+H)+, C78H82Fe2N12O8S2として計算値は1490.45;
UV-vis (pyridine) λmax / nm (吸光度) 555 (0.013), 522 (0.014), 407 (0.12)。
　（２）化合物１およびその位置異性体で修飾された金ナノ粒子の合成
　（ｉ）クエン酸で修飾された金ナノ粒子の合成
　使用する全てのガラス器具を王水（濃塩酸：濃硝酸＝３：１）で洗浄した。１ｍＭの塩化金酸水溶液（１００ｍＬ）を還流加熱した。この水溶液に３８．８ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を素早く加え、さらに還流を３０分間行った。反応混合物を室温で放冷して、クエン酸で保護された金ナノ粒子を得た。表面プラズモンに特徴的な５２０ｎｍ付近に吸収極大をもつＵＶ－ｖｉｓスペクトルを得たことにより金ナノ粒子の生成を確認した（図１）。また透過型電子顕微鏡写真からも金ナノ粒子の生成が確認された（図２）。
　（ｉｉ）化合物１およびその位置異性体で修飾された金ナノ粒子の合成
　クエン酸により保護された金ナノ粒子の溶液に、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨ１１に調整した。ＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させた化合物１およびその位置異性体（９４０μｇ，６．２９ｘ１０－７ｍｏｌ）とリポ酸（２３４０μｇ，１．０３ｘ１０－５ｍｏｌ）を金ナノ粒子の溶液（約１３ｎＭ、４０ｍＬ）に加え、室温暗所で終夜インキュベートした。この溶液を１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、過剰に加えた化合物１およびその位置異性体とリポ酸を除去した。残渣へｐＨ１１の水酸化ナトリウム水溶液を加えヘム修飾金ナノ粒子を再分散させた。この洗浄操作を計５回繰り返すことにより化合物１およびその位置異性体で修飾された金ナノ粒子を得た。得られた化合物１およびその位置異性体で修飾された金ナノ粒子のＵＶ－ｖｉｓスペクトルを図３に、透過型電子顕微鏡写真を図４に示す。
　修飾された金ナノ粒子上の化合物１およびその位置異性体の定量をＵＶ－ｖｉｓ測定により行った。シアン化カリウムを修飾された金ナノ粒子溶液に加えると、金ナノ粒子がＫ［Ａｕ（ＣＮ）４］に分解されることで表面プラズモンに由来する強い吸収が消失する。修飾された金ナノ粒子溶液（３０μＬ）に１Ｍシアン化カリウム水溶液（３０μＬ）を加え、２分間インキュベートして反応を完了させた。反応液のＵＶ－ｖｉｓスペクトルにより金ナノ粒子に由来する５２０ｎｍ付近の吸収が消失し、化合物１およびその位置異性体のヘムのビスシアニド錯体の吸収が確認された（図５）。ヘムのビスシアニド錯体の４２１ｎｍにおける吸光係数が６．８ｘ１０４Ｍ－１ｃｍ－１であることから、金ナノ粒子表面を修飾している化合物１およびその位置異性体は３７個と定量された。
　（３）シトクロムｂ５６２変異体の２量体からヘムが除去されたアポタンパク質の合成
　（ｉ）シトクロムｂ５６２変異体（Ｈ６３Ｃ）の調製
　部位特異的変異体の生成は、タカラ（ＴａＫａＲａ）社製ＬＡ　ＰＣＲインビトロ突然変異生成キット（in vitro Mutagenesis）を用いて、付属のプロトコルに従い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行った。野生型シトクロムｂ５６２（以下ｂ５６２と略す）の発現プラスミド（ｐＵＣ１１８）を持つ大腸菌ＴＧ１を大量培養してプラスミドを調製し、Ｈ６３Ｃ変異体を調製するためのテンプレートとした。変異部位導入プライマー（配列番号５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
  
　（下線部がミスマッチ塩基対）とＭ１３プライマーＭ４（配列番号６）（５’－ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ－３’）、もしくはＭ１３プライマーＲＶ配列番号７（５’－ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ－３’）とＭＵＴ４プライマー配列番号８（５’－ＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＴＡＧＣＴＴＡＣＡＴ－３’）を用い、それぞれの系でＰＣＲによる第１段階のＤＮＡ増幅を行った。これら２つの第１段階ＰＣＲ産物からヘテロな２本鎖ＤＮＡを調製し、Ｍ１３プライマーＲＶとＭ１３プライマーＭ４を用いて、このヘテロな２本鎖ＤＮＡのＰＣＲによる第２段階の増幅を行った。ｂ５６２変異体の塩基配列を持つＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲIとＨｉｎｄIIIによって切り出し、ｐＵＣ１１８ベクターのＥｃｏＲI／ＨｉｎｄIII部位に特異的に連結した。その後、大腸菌（Escherichia coli）菌株ＴＧ１を得られた発現プラスミドによって形質転換した。Ｈ６３Ｃ変異体の塩基配列はＤＮＡシークエンシングにより確認した（配列番号４）。その際、Ａｌａ３７の位置にも変異が見られたが、無変化の変異であった（ＧＣＣがＧＣＧに変異）。変異体タンパク質は大腸菌株ＴＧ１を用い、文献（Y. Kawamata, S. Machida, T. Ogawa, K. Horie, T. Nagamune, J. Lumin. 98, 141 (2002)）に従って野生型ｂ５６２の発現と同様の操作で大量発現した。発現したタンパク質は、陽イオン交換カラム（ＣＭ－５２、２．７ｃｍ×１８ｃｍ）とゲル濾過カラム（セファデックスＧ－５０、１．５ｃｍ×１００ｃｍ）によって精製し、Ｒｚ＝Ａ４１８／Ａ２８０≧６．０のフラクション（Ｈ６３Ｃのストック溶液）を回収して以下の実験に使用した。
　（ｉｉ）シトクロムｂ５６２変異体の２量体からヘムが除去されたアポタンパク質の合成
　Ｈ６３Ｃの精製段階で、タンパク質のほとんどがシステイン残基によるジスルフィドを形成し、２量体として存在している。シトクロムｂ５６２変異体の２量体をＳｕｐｅｒｄｅｘ７５１０／３００ＧＬカラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーにより分取した（図６）。得られたシトクロムｂ５６２変異体の２量体の溶液に１００ｍＭのヒスチジン溶液を加え、ｐＨ１．８になるまで０．１Ｍの塩酸を加え、シトクロムｂ５６２変異体の２量体に含まれるヘミンを遊離させた。２－ブタノンによりヘミンを抽出し、５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液で透析を行うことにより、シトクロムｂ５６２変異体の２量体からヘムが除去されたアポタンパク質を得た（図７）。
　（４）金ナノ粒子とシトクロムｂ５６２変異体の２量体からヘムが除去されたアポタンパク質との複合体の合成
　５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）に溶解したシトクロムｂ５６２変異体の２量体からヘムが除去されたアポタンパク質（約１００μＭ、８μＬ）に化合物１およびその位置異性体で修飾された金ナノ粒子の溶液（金ナノ粒子約３μＭ、２μＬ）を加え、金ナノ粒子とシトクロムｂ５６２変異体の２量体からヘムが除去されたアポタンパク質との複合体を得た。
　［比較例１］
　金ナノ粒子とシトクロムｂ５６２からヘムが除去されたアポタンパク質との複合体の合成
　５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）に溶解したシトクロムｂ５６２からヘムが除去されたアポタンパク質（約１０μＭ、８μＬ）に化合物１およびその位置異性体で修飾された金ナノ粒子溶液（金ナノ粒子約３μＭ、２μＬ）を加え、金ナノ粒子とシトクロムｂ５６２からヘムが除去されたアポタンパク質との複合体を得た。
　［実施例１（４）で得られた複合体と、比較例１で得られた複合体の物性］
　（１）アガロースゲル電気泳動
　実施例１（４）で得られた複合体をアガロースゲル電気泳動により確認した。複合体を含む溶液にグリセロールを１０％加え、ＴＢＥ緩衝液中の１．５％アガロースに添加した。１００Ｖ、８０ｍＡで３０分間電気泳動を行った。得られた電気泳動のゲルを図８に示す。図８中、レーン１は化合物１およびその位置異性体で修飾された金ナノ粒子（実施例１（２））、レーン２は比較例１で得られた複合体、レーン３は実施例１（４）で得られた複合体の電気泳動である。図８から、本発明の複合体が、金ナノ粒子とシトクロムｂ５６２変異体の２量体からヘムが除去されたアポタンパク質との複合体であることが確認できた。
　（２）透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による測定
　コロジオン支持膜が担持された銅グリッド上に実施例１（４）で得られた複合体の溶液を滴下し、充分乾燥させた。超純水をグリッド上に滴下し、ろ紙で吸水させた。この操作を２回繰り返し、塩を取り除いた。このグリッドをＴＥＭ測定装置にセットし、加速電圧１００ｋＶにて測定した。得られたＴＥＭ写真を図９（ａ）～（ｄ）に示す。図１０は、比較例１で得られた複合体のＴＥＭ写真である。図９から、ヘムタンパク質２量体のアポ体により金ナノ粒子が会合していること、また、金ナノ粒子間に２－５ｎｍの隙間が観察されたことから、ヘムタンパク質２量体を介した金ナノ粒子集合体であることが確認できた。
　（３）走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による測定
　エラスチックカーボン支持膜が担持された銅グリッドに実施例１（４）で得られた複合体の溶液を滴下し、十分乾燥させた。超純水をグリッド上に滴下し、ろ紙で吸水させた。この操作を２回繰り返し、塩を取り除いた。このグリッドをＳＥＭ測定装置（ＪＥＯＬ　ＪＳＭ－６７０１Ｆ）にセットし、加速電圧５．０　ｋＶ　にて測定した。得られたＳＥＭ写真を図１１に示す。図１２は比較例１で得られた複合体のＳＥＭ写真である。図１１から、ヘムタンパク質２量体のアポタンパク質が存在する場合では、金ナノ粒子が凝集しているのに対して、２量体でない場合には凝集はほとんど観測されないことが確認できた。
　（１）式（ＩＩＩ－３）で表す化合物の製造は、国際特許出願（出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５４５６９号、国際公開番号ＷＯ２００９／１１３５５１号）の実施例３を参考に下記スキーム３に従い製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
  
　前記変異体（ＶＩＩ－２）は、シトクロムｂ５６２変異体（Ｈ６３Ｃ、実施例１（３）（ｉ）で製造）である。前記変異体中、－ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、前記Ｈｅｍｅは、天然ヘムを意味し、式ＨＳ－Ｘ’’は、前記変異体のアポ体を意味する。
　スキーム３中、それぞれの「位置異性体」は、以下のとおり。化合物１（８）の位置異性体は化合物１（８）’、化合物（Ｉ－４）の位置異性体は化合物（Ｉ－４）’、化合物（ＩＩ－４）の位置異性体は化合物（ＩＩ－４）’である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
  
　また、前記ポリマー（ＩＩＩ－３）は、以下の式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
  
　前記式中、ｍおよびｎは整数であり、ｍ＋ｎは１０である。
　（２）シトクロムｂ５６２ポリマーの合成
　５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）に溶解したシトクロムｂ５６２（Ｈ６３Ｃ）の二量体（２００mＬ）に１０ｍＭのジチオスレイトール（３ｍＬ）を加えることでＨ６３Ｃに含まれるシステイン残基によるジスルフィド結合を還元し、Ｈ６３Ｃの単量体（ＶＩＩ－２）を得た。１０ｍＭのジチオスレイトール５０ｍＭを含んだ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）で２回、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）で１回限外濾過を行い、過剰のジチオスレイトールをゲル濾過カラムで取り除いた。次に還元体のＨ６３Ｃ溶液（３．４ｍＬ）にＤＭＳＯに溶解したマレイミドヘム（スキーム３中の１（８）およびその位置異性体、１．６ｘ１０－６ｍｏｌ）を加え、室温にて２時間攪拌した。このシトクロムｂ５６２モノマー（Ｉ－４）およびその位置異性体を含む反応溶液に塩酸水溶液をｐＨ１．８になるまで加え、天然のヘムを遊離し、シトクロムｂ５６２モノマー（ＩＩ－４）およびその位置異性体を得た。２－ブタノンで遊離したヘムを抽出した。抽出は５回繰り返した。５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）で透析することでマレイミドヘムによって表面修飾されたシトクロムｂ５６２ポリマー（ＩＩＩ－３）を得た。図１６に示すＵＶ－ｖｉｓスペクトルより、シトクロムｂ５６２ポリマーを形成していることが確認できた。
　（３）金ナノ粒子とシトクロムｂ５６２ポリマーとの複合体の合成
　５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）に溶解したシトクロムｂ５６２ポリマー（約２００μＭ）８μＬに化合物１で修飾された金ナノ粒子溶液（金ナノ粒子約３μＭ、２μＬ）を加えることで金ナノ粒子表面にシトクロムｂ５６２ポリマーが積層した複合体を得た。
　［実施例２（３）で得られた複合体と、比較例１で得られた複合体の物性］
　（１）アガロースゲル電気泳動
　金ナノ粒子表面にシトクロムｂ５６２ポリマーが積層した複合体をアガロースゲル電気泳動により確認した。複合体を含む溶液にグリセロールを１０％加え、ＴＢＥ緩衝液中の１．５％アガロースに添加した。１００Ｖ、８０ｍＡで３０分間電気泳動を行った。得られた電気泳動のゲルを図１３に示す。図１３中、レーン１は、リポ酸のみで修飾された金ナノ粒子、レーン２は化合物１およびその位置異性体で修飾された金ナノ粒子（実施例１（２））、レーン３は比較例１で得られた複合体、レーン４は実施例２（３）で得られた複合体の電気泳動である。図１３から、本発明の複合体が、金ナノ粒子とシトクロムｂ５６２ポリマーとの複合体であることが確認できた。
　（２）透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による測定
　コロジオン支持膜が担持された銅グリッド上に実施例２（３）で得られた複合体の溶液を滴下し、充分乾燥させた。超純水をグリッド上に滴下し、ろ紙で吸水させた。この操作を２回繰り返し、塩を取り除いた。このグリッドをＴＥＭ測定装置にセットし、加速電圧１００ｋＶにて測定した。得られたＴＥＭ写真を図１４に示す。図１４から、シトクロムｂ５６２ポリマーが金ナノ粒子に結合し、金ナノ粒子間の会合せずに数十ｎｍ以上の間隔を保っていることが確認できた。
　（３）動的光散乱（ＤＬＳ）による測定
　リポ酸で修飾した金ナノ粒子、比較例１で得られた複合体、実施例２（３）で得られた複合体のＤＬＳの測定結果を、それぞれ図１５（ａ）、図１５（ｂ）、図１５（ｃ）に示す。それぞれの粒子の平均半径は、２７ｎｍ、５３ｎｗｍ、７５ｎｍであり、実施例２（３）で得られた複合体はシトクロムｂ５６２ポリマーが金ナノ粒子に結合していることが確認できた。
　（１）化合物１で修飾された銀ナノ粒子の合成
　（ｉ）クエン酸で修飾された銀ナノ粒子の合成
　使用する全てのガラス器具を王水（濃塩酸：濃硝酸＝３：１）で洗浄した。０．２５ｍＭの硝酸銀水溶液（１００ｍＬ）と０．３１ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）を４℃に冷却後、混合し、攪拌した。０．２５ｍＭの水素化ホウ素ナトリウム水溶液（６ｍＬ）をこの水溶液に加え、４℃で１０分間攪拌した。室温で放冷した後、反応混合物を９０分間還流した。反応混合物を室温で放冷して、クエン酸で保護された銀ナノ粒子を得た。表面プラズモンに特徴的な３９６ｎｍ付近に吸収極大をもつＵＶ－ｖｉｓスペクトルを得たことにより銀ナノ粒子の生成を確認した（図１７）。また透過型電子顕微鏡写真からも銀ナノ粒子の生成が確認された（図１８）。
　（ｉｉ）化合物１およびその位置異性体で修飾された銀ナノ粒子の合成
　クエン酸により保護された銀ナノ粒子の溶液を遠心分離操作により、過剰のクエン酸ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウムを除去した。遠心分離後に得られた残渣に水酸化ナトリウム水溶液を加え、得られた溶液のｐＨを１１に調整した。ＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させた化合物１およびその位置異性体（１ｍｇ，６．６９ｘ１０－７ｍｏｌ、実施例１（１）で製造）とリポ酸（２３４０μｇ，１．７６ｘ１０－５ｍｏｌ）を銀ナノ粒子の溶液（８ｎＭ、８０ｍＬ）に加え、４℃、暗所で終夜インキュベートした。この溶液を４４００ｒｐｍで遠心分離して銀ナノ粒子の溶液を濃縮した。得られた濃縮液をＬＨ２０を用いてゲル濾過することで過剰の化合物１およびその位置異性体とリポ酸を除去し、化合物１で修飾された銀ナノ粒子を得た。得られた化合物１およびその位置異性体で修飾された銀ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真を図１９に示す。
　修飾された銀ナノ粒子上の化合物１およびその位置異性体の存在をＵＶ－ｖｉｓ測定により確認した。シアン化カリウムを修飾された銀ナノ粒子溶液に加えると、銀ナノ粒子がＫ［Ａg（ＣＮ）２］に分解されることで表面プラズモンに由来する強い吸収が消失する。修飾された銀ナノ粒子溶液（２５μＬ）に１Ｍシアン化カリウム水溶液（７５μＬ）を加え、５分間インキュベートして反応を完了させた。反応液のＵＶ－ｖｉｓスペクトルにより銀ナノ粒子に由来する４００ｎｍ付近の吸収が消失し、化合物１のヘムのビスシアニド錯体の吸収が確認された（図２０）。従って、図２０より、修飾された銀ナノ粒子上の化合物１の存在を確認できた。
　（２）銀ナノ粒子とシトクロムｂ５６２変異体の２量体からヘムが除去されたアポタンパク質との複合体の合成
　５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）に溶解したシトクロムｂ５６２変異体の２量体からヘムが除去されたアポタンパク質（約２μＭ、２４μＬ、実施例１（３）（ｉｉ）で製造）に化合物１およびその位置異性体で修飾された銀ナノ粒子の溶液（銀ナノ粒子約９００ｎＭ、５μＬ）を加え、銀ナノ粒子とシトクロムｂ５６２変異体の２量体からヘムが除去されたアポタンパク質との複合体を得た。
　［比較例２］
　５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）に溶解したシトクロムｂ５６２からヘムが除去されたアポタンパク質（約２μＭ、２４μＬ）に化合物１およびその位置異性体で修飾された銀ナノ粒子の溶液（５μＬ）を加え、銀ナノ粒子とシトクロムｂ５６２からヘムが除去されたアポタンパク質との複合体を得た。
　（３）透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による測定
　コロジオン支持膜が担持された銅グリッド上に実施例３（２）で得られた複合体の溶液を滴下し、充分乾燥させた。超純水をグリッド上に滴下し、ろ紙で吸水させた。この操作を２回繰り返し、塩を取り除いた。このグリッドをＴＥＭ測定装置にセットし、加速電圧１００ｋＶにて測定した。得られたＴＥＭ写真を図２１（ａ）および図２１（ｂ）に示す。また、図２２は、比較例２で得られたヘムタンパク質のアポ体との複合体のＴＥＭ写真である。図２２では、銀ナノ粒子の集合体の形成は確認できなかった。一方、図２１（ａ）および図２１（ｂ）において、銀ナノ粒子がヘムタンパク質２量体により会合していること、また、銀ナノ粒子間に２－５ｎｍの隙間が観察されたことから、ヘムタンパク質を介した銀ナノ粒子集合体であることが確認できた。
　本発明の複合体は、基板上に配置し、触媒として用いることも可能である。
　配列番号１　シトクロムｂ５６２
　配列番号２　マッコウクジラ由来野性型ミオグロビン（sperm whale）
　配列番号３　西洋ワサビペルオキシダーゼ
　配列番号４　Ｈ６３Ｃシトクロムｂ５６２
　配列番号５　変異部位導入プライマー
　配列番号６　Ｍ１３プライマーＭ４
　配列番号７　Ｍ１３プライマーＲＶ
　配列番号８　ＭＵＴ４プライマー
　配列番号９　ヘモグロビンαサブユニット（human）
　配列番号１０　ヘモグロビンβサブユニット（human）

Claims (4)

  1. 　複数の金属ナノ粒子とヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質との複合体であって、
    　前記金属ナノ粒子は、式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基により１箇所以上修飾され、
    　前記金属ナノ粒子を修飾した式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基に含まれるヘムと、ヘムが除去された前記ヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質とが結合することにより、複数の前記金属ナノ粒子と前記タンパク質とが結合した複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
      
    前記式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、
    　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
    　Ｙは、－Ｚ１－Ｙ１－Ｚ２－Ｙ２－または－Ｚ１－Ｙ１－で表される基であり、ただし、Ｚ１は式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、－ＣＯ－と結合する基を意味し、
    　Ｙ１およびＹ２は、独立に、－（ＣＨ２）ｎ１－、－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－、－（ＣＨ２）ｎ１－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－、－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－（ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２）ｎ１－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－（ＣＨ２）ｎ２－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－または－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ４－で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立して１～２０の整数を意味し、
    　Ｚ１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
    　Ｚ２は、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨおよびＮＨからなる群から選択され、
    　Ｍは、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋およびＭｎ３＋からなる群から選択され、
    　前記ヘムタンパク質２量体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えた変異体である。
  2. 　前記ヘムタンパク質２量体は、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビンまたはペルオキシダーゼの２量体である請求項１に記載の複合体。
  3. 前記金属ナノ粒子が、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、白金ナノ粒子、パラジウムナノ粒子、硫化カドミウム（ＣｄＳ）ナノ粒子、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）ナノ粒子、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）ナノ粒子、硫化亜鉛（ＺｎＳ）ナノ粒子、セレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）ナノ粒子、もしくはテルル化亜鉛（ＺｎＴｅ）ナノ粒子または、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）、セレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）およびテルル化亜鉛（ＺｎＴｅ）からなる群から選択される２種類から構成されるコア／シェル型のナノ粒子である請求項１または２に記載の複合体。
  4. 　請求項１に記載の複合体の製造方法であって、
    　複数の金属ナノ粒子と式（Ｉ’）および／または式（ＩＩ’）で表されるジスルフィド体と反応させて、金属ナノ粒子を式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基により１箇所以上修飾し、
    　複数の前記修飾された金属ナノ粒子と、ヘムが除去されたヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質とを反応させ、前記金属ナノ粒子を修飾した式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）で表される基に含まれるヘムと、ヘムが除去された前記ヘムタンパク質２量体由来のアポタンパク質とが結合することにより、複数の前記金属ナノ粒子と前記タンパク質とが結合した複合体を得る製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
      
    前記式（Ｉ’）および式（ＩＩ’）中、
    　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
    　Ｙは、－Ｚ１－Ｙ１－Ｚ２－Ｙ２－または－Ｚ１－Ｙ１－で表される基であり、ただし、Ｚ１は式（Ｉ’）および式（ＩＩ’）中、－ＣＯ－と結合する基を意味し、
    　Ｙ１およびＹ２は、独立に、－（ＣＨ２）ｎ１－、－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－、－（ＣＨ２）ｎ１－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－、－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－（ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２）ｎ１－（Ｃ６Ｈ４）ｎ５－（ＣＨ２）ｎ２－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－または－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ４－で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立して１～２０の整数を意味し、
    　Ｚ１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
    　Ｚ２は、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨおよびＮＨからなる群から選択され、
    　Ｍは、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋およびＭｎ３＋からなる群から選択される。
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