WO2011080329A2 - Gene gpav de resistance aux nematodes chez les solanacees - Google Patents

Gene gpav de resistance aux nematodes chez les solanacees Download PDF

Info

Publication number
WO2011080329A2
WO2011080329A2 PCT/EP2010/070952 EP2010070952W WO2011080329A2 WO 2011080329 A2 WO2011080329 A2 WO 2011080329A2 EP 2010070952 W EP2010070952 W EP 2010070952W WO 2011080329 A2 WO2011080329 A2 WO 2011080329A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
polynucleotide
solanum
polypeptide
plant
Prior art date
Application number
PCT/EP2010/070952
Other languages
English (en)
Other versions
WO2011080329A3 (fr
Inventor
Bernard Caromel
Jawad Aarrouf
Laura Chauvin
Marie-Claire Kerlan
Véronique LEFEBVRE
Adrien Speck
Original Assignee
Institut National De La Recherche Agronomique
Universite D'avignon Et Des Pays De Vaucluse
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National De La Recherche Agronomique, Universite D'avignon Et Des Pays De Vaucluse filed Critical Institut National De La Recherche Agronomique
Priority to EP10801176A priority Critical patent/EP2519638A2/fr
Priority to CA2786207A priority patent/CA2786207A1/fr
Priority to US13/519,886 priority patent/US20120291157A1/en
Publication of WO2011080329A2 publication Critical patent/WO2011080329A2/fr
Publication of WO2011080329A3 publication Critical patent/WO2011080329A3/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the invention relates to the GpaV gene conferring resistance to nematodes in solanaceous plants.
  • the activation of plant defense mechanisms results from a cascade of events in which higher plants and pathogens exchange molecular signals.
  • the signals triggering the defense mechanisms are called elicitors.
  • the recognition by the host cell of an elicitor produced by the pathogen or the plant is the preliminary and necessary step for the activation of specific genes (recognition gene by gene), others are general (non specific recognition ).
  • specific genes recognition gene by gene
  • others are general (non specific recognition ).
  • the presence of resistance genes makes it possible to limit, delay or prevent the course of the infection cycle of the pathogen in the plant.
  • the plant reacts very early to the attempt to invade pathogens aimed essentially at preventing or stopping the colonization of the pathogen.
  • the cell wall is a very effective natural physical barrier to pests that synthesize enzymes and compounds that can degrade it. During infection with a pathogen this wall will be reinforced by deposits of phenolic compounds (lignins), esters such as suberin, polysaccharides such as callose and the accumulation of glycoproteins rich in hydroxyproline.
  • the biochemical responses are: (1) synthesis of phytoalexins (antibiotic compounds), (2) synthesis and accumulation of low molecular weight and proteinaceous phenolic compounds in cell walls, (3) synthesis of PR proteins (Pathogenesis- Related). These syntheses of compounds are made in response to the recognition of the pathogen to inhibit its growth and development (lactic enzymes, phytoalexins) but also to limit its spread in the plant.
  • defense mechanisms results from transcriptional activation of a large number of genes. These genes code for enzymes in the phenylpropanoids biosynthetic pathway or for defense proteins, some of which possess known hydrolytic activities (chitinase, glucanases, RNases, protease inhibitors). Molecular dissection of the promoters of defense genes helped to highlight areas cz 's-regulatory and trans-regulators elements.
  • the phenomenon of resistance may be due to the effect of resistance alleles of a single gene (monogenic resistance), or to the combined effect of the alleles of several genes (polygenic resistance).
  • the monogenic resistance results from a specific interaction between a host plant resistance gene and a pathogen avirulence gene. This interaction can be direct or indirect. However, monogenic resistances often have the disadvantage of being quickly bypassed by the parasite and are in this case unsustainable. Polygenic resistances are considered as durable resistances, but difficult to analyze and exploit.
  • the potato ⁇ Solarium tuberosum ssp. tuberosum belongs to the Solanaceae family. This family also includes other widely grown vegetable species such as tomato (Solarium lycopersicum), chilli (Capsicum sp.) And eggplant (Solarium melongena).
  • the potato crop is one of the largest in the world. This tuber is indeed produced in more than 130 countries. With production of more than 320 million tonnes in 2007, it is the world's third largest food crop, after wheat and rice (FAO data, 2007). In France, the quantity of potatoes produced is estimated at 4,440,000 tons in 2006, including 1 million tons for the processing industry and nearly 2 million tons for the French fresh market (FAO data, 2007).
  • Cyst nematodes are very small worms (less than 1 mm). Their cysts resulting from the transformation of the females after fertilization, are visible with the naked eye on the roots. Females are white when they appear on the root surface; those of G. pallida remain white whereas those of G. rostochiensis will go through a golden yellow phase. When females are fully developed they die; their skin hardens, turns brown, and turns into a protective covering: the cyst. This cyst may contain more than 1000 larvae; it is thus the essential element which ensures the conservation and the dispersion of the species. It is therefore its form of resistance.
  • the cyst contains juvenile larvae at their second stage of development J2, which is the infective form. J2 in the cyst are in diapause. The emergence of this latency state is stimulated by root exudates secreted by a potential host plant. Nematodes at stage J2 attach to the roots and then enter and develop to induce the formation of their feeder site: the syncytium. It is a giant cell multinucleate, dense cytoplasm, resulting from the fusion of several tens of adjacent cells.
  • This syncytium has an important function during the growth of juveniles which preferentially develop in females (more than 90%) under favorable conditions. In the opposite case (competition between the nematodes too important, poor physiological state of the attacked plant, presence of certain resistance genes), they develop preferentially in males or remain blocked at a larval stage.
  • the resistance of a plant to nematodes has been defined as the ability of the host plant to reduce or prevent the reproduction of the plant.
  • the genes involved in resistance to cyst nematodes previously described in Solanaceae are not opposed to the penetration or migration of juveniles in the root (Caramel et al, 2004).
  • Expression of resistance occurs after syncytium initiation, inducing necrosis of the surrounding cells, thus preventing its function as a transfer cell.
  • Nematodes are thus deprived of food, which frequently results in the inversion of the sex ratio (percentages of males and females) of the population, usually observed in susceptible plants. The greater the necrosis, the less the syncytium develops. And in case of really serious necrosis, the majority of nematodes remain blocked at a juvenile stage (Mugniéry et al, 2001, Caramel et al, 2005).
  • the combined ef and QtL GpaV sp i mapped on the V chromosome and QTL GpaXI sp mapped on the XI chromosome, allows a considerable reduction in the development of the cyst nematode.
  • the expression of these QTLs allows the plant to develop a necrosis of the root infected by the parasite, and thus prevents the development of syncytium: the nematodes can no longer feed properly and less than 1% between them can develop into female (Caromel et al, 2005).
  • the subject of the present invention is now the complete genomic sequence of a resistance allele of the Gpa V gene conferring high resistance to nematodes in complementation tests.
  • the invention relates to isolated polynucleotides selected from the following polynucleotides:
  • polynucleotide of SEQ ID No. 1 The polynucleotide of SEQ ID No. 1, the polynucleotide of SEQ ID No. 3, the polynucleotide of SEQ ID No. 5, the polynucleotide of SEQ ID No. 7, the polynucleotide of SEQ ID No. 9; and the polynucleotide of SEQ ID No. 11;
  • the subject of the invention is also an isolated polynucleotide conferring on Solanaceae plants resistance to Globodera nematodes, said isolated polynucleotide being chosen from:
  • the plants are chosen from plants of the species Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum and plants of the genus Capsicum.
  • the nematodes are selected from Globodera pallida, Globodera rostochiensis, Globodera tabacum ssp. tabacum, ssp. virginiae and ssp. solanacearum, and Globodera mexicana.
  • the invention also relates to expression cassettes comprising in the direction of transcription:
  • the functional promoter in a host organism is selected from CaMV 35 S, T-DNA promoters, promoters of genes encoding ubiquitins, promoters expressed specifically in roots and the promoter of position 1 at position 1657 of SEQ ID No. 1.
  • Another subject of the present invention is a vector comprising a polynucleotide according to the invention or an expression cassette according to the invention.
  • the present invention also relates to a host cell transformed with a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the invention.
  • the transformed host cell is chosen from plant cells and plant cell protoplasts.
  • the subject of the invention is also a host organism comprising at least one transformed cell according to the invention.
  • the invention also relates to a host organism transformed with a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the invention.
  • the host organism is a non-human host organism.
  • the transformed host organism is chosen from plants, seeds and plant tissues.
  • the invention also relates to a transformed plant expressing a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the invention.
  • the subject of the invention is also a plant expressing a polypeptide according to one of SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10 or 12.
  • the transformed plants belong to the Solanaceae family. More preferably, the transformed plants are chosen from plants of the species Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum and plants of the genus Capsicum.
  • the invention also relates to the plants chosen from the plants of the species Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum and plants of the genus Capsicum comprising or expressing a polynucleotide or a polypeptide according to the invention. 'invention.
  • the plant is chosen from cultured potatoes and comprises or expresses polynucleotide according to the invention or a polypeptide according to the invention.
  • the invention also relates to a method for conferring resistance to Globodera nematodes to a Solanaceae plant comprising the following steps:
  • the invention also relates to a method for rendering a plant of Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum, Solanum tuberosum L. subsp. andigena, or Solanum phureja with Globodera nematodes comprising the following steps:
  • the invention also relates to the use of primers or polynucleotide probes derived from SEQ ID No. 1 for the detection of Solanaceae plants resistant to nematodes.
  • SEQ ID No. 12 Protein Code by Hl cDNA
  • the invention relates to the GpaV nematode resistance gene, isolated from Solanum sparsipilum, a wild species of Solanaceae related to potato.
  • the invention relates to the polynucleotide sequence of this gene comprising the coding part of the gene as well as regulatory sequences located upstream and downstream of these coding sequences.
  • the invention also relates to expression cassettes comprising the coding part of this gene, vectors as well as the polypeptides encoded by the GpaV gene.
  • the GpaV gene gives Solanaceae plants high resistance to nematodes. With the GpaV resistance gene, it is now possible to confer resistance to nematodes to other plants belonging to the family Solanaceae including plants of vegetable species widely cultivated.
  • Globodera nematode resistance is meant the resistance of plants, particularly Solanaceae plants, to nematodes of the genus Globodera.
  • the tests that are commonly performed are tests on potted plants, inoculated either with cysts or with already hatched J2.
  • the number of neo cysts formed on the roots is counted and compared with the number of neoformed cysts on a sensitive control (for example, the Desiree variety susceptible to G. pallida and G. rostochiensis).
  • a sensitive control for example, the Desiree variety susceptible to G. pallida and G. rostochiensis.
  • the procedure for carrying out the stress test is described in the European Union Directive 2007/33 / EC.
  • the G. pallida resistance test measures the number of neo cysts formed on a potato plant after a complete cycle of the nematode. It is carried out on 4 plants (4 repetitions) of each genotype with cysts of the Chavornay population, which corresponds to a Pa3 pathotype in the classification of Kort et al. (1977).
  • the tubers are individually planted in a pot containing 400 grams of a mix of loam and loam, to which 10 cysts of G. pallida are added. This number of cysts is sufficient to obtain, after hatching, 5 to 10 nematode larvae per gram of soil. The plants are grown in the greenhouse.
  • a complete cycle of culture is carried out in order to allow the nematode time to grow and to be cystic. After four months of culture, the contents of each pot are washed and sieved to allow counting of neoformed cysts. The average number of nematodes found on each potato genotype is compared to the average number of nematodes found on the Desiree susceptible variety, susceptible to G. pallida, following the protocol of Council Directive 2007/33 / EC. of 11 June 2007, published in the Official Journal of the European Union of 16/06/2007.
  • Solanaceae for which less than 200 or less than 100 neo-formed cysts are obtained, preferably between 0 and 100 neo-formed cysts, more preferably between 0 and 80 neformed cysts after carrying out the test according to the above protocol. Typically, under the same conditions, more than 400 cysts are observed on the susceptible variety Désirée.
  • the present invention relates to resistance to nematodes of the genus Globodera which are well known pests of plants of the family Solanaceae.
  • the GpaV gene of Solanum sparsipilum confers resistance to Solanaceae and Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L. and Nicotiana tabacum nematodes, and to plants belonging to the genus Solodum sparsipilum. Capsicum.
  • the Gpa V gene confers resistance to nematodes to the potato (Solanum tuberosum L. and Solanum phureja) including the many cultivars exploited commercially.
  • Cultivated potatoes include both subspecies: Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum and Solanum tuberosum L. subsp. Andegenum as well as Solanum phureja.
  • the GpaV gene confers nematode resistance to cultured potatoes of the subspecies Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum.
  • SEQ ID No. 1 also comprises sequences upstream downstream of the coding sequence of the GpaV gene.
  • position 1 at position 1657 of SEQ ID No. 1 contains, in particular, the promoter of the GpaV gene with respect to nematode resistance.
  • the invention therefore also relates to the promoter of the gpaV nematode resistance gene and in particular to the polynucleotide having the sequence of position 1 at position 1657 of SEQ ID No. 1.
  • the coding sequence of the Gpa V gene corresponds to the following positions on SEQ ID No. 1: 1822-2330, 2526-3615, 4227-4532 and 6844-8322. This coding sequence is represented in SEQ ID No. 3.
  • resistance to nematodes is obtained by transformation of plants
  • Solanaceae with the polynucleotide of SEQ ID No. 1 or by introgression of a genomic fragment comprising the polynucleotide of SEQ ID No. 1 in Solanaceae plants.
  • the genomic fragment of Solanum sparsipilum comprising the polynucleotide of SEQ ID No. 1 introgressed in a plant of interest preferably has a size of less than 20, 50, 200, 250, 500 kb or IMbp.
  • the resistance to nematodes is obtained by transformation of Solanaceae plants and expression of the polynucleotide of SEQ ID No. 3 or expression of the polypeptide of SEQ ID No. 2 in Solanaceae.
  • the GpaV gene transcript is susceptible to alternative splicing and different messenger RNAs corresponding to the GpaV gene have been identified.
  • SEQ ID Nos. 5, 7, 9 and 11 represent preferred cDNAs (B6 cDNA, cDNA 8, cDNA 9 and cDNA H1) corresponding to different messenger RNAs.
  • the resistance to nematodes is obtained by transformation of Solanaceae plants and expression of the polynucleotide of SEQ ID No. 5, 7, 9 or 11 or by expression of the polypeptide of SEQ ID No. 6, 8, 10 or 12 in the Solanaceae.
  • the GpaV gene has exons at the following positions on SEQ ID No. 1: 1658-2330 (exon 1), 2526-3615 (exon 2), 4227-4532 (exon 3), 6844-8331 (exon 4) and 8465 -8811 (exon 5).
  • the invention also relates to the polynucleotides corresponding to these different cDNAs and the polypeptides encoded by these cDNAs.
  • the resistance to nematodes is obtained by transformation of Solanaceae plants and expression of a polynucleotide corresponding to one of the various cDNAs above or by expression of a polypeptide encoded by one of the cDNAs. -above.
  • the subject of the invention is an isolated polynucleotide chosen from the following polynucleotides: the polynucleotide of SEQ ID No. 1, the polynucleotide of SEQ ID No. 3, the polynucleotide of SEQ ID No. 5, the polynucleotide of SEQ ID No. 7, the polynucleotide of SEQ ID No. 9, and the polynucleotide of SEQ ID No. 11;
  • polypeptide of SEQ ID No. 2 the polypeptide of SEQ ID No. 4, the polypeptide of SEQ ID No. 6, the polypeptide of SEQ ID No. 8, the polypeptide of SEQ ID No. ID No. 10 or the polypeptide of SEQ ID No. 12.
  • the subject of the invention is also an isolated polynucleotide conferring on Solanaceae plants resistance to Globodera nematodes, said isolated polynucleotide being chosen from:
  • the polynucleotides of the present invention are isolated from a plant resistant to nematodes of the Solanum species, sparsipilum. These polynucleotides have a homology with one of the polynucleotides of SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 or 11, and typically correspond to other resistance alleles of the GpaV gene of Solanum sparsipilum.
  • the polynucleotides of the present invention conferring resistance to Globodera nematodes to Solanaceae plants are isolated from plants of the species Solanum vernei or Solanum spegazzinii. These polynucleotides isolated from Solanum vernei or Solanum spegazzinii typically encode orthologues of the GpaV gene of SEQ ID No. 1. These orthologous genes can be isolated from Solanum vernei or Solanum spegazzinii using polynucleotides derived from SEQ ID No. 1 as probes or primers.
  • the invention thus also relates to the orthologous genes or polynucleotides of the GpaV gene of Solanum sparsipilum in Solanum vernei or Solanum spegazzinii.
  • These genes or polynucleotides encoding a resistance allele preferably having at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% and preferably at least 99% identity along their entire length with one of the polynucleotides of SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 or 11.
  • the polynucleotides of the present invention confer resistance to Globodera nematodes to plants of the species Solanum tuberosum L. (spp tuberosum). and andigena), Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum and plants of the genus Capsicum.
  • the polypeptides of the present invention confer resistance to nematodes Globodera pallida and Globodera rostochiensis, Globodera tabacum ssp. tabacum, Globodera tabacum ssp. virginiae and Globodera tabacum ssp. solanacearum, and Globodera mexicana.
  • polynucleotide is understood to mean a single-stranded nucleotide chain or its complementary which may be of the DNA or RNA type, or a double-stranded nucleotide chain which may be of the complementary or genomic DNA type.
  • the polynucleotides of the invention are of the DNA type, in particular double-stranded DNA.
  • polynucleotide also refers to modified polynucleotides.
  • polynucleotides of the present invention are isolated or purified from their natural environment.
  • the polynucleotides of the present invention may be prepared by standard molecular biology techniques as described by Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989) or by chemical synthesis.
  • the invention relates to the polynucleotides of SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 and 11.
  • the invention also relates to polynucleotides having at least 75%, 80%>,
  • the invention relates to polynucleotides having at least 75%>, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% and preferably at least 99% full length identity with one of the polynucleotides. SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 or 11.
  • the invention also relates to polynucleotides having at least 75%>, 80%>, 85% o, 90%), 95%), 98% o and preferably at least 99%> homology with one of the polynucleotides. SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 or 11.
  • the invention also relates to polynucleotides having at least 75%>, 80%>, 85% o, 90%), 95%), 98%> and preferably at least 99%> homology along their entire length with respect to one of the polynucleotides of SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 or 11.
  • the invention also relates to fragments of at least 500bp, 1kb, 1.5kb, 2kb or 2.5kb of the polynucleotides of SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 or 11.
  • fragment of a polynucleotide refers to a polynucleotide comprising part but not all of the polynucleotide from which it is derived.
  • these polynucleotides confer resistance to nematodes Solanaceae plants when these polynucleotides are introduced and expressed in these plants.
  • nucleotides invariant or unchanged between two sequences may have a deletion, an addition or a substitution of at least one nucleotide relative to the reference polynucleotide.
  • homology is meant the measurement of the similarity between nucleic sequences. These polynucleotides may have a deletion, an addition or a substitution of at least one nucleotide relative to the reference polynucleotide. The percentage of homology between two sequences, quantified by a score, is based on the percentage of identities and / or conservative substitutions of the sequences.
  • polynucleotides having a degree of homology with a reference polynucleotide retain the function of the reference sequence.
  • the polynucleotides confer resistance to nematodes to plants of the family Solanaceae.
  • the applicable resistance tests are described above and in the examples.
  • the invention also relates to polynucleotides capable of hybridizing selectively with one of the polynucleotides of SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 or 11.
  • the selective hybridization is carried out under conditions of medium stringency and preferably under conditions of high stringency.
  • sequence capable of hybridizing selectively sequences which hybridize with the reference sequence at a level above the background noise significantly.
  • the level of the signal generated by the interaction between the sequence capable of hybridizing selectively and the reference sequences is generally 10 times, preferably 100 times more intense than that of the interaction of the other DNA sequences generating the background noise.
  • Stringent hybridization conditions allowing selective hybridization are well known to those skilled in the art. In general, the hybridization and washing temperature is at least 5 ° C below the Tm of the reference sequence at a given pH and for a given ionic strength.
  • the hybridization temperature is at least 30 ° C for a polynucleotide of 15 to 50 nucleotides and at least 60 ° C for a polynucleotide of more than 50 nucleotides.
  • the hybridization is carried out in the following buffer: 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 ⁇ g / ml sperm denatured salmon DNA.
  • the washes are, for example, carried out successively at low stringency in a 2 ⁇ SSC buffer, 0.1% SDS, medium stringency in a 0.5 ⁇ SSC buffer, 0.1% SDS and high stringency in a 0.1 ⁇ SSC buffer. , the OSDs%.
  • Hybridization can of course be carried out according to other usual methods well known to those skilled in the art (see in particular Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989).
  • polynucleotides hybridizing selectively to a reference polynucleotide retain the function of the reference sequence.
  • the invention relates generally to the polynucleotides encoding the polypeptides according to the invention. Due to the degeneracy of the genetic code, different polynucleotides can encode the same polypeptide.
  • the GpaV gene can be expressed in Solanaceae plants from its homologous regulatory sequences, in particular for overexpression in Solarium tuberosum L.
  • the GpaV gene can be expressed in a Solanaceae plant under the control of the promoter of SEQ ID No. 1. of the present invention or under the control of a heterologous promoter.
  • the polynucleotide of SEQ ID No. 1 encodes a polypeptide comprising TIR, NBS and LRR domains.
  • the polynucleotides of the present invention encode a polypeptide comprising at least one T1R domain.
  • the invention also relates to polypeptides whose expression in Solanaceae plants confers resistance to Globodera nematodes.
  • the subject of the invention is therefore the polypeptides of SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10 and 12.
  • the invention also relates to polypeptides having at least 80%>, 85%, 90%, 95%, 98% and preferably at least 99% of identical amino acids with one of the polypeptides of SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10 and 12.
  • identical amino acids amino acids that are invariant or unchanged between two sequences.
  • These polypeptides may have a deletion, addition or substitution of at least one amino acid with respect to the reference polypeptide
  • the subject of the invention is also polypeptides having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98% and preferably at least 99% of similarity with one of the polypeptides of SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10 and 12.
  • Similarity is the measurement of the resemblance between protein sequences. These polypeptides may have a deletion, addition or substitution of at least one amino acid relative to the reference polypeptide.
  • the degree of similarity between two sequences, quantified by a score, is based on the percentage of identities and / or conservative substitutions of the sequences.
  • polypeptides according to the invention are isolated or purified from their natural environment.
  • polypeptides of the present invention when expressed in a plant of the family Solanaceae confer resistance to nematodes and in particular to
  • the polypeptide of SEQ ID No. 2 comprises TIR, NBS and LRR domains.
  • the polypeptides of the present invention comprise at least the T1R domain.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide according to the invention is inserted into an expression cassette by using cloning techniques well known to those skilled in the art.
  • This expression cassette comprises the elements necessary for the transcription and translation of the sequences coding for the polypeptides according to the invention.
  • this expression cassette comprises both elements making it possible to produce a polypeptide by a host cell or a host organism and elements necessary for the regulation of this expression.
  • these expression cassettes comprise in the direction of transcription:
  • any type of promoter sequence may be used in the expression cassettes according to the invention.
  • the choice of the promoter will depend in particular on the host organism chosen for the expression of the GpaV gene.
  • the expression cassettes of the present invention are for the expression of the polynucleotides or polypeptides of the present invention in plants, seeds, plant tissues and plant cells and more particularly for expression in plants. Solanaceae. Some promoters allow constitutive expression whereas other promoters are inducible on the contrary.
  • promoters in plants are CaMV 35 S promoters, T-DNA promoters, promoters of genes encoding ubiquitins (Garbarinov et al., 1994, 1995), promoters expressed specifically in roots such as Tob, RB7 and SIREO (Opperman et al 1994, Jones et al., 2008). These promoters are described in the literature and well known to those skilled in the art.
  • the polynucleotides of the present invention are expressed in Solanaceae plants and in particular in plants of the species Solanum tuberosum L. under the control of a strong constitutive promoter such as the 35S promoter. In another embodiment of the invention, the polynucleotides of the present invention are expressed in Solanaceae plants and in particular in plants of the species Solanum tuberosum L. under the control of a root-specific promoter.
  • the polynucleotides of the present invention are expressed under the control of the promoter of SEQ ID No. 1 and in particular under the control of the polynucleotide or a fragment of the polynucleotide of position 1 at position 1657 of SEQ ID No. 1.
  • the expression cassettes according to the present invention may further include any other sequence necessary for the expression of the polypeptides or polynucleotides.
  • any regulatory sequence making it possible to increase the level of expression of the coding sequence inserted in the expression cassette.
  • terminator sequences can be used in the expression cassettes according to the invention, these sequences allow termination of the transcription and polyadenylation of the mRNA. Any functional terminator sequence in the selected host organism may be used.
  • expression cassettes comprising a terminator selected from the terminator sequence of SEQ ID No. 1 (8811-10046) or ubiquitin gene terminator sequences will be selected.
  • the expression cassettes according to the present invention are inserted into a vector.
  • the invention also relates to vectors comprising a polynucleotide according to the invention or an expression cassette according to the invention.
  • the present invention therefore also relates to replication or expression vectors for the transformation of a host organism comprising at least one polynucleotide or an expression cassette according to the present invention.
  • This vector may especially correspond to a plasmid, a cosmid, a bacteriophage, a virus or an artificial chromosome into which is inserted a polynucleotide or an expression cassette according to the invention.
  • the techniques for constructing these vectors and for inserting a polynucleotide of the invention into these vectors are well known to those skilled in the art.
  • any vector capable of maintaining, self-replicating, propagating or inserting itself into the genome of a host cell or a host organism in order to induce, in particular, the expression of a polynucleotide or a polypeptide can be used.
  • Those skilled in the art will choose the appropriate vectors according to the host organism to be transformed, and according to the transformation technique used.
  • the vectors of the present invention allow the expression of a polynucleotide or a polypeptide according to the invention in a plant of the family Solanaceae or in a plant cell, a seed or a plant tissue derived from a plant. Solanaceae plant.
  • the present invention also relates to a method for transforming a host cell or organism by integrating into said cell or said host organism at least one polynucleotide or an expression cassette or a vector according to the invention.
  • the polynucleotide can be integrated into the genome of the host cell / organism or replicate stably in the host cell / organism. Transformation methods of host cells / organisms are well known to those skilled in the art and widely described in the literature.
  • the subject of the invention is therefore also a host cell transformed with a polynucleotide according to the invention, an expression cassette according to the invention or with a vector according to the invention.
  • these transformed cells are plant cells or protoplasts of plant cells.
  • the present invention further relates to a host organism transformed with a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the invention.
  • host organism is meant in particular according to the invention any mono or multicellular organism, lower or higher.
  • host organism is meant a non-human organism.
  • the transformed host organism is a plant, a seed or a plant tissue.
  • the invention also relates to a plant transformed with a polynucleotide according to the invention, an expression cassette according to the invention or a vector according to the invention.
  • the transformed plant is a Solanaceae plant in which the GpaV gene is expressed or over-expressed in order to confer on this plant resistance to Globodera nematodes.
  • the transformed plant is chosen from plants of the species Solarium tuberosum L., Solarium phureja, Solarium lycopersicum L., Solarium melongena L., Nicotiana tabacum and plants of the genus Capsicum.
  • the transformed plant is a potato and more particularly a potato cultivar exploited commercially.
  • Solanaceous plants can be made resistant to nematodes by transformation with a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the invention.
  • the transformed plants are therefore typically transgenic plants having integrated in their genome a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the invention.
  • polynucleotide or a polypeptide according to the invention express polynucleotide or a polypeptide according to the invention.
  • the invention also relates to plants, and especially commercially grown Solanaceae plants in which the polynucleotides of the present invention, in particular the polynucleotide of SEQ ID No. 1, has been introduced by introgression.
  • the invention relates to plants selected from the species Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum and plants of the genus Capsicum comprising a polynucleotide according to the invention.
  • the invention also relates to plants selected from Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum and plants of the genus Capsicum comprising a polynucleotide of Solanum sparsipiulum consisting of a genomic fragment. of size less than 15, 20, 50, 200, 250, 500 kb or 1 Mbp comprising a resistance allele of the GpaV gene according to the invention, a polynucleotide according to the present invention or more preferably the polynucleotide of SEQ ID No. 1. .
  • the subject of the invention is a potato (Solanum tuberosum or Solanum phureja) comprising a Solanum sparsipiulum polynucleotide consisting of a genomic fragment of size less than 15, 20, 50, 200, 250, 500 kb or 1 Mbp comprising a resistance allele of the GpaV gene according to the invention, a polynucleotide according to the present invention or more preferably the polynucleotide of SEQ ID No. 1.
  • the invention relates to a potato (Solanum tuberosum or Solanum phureja) comprising a polynucleotide according to the invention and in particular a polynucleotide according to SEQ ID No. 1.
  • the subject of the invention is a potato (Solanum tuberosum L subsp. tuberosum) comprising a polynucleotide according to the invention and in particular a polynucleotide according to SEQ ID No. 1.
  • the GpaV gene of Solanum sparsipilum conferring nematode resistance has been identified. This gene can now be introduced into Solanaceae species of interest.
  • molecular markers specific for the GpaV gene of the present invention include primers or probes derived from SEQ ID No. 1. These molecular markers in the form of primers or probes can in particular be identified by aligning the polynucleotide of SEQ ID No. 1 coding for a resistance allele of the GpaV gene with the polynucleotides of SEQ ID Nos. 34-36 coding for susceptibility alleles of the GpaV nematode resistance gene.
  • the invention therefore also relates to selection markers derived from the polynucleotides of the present invention and to their use for marker-assisted selection of plants resistant to nematodes and in particular of plants of the family Solanaceae such as potatoes.
  • the primer pair of SEQ ID No. 32-33 is used for marker-assisted selection of nematode-resistant plants.
  • Another aspect of the invention is therefore the use of primers or polynucleotide probes derived from SEQ ID No. 1 for the detection of Solanaceae plants resistant to nematodes, for the detection of plants expressing a polynucleotide according to SEQ ID No. 1, 3, 5, 7, 9 or 11 or for the detection of plants comprising the GpaV nematode resistance gene of SEQ ID No. 1.
  • the invention thus also relates to methods for detecting Solanaceae plants resistant or nematode-sensitive using probes or primers derived from SEQ ID No. 1 of the present invention.
  • these probes or primers are fragments of at least 15 nucleotides of the polynucleotide of SEQ ID No. 1.
  • nematode-resistant Solanaceae plants are detected with the primer pair of the SEQs. ID No. 32-33.
  • This detection can be carried out according to methods well known to those skilled in the art such as PCR or hybridization.
  • the GpaV gene is inserted into the genome of the plant of interest by transformation or transgenesis.
  • Species of interest include plants selected from Solarium tuberosum L., Solarium phureja, Solarium lycopersicum L., Solarium melongena L., Nicotiana tabacum and plants of the genus Capsicum.
  • the subject of the invention is therefore a method for conferring resistance to Globodera nematodes to a Solanaceae plant comprising the following steps:
  • the selection of a nematode-resistant plant is by markers or primers derived from the polynucleotides of the present invention.
  • Transgenesis involves introducing into the genome of the host plant a DNA fragment coding for a gene involved in the expression of a trait of interest.
  • the most commonly used method is transformation via Agrobacterium tumefasciens.
  • the DNA fragment is recombined into a binary vector (see description of the vectors) which will be introduced into a strain of Agrobacterium tumefasciens by electroporation or by thermal shock.
  • This bacterial strain will be used to infect plant tissues or protoplasts, and the DNA fragment of interest will be integrated into the genome of certain cells. These cells will be grown on a regenerating medium to regenerate an entire plant.
  • the transformed plants will be selected either by culture on a medium supplemented with antibiotic or herbicide if an antibiotic or herbicide resistance gene has been transferred together with the gene of interest, or by molecular techniques (PCR with primers specific for the gene of interest) directly (de Vetten et al., 2003).
  • An alternative technique to transformation via Agrobacterium tumefasciens is the transformation by biolistics.
  • the DNA containing the gene of interest is deposited on metal balls (usually gold), and these metal balls are projected onto plant tissues using a particle gun. DNA enters the cells and in some cases integrates into the genome.
  • the selection of transformed plants is carried out in the same way as for the transformation via Agrobacterium tumefasciens.
  • the nematode resistance GpaV gene is inserted into the plant of interest by introgression.
  • the plant of interest is preferably a potato and the introgression comprises a cross of a plant species Solanum tuberosum L. ssp. tuberosum, Solanum tuberosum L. ssp. andigena, or Solanum phureja with a wild plant related to the potato, Solanum sparsipilum, resistant to nematodes.
  • These introgression techniques followed by backcrossing to obtain the return to the genetic background of the recipient (plant of interest) are well known to those skilled in the art.
  • the invention thus relates to a method for rendering a plant of the species Solanum tuberosum L. ssp. tuberosum, Solanum tuberosum L. ssp. andigena, or Solanum phureja with Globodera nematodes comprising the following steps:
  • the genomic fragment of Solanum sparsipilum comprising the polynucleotide of SEQ ID No. 1 introgressed in a plant of interest preferably has a size of less than 15, 20, 50, 200, 250, 500 kb, IMbp or 2Mbp.
  • Solanum sparsipilum is a diploid species while Solanum tuberosum is a tetraploid species. Introgression of a S. sparsipilum gene into the S. tuberosum genome therefore requires a change in ploidy level. By parthenogenesis in situ, or by culture of anthers or ovules, clones of diploid S. tuberosum can be obtained. These diploid clones are sexually compatible with S. sparsipilum. Conversely, one can go from the diploid level to the tetraploid level or by using the ability of certain wild or cultivated potato clones to produce diplogametes, or by causing polyploidization by in vitro culture or by treatment with chemical agents such as colchicine.
  • the introgression of a gene from a diploid wild species into the genome of a tetraploid cultivated species can therefore be done by a succession of pseudo-backcross (the clone of S. tuberosum is changed at each cross because the potato poorly supports inbreeding) either at the diploid level or at the tetraploid level.
  • pseudo-backcross the clone of S. tuberosum is changed at each cross because the potato poorly supports inbreeding
  • Each new generation is selected on the basis of markers (in this case, but we can also do phenotypic selection) individuals who have the gene of interest (or more precisely the allele of resistance to the gene in question). question). If the selection was made at the diploid level, it is necessary to return to the tetraploid level after 4 to 5 generations in order to obtain a plant of a good agronomic level.
  • Figure 1 Genotype and phenotype of individuals with a recombination event between markers MS063_2 and Z751_2R.
  • the QTL GPAV sp i was mapped by interspecific offspring (named 96D31 / 00D53) 239 diploid clones from the cross between two parental accessions spl329.18 and Caspar H3 (Caromel et al. 2005).
  • the G. pallida-resistant parent, spl329.18 is a diploid clone of S. sparsipilum accession PI310984, from the Sturgeon Bay (USA) collection.
  • the susceptible parent, Caspar H3 is a dihaploid clone obtained by parthenogenesis in situ at INRA Ploudaniel (France) from the tetraploid Caspar variety.
  • the 96D31.75 and 96D31.69 genotypes are part of the 96D31 offspring.
  • the 96D31.75 genotype has been the sensitivity of the QTL GPAV sp i and allele resistance QTL GpaXI sp i.
  • the 96D31.69 genotype has the QTL sensitivity allele GpaV sp i and the QTL sensitivity allele GpaXI sp i (Caromel et al., 2005).
  • Neoformed cysts were separated from the substrate by elutriation. They were counted separately for each pot. The raw data was transformed by a logarithmic function: log10 (number of cysts + 1). III. Development of new markers and genetic mapping of the gene underlying QTL GpaV sp i
  • ASC231, ASC240, Z751F 2R, ASC102 and MS092 markers were developed from the AC151803 and AC154033 BAC sequences.
  • the MS063 2 marker was developed from the CK864217 potato EST sequence. The sequences of the primers for amplifying these markers are indicated in the sequence listing.
  • the 107 clones exhibiting a recombination event between these two markers were then genotyped with the markers MS063 2 and Z751F 2R, which allowed us to identify 12 clones exhibiting a recombination event between these two markers.
  • the 12 clones exhibiting a recombination event between MS063 2 and Z751F 2R were phenotyped according to the protocol described above for QTL mapping, with four repeats per clone. Of the 12 clones tested, 5 were considered resistant, five as sensitive, and two were not considered ( Figure 1).
  • the 12 clones exhibiting a recombination event between MS063 2 and Z751F 2R were also genotyped with five markers defined according to the sequence of BAC clones of S. demissum (AC151803 and AC154033): the markers ASC231, ASC240, Z751, ASC 102 and MS092. Mapping of the resistance trait and these new markers allowed the gene underlying the QTL GpaV sp i to be located between the ASC231 and ASC240 markers (FIG. 1).
  • a recombination event separates the GpaV sp i locus from the ASC231 marker and two recombination events separate it from the ASC240 marker. There was no recombination event to separate the ASC 102 and MS092 markers from G. pallida resistance.
  • TIR domain Toll-interleukin 1 receptor homology region
  • NB-ARC domain nucleotide-binding adapter shared by APAF-1 resistance proteins, and CED-4
  • LRR leucine-rich repeat
  • the Z1505 6F / Z1505 R primer pair was defined from the sequences of S. demissum-overlapping BAC clones (AC151803 and AC154033) and S. lycopersicum (AC232763), to amplify the entire coding sequence by PCR. of the TIR-NB-ARC-LRR gene and about 2000 base pairs of 5 'and 3' flanking sequences.
  • the amplification was carried out in 50 ⁇ from 50 ng of genotype 05D2.12 DNA, derived from a sibling cross between two genotypes of the mapping progeny and homozygous at the GpaV sp i locus, using a Takara ExTaq HS unit (Lonza, Verviers, Belgium) according to the conditions described in the protocol provided by the supplier, with the following amplification program: an initial denaturation step at 94 ° C for 2 minutes, followed by 40 cycles comprising a denaturation step at 98 ° C for 10 seconds and a primer hybridization step and synthesis of the complementary strand at 68 ° C for 10 minutes, and followed by a final step of elongation at 72 ° C for 15 minutes. minutes.
  • the size and quantity of the PCR product obtained was estimated by migration of 2 ⁇ l of 0.8% agarose gel PCR product. Eight independent amplifications were performed. The PCR products were purified by precipitation with two volumes of absolute ethanol and 0.3 M sodium acetate of final concentration, washed twice with 600 ⁇ l of 70% ethanol and re-suspended in ultra-pure water. The purified PCR product was sent to sequence at Cogenics (Meylan, France). The resulting sequence served as a reference sequence for the subsequent amplification and cloning step.
  • the primer pair Z1505 8F / Z1505 4R was defined from the sequence of the fragment obtained by PCR with the Z1505 6F / Z1505 R primer pair on the DNA of the genotype 05D2.12. These primers were used to PCR amplify the entire TIR-NB-ARC-LRR gene with 1821 base pairs of upstream 5 'sequences (before ATG) and 1720 base pairs of downstream sequences after the STOP codon, from genotype spl329.18 genotype resistant to G. pallida. The amplification was carried out in 8 times 20 ⁇ using Herculase II Fusion Enzyme (Agilent Technologies, Massy, France) according to the supplier's instructions.
  • the following amplification program was used: an initial denaturation step at 94 ° C for 2 minutes, followed by 20 cycles including a denaturation step at 98 ° C for 10 seconds and a primer hybridization step and synthesis of the complementary strand at 68 ° C for 5 minutes, and followed by a final elongation step at 72 ° C for 15 minutes.
  • each amplification product was cloned separately into the binary vector pBIN19 (Bevan et al., 1984) digested with the SalI enzyme, using the In-Fusion 2.0 cloning kit.
  • Clontech Dry-Down PCR Cloning Kit (sold by Ozyme, Saint-Quentin-en-Yvelines, France) according to the supplier's instructions.
  • the product of each reaction was used to transform 50 ⁇ l of the NEB 10-beta Competent E. coli strain, then cultured according to the supplier's instructions (New England BioLabs, sold by Ozyme, Saint-Quentin-en-Yvelines, France). France).
  • Two of the eight sequenced clones had a sequence 100% identical to the reference sequence obtained from the PCR product.
  • the Gpa clone was used for subsequent functional validation steps.
  • the sequence of the cloned fragment corresponds to the "genomic sequence GpaV sp i" of SEQ ID No. 1.
  • the explants were transferred to petri dishes on a new potato medium rich in antibiotic selection (Kanamycin 300 mg / L), antibiotic to eliminate the bacterium (Timentin 225 mg / L) and regeneration promoting hormones (ANA 0.1 mg / L, GA3 0.1 mg / L, BAP 1 mg / L) and then placed in a culture chamber at 20 ° C.
  • the culture medium was renewed every 15 days.
  • the regenerated plants were isolated from the explants and then transferred for rooting into culture tubes containing "potato" medium supplemented with 225 mg / L of Timentin and 300 mg / L of Kanamycin.
  • the plants resulting from a transformation event and producing a root system on the medium supplemented with kanamycin, were indexed and multiplied in order to have a sufficient number of cuttings to carry out the G. pallida resistance tests.
  • G. pallida resistance of transgenic plants was evaluated by an in vitro test.
  • Six independent transformation events regenerated from the 96D31.75 genotype with the QTL GpaV sensitivity allele sp i and the QTL GpaXIs p i resistance allele were tested. These independent transformation events were named 96D31.75A, 96D31.75B, 96D31.75C, 96D31.75E, 96D31.75F, and 96D31.75G.
  • Genotype 96D31.75, transformed with the reporter gene GUS was used as a control (named 96D31.75 GUS).
  • Rooted cuttings were transferred to Petri dishes containing sucrose-free potato medium and in which Vitro Agar was replaced with Gelrite (Kalys, Saint Ismier, France) at 5 g / l.
  • the boxes were placed vertically in a phytotron set at a temperature of 17 ° C, hygrometry 70%, duration of the day 16 hours and night 8 hours, illumination intensity of 250 ⁇ . ⁇ . ⁇ 2 ⁇ "1 .
  • thirty roots were inoculated per transformation event and for the control (2 roots per cuttings and 15 cuttings per transformation event or control) Each root was inoculated with 5 juveniles of G.
  • inoculated roots were excised 4 weeks after inoculation, immersed for 5 min in a 1% calcium hypochlorite solution and stained for 15 seconds in a solution of Fuchsin Acid (0.1% in 30% of Acetic Acid) at 100 ° C. The nematodes are thus stained red The roots were then crushed between blade and coverslip , and nematodes at different stages of development were counted under a microscope (400 magnification). They were divided into two classes: female stage on the one hand, and other stages on the other hand (male stages, J2 and J3).
  • genotype 96D31.69 with alleles of sensitivity to both QTL GpaV sp i and GpaXI sp i, was transformed with the same bacterial strain (bacterial clone Gpa in the Agrobacterium tumefasciens strain C58 carrying the helper plasmid pGV2660). Three independent transformation events (09D803.5, 09D.817.36, and 09D.817.42) were tested for resistance to G. pallida. Genotype 96D31.69 transformed with the GFP reporter gene was used as a control. The resistance test was performed as described above. Two roots of 5 to 15 cuttings were inoculated for each independent transformation event.
  • Table 3 Percentage of nematodes developed in females, 28 days after inoculation, in the roots of plants from genotype 96D31.69, transformed with the TIR-NBS-LRR gene.
  • RNA derived from tissue fragments taken from the 05D2.12 genotype Tissue fragments were collected from inoculated and non inoculated G. pallida roots at 6 hours, 2 days and 4 days postinoculation, as well as on leaves, sprouts and stems.
  • RNAs from each sample were extracted with the Qiagen RNeasy Plant Mini Kit kit (Courtaboeuf, France), as specified by the supplier and assayed by the spectrophotometer. The RNAs of the different samples were mixed in equivalent proportions.
  • One microgram of total RNA was retro-transcribed with 200 units of SuperScript TM II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), according to the supplier's instructions.
  • RNAs transcribed from the TIR-NB-ARC-LRR gene were determined by 5 'and 3' RACE using the SMART RACE kit cDNA Amplification Kit (ClonTech, resold by OZYME).
  • a series of RT-PCR experiments was performed using the primers defined for the RACE experiments and primers defined on the 5 'and 3' ends of the cDNAs.
  • the cDNA fragments were amplified by PCR with one unit of ExTaq HS from Takara (Lonza, Verviers, Belgium) according to the conditions described in the protocol provided by the supplier, with the following amplification program: an initial denaturation step at 94 ° C for 2 minutes, followed by 40 cycles comprising a denaturation step at 98 ° C for 10 seconds, a primer hybridization step at 60 ° C for 20 seconds and a complementary strand synthesis step at 72 ° C for 3 minutes, and followed by a final step elongation at 72 ° C for 10 minutes.
  • the amplified products were cloned and / or purified and sent to sequence at Cogenics.
  • the GpaV sp i gene comprises 5 exons and 4 introns.
  • Exon 1 has the 5 'untranslated region (5'UTR) and the TIR domain
  • exon 2 has the NB-ARC domain
  • exon 3 has the beginning of the LRR domain
  • exon 4 has the end from the LRR domain to the stop codon and the beginning of the 3 'untranslated region (3' UTR)
  • exon 5 has the end of the 3'UTR region.
  • MRNAs corresponding to different mechanisms of alternative splicing were observed: retention of intron 1, intron 2 and / or intron 3, skip of exon 3, use of a cryptic acceptor site in exon 2 leading to a deletion the first 966 base pairs of exon 2.
  • the level of expression of the TIR-NB-ARC-LRR gene was determined under two conditions (I: Inoculated with the nematode and NI: Not Inoculated) and at three kinetic points (6h, 2 days and 4 days after the infection with the parasite) in different genotypes of the population from the cross between Caspar H3 and spl3219.18.
  • the genotypes were chosen according to their allelic combinations to both QTL GpaV sp i and GpaXI sp i (Caramel et al., 2005).
  • Genotype 96D31.139 has resistance alleles to both QTLs (R5R11), genotype 96D31.03 possesses the QTL resistance allele GpaV sp i and the QTL sensitivity GpaXI sp i (R5S11), and the 96D31.152 genotype has alleles of sensitivity to both QTL (S5S11).
  • RNAs were extracted from 5 mm root fragments around the inoculation point or the corresponding area for uninoculated plants, with the Qiagen RNeasy Plant Mini Kit kit (Courtaboeuf, France). For each sample, 1 g of RNA was retro-transcribed with 200 units of SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), according to the supplier's instructions. The reaction was then diluted 20-fold with ultrapure water.
  • the TIR-NB-ARC-LRR gene expression level was measured by Q-RT-PCR with the SYBR Premix Ex Taq kit (Takara) on an MX3005 (Stratagene) apparatus according to the supplier's instructions, using the primers.
  • Q63 and the following program an initial denaturation step at 95 ° C for 2 minutes followed by 40 cycles including a denaturation step at 95 ° C for 20 seconds, a primer hybridization step at 55 ° C for 20 seconds and a step of synthesis of the complementary strand at 72 ° C for 30 seconds.
  • the denaturation curve of the amplified product was calculated after the following three steps: 95 ° C for 1 minute, 55 ° C for 30 seconds and 95 ° C for 1 minute.
  • control target Ct of the target gene in the control sample (for example S S NI 6h).
  • - MEAN sample target Ct of the target gene in the unknown sample (for example SS I 6h).
  • the TIR-NB-ARC-LRR gene is much more expressed in an R5R11 genotype than in an S5S11 genotype, at 6h (31 times more) and at 4 days (14 times more). Likewise, this gene is 6 times more expressed in an R5R11 genotype than in an R5S1 genotype 1, 6h after inoculation with the nematode.
  • the TIR-NSB-LRR gene is also more expressed, whatever the kinetics, in an R5R11 genotype than in an S5S11 genotype: 6h after infection it is 16 times more expressed, 2 days later. it is 13 times more and after 4 days it is 234 times more.
  • the Z1505 8F / Z1505 5R primer pair was used to amplify the GpaV locus from two accessions of S. sparsipilum (spl329.18 and spl504.5) and two diploid accessions of S. tuberosum (Caspar H3 and Rosa hl).
  • the amplified products were cloned as previously described. At least three clones per allele were sequenced.
  • the resistance allele is identical and corresponds to the sequence SEQ ID No. 1.
  • the alleles of sensitivity from these two accessions are different and correspond to the sequences SEQ ID No. 34 and SEQ ID No. 35.
  • a single allele was cloned from S. tuberosum; this allele is identical in the two accessions sensitive to G. pallida, Caspar H3 and Rosa Hl. The sequence of this allele corresponds to the sequence SEQ ID No. 36.
  • Clones of S. sparsipilum spl329.18 and spl504.5 are heterozygous at the GpaV locus.
  • the resistance allele, GpaV sp i is identical in these two clones.
  • the sensitivity alleles of these two clones are different.
  • the susceptibility allele of S. tuberosum, isolated from Caspar H3 and Rosa H1 clones is different from all alleles isolated from S. sparsipilum.
  • the genomic sequences of the GpaV sp i resistance allele and the three sensitivity alleles were aligned with the Multalin software (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html).
  • the primers for amplifying this marker are as follows:
  • Digestion of the amplifiates with the restriction enzyme Mbol produced three fragments of 208, 229, and 622 base pairs for the GpaV sp i resistance allele, and only two fragments for the 3 susceptibility alleles (a 229 fragment). bp and a fragment of a size between 845 and 856 bp according to the sensitivity allele).
  • the visualization of the different fragments is carried out after electrophoresis of the digests digested with Mbol in a 2% agarose gel. This marker specifically distinguishes the GpaV sp i resistance allele from sensitivity alleles, whether they originate from S. tuberosum or S. sparsipilum. References
  • RI resistance gene cluster contains three groups of independently evolving, type I RI homologues and shows substantial structural variation among haplotypes of Solanum demissum. Plant Journal 44: 37-
  • Van der Voort, JNAM Van der Vossen, E., Bakker, E., Overmars, H., van Zandvoort, P., Hutten, R., Klein Lankhorst, R. and Bakker, J. 2000. Two additive QTLs conferring broad-spectrum resistance in potato to Globodera pallida are localized on resistance gene clusters. Theor. Appl. Broom. 101: 1122-1130.
  • the tomato resistance protein Bs4 is a predicted no -nuclear TIR- NB-LRR protein that mediates defense responses to severely truncated derivatives of AvrBs4 and overexpressed AvrBs3. Plant Journal 37: 46-60.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Gene GpaV conferant une résistance aux nématodes chez les plantes Solanacées en particulier chez Ia pomme de terre (Solarium tuberosum et Solarium phureja).

Description

Gène GpaV de résistance aux nématodes chez les solanacées
L'invention concerne le gène GpaV conférant une résistance aux nématodes chez les plantes solanacées.
On conçoit aujourd'hui que l'activation des mécanismes de défense de plantes résulte d'une cascade d'événements au cours desquels les plantes supérieurs et les agents pathogènes échangent des signaux moléculaires. Les signaux déclenchant les mécanismes de défense sont appelés des éliciteurs. La reconnaissance par la cellule hôte d'un éliciteur produit par l'agent pathogène ou par la plante constitue l'étape préalable et nécessaire à l'activation de gènes spécifiques (reconnaissance gène par gène), d'autres sont généraux (reconnaissance non spécifique). Selon le comportement de l'hôte, on distingue les résistances totales des résistances partielles et, selon le spectre d'action du gène de résistance, on distingue les résistances spécifiques (ou verticales) des résistances générales (ou horizontales). La présence de gènes de résistance permet de limiter, retarder ou empêcher le déroulement du cycle d'infection de l'agent pathogène dans la plante.
La plante réagit très tôt à la tentative d'invasion des agents pathogènes visant essentiellement à empêcher ou à stopper la colonisation du pathogène. La paroi cellulaire est une barrière physique naturelle très efficace face aux bioagresseurs qui synthétisent des enzymes et composés capables de la dégrader. Lors d'une infection par un agent pathogène cette paroi va être renforcée par des dépôts de composés phénoliques (lignines), d'esters tels que la subérine, de polysaccharides tel que la callose et par l'accumulation de glycoprotéines riches en hydroxyproline.
Les réponses biochimiques sont: (1) une synthèse de phytoalexines (composés antibiotiques), (2) une synthèse et une accumulation de composés phénoliques de faible poids moléculaires et protéiques dans les parois cellulaires, (3) une synthèse de protéines PR {Pathogenesis-Related). Ces synthèses de composés se font en réponse à la reconnaissance de l'agent pathogène pour inhiber sa croissance et son développement (enzymes litiques, phytoalexines) mais aussi pour limiter sa propagation dans la plante.
La mise en place des mécanismes de défense résulte d'une activation transcriptionelle d'un grand nombre de gènes. Ces gènes codent pour des enzymes de la voie de biosynthèse des phenylpropanoïdes ou pour des protéines de défense dont certaines possèdent des activités hydrolitiques connues (chitinase, glucanases, RNases, inhibiteurs de protéases). La dissection moléculaire des promoteurs des gènes de défense a permis de mettre en évidence des régions cz's-régulatrices ainsi que des éléments trans-regulateurs.
Le phénomène de résistance peut être dû à l'effet des allèles de résistance d'un seul gène (résistance monogénique), ou à l'effet combiné des allèles de plusieurs gènes (résistance polygénique). La résistance monogénique résulte d'une interaction spécifique entre un gène de résistance de la plante hôte et un gène d'avirulence du pathogène. Cette interaction peut être directe ou indirecte. Cependant, les résistances monogéniques présentent souvent l'inconvénient d'être rapidement contournées par le parasite et sont dans ce cas peu durable. Les résistances polygéniques sont considérées comme des résistances durables, mais difficiles à analyser et exploiter. Plusieurs loci gouvernent ce type de résistance : Il s'agit de QTL (Quantitative Trait Loci). A l'inverse des résistances monogénique, la résistance conférée par les QTL est souvent non spécifique d'un pathotype, et elle conduit à un ralentissement de développement de la maladie.
Le marquage moléculaire des régions génomiques impliquées dans les résistances est aujourd'hui possible grâce aux marqueurs moléculaires qui permettent d'établir une trame de génome (carte génétique). Sur cette trame, sont localisées les régions associées à la variation phénotypique du caractère. Ces régions sont couramment appelées QTL dans le cas d'une résistance quantitative ou polygénique. Ce marquage devrait permettre à terme, de sélectionner spécifiquement chaque QTL séparément sur la base de marqueurs moléculaires en fonction de son effet, de son origine et de son mode d'action.
La pomme de terre {Solarium tuberosum ssp. tuberosum) appartient à la famille de solanacées. Cette famille comprend également d'autres espèces légumières largement cultivées comme la tomate (Solarium lycopersicum), le piment (Capsicum sp.) et l'aubergine (Solarium melongena). La culture de la pomme de terre est l'une des plus importantes à travers le monde. Ce tubercule est en effet produit dans plus de 130 pays. Avec une production de plus de 320 millions de tonnes en 2007, c'est la troisième culture alimentaire mondiale, après le blé et le riz (Données FAO, 2007). En France, on estime la quantité de pomme de terre produite à 4 440 000 tonnes en 2006, dont 1 million de tonnes destinés aux industries de transformation et près de 2 millions de tonnes au marché du frais français (Données FAO, 2007).
Deux espèces de nématodes à kyste attaquent la pomme de terre: Globodera pallida et G. rostochiensis . Ces deux espèces sont inscrites sur la liste des parasites de quarantaine. Les pertes de production de pomme de terre dues aux nématodes sont estimées à 12,2 % de la production mondiale. Si les niveaux de populations de nématodes sont très élevés, 80 % de la récolte peut être perdue.
Les nématodes à kystes sont des vers de très petite taille (moins de 1 mm). Leurs kystes résultant de la transformation des femelles après fécondation, sont visibles à l'œil nu sur les racines. Les femelles sont blanches quand elles apparaissent à la surface racinaire; celles de G. pallida restent blanches alors que celles de G. rostochiensis vont passer par une phase jaune doré. Quand les femelles sont totalement développées elles meurent ; leur peau durcit, devient marron, et se transforme en une enveloppe protectrice : le kyste. Ce kyste peut renfermer plus de 1000 larves ; il est ainsi l'élément essentiel qui assure la conservation et la dispersion de l'espèce. Il s'agit donc de sa forme de résistance. Grâce à sa paroi riche en chitine, il est capable de supporter des conditions environnementales hostiles et peut, sous cette forme, se conserver plusieurs années dans le sol. Le kyste contient les larves juvéniles à leur deuxième stade de développement J2, qui est la forme infectante. Les J2 dans le kyste sont en diapause. La levée de cet état de latence est stimulée par les exsudais racinaires sécrétés par une plante hôte potentielle. Les nématodes au stade J2 se fixent sur les racines, puis pénètrent et se développent pour induire la formation de leur site nourricier: le syncytium. Il s'agit d'une cellule géante plurinucléée, à cytoplasme dense, résultant de la fusion de plusieurs dizaines de cellules adjacentes. Ce syncytium a une fonction importante lors de la croissance des juvéniles qui se développent préférentiellement en femelles (plus de 90 %) en conditions favorables. Dans le cas contraire (compétition entre les nématodes trop importante, mauvais état physiologique de la plante attaquée, présence de certains gènes de résistance), ils se développent préférentiellement en mâles ou restent bloqués à un stade larvaire.
La résistance d'une plante aux nématodes a été définie comme l'aptitude de la plante hôte à réduire ou à prévenir la reproduction de celui-ci. Dans le cas présent, les gènes impliqués dans la résistance aux nématodes à kyste décrits jusqu'alors chez les Solanacée ne s'opposent ni à la pénétration, ni à la migration des juvéniles dans la racine (Caramel et al, 2004). L'expression de la résistance se manifeste après l'initiation du syncytium, en induisant une nécrose des cellules environnantes, empêchant ainsi son fonctionnement comme cellule de transfert. Les nématodes sont alors privés de nourriture, ce qui se traduit fréquemment par l'inversion du sex-ratio (pourcentages de mâles et de femelles) de la population, habituellement observées chez les plantes sensibles. Plus la nécrose est importante, moins le syncytium se développe. Et en cas de nécrose vraiment sérieuse, la majorité des nématodes restent bloqués à un stade juvénile (Mugniéry et al, 2001 ; Caramel et al, 2005).
A l'exception du gène Gpa2 qui ne confère la résistance qu'à quelques populations de G. pallida (Rouppe Van der Voort et al, 1997), aucune résistance monogénique de haut niveau n'a été détecté chez la pomme de terre.
En revanche, la cartographie de QTL de résistance à G. pallida, à partir de sources de résistance naturelle appartenant à trois espèces sauvages apparentées à la pomme de terre, S. sparsipilum (Caramel et al, 2005), S. spegazzinii (Caramel et al, 2003; Kreike et al, 1994) et S. vernei (Bryan et al, 2002 ; Rouppe van der Voort et al, 1998, 2000), a montré que l'expression d'un QTL à effet fort, localisé en position co linéaire sur le chromosome V (locus GpaV) de ces trois espèces, ainsi que l'expression de QTL à effet faible, était indispensable pour l'obtention d'une résistance de haut niveau. Les derniers résultats de cartographie localisaient le ou les gènes de résistance Gpa V dans une région d'environ 5 cM sur le chromosome 5 de S. sparsipilum.
Chez S. sparsipilum, l'ef et combiné du QTL GpaVspi, cartographié sur le chromosome V et du QTL GpaXI sp cartographié sur le chromosome XI, permet une diminution considérable du développement du nématode à kyste. L'expression de ces QTL permet à la plante de développer une nécrose au niveau de la racine infectée par le parasite, et ainsi empêche le développement du syncytium: les nématodes ne peuvent alors plus se nourrir correctement et moins de 1 % entre eux peuvent se développer en femelle (Caromel et al, 2005).
La présente invention a maintenant pour objet la séquence génomique complète d'un allèle de résistance du gène Gpa V conférant une forte résistance aux nématodes dans des tests de complémentation.
RESUME DE L'INVENTION
L'invention se rapporte à des polynucléotides isolés choisis parmi les polynucléotides suivants :
· le polynucléotide de la SEQ ID No. l, le polynucléotide de la SEQ ID No. 3, le polynucléotide de la SEQ ID No. 5, le polynucléotide de la SEQ ID No. 7, le polynucléotide de la SEQ ID No. 9 et le polynucléotide de la SEQ ID No. 11;
• un polynucléotide codant pour le polypeptide de la SEQ ID No. 2, le polypeptide de la SEQ ID No. 4, le polypeptide de la SEQ ID No. 6, le polypeptide de la SEQ ID No. 8, le polypeptide de la SEQ ID No. 10 ou le polypeptide de la SEQ ID No. 12.
L'invention a aussi pour objet un polynucléotide isolé conférant aux plantes Solanacées une résistance aux nématodes Globodera, ledit polynucléotide isolé étant choisi parmi :
• un polynucléotide présentant au moins 80% d'homologie avec le polynucléotide de la SEQ ID No. l, le polynucléotide de la SEQ ID No. 3, le polynucléotide de la
SEQ ID No. 5, le polynucléotide de la SEQ ID 7, le polynucléotide de la SEQ ID No. 9 ou le polynucléotide de la SEQ ID No. 11;
• un fragment d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 1, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 3, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 5, d'un polynucléotide de la SEQ ID 7, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 9 ou d'un polynucléotide de la
SEQ ID No. 11. De préférence, les plantes sont choisies parmi les plantes des espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum.
De préférence, les nématodes sont choisis parmi Globodera pallida, Globodera rostochiensis, Globodera tabacum ssp. tabacum, ssp. virginiae et ssp. solanacearum, et Globodera mexicana.
L'invention a aussi pour objet des cassettes d'expression comprenant dans le sens de la transcription :
• un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte,
« un polynucléotide isolé selon l'invention;
• une séquence terminatrice fonctionnelle dans le même organisme hôte.
Avantageusement, le promoteur fonctionnel dans un organisme hôte est choisi parmi CaMV 35 S, les promoteurs T-DNA, les promoteurs de gènes codant pour des ubiquitines, des promoteurs exprimés spécifiquement dans les racines et le promoteur de la position 1 à la position 1657 de la SEQ ID No. 1.
Un autre objet de la présente invention est un vecteur comprenant un polynucléotide selon l'invention ou une cassette d'expression selon l'invention.
La présente invention se rapporte aussi à une cellule hôte transformée avec un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention.
Préférentiellement, la cellule hôte transformée est choisie parmi les cellules végétales et les protoplastes de cellules végétales.
L'invention a aussi pour objet un organisme hôte comprenant au moins une cellule transformée selon l'invention.
L'invention se rapporte aussi à un organisme hôte transformé avec un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention.
L'organisme hôte est un organisme hôte non humain.
Avantageusement, l'organisme hôte transformé est choisi parmi les plantes, les graines et les tissus végétaux.
L'invention se rapporte aussi à une plante transformée exprimant un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention.
L'invention a aussi pour objet une plante exprimant un polypeptide selon l'une des SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10 ou 12.
De préférence, les plantes transformées appartiennent à la famille des Solanacées. Plus préférentiellement, les plantes transformées sont choisies parmi les plantes des espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum. L'invention se rapporte aussi aux plantes choisies parmi les plantes des espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum comprenant ou exprimant un polynucléotide ou un polypeptide selon l'invention.
De préférence, la plante est choisie parmi les pommes de terre de culture et elle comprend ou exprime polynucléotide selon l'invention ou un polypeptide selon l'invention.
L'invention a aussi pour objet un procédé pour conférer une résistance aux nématodes Globodera à une plante Solanacée comprenant les étapes suivantes :
transformation de la plante avec un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention;
sélection d'une plante résistante aux nématodes Globodera.
L'invention se rapporte également à un procédé pour rendre résistante une plante de Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum, Solanum tuberosum L. subsp. andigena, ou Solanum phureja aux nématodes Globodera comprenant les étapes suivantes :
introgression d'un segment d'ADN génomique de Solanum sparsipilum comprenant un polynucléotide selon l'invention dans une plante de Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum, Solanum tuberosum L. subsp. andigena, ou
Solanum phureja ;
sélection d'une plante de Solanum tuberosum L. subsp. Tuberosum, Solanum tuberosum L. subsp. andigena, ou Solanum phureja résistante aux nématodes Globodera, avec des marqueurs moléculaires dérivés de la SEQ ID No 1.
L'invention se rapporte enfin à l'utilisation d'amorces ou de sondes polynucléotidiques dérivées de la SEQ ID No. 1 pour la détection de plantes Solanacées résistantes aux nématodes.
LISTAGE DES SEQUENCES
SEQ ID No. 1 Séquence génomique du gène Gpa V
SEQ ID No. 2 Protéine GpaV
SEQ ID No. 3 ADNc 1
SEQ ID No. 4 Protéine codée par l'ADNc 1
SEQ ID No. 5 ADNc B6
SEQ ID No. 6 Protéine codée par l'ADNc B6
SEQ ID No. 7 ADNc 8 SEQ ID No. 8 : Protéine codée par l'ADNc 8
SEQ ID No. 9 : ADNc 9
SEQ ID No. 10 Protéine codée par l'ADNc 9
SEQ ID No. 11 ADNc Hl
SEQ ID No. 12: Protéine code par l'ADNc Hl
SEQ ID No. 13 Amorce MS063 2F
SEQ ID No. 14 Amorce MS063 2R
SEQ ID No. 15 Amorce MS092 F
SEQ ID No. 16 Amorce MS092 R
SEQ ID No. 17 Amorce ASC102 F
SEQ ID No. 18 Amorce ASC102 R
SEQ ID No. 19 Amorce ASC231_F
SEQ ID No. 20 Amorce ASC231 R
SEQ ID No. 21 Amorce ASC240 F
SEQ ID No. 22 Amorce ASC240 R
SEQ ID No. 23 Amorce Z751 2F
SEQ ID No. 24 Amorce Z751 2R
SEQ ID No. 25: Amorce ZI 505 6F
SEQ ID No. 26 Amorce ZI 505 R
SEQ ID No. 27 Amorce ZI 505 8F
SEQ ID No. 28 Amorce ZI 505 4R
SEQ ID No. 29 Amorce Q63F
SEQ ID No. 30 Amorce Q63R
SEQ ID No. 31 Amorce ZI 505 5R
SEQ ID No. 32 Amorce Z3461 F
SEQ ID No. 33 Amorce Z3461 R
SEQ ID No. 34 Allèle sensible du clone spl329.18 de Solanum sparsipilum
SEQ ID No. 35 Allèle sensible du clone spl504.5 de Solanum sparsipilum
SEQ ID No. 36 Allèle sensible des clones Caspar H3 et Rosa Hl de Solanum
tuberosum
DESCRIPTION DE L'INVENTION
L'invention concerne le gène GpaV de résistance aux nématodes, isolé de Solanum sparsipilum une espèce sauvage de Solanacée apparentée à la pomme de terre. L'invention concerne la séquence polynucléotidique de ce gène comprenant la partie codante du gène ainsi que des séquences régulatrices situées en amont et en aval de ces séquences codantes. L'invention a aussi pour objet des cassettes d'expression comportant la partie codante de ce gène, des vecteurs ainsi que les polypeptides codés par le gène GpaV.
Le gène GpaV confère aux plantes Solanacées une résistance de haut niveau aux nématodes. Avec le gène de résistance GpaV, il est donc maintenant possible de conférer une résistance aux nématodes à d'autres plantes appartenant à la famille des Solanacées et notamment à des plantes d'espèces légumières largement cultivées.
Par « résistance aux nématodes Globodera », on entend la résistance de plantes, en particulier de plantes Solanacées, aux nématodes du genre Globodera. Les tests qui sont pratiqués couramment sont des tests sur plantes en pots, inoculées soit avec des kystes, soit avec des J2 déjà éclos. En fin de culture, on compte le nombre de kystes néo formés sur les racines et on le compare avec le nombre de kystes néoformés sur un témoin sensible (par exemple, la variété Désirée sensible à G. pallida et G. rostochiensis). La procédure pour réaliser le test de résistance est décrite dans la directive 2007/33/CE de l'union européenne.
Le test de résistance à G. pallida permet de mesurer le nombre de kystes néo formés sur une plante de pomme de terre après un cycle complet du nématode. Il est réalisé sur 4 plantes (4 répétitions) de chaque génotype avec des kystes de la population Chavornay, qui correspond à un pathotype Pa3 dans la classification de Kort et al. (1977). Les tubercules sont plantés individuellement dans un pot contenant 400 grammes d'un mélange de terreau et de terre franche, auxquels sont ajoutés 10 kystes de G. pallida. Ce nombre de kystes est suffisant pour obtenir, après éclosion, 5 à 10 larves de nématode par gramme de sol. Les plantes sont mises en culture en serre. Un cycle complet de culture est effectué afin de laisser le temps aux nématodes de se développer et de s'enkyster. Au bout de quatre mois de culture, le contenu de chaque pot est lavé et tamisé afin de permettre le comptage des kystes néoformés. La moyenne des nombres de nématodes retrouvés sur chaque génotype de pomme de terre est comparée à la moyenne des nombres de nématodes retrouvés sur la variété témoin Désirée, sensible à G. pallida, en suivant le protocole de la directive 2007/33/CE du conseil du 11 juin 2007, publiée au journal officiel de l'Union européenne du 16/06/2007.
Par « résistance aux nématodes Globodera », on entend donc la résistance de plantes
Solanacées, pour lesquelles on obtient moins de 200 ou moins de 100 kystes néo formés, de préférence entre 0 et 100 kystes néo formés, plus préférentiellement entre 0 et 80 kystes néoformés après réalisation du test selon le protocole ci-dessus. Typiquement, dans les mêmes conditions il est observé plus de 400 kystes sur la variété sensible Désirée.
La présente invention concerne la résistance aux nématodes du genre Globodera qui sont des ravageurs bien connus des plantes de la famille des Solanacées. On citera en particulier Globodera pallida et Globodera rostochiensis qui infestent la pomme de terre, la tomate et l'aubergine, ainsi que Globodera mexicana qui infecte la tomate et des Solanum apparentées à la pomme de terre et Globodera tabacum (incluant les sous-espèces Globodera tabacum tabacum, Globodera tabacum virginiae et Globodera tabacum solanacearum) qui infecte principalement le tabac mais aussi le piment et certaines espèces apparentées à la pomme de terre.
Le gène GpaV de Solanum sparsipilum confère une résistance aux nématodes Globodera aux plantes Solanacées et en particulier aux plantes des espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L. et Nicotiana tabacum ainsi qu'aux plantes appartenant au genre Capsicum.
Avantageusement, le gène Gpa V confère une résistance aux nématodes à la pomme de terre (Solanum tuberosum L. et Solanum phureja) dont notamment les nombreux cultivars exploités commercialement. Les pommes de terre cultivées comprennent les deux sous-espèces : Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum et Solanum tuberosum L. subsp. Andegenum ainsi que Solanum phureja. Dans un mode de réalisation préféré, le gène GpaV confère une résistance aux nématodes aux pommes de terre cultivées de la sous- espèce Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum.
Polynucléotides
L'invention concerne donc la séquence polynucléotidique du gène GpaV représenté à la SEQ ID No. 1. La SEQ ID No. l comporte également des séquences en amont en en aval de la séquence du codante du gène GpaV. En particulier, la position 1 à la position 1657 de la SEQ ID No. 1 contiennent notamment le promoteur du gène GpaV ào, résistance aux nématodes.
L'invention se rapporte donc également au promoteur du gène GpaV de résistance aux nématodes et en particulier au polynucléotide ayant la séquence de la position 1 à la position 1657 de la SEQ ID No.l .
La séquence codante du gène Gpa V correspond aux positions suivantes sur la SEQ ID No. 1 : 1822-2330, 2526-3615, 4227-4532 et 6844-8322. Cette séquence codante est représentée à la SEQ ID No. 3.
De préférence, la résistance aux nématodes est obtenu par transformation de plantes
Solanacées avec le polynucléotide de la SEQ ID No.l ou par introgression d'un fragment génomique comprenant le polynucléotide de la SEQ ID No. 1 dans les plantes Solanacées.
Au final, le fragment génomique de Solanum sparsipilum comprenant le polynucléotide de la SEQ ID No. 1 introgressé dans une plante d'intérêt a de préférence une taille inférieure à 20, 50, 200, 250, 500 kb ou IMbp. Dans un autre mode de réalisation, la résistance aux nématodes est obtenue par transformation de plantes Solanacées et expression du polynucléotide de la SEQ ID No.3 ou par expression du polypeptide de la SEQ ID No. 2 dans les Solanacées.
Le transcrit du gène GpaV est susceptible d'épissage alternatif et différents ARN messagers correspondant au gène GpaV ont été identifiés. Les SEQ ID No. 5, 7, 9 et 11 représentent des ADNc préférés (ADNc B6, ADNc 8, ADNc 9 et ADNc Hl) correspondant à différents ARN messagers.
Dans un autre mode de réalisation, la résistance aux nématodes est obtenue par transformation de plantes Solanacées et expression du polynucléotide de la SEQ ID No.5, 7, 9 ou 11 ou par expression du polypeptide de la SEQ ID No. 6, 8, 10 ou 12 dans les Solanacées.
Le gène GpaV comporte des exons aux positions suivantes sur la SEQ ID No.l : 1658-2330 (exon 1), 2526-3615 (exon 2), 4227-4532 (exon 3), 6844-8331 (exon 4) et 8465-8811 (exon 5).
Différentes possibilités de séquences codantes résultant de différents types d'épissage alternatif ont été identifiées. Ces séquences ont été construites à partir des séquences obtenues par RACE et RT-PCR. Les régions 5' et 3' UTR n'ont pas été représentées : les séquences débutent à l'ATG (exon 1) et se terminent au premier codon stop rencontré (en fonction du décalage de cadre de lecture dû à l'épissage alternatif, le codon stop peut être dans un exon ou un intron). Ces ADNc additionnels correspondent aux positions suivantes sur les exons/introns de la SEQ ID No. 1 : cDNA_2 (El : 1-509, E2 : 510-1599, E4 : 1600-3081), cDNA_3 (El : 1-509, E3 : 510-519), cDNA_4 (El : 1- 509, E4 : 510-549), cDNA_5 (El : 1-509, ÔE2 : 510-633, E3 : 634-939, E4 : 940-2421), cDNA_6 (El : 1-509, ÔE2 : 510-633, E4 : 634-2115), cDNA_7 (El : 1-509, Il : 510-528), cDNA_8 (El : 1-509, E2 : 510-1599, 12 : 1600-1638), cDNA_9 (El : 1-509, E2 : 510-1599, E3 : 1600-1905, 13 : 1906-1992), cDNA lO (El : 1-509, ÔE2 : 510-633, 12 : 634-672) et cDNA l l (El : 1-509, ÔE2 : 510-633, E3 : 634-939, 13 : 940-1026).
L'invention se rapporte aussi aux polynucléotides correspondants à ces différents ADNc et aux polypeptides codés par ces ADNc.
Dans un autre mode de réalisation, la résistance aux nématodes est obtenue par transformation de plantes Solanacées et expression d'un polynucléotide correspondant à l'un des différents ADNc ci-dessus ou par expression d'un polypeptide codé par l'un des ADNc ci-dessus.
L'invention a pour objet un polynucléotide isolé choisi parmi les polynucléotides suivants : le polynucléotide de la SEQ ID No.l, le polynucléotide de la SEQ ID No. 3, le polynucléotide de la SEQ ID No. 5, le polynucléotide de la SEQ ID No. 7, le polynucléotide de la SEQ ID No. 9 et le polynucléotide de la SEQ ID No. 11 ;
- un polynucléotide codant pour le polypeptide de la SEQ ID No. 2, le polypeptide de la SEQ ID No. 4, le polypeptide de la SEQ ID No. 6, le polypeptide de la SEQ ID No. 8, le polypeptide de la SEQ ID No. 10 ou le polypeptide de la SEQ ID No.12.
L'invention a également pour objet un polynucléotide isolé conférant aux plantes Solanacées une résistance aux nématodes Globodera, ledit polynucléotide isolé étant choisi parmi :
- un polynucléotide présentant au moins 80% d'homologie avec le polynucléotide de la SEQ ID No. l, le polynucléotide de la SEQ ID No. 3, le polynucléotide de la SEQ ID No. 5, le polynucléotide de la SEQ ID 7, le polynucléotide de la SEQ ID No. 9 ou le polynucléotide de la SEQ ID No. 11 ;
- un fragment d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 1, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 3, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 5, d'un polynucléotide de la SEQ ID
7, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 9 ou d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 11.
De préférence, les polynucléotides de la présente invention sont isolés d'une plante résistante aux nématodes de l'espèce Solanum, sparsipilum. Ces polynucléotides présentent une homologie avec l'un des polynucléotides des SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 ou 11, et correspondent typiquement à d'autres allèles de résistance du gène GpaV de Solanum sparsipilum.
Dans d'autres modes de réalisation, les polynucléotides de la présente invention conférant une résistance aux nématodes Globodera aux plantes Solanacées sont isolés de plantes des espèces Solanum vernei ou Solanum spegazzinii. Ces polynucléotides isolés de Solanum vernei ou Solanum spegazzinii codent typiquement pour des orthologues du gène GpaV de la SEQ ID No. l . Ces gènes orthologues peuvent être isolés de Solanum vernei ou Solanum spegazzinii en utilisant des polynucléotides dérivés de la SEQ ID No. l comme sondes ou comme amorces.
L'invention se rapporte donc également aux gènes ou polynucléotides orthologues du gène GpaV de Solanum sparsipilum chez Solanum vernei ou Solanum spegazzinii. Ces gènes ou polynucléotides codant pour un allèle de résistance présentant préférentiellement au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 99% d'identité sur toute leur longueur avec l'un des polynucléotides des SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 ou 11.
De préférence, les polynucléotides de la présente invention confèrent une résistance aux nématodes Globodera aux plantes des espèces Solanum tuberosum L. (ssp. tuberosum et andigena), Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum.
Préférentiellement, les polypeptides de la présente invention confèrent une résistance aux nématodes Globodera pallida et Globodera rostochiensis, Globodera tabacum ssp. tabacum, Globodera tabacum ssp. virginiae et Globodera tabacum ssp. solanacearum, et Globodera mexicana.
Selon la présente invention, on entend par "polynucléotide " une chaîne nucléotidique simple brin ou son complémentaire pouvant être de type ADN ou ARN, ou une chaîne nucléotidique double brin pouvant être de type ADN complémentaire ou génomique. De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment dADN double brin. Le terme "polynucléotide" désigne également les polynucléotides modifiés.
Les polynucléotides de la présente invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel. De préférence, les polynucléotides de la présente invention peuvent être préparés par les techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook et al. (Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989) ou par synthèse chimique.
Dans un premier mode de réalisation, l'invention se rapporte aux polynucléotides des SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 et 11.
L'invention concerne aussi des polynucléotides présentant au moins 75%, 80%>,
85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 99% d'identité avec l'un des polynucléotides des SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 ou 11.
De préférence, l'invention concerne des polynucléotides présentant au moins 75%>, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 99% d'identité sur toute leur longueur avec l'un des polynucléotides des SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 ou 11.
L'invention concerne aussi des polynucléotides présentant au moins 75%>, 80%>, 85%o, 90%), 95%), 98%o et de préférence au moins 99%> d'homologie avec l'un des polynucléotides des SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 ou 11.
L'invention concerne aussi des polynucléotides présentant au moins 75%>, 80%>, 85%o, 90%), 95%), 98%> et de préférence au moins 99%> d'homologie sur toute leur longueur avec l'un des polynucléotides des SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 ou 11.
L'invention se rapporte aussi à des fragments d'au moins 500bp, lkb, 1.5kb, 2kb ou 2.5kb des polynucléotides des SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 ou 11.
Le terme "fragment" d'un polynucléotide désigne un polynucléotide comprenant une partie mais pas la totalité du polynucléotide dont il est dérivé. De préférence, ces polynucléotides confèrent une résistance aux nématodes aux plantes Solanacées lorsque ces polynucléotides sont introduits et exprimés dans ces plantes.
Par nucléotides identiques, on entend des nucléotides invariants ou inchangés entre deux séquences. Ces polynucléotides peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un nucléotide par rapport au polynucléotide de référence.
Par homologie, on entend la mesure de la ressemblance entre séquences nucléiques. Ces polynucléotides peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un nucléotide par rapport au polynucléotide de référence. Le pourcentage d'homologie entre deux séquences, quantifié par un score, est basé sur le pourcentage d'identités et/ou de substitutions conservatrices des séquences.
Les méthodes de mesure et d'identification du degré d'identité et du degré d'homologie entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple le programme Lalign (http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html) en utilisant la méthode d'alignement "global" et les paramètres par défaut, à l'exception de la matrice de score "DNA" qui sera choisie pour les séquences nucléotidiques. Ce programme permet de calculer le degré d'identité sur la totalité de la séquence. La suite de programmes BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) permet d'identifier rapidement les gènes présentant une forte homologie avec tout ou partie de la séquence testée (QUERY). Le programme donne le pourcentage d'identité pour les portions de séquences homologues (alignement local).
Préférentiellement, les polynucléotides présentant un degré d'homologie avec un polynucléotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence. Dans le cas présent, les polynucléotides confèrent une résistance aux nématodes aux plantes de la famille des Solanacées. Les tests de résistance applicables sont notamment décrit ci-dessus et dans les exemples.
L'invention concerne aussi des polynucléotides capables de s'hybrider de manière sélective avec l'un des polynucléotides des SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 ou 11.
De préférence, l'hybridation sélective est effectuée dans des conditions de moyenne stringence et préférentiellement dans des conditions de forte stringence.
Par " séquence capable de s'hybrider de manière sélective ", on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec la séquence de référence à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et les séquences de référence est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont bien connues de l'homme du métier. En général la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5°C au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Typiquement la température d'hybridation est d'au moins 30°C pour un polynucléotide de 15 à 50 nucléotides et d'au moins 60°C pour un polynucléotide de plus de 50 nucléotides. A titre d'exemple, l'hybridation est réalisée dans le tampon suivant: 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 ug/ml sperme de saumon dénaturé DNA. Les lavages sont par exemple réalisés successivement à faible stringence dans un tampon 2X SSC, 0,1 % SDS, à moyenne stringence dans un tampon 0,5X SSC, 01%> SDS et à forte stringence dans un tampon 0,1X SSC, 0,l%oSDS. L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon d'autres méthodes usuelles bien connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989).
De préférence, les polynucléotides s'hybridant de manière sélective à un polynucléotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence.
L'invention se rapporte de manière générale aux polynucléotides codant pour les polypeptides selon l'invention. En raison de la dégénérescence du code génétique, différents polynucléotides peuvent coder pour un même polypeptide.
Le gène GpaV peut être exprimé dans les plantes Solanacées à partir de ses séquences régulatrices homologues notamment pour une surexpression dans Solarium tuberosum L. Ainsi, le gène GpaV peut être exprimé dans une plante Solanacée sous le contrôle du promoteur de la SEQ ID No. 1 de la présente invention ou sous le contrôle d'un promoteur hétérologue.
La transformation et l'expression des polynucléotides selon l'invention dans des plantes de la famille des Solanacées confèrent à ces dernières une résistance aux nématodes et en particulier à Globodera tel que décrit ci-dessus.
Le polynucléotide de la SEQ ID No. 1 code pour un polypeptide comprenant des domaines TIR, NBS et LRR. De préférence, les polynucléotides de la présente invention codent pour un polypeptide comprenant au moins un domaine TIR.
Polypeptides
L'invention se rapporte aussi à des polypeptides dont l'expression dans des plantes Solanacées confère une résistance aux nématodes Globodera.
L'invention a ainsi pour objet les polypeptides des SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10 et 12. L'invention a aussi pour objet des polypeptides présentant au moins 80%>, 85%, 90%, 95%, 98% et préférentiellement au moins 99% d'acides aminés identiques avec l'un des polypeptides des SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10 et 12.
Par acides aminés identiques, on entend des acides aminés invariants ou inchangés entre deux séquences. Ces polypeptides peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un acide aminé par rapport au polypeptide de référence
L'invention a également pour objet des polypeptides présentant au moins 80%, 85%), 90%), 95%o, 98%o et préférentiellement au moins 99% de similarité avec l'un des polypeptides des SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10 et 12.
Par similarité, on entend la mesure de la ressemblance entre séquences protéiques. Ces polypeptides peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un acide aminé par rapport au polypeptide de référence. Le degré de similarité entre deux séquences, quantifié par un score, est basé sur le pourcentage d'identités et/ou de substitutions conservatrices des séquences.
Les méthodes de mesure et d'identification du degré d'identité et du degré de similarité entre polypeptides sont connues de l'homme du métier. Pour calculer le degré d'identité sur l'ensemble de la séquence (alignement global), on peut employer par exemple le programme Lalign (http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html) en utilisant la méthode d'alignement "global" et les paramètres par défaut. Le programme BlastP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) permet d'identifier rapidement les gènes présentant une forte homologie avec tout ou partie de la séquence testée (QUERY). Le programme donne les pourcentages d'identité et de similarité pour les portions de séquences homologues (alignement local).
Les polypeptides selon l'invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel.
Les polypeptides de la présente invention lorsqu'ils sont exprimés dans une plante de la famille des Solanacées confèrent une résistance aux nématodes et en particulier à
Globodera tel que décrit ci-dessus.
Le polypeptide de la SEQ ID No. 2 comprend des domaines TIR, NBS et LRR. De préférence les polypeptides de la présente invention comprennent au moins le domaine TIR.
Cassettes d'expression
Selon un mode de réalisation de l'invention, un polynucléotide codant pour un polypeptide selon l'invention est inséré dans une cassette d'expression en utilisant des techniques de clonage bien connues de l'homme du métier. Cette cassette d'expression comprend les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction des séquences codant pour les polypeptides selon l'invention. Avantageusement, cette cassette d'expression comprend à la fois des éléments permettant de faire produire un polypeptide par une cellule hôte ou un organisme hôte et des éléments nécessaires à la régulation de cette expression.
Typiquement, ces cassettes d'expression comprennent dans le sens de la transcription:
un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte;
un polynucléotide selon l'invention;
- une séquence terminatrice fonctionnelle dans le même organisme hôte.
Tout type de séquence promotrice peut être utilisée dans les cassettes d'expression selon l'invention. Le choix du promoteur dépendra notamment de l'organisme hôte choisi pour l'expression du gène GpaV. De préférence, les cassettes d'expression de la présente invention sont pour l'expression des polynucléotides ou des polypeptides de la présente invention dans les plantes, les graines, les tissus végétaux et les cellules végétales et plus particulièrement pour l'expression dans les plantes Solanacées. Certains promoteurs permettent une expression constitutive alors que d'autres promoteurs sont au contraire inductibles. Parmi les promoteurs fonctionnels dans les plantes on citera les promoteurs CaMV 35 S, les promoteurs T-DNA, les promoteurs de gènes codant pour des ubiquitines (Garbarinov et al.1994, 1995), des promoteurs exprimés spécifiquement dans les racines tels que Tob, RB7 et SIREO (Opperman et al. 1994, Jones et al. 2008). Ces promoteurs sont décrits dans la littérature et bien connus de l'homme du métier.
Dans un mode de réalisation, les polynucléotides de la présente invention sont exprimés dans les plantes Solanacées et en particulier dans les plantes de l'espèce Solanum tuberosum L. sous le contrôle d'un promoteur fort constitutif tel que le promoteur 35S. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les polynucléotides de la présente invention sont exprimés dans les plantes Solanacées et en particulier dans les plantes de l'espèce Solanum tuberosum L. sous le contrôle d'un promoteur spécifique des racines.
Dans un mode de réalisation préféré, les polynucléotides de la présente invention sont exprimés sous le contrôle du promoteur de la SEQ ID No. 1 et en particulier sous le contrôle du polynucléotide ou d'un fragment du polynucléotide de la position 1 à la position 1657 de la SEQ ID No. 1.
Les cassettes d'expression, selon la présente invention, peuvent en outre inclure toute autre séquence nécessaire à l'expression des polypeptides ou des polynucléotides. On peut notamment utiliser toute séquence de régulation permettant d'augmenter le niveau d'expression de la séquence codante insérée dans la cassette d'expression. Selon l'invention, on peut notamment utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer").
Une grande variété de séquences terminatrices sont utilisables dans les cassettes d'expression selon l'invention, ces séquences permettent la terminaison de la transcription et la polyadénylation de l'ARNm. Toute séquence terminatrice fonctionnelle dans l'organisme hôte sélectionné peut être utilisée.
Pour l'expression dans les plantes Solanacées, on choisira par exemple des cassettes d'expression comprenant un terminateur choisi parmi la séquence terminatrice de la SEQ ID No. 1 (8811-10046) ou des séquences terminatrices de gènes d'ubiquitine.
Avantageusement, les cassettes d'expression selon la présente invention sont insérées dans un vecteur.
Vecteurs
L'invention se rapporte aussi à des vecteurs comprenant un polynucléotide selon l'invention ou une cassette d'expression selon l'invention.
La présente invention concerne donc également des vecteurs de réplication ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte comprenant au moins un polynucléotide ou une cassette d'expression selon la présente invention. Ce vecteur peut notamment correspondre à un plasmide, un cosmide, un bactériophage, un virus ou un chromosome artificiel dans lequel est inséré un polynucléotide ou une cassette d'expression selon l'invention. Les techniques de construction de ces vecteurs et d'insertion d'un polynucléotide de l'invention dans ces vecteurs sont bien connues de l'homme du métier.
De manière générale, tout vecteur capable de se maintenir, de s'autorépliquer, de se propager ou de s'insérer dans le génome d'une cellule hôte ou d'un organisme hôte afin d'induire notamment l'expression d'un polynucléotide ou d'un polypeptide peut être utilisé. L'homme du métier choisira les vecteurs appropriés en fonction de l'organisme hôte à transformer, et en fonction de la technique de transformation mise en œuvre.
De préférence, les vecteurs de la présente invention permettent l'expression d'un polynucléotide ou d'un polypeptide selon l'invention dans une plante de la famille des Solanacées ou dans une cellule végétale, une graine ou un tissu végétal issu d'une plante Solanacée.
Parmi les vecteurs habituellement utilisés pour la transformation de la pomme de terre on citera notamment pBIN19 et dérivés (Bevan et al. 1984), la série des pCAMBIA et dérivés, la série des pPZP (Hajdukiewicz et al. 1994) et dérivés, en particulier les vecteurs GATEWAY compatibles, par exemple p*GW (Karimi et al. 2002), la série des pGWB (Nakagawa et al. 2009) ou encore les vecteurs décrits dans les reviews Hellens et al. 2000 et Karimi et al. 2007. Cellules et organismes hôtes
La présente invention a également pour objet, un procédé de transformation d'une cellule ou d'un organisme hôte par intégration dans ladite cellule ou dans ledit organisme hôte d'au moins un polynucléotide ou d'une cassette d'expression ou d'un vecteur selon l'invention. Le polynucléotide peut être intégré dans le génome de la cellule/de l'organisme hôte ou se répliquer de manière stable dans la cellule/l'organisme hôte. Les méthodes de transformation des cellules/organismes hôtes sont bien connues de l'homme du métier et largement décrites dans la littérature.
L'invention a donc également pour objet une cellule hôte transformée avec un polynucléotide selon l'invention, une cassette d'expression selon l'invention ou avec un vecteur selon l'invention. De préférence, ces cellules transformées sont des cellules végétales ou des protoplastes de cellules végétales.
La présente invention concerne en outre un organisme hôte transformé avec un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. Par organisme hôte, on entend en particulier selon l'invention tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur. Par organisme hôte on entend un organisme non humain. De préférence, l'organisme hôte transformé est une plante, une graine ou un tissu végétal.
Ainsi l'invention se rapporte aussi à une plante transformée avec un polynucléotide selon l'invention, une cassette d'expression selon l'invention ou un vecteur selon l'invention.
De préférence, la plante transformée est une plante Solanacée dans laquelle on exprime ou l'on sur-exprime le gène GpaV afin de conférer à cette plante une résistance aux nématodes Globodera.
Avantageusement, la plante transformée est choisie parmi les plantes des espèces Solarium tuberosum L., Solarium phureja, Solarium lycopersicum L., Solarium melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum.
Plus préférentiellement, la plante transformée est une pomme de terre et plus particulièrement un cultivar de pomme de terre exploité commercialement.
Les plantes Solanacées peuvent être rendues résistantes aux nématodes par transformation avec un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. Les plantes transformées sont donc typiquement des plantes transgéniques ayant intégré dans leur génome un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention.
Ces cellules, organismes hôtes et plantes transformées expriment polynucléotide ou un polypeptide selon l'invention. Cependant, l'invention concerne aussi des plantes, et particulièrement des plantes Solanacées cultivées commercialement dans lesquelles les polynucléotides de la présente invention notamment le polynucléotide de la SEQ ID No. 1 a été introduit par introgression.
Ainsi, l'invention se rapporte à des plantes choisies parmi les espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum comprenant un polynucléotide selon l'invention.
L'invention se rapporte également à des plantes choisies parmi les espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum comprenant un polynucléotide de Solanum sparsipiulum consistant en un fragment génomique de taille inférieure à 15, 20, 50, 200, 250, 500 kb ou 1 Mbp comprenant un allèle de résistance du gène GpaV selon l'invention, un polynucléotide selon la présente invention ou plus préférentiellement le polynucléotide de la SEQ ID No.1.
Préférentiellement, l'invention a pour objet une pomme de terre {Solanum tuberosum ou Solanum phureja) comprenant un polynucléotide de Solanum sparsipiulum consistant en un fragment génomique de taille inférieure à 15, 20, 50, 200, 250, 500 kb ou 1 Mbp comprenant un allèle de résistance du gène GpaV selon l'invention, un polynucléotide selon la présente invention ou plus préférentiellement le polynucléotide de la SEQ ID No.l .
Préférentiellement, l'invention a pour objet une pomme de terre {Solanum tuberosum ou Solanum phureja) comprenant un polynucléotide selon l'invention et en particulier un polynucléotide selon la SEQ ID No. 1.
Plus préférentiellement, l'invention a pour objet une pomme de terre {Solanum tuberosum L subsp. tuberosum) comprenant un polynucléotide selon l'invention et en particulier un polynucléotide selon la SEQ ID No. 1.
Procédés pour conférer une résistance aux nématodes aux plantes Solanacées
Le gène GpaV de Solanum sparsipilum conférant une résistance aux nématodes a été identifié. Ce gène peut maintenant être introduit dans des espèces de Solanacées d'intérêt.
Pour l'introduction du gène Gpa V dans les plantes Solanacées, il est essentiel de disposer de marqueurs moléculaires spécifiques du gène GpaV la présente invention. Ces marqueurs moléculaires sont notamment des amorces ou des sondes dérivées de la SEQ ID No. l . Ces marqueurs moléculaires sous forme d'amorces ou de sondes peuvent notamment être identifiés en alignant le polynucléotide de la SEQ ID No. 1 codant pour un allèle de résistance du gène GpaV avec les polynucléotides des SEQ ID Nos. 34-36 codant pour des allèles de sensibilité du gène GpaV de résistance aux nématodes.
L'invention se rapporte donc aussi à des marqueurs de sélection dérivés des polynucléotides de la présente invention et à leur utilisation pour la sélection assistée par marqueurs de plantes résistantes aux nématodes et notamment de plantes de la famille des Solanacées telles que les pommes de terre. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le couple d'amorces des SEQ ID No. 32-33 est utilisé pour la sélection assistée par marqueurs de plantes résistantes aux nématodes.
Un autre aspect de l'invention est donc l'utilisation d'amorces ou de sondes polynucléotidiques dérivées de la SEQ ID No. 1 pour la détection de plantes Solanacées résistantes aux nématodes, pour la détection de plantes exprimant un polynucléotide selon la SEQ ID No. 1, 3, 5, 7, 9 ou 11 ou pour la détection de plantes comprenant le gène de résistance aux nématodes GpaV la SEQ ID No. 1.
L'invention se rapport donc également à des procédés pour détecter des plantes Solanacées résistantes ou sensibles aux nématodes mettant en œuvre des sondes ou des amorces dérivées de la SEQ ID No. 1 de la présente invention. De préférence, ces sondes ou ces amorces sont des fragments d'au moins 15 nucléotides du polynucléotide de la SEQ ID No. 1. Dans un mode de réalisation préféré, les plantes Solanacées résistantes aux nématodes sont détectées avec le couple d'amorces des SEQ ID No. 32-33.
Cette détection peut s'effectuer selon des méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la PCR ou l'hybridation.
De préférence, le gène GpaV est inséré dans le génome de la plante d'intérêt par transformation ou transgénèse. Les espèces d'intérêt sont notamment les plantes choisies parmi les espèces Solarium tuberosum L., Solarium phureja, Solarium lycopersicum L., Solarium melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum.
L'invention a donc pour objet un procédé pour conférer une résistance aux nématodes Globodera à une plante Solanacée comprenant les étapes suivantes :
transformation de la plante avec un polynucléotide selon l'invention, une cassette d'expression selon l'invention ou un vecteur selon l'invention ;
- sélection d'une plante résistante aux nématodes Globodera.
De préférence, la sélection d'une plante résistante aux nématodes s'effectue à l'aide de marqueurs ou d'amorces dérivés des polynucléotides de la présente invention.
La transgenèse consiste à introduire dans le génome de la plante hôte un fragment d'ADN codant pour un gène impliqué dans l'expression d'un caractère d'intérêt. La méthode la plus couramment utilisée est la transformation via Agrobacterium tumefasciens. Le fragment d'ADN est recombiné dans un vecteur binaire (voir la description des vecteurs) qui sera introduit dans une souche d'Agrobacterium tumefasciens par électroporation ou par choc thermique. Cette souche bactérienne sera utilisée pour infecter des tissus végétaux ou des protoplastes, et le fragment d'ADN d'intérêt sera intégré dans le génome de certaines cellules. Ces cellules seront cultivées sur un milieu favorisant la régénération, afin de régénérer une plante entière. Les plantes transformées seront sélectionnées soit par culture sur un milieu additionné d'antibiotique ou d'herbicide si un gène de résistance à l'antibiotique ou à l'herbicide a été transféré conjointement au gène d'intérêt, soit par des techniques moléculaires (PCR avec des amorces spécifiques du gène d'intérêt) directement (de Vetten et al. 2003). Une technique alternative à la transformation via Agrobacterium tumefasciens, est la transformation par biolistique. L'ADN contenant le gène d'intérêt est déposé sur des billes de métal (en général de l'or), et ces billes de métal sont projetées sur des tissus végétaux grâce à un canon à particule. L'ADN pénètre dans les cellules et dans certains cas s'intégre dans le génome. La sélection des plantes transformée s'effectue de la même façon que pour la transformation via Agrobacterium tumefasciens.
Dans un autre mode de réalisation préféré, le gène GpaV de résistance aux nématodes est inséré dans la plante d'intérêt par introgression. Dans ce cas, la plante d'intérêt est de préférence une pomme de terre et l'introgression comporte un croisement d'une plante des espèces Solanum tuberosum L. ssp. tuberosum, Solanum tuberosum L. ssp. andigena, ou Solanum phureja avec une plante sauvage apparentée à la pomme de terre, Solanum sparsipilum, résistante aux nématodes. Ces techniques d'introgression suivies de rétrocroisements pour obtenir le retour au fond génétique du receveur (plante d'intérêt) sont bien connues de l'homme du métier.
Ces procédés d'introgression sont rendus possibles par l'identification du gène GpaV et de sa séquence polynucléotidique. Les polynucléotides de la présente invention, des marqueurs ou des amorces dérivables de ces polynucléotides sont notamment utilisables dans la sélection assistée par marqueurs.
L'invention se rapporte ainsi à un procédé pour rendre résistante une plante des espèces Solanum tuberosum L. ssp. tuberosum, Solanum tuberosum L. ssp. andigena, ou Solanum phureja aux nématodes Globodera comprenant les étapes suivantes :
- introgression d'un segment d'ADN génomique de Solanum sparsipilum comprenant un polynucleotide selon l'invention dans une plante de Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum ;
sélection, avec des marqueurs moléculaires dérivés de la SEQ ID No. 1, d'une plante des espèces Solanum tuberosum L. ssp. tuberosum, Solanum tuberosum L. ssp. andigena, ou Solanum phureja résistante aux nématodes Globodera. Au final, le fragment génomique de Solanum sparsipilum comprenant le polynucléotide de la SEQ ID No. 1 introgressé dans une plante d'intérêt a de préférence une taille inférieure à 15, 20, 50, 200, 250, 500 kb, IMbp ou 2Mbp.
Solanum sparsipilum est une espèce diploïde alors que Solanum tuberosum est une espèce tétraploïde. L'introgression d'un gène de S. sparsipilum dans le génome de S. tuberosum nécessite donc un changement de niveau de ploïdie. On peut, par parthénogenèse in situ, ou par culture d'anthères ou d'ovules, obtenir des clones de S. tuberosum diploïdes. Ces clones diploïdes sont sexuellement compatibles avec S. sparsipilum. Inversement, on peut passer du niveau diploïde au niveau tétraploïde soit en utilisant l'aptitude de certains clones de pomme de terre sauvages ou cultivés à produire des diplogamètes, soit en provocant la polyploïdisation par culture in vitro ou par traitement avec des agents chimiques comme la colchicine. L'introgression d'un gène d'une espèce sauvage diploïde dans le génome d'une espèce cultivée tétraploïde peut donc se faire par une succession de pseudo-backcross (on change de clone de S. tuberosum à chaque croisement car la pomme de terre supporte mal la consanguinité) soit au niveau diploïde soit au niveau tétraploïde. A chaque nouvelle génération on sélectionne sur la base des marqueurs (dans le cas qui nous intéresse, mais on peut aussi faire de la sélection phénotypique) les individus qui possèdent le gène d'intérêt (ou plus exactement l'allèle de résistance au gène en question). Si la sélection a été faite au niveau diploïde, il faut repasser au niveau tétraploïde au bout de 4 à 5 générations afin d'obtenir une plante d'un bon niveau agronomique. Si un clone diploïde de S. sparsipilum a été doublé dès le départ, il n'y a pas de changement de ploïdie ultérieur, mais il est plus difficile de se débarrasser d'allèles défavorables (ayant une influence sur la teneur en glycoalcaloïdes, la qualité agronomique et gustative) apportés par le génome du parent sauvage.
FIGURES
Figure 1 : Génotype et phénotype des individus présentant un événement de recombinaison entre les marqueurs MS063_2 et Z751_2R. EXEMPLES
I. Matériel végétal :
Le QTL GpaVspi a été cartographié grâce à une descendance interspécifique (nommée 96D31/00D53) de 239 clones diploïdes issue du croisement entre les deux accessions parentales spl329.18 et Caspar H3 (Caromel et al. 2005). Le parent résistant à G. pallida, spl329.18, est un clone diploïde de l'accession de S. sparsipilum PI310984, provenant de la collection de Sturgeon Bay (USA). Le parent sensible, Caspar H3, est un clone dihaploïde obtenu par parthénogenèse in situ à l'INRA de Ploudaniel (France) à partir de la variété tétraploïde Caspar. 1393 plantes supplémentaires, issues du même croisement, ont été analysées pour la cartographie à haute résolution du QTL GpaVspi. Les génotypes 96D31.75 et 96D31.69 font partie de la descendance 96D31. Le génotype 96D31.75 possède l'allé le de sensibilité au QTL GpaVspi et Pallèle de résistance au QTL GpaXIspi. Le génotype 96D31.69 possède l'allèle de sensibilité au QTL GpaVspi et l'allèle de sensibilité au QTL GpaXIspi (Caromel et al. 2005).
Deux génotypes de la descendance 96D31, hétérozygotes pour la résistance au locus GpaVspi, ont été croisés pour donner naissance à la descendance 05D2. Quarante individus de cette descendance ont été analysés avec des marqueurs flanquant le QTL GpaVspi afin d'identifier le génotype 05D2.12, homozygote au locus GpaVspi.
IL Tests de résistance à G. pallida pour la cartographie génétique :
La résistance des clones de pomme de terre à G. pallida, pour la cartographie du QTL GpaVspi et pour la cartographie à haute résolution du gène sous-jacent au QTL GpaVspi, a été évaluée par dénombrement des kystes néo formés comme décrit dans la publication Caromel et al. 2005. Brièvement, quatre tubercules par génotype ont été plantés séparément dans des pots en plastiques, remplis avec 400 cm3 d'un mélange de sable et de terre franche. Dix kystes de G. pallida, pathotype Pa2/3 (population Chavornay), ont été ajoutés dans chaque pot de façon à obtenir une densité d'infestation de 5 à 10 juvéniles de G. pallida par gramme de sol. Les plantes ont été cultivées en serre pendant quatre mois. Le témoin sensible était la variété Désirée. Les kystes néoformés ont été séparés du substrat par élutriation. Ils ont été dénombrés séparément pour chaque pot. Les données brutes ont été transformées par une fonction logarithmique : loglO (nombre de kystes + 1). III. Développement de nouveaux marqueurs et cartographie génétique du gène sous-jacent au QTL GpaVspi
Le QTL GpaVspi a été cartographié sur le chromosome V de spl329.18, dans un intervalle de 5 cM compris entre les marqueurs GP21-SCAR et TG432P-CAPS (Caromel et al. 2005). Afin de développer de nouveaux marqueurs moléculaires dans cet intervalle, une recherche d'homologie a été réalisée entre les séquences de GP21-SCAR et TG432P- CAPS et les séquences de clones BAC de Solarium demissum disponibles dans les bases de données publiques. La séquence du marqueur TG432P-CAPS a permis d'identifier le clone BAC AC 150162. Le clone BAC AC 150162 est chevauchant, avec les clones BAC AC151803 et AC 154033 (Kuang et al. 2005). Les marqueurs ASC231, ASC240, Z751F 2R, ASC102 et MS092 ont été développés à partir des séquences des BAC AC151803 et AC 154033. Le marqueur MS063 2 à été développé à partir de la séquence de l'EST de pomme de terre CK864217. Les séquences des amorces permettant d'amplifier ces marqueurs sont indiquées dans le listage de séquences.
Afin de cartographier le gène sous-jacent au QTL GpaVspi comme un locus marqueur, nous avons converti les données quantitatives de résistance (nombre de kystes de G. pallida néoformés) en données qualitatives (résistant vs. sensible). Un clone a été considéré comme possédant l'allèle de résistance au QTL GpaVspi quand un nombre moyen inférieur à 13 kystes néo formés par pot a été retrouvés, et un clone a été considéré comme possédant l'allèle de sensibilité au QTL GpaVspi quand un nombre moyen supérieur à 70 kystes néoformés par pot a été retrouvé. Les clones sur lesquels ont été retrouvés un nombre moyen de kystes néo formés compris entre 13 et 70 n'ont pas été pris en considération. De cette façon, nous avons cartographié le gène sous-jacent au QTL GpaVspi, dans la descendance de cartographie de 239 clones utilisée pour la détection du QTL (Caromel et al. 2005), entre les marqueurs MS063 2 et Z751F 2R, à 0,4 cM de chacun de ces deux marqueurs.
Afin de trouver des événements de recombinaison plus proches du gène sous-jacent au QTL GpaVspi, les 1393 clones, issus du croisement des mêmes parents spl329.18 et Caspar H3, ont été triés à l'aide de marqueurs moléculaires en plusieurs étapes. Un premier tri a été effectué sur l'ensemble de ces plantes avec les marqueurs GP21-SCAR (Caromel et al. 2005) et GP179 (Meksem et al. 1995), flanquant largement l'intervalle de confiance du QTL GpaVspi, mais faciles à utiliser sur de grands effectifs. Les 107 clones présentant un événement de recombinaison entre ces deux marqueurs ont ensuite été génotypés avec les marqueurs MS063 2 et Z751F 2R, ce qui nous a permis d'identifier 12 clones présentant un événement de recombinaison entre ces deux marqueurs. Les 12 clones présentant un événement de recombinaison entre MS063 2 et Z751F 2R ont été phénotypées selon le protocole décrit ci-dessus pour la cartographie de QTL, avec quatre répétitions par clone. Sur les 12 clones testés, 5 ont été considérés comme résistants, cinq comme sensibles, et deux n'ont pas été pris en compte (figure 1). Les 12 clones présentant un événement de recombinaison entre MS063 2 et Z751F 2R ont également été génotypés avec cinq marqueurs définis d'après la séquence des clones BAC de S. demissum (AC151803 et AC154033): les marqueurs ASC231, ASC240, Z751, ASC 102 et MS092. La cartographie du caractère de résistance et de ces 5 nouveaux marqueurs a permis de localiser le gène sous-jacent au QTL GpaVspi entre les marqueurs ASC231 et ASC240 (figure 1). Un événement de recombinaison sépare le locus GpaVspi du marqueur ASC231 et deux événements de recombinaisons le séparent du marqueur ASC240. Aucun événement de recombinaison n'a permis de séparer les marqueurs ASC 102 et MS092 de la résistance à G. pallida. IV. Atterrissage chromosomique au locus GpaVspi et identification de gènes
candidats
Sur la séquence du clone BAC de S. demissum AC151803, les marqueurs ASC231 et ASC240 sont distants de 30 kb. Trois gènes putatifs ont été annotés dans ces 30 kb : - SDMl_55t00002 ="Leucine Rich Repeat family protein", position 18476 à 20167, - SDMl_55t00003 - 'Disease résistance protein, putative", position 22149 à 26161,
SDMl_55t00004 - 'Putative mTERF domain containing protein, identical", position 28630 à 29641.
Plusieurs gènes de résistance, décrits dans la bibliographie (van Ooijen et al. 2007), comprennent un domaine TIR (Toll-interleukin 1 receptor homology région), un domaine NB-ARC (nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1 résistance proteins, and CED-4) et un domaine LRR (leucine-rich repeat). Les domaines TIR et NB-ARC sont détectés dans le gène putatif SDMl_55t00003 et le domaine LRR est détecté dans le gène putatif SDMl_55t00002. Ces deux gènes putatifs, annotés sur la séquence du clone BAC de S. demissum, espèce sensible à G. pallida, pourraient donc former un seul gène fonctionnel chez l'accession de S. sparsipilum résistante à G. pallida. Un autre argument allant dans ce sens provient de la séquence du gène Bs4 conférant la résistance à Xanthomonas campestris pv. tomato chez la tomate (Schornack et al. 2004). Ce gène, cartographié en position co linéaire au locus GpaVspi, possède les trois domaines TIR, NBS et LRR. Il était donc probable que les deux gènes putatifs SDMl_55t00002 et SDMl_55t00003 n'en forment en réalité qu'un seul chez S. sparsipilum. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons amplifié des ADNc correspondant à ce locus chez S. sparsipilum et les avons séquencés. Les séquences correspondant aux domaines TIR, NB-ARC et LRR se retrouvent sur un même ADNc (séquence ADNc Hl), confirmant ainsi que les deux gènes putatifs détectés sur la séquence de S. demissum n'en forment en réalité qu'un seul chez S. sparsipilum. Les gènes de la famille des TIR-NB- ARC-LRR étant des gènes de résistance classique, nous avons décidé de cloner l'allèle de résistance de ce gène chez spl329.18 pour valider fonctionnellement son implication dans la résistance à G. pallida. V. Obtention de la séquence de l'allèle de résistance du gène TIR-NB-ARC-LRR sous jacent au QTL GpaVspi
Le couple d'amorce Z1505 6F/Z1505 R a été défini à partir des séquences des clones BAC chevauchant de S. demissum (AC151803 et AC 154033) et de S. lycopersicum (AC232763), pour amplifier par PCR la totalité de la séquence codante du gène TIR-NB- ARC-LRR et environ 2000 paires de bases de séquences flanquantes 5' et 3'. L'amplification a été réalisée dans 50 μΐ à partir de 50 ng d'ADN du génotype 05D2.12, issus d'un croisement frère-sœur entre deux génotypes de la descendance de cartographie et homozygote au locus GpaVspi, en utilisant une unité d'ExTaq HS de Takara (Lonza, Verviers, Belgique) selon les condition décrites dans le protocole fourni par le fournisseur, avec le programme d'amplification suivant : une étape de dénaturation initiale à 94°C pendant 2 minutes, suivie de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 98°C pendant 10 secondes et une étape d'hybridation des amorces et synthèse du brin complémentaire à 68°C pendant 10 minutes, et suivis d'une étape finale d'élongation à 72°C pendant 15 minutes. La taille et la quantité du produit de PCR obtenu a été estimée par migration de 2 μΐ de produit de PCR sur gel d'agarose à 0,8 %. Huit amplifications indépendantes ont été réalisées. Les produits de PCR ont été purifiés par précipitation avec deux volumes d'éthanol absolu et de l'acétate de sodium à 0,3 M de concentration finale, lavé deux fois avec 600 μΐ d'éthanol à 70 % et re-suspendu dans de l'eau ultra-pure. Le produit de PCR purifié a été envoyé à séquencer chez la société Cogenics (Meylan, France). La séquence obtenue a servi de séquence de référence pour l'étape ultérieure d'amplification et de clonage.
VI. Validation fonctionnelle du gène TIR-NB-ARC-LRR sous jacent au QTL
GpaVspi
Le couple d'amorce Z1505 8F/Z1505 4R a été défini à partir de la séquence du fragment obtenu par PCR avec le couple d'amorce Z1505 6F/Z1505 R sur l'ADN du génotype 05D2.12. Ces amorces ont été utilisées pour amplifier par PCR la totalité du gène TIR-NB-ARC-LRR avec 1821 paires de bases de séquences amont en 5' (avant l'ATG ) et 1720 paires de bases de séquences aval après le codon STOP, à partir de l'ADN du génotype spl329.18 résistant à G. pallida. L'amplification a été réalisée dans 8 fois 20 μΐ en utilisant l'Herculase II Fusion Enzyme (Agilent Technologies, Massy, France) suivant les instructions du fournisseur. Le programme d'amplification suivant a été utilisé : une étape de dénaturation initiale à 94°C pendant 2 minutes, suivie de 20 cycles comprenant une étape de dénaturation à 98°C pendant 10 secondes et une étape d'hybridation des amorces et synthèse du brin complémentaire à 68°C pendant 5 minutes, et suivis d'une étape finale d'élongation à 72°C pendant 15 minutes.
Après vérification sur gel d'agarose 0,8 %, chaque produit d'amplification a été cloné séparément dans le vecteur binaire pBIN19 (Bevan et al. 1984) digéré par l'enzyme Sali, en utilisant le kit de clonage In-Fusion 2.0 Dry-Down PCR Cloning Kit de Clontech (revendu par Ozyme, Saint-Quentin-en-Yvelines, France) suivant les instructions du fournisseur. Le produit de chaque réaction a été utilisé pour transformer 50 μΐ de la souche NEB 10-beta Compétent E. coli, puis mis en culture selon les instructions du fournisseur (New England BioLabs, revendu par Ozyme, Saint-Quentin-en-Yvelines, France). Pour chacun des huit clonages indépendants, 12 colonies blanches isolées (la couleur indiquant la présence d'un insert dans le plasmide (Bevan et al. 1984)) ont été mises en culture dans 2 ml de milieu LB contenant 50 μg de kanamycine par ml. Un aliquote de la culture a été utilisé pour vérifier par PCR la présence d'un insert de la taille attendue en utilisant le couple d'amorces Z1505 8F/Z1505 4R. Un clone positif par clonage indépendant a été envoyé à séquencer chez la société Cogenics après purification du plasmide avec le kit NucleoSpin Plasmid de Macherey-Nagel (Dùren, Allemagne). Deux des huit clones séquencés présentaient une séquence 100 % identique à la séquence de référence obtenue à partir du produit de PCR. Un de ces deux clones, le clone Gpa
Figure imgf000028_0001
a été utilisé pour les étapes ultérieures de validation fonctionnelle. La séquence du fragment cloné correspond à la « séquence génomique GpaVspi » de la SEQ ID No. l .
Deux μΐ de plasmide purifié du clone Gpa
Figure imgf000028_0002
ont été introduit par électroporation dans la souche d'Agrobacterium tumefasciens C58 porteuse du plasmide assistant pGV2660 (Deblaere et al. 1985), en utilisant une procédure classique. La souche a été cultivée à 28 °C pendant environ 24 heure dans un milieu LB + kanamycine (50μg/ml) jusqu'à l'obtention d'une densité optique de 0,3 à 600 nm. Des fragments d'entre-nœuds (0,5 - 0,8 cm de long), issus de boutures de pomme de terre cultivées in vitro, ont été mis à incuber pendant 20 minutes dans 15 ml de la solution bactérienne. Les fragments d'entre- nœuds ont ensuite été essorés sur papier filtre et co-cultivés sur un milieu de co-culture « pomme de terre » (tableau 1) supplémenté avec 0,9 mg/L de Thiamine et 39 d'Acétosyringone puis placés à l'obscurité pendant deux jours à 24°C.
Tableau 1 : composition du milieu « pomme de terre »
Figure imgf000029_0001
pH ajusté à 5,8 avec KOH
Après cette période de coculture, les explants ont été transférés dans des boites de pétri sur un nouveau milieu « pomme de terre » riche en antibiotique de sélection (Kanamycine 300 mg/L), antibiotique pour éliminer la bactérie (Timentin 225 mg/L) et hormones favorisant la régénération (ANA 0,1 mg/L, GA3 0,1 mg/L, BAP 1 mg/L), puis placés en chambre de culture à 20°C. Le milieu de culture a été renouvelé tous les 15 jours. Après 2 à 3 mois de culture, les plantes régénérées ont été isolées des explants puis transférées pour enracinement dans des tubes de culture contenant du milieu « pomme de terre » additionné de 225 mg/L de Timentin et de 300 mg/L de Kanamycine. Les plantes issue d'un événement de transformation et produisant un système racinaire sur le milieu additionné de kanamycine, ont été indexées et multipliées afin de disposer d'un nombre de boutures suffisant pour réaliser les tests de résistance à G. pallida.
La résistance à G. pallida des plantes transgéniques a été évaluée par un test in vitro. Six événements de transformation indépendants, régénérés à partir du génotype 96D31.75 possédant l'allèle de sensibilité au QTL GpaVspi et l'allèle de résistance au QTL GpaXIspi, ont été testés. Ces événements de transformation indépendants ont été nommés 96D31.75 A, 96D31.75 B, 96D31.75 C, 96D31.75 E, 96D31.75 F, et 96D31.75 G. Le génotype 96D31.75, transformé avec le gène rapporteur GUS a été utilisé comme témoin (nommé 96D31.75 GUS). Des boutures enracinées ont été transférées dans des boites de Pétri contenant du milieu « pomme de terre » sans saccharose et dans lequel le Vitro Agar a été remplacé par de la Gelrite (Kalys, Saint Ismier, France) à 5 g/1. Les boites ont été placées verticalement dans un phytotron réglé à une température de 17°C, hygrométrie 70 %, durée du jour 16 heures et de la nuit 8 heures, intensité d'éclairage de 250 μηιοΐ.ρΐιοίοη.ηι2^"1. Au bout de deux jours, trente racines ont été inoculées par événement de transformation et pour le témoin (2 racines par bouture et 15 boutures par événement de transformation ou pour le témoin). Chaque racine a été inoculée avec 5 juvéniles de G. pallida (population Chavornay) au stade J2 et les boites contenant les boutures inoculées ont été placées horizontalement dans le phytotron. Les racines inoculées ont été excisées 4 semaines après inoculation, immergée 5 min dans une solution d'hypochlorite de calcium à 1 % et colorées 15 secondes dans une solution de Fuchsine Acide (0,1% dans 30 % d'Acide Acétique) à 100°C. Les nématodes sont ainsi colorés en rouge. Les racines ont été ensuite écrasées entre lame et lamelle, et les nématodes aux différents stades de développement ont été dénombrés sous un microscope (grossissement 400). Ils ont été répartis en deux classes : stade femelle d'une part, et autres stades d'autre part (stades mâles, J2 et J3).
Les données obtenues sur les six événements de transformation ont été comparées à celle obtenues sur le génotype témoin 96D31.75 GUS, par un test de khi2 à 1 degré de liberté. Selon le test Khi2 les événements de transformation 96D31.75.A, B, C, E et G sont signifîcativement différents du témoin utilisé : ils ont permis le développement d'un nombre signifîcativement plus faible de femelles que dans le témoin (tableau 2). Tableau 2 : Pourcentage de nématodes développés en femelles, 21 jours après inoculation, dans les racines des plantes transformées avec le gène TIR-NBS-LR .
La signifîcativité des différences entre les transformants 96D31.75.A à G et le témoin 96D31.75 transformé avec le gène GUS a été évaluée par une statistique du khi2 à 1 degré de liberté.
Figure imgf000031_0002
L'expérience a été répétée une seconde fois pour les événements 96D31.75.C, E et G et a une nouvelle fois montré des différences très significatives entre ces trois transformants et le témoin (96D31.75.C : khi2 = 18,58, p = 4,66.10"5 ; 96D31.75.E : khi2 = 36,70, p = 1 ,36.10"9 ; 96D31.75.G : khi2 = 34,77, p = 3,70.10"9). Ces expériences démontrent que le gène TIR-NB-ARC-LRR est impliqué dans la résistance à G. pallida.
Afin de valider ces résultats, le génotype 96D31.69, possédant les allèles de sensibilité aux deux QTL GpaVspi et GpaXIspi, a été transformé avec la même souche bactérienne (clone bactérien Gpa
Figure imgf000031_0001
dans la souche dAgrobacterium tumefasciens C58 porteuse du plasmide assistant pGV2660). Trois événements de transformation indépendants (09D803.5, 09D.817.36, et 09D.817.42) ont été testés pour leur résistance à G. pallida. Le génotype 96D31.69, transformé avec le gène rapporteur GFP a été utilisé comme témoin. Le test de résistance a été réalisé comme décrit ci-dessus. Deux racines de 5 à 15 boutures ont été inoculées pour chaque événement de transformation indépendant.
Les données obtenues sur les trois événements de transformation issus du génotype 96D31.69 ont été comparées à celle obtenues sur le génotype témoin 96D31.69 GFP, par un test de khi2 à 1 degré de liberté. Selon le test Khi2, les trois événements de transformation sont signifïcativement différents du témoin utilisé : ils ont permis le développement d'un nombre signifïcativement plus faible de femelles que dans le témoin (tableau 3).
Tableau 3 : Pourcentage de nématodes développés en femelles, 28 jours après inoculation, dans les racines des plantes issues du génotype 96D31.69, transformées avec le gène TIR- NBS-LRR.
La signifïcativité des différences entre les transformants 09D803.5, 09D817.36, 09D817.42 et le témoin 96D31.69, transformé avec le gène rapporteur GFP, a été évaluée par une statistique du khi2 à 1 degré de liberté.
Figure imgf000032_0001
VIL Détermination de la séquence codante du gène TIR-NB-ARC-LRR sous jacent au QTL GpaVspi
La séquence codante du gène a été identifiée à partir d'ARN issus de fragments tissulaires prélevé sur le génotype 05D2.12. Des fragments tissulaires ont été prélevés sur des racines inoculées et non inoculées par G. pallida à 6 heures, 2 jours et 4 jours postinoculation, ainsi que sur des feuilles, des germes et des tiges. Les ARN de chaque échantillon ont été extraits avec le kit RNeasy Plant Mini Kit de Qiagen (Courtaboeuf, France), selon les indications du fournisseur et dosé au spectrophotomètre. Les ARN des différents échantillons ont été mélangés en proportions équivalentes. Un microgramme dARN total a été rétro -transcrit avec 200 unités de SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), suivant les instructions du fournisseur.
Les extrémités des ARN transcrits à partir du gène TIR-NB-ARC-LRR ont été déterminées par 5' et 3' RACE en utilisant le kit SMART RACE cDNA Amplification Kit (ClonTech, revendu par OZYME). Une série d'expérience de RT-PCR a été réalisée en utilisant les amorces définies pour les expériences de RACE et des amorces définies sur les extrémités 5' et 3' des ADNc. Les fragments d'ADNc ont été amplifié par PCR avec une unité d'ExTaq HS de Takara (Lonza, Verviers, Belgique) selon les condition décrites dans le protocole fourni par le fournisseur, avec le programme d'amplification suivant : une étape de dénaturation initiale à 94°C pendant 2 minutes, suivie de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 98°C pendant 10 secondes, une étape d'hybridation des amorces à 60°C pendant 20 secondes et une étape de synthèse du brin complémentaire à 72°C pendant 3 minutes, et suivis d'une étape finale d'élongation à 72°C pendant 10 minutes. Les produits amplifiés ont été clonés et/ou purifiés et envoyé à séquencer chez la société Cogenics. Les séquences obtenues suite aux expériences de RACE et de RT-PCR ont été alignées avec la séquence de l'ADN génomique grâce aux logiciel SIM4 (http://pbil.univ- lyonl .fr/sim4.php) et Multalin (http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html). Les alignements ont permis de déterminer la position des introns et des exons et ont mis en évidence une importante utilisation des mécanismes d'épissage alternatif lors de la maturation des ARNm.
Après la région promotrice, le gène GpaVspi comprend 5 exons et 4 introns. L'exon 1 comporte la région 5' non traduite (5'UTR) et le domaine TIR, l'exon 2 comporte le domaine NB-ARC, l'exon 3 comporte le début du domaine LRR, l'exon 4 comporte la fin du domaine LRR jusqu'au codon stop et le début de la région 3' non traduite (3 'UTR), et l'exon 5 comporte la fin de la région 3'UTR. Des ARNm correspondant à différents mécanismes d'épissage alternatif ont été observé : rétention des intron 1, intron 2 et/ou intron 3, saut de l'exon 3, utilisation d'un site accepteur cryptique dans l'exon 2 conduisant à une délétion des 966 premières paires de bases de l'exon 2. Des sites de polyadenylation alternatifs ont été identifiés dans les exons 2, 3 et 5 ainsi que dans Γ intron 3. Quatre sites d'initiation de la transcription ont été identifiés dans l'exon 1. La rétention d'un intron entraine systématiquement l'apparition d'un codon STOP prématuré avant l'exon suivant. Les séquences nucléotidiques, allant de l'ATG jusqu'au codon STOP, et résultant des différents types d'épissage possibles correspondent aux séquences cDNA_l à cDNA_l 1.
VIII. Evaluation du niveau d'expression du gène TIR-NB-ARC-LRR sous jacent au QTL GpaVspi
Le niveau d'expression du gène TIR-NB-ARC-LRR a été déterminé sous deux conditions (I : Inoculé avec le nématode et NI : Non Inoculé) et en trois points de cinétique (6h, 2 jours et 4 jours après l'infection avec le parasite) dans différent génotypes de la population issue du croisement entre Caspar H3 et spl3219.18. Les génotypes ont été choisis en fonction de leurs combinaisons alléliques au deux QTL GpaVspi et GpaXIspi (Caramel et al. 2005). Le génotype 96D31.139 possède les allèles de résistance aux deux QTL (R5R11), le génotype 96D31.03 possède l'allèle de résistance au QTL GpaVspi et l'allé le de sensibilité au QTL GpaXIspi (R5S11), et le génotype 96D31.152 possède les allèles de sensibilité aux deux QTL (S5S11).
Les ARN ont été extraits à partir de 5 fragments racinaires de 5 mm autour du point d'inoculation ou de la zone correspondante pour les plantes non inoculées, avec le kit RNeasy Plant Mini Kit de Qiagen (Courtaboeuf, France). Pour chaque échantillon, ^g d'ARN a été rétro-transcrit avec 200 unités de SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), suivant les instructions du fournisseur. La réaction a ensuite été diluée 20 fois avec de l'eau ultra-pure.
Le niveau d'expression du gène TIR-NB-ARC-LRR a été mesuré par Q-RT-PCR avec le kit SYBR Premix Ex Taq (Takara) sur un appareil MX3005 (Stratagene) suivant les instructions du fournisseur, en utilisant les amorces Q63 et le programme suivant : une étape de dénaturation initiale à 95°C pendant 2 minutes, suivie de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 95°C pendant 20 secondes, une étape d'hybridation des amorces à 55°C pendant 20 secondes et une étape de synthèse du brin complémentaire à 72°C pendant 30 seconde. La courbe de dénaturation du produit amplifié a été calculée après les trois étapes suivantes : 95°C pendant 1 minute, 55°C pendant 30 seconde et 95°C pendant 1 minute. Nous avons utilisé comme référence les données d'expression du gène de la Phosphoglycerate kinase Cytosolique F (PGK) pour la normalisation des résultats obtenus entre les différents échantillons (Coker and Davies 2003). Il a été amplifié selon le même protocole, à l'exception de la température d'hybridation des amorces qui était de
50°C.
Les analyses statistiques pour interpréter les résultats bruts donnés par le Mx3005P® QPCR System ont été réalisées à l'aide du logiciel REST® (Pfaffl et al. 2002). Celui-ci fonctionne en se basant sur les valeurs de Ct et l'Efficacité de la Q-RT-PCR. On calcule un ratio d'expression relative entre un gène cible et un gène de référence (ou gène de ménage), dont l'expression reste inchangée dans la cellule au cours du temps. Cela permet de s'affranchir d'éventuelles différences de quantité d'ADNc au départ. Si d'un échantillon à l'autre, la quantité d'ADNc est fortement différente, le gène de ménage, permet de normaliser les résultats.
Ce ratio est déterminé suivant la formule :
( MEAN control - MEAN sample )
( ^ta¾et )
R =
ACPref (MEAN control- MEAN sample )
( Eref ) Dans notre cas :
- E target = Efficacité de la PCR avec le gène cible (TIR-NB-ARC-LRR).
- ME AN control target = Ct du gène cible dans l'échantillon contrôle (par exemple S S NI 6h).
- MEAN sample target = Ct du gène cible dans l'échantillon inconnu (par exemple SS I 6h).
- E ref = Efficacité de la PCR avec le gène de ménage PGK.
- MEAN control ref = Ct du gène PGK dans l'échantillon contrôle (par exemple SS NI 6h).
- MEAN sample ref = Ct du gène PGK dans l'échantillon inconnu (par exemple SS I 6h).
Le gène TIR-NB-ARC-LRR est beaucoup plus exprimé dans un génotype R5R11 que dans un génotype S5S11, à 6h (31 fois plus) et à 4 jours (14 fois plus). De même, ce gène est 6 fois plus exprimé dans un génotype R5R11 que dans un génotype R5S1 1, 6h après l'inoculation avec le nématode.
Dans le cas de plantes non inoculées, le gène TIR-NSB-LRR est également plus exprimé, quelque soit la cinétique, dans un génotype R5R11 que dans un génotype S5S11 : 6h après l'infection il est 16 fois plus exprimé, 2 jours après il l'est 13 fois plus et après 4 jours il l'est 234 fois plus.
Les différences de niveaux d'expression observés entre génotypes possédant l'allèle de sensibilité au gène TIR-NSB-LRR (S5S11) et génotypes possédant l'allèle de résistance (R5S11 et R5R11), suggèrent une influence du promoteur du gène sur l'expression de la résistance. Pour les génotypes possédant l'allèle de résistance au gène TIR-NSB-LRR, les différences de niveaux d'expression, observées pour ce gène, entre génotypes possédant les allèles de sensibilité (R5S11) et de résistance (R5R11) au QTL à effet faible GpaXIspi suggèrent également que l'interaction entre les deux QTL est liée à une augmentation du niveau de transcription du gène TIR-NB-ARC-LRR par l'allèle de résistance au QTL GpaXIspi. Il est probable que cette augmentation du niveau d'expression du gène TIR-NB- ARC-LRR passe par la reconnaissance (directe ou indirecte) d'un motif spécifique de son promoteur par l'allèle de résistance au QTL GpaXIspi.
IX. Identification des séquences des allèles de sensibilité issus de deux accessions de S. sparsipilum et de S. tuberosum
Le couple d'amorces Z1505 8F/Z1505 5R a été utilisé pour amplifier le locus GpaV à partir de deux accessions de S. sparsipilum (spl329.18 et spl504.5) et de deux accessions diploïdes de S. tuberosum (Caspar H3 et Rosa Hl). Les produits amplifiés ont été clonés, comme décrit précédemment. Au moins trois clones par allèle ont été séquencés. Chez les deux accessions de S. sparsipilum spl329.18 et spl504.5, l'allèle de résistance est identique et correspond à la séquence SEQ ID No. 1. Les allèles de sensibilité issus de ces deux accessions sont différents et correspondent aux séquences SEQ ID No. 34 et SEQ ID No. 35. Un seul allèle a été cloné à partir de S. tuberosum; cet allèle est identique chez les deux accessions sensibles à G. pallida, Caspar H3 et Rosa Hl . La séquence de cet allèle correspond à la séquence SEQ ID No. 36.
X. Définition d'un marqueur permettant de suivre l'allèle de résistance GpaVspi au cours du processus de sélection
Les clones de S. sparsipilum spl329.18 et spl504.5 sont hétérozygotes au locus GpaV. L'allèle de résistance, GpaVspi, est identique chez ces deux clones. En revanche, les allèles de sensibilité de ces deux clones sont différents. L'allèle de sensibilité de S. tuberosum, isolé à partir des clones Caspar H3 et Rosa Hl est différent des tous les allèles isolés chez S. sparsipilum. Les séquences génomiques de l'allèle de résistance GpaVspi et des trois allèles de sensibilité ont été alignées avec le logiciel Multalin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html). Les régions polymorphes entre l'allèle de résistance, d'une part, et les allèles de sensibilité, d'autre part, ont été identifiées. Des amorces PCR flanquant ces régions ont été définies, de façon à amplifier ces régions polymorphes pour tous les allèles. La spécificité des amorces a été vérifiée par une recherche d'homologie (blastn) avec toutes les séquences génomiques de pomme de terre présentes dans les bases de données publiques : n'ont été conservées que les couples d'amorces ne présentant une forte homologie qu'avec des séquences de clones BAC du chromosome 5. Le couple d'amorce Z3461 a été défini pour amplifier un fragment de 1050 à 1100 paires de bases selon les allèles, comprenant une partie de l'exon 3 et une partie de l'intron 3.
Les amorces permettant d'amplifier ce marqueur sont les suivantes :
Z3461F GACCATGACAGTGGAAGCAA
Z3461R TGGTTGTCAGAAGCAAATGAAG
La digestion des amplifïats avec l'enzyme de restriction Mbol, produit trois fragments de 208, 229, et 622 paires de bases pour l'allèle de résistance GpaVspi, et uniquement deux fragments pour les 3 allèles de sensibilité (un fragment de 229 bp et un fragment d'une taille comprise entre 845 et 856 bp selon l'allèle de sensibilité). La visualisation des différents fragments est réalisée après électrophorèse des amplifïats digérés par Mbol, dans un gel d'agarose à 2 %. Ce marqueur permet de distinguer spécifiquement l'allèle de résistance GpaVspi des allèles de sensibilité, qu'ils soient originaires de S. tuberosum ou de S. sparsipilum. Références
Bevan, M. 1984. A New Agrobacterium Vector for Plant Transformation. Heredity 53:577-578.
Bryan, G. J., McLean, K., Bradshaw, J. E., Jong, W. S. d., Phillips, M., Castelli, L. and Waugh, R. 2002. Mapping QTLs for résistance to the cyst nematode Globodera pallida derived from the wild potato species Solarium vernei. Theor. Appl. Genêt. 105:68-77.
Caramel, B., Mugniery, D., Lefebvre, V., Andrzejewski, S., Ellisseche, D., Kerlan, M. C, Rousselle, P. and Rousselle-Bourgeois, F. 2003. Mapping QTLs for résistance against Globodera pallida (Stone) Pa2/3 in a diploid potato progeny originating from Solarium spegazzinii. Theor. Appl. Genêt. 106:1517-1523.
Caramel, B. 2004. Cartographie génétique et étude de QTL conférant la résistance au nématode à kyste Globodera pallida (Stone) chez la pomme de terre {Solarium tuberosum ssp. tuberosum L.). Ph.D. Thesis Paris XI University, France
Caramel, B., Mugniéry, D., Kerlan, M. C, Andrzejewski, S., Palloix, A., Ellissèche, D., Rousselle-Bourgeois, F. and Lefebvre, V. 2005. Résistance quantitative trait loci originating from Solarium sparsipilum act independently on the sex ratio of Globodera pallida and together for developing a necrotic reaction. Mol. Plant- Microbe Interact. 18 : 1186- 1194.
Coker, J. S. and Davies, E. 2003. Sélection of candidate housekeeping contrais in tomato plants using EST data. BioTechniques 35:740-748.
Deblaere, R., Bytebier, B., De Grève, H., Deboeck, F., Schell, J., Van Montagu, M. and Leemans, J. 1985. Efficient octopine Ti-plasmid derived for Agrobacterium- mediated gene transfer. Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788.
de Vetten, N., Wolters, A. M., Raemakers, K., van der Meer, L, ter Stege, R., Heeres, E., Heeres, P. and Visser, R. 2003. A transformation method for obtaining marker-free plants of a cross-pollinating and vegetatively propagated crop. Nat. Biotechnol. 21 :439-442.
Garbarino, J. E. and Belknap, W. R. 1994. Isolation of a Ubiquitin-Ribosomal Protein Gene (Ubi3) from Potato and Expression of Its Promoter in Transgenic Plants.
Plant mol. Biol. 24: 119-127. Garbarino, J. E., Oosumi, T. and Belknap, W. R. 1995. Isolation of a Polyubiquitin Promoter and Its Expression in Transgenic Potato Plants. Plant Physiol. 109: 1371- 1378.
Hajdukiewicz, P., Svab, Z. and Maliga, P. 1994. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant mol. Biol. 25:989-
994.
Hellens, R., Mullineaux, P. and Klee, H. 2000. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends Plant Sci. 5:446-451.
Jones, M. O., Manning, K., Andrews, J., Wright, C, Taylor, I. B. and Thompson, A. J.
2008. The promoter from S1REO, a highly-expressed, root-specifïc Solarium lycopersicum gene, directs expression to cortex of mature roots. Functional Plant Biology 35: 1224-1233.
Karimi, M., Inze, D. and Depicker, A. 2002. GATEWAYTM vectors for Agrobacterium- mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7:193-195.
Karimi, M., Bleys, A., Vanderhaeghen, R. and Hilson, P. 2007. Building blocks for plant gene assembly. Plant Physiol. 145: 1183-1191.
Kort, J., Ross, H., Rumpenhorst, J. H. and Stone, A. R. 1977. An international scheme for classifying pathotypes of potato cyst nematodes Globodera rostochiensis and G. pallida. Nematologica 23:333-339.
Kuang, H. H., Wei, F. S., Marano, M. R., Wirtz, U., Wang, X. X., Liu, J., Shum, W. P., Zaborsky, J., Talion, L. J., Rensink, W., Lobst, S., Zhang, P. F., Tornqvist, C. E., Tek, A., Bamberg, J., Helgeson, J., Fry, W., You, F., Luo, M. C, Jiang, J. M., Buell, C. R. and Baker, B. 2005. The RI résistance gene cluster contains three groups of independently evolving, type I RI homologues and shows substantial structural variation among haplotypes of Solanum demissum. Plant Journal 44:37-
51.
Meksem, K., Leister, D., Peleman, J., Zabeau, M., Salamini, F. and Gebhardt, C. 1995. A high-resolution map of the vicinity of the RI locus on chromosome V of potato based on RFLP and AFLP markers. Mol. gen. Genêt. 249:74-81.
Mugniéry, D., Fouville, D., Dantec, J. P., Pellé, R., Rousselle-Bourgeois, F. and Ellissèche, D. 2001. Résistance à Globodera pallida Pa2/3 chez Solanum sparsipilum. Nematology 3:619-626. Nakagawa, T., Ishiguro, S. and Kimura, T. 2009. Gateway vectors for plant transformation. Plant Biotechnology 26:275-284.
Opperman, C H., Taylor, C. G. and Conkling, M. A. 1994. Root-Knot Nematode-Directed Expression of a Plant Root-Specifïc Gene. Science 263:221-223.
Pfaffl, M. W., Horgan, G. W. and Dempfle, L. 2002. Relative expression software tool (REST (c)) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucl. Acids. Res. 30:
Rouppe van der Voort, J., Wolters, P., Folkerstma, R., Hutten, R., van Zanvoort, P., Vinke, H., Kanyuka, K., Bendahmane, A., Jacobsen, E., Janssen, R. and Bakker, J. 1997. Mapping of the cyst nematode résistance locus Gpa2 in potato using a strategy based on co-migrating AFLP markers. Theor. Appl. Genêt. 95:874-880.
Rouppe van der Voort, J. N. A. M., Lindeman, W., Folkertsma, R., Hutten, R. C. B., Overmars, H., Van der Vossen, E., Jacobsen, E. and Bakker, J. 1998. A QTL for broad-spectrum résistance to cyst nematode species (Globodera ssp.) maps to a résistance gene cluster in potato. Theor. Appl. Genêt. 96:654-661.
Rouppe van der Voort, J. N. A. M., van der Vossen, E., Bakker, E., Overmars, H., van Zandvoort, P., Hutten, R., Klein Lankhorst, R. and Bakker, J. 2000. Two additive QTLs conferring broad-spectrum résistance in potato to Globodera pallida are localized on résistance gene clusters. Theor. Appl. Genêt. 101 :1122-1130.
Schornack, S., Ballvora, A., Gurlebeck, D., Peart, J., Ganal, M., Baker, B., Bonas, U. and Lahaye, T. 2004. The tomato résistance protein Bs4 is a predicted non-nuclear TIR- NB-LRR protein that médiates défense responses to severely truncated derivatives of AvrBs4 and overexpressed AvrBs3. Plant Journal 37:46-60.
van Ooijen, G., van den Burg, H. A., Cornelissen, B. J. C. and Takken, F. L. W. 2007.
Structure and function of résistance proteins in solanaceous plants. Ann. Rev.
Phytopathol. 45:43-72.

Claims
REVENDICATIONS
Polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polynucléotides suivants :
le polynucléotide de la SEQ ID No.l, le polynucléotide de la SEQ ID No. 3, le polynucléotide de la SEQ ID No.
5, le polynucléotide de la SEQ ID No. 7, le polynucléotide de la SEQ ID No. 9 ou le polynucléotide de la SEQ ID No. 11;
- un polynucléotide codant pour le polypeptide de la SEQ ID No. 2, le polypeptide de la SEQ ID No. 4, le polypeptide de la SEQ ID No.
6, le polypeptide de la SEQ ID No. 8, le polypeptide de la SEQ ID No. 10 ou le polypeptide de la SEQ ID No. 12.
Polynucléotide isolé conférant aux plantes Solanacées une résistance aux nématodes Globodera, ledit polynucléotide isolé étant choisi parmi :
- un polynucléotide présentant au moins 80% d'homologie avec le polynucléotide de la SEQ ID No. l, le polynucléotide de la SEQ ID No. 3, le polynucléotide de la SEQ ID No. 5, le polynucléotide de la SEQ ID 7, le polynucléotide de la SEQ ID No. 9 ou le polynucléotide de la SEQ ID No. 11;
- un fragment d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 1, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 3, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 5, d'un polynucléotide de la SEQ ID 7, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 9 ou d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 11.
Polynucléotide isolé selon la revendication 2 caractérisé en ce que les plantes sont choisies parmi les plantes des espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum.
Polynucléotide isolé selon l'une des revendications 2-3 caractérisé en ce que les nématodes sont choisis parmi Globodera pallida, Globodera rostochiensis, Globodera tabacum ssp. tabacum, ssp. virginiae et ssp. solanacearum, et Globodera mexicana.
Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend dans le sens de la transcription :
un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte,
- un polynucléotide isolé selon l'une des revendications 1-4;
une séquence terminatrice fonctionnelle dans le même organisme hôte.
Cassette d'expression selon la revendication 5 caractérisée en ce que le promoteur fonctionnel dans un organisme hôte est choisi parmi CaMV 35S, des promoteurs exprimés spécifiquement dans les racines et le promoteur de la position 1 à la position 1657 de la SEQ ID No. 1.
7. Vecteur comprenant un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4 ou une cassette d'expression selon l'une des revendications 5-6.
8. Cellule hôte transformée avec un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4, une cassette d'expression selon l'une des revendications 5-6 ou un vecteur selon la revendication 7.
9. Cellule hôte transformée selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les cellules végétales et les protoplastes de cellules végétales.
10. Organisme hôte, à l'exclusion de l'homme, transformé avec un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4, une cassette d'expression selon l'une des revendications 5-6 ou un vecteur selon la revendication 7.
11. Organisme hôte transformé, à l'exclusion de l'homme, selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les plantes, les graines et les tissus végétaux.
12. Organisme hôte transformé, à l'exclusion de l'homme, selon l'une des revendications 10-11 caractérisé en ce que l'organisme hôte est une plante de la famille des Solanacées.
13. Organisme hôte transformé, à l'exclusion de l'homme, selon la revendication 12 caractérisé en ce que l'organisme hôte est choisi parmi les plantes des espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L.,
Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum.
14. Plante choisie parmi les espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum caractérisée en ce qu'elle comprend un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4.
15. Plante choisie parmi les espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum caractérisée en ce qu'elle exprime un polypeptide choisi parmi le polypeptide de la SEQ ID No. 2, le polypeptide de la SEQ ID No. 4, le polypeptide de la SEQ ID No. 6, le polypeptide de la SEQ ID No. 8, le polypeptide de la SEQ ID No.
10 ou le polypeptide de la SEQ ID No. 12.
16. Plante choisie parmi les pommes de terre de culture caractérisée en ce qu'elle comprend un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4.
17. Plante choisie parmi les pommes de terre de culture caractérisée en ce qu'elle exprime un polypeptide choisi parmi le polypeptide de la SEQ ID No. 2, le polypeptide de la SEQ ID No. 4, le polypeptide de la SEQ ID No. 6, le polypeptide de la SEQ ID No. 8, le polypeptide de la SEQ ID No. 10 ou le polypeptide de la SEQ ID No. 12.
18. Procédé pour conférer une résistance aux nématodes Globodera à une plante Solanacée caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
transformation de la plante avec un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4, une cassette d'expression selon l'une des revendications 5-6 ou un vecteur selon la revendication 7 ;
- sélection d'une plante résistante aux nématodes Globodera.
19. Procédé pour rendre résistante une plante de Solarium tuberosum L. subsp. tuberosum, Solarium tuberosum L. subsp. andigena, ou Solarium phureja aux nématodes Globodera caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
introgression d'un segment d'ADN génomique de Solarium sparsipilum comprenant le polynucléotide de la SEQ ID No.l dans une plante de Solarium tuberosum L. subsp. tuberosum, Solarium tuberosum L. subsp. andigena, ou Solanum phureja ;
sélection d'une plante de Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum, Solanum tuberosum L. subsp. andigena, ou Solanum phureja résistante aux nématodes Globodera, avec des marqueurs moléculaires dérivés de la SEQ ID No 1.
20. Utilisation d'amorces ou de sondes polynucléotidiques dérivées de la SEQ ID No. 1 pour la détection de plantes Solanacées résistantes aux nématodes.
PCT/EP2010/070952 2009-12-31 2010-12-31 Gene gpav de resistance aux nematodes chez les solanacees WO2011080329A2 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10801176A EP2519638A2 (fr) 2009-12-31 2010-12-31 Gene gpav de resistance aux nematodes chez les solanacees
CA2786207A CA2786207A1 (fr) 2009-12-31 2010-12-31 Gene gpav de resistance aux nematodes chez les solanacees
US13/519,886 US20120291157A1 (en) 2009-12-31 2010-12-31 Gpav gene resistant to nematodes in the solanacea

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0906432A FR2954779B1 (fr) 2009-12-31 2009-12-31 Gene gpav de resistance aux nematodes chez les solanacees
FR09/06432 2009-12-31

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2011080329A2 true WO2011080329A2 (fr) 2011-07-07
WO2011080329A3 WO2011080329A3 (fr) 2011-08-25

Family

ID=42111781

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2010/070952 WO2011080329A2 (fr) 2009-12-31 2010-12-31 Gene gpav de resistance aux nematodes chez les solanacees

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20120291157A1 (fr)
EP (1) EP2519638A2 (fr)
CA (1) CA2786207A1 (fr)
FR (1) FR2954779B1 (fr)
WO (1) WO2011080329A2 (fr)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107937591B (zh) * 2017-12-12 2021-04-13 华中农业大学 马铃薯染色体ⅺ末端抗低温糖化相关的qtl位点的snp标记及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6630618B2 (en) * 2000-03-21 2003-10-07 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Transgenic plants having non-pathogen induced systemic acquired resistance (SAR)

Non-Patent Citations (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEVAN, M.: "A New Agrobacterium Vector for Plant Transformation", HEREDITY, vol. 53, 1984, pages 577 - 578
BRYAN, G. J.; MCLEAN, K.; BRADSHAW, J. E.; JONG, W. S. D.; PHILLIPS, M.; CASTELLI, L.; WAUGH, R.: "Mapping QTLs for resistance to the cyst nematode Globodera pallida derived from the wild potato species Solanum vernei", THEOR. APPL. GENET., vol. 105, 2002, pages 68 - 77
CAROMEL, B.: "Cartographie génétique et étude de QTL conférant la résistance au nématode à kyste Globodera pallida (Stone) chez la pomme de terre (Solanum tuberosum ssp. tuberosum L.)", PH.D. THESIS PARIS XI UNIVERSITY, 2004
CAROMEL, B.; MUGNIÉRY, D.; KERLAN, M. C.; ANDRZEJEWSKI, S.; PALLOIX, A.; ELLISSÈCHE, D.; ROUSSELLE-BOURGEOIS, F.; LEFEBVRE, V.: "Resistance quantitative trait loci originating from Solanum sparsipilum act independently on the sex ratio of Globodera pallida and together for developing a necrotic reaction", MOL. PLANT-MICROBE INTERACT, vol. 18, 2005, pages 1186 - 1194
CAROMEL, B.; MUGNIERY, D.; LEFEBVRE, V.; ANDRZEJEWSKI, S.; ELLISSECHE, D.; KERLAN, M. C.; ROUSSELLE, P.; ROUSSELLE-BOURGEOIS, F.: "Mapping QTLs for resistance against Globodera pallida (Stone) Pa2/3 in a diploid potato progeny originating from Solanum spegazzinii", THEOR. APPL. GENET., vol. 106, 2003, pages 1517 - 1523
COKER, J. S.; DAVIES, E.: "Selection of candidate housekeeping controls in tomato plants using EST data", BIOTECHNIQUES, vol. 35, 2003, pages 740 - 748
DE VETTEN, N.; WOLTERS, A. M.; RAEMAKERS, K.; VAN DER MEER, I.; TER STEGE, R.; HEERES, E.; HEERES, P.; VISSER, R.: "A transformation method for obtaining marker-free plants of a cross-pollinating and vegetatively propagated crop", NAT. BIOTECHNOL., vol. 21, 2003, pages 439 - 442
DEBLAERE, R.; BYTEBIER, B.; DE GREVE, H.; DEBOECK, F.; SCHELL, J.; VAN MONTAGU, M.; LEEMANS, J.: "Efficient octopine Ti-plasmid derived for Agrobacterium- mediated gene transfer", NUCL. ACIDS. RES., vol. 13, 1985, pages 4777 - 4788
G. PALLIDA, JOURNAL OFFICIEL DE L'UNION EUROPÉENNE DU 16/06/2007, 11 June 2007 (2007-06-11)
GARBARINO, J. E.; BELKNAP, W. R.: "Isolation of a Ubiquitin-Ribosomal Protein Gene (Ubi3) from Potato and Expression of Its Promoter in Transgenic Plants", PLANT MOL. BIOL., vol. 24, 1994, pages 119 - 127
GARBARINO, J. E.; OOSUMI, T.; BELKNAP, W. R.: "Isolation of a Polyubiquitin Promoter and Its Expression in Transgenic Potato Plants", PLANT PHYSIOL., vol. 109, 1995, pages 1371 - 1378
HAJDUKIEWICZ, P.; SVAB, Z.; MALIGA, P.: "The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation", PLANT MOL. BIOL., vol. 25, 1994, pages 989 - 994
HELLENS, R.; MULLINEAUX, P.; KLEE, H.: "A guide to Agrobacterium binary Ti vectors", TRENDS PLANT SCI., vol. 5, 2000, pages 446 - 451
JONES, M. O.; MANNING, K.; ANDREWS, J.; WRIGHT, C.; TAYLOR, I. B.; THOMPSON, A. J.: "The promoter from SIREO, a highly-expressed, root-specific Solanum lycopersicum gene, directs expression to cortex of mature roots", FUNCTIONAL PLANT BIOLOGY, vol. 35, 2008, pages 1224 - 1233
KARIMI, M.; BLEYS, A.; VANDERHAEGHEN, R.; HILSON, P.: "Building blocks for plant gene assembly", PLANT PHYSIOL., vol. 145, 2007, pages 1183 - 1191
KARIMI, M.; INZE, D.; DEPICKER, A.: "GATEWAYTM vectors for Agrobacterium- mediated plant transformation", TRENDS PLANT SCI., vol. 7, 2002, pages 193 - 195
KORT, J.; ROSS, H.; RUMPENHORST, J. H.; STONE, A. R.: "An international scheme for classifying pathotypes of potato cyst nematodes Globodera rostochiensis and G. pallida", NEMATOLOGICA, vol. 23, 1977, pages 333 - 339
KUANG, H. H.; WEI, F. S.; MARANO, M. R.; WIRTZ, U.; WANG, X. X.; LIU, J.; SHUM, W. P.; ZABORSKY, J.; TALLON, L. J.; RENSINK, W.: "The RI resistance gene cluster contains three groups of independently evolving, type 1 RI homologues and shows substantial structural variation among haplotypes of Solanum demissum", PLANT JOURNAL, vol. 44, 2005, pages 37 - 51
MEKSEM, K.; LEISTER, D.; PELEMAN, J.; ZABEAU, M.; SALAMINI, F.; GEBHARDT, C.: "A high-resolution map of the vicinity of the RI locus on chromosome V of potato based on RFLP and AFLP markers", MOL. GEN. GENET., vol. 249, 1995, pages 74 - 81
MUGNIÉRY, D.; FOUVILLE, D.; DANTEC, J. P; PELLÉ, R.; ROUSSELLE-BOURGEOIS, F.; ELLISSÈCHE, D.: "Résistance à Globodera pallida Pa2/3 chez Solanum sparsipilum", NEMATOLOGY, vol. 3, 2001, pages 619 - 626
NAKAGAWA, T.; ISHIGURO, S.; KIMURA, T.: "Gateway vectors for plant transformation", PLANT BIOTECHNOLOGY, vol. 26, 2009, pages 275 - 284
OPPERMAN, C. H.; TAYLOR, C. G.; CONKLING, M. A.: "Root-Knot Nematode-Directed Expression of a Plant Root-Specific Gene", SCIENCE, vol. 263, 1994, pages 221 - 223
PFAFFL, M. W.; HORGAN, G. W.; DEMPFLE, L.: "Relative expression software tool (REST (c)) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR", NUCL. ACIDS. RES., vol. 30, 2002
ROUPPE VAN DER VOORT, J. N. A. M.; LINDEMAN, W.; FOLKERTSMA, R.; HUTTEN, R. C. B.; OVERMARS, H.; VAN DER VOSSEN, E.; JACOBSEN, E.;: "A QTL for broad-spectrum resistance to cyst nematode species (Globodera ssp.) maps to a resistance gene cluster in potato", THEOR. APPL. GENET., vol. 96, 1998, pages 654 - 661
ROUPPE VAN DER VOORT, J. N. A. M.; VAN DER VOSSEN, E.; BAKKER, E.; OVERMARS, H.; VAN ZANDVOORT, P.; HUTTEN, R.; KLEIN LANKHORST, R: "Two additive QTLs conferring broad-spectrum resistance in potato to Globodera pallida are localized on resistance gene clusters", THEOR. APPL. GENET., vol. 101, 2000, pages 1122 - 1130
ROUPPE VAN DER VOORT, J.; WOLTERS, P.; FOLKERSTMA, R.; HUTTEN, R.; VAN ZANVOORT, P.; VINKE, H.; KANYUKA, K.; BENDAHMANE, A.; JACOB: "Mapping of the cyst nematode resistance locus Gpa2 in potato using a strategy based on co-migrating AFLP markers", THEOR. APPL. GENET., vol. 95, 1997, pages 874 - 880
SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning : A Labratory Manual", 1989
SCHORNACK, S.; BALLVORA, A.; GURLEBECK, D.; PEART, J.; GANAL, M.; BAKER, B.; BONAS, U.; LAHAYE, T.: "The tomato resistance protein Bs4 is a predicted non-nuclear TIR-NB-LRR protein that mediates defense responses to severely truncated derivatives of AvrBs4 and overexpressed AvrBs3", PLANT JOURNAL, vol. 37, 2004, pages 46 - 60
VAN OOIJEN, G.; VAN DEN BURG, H. A.; CORNELISSEN, B. J. C.; TAKKEN, F. L. W.: "Structure and function of resistance proteins in solanaceous plants", ANN. REV. PHYTOPATHOL., vol. 45, 2007, pages 43 - 72

Also Published As

Publication number Publication date
CA2786207A1 (fr) 2011-07-07
WO2011080329A3 (fr) 2011-08-25
US20120291157A1 (en) 2012-11-15
EP2519638A2 (fr) 2012-11-07
FR2954779A1 (fr) 2011-07-01
FR2954779B1 (fr) 2012-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dinh et al. RNA interference of effector gene Mc16D10L confers resistance against Meloidogyne chitwoodi in Arabidopsis and potato
AU2005336142B2 (en) A transgenic plant having enhanced drought tolerance
US20170260538A1 (en) Plant nitrate transporters and uses thereof
He et al. Production and evaluation of transgenic sweet orange (Citrus sinensis Osbeck) containing bivalent antibacterial peptide genes (Shiva A and Cecropin B) via a novel Agrobacterium-mediated transformation of mature axillary buds
MXPA06009608A (es) Plantas injertadas resistentes a enfermedades virales y metodos de produccion de las mismas.
US9732354B2 (en) Plant resistance gene
EP0412912B1 (fr) Plantes transgéniques appartenant à l'espèce Cucumis melo
MX2008015938A (es) Generacion de plantas con resistencia a patogenos mejorada.
CN114641572A (zh) 来自香蕉的野生近缘种的抗性基因的鉴定及其在控制巴拿马病中的用途
CA2872128C (fr) Gene dirigeant eg261 et ses orthologues et paralogues et leurs utilisations dans la resistance aux pathogenes chez les plantes
WO2005090578A1 (fr) Gene de resistance a sclerotinia
WO2004072109A1 (fr) Gene de resistance a aphis gossypii
KR20000029896A (ko) 선충및/또는진딧물에대한내성유전자
CN110714023B (zh) 番茄cti1基因在提高植物根结线虫抗性中的应用
JP4320399B2 (ja) 新規ネコブセンチュウ抵抗性遺伝子とその利用
US8569578B1 (en) Generating transgenic potatoes with novel resistance to potato cyst nematodes by silencing nematode parasitism genes of CLE -1 and CLE-4s
EP2519638A2 (fr) Gene gpav de resistance aux nematodes chez les solanacees
EP3193586B1 (fr) Nouveau gène de résistance à phytophthora
US20180127770A1 (en) Xa1-mediated resistance to tale-containing bacteria
US20150259700A1 (en) Transgenic Plants With RNA Interference-Mediated Resistance Against Root-Knot Nematodes
US11319553B2 (en) Compositions and methods conferring resistance to fungal diseases
WO2005116215A1 (fr) Amelioration de la resistance d'une plante a des insectes ravageurs
WO2004092372A1 (fr) Gene pouvant conferer une resistance au stress du aux sels
Yeckel Characterization of a soybean BAG gene and its potential role in nematode resistance
EP3935181A2 (fr) Maîtriser l'auto-incompatibilité chez les plantes diploïdes pour la sélection et la production d'hybrides par la modulation du ht

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10801176

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13519886

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2786207

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010801176

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 6443/DELNP/2012

Country of ref document: IN