WO2011098615A1 - Cellules modifiees pour la production virale par l'inhibition du gene hipk2 - Google Patents

Cellules modifiees pour la production virale par l'inhibition du gene hipk2 Download PDF

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WO2011098615A1
WO2011098615A1 PCT/EP2011/052194 EP2011052194W WO2011098615A1 WO 2011098615 A1 WO2011098615 A1 WO 2011098615A1 EP 2011052194 W EP2011052194 W EP 2011052194W WO 2011098615 A1 WO2011098615 A1 WO 2011098615A1
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WO
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cells
virus
hipk2
production
modified
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PCT/EP2011/052194
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Manuel Rosa-Calatrava
Jean-Jacques Diaz
Sabine Hacot
Bruno Lina
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Universite Claude Bernard Lyon 1
Hospices Civils De Lyon
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16051—Methods of production or purification of viral material
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    • C12N2760/16052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Definitions

  • the present invention provides methods and cells for enhancing the production of virus and viral proteins in cell culture.
  • the invention relates to improving the industrial production of vaccine seeds or influenza virus antigens in cell culture.
  • influenza viruses are typically produced in chicken eggs. This production of influenza viruses in eggs is not without many problems including the time required for the reassortment of viruses and the production of vaccine seeds. In addition, the poultry itself is likely to be affected by influenza viruses which could cause supply difficulties if farms intended for virus production were themselves affected by an influenza virus pandemic.
  • a first alternative would be the production of viruses in cell cultures, this solution is also implemented for many viruses including influenza viruses. From virus produced in cell culture, viral antigens can be purified according to standard techniques. Another solution would be the direct production of viral antigens in cell culture. However, both the production of viruses and the production of viral antigens in cell culture encounter difficulties in terms of yield and thus of the amount of virus or antigen produced.
  • influenza viruses cell lines with regulatory approvals such as MDCK, Vero, BHK21, CHO, HEK 293 and PERC6 are not optimized for vaccine seed production. These lines do not make it possible to obtain adequate production yields for manufacturers. It is the same for other viruses such as adenoviruses or Herpes Simplex Virus (HSV).
  • HSV Herpes Simplex Virus
  • the research therefore focuses on the development of new cell lines for the production of viruses in cell culture as well as on the improvement of the yields of viral and virus production in cell lines available for industrial production.
  • HIPK2 Homeodomain-interacting protein kinase 2 is a serine-threonine kinase protein originally identified as a co-repressor of homeo- domain transcription factors. Since then, HIPK2 has been the best characterized member of the family of HIPK proteins (1 to 4); it is a co-regulator that phosphorylates many factors and cofactors of cellular transcription. HIPK2 is activated in response to DNA damage agents and morphogenetic signals. It is therefore involved in the regulation of gene expression programs for cell differentiation, development and apoptosis. HIPK2 has a pleiotropic effect and is involved in many cellular pathways, including p53. The stable Knockout of HIPK2 in MCF7 cells (breast cancer), for example, induces misfolding of p53 and inhibition of the trancription of p53 target genes.
  • HIPK2 has therefore been the subject of research in the field of oncology.
  • WO 2004/108754 as well as Giraud et al. disclose that the US 11 Herpes Simplex Virus (HSV) protein interacts with HIPK2. No effect on virus replication, viral production or viral antigen production has however been reported.
  • HSV Herpes Simplex Virus
  • the present invention shows that suppressing HIPK2 expression in producer cells provides better replication and viral production.
  • the methods of the present invention thus make it possible to improve the production of viruses and viral antigens in existing cell lines by inactivating or inhibiting the expression of the HIPK2 gene in these cells.
  • the present invention also relates to novel cells and cell lines particularly suitable for viral production in which the HIPK2 gene has been inactivated or inhibited.
  • One of the applications of the methods and modified cells of the present invention is the production of influenza viruses for use as vaccine seeds.
  • the objective is to achieve yields that are similar to or better than the yields achieved by current chicken egg production processes or current production processes on cell lines with regulatory approvals.
  • the invention thus relates to methods of in vitro production of virus by cell culture comprising the infection of cells with a virus and the replication of the virus in these cells wherein the cells are modified cells in which the HIPK2 gene is inactivated or in which the expression of the HIPK2 gene is inhibited.
  • the methods according to the invention further comprise isolating the viruses from the cell culture.
  • the modified cells have a deletion of the HIPK2 gene.
  • the modified cells express an interfering RNA specific for HIPK2.
  • the invention relates to methods for producing viruses selected from adenoviruses, HSV viruses and viruses of the family of orthomyxoviridae.
  • the invention relates to methods of producing viruses selected from influenza viruses of type A, B and C.
  • the cells are chosen from mammalian cells, avian cells or insect cells.
  • the cells are chosen from CHO, MDCK, COS, CV1, Vero, BHK21, PERC6, HEK, HeLa, AGE1 .CR, AGE1 .CR.pIX, EB66, EBx and HEp-2 cells.
  • the invention also relates to the production of viral products comprising the in vitro production of virus by cell culture according to one of the preceding claims.
  • the subject of the invention is also cells modified for the production of viruses by cell culture in which the HIPK2 gene is inactivated or the expression of the HIPK2 gene is inhibited; these cells being infected by a virus.
  • the subject of the invention is also cells modified for the production of viruses by cell culture chosen from CHO, MDCK, COS, CV1, Vero, BHK21, PERC6, HEK, HeLa, AGE1 .CR, AGE1 .CR.pIX cells, EB66, EBx and HEp-2; in which the HIPK2 gene is inactivated or the expression of the HIPK2 gene is inhibited.
  • the cells modified according to the invention are infected with a virus, preferably with a virus chosen from adenoviruses, HSV viruses and viruses of the ortyhomyoxoviridae family, more preferably by a virus chosen from influenza A viruses. , Goat.
  • the HIPK2 gene is inhibited by the expression of a HIPK2-specific interfering RNA.
  • the HIPK2 gene has been deleted.
  • the invention thus relates to a method of producing virus by cell culture comprising the infection of cells with a virus and the replication of the virus in these cells wherein the cells are cells modified in such a way that the HIPK2 gene is inactivated or such that the expression of the HIPK2 gene is inhibited.
  • the invention also relates to a method for producing viral antigens by cell culture comprising expressing the viral antigens in the cells wherein the cells are cells modified such that the HIPK2 gene is inactivated or in such a way that the HIPK2 gene expression is inhibited.
  • the methods of the present invention are preferably in vitro methods.
  • the invention thus particularly relates to a method of producing virus by cell culture comprising infecting the cells with a virus and culturing the cells to obtain viral replication.
  • the method may include isolating or purifying viruses produced from the cells or cell culture.
  • isolation or purification of viruses is also meant the production and purification of viral products including viral antigens.
  • the present invention is based on the unexpected observation that inactivation or inhibition of the HIPK2 gene in cells enhances replication or virus production in cells.
  • the culture of modified cells in which the HIPK2 gene is inactivated or in which the expression of the HIPK2 gene is inhibited makes it possible to significantly increase the yield of virus production by cell culture.
  • modified cells are also useful for increased production of viral antigens by direct expression of genes encoding these antigens in cells.
  • the modified cells used in the methods according to the invention have, for example, a deletion of the HIPK2 gene or they express a HIPK2-specific interfering RNA that inhibits the expression of this gene in the cells.
  • the cells are used for the production of viruses or for the direct production of viral antigens.
  • the cells modified according to the present invention are useful for the industrial production of viruses, viral products, vaccine seeds and / or viral antigens.
  • the modified cells are thus infected with a virus and allow multiplication or replication of the virus in the cell.
  • the virus is a virus chosen from adenoviruses, HSV viruses and viruses of the family of orthomyxoviridae, more preferentially, the virus is chosen from influenza viruses of type A, B and C.
  • the modified cells implemented in the methods of the present invention as well as the modified cells of the present invention may be any type of cell suitable for cell culture, replication, virus production and viral antigen production.
  • the cells are for example selected from mammalian cells, avian cells and insect cells.
  • culture cells derived from human cells, pig or dog cells can in particular be derived from pulmonary epithelium cells (eg human lung carcinoma human A549 CCL-185) or intestinal epithelium (Caco-2 ATCC HTB-37).
  • pulmonary epithelium cells eg human lung carcinoma human A549 CCL-185
  • intestinal epithelium eg human ATCC HTB-37
  • the pulmonary epithelium cells of SJPL pig including in particular the PTA-
  • o HOS human cells including the CRL-1543 line.
  • Drosophila cells and cells selected from SF9 cells CRL-1711, Schneider's Drosophila Line 2 CRL-1963 and BM-N CRL-8910 bombyx are particularly interesting.
  • the cells are avian cells adapted to cell culture, such as, for example:
  • avian cell lines are known to those skilled in the art and can be used. It may in particular be avian embryonic cells.
  • the EB66 and EBx cell lines have been described in WO03 / 076601 and WO2008129058. Lohr et al. describe the establishment of avian cell lines AGE1 .CR and AGE1 .CR.pIX for viral propagation or replication.
  • WO2009 / 004016 also describes immortalized avian cells for viral production and methods for their preparation.
  • these cells are chosen from MDCK, Vero, A549 cells and, generally, from avian cell lines used for the production of influenza viruses.
  • MDCK cells are for example described in US2006 / 0188977 and EPI 862537.
  • the following lines will be mentioned in particular: MDCK-SF101 (ATCC PTA-6501), MDCK-SF102 (ATCC PTA-6502) and MDCK-SF103 (ATCC PTA- 6503).
  • the cells are preferably chosen from the cells:
  • Vero cells including the line CCL-81 Cercopithecus aethiops Vero;
  • CHO cells in particular lines CRL-12444 Cricetulus griseus (Chinese hamster) and CHO DP-12 clone # 1933 aIL8.92 NB 28605/12;
  • o MDCK cells in particular the line CCL-34 Canis familiaris MDCK (NBL-2);
  • COS cells in particular the lines CRL-1650 Cercopithecus aethiops,
  • the CV1 cells in particular the CCL-70 Cercopithecus aethiops CV-1 lines; o HeLa cells, and
  • the cells are chosen from cell lines benefiting from regulatory authorizations for viral production in cell culture for medical purposes.
  • the cells are chosen from BHK21, Vero, PERC6, HEK and EB66 cells.
  • the cells are selected from CHO, MDCK, COS, CV-1, Vero, BHK21, PERC6, HEK, HeLa, AGE1.CR, AGE1 .CR.pIX, EB66, EBx and HEp-2.
  • CV-1, CV-C, Vero and BSC-1 cell lines for viral production is for example described in US 6,303,371.
  • modified cells are modified cells.
  • modified cell is meant a cell whose genome has been modified or into which extra-chromosomal genetic material has been introduced. Typically, this change is a stable or constitutive change.
  • modified cell is also meant a cell in which the HIPK2 protein is inactivated or inhibited.
  • the HIPK2 gene is inactivated or the expression of the HIPK2 gene is inhibited.
  • the inactivation or knock-out of the HIPK2 gene can be achieved by any method of site-specific mutagenesis or recombination known to those skilled in the art.
  • the cells have been modified by the deletion of the HIPK2 gene.
  • the gene may also be inactivated by the insertion of a sequence into the HIPK2 gene that interrupts the open reading frame of the HIPK2 gene. When the HIPK2 gene is inactivated there is no longer any expression of the HIPK2 gene in the modified cell. Inactivation of the HIPK2 gene does not affect cell viability.
  • modified cell in which the expression of the HIPK2 gene is inhibited is meant modified cells in which the expression of the HIPK2 gene is reduced by at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or 98% compared to the same unmodified cell. Inhibition of gene expression may affect transcription or translation of the HIPK2 gene. Alternatively, this inhibition is an inhibition of the activity of the HIPK2 protein.
  • the HIPK2 gene is inhibited by the expression of a HIPK2-specific interfering RNA.
  • the inhibition of the expression or the activity of the HIPK2 gene can be carried out by all the usual means available to those skilled in the art for controlling the expression of the genes that can be used, in particular the use of inhibitors. transcription or translation.
  • interfering RNA molecules are used to specifically target messenger RNA (mRNA): the interfering RNA hybridizes to the mRNA and therefore inhibits the translation of the corresponding protein, either by simple steric hindrance or by promoting the cleavage of the mRNA.
  • the interfering RNA can be selected from several forms such as: antisense RNA, double-stranded RNA, "small interfering" RNA (siRNA), "Small Hairpin” RNA (shRNA) or ribosomal RNA.
  • the interfering RNA is a miRNA.
  • SiRNAs for "Small Interfering RNA” or small interfering RNA, are short sequences of about 15 to 30 base pairs (bp), preferably 19 to 25 bp. They comprise a first strand and a complementary strand identical to the targeted region of the RNA of the target gene. SiRNA refers to synthetic double-stranded RNA forms.
  • ShRNAs for "Small Hairpin RNA” are double-stranded RNAs produced by a sequence cloned into an expression vector, encoding an RNA molecule that will adopt a hairpin shape after cleavage.
  • MiRNAs are long single-stranded RNAs of about 21 to 24 nucleotides produced from double-stranded RNA precursors called pre-miRNAs. In animals, miRNA pre-miRNA processing is performed in the nucleus and in the cytoplasm. The mature miRNA acts on its target mRNA in the cytoplasm within a complex called RISC. It then occurs either a degradation of the mRNA if the complex contains the Ago2 protein, or an inhibition of its translation if the complex contains the Ago 1 protein.
  • RISC complex
  • SiRNAs can be designed and prepared using appropriate software well known to those skilled in the art.
  • siRNA vectors marketed by Invitrogen®.
  • HIPK2-specific interfering RNA is meant a single or double-stranded ribonucleic acid, which interferes with the messenger RNA specific for the HIPK2 gene leading to its degradation and the decrease in its translation into protein.
  • the expression of the HIPK2 gene is inhibited by the modification of the cell to obtain the expression of a HIPK2-specific siRNA having the "sense" sequence 5'-GACACCAGAUGACCAUGAA-3 'and 5'-antisense -UUCAUGGUCAUCUGGUGUC-3 '.
  • the modified cells express a protein "neutralizing" the activity of HIPK2. It may for example be a protein binding to HIPK2.
  • the modified cells express a negative dominant mutant of HIPK2.
  • Any other suitable method may be used to inactivate or inhibit the HIPK2 gene in the modified cells.
  • the HIPK2 gene is a gene conserved within different species and the skilled person will know how to inactivate or inhibit the HIPK2 gene in the various cells used for viral production.
  • NM. .138194 One skilled in the art therefore has the information necessary for the inactivation or inhibition of the HIPK2 gene in cells derived from different species.
  • the modified cells of the present invention are infected with a virus for the production of this virus by cell culture.
  • Any type of virus that can replicate in in vitro cell cultures can be produced by the methods of the present invention.
  • the viruses are chosen from DNA viruses, for example adenoviruses and HSV viruses.
  • the viruses are chosen among the AR viruses such as viruses of the family of orthomyxoviridae and in particular influenza viruses type A, B and C humans and animals.
  • viruses having an interest in a vaccine application and more particularly influenza virus are viruses having an interest in a vaccine application and more particularly influenza virus.
  • the invention also relates to a method for producing a vaccine seed comprising the in vitro production of virus by cell culture according to the methods of the present invention or using cells modified according to the present invention.
  • Figure 1 Quantification of the production of A / H3N2 virus in a state of extinction of the endogenous expression of HIPK2 by transfection of siRNA (SiHIPK2). After transfection with SiRNA, HeLa cells were infected with A / H3N2 virus (at 0.1 MOI). Viral offspring produced at 8, 24 and 32 hpi were titrated with RT-qPCR. The extinction of HIPK2 induces an increase in the amount of A / H3N2 virus produced relative to the conditions of production in non-transfected cells (T) or transfected with a control siRNA (SiC).
  • T non-transfected cells
  • SiC control siRNA
  • FIG. 2 Quantification of the production of Ad5 under conditions of extinction of the endogenous expression of HIPK2 by transfection of siRNA (SHIPK2). After transfection with SiRNA, HeLa cells were infected with Ad5 (at MOI 0.1 and 1). The viral offspring produced at 36 and 90 hpi was titrated on 293 cells. The extinction of HIPK2 induced an increase in the amount of Ad5 produced relative to the conditions of production in cells transfected with a control siRNA (SiC).
  • SiC siRNA
  • FIG. 3 Quantification of the production of HSV-1 under conditions of extinction of the endogenous expression of HIPK2 by transfection of siRNA (SHIPK2). After transfection with SiRNA, HeLa cells were infected with HSV-1 (at 0.1 MOI). Viral offspring produced at 3, 6, 9 and 12 hpi were titrated on elisa plate. The extinction of HIPK2 induces an increase in the amount of HSV-1 produced relative to the conditions of production in cells transfected with a control siRNA (SiC).
  • SiC siRNA
  • FIG. 4 Quantification of A / H3N2 virus production in overexpression of eGFP-HIPK2 by transfection of plasmid encoding the eGFP-HIPK2 fusion. After transfection, HeLa cells were infected with A / H3N2 virus (at 0.1 MOI). Viral offspring produced at 16, 20 and 36 hpi were titrated with RT-qPCR. The overexpression of eGFP-HIPK2 induces a decrease in the amount of A / H3N2 virus produced up to 20 hpi with respect to production conditions in cells transfected with a plasmid encoding eGFP.
  • FIG. 5 Quantification of the production of Ad5 under overexpression of eGFP-HIPK2 by transfection of plasmid encoding the eGFP-HIPK2 fusion. After transfection, HeLa cells were infected with Ad5 (at MOI 0.1 and 1). The viral offspring produced at 48 and 56 hpi was titrated on 293 cells. Overexpression of eGFP-HIPK2 induces a decrease in the amount of Ad5 at 48 and 56 hpi compared to the production conditions in cells transfected with a mouse. plasmid encoding the eGFP.
  • FIG. 6 Quantification of the production of HSV-1 in overexpression condition of eGFP-HIPK2 by transfection of plasmid encoding the eGFP-HIPK2 fusion. After transfection, HeLa cells were infected with HSV-1 (at MOI 0.1, 0.5 and 1). Viral offspring produced at 6, 9 and 12 hpi were titrated on Elisa plate. Over-expression of eGFP-HIPK2 induces a decrease in the amount of HSV-1 at 6, 9 and 12 hpi compared to the production conditions in cells transfected with a plasmid encoding eGFP.
  • A549 cells were infected with H3N2 virus at a MOI of 0.1 for 24 hours (hpi). After binding to 4% PFA, endogenous HIPK2 and viral nucleoprotein (NP) were immunodetected by anti-HIPK2 (rabbit polyclonal, Santa Cruz H55) and anti-NP (17C2 mouse monoclonal, FRE3011) antibodies and cell nuclei marked by the DAPI. The cells were observed by confocal microscopy.
  • NP viral nucleoprotein
  • HIPK2 The subcellular localization pattern of endogenous HIPK2 is completely remodeled by infection at 30 hpi: the HIPH2 accumulation domains (visible in the nucleus of uninfected cells, m) have disappeared; HIPK2 labeling is diffuse in the nuclear space. Identical results were obtained in HeLa cells.
  • HIPK2 is a prime target for viruses, which systematically modify the subcellular localization pattern.
  • HeLa cells were infected with virtus A / H3N2 at a MOI of 0.1 for 8, 24 and 30 hpi.
  • Total cell extracts were made and deposited on SDS PAGE polyacrilamide gel for characterization.
  • Western blots were made with antibodies to reveal the proteins HIPK2, NP (infection marker) and cellular actin (standard control for the amount of material).
  • HIPK2 The endogenous cellular expression of HIPK2 is induced during stress such as viral infections. Like PML, HIPK2 could be a major player in a new cell (innate) anti-viral response pathway. III. Under-expression of endogenous HIPK2 results in a significant increase in A / H3N2 virus production
  • HeLa cells were transfected with control siRNA (SiC) or specific for the mRNA encoding HIPK2 (SiKK2). At 48 hours post-transfection, the cells were infected with the H3N2 virus at a MOI of 0.1 for 8, 24 and 32 hpi.
  • Immunofluorescence analysis at 32 hpi was performed and revealed a significant decrease in endogenous HIPK2 expression in HIPK2 siRNA transfected cells compared to control siRNA (SiC) transfected cells. Labeling of the viral nucleoprotein in the nuclei of infected cells indicates a significant increase in the number of infected cells in the context of extinction of endogenous HIPK2 expression.
  • Quantification of the viruses produced was performed in the two control siRNA (SiC) and endogenous HIPK2 expression silencing (SIHIPK2) transduced control cell populations, as well as in a non-transduced (T) cell population ( Figure 1). Viral titration was performed by RTqPCR to quantify viral RNA contained in the virions produced in the culture supernatant ( Figure 1). Under the condition of extinction of expression of HIPK2 (siHIPK2), the production of influenza virus is optimized.
  • HIPK2 Over-expression of HIPK2 is unfavorable to the replicative cycle of A / H3N2 virus.
  • HeLa cells were transfected with a pcDNA3 plasmid encoding HIPK2 protein merged with eGFP or only eGFP.
  • the cells were infected with the H3N2 virus at a MOI of 0.1 for 16, 20 and 36 hpi.
  • Quantification of the produced viruses was performed in both cell populations transduced by the plasmids encoding eGFP-HIPK2 and eGFP ( Figure 4). Viral titration was performed by RTqPCR in order to quantify the viral AR contained in the virions produced in the culture supernatant.
  • eGFP-HIPK2 under overexpression of HIPK2 (eGFP-HIPK2), influenza virus production was significantly decreased at 16 and 20 hpi, compared to that obtained from cells overexpressing eGFP alone or untransfected ( Figure 4).

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Abstract

La présente demande concerne des procédés et cellules modifiées pour améliorer la production de virus et de protéines virales en culture, en particulier la production industrielle de semences vaccinales ou d'antigènes de virus influenza en culture cellulaire. Le procédé comprend : - l'infection de cellules avec un virus choisi parmi les adénovirus, les virus HSV et les virus influenza de type A, B et C, - la réplication du virus dans ces cellules, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules modifiées dans lesquelles le gène HIPK2 est inactivé ou dans lesquelles l'expression du gène HIPK2 est inhibée.

Description

CELLULES MODIFIÉES POUR LA PRODUCTION VIRALE PAR
L'INHIBITION DU GENE HIPK2
La présente invention concerne des procédés et des cellules pour améliorer la production de virus et de protéines virales en culture cellulaire. En particulier, l'invention concerne l'amélioration de la production industrielle de semences vaccinales ou d'antigènes de virus influenza en culture cellulaire.
Pour la production de semences vaccinales, les virus influenza sont classiquement produits dans des œufs de poule. Cette production des virus de la grippe dans les œufs n'est pas sans poser de nombreux problèmes dont notamment le délai nécessaire pour le réassortiment des virus puis la production des semences vaccinales. En outre, les volailles elles-mêmes sont susceptibles d'être affectés par des virus influenza ce qui pourrait causer des difficultés d'approvisionnement si des élevages destinés à la production de virus étaient eux-mêmes concernés par une pandémie de virus influenza.
Une première alternative serait la production de virus dans des cultures cellulaires, cette solution est d'ailleurs mise en œuvre pour de nombreux virus dont les virus influenza. A partir des virus produits en culture cellulaire, des antigènes viraux peuvent être purifiés selon des techniques habituelles. Une autre solution serait la production directe d'antigènes viraux en culture cellulaire. Cependant, tant la production de virus que la production d'antigènes viraux en culture cellulaire se heurtent à des difficultés en termes de rendement et donc de quantité de virus ou d'antigènes produits.
Dans le cas particulier des virus de la grippe, les lignées cellulaires bénéficiant d'autorisations réglementaires telles que les lignées MDCK, Vero, BHK21, CHO, HEK 293 et PERC6 ne sont pas optimisées pour la production des semences vaccinales. Ces lignées ne permettent pas d'obtenir des rendements de production adéquats pour les industriels. Il en est de même pour d'autres virus tels que les adénovirus ou les Herpès Simplex Virus (HSV).
La recherche porte donc sur le développement de nouvelles lignées cellulaires pour la production de virus en culture cellulaire ainsi que sur l'amélioration des rendements de la production de virus et d'antigènes viraux dans des lignées cellulaires disponibles pour la production industrielle.
HIPK2 (Homeodomain-interacting protein kinase 2) est une protéine Sérine- Thréonine kinase originellement identifiée comme co-répresseur de facteurs de transcription à homéo-domaine. Depuis, HIPK2 a été le membre le mieux caractérisé de la famille des protéines HIPK (1 à 4) ; c'est un co-régulateur qui phosphoryle de nombreux facteurs et cofacteurs de transcription cellulaire. HIPK2 est activé en réponse à des agents de dommage de l'ADN et à des signaux morphogénétiques. Il est de ce fait impliqué dans la régulation des programmes d'expression génique de la différenciation, du développement et de l'apoptose cellulaire. HIPK2 a un effet pléiotropique et il est impliqué dans de nombreuses voies cellulaires, dont celle de p53. Le Knock-out stable de HIPK2 dans les cellules MCF7 (cancer sein) par exemple, induit un misfolding de p53 et l'inhibition de la trancription des gènes cibles de p53.
HIPK2 a donc essentiellement fait l'objet de recherches dans le domaine de la cancérologie. En outre, le document WO 2004/108754 ainsi que Giraud et al. divulguent que la protéine US 11 du Herpès Simplex Virus (HSV) interagit avec HIPK2. Aucun effet sur la réplication du virus, sur la production virale ou sur la production d'antigènes viraux n'a cependant été évoqué.
De façon inattendue, la présente invention montre que la suppression de l'expression de HIPK2 dans les cellules productrices permet d'obtenir une meilleure réplication et une meilleure production virale. Les procédés de la présente invention permettent ainsi d'améliorer la production de virus et d'antigènes viraux dans les lignées cellulaires existantes en inactivant ou inhibant l'expression du gène HIPK2 dans ces cellules. Ainsi, la présente invention concerne également de nouvelles cellules et lignées cellulaires particulièrement adaptées pour la production virale dans lesquelles le gène HIPK2 a été inactivé ou inhibé.
Une des applications des procédés et des cellules modifiées de la présente invention est la production de virus influenza pour utilisation comme semences vaccinales. L'objectif étant d'atteindre des rendements similaires ou supérieurs aux rendements obtenus par les procédés de production actuels sur œufs de poule ou par les procédés de production actuels sur lignées cellulaires bénéficiant d'autorisations réglementaires.
RESUME DE L'INVENTION L'invention se rapporte donc à des procédés de production in vitro de virus par culture cellulaire comprenant l'infection de cellules avec un virus et la réplication du virus dans ces cellules dans lequel les cellules sont des cellules modifiées dans lesquelles le gène HIPK2 est inactivé ou dans lesquelles l'expression du gène HIPK2 est inhibée. De préférence, les procédés selon l'invention comprennent en outre l'isolement des virus à partir de la culture cellulaire.
Dans un premier mode de réalisation, les cellules modifiées ont une délétion du gène HIPK2.
Dans un deuxième mode de réalisation, les cellules modifiées expriment un ARN interférant spécifique de HIPK2.
De préférence, l'invention se rapporte à des procédés de production de virus choisis parmi les adénovirus, les virus HSV et les virus de la famille des orthomyxoviridae.
Plus préférentiellement, l'invention se rapporte à des procédés de production de virus choisi parmi les virus influenza de type A, B et C.
Avantageusement, les cellules sont choisies parmi les cellules de mammifères, les cellules aviaires ou les cellules d'insectes.
De préférence, les cellules sont choisies parmi les cellules CHO, MDCK, COS, CV1, Vero, BHK21, PERC6, HEK, HeLa, AGEl .CR, AGEl .CR.pIX, EB66, EBx et HEp-2.
L'invention a aussi pour objet la production de produits viraux comprenant la production in vitro de virus par culture cellulaire selon l'une des revendications précédentes.
L'invention a aussi pour objet des cellules modifiées pour la production de virus par culture cellulaire dans lesquelles le gène HIPK2 est inactivé ou l'expression du gène HIPK2 est inhibée; ces cellules étant infectées par un virus.
L'invention a aussi pour objet des cellules modifiées pour la production de virus par culture cellulaire choisies parmi les cellules CHO, MDCK, COS, CV1, Vero, BHK21, PERC6, HEK, HeLa, AGEl .CR, AGEl .CR.pIX, EB66, EBx et HEp-2 ; dans lesquelles le gène HIPK2 est inactivé ou l'expression du gène HIPK2 est inhibée.
De préférence, les cellules modifiées selon l'invention sont infectées par un virus, préférentiellement par un virus choisi parmi les adénovirus, les virus HSV et les virus de la famille des ortyhomyoxoviridae, plus préférentiellement par un virus choisi parmi les virus influenza de type A, B ou C.
Dans un premier mode de réalisation, le gène HIPK2 est inhibé par l'expression d'un ARN interférant spécifique de HIPK2.
Dans un deuxième mode de réalisation, le gène HIPK2 a été supprimé. DESCRIPTION DE L'INVENTION
L'invention concerne donc un procédé de production de virus par culture cellulaire comprenant l'infection de cellules avec un virus et la réplication du virus dans ces cellules dans lequel les cellules sont des cellules modifiées de telle façon que le gène HIPK2 est inactivé ou de telle façon que l'expression du gène HIPK2 est inhibée.
L'invention concerne également un procédé de production d'antigènes viraux par culture cellulaire comprenant l'expression des antigènes viraux dans les cellules dans lequel les cellules sont des cellules modifiées de telle façon que le gène HIPK2 est inactivé ou de telle façon que l'expression du gène HIPK2 est inhibée.
Les procédés de la présente invention sont de préférence des procédés in vitro.
L'invention concerne donc notamment un procédé de production de virus par culture cellulaire comprenant l'infection des cellules avec un virus et la culture des cellules pour obtenir la réplication virale. Après la réplication du virus, le procédé peut comprendre l'isolement ou la purification des virus produits à partir des cellules ou de la culture cellulaire. Par "isolement ou purification des virus" on entend également l'obtention et la purification de produits viraux dont notamment les antigènes viraux.
La culture des cellules, l'infection des cellules par un virus et la réplication virale dans les cellules sont effectués selon les techniques habituelles dans ce domaine.
La présente invention repose sur l'observation inattendue que l'inactivation ou l'inhibition du gène HIPK2 dans les cellules accroît la réplication ou la production de virus dans les cellules. Ainsi, la culture de cellules modifiées dans lesquelles le gène HIPK2 est inactivé ou dans lesquelles l'expression du gène HIPK2 est inhibée, permet d'accroître signifîcativement le rendement de la production de virus par culture cellulaire.
Ces cellules modifiées sont également utiles pour une production accrue d'antigènes viraux par expression directe des gènes codant pour ces antigènes dans les cellules.
Les cellules modifiées mise en œuvre dans les procédés selon l'invention ont par exemple une délétion du gène HIPK2 ou elles expriment un ARN interférant spécifique de HIPK2 inhibant l'expression de ce gène dans les cellules.
Ces cellules sont mise en œuvre pour la production de virus ou pour la production directe d'antigènes viraux. Les cellules modifiées selon la présente invention sont utiles pour la production industrielle de virus, de produits viraux, de semences vaccinales et/ou d'antigènes viraux. Dans des modes de réalisation préférées, les cellules modifiées sont donc infectées par un virus et permettent la multiplication ou la réplication du virus dans la cellule. De préférence, le virus est un virus choisis parmi les adénovirus, les virus HSV et les virus de la famille des orthomyxoviridae, plus préférentiellement, le virus est choisi parmi les virus influenza de type A, B et C.
Les cellules modifiées mises en œuvre dans les procédés de la présente invention ainsi que les cellules modifiées de la présente invention peuvent être tout type de cellule appropriée pour la culture cellulaire, la réplication, la production de virus et la production d'antigènes viraux.
Ainsi, les cellules sont par exemple choisies parmi les cellules de mammifères, les cellules aviaires et les cellules d'insectes.
Parmi les cellules de mammifères on citera en particulier les cellules de culture dérivées de cellules humaines, de cellules de porc ou de chien. Ces cellules peuvent notamment être dérivées de cellules d'épithélium pulmonaire (ex : carcinome humain poumon A549 humaine CCL-185) ou d'épithélium intestinal (Caco-2 ATCC HTB-37).
Parmi les cellules de mammifères, on citera également les cellules suivantes :
o les cellules d'épithélium pulmonaire de porc SJPL dont notamment la lignée PTA-
3256 déposée à l'ATCC (US2004/0142450 et WO2009/059411),
o les cellules MDCK de chien,
o BHK21 CCL- 10 Mesocricetus auratus (hamster),
o les cellules humaines HOS dont notamment la lignée CRL-1543.
Parmi les cellules d'insectes, on citera en particulier les cellules de drosophiles et les cellules choisies parmi les cellules SF9 CRL-1711, Schneider's Drosophila Line 2 CRL- 1963 et bombyx BM-N CRL-8910.
Dans un mode de réalisation préféré, les cellules sont des cellules aviaires adaptées à la culture cellulaire telles que par exemple :
o CCL- 141 Anas platyrhynchus domesticus,
o CRL-12135 Gallus gallus Con A - Cl - VICK,
o CRL- 12203 Gallus gallus UMNSAH/DF-1,
o CRL-12357 Gallus gallus ConA-Bl-VICK,
o CRL- 1590 Gallus gallus SL-29,
o CRL- 1708 Coturnix coturnix japonica QT6,
o CRL- 1962 Coturnix coturnix japonica QM7 (Quail muscle clone 7),
o CRL-2111 Gallus gallus (chicken) DT40, o CRL-2112 Gallus gallus (chicken) DT95,
o CRL-8135 Meleagris gallopavo (turkey) MDTC-RP19, et
o et la lignée QM7 de myoblastes déposée à l'ATCC (CRL-1632) décrite dans le document US2005/0084503.
D'autres lignées cellulaires aviaires sont connues de l'homme du métier et peuvent être utilisées. Il peut notamment s'agir de cellules embryonnaires aviaires. Les lignées cellulaires EB66 et EBx ont été décrites dans le WO03/076601 et le WO2008129058. Lohr et al. décrivent l'établissement de lignées cellulaires aviaires AGEl .CR et AGEl .CR.pIX pour la propagation ou la réplication virale. WO2009/004016 décrit également des cellules aviaires immortalisées pour la production virale et leurs procédés de préparation.
De préférence, ces cellules sont choisies parmi les cellules MDCK, Vero, A549 et de manière générale parmi les lignées de cellules aviaires utilisées pour la production de virus influenza.
Les cellules MDCK sont par exemple décrites dans US2006/0188977 et EPI 862537. On citera en particulier les lignées suivantes : MDCK-SF101 (ATCC PTA- 6501), MDCK-SF102 (ATCC PTA-6502) et MDCK-SF103 (ATCC PTA-6503).
Les cellules sont de préférence choisies parmi les cellules :
o les cellules Vero notamment la lignée CCL-81 Cercopithecus aethiops Vero ;
o les cellules CHO notamment les lignées CRL- 12444 Cricetulus griseus (Chinese hamster) et CHO DP-12 clone#1933 aIL8.92 NB 28605/12 ;
o les cellules MDCK notamment la lignée CCL-34 Canis familiaris MDCK (NBL-2) ;
o les cellules COS notamment les lignées CRL- 1650 Cercopithecus aethiops,
COS-1 CRL- 1651 Cercopithecus aethiops et COS-7 ;
o les cellules CV1 notamment les lignées CCL-70 Cercopithecus aethiops CV-1 ; o les cellules HeLa, et
o les cellules HEp-2.
Avantageusement, les cellules sont choisies parmi les lignées cellulaires bénéficiant d'autorisations réglementaires pour la production virale en culture cellulaire à des fins médicales.
De préférence, les cellules sont choisies parmi les cellules BHK21, Vero, PERC6, HEK et EB66. Dans des modes de réalisation avantageux, les cellules sont choisies parmi CHO, MDCK, COS, CV-1, Vero, BHK21, PERC6, HEK, HeLa, AGE1.CR, AGEl .CR.pIX, EB66, EBx et HEp-2.
L'utilisation de lignées cellulaires CV-1, CV-C, Vero et BSC-1 pour la production virale est par exemple décrite dans US 6,303,371.
Les cellules de la présente invention sont des cellules modifiées. Par « cellule modifiée », on entend une cellule dont le génome a été modifié ou dans laquelle a été introduit un matériel génétique extra-chromosomique. Typiquement, cette modification est une modification stable ou constitutive. Par "cellule modifiée", on entend également une cellule dans laquelle la protéine HIPK2 est inactivée ou inhibée.
De préférence, dans les cellules modifiées selon la présente invention, le gène HIPK2 est inactivé ou l'expression du gène HIPK2 est inhibée.
L'inactivation ou le « Knock-out » du gène HIPK2 peut être obtenue par toute méthode de mutagénèse dirigée ou de recombinaison connue de l'homme du métier. Dans des modes de réalisation préférés, les cellules ont été modifiées par la délétion du gène HIPK2. Le gène peut également être inactivé par l'insertion d'une séquence dans le gène HIPK2 qui interrompt le cadre ouvert de lecture du gène HIPK2. Lorsque le gène HIPK2 est inactivé il n'y a plus aucune expression du gène HIPK2 dans la cellule modifiée. L'inactivation du gène HIPK2 n'affecte pas la viabilité des cellules.
Par « cellule modifiée dans laquelle l'expression du gène HIPK2 est inhibée », on entend des cellules modifiées dans lesquelles l'expression du gène HIPK2 est réduite d'au moins 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% par rapport à la même cellule non modifiée. L'inhibition de l'expression du gène peut affecter la transcription ou la traduction du gène HIPK2. Alternativement, cette inhibition est une inhibition de l'activité de la protéine HIPK2.
Dans un mode de réalisation préféré, le gène HIPK2 est inhibé par l'expression d'un ARN interférant spécifique de HIPK2.
L'inhibition de l'expression ou de l'activité du gene HIPK2 peut s'effectuer par tous les moyens usuels à disposition de l'homme du métier permettant de contrôler l'expression des gènes sont utilisables, notamment l'utilisation d'inhibiteurs de transcription ou de traduction.
En particulier l'usage d'ARN interférents permet d'inhiber spécifiquement l'expression de gènes d'intérêt. Les molécules d'ARN interfèrent sont utilisées pour cibler spécifiquement des ARN messager (ARNm) : l'ARN interfèrent vient s'hybrider à l'ARNm et par conséquent inhibe la traduction de la protéine correspondante, soit par simple encombrement stérique, soit en favorisant le clivage de l'ARNm. L'ARN interfèrent peut être choisi parmi plusieurs formes telles que : ARN antisens, ARN double- brin, « small interfering » ARN (siRNA), « Small Hairpin» ARN (shRNA) ou ARN ribosomal. Dans un autre mode de réalisation, Γ ARN interférant est un miARN.
Les siRNA, pour « Small Interfering RNA » ou ARN interférant de petite taille, sont des séquences courtes d'environ 15 à 30 paires de bases (bp), de préférence de 19 à 25 bp. Elles comprennent un premier brin et un brin complémentaire identiques à la région ciblée de l'ARN du gène cible. Par siRNA, on entend les formes d'ARN double brin synthétiques.
Les shRNA pour « Small Hairpin RNA » sont des ARN double brin produits par une séquence clonée dans un vecteur d'expression, codant pour une molécule d'ARN qui adoptera une forme en épingle à cheveux après clivage.
Les miRNA (micro ARN) sont des ARN simple-brin longs d'environ 21 à 24 nucléotides produits à partir de précurseurs ARN double brin appelés pré-miARN. Chez les animaux, la maturation des pré-miARN en miARN est effectuée dans le noyau et dans le cytoplasme. Le miARN mature agit sur son ARNm cible dans le cytoplasme au sein d'un complexe appelé RISC. Il se produit ensuite soit une dégradation de l'ARNm si le complexe contient la protéine Ago2, soit une inhibition de sa traduction si le complexe contient la protéine Ago 1.
Le design et la préparation d'ARN interférents et leur utilisation pour la transfection de cellules in vivo et in vitro sont bien connues et largement décrites dans de nombreuses publications. Les siRNA peuvent être conçus et préparés en employant des logiciels appropriés bien connus de l'homme du métier.
Les outils pour la préparation de siRNA et la transfection de cellules sont à la disposition du public, comme par exemple les vecteurs de siRNA commercialisés par la société Invitrogen®.
Par « ARN interfèrent spécifique de HIPK2», on entend un acide ribonucléique simple ou double brin, qui interfère avec l'ARN messager spécifique du gène HIPK2 conduisant à sa dégradation et à la diminution de sa traduction en protéine.
Dans un mode de réalisation préféré, l'expression du gène HIPK2 est inhibée par la modification de la cellule pour obtenir l'expression d'un siRNA spécifique de HIPK2 ayant la séquence « sensé » 5'-GACACCAGAUGACCAUGAA-3' et antisense 5 '-UUCAUGGUCAUCUGGUGUC-3 '. Dans un autre mode de réalisation, les cellules modifiées expriment une protéine « neutralisant » l'activité de HIPK2. Il peut par exemple s'agir d'une protéine se liant à HIPK2.
Dans un autre mode de réalisation, les cellules modifiées expriment un mutant dominant négatif de HIPK2.
Toute autre méthode appropriée peut être utilisée pour inactiver ou inhiber le gène HIPK2 dans les cellules modifiées.
Le gène HIPK2 est un gène conservé au sein de différentes espèces et l'homme du métier saura donc inactiver ou inhiber le gène HIPK2 dans les différentes cellules utilisées pour la production virale.
Le tableau ci-dessus indique les références GENBANK du gène HIPK2 dans différentes espèces.
espèce symbol gene/unigene Refseq Accession
Homo sapiens HIPK2 28996 NM. .001 1 13239 AAL37371
NM. .022740 AAG41236
Mus musculus Hipk2 15258 NM. .010433 AAK07649
NM. .001 136065 AAK07650
Rattus norvegicus Hipk2 362342 XM_ .001066812
XM_ .342662
Danio rerio Hipk2 557551 NM. .001080160 BC171706
NM. .001099985
Pan troglodytes Hipk2 463772 XM_ .519419
XM_ .001 151817
Gallus gallus Hipk2 374138 XM_ .416335 AF461697
BX950640
Canis lupus familiaris LOC482772 482772 NM. .001014769 AY800385
Drosophila melanogaster CG 17090 38070 NM. .167834
NM. .138194 L'homme du métier dispose donc des informations nécessaires à l'inactivation ou à l'inhibition du gène HIPK2 dans des cellules dérivées de différentes espèces.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules modifiées de la présente invention sont infectées par un virus pour la production de ce virus par culture cellulaire.
Tout type de virus pouvant se répliquer dans des cultures cellulaires in vitro peut être produit par les procédés de la présente invention.
Avantageusement, les virus sont choisis parmi les virus à ADN dont par exemple les Adénovirus et les virus HSV. Dans un autre mode de réalisation, les virus sont choisis parmi les virus à AR comme les virus de la famille des orthomyxoviridae et en particulier les virus influenza de type A, B et C humains et animaux.
De préférence, il s'agit de virus ayant un intérêt dans une application vaccinale et plus particulièrement de virus influenza.
Ainsi l'invention concerne aussi un procédé de production d'une semence vaccinale comprenant la production in vitro de virus par culture cellulaire selon les procédés de la présente invention ou mettant en œuvre des cellules modifiées selon la présente invention.
FIGURES
Figure 1 : Quantification de la production de virus A/H3N2 en condition d'extinction de l'expression endogène d'HIPK2 par transfection de siRNA (SiHIPK2). Après transfection par des SiRNA, les cellules HeLa ont été infectées par le virus A/H3N2 (à MOI 0,1). La progéniture virale produite à 8, 24 et 32 hpi a été titrée par RT-qPCR. L'extinction d'HIPK2 induit une augmentation de la quantité de virus A/H3N2 produite par rapport aux conditions de production en cellules non transfectées (T) ou transfectées par un siRNA témoin (SiC).
Figure 2 : Quantification de la production d'Ad5 en conditions d'extinction de l'expression endogène d'HIPK2 par transfection de siRNA (SÏHIPK2). Après transfection par des SiRNA, les cellules HeLa ont été infectées par l'Ad5 (à MOI 0,1 et 1). La progéniture virale produite à 36 et à 90 hpi a été titrée sur cellules 293. L'extinction d'HIPK2 induit une augmentation de la quantité d'Ad5 produite par rapport aux conditions de production en cellules transfectées par un siRNA témoin (SiC).
Figure 3 : Quantification de la production d'HSV-1 en conditions d'extinction de l'expression endogène d'HIPK2 par transfection de siRNA (SÏHIPK2). Après transfection par des SiRNA, les cellules HeLa ont été infectées par l'HSV-l (à MOI 0,1). La progéniture virale produite à 3, 6, 9 et 12 hpi a été titrée sur plaque elisa. L'extinction d'HIPK2 induit une augmentation de la quantité d'HSV-1 produite par rapport aux conditions de production en cellules transfectées par un siRNA témoin (SiC).
Figure 4 : Quantification de la production de virus A/H3N2 en condition de surexpression d'eGFP-HIPK2 par transfection de plasmide codant pour la fusion eGFP- HIPK2. Après transfection, les cellules HeLa ont été infectées par le virus A/H3N2 (à MOI 0,1). La progéniture virale produite à 16, 20 et 36 hpi a été titrée par RT-qPCR. La sur-expression d'eGFP-HIPK2 induit une diminution de la quantité de virus A/H3N2 produite jusqu'à 20 hpi par rapport aux conditions de production en cellules transfectées par un plasmide codant pour l'eGFP.
Figure 5 : Quantification de la production d'Ad5 en condition de sur-expression d'eGFP-HIPK2 par transfection de plasmide codant pour la fusion eGFP-HIPK2. Après transfection, les cellules HeLa ont été infectées par l'Ad5 (à MOI 0,1 et 1). La progéniture virale produite à 48 et 56 hpi a été titrée sur cellules 293. La sur-expression d'eGFP- HIPK2 induit une diminution de la quantité d'Ad5 à 48 et 56 hpi par rapport aux conditions de production en cellules transfectées par un plasmide codant pour l'eGFP.
Figure 6 : Quantification de la production d'HSV-1 en condition de sur-expression d'eGFP-HIPK2 par transfection de plasmide codant pour la fusion eGFP-HIPK2. Après transfection, les cellules HeLa ont été infectées par l'HSV-1 (à MOI 0,1 ; 0,5 et 1). La progéniture virale produite à 6, 9 et 12 hpi a été titrée sur plaque Elisa. La sur-expression d'eGFP-HIPK2 induit une diminution de la quantité d'HSV-1 à 6, 9 et 12 hpi par rapport aux conditions de production en cellules transfectées par un plasmide codant pour l'eGFP.
EXEMPLES
I. Modification du patron de localisation subcellulaire d'HIPK2 endogène au cours de l'infection
Par le virus influenza A/Moscow/ 10/99 H3N2
Des cellules A549 ont été infectées par le virus H3N2 à une MOI de 0,1 pendant 24 heures (hpi). Après fixation au PFA 4%, HIPK2 endogène et la nucléoprotéine virale (NP) ont été immunodétectées par les anticorps anti-HIPK2 (polyclonal de lapin, Santa Cruz H55) et anti-NP (monoclonal de souris 17C2, FRE3011) et les noyaux cellulaires marqués par le DAPI. Les cellules ont été observées en microscopie confocale.
Le patron de localisation subcellulaire de HIPK2 endogène est complètement remodelé par l'infection à 30 hpi : les domaines d'accumulation d'HIPH2 (visible dans le noyau des cellules non infectées, m) ont disparu ; le marquage d'HIPK2 est diffus dans l'espace nucléaire. Des résultats identiques ont été obtenus en cellules HeLa.
Des résultats similaires ont été obtenus avec des cellules infectées par HSV-1 ou par l'Adénovirus de type 5. Dans des cellules A549 infectées par l'Adénovirus de type 5 (Ad5). Le patron de localisation d'HIPK2 endogène est modifié par rapport aux cellules non infectées. HIPK2 s'accumule fortement dans des domaines nucléaires périphériques à la zone centrale nucléaire d'accumulation de matériel viral (sous forme de chapelet). Dans des cellules infectés par un virus HSV-1. Le patron de localisation subcellulaire d'HIPK2 endogène est modifié par rapport aux cellules non infectées.
HIPK2 constitue une cible privilégiée des virus, qui en modifient systématiquement le patron de localisation subcellulaire.
II. L'infection par le virus influenza A/H3N2 induit une forte augmentation d'expression d'HIPK2 endogène
Des cellules HeLa ont été infectées par le virtus A/H3N2 à une MOI de 0,1 pendant 8, 24 et 30 hpi. Des extraits cellulaires totaux ont été réalisés et déposés sur gel de polyacrilamide SDS PAGE pour caractérisation. Des Western blot ont été réalisés avec des anticorps permettant de révéler les protéines HIPK2, NP (marqueur d'infection) et actine cellulaire (témoin étalon pour la quantité de matériel).
Des résultats similaires ont été obtenus avec des cellules infectées par HSV-1 ou par l'Adénovirus de type 5 : l'expression endogène d'HIPK2 est induite par les infections à virus HSV-1 et Ad5.
L'expression endogène cellulaire d'HIPK2 est induite lors de stress tels que les infections virales. A l'image de PML, HIPK2 pourrait constituer un acteur majeur dans une nouvelle voie de réponse cellulaire (innée) anti-virale. III. La sous-expression d'HIPK2 endogène aboutit à une augmentation significative de la production de virus A/H3N2
Des cellules HeLa ont été transfectées par des siRNA témoin (SiC) ou spécifique de l'ARNm codant HIPK2 (SÏHIPK2). A 48 heures post-transfection, les cellules ont été infectées par le virus H3N2 à une MOI de 0,1 pendant 8, 24 et 32 hpi.
Une analyse par immunofluorescence à 32 hpi a été effectuée et révèle une diminution significative de l'expression d'HIPK2 endogène dans les cellules transfectées par le siRNA HIPK2 en comparaison des cellules transfectées par le siRNA témoin (SiC). Le marquage de la nucléoprotéine virale dans les noyaux de cellules infectées, indique une augmentation significative du nombre de cellules infectées dans le contexte d'extinction de l'expression de HIPK2 endogène.
Une quantification des virus produits a été réalisée dans les deux populations de cellules transduites par les siRNA témoin (SiC) et d'extinction d'expression d'HIPK2 endogène (SÏHIPK2), ainsi que dans une population de cellules non transduites (T) (Figure 1). La titration virale a été réalisée par RTqPCR afin de quantifier l'ARN viral contenu dans les virions produits dans le surnageant de culture (Figure 1). En condition d'extinction d'expression d'HIPK2 (siHIPK2), la production de virus influenza est optimisée.
Des résultats similaires ont été obtenus pour les virus HSV-1 et Ad5, dont la production est augmentée en condition d'extinction d'expression d'HIPK2 endogène (Figure 2 et Figure 3).
IV. La sur-expression d'HIPK2 est défavorable au cycle réplicatif du virus A/H3N2 Des cellules HeLa ont été transfectées par un plasmide pcDNA3 codant la protéine HIPK2 en fusion avec l'eGFP ou uniquement l'eGFP. A 48 heures post-transfection, les cellules ont été infectées par le virus H3N2 à une MOI de 0,1 pendant 16, 20 et 36 hpi. Une quantification des virus produits a été réalisée dans les deux populations de cellules transduites par les plasmides codant eGFP-HIPK2 et eGFP (Figure 4). La titration virale a été réalisée par RTqPCR afin de quantifier l'AR viral contenu dans les virions produits dans le surnageant de culture. En condition de surexpression d'HIPK2 (eGFP-HIPK2), la production de virus influenza est diminuée de manière significative à 16 et 20 hpi, en comparaison à celle obtenue à partir de cellules surexprimant l'eGFP seule ou non transfectées (Figure 4). RÉFÉRENCES
Références Bibliographiques
Giraud S et al, J Virol. 2004, 78(6):2984-93
Lohr et al, Vaccine, 2009, 27:4975-4982
Références Brevet
WO 2003/076601
WO 2004/108754
WO 2008/129058
WO 2009/059411
WO 2009/004016
US 6,303,371
EP 1862537
US 2006/0188977
US 2004/0142450
US 2005/0084503

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de production in vitro de virus par culture cellulaire comprenant :
l'infection de cellules avec un virus choisi parmi les adénovirus, les virus HSV et les virus influenza de type A, B et C,
la réplication du virus dans ces cellules,
caractérisé en ce que les cellules sont des cellules modifiées dans lesquelles le gène HIPK2 est inactivé ou dans lesquelles l'expression du gène HIPK2 est inhibée.
Procédé de production in vitro de virus par culture cellulaire selon la revendication précédente dans lequel les cellules modifiées ont une délétion du gène HIPK2.
Procédé de production in vitro de virus par culture cellulaire selon l'une des revendications précédentes dans lequel les cellules modifiées expriment un ARN interférant spécifique de HIPK2.
Procédé de production in vitro de virus par culture cellulaire selon l'une des revendications précédentes dans lequel le virus est choisi parmi les virus influenza de type A, B et C.
Procédé de production in vitro de virus par culture cellulaire selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les cellules sont choisies parmi les cellules de mammifères, les cellules aviaires ou les cellules d'insectes.
Procédé de production in vitro de virus par culture cellulaire selon l'une des revendications précédentes caractérisé en que les cellules sont choisies parmi les cellules CHO, MDCK, COS, CV1 , Vero, BHK21, PERC6, HEK, HeLa, AGE1.CR, AGEl .CR.pIX, EB66, EBx et HEp-2.
7. Procédé de production de produits viraux comprenant la production in vitro de virus par culture cellulaire selon l'une des revendications précédentes.
8. Cellules modifiées pour la production de virus par culture cellulaire infectées par un virus choisi parmi les adénovirus, les virus HSV et les virus influenza de type A, B et C, caractérisées en ce que le gène HIPK2 des cellules modifiées est inactivé ou l'expression du gène HIPK2 des cellules modifiées est inhibée.
9. Cellules modifiées pour la production de virus par culture cellulaire choisies parmi les cellules CHO, MDCK, COS, CV1 , Vero, BHK21, PERC6, HEK, HeLa, AGE1.CR, AGEl .CR.pIX, EB66, EBx et HEp-2 caractérisées en ce que le gène HIPK2 des cellules modifiées est inactivé ou l'expression du gène HIPK2 des cellules modifiées est inhibée.
10. Cellules modifiées pour la production de virus par culture cellulaire selon la revendication 9 caractérisées en ce que les cellules modifiées sont infectées avec un virus choisi parmi les adénovirus, les virus HSV et les virus influenza de type A.
11. Cellules modifiées pour la production de virus par culture cellulaire selon la revendication 10 caractérisées en ce que lesdites cellules modifiées sont infectées avec un virus choisi parmi les virus influenza de type A, B et C.
12. Cellules modifiées pour la production de virus par culture cellulaire selon l'une des revendications 9-11 caractérisées en ce que le gène HIPK2 est inhibé par l'expression d'un ARN interférant spécifique de HIPK2.
13. Cellules modifiées pour la production de virus par culture cellulaire selon l'une des revendications 9-11 caractérisées en ce que le gène HIPK2 est inactivé par sa délétion.
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