WO2011102532A1

WO2011102532A1 - 誘導肝細胞

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Publication number: WO2011102532A1
Application number: PCT/JP2011/053875
Authority: WO
Inventors: 鈴木　淳史
Original assignee: Kyushu University NUC
Current assignee: Kyushu University NUC
Priority date: 2010-02-16
Filing date: 2011-02-16
Publication date: 2011-08-25
Anticipated expiration: 2012-08-16
Also published as: JPWO2011102532A1; US20130071365A1

Abstract

低侵襲、低コストで得られる肝臓細胞以外の細胞から肝臓細胞を生み出すことを課題とする。HNF3α、HNF3β、又はHNF3γ及びHNF4αを、非肝臓細胞に導入する。本発明により、肝臓細胞以外の体細胞、例えば皮膚細胞から、誘導肝細胞を製造することができる。本発明により得られた誘導肝細胞を利用することで、これまで、細胞の調達の難しさから一般化できなかった肝臓への細胞移植、人工肝臓、薬剤反応性試験を、一般医療として確立・発展させることができる。

Description

誘導肝細胞

　本発明は、種々の細胞から肝臓細胞を製造する方法に関する。本発明は、ライフサイエンス、医療、薬理に関連する分野で有用である。

　ドナー臓器不足が深刻な肝移植に代わる新しい肝疾患治療法として期待される肝細胞移植、劇症肝炎の効果的な治療に向けて開発が進む人工肝臓、そして薬の効果や副作用を評価するための薬剤反応性試験のそれぞれにおいて、肝細胞は必要不可欠な細胞材料である。しかしながら、生体組織から直接採取できる肝細胞の数には限界があり、また肝細胞は生体外で増殖させることが困難なために、肝細胞を用いた医療応用へのステップは実験段階を脱することができていない。

　一方、肝細胞の新たな供給源として期待される胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）（特許文献１）に関しても、現時点において、これらの細胞から肝細胞を特異的に分化誘導する方法は見出されておらず、さらに、植後の腫瘍形成の危険性や倫理面の問題なども残されている。また、現状の薬剤反応性試験では、主に米国の企業から販売されている死体由来肝細胞や不死化肝細胞が用いられるが、これらの細胞の肝細胞としての機能のレベルは低く、さらにそれらを継続して購入するには莫大な費用がかかる。

　他方、肝特異的代謝酵素及び血清蛋白質をコードする遺伝子群の転写制御因子群の同定が行なわれている。そのような因子群はＨＮＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ）と呼称され，これまでＨＮＦ１α、ＨＮＦ１β（ｖＨＮＦ１）、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ３γ、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ６、Ｃ／ＥＢＰファミリー、ＧＡＴＡファミリーが同定されてきた。また、肝発生とは無関係な研究から、肝発生や肝芽細胞に関与する遺伝子群として、Ｈｌｘ遺伝子、Ｈｅｘ遺伝子、Ｐｒｏｘ１遺伝子が同定されてきた。より詳細には、骨髄由来のヒト間葉系幹細胞にＨＮＦ３βを発現させて肝細胞様の細胞に分化させたという報告（非特許文献１）、脂肪由来のヒト間葉系幹細胞から肝細胞様の細胞を分化誘導したという報告（非特許文献２）がある。また本発明者らは、マウス胎仔肝幹細胞（肝芽細胞）から肝細胞の分化機序について報告してきた（非特許文献３）。

国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６

Ｉｓｈｉｉ　Ｋ，Ｙｏｓｈｉｄａ　Ｙ，Ａｋｅｃｈｉ　Ｙ，Ｓａｋａｂｅ　Ｔ，Ｎｉｓｈｉｏ　Ｒ，Ｉｋｅｄａ　Ｒ，Ｔｅｒａｂａｙａｓｈｉ　Ｋ，Ｍａｔｓｕｍｉ　Ｙ，Ｇｏｎｄａ　Ｋ，Ｏｋａｍｏｔｏ　Ｈ，Ｔａｋｕｂｏ　Ｋ，Ｔａｊｉｍａ　Ｆ，Ｔｓｕｃｈｉｙａ　Ｈ，Ｈｏｓｈｉｋａｗａ　Ｙ，Ｋｕｒｉｍａｓａ　Ａ，Ｕｍｅｚａｗａ　Ａ，Ｓｈｉｏｔａ　Ｇ．Ｈｅｐａｔｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　３ｂｅｔａ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００８　Ａｕｇ；４８（２）：５９７−６０６．Ｂａｎａｓ　Ａ，Ｔｅｒａｔａｎｉ　Ｔ，Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｙ，Ｔｏｋｕｈａｒａ　Ｍ，Ｔａｋｅｓｈｉｔａ　Ｆ，Ｑｕｉｎｎ　Ｇ，Ｏｋｏｃｈｉ　Ｈ，Ｏｃｈｉｙａ　Ｔ．Ａｄｉｐｏｓｅ　ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ａｓ　ａ　ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００７　Ｊｕｌ；４６（１）：２１９−２８．Ｓｕｚｕｋｉ　Ａ．，Ｉｗａｍａ　Ａ．，Ｍｉｙａｓｈｉｔａ　Ｈ．，Ｎａｋａｕｃｈｉ　Ｈ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　Ｈ．Ｒｏｌｅ　ｆｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｔｒｉｘ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１３０，２５１３−２５２４，２００３．

　肝細胞は利用価値の極めて高い細胞であるが、医療利用可能な質や量を満たすものを、安全かつ簡便に入手する方法は確立されておらず、肝細胞の医療応用にとって大きな問題となっている。この問題を解消し、肝細胞の医療利用を実現させるためには、低侵襲、低コストで得られる細胞から肝細胞を生み出すといった、これまでにない、画期的な新技術の開発が必要と考えられる。

　本発明者は、肝臓の発生過程において肝細胞分化に関連する１２個の転写因子を選択した。そして、それらをコードする遺伝子をレトロウイルスに組み込み、マウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ）に感染させたところ、ＨＮＦ４α＋ＨＮＦ３α、ＨＮＦ４α＋ＨＮＦ３β、又はＨＮＦ４α＋ＨＮＦ３γの遺伝子セットを導入した場合において、アルブミンやα−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎの強い発現誘導が認められた。また、ＭＥＦに対してＨＮＦ４αとＨＮＦ３βを導入し、適当な条件で培養を行ったものが、ＭＥＦとは完全に異なる上皮様の細胞形態を示し、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、アルブミン、サイトケラチン８−１８のほか、肝細胞の中期分化マーカーであるα−１−アンチトリプシンの発現も認められたことから、本発明を完成した。

　本発明は以下を提供する。
１）非肝臓細胞から誘導肝細胞を製造する方法であって、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、又はＨＮＦ３γ及びＨＮＦ４α（好ましくは、ＨＮＦ３γ及びＨＮＦ４α）を、非肝臓細胞に導入する工程を含む、方法。
２）ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、又はＨＮＦ３γをコードする遺伝子及びＨＮＦ４αをコードする遺伝子（好ましくは、ＨＮＦ３γをコードする遺伝子及びＨＮＦ４αをコードする遺伝子）を、非肝臓細胞に導入する工程を含む、１）記載の製造方法。
３）非肝臓細胞が、ヒト由来である、１）又は２）に記載の製造方法。
４）１）~３）のいずれか一に記載の製造方法で製造された誘導肝細胞又はその子孫を含む、人工肝臓組織。
５）非肝臓細胞に由来し、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、又はＨＮＦ３γをコードする遺伝子及びＨＮＦ４αをコードする遺伝子（好ましくは、ＨＮＦ３γをコードする遺伝子及びＨＮＦ４αをコードする遺伝子）が導入されている細胞。
６）ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β又はＨＮＦ３γをコードする遺伝子及びＨＮＦ４αをコードする遺伝子（好ましくは、ＨＮＦ３γをコードする遺伝子及びＨＮＦ４αをコードする遺伝子）が導入された非肝臓細胞から誘導された、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性であり、アルブミン、サイトケラチン−８、サイトケラチン−１８又はα−１−アンチトリプシンを発現可能である細胞。
７）ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、又はＨＮＦ３γとＨＮＦ４αとからなる（好ましくは、ＨＮＦ３γとＨＮＦ４αとからなる）、非肝臓細胞から誘導肝細胞を製造する方法において使用するための、因子セット（例えば、キット）。
８）ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、又はＨＮＦ３γをコードする遺伝子とＨＮＦ４αをコードする遺伝子（好ましくは、ＨＮＦ３γをコードする遺伝子及びＨＮＦ４αをコードする遺伝子）とからなる、非肝臓細胞から誘導肝細胞を製造する方法において使用するための、遺伝子セット（例えば、キット）。
９）ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、又はＨＮＦ３γをコードする遺伝子とＨＮＦ４αをコードする遺伝子（好ましくは、ＨＮＦ３γをコードする遺伝子及びＨＮＦ４αをコードする遺伝子）が導入された非肝臓細胞を、成長因子の存在下で（所望により、細胞外マトリクス上で）、培養する工程を含む、誘導肝細胞の製造方法。
１０）５）に記載の細胞を移植する工程を含む、肝臓への細胞移植方法。
１１）５）に記載の細胞を用いる工程を含む、疾患の処置方法。
１２）５）に記載の細胞を用いる工程を含む、薬剤反応性の評価方法。

　本発明により、肝臓細胞でない体細胞、例えば皮膚細胞から、肝臓細胞を製造することができる。本発明により得られた肝臓細胞を利用することで、これまで、細胞の調達の難しさから一般化できなかった肝細胞移植、人工肝臓、薬剤反応性試験を、一般医療として確立・発展させることができる。

（１２因子から１因子除いたときの遺伝子発現誘導効果）図１は、選択した肝細胞分化に関連する１２個の転写因子の遺伝子発現誘導効果を示したグラフである。１２個すべてを導入したＭＥＦでは、アルブミン、α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ及びＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの遺伝子発現が認められた。１２因子から１因子を除いた遺伝子セットを導入したＭＥＦでは、ＨＮＦ４α又はＨＮＦ６を除いた群でアルブミンの遺伝子発現が減少し、ＨＮＦ４α又はＨＮＦ１βを除いた群でα−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子発現が減少したが、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎの遺伝子発現を著しく低下させる群は見られなかった。（１因子＋ＨＮＦ４αの遺伝子発現誘導効果）図２は、ＨＮＦ４αと他の１因子の同時導入の効果を示したグラフである。ＨＨＮＦ４α＋ＨＮＦ３α、ＨＮＦ４α＋ＨＮＦ３β又はＨＮＦ４α＋ＨＮＦ３γの遺伝子セットを導入した場合に、アルブミンやα−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎの強い発現誘導が認められた。（ＨＮＦ４αとＨＮＦ３βの遺伝子導入後における上皮様細胞の増殖）図３は、誘導された上皮様細胞の写真である。ＨＮＦ４αとＨＮＦ３βを導入したＭＥＦをＩ型コラーゲンコートディッシュに移し、肝幹細胞用培地を用いて培養を行ったところ、細胞形態がＭＥＦとは完全に異なる上皮様の細胞が出現した。（ＨＮＦ４αとＨＮＦ３βの導入によって出現する上皮様細胞におけるＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、アルブミン、ＣＫ８−１８、α−１−アンチトリプシンの発現）図４は、ＨＮＦ４αとＨＮＦ３βを導入した上皮様細胞の蛍光染色写真である。ＭＥＦから誘導された上皮様細胞のすべてがＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性であり、かつ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎが細胞接着領域に局在していた。また、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞の多くが、アルブミンやサイトケラチン８−１８を発現していた。また、α−１−アンチトリプシンの発現も認められた（グラフ）。（ＭＥＦ由来上皮様細胞による肝臓組織の再構築）図５は、ＭＥＦから誘導された上皮様細胞をＦＡＨノックアウトマウスの肝臓へ移植し、１ヶ月経過したときの写真である。細胞がＦＡＨ陽性の成熟した肝細胞としてＦＡＨノックアウトマウスの肝臓組織中に生着し、肝臓組織を再構築していることが判明した。この結果から、ＨＮＦ４αとＨＮＦ３βの導入によってＭＥＦから誘導された上皮様細胞は、肝臓組織再構築能を有した肝上皮細胞であることが明らかとなった。なおコントロールではＭＥＦを移植した。図６Ａは、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ３γそれぞれをコードする遺伝子（マウス）のヌクレオチド配列を示したものである。図６Ｂは、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ３γそれぞれをコードする遺伝子（ヒト）のヌクレオチド配列を示したものである。図７は、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ３γそれぞれのアミノ酸配列（マウス及びヒト）を示したものである。（ＨＮＦ４αとＨＮＦ３γの導入によるヒト皮膚由来繊維芽細胞における遺伝子発現誘導効果）図８は、ヒトの皮膚由来繊維芽細胞に対するＨＮＦ４αとＨＮＦ３γの同時導入による遺伝子発現誘導効果を示したグラフである。マウスと同様に、アルブミンやα−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎの強い発現誘導が認められた。

　本発明は、特定の因子のセットを種々の細胞に導入することにより、肝臓細胞を製造することができる。

［肝臓細胞を製造するための因子セット］
　本発明の肝臓細胞を製造するための因子セットは、本発明者が、肝芽細胞（肝幹／前駆細胞）又は内胚葉細胞で発現し、肝細胞分化に関係するか又はその可能性があると考えた１２の因子、具体的にはＨｅｘ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、Ｔｂｘ３、Ｃ／ＥＢＰα、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ１β、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ３γ、ＨＮＦ４α及びＨＮＦ６からなる群から選択されたものである。

　本発明の因子セットは少なくともＨＮＦ４αを含む。好ましい態様では、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、又はＨＮＦ３γ及びＨＮＦ４αを含むことを特徴としており、特に好ましい態様では、ＨＮＦ４α、及びＨＮＦ３βを含む。

　これらの因子はいずれもヒトを含む哺乳類動物において共通して存在する因子である。本発明においては、特に示した場合を除き、用いる因子は哺乳類動物のいずれに由来してもよい。本発明には、例えばマウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サル、ヒト由来の因子を用いることができる。

　本発明に用いる因子は、特定のｉｓｏｆｏｒｍに限定されない。ヒトでは、少なくともＨＮＦ４αに６個、ＨＮＦ３βに２個のｉｓｏｆｏｒｍがあるが、本発明においてはいずれも用いることができる。

　本発明に特に関係のある因子及びその因子をコードするマウス及びヒト遺伝子のヌクレオチド配列のＮＣＢＩ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏを下表に示す。

　本出願に含まれる配列表には、配列番号１~４として、順に、マウスのＨＮＦ４α、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ３γ遺伝子のヌクレオチド配列が示されている。また、配列番号５~１０として、ヒトＨＮＦ４αの６つのｉｓｏｆｏｒｍ、配列番号：１１としてヒトＨＮＦ３α、配列番号：１２及び１３としてヒトＨＮＦ３βの２つのｉｓｏｆｏｒｍ、配列番号：１４として、ヒトＨＮＦ３γ遺伝子のヌクレオチド配列が示されている。各因子のアミノ酸配列は、遺伝子配列から導くことができる。本出願に含まれる配列表には、配列番号１５~１８として、順に、マウスのＨＮＦ４α、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ３γのアミノ酸配列が示されている。また、配列番号１９~２４として、ヒトＨＮＦ４αの６つのｉｓｏｆｏｒｍｓ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔｓ　１−６）、配列番号：２５としてヒトＨＮＦ３α、配列番号：２６及び２７としてヒトＨＮＦ３βの２つのｉｓｏｆｏｒｍ、配列番号：２８として、ヒトＨＮＦ３γのアミノ酸配列が示されている。

　本発明者の検討によると、マウス由来細胞を用いた実験では、ＨＮＦ４α＋ＨＮＦ３α及びＨＮＦ４α＋ＨＮＦ３βでも遺伝子発現誘導が起こるが、ＨＮＦ４αとＨＮＦ３γの組み合わせにおける遺伝子発現誘導効果が最も大きいという傾向がみられた。また、ヒト由来細胞でも、ＨＮＦ４α＋ＨＮＦ３α及びＨＮＦ４α＋ＨＮＦ３βで遺伝子発現誘導が得られることを確認したが、マウスと同様に、ＨＮＦ４αとＨＮＦ３γとの組み合わせが最も効果的であるとの傾向であった。また、マウス由来細胞を用いた実験では、最終的に得られた細胞は、上記のどの組み合わせで因子を導入した場合であっても、アルブミン分泌能や遺伝子発現プロファイルなどには違いはあるが、大差は認められなかった。さらに、ヒト由来細胞を用いてＨＮＦ４αのｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔｓ　１~５を試験した結果では、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔｓ　１~３、特にｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　３の効果が高いように思われた。

　本発明の範囲には、上述の因子及び当該因子をコードする遺伝子のほか、それらの変異体の使用も含まれる。すなわち、本発明で、ある因子をいうときは、特に記載した場合を除き、いずれも、（ａ）配列表に示された、該当する配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）当該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ当該因子の機能を有するタンパク質、並びに（ｃ）当該アミノ酸配列と少なくとも９０％（好ましくは９５％、より好ましくは９８％）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ当該因子の機能を有するタンパク質を含む。また、本発明で、ある因子をコードする遺伝子をいうときは、特に記載した場合を除き、いずれも、（ｄ）配列表の該当する配列番号のヌクレオチド配列からなる遺伝子；（ｅ）当該ヌクレオチド配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ当該因子の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；（ｆ）当該ヌクレオチド配列と少なくとも９０％（好ましくは９５％、より好ましくは９８％）の同一性を有し、かつ当該因子の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；並びに（ａ）~（ｃ）のいずれか一のタンパク質をコードする遺伝子を含む。

　このような変異体を得る手法は、当業者にはよく知られている。なお、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、６Ｍ尿素、０．４％　ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件又はこれと同等のハイブリダイゼーション条件を指し、さらに必要に応じ、本発明には、よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ尿素、０．４％　ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ又はこれと同等のハイブリダイゼーション条件を適用してもよい。それぞれの条件において、温度は約４０℃以上とすることができ、よりストリンジェンシーの高い条件が必要であれば、例えば約５０℃、さらに約６５℃としてもよい。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の相同性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：２２６４−２２６８、１９９０、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ，ｅｔ　ａｌ：Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。

　本発明の因子セットは、上述の因子のほか、他の因子を含むことができる。他の因子及びその因子をコードするマウス及びヒト遺伝子のヌクレオチド配列のＮＣＢＩ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏを下表に示す。

　なお転写因子Ｔｂｘ３は、本発明者らが同定し、報告したものである（Ｓｕｚｕｋｉ　Ａ．，Ｓｅｋｉｙａ　Ｓ．，Ｂｕｓｃｈｅｒ　Ｄ．，Ｉｚｐｉｓｕａ　Ｂｅｌｍｏｎｔｅ　Ｊ．Ｃ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　Ｈ．Ｔｂｘ３　ｃｏｎｔｒｏｌｓ　ｔｈｅ　ｆａｔｅ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｂｙ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｐ１９ＡＲＦ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１３５，１５８９−１５９５，２００８．）。

　本明細書の実施例の結果（図１）からは、ＨＮＦ１βやＨＮＦ６の影響も検討する必要があると思われる。

　本発明の肝臓細胞を製造するための因子セットは、上述の具体的に説明した因子に加えて、さらに別の因子を１又は２以上含むことができる。このような因子は、例えば、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ３γ及びＨＮＦ４αからなる群から選択される一以上を発現させた体細胞に、種々の候補因子をコードする遺伝子を導入し、さらに高い確率で肝臓細胞を誘導することができた細胞を選択することにより、選抜することができる。

　本発明に用いられる因子は、その因子をコードする遺伝子から産生されるタンパク質自体のほか、そのタンパク質と別のタンパク質又はペプチドなどとの融合タンパク質の形態であってもよい。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質やヒスチジンタグなどのペプチドとの融合タンパク質であってもよい。また、ＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｄｏｍａｉｎ）ペプチドとの融合タンパク質であってもよい。このような融合タンパク質の調製方法は当業者によく知られている。

［導入手段］
　本発明の、肝臓細胞を調製する方法は、特定の因子を対象細胞に導入する行程を含むが、この行程を実施するための具体的な手段は、特に限定されない。各因子は、本来、細胞内で遺伝子から転写され、翻訳され、タンパク質（転写因子）として機能していると考えられるので、因子を細胞へ直接導入することにより、又は因子をコードする遺伝子を物理化学的又はウイルスベクターを用いて細胞内に導入することにより、目的の効果を達成しうる。

　因子を細胞へ直接導入する手段の典型的な例は、膜透過機能を有するＰＴＤペプチド（例えば、ＡｎｔＰ、ＨＩＶ／ＴＡＴ、ＨＳＶ／ＶＰ−２２）を結合させることによる。この方法は、ｉｎ　ｖｉｖｏ個体に応用でき、また既存のトランスフェクションでは遺伝子導入の困難な細胞を含むほぼすべての細胞に導入することができる点で優れている。また、細胞に対する煩雑な遺伝子導入操作を回避して、融合タンパク質を培養環境に添加するだけで因子を導入することができる点で、優れている。目的タンパク質とＰＴＤの融合タンパク質の調製方法や、対象細胞内へ融合タンパク質を導入するための条件等は、当業者にはよく知られている。

　遺伝子を物理化学的に細胞内に導入する手段の例は、リン酸カルシウム法／リポフェクション法、エレクトロポーレーション法、超音波遺伝子導入法、遺伝子銃による導入法、組換えイムノジーン法である。これらの方法はいずれも、当業者によく知られている。

　遺伝子をウイルスベクターを用いて細胞内に導入する際に用いられるウイルスベクターの例は、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターである。因子をコードする遺伝子を組み込んだベクターの作製、細胞への感染方法等は、当業者によく知られている。増殖能の高くない細胞にも高い効率で遺伝子導入できるとの観点からは、レンチウイルスベクターによる方法が好ましいであろう。

　目的の遺伝子が導入されたか否かは、当業者であれば適宜行うことができる。例えば、ベクター上で、導入する遺伝子の下流にＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ）を挟んでマーカー遺伝子（蛍光タンパク質をコードする遺伝子、薬剤耐性遺伝子等）をつないでおき、目的の遺伝子の産物と同時にマーカーを発現できるようにして、目的の遺伝子が導入された細胞を選抜又は可視化することができる。２つの目的遺伝子が同時に導入されているかどうかは、各々異なるマーカー遺伝子、例えば一方の目的遺伝子をＧＦＰ（緑色）につなぎ、もう一方の目的遺伝子をＲＦＰ１（赤色）につないだコンストラクトを作製することにより、確認できる。また、遺伝子導入された細胞を細胞株としてクローン化することができれば、細胞全体に対するＰＣＲやサザンブロッティングで導入遺伝子の有無を確認できる。

［因子が導入される対象細胞］
　本発明においては、因子が導入される対象細胞は、非肝臓細胞（ｎｏｎ−ｈｅｐａｔｉｃ　ｃｅｌｌ）である。本発明で「非肝臓細胞」というときは、特に記載した場合を除き、後述する肝臓細胞以外の細胞をいう。

　因子が導入される対象細胞は、いずれの動物に由来してもよい。本発明は、例えばマウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サル、又はヒト由来の細胞を対象とすることができる。

　因子が導入される対象細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）でも人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）であってもよく、それ以外の体細胞であってもよい。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）とは、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内部細胞塊より作られる幹細胞細胞株をいう。及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）とは、体細胞へ特定の因子を導入することにより、ＥＳ細胞のように非常に多くの細胞に分化できる分化万能性と、分裂増殖を経てもそれを維持できる自己複製能を有する細胞をいう。

　体細胞には、何種類かの異なる機能を持つ細胞に分化する能力を持った幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）と、ある機能に特化してしまいそれ以外の細胞にならない分化した細胞（例えば、繊維芽細胞、成体皮膚細胞）とが含まれる。

　因子が導入される対象細胞は、生殖系の細胞や、生殖系細胞由来の細胞、羊膜細胞（胎盤の細胞等を含む。）であってもよい。

　本発明を用いて肝臓細胞を製造するにあたり、用いる対象細胞は特に限定されず、胎児期の細胞でもよく、成熟した成体由来の細胞であってもよい。

　レトロウイルスによって遺伝子を導入する場合、活発に増殖できる細胞を選択することが好ましい場合がある。この例として、胎児由来の繊維芽細胞と、成体骨髄由来の間葉系幹細胞を挙げることができる。

　本発明により得られた肝臓細胞をヒトの疾病の治療に用いるとの観点からは、用いる対象細胞はヒト（成人）由来のもの、例えば皮膚細胞から得た繊維芽細胞であることが好ましく、また患者本人又は患者と同系のヒトから分離した細胞を用いることが好ましい場合がある。

［肝臓細胞、誘導肝細胞］
　本発明で「肝臓細胞（ｈｅｐａｔｉｃ　ｃｅｌｌ）」というときは、特に記載した場合を除き、胎児又は成体の、肝臓を構成する細胞、肝前駆細胞（ｈｅｐａｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ）（肝幹細胞ということもある。）、及び部分的に肝細胞へ分化した細胞を含む。肝臓を構成する細胞は、肝実質細胞（肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ））及び肝非実質細胞（類洞内皮細胞、クッパー細胞、星細胞、ピット細胞、胆管上皮細胞、等）を含む。

　本発明により、非肝臓細胞から肝臓細胞の機能を有する細胞へ誘導された細胞を、既存の肝臓細胞と区別するため、誘導肝細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ，ｉＨｅｐｓ）ということができる。誘導肝細胞には、肝細胞様のもののほか、肝前駆細胞様のもの、又は部分的に肝細胞へ分化した細胞様のものが含まれる。

　ある因子が導入された細胞が誘導肝細胞となったかどうかは、当業者であれば肝細胞分化マーカーであるアルブミンの発現の有無、肝細胞の中期分化マーカーであるα−１−アンチトリプシンの発現の有無、グリコーゲン蓄積能の有無を指標に、及び／又は形態学的な観察により、判断することができる。場合により、α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎの発現を確認してもよい。また特定の肝細胞については、サイトケラチン８及び／又はサイトケラチン１８（ＣＫ８／１８）の発現の有無、コレステロールから胆汁酸への生合成経路の初発段階反応を触媒するＣＹＰ７Ａ１（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　７ａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）の発現の有無、上皮細胞の代表的な接着分子であるＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現の有無を指標に判断してもよい。

［誘導方法］
　本発明においては、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、又はＨＮＦ３γ及びＨＮＦ４αを導入された細胞は、必要であれば標準的な培地（例えば、ＳＣＭ（後掲参照文献１~４参照））で数時間~数週間、例えば２週間前後培養した後、適当な培養条件で培養することにより、肝臓細胞の機能を有する細胞へと誘導されうる。適当な培養のための条件は、細胞を維持する環境に成長因子が含まれ、所望により細胞外マトリクスが存在する培養条件下での培養を意味する。培地は、後掲参照文献２に記載の標準培地を好ましく用いることができる。

　培養のための環境に含まれうる成長因子の例は、肝臓細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，ＨＧＦ）及び上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，ＥＧＦ）等のサイトカインである。ＨＧＦ及びＥＧＦを含む培地が好ましい。

　培地中の成長因子の濃度は、誘導が可能であるかぎり、特に限定されず、また用いる成長因子の種類によっても異なるが、ＥＧＦの場合には、１０~４０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ程度であり、ＨＧＦの場合は、１０~５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０~４０ｎｇ／ｍＬである。

　成長因子の由来は特に限定されず、ヒト組換え体であってもよい。

　細胞外マトリクスの例は、コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン）、ラミニンである。Ｉ型コラーゲンを用いることが好ましい。

　細胞外マトリックスは、培養基材のコーティング剤として用いられることが好ましい。細胞外マトリックスによる培養容器のコーティングは、用いる細胞外マトリックスの種

　類に応じて当分野で通常実施されている方法によって行なうことができる。

　本発明において因子が導入される対象となる細胞として、ヒト成人由来の細胞を用いる場合、マウス由来の細胞に比べると殖能が低い場合が多いが、本発明の実施例で用いている誘導のための培地は、ヒト組替え成長因子を用いていることもあり、ヒト由来細胞にも適用することができる。得られた誘導肝細胞を医療に応用する際には、血清フリーで、かつ他生物由来の物質を排除した培養系により細胞が誘導されることが好ましい。

　誘導のための培養においては、培養容器にも特に限定はなく、例えば、フラスコ、ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロウエルプレート、培養バック、ローラーボトルが用いうる。その他の培養条件は、肝臓細胞の培養のために知られた種々の条件を応用することができる。例えば、培養温度は、３０~４０℃、好ましくは３７℃である。ＣＯ_２濃度は、例えば１~１０％、好ましくは２~５％である。

　誘導のための培養は、通常、１日~数週間、好ましくは１週間~３週間、例えば２週間、継続して行うことができる。培養の適切な段階で、上述の肝細胞分化マーカーの発現の有無の確認や、形態的な観察を行うことにより、培養の終点や、次の段階、例えば、肝臓組織構築のために、三次元培養可能な培養器への細胞の継代や、個体への投与へ移行する段階を決定することができる。

　本発明者らの検討によると、ＭＥＦに対してＨＮＦ４αとＨＮＦ３βを導入することにより得られた細胞は、適切な条件での培養により、肝細胞マーカーを発現する上皮様の増殖を続ける細胞集団となり、その後の継代や凍結保存も可能なものであった。このことは、得られた細胞集団には分化した細胞に加え、より未分化な前駆細胞が混在していることを示しているといえる。

［用途］
　本発明の方法により製造された細胞の用途は特に限定されず、細胞を利用して行われているあらゆる試験・研究、肝臓細胞を用いた疾病の治療などに使用することができる。例えば、本発明により得られた誘導肝細胞は又はその子孫は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏで、人工肝臓組織を構成しうる。本発明により得られた誘導肝細胞又はその子孫を適切な方法で患者に投与することにより、肝臓への細胞移植を達成しうる。このような移植技術は、肝臓の一部切除及び／又は肝臓移植によって処置可能なものを含む各種肝臓疾患、例えば、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、自己免疫性肝炎、肝癌、肝細胞癌、胆管細胞癌、転移性肝癌、肝膿瘍、先天代謝異常症候群（例えば、遺伝性高チロシン血症Ｉ型（フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ欠損症，肝腎型チロシン血症））等の疾患又は状態の処置のために有効であろう。本発明は、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、又はＨＮＦ３γとＨＮＦ４αとを用いる、肝臓疾患の処置方法を提供する。

　方法
　細胞培養
　マウス胎仔繊維芽細胞（Ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ＭＥＦ））をマウス胎仔（Ｃ５７ＢＬ／６Ｅ１３．５）から得て、１０％　ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ））、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（２ｍｍｏｌ／Ｌ）及びｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤＭＥ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。増殖中のＭＥＦに対し、レトロウイルスによる遺伝子導入を５回繰り返した。

　最終導入から１日後、培地をＳＣＭ（ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ、参照文献１~４）に交換した。ＳＣＭ培地は、ＤＭＥＭ及びＦ−１２（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）の１：１混合物に下記を添加したものである。
　１０％　ＦＢＳ
　ｉｎｓｕｌｉｎ（１μｇ／ｍＬ）（Ｗａｋｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）
　ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（１ｘ１０７ｍｏｌ／Ｌ）（Ｓｉｇｍａ）
　ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）（Ｓｉｇｍａ）
　Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（２ｍｍｏｌ／Ｌ），
　β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（５０μｍｏｌ／Ｌ）（Ｓｉｇｍａ）
　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ

　ＳＣＭ培地で２週間培養した後、細胞をタイプＩコラーゲンコートディッシュ（Ｉｗａｋｉ　Ｇｌａｓｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）上に置き換え、ヒト組換え肝臓細胞成長因子（ｈｕｍａｎ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，ＨＧＦ））２０ｎｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ）及び上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，ＥＧＦ））（２０ｎｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）を含む培地で培養した。

　遺伝子発現解析
　ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、キット付属のマニュアルに従い、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを得た。ＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊａｐａｎ）及びＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施した。Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　ＩＤ：Ｍｍ００４８６９０９＿ｇ１）（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を除き、ＰＣＲプライマー及びプローブの情報は文献１~３に示されている。

　レトロウイルス産生
　レトロウイルスベクターｐＧＣｓａｍ（ｍｕｒｉｎｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｖｉｒｕｓ，ＭＳＣＶ）（文献１参照）を用いた。下記の、１２因子をコードするマウス由来の遺伝子各々を、ベクターにサブクローニングした。

　レトロウイルスを生産するため、ｇａｇ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子を含むがｅｎｖ遺伝子を含まない２９３細胞に、プラスミドＤＮＡ、ＶＳＶ−Ｇ　ｅｎｖ発現プラスミド（ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ）（Ｈ．Ｍｉｙｏｓｈｉ氏より供与）の混合物をポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）とともに供給し、そして感染細胞からの上清を集め、９０００ｇ、４℃で１２時間遠心してウイルスを濃縮した。

　感染には、１２−ｗｅｌｌ培養プレートの各ｗｅｌｌに対して１４０倍濃縮ウイルス５０μＬを用いた。

　免疫染色
　組織及び培養した細胞を固定し、抗アルブミン抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）、抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ（ＣＫ）８−１８抗体（Ｐｒｏｇｅｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ、ＣＫ８とＣＫ１８の両分子を検出することができる。）、及び抗ｆｕｍａｒｙｌａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＦＡＨ）抗体（Ｒ．Ｍ．Ｔａｎｇｕａｙ氏より供与）を一次抗体としてインキュベートした。洗浄後、組織及び細胞に、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ　ｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識二次抗体（１：５００；Ｄａｋｏ）、又はＡｌｅｘａ４８８−及び／若しくはＡｌｅｘａ５５５−標識二次抗体（１：２００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を加え、４’，６−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）とともにインキュベートした。

　細胞移植
　ＭＥＦから誘導された上皮様細胞（又はコントロールではＭＥＦ）をトリプシン処理し、洗浄し、２００μｌのＳＣＭに懸濁して、門脈経由で注入することにより、ＦＡＨ欠損マウス（ＦＡＨ−／−、参照文献４）の肝臓に細胞を移植した（１ｘ１０^７　ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）。ＦＡＨ−／−マウスは、遺伝性高チロシン血症Ｉ型のモデルとして知られており、通常は７．５ｍｇ／ｌの２−（２−ｎｉｔｒｏ−４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｙｌ）−１，３−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｄｉｏｎｅ（ＮＴＢＣ）（Ｓｗｅｄｉｓｈ　Ｏｒｐｈａｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含む水を与えて維持しているが、細胞移植後は、この処置を停止した。

　２．結果
　繊維芽細胞を肝細胞に変化させるリプログラミング因子の同定
　肝臓の発生過程において肝細胞分化に関連する１２個の転写因子をコードする遺伝子をレトロウイルスに組み込み、マウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ）に感染させた。

　感染から２週間後、１２因子すべてを導入したＭＥＦでは、肝細胞及び肝前駆細胞で発現するアルブミンやα−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、及び、上皮細胞マーカーであるＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの遺伝子発現が認められた（図１）。そこで次に、１２因子の中で肝細胞へのリプログラミング機能を有する遺伝子を抽出すべく、１２因子から１因子を除いた遺伝子セットをＭＥＦに感染させた。その結果、ＨＮＦ４αやＨＮＦ６を除いた群ではアルブミンの遺伝子発現が減少し、また、ＨＮＦ４αやＨＮＦ１βを除いた群ではα−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子発現が減少した。一方、１２因子から１因子を除いた場合では、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎの遺伝子発現を著しく低下させる群は見られなかった（図１）。

　以上の結果から、アルブミンとα−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎの両遺伝子発現に深く関与することが示唆されたＨＮＦ４αに着目し、ＨＮＦ４αと他の１因子を同時に感染させる実験を行った。その結果、ＨＮＦ４α＋ＨＮＦ３α、ＨＮＦ４α＋ＨＮＦ３β、又はＨＮＦ４α＋ＨＮＦ３γの遺伝子セットを導入した場合において、アルブミンやαｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎの強い発現誘導が認められた（図２）。

　繊維芽細胞のリプログラミングによる肝上皮細胞の出現
　ＭＥＦに対してＨＮＦ４αとＨＮＦ３βを導入してから２週間培養後、Ｉ型コラーゲンコートディッシュに細胞を移し、ＨＧＦ及びＥＧＦを含む肝幹細胞用培地を用いて引き続き培養を行った。その結果、細胞形態がＭＥＦとは完全に異なる上皮様の細胞が出現することが判明した（図３）。免疫染色の結果、これら上皮様細胞のすべてがＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性であり、かつ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎが細胞接着領域に局在するといった上皮細胞特有の形態も獲得していることが判明した（図４）。また、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞の多くが、肝細胞分化マーカーのアルブミンやサイトケラチン８、サイトケラチン１８を発現していることも明らかとなった（図４）。さらに、誘導された上皮様細胞では、肝細胞の中期分化マーカーであるα−１−アンチトリプシンの発現も認められた（図４）。

　以上の結果から、ＨＮＦ４αとＨＮＦ３βの導入によってＭＥＦから生まれる上皮様細胞は、肝上皮細胞であることが明らかとなった。培養中のＭＥＦは早期に老化して細胞死を迎えるが、新しく生まれた上皮様の細胞集団は増殖を続け、その後、継代や凍結保存も可能である。従って、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性の肝上皮細胞集団には、分化した肝細胞に加え、より未分化な肝前駆細胞が混在していると考えられる。すなわち、増殖能力の高い肝前駆細胞から、長期間にわたって、たくさんの肝細胞が供給されていると考えられる。

　繊維芽細胞から誘導された上皮様細胞による肝臓組織の再構築
　ＨＮＦ４αとＨＮＦ３βの導入によってＭＥＦから誘導された上皮様細胞が肝上皮細胞であることを確かめるために、得られた上皮様細胞をＦＡＨノックアウトマウスの肝臓へ移植し、肝臓組織の再構築能を解析した。

　その結果、移植１ヶ月後において、ドナー細胞はＦＡＨ陽性の成熟した肝細胞としてＦＡＨノックアウトマウスの肝臓組織中に生着し、肝臓組織を再構築していることが判明した（図５）。

　この結果から、ＨＮＦ４αとＨＮＦ３βの導入によってＭＥＦから誘導された上皮様細胞は、肝臓組織再構築能を有した肝上皮細胞であることが明らかとなった。

　Ｃｅｌｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓから購入したヒト皮膚由来繊維芽細胞を添付プロトコル通りに培養し、誘導培地及びベクターは、実施例１と同様のものを用いて、下表のＨＮＦ４αとＨＮＦ３γの導入によるにおける遺伝子発現誘導効果を確認した。

　図８に、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　３を用いた場合の結果を示した。

　ＨＮＦ４αのｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔｓ　１~５を試した結果、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔｓ　１~３、特にｔｒａｎｓｃｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　３の効果が高いように思われた。ヒト由来細胞を用いた場合、ＨＮＦ４α＋ＨＮＦ３α及びＨＮＦ４α＋ＨＮＦ３βでも遺伝子発現誘導が得られることを確認したが、マウスと同様、ＨＮＦ４αとＨＮＦ３γとの組み合わせが最も効果的であるとの傾向がみられた。

［実施例で参照した文献］
　参照文献１：Ｓｕｚｕｋｉ　Ａ．，Ｉｗａｍａ　Ａ．，Ｍｉｙａｓｈｉｔａ　Ｈ．，Ｎａｋａｕｃｈｉ　Ｈ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　Ｈ．Ｒｏｌｅ　ｆｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｔｒｉｘ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１３０，２５１３−２５２４，２００３．
　参照文献２：Ｓｕｚｕｋｉ　Ａ．，Ｚｈｅｎｇ　Ｙ．Ｗ．，Ｋｏｎｄｏ　Ｒ．，Ｋｕｓａｋａｂｅ　Ｍ．，Ｔａｋａｄａ　Ｙ．，Ｆｕｋａｏ　Ｋ．，Ｎａｋａｕｃｈｉ　Ｈ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　Ｈ．Ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｍｏｕｓｅ　ｌｉｖｅｒ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　３２，１２３０−１２３９，２０００．
　参照文献３：Ｓｕｚｕｋｉ　Ａ．，Ｚｈｅｎｇ　Ｙ．Ｗ．，Ｋａｎｅｋｏ　Ｓ．，Ｏｎｏｄｅｒａ　Ｍ．，Ｆｕｋａｏ　Ｋ．，Ｎａｋａｕｃｈｉ　Ｈ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　Ｈ．Ｃｌｏｎａｌ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｌｉｖｅｒ．Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１５６，１７３−１８４，２００２．
　参照文献４：Ｓｕｚｕｋｉ　Ａ．，Ｓｅｋｉｙａ　Ｓ．，Ｏｎｉｓｈｉ　Ｍ．，Ｏｓｈｉｍａ　Ｎ．，Ｋｉｙｏｎａｒｉ　Ｈ．，Ｎａｋａｕｃｈｉ　Ｈ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　Ｈ．Ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｌｏｎａｌ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ　ｂｉｐｏｔｅｎｔ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａｄｕｌｔ　ｍｏｕｓｅ　ｌｉｖｅｒ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　４８，１９６４−１９７８，２００８．
　参照文献５：Ｋａｎｅｋｏ　Ｓ，Ｏｎｏｄｅｒａ　Ｍ，Ｆｕｊｉｋｉ　Ｙ，Ｎａｇａｓａｗａ　Ｔ，Ｎａｋａｕｃｈｉ　Ｈ．Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ　ｇｃｓａｐ　ｗｉｔｈ　ｍｕｒｉｎｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｖｉｒｕｓ　ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ　ａｌｌｏｗｓ　ｈｉｇｈ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｙ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ　ｅｎｇｒａｆｔｅｄ　ｉｎ　ｎｏｎｏｂｅｓｅ　ｄｉａｂｅｔｉｃ／ｓｅｖｅｒｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｉｃｅ．Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　１２，３５−４４，２００１．

Claims

　非肝臓細胞から誘導肝細胞を製造する方法であって、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、又はＨＮＦ３γ及びＨＮＦ４αを、非肝臓細胞に導入する工程を含む、方法。
　ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、又はＨＮＦ３γをコードする遺伝子及びＨＮＦ４αをコードする遺伝子を、非肝臓細胞に導入する工程を含む、請求項１に記載の方法。
　非肝臓細胞が、ヒト由来である、請求項１又は２に記載の方法。
　請求項１~３のいずれか１項に記載の製造方法で製造された誘導肝細胞又はその子孫を含む、人工肝臓組織。
　非肝臓細胞に由来し、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、又はＨＮＦ３γをコードする遺伝子及びＨＮＦ４αをコードする遺伝子が導入されている細胞。
　ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β又はＨＮＦ３γをコードする遺伝子及びＨＮＦ４αをコードする遺伝子が導入された非肝臓細胞から誘導された、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性であり、アルブミン、サイトケラチン−８、サイトケラチン−１８又はα−１−アンチトリプシンを発現可能である細胞。
　ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、又はＨＮＦ３γをコードする遺伝子とＨＮＦ４αをコードする遺伝子とからなる、因子セット。
　ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、又はＨＮＦ３γをコードする遺伝子とＨＮＦ４αをコードする遺伝子とからなる、遺伝子セット。
　ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、又はＨＮＦ３γをコードする遺伝子とＨＮＦ４αをコードする遺伝子が導入された非肝臓細胞を、成長因子の存在下で培養する工程を含む、誘導肝細胞の製造方法。
　請求項５に記載の細胞を移植する工程を含む、肝臓への細胞移植方法。
　請求項５に記載の細胞を用いる工程を含む、疾患の処置方法。
　請求項５に記載の細胞を用いる工程を含む、薬剤反応性の評価方法。