CN110711202A - Phb2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种PHB2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用。本发明的PHB2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用，通过间接免疫荧光试验检测PCV2在PK‑15细胞中的增殖变化，检测PCV2感染PK‑15细胞后PHB2 mRNA的动态变化，和鉴定在PHB2基因或蛋白的抑制剂转染PK‑15细胞中PCV2 Cap蛋白表达。结果表明，PHB2在正常及PCV2感染的PK‑15细胞中均有效表达。PCV2可显著影响PK‑15细胞中PHB2转录，而且PHB2对PCV2病毒复制具有调节作用，下调PHB2的表达，即PHB2基因敲除或蛋白表达下调，能明显抑制PCV2复制，对阐明PCV2致病机理和研究新的抗病毒药物具有重要意义。

Description

PHB2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别地，涉及一种PHB2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用。

背景技术

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，是无囊膜的环状单链DNA病毒(直径17nm)。目前在猪群中已鉴定出PCV1、PCV2和PCV3。其中，PCV2临床或亚临床感染被认为是猪圆环病毒病(porcine circovirus diseases and porcinecircovirus-associated diseases，PCVD/PCVAD)的主要原因，PCVD/PCVAD传染性强、流行范围广，不同猪(群或场)的PCVAD发病率和严重程度存在差异，该疾病日趋复杂，其代表性特征主要是猪皮炎和肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaningmultisystemic wasting syndrome，PMWS)以及猪呼吸系统疾病综合征(Porcine respiratory disease complex，PRDC)，还可引起繁殖障碍等，严重危害全球养殖业。PCV2Cap蛋白(Capsidprotein)是PCV2唯一的核衣壳蛋白，也是主要免疫原性蛋白，基于PCV2Cap蛋白组装的病毒样颗粒(Virus-likeparticles，VLPs)亚单位疫苗可应用于猪场PCV2的预防。

迄今为止，PCVD/PCVAD的确切机制还有待阐明，加上临床上PCV2基因组的高突变率和混合感染问题日益严重，使防控PCV2流行面临严峻挑战。Shuang等在研究泛素-蛋白酶体系统(UPS)与PCV2复制的互作时发现，其蛋白酶体抑制剂(MG132和lactacystin)显著降低PCV2早期复制滴度，UPS可能以细胞周期依赖的方式降低病毒蛋白表达和RNA转录，表明PCV2复制效率与UPS密切相关。Liu等利用Hsp 90抑制剂(17-AAG)腹腔注射小鼠后发现，17-AAG能够显著降低血液和组织中PCV2病毒载量，可降低PCV2感染小鼠血液和组织中的病毒载量，表明Hsp 90与PCV2复制密切相关。Wang等研究发现波形蛋白(Vimentin)可以与PCV2Cap蛋白之间的相互作用，并对PCV2在PK-15细胞中的复制有一定的抑制作用。目前PCV2感染与宿主细胞之间的相互作用网络还不是十分清楚，而PCV2与宿主细胞内蛋白分子互作的研究报道相对较少。

抗增殖蛋白(prohibitins，PHBs)是一种高度保守和结构非常稳定的蛋白质家族(包括PHB1和PHB2等)，PHBs广泛分布于各种生物细胞，呈现不同细胞定位，主要存在于线粒体内膜，也少量分布于细胞质膜和细胞核。PHBs是细胞中重要的多功能蛋白，直接参与调控细胞增殖、凋亡和分化等多种细胞生物学进程，与肿瘤、糖尿病和肥胖症等疾病密切相关。而PHB2是PHBs家族中的重要成员，是线粒体与细胞核间相互交流的重要媒介。

发明内容

本发明提供了一种PHB2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用，解决如何抑制猪圆环病毒2型的复制的技术问题。

本发明采用的技术方案如下：

一种PHB2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用。

进一步地，抑制剂选择以能够抑制PHB2蛋白表达或基因转录的小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)或反义寡核苷酸；或能表达或形成siRNA、dsRNA、shRNA或反义寡核苷酸的构建物。

进一步地，siRNA包括PHB2siRNA-1或PHB2siRNA-2；PHB2siRNA-1的靶序列如SEQID NO：1所示，或者，PHB2siRNA-2的靶序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步地，shRNA的编码序列正义链如SEQ ID NO：3所示，反义链如SEQ ID NO：4所示。

根据本发明的另一方面，还提供了一种抑制猪圆环病毒2型的siRNA的靶序列，siRNA包括PHB2siRNA-1或PHB2siRNA-2；PHB2siRNA-1的靶序列如SEQ ID NO：1所示，或者，PHB2siRNA-2的靶序列如SEQ ID NO：2所示。

根据本发明的另一方面，还提供了一种抑制猪圆环病毒2型的shRNA分子，shRNA分子的编码序列正义链如SEQ ID NO：3所示，反义链如SEQ ID NO：4所示。

根据本发明的另一方面，还提供了一种含有上述抑制猪圆环病毒2型的shRNA分子的shRNA表达质粒。

根据本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物，包括上述siRNA的靶序列、shRNA分子、shRNA表达质粒中的一种，还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。

根据本发明的另一方面，还提供了一种用于抑制猪圆环病毒2型复制的试剂盒，包括上述siRNA的靶序列、上述shRNA分子、上述shRNA表达质粒中的一种。

本发明具有以下有益效果：

本发明的PHB2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用，通过间接免疫荧光试验检测PCV2在PK-15细胞中的增殖变化，检测PCV2感染PK-15细胞后PHB2mRNA的动态变化，和鉴定在PHB2基因或蛋白的抑制剂转染PK-15细胞中PCV2Cap蛋白表达。结果表明，PHB2在正常及PCV2感染的PK-15细胞中均有效表达。PCV2可显著影响PK-15细胞中PHB2转录，而且PHB2对PCV2病毒复制具有调节作用，下调PHB2的表达，即PHB2基因敲除或蛋白表达下调，能明显抑制PCV2的复制，对阐明PCV2致病机理和研究新的抗病毒药物具有重要意义。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明的PCV2在PK-15细胞中的增殖情况示意图；

图2是本发明的gC1qR和PHB2荧光定量PCR引物溶解曲线图；

图3是本发明的gC1qR和PHB2荧光定量PCR扩增曲线图；

图4是本发明的PCV2感染PK-15细胞后gC1qR基因mRNA水平的变化结果示意图；

图5是本发明的PCV2感染PK-15细胞后PHB2基因mRNA水平的变化结果示意图；

图6是本发明的siRNA转染PK-15细胞后PHB2基因mRNA水平的变化结果示意图；

图7是本发明的siRNA转染PK-15细胞后PCV2Cap蛋白Westernblot鉴定图；

图8是本发明的siRNA转染PK-15细胞后PCV2Cap蛋白的变化结果示意图；

图9是本发明的siRNA转染PK-15细胞后IFA检测结果图；

图10是本发明的shRNA设计示意图；

图11是本发明的shRNA转染PK-15细胞后PHB2基因mRNA水平的变化结果示意图；以及

图12是本发明的shRNA转染PK-15细胞后PCV2Cap蛋白的变化结果示意图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

本实施例中，一种PHB2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用。本发明的PHB2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用，通过间接免疫荧光试验检测PCV2在PK-15细胞中的增殖变化，检测PCV2感染PK-15细胞后PHB2mRNA的动态变化，和鉴定在PHB2基因或蛋白的抑制剂转染PK-15细胞中PCV2Cap蛋白表达。结果表明，PHB2在正常及PCV2感染的PK-15细胞中均有效表达。PCV2可显著影响PK-15细胞中PHB2转录，而且PHB2对PCV2病毒复制具有调节作用，下调PHB2的表达，即PHB2基因敲除或蛋白表达下调，能明显抑制PCV2的复制，对阐明PCV2致病机理和研究新的抗病毒药物具有重要意义。

基于GenBank库中猪PHB2基因序列(Gene ID：100627467)，设计并合成引物，引物F1(Forwardprimer)如SEQ ID NO：5所示，具体的：ctgccctccattgtcaacga，引物R1(Reverseprimer)如SEQ ID NO：6所示，具体的：cagctcccttcggatcaaca；并以TBP作为内参基因，依据TBP基因序列(Gene ID：110259740)，设计并合成引物，引物F2(Forwardprimer)如SEQ IDNO：7所示，具体的：gatggacgttcggtttagg，引物R2(Reverse primer)如SEQ ID NO：8所示，具体的：agcagcacagtacgagcaa；提取具有PCV2感染的PK-15细胞的cDNA，以cDNA为模板，进行PCR扩增，检测PHB2在PCV2感染的PK-15细胞中mRNA动态变化。在PCV2感染的作用下，PK-15细胞中PHB2mRNA转录水平升高，在感染后6h内，PHB2mRNA转录水平逐渐上升，且呈现时间相关性，在感染后6h时显著升高，是对照组的4.08倍(P<0.01)，且达到了最高水平。说明PCV2感染对细胞宿主因子PHB2mRNA转录的影响。经过前期的试验研究发现将PCV2病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)侵染猪肺泡巨噬细胞(3D4/2细胞系)，利用免疫共沉淀联合质谱方法发现，PHB2是PCV2VLPs候选细胞互作蛋白之一，提示该蛋白可能参与了PCV2细胞入侵和复制，因此进一步探究PHB2在PCV2感染细胞过程中发挥的作用。

本实施例中，抑制剂选择为能够抑制PHB2蛋白表达或基因转录的小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)或反义寡核苷酸；或能表达或形成siRNA、dsRNA、shRNA或反义寡核苷酸的构建物。

本实施例中，siRNA包括PHB2siRNA-1或PHB2siRNA-2。PHB2siRNA-1的靶序列如SEQID NO：1所示，或者，PHB2siRNA-2的靶序列如SEQ ID NO：2所示。将PHB2siRNA-1、PHB2siRNA-2的干扰片段转染PK-15细胞，并检测PHB2基因变化，PHB2siRNA-1和PHB2siRNA-2都可以抑制PHB2在PK-15细胞中mRNA的转录水平。优选地，siRNA选择PHB2siRNA-2，其敲除效率最高(71％)。将PCV2接种转染PHB2siRNA-1或PHB2siRNA-2后的PK-15细胞，并进行培养。检测结果显示，PCV2Cap蛋白水平均显著降低。说明PHB2基因敲除或蛋白表达下调，能明显抑制PCV2复制，指示PHB2siRNA-1和PHB2siRNA-2均能抑制PCV2复制。PHB2siRNA-1的靶序列具体为5′-ccaucacugagcugagcuu-3′。PHB2siRNA-2的靶序列具体为5′-ccaguacccuaucaucuau-3′。

本实施例中，shRNA的编码序列正义链如SEQ ID NO：3所示，反义链如SEQ ID NO：4所示。通过已选的靶点序列设计shRNA干扰序列，获得上述shRNA的编码序列正义链和反义链，并合成双链DNAoligo(简称ds oligo)，将ds oligo与线性化载体连接，转化大肠杆菌DH5α中获得菌液，提取质粒获得shRNA表达质粒。线性化载体采用pENTRTM/U6。shRNA的编码序列正义链具体为5'-caccg*ccagtaccctatcatctatcgaaatagatgatagggtactgg-3'，shRNA的编码序列反义链具体为5'-aaaaccagtaccctatcatctatttcgatagatgatagggtactggc*-3'。

根据本发明的另一方面，还提供了一种抑制猪圆环病毒2型的siRNA的靶序列，siRNA包括PHB2siRNA-1或PHB2siRNA-2；PHB2siRNA-1的靶序列如SEQ ID NO：1所示，或者，PHB2siRNA-2的靶序列如SEQ ID NO：2所示。

根据本发明的另一方面，还提供了一种抑制猪圆环病毒2型的shRNA分子，shRNA分子的编码序列正义链如SEQ ID NO：3所示，反义链如SEQ ID NO：4所示。

根据本发明的另一方面，还提供了一种含有上述抑制猪圆环病毒2型的shRNA分子的shRNA表达质粒。

根据本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物，包括上述siRNA的靶序列、shRNA分子、shRNA表达质粒中的一种，还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。在制备这些药物组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以以胶囊或药囊形式存在的载体中。用于预防或治疗由PCV2感染导致的疾病。

根据本发明的另一方面，还提供了一种用于抑制猪圆环病毒2型复制的试剂盒，包括siRNA的靶序列、shRNA分子、shRNA表达质粒中的一种。

实施例

病毒PCV2d毒株，GenBank登录号：KJ867555，其TCID50为1×10^5.66/mL，本实验室保存。

猪肾上皮细胞(PK-15)，本实验室保存。

兔源性抗PCV2Cap多克隆抗体，本实验室保存；异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的驴抗兔IgG抗体，购自Life Technologies公司；过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG抗体，购自KPL公司。

Trizol reagent和LipofectamineTM 2000转染试剂，购自Invitrogen公司。

M-MLV反转录酶及相关试剂盒，购自Promega公司。

EasyTaq DNA聚合酶，购自北京全式金生物公司。

qPCR

Green Master Mix，购自广州唯赞生物公司。

DMEM细胞培养基及小牛血清，购自Gibco公司。

其他相关试剂均为国产分析纯。

实验数据以平均数±标准差(mean±SD)表示，利用SPSS Statistics 22.0软件中的单因素方差分析(one-wayANOVA)法，对结果进行分析。0.01＜P＜0.05为差异显著，用*标示；P＜0.01为差异极显著，用**标示。

实施例1

1.1PCV2d感染PK-15细胞

将无PCV1/PCV2污染的PK-15细胞接种于6孔细胞培养板中，用含10％NBCS(新生牛血清)的DMEM培养基培养细胞，至细胞融合率为60％。用TCID50＝1×10^5.66/mL的PCV2d感染PK-15细胞后，分别于3、6、12、24和48h收集各孔细胞，作为实验组；不做任何处理的细胞标记为0h，作为对照组，每个时间点设置3个复孔。

1.2间接免疫荧光法检测PCV2在PK-15细胞中的增殖

利用上述方法将PCV2d感染PK-15细胞后，分别于0.5、1、12、24和36h用4％多聚甲醛固定细胞20min，再用含0.1％Triton X-100的PBS透化处理细胞10min，PBS洗3次后在含3％BSA(小牛血清白蛋白)的PBS中封闭1h。以兔源性抗PCV2Cap的多克隆抗体作为一抗室温孵育1h，FITC标记的驴抗兔IgG的抗体作为二抗室温避光孵育1h，于荧光倒置显微镜下观察，以上每两步骤间用PBS洗3次，每次5min。

1.3细胞RNA提取及其反转录

利用细胞RNA提取试剂盒(Trizol法)对上述收集的细胞进行总RNA提取。取2uLRNA样品，利用NanoDrop分光光度计测定RNA浓度及纯度(D260nm/280nm比值)。取1ug细胞总RNA，利用M-MLV First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录合成cDNA。

1.4PCV2感染PK-15细胞中PHB2mRNA水平的检测

基于GenBank库中猪PHB2基因序列(Gene ID：100627467)，设计并合成引物，引物F1(Forwardprimer)如SEQ ID NO：5所示，引物R1(Reverse primer)如SEQ ID NO：6所示；并以TBP作为内参基因，依据TBP基因序列(Gene ID：110259740)，设计并合成引物，引物F2(Forwardprimer)如SEQ ID NO：7所示，引物R2(Reverse primer)如SEQ ID NO：8所示；以cDNA为模板，利用AceQ qPCR

Green Master Mix试剂盒进行SYBR Green荧光定量PCR扩增，检测PHB2在PCV2感染的PK-15细胞中mRNA动态变化，反应条件为：95℃，5min；95℃，10s，60℃，30s，重复40个循环；最后为溶解曲线设置阶段，95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s。

对比例1

对比例1的步骤与实施例1的步骤相同，区别在于：基于GenBank库中猪gC1qR基因序列(Gene ID：110256103)，设计并合成引物，引物F3(Forward primer)如SEQ ID NO：9所示，具体的actcccaacttcgtggttgaag，引物R3(Reverse primer)如SEQ ID NO：10所示；具体的cctcgtcctcttgtccaatctc。

检测结果如下所示：

图1是本发明的PCV2在PK-15细胞中的增殖情况示意图。

图2是本发明的gC1qR和PHB2荧光定量PCR引物溶解曲线图。

图3是本发明的gC1qR和PHB2荧光定量PCR扩增曲线图。

图4是本发明的PCV2感染PK-15细胞后gC1qR基因mRNA水平的变化结果示意图。

图5是本发明的PCV2感染PK-15细胞后PHB2基因mRNA水平的变化结果示意图。

如图1所示，PCV2感染PK-15细胞后，随着时间的推移(0h～36h)，PK-15细胞中特异性的荧光信号(PCV2)数量不断增多，荧光强度不断增强，且大部分荧光信号由点状分布于细胞膜周边(0.5h～1h)，逐渐聚集在细胞质和细胞核(12h～24h)，最后到感染后36h时，PCV2阳性信号均聚集在细胞核。结果表明PCV2在1h内完成入侵，随后在PK-15细胞中不断增殖。

如图2和图3所示，通过荧光定量PCR对不同样品进行分析，gC1qR引物和PHB2引物的溶解曲线均峰值集中无杂带，显示出单一峰，同时扩增曲线清晰，平台期稳定，表明检测方法具有较好的准确性和敏感性。

如图4和图5所示，在PCV2感染的作用下，PK-15细胞中PHB2mRNA转录水平(除了24h外)均升高，在感染后6h内，PHB2mRNA转录水平逐渐上升，且呈现时间相关性，在感染后6h时显著升高，是对照组的4.08倍(P<0.01)，且达到了最高水平。而后随着时间的推移，PHB2mRNA表达呈下降趋势。而gC1qRmRNA转录水平在病毒感染6h时升高，是对照组的1.25倍，而随着时间(12h、24h和48h)转录水平下降，尽管在48h又再次升高，但仍低于对照组。因此，通过实施例1与对比例1的检测可知，并非所有蛋白在PCV2感染的作用下，PK-15细胞中的mRNA转录都会提高，本发明则是PCV2特异性的促进PHB2在PK-15细胞中PHB2mRNA转录水平。

实施例2

PK-15细胞长成单层后转染靶向PHB2基因的RNA干扰片段。干扰片段是PHB2siRNA-1，PHB2siRNA-1的靶序列如SEQ ID NO：1所示，转染PK-15细胞。qPCR用于检测PHB2基因的RNA干扰效率。转染24h后弃培养基，PBS洗涤3次后，用PCV2侵染细胞1h后弃培养基，PBS洗涤3次后，换新鲜培养基继续培养48h。裂解细胞计算蛋白浓度后，以β-actin作为内参，分别以抗β-actin(鼠源)和兔源性抗PCV2Cap的多克隆抗体作为一抗，以对应的HRP标记的抗鼠和抗兔抗体作为二抗，进行Western blot试验，检测PCV2Cap蛋白的变化。

实施例3

PK-15细胞长成单层后转染靶向PHB2基因的RNA干扰片段。干扰片段是PHB2siRNA-2，PHB2siRNA-2的靶序列如SEQ ID NO：2所示，转染PK-15细胞。qPCR用于检测PHB2基因的RNA干扰效率。转染24h后弃培养基，PBS洗涤3次后，用PCV2侵染细胞1h后弃培养基，PBS洗涤3次后，换新鲜培养基继续培养48h。裂解细胞计算蛋白浓度后，以β-actin作为内参，分别以抗β-actin(鼠源)和兔源性抗PCV2Cap的多克隆抗体作为一抗，以对应的HRP标记的抗鼠和抗兔抗体作为二抗，进行Western blot试验，检测PCV2Cap蛋白的变化。并采用IFA测试方法检测PCV2在PK-15细胞中的增殖，其操作方法与实施例1的1.2步骤相似。

对比例2

无关干扰片段siRNA-NC作为对照，siRNA-NC的靶序列如SEQ ID NO：11所示，具体的：5′-uucuccgaacgugucacgu-3′。其他步骤与实施例2相同。

检测结果如下所示：

图6是本发明的siRNA转染PK-15细胞后PHB2基因mRNA水平的变化结果示意图。

图7是本发明的Western blot鉴定图；泳道1：无关干扰片段siRNA-NC；泳道2：干扰片段PHB2siRNA-1；泳道3：干扰片段PHB2siRNA-2；Cap代表PCV2Cap蛋白，β-actin为内参蛋白。

图8是本发明的siRNA转染PK-15细胞后PCV2Cap蛋白的变化结果示意图。

图9是本发明的siRNA转染PK-15细胞后PCV2的IFA检测结果图；1：siRNA-NC；2：PHB2siRNA-2。

如图6所示，为了验证PHB2与PCV2复制间的关系，PHB2siRNA-1、PHB2siRNA-2及无关干扰片段siRNA-NC为对照转染PK-15细胞，qPCR检测PHB2基因变化，结果显示PHB2siRNA-1和PHB2siRNA-2都可以抑制PHB2在PK-15细胞中mRNA的转录水平。其中，PHB2siRNA-2的敲除效率最高(71％)，可以明显抑制PHB2在PK-15细胞中mRNA的转录水平(0.01<P<0.05)。

如图7、图8和图9所示，siRNA转染24h后，接种PCV2培养48h，Westernbot鉴定结果显示，PHB2siRNA-2干扰组中PCV2Cap蛋白水平显著低于对照组，约低于siRNA-NC的25％(0.01<p<0.05)。并且IFA结果表明，与对比例2的siRNA-NC相比，PHB2siRNA-2的使用能导致荧光信号(代表PCV2)减少，说明PHB2基因的沉默能抑制PCV2复制。

实施例4

4.1shRNA预处理

如图10所示，通过PHB2siRNA-2靶点序列设计shRNA序列，shRNA的编码序列正义链(简称Top Strand oligo)如SEQ ID NO：3所示，反义链(简称Bottom Strand oligo)如SEQID NO：4所示。shRNA由公司合成。其中，CACCG*与AAAA代表loop序列。

反应体系(20μL)如下：5μLtop strand oligo(200μM)，5μLbottom strand oligo(200μM)，2μL 10×Oligo Annealing Buffer(100mM Tris-HCl,10mM EDTA,1M NaCl pH8.0)，8μL DNase/RNase-free water。分别将20μL体系的PCR管于95℃4min，室温10min，获得ds oligo产物，用DNase/RNase-free water稀释产物(1μL)100倍，再分别取10μL 10×OligoAnnealing Buffer和89μLDNase/RNase-free water与1μL稀释后的产物混匀，获得稀释后的产物浓度(5nM)。

4.2shRNA表达质粒的构建

反应体系(20μL)：4μL 5×Ligation Buffer，2μLpENTRTM/U6，2μLds oligo(5nM)，2μL DNase/RNase-Free water，1μLT4DNALigase。反应体系室温放置6min。然后反应产物(2μL)加入大肠杆菌(DH5α)中，经过热激(42℃)1min、冰上放置6min后，加入300μL SOC培养基，然后37℃培养1h。取50μL转化菌液涂布在LB培养板中于37℃培养12h，再将单克隆菌落至LB培养基中培养12h。按质粒提取试剂盒的说明书提取质粒。

4.3shRNA表达质粒抑制PCV2

将shRNA表达质粒转染PK-15细胞，qPCR用于检测PHB2基因的RNA干扰效率。转染24h后弃培养基，PBS洗涤3次后，用PCV2侵染细胞1h后弃培养基，PBS洗涤3次后，换新鲜培养基继续培养至48h。Western blot检测PCV2Cap蛋白表达量的变化。

检测结果如下所示：

图10是本发明的shRNA设计示意图；

图11是本发明的shRNA转染PK-15细胞后PHB2基因mRNA水平的变化结果示意图，shRNA-NC代表对照组，即为空载体；

图12是本发明的shRNA转染PK-15细胞后PCV2Cap蛋白表达量变化的结果示意图，shRNA-NC代表对照组，即为空载体。

如图11所示，shRNA和空载体转染PK-15细胞，qPCR检测PHB2基因变化，结果显示shRNA可以明显抑制PHB2在PK-15细胞中mRNA的转录水平(0.01<P<0.05)。

如图12所示，shRNA和空载体转染24h后，接种PCV2培养48h，Western bot鉴定结果显示，shRNA干扰组中PCV2Cap蛋白水平显著低于对照组(0.01<P<0.05)。与相应的PHB2siRNA抑制PCV2复制的结果相似(如图9)，说明shRNA-2同样能抑制PCV2复制。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> PHB2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccaucacuga gcugagcuu 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccaguacccu aucaucuau 19

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caccgccagt accctatcat ctatcgaaat agatgatagg gtactgg 47

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaaccagta ccctatcatc tatttcgata gatgataggg tactggc 47

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgccctcca ttgtcaacga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagctccctt cggatcaaca 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gatggacgtt cggtttagg 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcagcacag tacgagcaa 19

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

actcccaact tcgtggttga ag 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cctcgtcctc ttgtccaatc tc 22

<210> 11

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

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Claims (9)

1.一种PHB2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂选择以能够抑制PHB2蛋白表达或基因转录的小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)或反义寡核苷酸；或能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA或反义寡核苷酸的构建物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，

所述siRNA包括PHB2 siRNA-1或PHB2 siRNA-2；

所述PHB2 siRNA-1的靶序列如SEQ ID NO：1所示，或者

所述PHB2 siRNA-2的靶序列如SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，

所述shRNA的编码序列正义链如SEQ ID NO：3所示，反义链如SEQ ID NO：4所示。

5.一种抑制猪圆环病毒2型的siRNA的靶序列，其特征在于，

所述siRNA包括PHB2 siRNA-1或PHB2 siRNA-2；

所述PHB2 siRNA-1的靶序列如SEQ ID NO：1所示，或者

所述PHB2 siRNA-2的靶序列如SEQ ID NO：2所示。

6.一种抑制猪圆环病毒2型的shRNA分子，其特征在于，

所述shRNA分子的编码序列正义链如SEQ ID NO：3所示，反义链如SEQ ID NO：4所示。

7.一种含有权利要求6所述的抑制猪圆环病毒2型的shRNA分子的shRNA表达质粒。

8.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求5所述的siRNA的靶序列、权利要求6所述的shRNA分子、权利要求7所述的shRNA表达质粒中的一种，还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。

9.一种用于抑制猪圆环病毒2型复制的试剂盒，其特征在于，包括权利要求5所述的siRNA的靶序列、权利要求6所述的shRNA分子、权利要求7所述的shRNA表达质粒中的一种。

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