WO2011078601A2 - 음식물 쓰레기 처리용 혼합 균주 및 이를 이용한 음식물 쓰레기 처리 방법 - Google Patents

음식물 쓰레기 처리용 혼합 균주 및 이를 이용한 음식물 쓰레기 처리 방법 Download PDF

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안태석
정다운
조안나
이은영
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    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/10—Bacillus licheniformis

Definitions

  • the present invention relates to a mixed strain for treating food waste, more specifically, has a high decomposition activity for cellulose, amylose, protein and fat at a wide temperature, pH and salt range, and can also decompose food waste having a high water content.
  • the present invention relates to a mixed strain for treating food waste, which can efficiently decompose food waste, and a method for treating food waste using the same.
  • landfill since food waste has a high water content, landfill itself is a source of leachate, and it is easily decayed during the collection and transportation process, which is likely to cause various problems such as odor. Since 2005, direct landfilling has been banned. Separate collection was established by prohibiting direct landfilling of food waste, but the average amount of food waste was 11,577 tons per day in 1999 due to population growth, income improvement and lifestyle changes. The amount increased.
  • Anaerobic digestion is advantageous compared to composting in that it targets wet biodegradable waste and recovers energy, but it also has the disadvantage of larger facility size and higher maintenance costs than composting.
  • annihilation type, fermentation type, and dry type were installed and operated as a representative method. It is pointed out that the supply and demand of water supply and the increase of price are the problems.
  • dry type food waste is put in, and hot air or a heater or an indirect steam heater is applied to a temperature of 70 to 120 ° C. to evaporate moisture and dried at the same time.
  • the effectiveness is inferior in the practical screen.
  • the high temperature aerobic method using heat energy generated by microbial reaction without additional heat supply from the outside has been studied as a method of purifying organic wastewater, but it is not applied in the field due to the lack of various control technologies.
  • This treatment method is the key to activate the thermophilic microorganisms, and there is no method to maintain the temperature continuously, so it has not reached the commercialization stage like various wastewater treatment methods currently used.
  • the representative microorganisms currently used in food waste composting and extinction methods are microbial species known to degrade cellulose, such as coryneform, nocardioform, and true filamentous bacteria. ), Such as actinomycetes. These bacteria play a major role in the breakdown of hydrocarbons, plant residues, and soil compost. Some microorganisms belonging to this group also degrade pesticides. Fibrous actinomycetes, primarily belonging to Streptomyces, produce compounds with a characteristic earthy odor, such as geosmin (Parker, 2001). Soil microorganisms can be classified based on (1) preference for readily available or difficult substrates with respect to organic matter treatment, and (2) concentrations of substrates they require.
  • Korean Patent No. 0580857 uses ATS-1 (KCTC 10637BP), a mixed strain of Bacillus smithii and thermophilic yeast, to maintain high decomposition activity even in high water content and to efficiently treat food waste. Is starting.
  • the present invention has a technical problem to provide a microbial strain for food waste treatment that has a high decomposition activity for cellulose, amylose, protein and fat at a wide temperature, pH and salinity range, which can efficiently decompose food waste. .
  • the present invention provides a mixed food waste treatment strain (KCTC 11585BP) including Brevibacillus borstelensis, Bacillus licheniformis and Kazachstania telluris .
  • KCTC 11585BP mixed food waste treatment strain
  • the present invention also provides a method for treating food waste using the mixed strain.
  • the mixed strain for treating food waste of the present invention includes Brevibacillus borstelensis, Bacillus licheniformis and Kazachstania telluris , and was deposited with the KCTC 11585BP at the Korea Biotechnology Research Institute microbial resource center on November 10, 2009.
  • the mixed strain for treating food waste is composed of bacteria Brevibacillus borstelensis and Bacillus licheniformis and the yeast Kazachstania telluris .
  • Brevibacillus borstelensis and Bacillus licheniformis both have fibrinolytic, starch, lipolytic, and proteolytic properties and can survive at 4% salinity.
  • Brevibacillus borstelensis is a Gram-positive bacterium that is isolated from soil and produces a thermophilic microorganism that produces D-stereospecific amino acid amidase, an enzyme that hydrolyzes the amino terminal amino acids of D-amino acid-containing amides.
  • thermophilic microorganism that produces D-stereospecific amino acid amidase, an enzyme that hydrolyzes the amino terminal amino acids of D-amino acid-containing amides.
  • Bacillus licheniformis is also a Gram-positive bacterium, mainly isolated from soil. It is a thermophilic bacterium that can grow at a high temperature of 50 °C or higher. It survives as spores in difficult environments and grows when it is in good condition.
  • Kazachstania telluris has the ability to degrade and ferment fibrin, starch and glucose with a suitable growth temperature of 37 to 45 ° C. Kazachstania telluris grows very fast and is known to ferment various carbohydrates using nitrates.
  • KCTC 11585BP mixed strain
  • Food waste treatment method may be carried out preferably at 30 to 60 °C, more preferably 40 to 50 °C.
  • the mixed food waste treatment strain of the present invention is composed of high temperature bacteria and high temperature yeast to efficiently treat food waste in the high temperature range.
  • the ability to maintain its decomposition activity even at high temperatures is one of the important factors to increase the temperature inside the processor due to the exothermic reaction during food waste decomposition.
  • processing at higher temperatures may not only cause food waste to decompose more actively, but also may serve to maintain the flora by preventing contamination by other microorganisms.
  • the mixed strain of the present invention may be formulated in various forms for convenience of transportation or storage.
  • it may be used in the form of a powder by lyophilization with a lyoprotectant, or may be mixed with a preservation carrier, adsorbed, dried and then solidified.
  • the cryoprotectant and the preservative carrier are not particularly limited as long as they are commonly used in the art, for example, glycerol, skim milk, honey, etc. may be used as the cryoprotectant, and diatomaceous earth, activated carbon, degreasing steel, etc. And the like can be used.
  • the mixed food waste treatment strain of the present invention (KCTC 11585BP) has a high decomposition activity for cellulose, amylose, protein and fat at a wide temperature, pH and salt range, and can also decompose food waste having a high water content so that various kinds of Food waste can be efficiently decomposed so food waste can be disposed of at low cost.
  • Yeast contained in the mixed strain (KCTC 11585BP) dilutes the characteristic odor during food breakdown, and performs alcohol fermentation to help break down food and increase the decomposition rate. Therefore, it is possible to dispose of food wastes in an environmentally friendly manner while solving the problem of environmental pollution, which is a problem in landfilling or incineration, which is generally used for food waste disposal.
  • 1 is a photograph taken by enlarging a magnification of 1,000 times Brevibacillus borstelensis under a microscope.
  • Figure 2 is a photograph taken by magnifying 1000 times under a microscope Bacillus licheniformis .
  • 5 is a graph showing the degradation rate of glucose 10mg / 100ml by yeast.
  • 6 is a graph showing the degradation rate of glucose 20mg / 100ml by yeast.
  • FIG. 7 is a graph showing a growth curve with temperature of nATS-AG.
  • Figure 8 is a graph showing the growth curve according to the temperature of the comparative strain.
  • FIG. 9 is a graph showing a growth curve according to the initial pH of nATS-AG.
  • 11 is a graph showing the growth curve according to the salinity of nATS-AG.
  • FIG. 13 is a photograph taken after magnification of a carrot 1000 times after 24 hours of strain treatment
  • FIG. 14 is a photograph taken after 48 hours. (Left: comparative strain, right: nATS-AG)
  • FIG. 15 is a photograph taken after magnification of a seaweed by a microscope 1000 times after 24 hours of strain treatment
  • FIG. 16 is a photograph taken after 48 hours. (Left: comparative strain, right: nATS-AG)
  • FIG. 17 is a photograph taken at 1,000 times magnification under a microscope after 24 hours of strain treatment
  • FIG. 18 is a picture taken after 48 hours. (Left: comparative strain, right: nATS-AG)
  • Amylase, cellulase, protease and lipase activity were examined to determine the substance resolution of the isolated strains.
  • Cellulose detection medium 1% CMC, 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.5% agar
  • amylase detection medium (0.3% beep extract, 2 % Soluble starch, 0.5% peptone, 0.5% NaCl, 1.5% agar
  • protease detection medium (0.5% pancreatic digest of casein, 0.25% yeast extract, 0.1% glucose, 1% skim milk) , 1.5% agar
  • lipase detection medium 1% Tween 80, 1% peptone, 0.5% NaCl, 0.01% CaCl 2 H 2 O, 1.5% agar
  • yeast was sampled at a prognosis treatment plant near Chuncheon, Gangwon-do, Korea. After concentration at the concentration was cultured. After incubation, the presence of yeast was confirmed under a microscope and purely separated in the same medium.
  • yeast plays a role of decomposing and absorbing the low molecular weight substance which is an organic decomposition product
  • the activity of yeast was measured by reducing sugar consumption rate. Reducing sugar concentration was measured by Somogyi method.
  • Glucose from three types of yeasts (Pichia angusta: Strain No. 17664) distributed from Kyobo (Centa tropicals ) and KCTC (Bio Resources Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) used in Kazachstania telluris , Korean Patent No. 0580857 Absorption decomposition rate of the was measured and compared (Figs. 4 to 6).
  • the obtained mixed strain was deposited on November 10, 2009 with the deposit number KCTC 11585BP at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology. (Hereinafter, the mixed strain is named “nATS-AG”.)
  • the growth curve of nATS-AG was determined by varying the temperature, initial pH conditions and salt concentration.
  • the medium was peptone 5 g / l, gelatin 10 g / l, yeast extract 2.5 g / l, soluble starch 5 g / l, malt extract 3 g / l, cellulose 3 g / l, beef extract 2 g / l, NaCl It consisted of 5 g / l.
  • the increase in population was expressed as a change in absorbance at 600 nm wavelength of the spectrophotometer.
  • ATS-1 which is a mixed strain of Bacillus smithii and thermophilic yeast disclosed in Korean Patent No. 0580857, was measured. Compared with AG.
  • nATS-AG was sufficiently grown even after 24 hours of incubation, and was grown at 45 ° C. At 37 ° C, Kazachstania telluris grew vigorously and showed much higher OD than other temperatures.
  • nATS-AG has a much higher growth rate at higher temperatures than the comparative strain.
  • Comparative strains showed higher growth rates only when the initial pH was 4, whereas nATS-AG showed higher growth rates than the comparative strains when the initial pH was 4, 6 and 7.
  • nATS-AG shows higher growth rate at various initial pHs, it can be seen that nATS-AG can be usefully used even when the pH conditions are lowered during the processing and food decomposition of foods having various pHs.
  • nATS-AG maintained growth even at 4% salinity.
  • the concentration of salt in Korean food is generally less than 3%, and it is considered that there is no problem due to salt considering that salt is removed by contact with water in the process of processing food waste.
  • the comparison strain increased the OD value after 24 hours, whereas nATS-AG showed a normal growth curve, indicating that nATS-AG can decompose food more effectively from the beginning of food treatment than the comparative strain. .
  • the degradation activity of the food of nATS-AG and the comparative strain was measured.
  • Rice, lettuce, pork was mixed 1: 1 by weight based on the experiment was used as a sample.
  • Food waste treatment process using microorganisms is usually made of food waste continuously at regular time intervals after inoculation of the strain, so it is important that the microbial flora maintains stable degradation activity. Therefore, first, the flora was stabilized for 24 hours before the experiment.
  • Initial bacterium production conditions are shown in Table 2 below.
  • nATS-AG is better in food degradation than the comparative strain and maintains its degradation activity for a long time.
  • Degradation activity was determined for foods that are known to be poorly degraded. The high degradation activity depends on whether the strain adheres well to foods and penetrates the tissues. To determine this, carrots, kelp and leeks were selected as non-degradable foods and treated with nATS-AG and comparative strains. After 48 hours and the food was stained with DAPI and photographed with a fluorescence microscope (BX-60, Olympus) to compare the results (Figs. 13-18).
  • nATS-AG was much more attached to food and compared to the comparative strain, and it was also found that the tissue penetrated well.
  • nATS-AG was inoculated in 5 L of medium (0.5% yeast extract, 1% peptone, 2% dextrose, 0.8% nutrient broth, 0.5% malt extract), and then 10% w / v skim milk as a cryoprotectant after incubation. was added and then lyophilized to recover 311.26 g of powder.
  • 0.1 g of the recovered lyophilized strain was suspended in 1 ⁇ PBS, plated in nutrient agar and potato dextrose agar medium, incubated for 24 hours in a 37 ° C incubator, and the survival rate was measured by counting the resulting colony.
  • Table 4 is as follows.

Abstract

본 발명은 음식물 쓰레기 처리용 혼합 균주에 관한 것으로 보다 상세하게는 넓은 온도, pH 및 염분 범위에서 셀룰로오스, 아밀로오스, 단백질 및 지방에 대한 높은 분해 활성을 갖고, 함수율이 높은 음식물 쓰레기도 분해할 수 있어서 효율적으로 음식물 쓰레기를 분해할 수 있는 음식물 쓰레기 처리용 혼합 균주 및 이를 이용한 음식물 쓰레기 처리 방법에 관한 것이다.

Description

음식물 쓰레기 처리용 혼합 균주 및 이를 이용한 음식물 쓰레기 처리 방법
본 발명은 음식물 쓰레기 처리용 혼합 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 넓은 온도, pH 및 염분 범위에서 셀룰로오스, 아밀로오스, 단백질 및 지방에 대한 높은 분해 활성을 갖고, 함수율이 높은 음식물 쓰레기도 분해할 수 있어서 효율적으로 음식물 쓰레기를 분해할 수 있는 음식물 쓰레기 처리용 혼합 균주 및 이를 이용한 음식물 쓰레기 처리 방법에 관한 것이다.
대한민국에서 1일 생활폐기물 발생량은 50,346톤(2007년 기준)에 달하고 있으며 지난 20여 년간 인구의 증가와 도시의 산업화, 도시 집중화로 인하여 폐기물 발생량이 급격히 증가하고 있다. 폐기물의 처리현황을 살펴보면 1991년에는 생활폐기물 중 89.2%를 매립처리하고, 7.9%만을 재활용하였으나, 2000년에는 쓰레기 종량제 실시 및 재활용정책에 힘입어 매립처리율이 47.0%로 줄어드는 한편 재활용률이 41.3%로 증가하고 있다.
이중에서도, 음식물쓰레기의 처리는 대부분 매립에 의존하고 있었으나, 음식물 쓰레기의 경우 함수량이 높기 때문에 매립하면 그 자체가 침출수 발생원이 되며, 수거 및 운반 과정에서 쉽게 부패하여 악취 등 제반 문제의 원인이 되기 쉬어 2005년부터 직매립을 금지시키고 있다. 음식물쓰레기의 직매립을 금지시킴에 따라 분리수거가 정착되기는 하였으나, 인구 증가, 소득향상 및 생활양식의 변화로 인하여 1999년 1일 평균 11,577톤 발생하던 음식물쓰레기의 양이 2007년 1일 평균 14,452톤으로 발생량이 증가하였다.
또 다른 처리 방법으로 소각하는 방법이 있으나, 많은 수분함량으로 인하여 소각효율을 저하시키기 때문에 처리비용이 비싸며 다이옥신 등의 환경유해성 물질이 배출되게 된다. 이러한 문제들을 해결하기 위하여 음식물쓰레기를 퇴비화, 사료화, 에너지화 등으로 재활용하는 방안이 본격적으로 진행되고 있다.
혐기성 소화는 습한 생분해성 폐기물을 대상으로 하고 에너지를 회수할 수 있는 점에서 퇴비화에 비해 유리하다고 볼 수 있으나, 또한 퇴비화에 비해 시설규모가 크고 유지비용이 더 많이 소요된다는 단점이 있다. 퇴비화 방식의 경우 소멸식, 발효식, 건조식 등이 대표적으로 설치, 운영되었는데, 수분 조절제(톱밥, 왕겨, 코코피드 등)와 미생물을 넣어 음식물쓰레기(유기물)를 분해하는 방식인 소멸식은 수분조절제의 수급이 어려운 점과 가격의 상승 등이 문제점으로 지적되고 있으며, 건조식의 경우 음식물쓰레기를 투입하고 열풍이나 히터 또는 간접 증기 가열장치로 70 내지 120℃의 온도를 가하여 수분을 증발시키고 동시에 건조된 내용물을 교반 작용에 의해 분쇄, 감량화시키는 방식이나 가열장치의 경제성을 고려해 볼 때 실용화면에서 실효성이 떨어진다. 반면에 외부로부터 추가적인 열 공급 없이 미생물반응에 의해서 생성되는 열에너지를 이용하는 고온호기성 방식은 유기폐수의 정화 처리방식의 한 방식으로 연구가 진행되었는데, 각종 제어 기술의 부족으로 인하여 현장에서 적용되지 못하고 있다. 이 처리방법은 고온성 미생물을 활성화시키는 것이 관건이며, 지속적으로 온도를 유지시키는 방법이 없어 현재 이용되는 각종 폐수처리방법처럼 상용화 단계까지는 도달하지 못하고 있다.
이러한 반응열을 이용하는 공정들의 장점은 고온에서 반응이 진행되기 때문에 유기물 제거속도가 빠르고, 유기물 부하에 대한 안정적인 처리효율을 나타내며, 고온이므로 질산화가 일어나지 않아 공급된 산소의 효율적인 이용이 가능하고 안정된 처리물을 얻을 수 있다는 점이다.
이중 퇴비화와 소멸화 방식의 경우 톱밥과 같은 팽창제(bulking agent)를 필요로 하게 되는데, 그만큼 장치의 부피가 커지기 때문에 쓰레기 처리비용이 높다. 또한, 퇴비화 과정 중에 대부분의 유기물은 이산화탄소, 암모니아, 호기 및 혐기성 상태에서 생성되는 메르캅탄, 물, 미생물세포, 열에너지, 그리고 부식질(humus)로 전환되며, 이중 암모니아와 메르캅탄은 심한 악취를 발생하기 때문에 이를 제거하기 위한 탈취탑과 백금촉매 사용의 불편비용을 초래한다. 최근에는 이러한 부가적인 비용을 줄이기 위해 배기가스를 재순환 시키는 방식을 도입한 바 있으나, 여전히 악취제거를 위한 백금촉매를 일반적으로 사용하고 있어 근본적인 비용절감은 이루어지지 않고 있다.
현재 음식물쓰레기 퇴비화 및 소멸화 방식에서 사용하고 있는 대표적인 미생물은, 셀룰로오스를 분해할 수 있는 미생물 종으로 알려져 있는 미생물 종으로서 코리네형(coryneform), 노카디오형(nocardioform), 진정 섬유상 세균(true filamentous bacteria), 방선균류(actinomycetes)와 같은 것이 있다. 이러한 세균은 탄화수소, 식물의 잔재, 그리고 토양퇴비의 분해에 있어 주요 역할을 담당한다. 이러한 그룹에 속하는 일부 미생물은 또한 살충제를 분해한다. 주로 Streptomyces에 속하는 섬유상 방선균류는 특징적인 땅 냄새를 주는 지오스민(geosmin) 같은 냄새가 나는 화합물을 생성한다(Parker, 2001). 토양미생물은 유기물 처리에 관하여 (1) 쉽게 사용할 수 있거나 어려운 기질에 대한 선호도, (2) 이들이 필요로 하는 기질의 농도에 기초하여 분류될 수 있다. 고영양 수준에서 슈도모나스균(Pseudomonas)과 같은 미생물은 당이나 아미노산과 같은 쉽게 사용할 수 있는 기질에 빠르게 반응한다. 토착형은 자연적 유기물을 최대한 이용하는 경향이 있다. 이들은 아트로박터(Arthrobacter)와 많은 토양 방선균류(actinomycetes)와 같은 것이다. 방선균류 미생물의 경우 함수율이 70% 이하에서 성장이 빠르기 때문에 기존에 개발된 음식물쓰레기의 퇴비화 및 소멸화 방식은 모두 함수율을 40 내지 60% 사이로 맞추도록 권장하고 있다. 그러나 이러한 함수율 조절은 대규모 쓰레기 처리장에서는 일부 가능하겠으나, 가정이나 식품접객업소, 대형 유통 시장과 같은 곳에서는 대부분 불가능하기 때문에 효율적인 쓰레기 처리의 가장 큰 실패 원인이라 할 수 있다. 또한 함수율을 낮추기 위하여서는 열을 가하는 등 많은 에너지 소모가 유발될 수 있고, 함수율을 낮은 상태로 유지하여야 하므로 분해 산물을 제거하기 위한 살수 장치를 제대로 사용할 수 없다는 단점이 있다.
대한민국 특허 제0580857호에서는 바실러스 스미스아이(Bacillus smithii) 및 고온성 효모의 혼합균주인 ATS-1(KCTC 10637BP)를 사용하여 함수율이 높은 상태에서도 높은 분해 활성을 유지하며 음식물 쓰레기를 효율적으로 처리하는 방법을 개시하고 있다.
그러나 음식물 쓰레기는 그 특성상 다양한 pH 및 염도를 나타내기에 이를 더 효율적으로 처리하기 위하여 넓은 온도, pH 및 염도 범위에서도 효율적으로 음식물 쓰레기를 분해할 수 있는 미생물 균주의 개발이 강하게 요구되고 있다.
참고문헌
Parker M. M., Block Biology of Microorganisms (Ninth Edition), 2001, New Jersey: Prentice Hall
따라서 본 발명은 넓은 온도, pH 및 염분 범위에서 셀룰로오스, 아밀로오스, 단백질 및 지방에 대한 높은 분해 활성을 가져서 효율적으로 음식물 쓰레기를 분해할 수 있는 음식물 쓰레기 처리용 미생물 균주를 제공하는 것을 그 기술적 과제로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 Brevibacillus borstelensis, Bacillus licheniformis 및 Kazachstania telluris를 포함하는 음식물 쓰레기 처리용 혼합 균주(KCTC 11585BP)를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 혼합 균주를 사용하여 음식물 쓰레기를 처리하는 방법을 제공한다.
이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 음식물 쓰레기 처리용 혼합 균주는 Brevibacillus borstelensis, Bacillus licheniformis 및 Kazachstania telluris를 포함하며, 2009년 11월 10일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁번호 KCTC 11585BP로 기탁되었다.
본 발명에서 음식물 쓰레기 처리용 혼합 균주는 세균인 Brevibacillus borstelensis 및 Bacillus licheniformis와 효모인 Kazachstania telluris로 구성된다.
Brevibacillus borstelensis 및 Bacillus licheniformis는 모두 섬유소 분해, 녹말분해, 지방 분해, 단백질 분해능을 가지고 있고, 염분 4%에서도 생존을 유지할 수 있다. Brevibacillus borstelensis는 그람 양성 균으로 주로 토양에서 분리되며 D-아미노산 함유 아미드의 아미노 말단 아미노산을 가수분해하는 효소인 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 (D-stereospecific amino acid amidase)를 생산하는 고온성 미생물로 알려져 있다.
Bacillus licheniformis 역시 그람 양성 균으로 주로 토양에서 분리된다. 50℃ 이상의 고온에서 자랄 수 있는 고온성 균이며 어려운 환경에서는 포자로 생존하며 상태가 좋을 때 성장하는 특징을 가지고 있다.
Kazachstania telluris는 적정 생장 온도가 37 내지 45℃로, 섬유소, 녹말 및 포도당을 분해 발효하는 능력이 있다. Kazachstania telluris는 매우 빨리 자라며, 질산염을 이용하며 다양한 탄수화물을 발효시키는 것으로 알려져 있다.
Brevibacillus borstelensis, Bacillus licheniformis 및 Kazachstania telluris에 대하여 아직까지 건강 및 환경에 유해할 수 있다는 것을 보고한 문헌은 없다. 또한 이들은 국제생물자원센터(ATCC)에서 생물안전등급(biosafety level)을 1로서 분류한 것으로 비병원성 박테리아와 효모로 분류되어 있다. 따라서 본 발명의 음식물 쓰레기 처리용 혼합 균주에 포함되는 균주들은 모두 안전한 것으로 인체나 환경에 대한 문제가 없다.
본 발명의 다른 측면에 따르면 본 발명의 혼합 균주(KCTC 11585BP)를 사용하여 음식물 쓰레기를 처리하는 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 음식물 쓰레기 처리 방법은 바람직하게는 30 내지 60℃, 더 바람직하게는 40 내지 50℃에서 수행될 수 있다. 본 발명의 음식물 쓰레기 처리용 혼합 균주는 고온성 세균 및 고온성 효모로 구성됨으로써 상기 높은 온도 범위에서 음식물 쓰레기를 효율적으로 처리할 수 있다. 높은 온도에서도 그 분해 활성을 유지할 수 있는 것은 음식물 쓰레기 분해시의 발열 반응으로 인하여 처리기 내부의 온도가 상승하기에 중요한 요소 중인 하나이다. 또한 높은 온도에서 처리하는 것은 음식물 쓰레기 분해가 보다 활발하게 일어날 수 있을 뿐만 아니라 다른 미생물에 의한 오염을 막아 균총(flora)을 계속적으로 유지할 수 있는 역할도 할 수 있다.
본 발명의 혼합 균주(KCTC 11585BP)는 운반이나 보관 등의 편의를 위하여 다양한 형태로 제제화될 수 있다. 예를 들면, 동결보호제와 함께 동결건조하여 분말의 형태로 사용될 수 있고, 보존 담체와 혼합하여 흡착시킨 후 건조시켜 고체화하여 사용할 수도 있다. 상기 동결보호제 및 보존 담체는 당 분야에서 통상적으로 사용되는 것이면 그에 따른 특별한 제한은 없고, 예를 들면 동결보호제로는 글리세롤, 탈지유, 꿀 등이 사용될 수 있고, 보존 담체로는 규조토, 활성탄, 탈지강 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 음식물 쓰레기 처리용 혼합 균주(KCTC 11585BP)는 넓은 온도, pH 및 염분 범위에서 셀룰로오스, 아밀로오스, 단백질 및 지방에 대한 높은 분해 활성을 갖고, 함수율이 높은 음식물 쓰레기도 분해할 수 있어서 다양한 종류의 음식물 쓰레기를 효율적으로 분해할 수 있기에 저비용으로 음식물 쓰레기를 처리할 수 있다. 혼합 균주(KCTC 11585BP)에 포함된 효모는 음식물 분해시 특유의 악취를 희석하고, 알코올 발효를 수행하여 음식물 분해를 도와 분해율을 높인다. 따라서 일반적으로 음식물 쓰레기 처리에 사용되는 매립이나 소각 등의 방법에서 문제가 되는 환경 오염 문제를 해결하면서 친환경적으로 음식물 쓰레기를 처리할 수 있다.
도 1은 Brevibacillus borstelensis를 현미경으로 1,000배 확대하여 촬영한 사진이다.
도 2는 Bacillus licheniformis를 현미경으로 1,000배 확대하여 촬영한 사진이다.
도 3은 Kazachstania telluris를 현미경으로 1,000배 확대하여 촬영한 사진이다.
도 4는 효모에 의한 글루코스 5mg/100㎖의 분해율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 효모에 의한 글루코스 10mg/100㎖의 분해율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 효모에 의한 글루코스 20mg/100㎖의 분해율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 nATS-AG의 온도에 따른 성장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 8은 비교 균주의 온도에 따른 성장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 9는 nATS-AG의 초기 pH에 따른 성장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 10은 비교 균주의 초기 pH에 따른 성장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 11은 nATS-AG의 염도에 따른 성장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 12는 비교 균주의 염도에 따른 성장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 13은 균주 처리 24시간 후에 당근을 현미경으로 1,000배 확대하여 촬영한 사진이고, 도 14는 48시간 후에 촬영한 사진이다. (좌측: 비교 균주, 우측: nATS-AG)
도 15는 균주 처리 24 시간 후에 다시마를 현미경으로 1,000배 확대하여 촬영한 사진이고, 도 16은 48시간 후에 촬영한 사진이다. (좌측: 비교 균주, 우측: nATS-AG)
도 17은 균주 처리 24 시간 후에 부추를 현미경으로 1,000배 확대하여 촬영한 사진이고, 도 18은 48시간 후에 촬영한 사진이다. (좌측: 비교 균주, 우측: nATS-AG)
이하에서 본 발명을 실시예에 의하여 구체적으로 설명한다. 그러나 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.
미생물의 분리 및 선별
고온에서 서식하는 단백질, 섬유소, 전분, 지방 분해능이 뛰어난 균주를 분리하기 위하여 유기물 분해가 활발히 일어나는 낙엽 퇴비화 지점에서 시료를 채취하였다. 채취한 토양 및 부식질 시료 1g을 각각 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, 1%), 전분(starch, 1%), 펩톤(peptone, 1%) 및 올리브 오일(1%)을 함유한 액체 배지에 넣은 후 45℃, 60℃ 및 70℃에서 24시간 농화 배양(enrichment culture)하였다. 이 상등액을 고체 배지로 옮겨 평판도말 후 3차 도말을 거쳐 콜로니(colony)의 크기와 형태가 서로 다른 콜로니를 선발한 다음 영양배지에 접종하여 48시간 배양 후 OD600으로 성장을 확인하였다.
분리된 균주의 물질 분해능을 측정하기 위하여 아밀라아제(amylase), 셀룰라아스(cellulase), 프로티아제(protease) 및 리파아제(lipase) 활성을 조사하였다. 셀룰로스 검출배지(1% CMC, 1% 트립톤(tryptone), 0.5% 효모추출물(yeast extract), 1% NaCl, 1.5% agar), 아밀라아제 검출배지(0.3% 비프 익스트렉트(beef extract), 2% 가용성녹말(soluble starch), 0.5% 펩톤, 0.5% NaCl, 1.5% agar), 프로티아제 검출배지(0.5% pancreatic digest of casein, 0.25% 효모추출물, 0.1% 글루코오스, 1% 탈지유(skim milk), 1.5% agar) 및 리파아제 검출배지(1% Tween 80, 1% 펩톤, 0.5% NaCl, 0.01% CaCl2H2O, 1.5% agar)에 형성된 콜로니 중에서 투명환(clear zone)의 크기로 활성도를 파악하였다. 활성이 우수한 균주를 선별 후 이들 중 최적의 조합을 보이는 2 개 균주를 선택하여 염기분석을 실시함으로써 동정하였다. 효모는 강원도 춘천시 인근 예지 처리장에서 시료를 채취하여 YM배지(조성: 효모추출물 0.3%, 맥아추출물(Malt Extract) 0.3%, 펩톤 0.5%, 덱스트로스 1%)에 항생제(ampicillin)를 4㎍/ml의 농도로 넣어준 후 농화 배양하였다. 배양 후 현미경으로 효모의 존재를 확인하고 같은 배지에서 순수 분리하였다.
각 균주들의 물질 분해능은 다음의 방법으로 평가되었다. 배양 후 나타나는 콜로니 주위의 환 크기를 측정하였고, 환의 크기가 6 ㎜ 이상은 +++, 3 내지 5 ㎜는 ++, 3 ㎜ 미만은 +로 등급을 나누었다.
효모의 물질 분해능은 환원당 소모율로 평가되었다. 환원당 농도는 소모기(Somogyi) 방법으로 측정하였다.
미생물의 동정
선택된 세균의 16S rRNA 염기서열 분석을 한 다음 이 결과를 NCBI의 BLAST와 비교한 결과, 각각 Brevibacillus borstelensis(98% 일치), Bacillus licheniformis (99% 일치)로 확인되었다. 효모는 18S rRNA 염기서열 분석을 한 다음 이 결과를 NCBI의 BLAST와 비교한 결과, Kazachstania telluris (100% 일치)로 확인되었다.
물질 분해능의 평가
선택된 세균 균주의 측정된 각 기질에 대한 활성도는 다음의 표 1과 같다.
표 1
Figure PCTKR2010009274-appb-T000001
효모는 유기물 분해 산물인 저분자 물질을 분해 흡수하는 역할을 하므로 효모의 활성은 환원당 소모율로 측정하였다. 환원당 농도는 소모기(Somogyi) 방법으로 측정하였다. Kazachstania telluris, 대한민국 특허 제0580857호에서 사용된 고온성 효모(Candida tropicals) 및 KCTC (한국생명공학연구원 생물자원센터)로부터 분양 받은 고온효모(Pichia angusta: 균주번호 17664) 3종 효모의 포도당(glucose)의 흡수 분해율을 측정, 비교하였다 (도 4 내지 6).
도 4 내지 6으로부터 볼 수 있듯이 모든 농도에서 환원당 소모율이Kazachstania telluris와 대한민국 특허 제0580857호에서 사용된 고온성 효모에서 비슷하게 나왔으며, KCTC에서 분양받은 균주(Pichia angusta)의 결과값은 그보다 낮게 나왔음을 확인할 수 있었다.
혼합 균주의 제조
Brevibacillus borstelensis 및 Bacillus licheniformis의 stock을 선별배지(Nutrient Broth)에 1%로 넣어준 후 45℃ 배양기에서 24시간 동안 교반하면서 배양하였고, Kazachstania telluris는 stock을 선별배지(YM Broth)에 1%로 넣어준 후 37℃ 배양기에서 24시간 동안 교반하면서 배양하였다. 세균 배양액 각 400㎖을 효모 배양액 200㎖과 혼합하여 1,000㎖의 혼합 균주를 제조하였다.
얻어진 혼합 균주는 2009년 11월 10일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁번호 KCTC 11585BP로 기탁되었다. (이하에서 상기 혼합 균주를 “nATS-AG”으로 명명한다.)
실험예 1: 온도, 초기 pH 및 염분의 농도에 따른 성장률 측정
실험 방법
온도, 초기 pH 조건 및 염분의 농도를 달리하여 nATS-AG의 성장 곡선을 구하였다. 배지는 펩톤 5g/ℓ, 젤라틴 10 g/ℓ, 효모추출물 2.5 g/ℓ, 가용성녹말 5 g/ℓ, 맥아추출물 3 g/ℓ, 셀룰로오스 3 g/ℓ, 비프 익스트렉트 2 g/ℓ, NaCl 5 g/ℓ 로 구성하였다. 개체수의 증가는 분광광도계(spectrophotometer)의 600 nm 파장에서 흡광도의 변화로 표시하였다.
상기와 동일한 방법으로 대한민국 특허 제0580857호에서 개시하고 있는 바실러스 스미스아이(Bacillus smithii) 및 고온성 효모의 혼합균주인 ATS-1(이하에서 “비교 균주”라 한다)의 성장률을 측정한 다음 nATS-AG와 비교하였다.
실험예 1-1: 온도에 따른 성장률
상기의 실험 방법으로 37℃, 45℃, 60℃ 및 70℃에서의 nATS-AG 및 비교 균주의 성장률을 측정 후 그 결과를 각각 도 7 및 도 8에 나타내었다.
nATS-AG는 비교 균주와는 달리 배양 시작 24시간 후에도 성장이 충분히 이루어지고 있었고, 45℃에서도 성장이 이루어지고 있었다. 37℃에서는 Kazachstania telluris가 왕성하게 성장하여 다른 온도보다 훨씬 높은 OD 값을 나타내었다.
상기 결과로부터 nATS-AG가 비교 균주에 비하여 고온에서의 성장률이 훨씬 뛰어나다는 것을 알 수 있었다.
실험예 1-2: 초기 pH에 따른 성장률
상기의 실험 방법으로 pH 3, 4, 5, 6 및 7의 초기 pH에서 nATS-AG 및 비교 균주의 성장률을 측정 후 그 결과를 각각 도 9 및 도 10에 나타내었다.
비교 균주는 초기 pH가 4인 경우에만 높은 성장률을 보인 반면 nATS-AG는 초기 pH가 4, 6, 7인 조건에서 비교 균주보다 뛰어난 성장률을 보였다. 균들이 음식물을 분해시 유기산이 생성되면서 pH가 낮아지는데 일반적으로 pH 4 이하로는 내려가지 않는다. nATS-AG는 다양한 범위의 초기 pH에서 높은 성장률을 보이기에 다양한 pH를 갖는 음식물의 처리 및 음식물 분해 과정에서 pH 조건이 낮아져도 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 1-3: 염도에 따른 성장률
상기의 실험 방법으로 0%, 1%, 2%, 3% 및 4%의 염도에서 nATS-AG 및 비교 균주의 성장률을 측정 후 그 결과를 각각 도 11 및 도 12에 나타내었다.
nATS-AG는 염도 4%에서도 성장을 유지하였다. 우리나라 음식에 포함되는 소금의 농도는 일반적으로 3% 이하이고, 음식물 쓰레기 처리과정에서 물과 접촉하여 소금기가 제거되는 것을 고려하면 염분으로 인한 문제는 없을 것으로 파악되었다. 또한, 비교 균주는 24시간이 경과 후 OD 값이 증가하는 반면에 nATS-AG는 정상적인 성장 곡선을 보여서 nATS-AG가 비교 균주에 비하여 음식물 처리 초기부터 보다 효과적으로 음식물을 분해할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
실험예 2: 분해 활성 측정
실험예 2-1: 소규모 처리
nATS-AG 및 비교 균주의 음식물의 분해 활성을 측정하였다. 쌀밥, 상추, 돼지고기가 중량 기준으로 1:1:1로 혼합된 것을 시료로 사용하여 실험하였다. 미생물을 이용한 음식물 쓰레기 처리 과정은 균주를 접종 후 음식물 쓰레기가 일정한 시간 간격으로 계속적으로 투입되며 이루어지는 경우가 일반적이기에 미생물 균총이 안정적으로 분해 활성을 계속 유지하는 것이 중요하다. 따라서 먼저 실험 전 24시간 동안 균총을 안정화시켰다. 초기 균총 제작 조건을 다음의 표 2와 같다.
표 2
Figure PCTKR2010009274-appb-T000002
그 다음 6시간 간격으로 500g의 음식물을 계속적으로 넣어주면서 각 시간대에 따른 분해율을 누적된 총투입량(건조중량) - 최종잔류음식물량(건조중량)/누적된 총투입량(건조중량) × 100(%)로 계산하였고 그 평균을 구하였다. 그 결과를 다음의 표 3에 나타내었다.
표 3
Figure PCTKR2010009274-appb-T000003
상기 표 3의 결과로부터 음식물에 대해 높은 분해 활성을 가진다고 알려진 비교 균주에 비하여 nATS-AG가 더 높은 분해 활성을 나타냄으로써 보다 효율적으로 음식물 쓰레기를 처리할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 2-2: 대규모 처리
nATS-AG가 많은 양의 음식물 쓰레기를 장시간에 걸쳐 효율적으로 분해할 수 있는지에 대하여 알아보기 위한 실험을 수행하였다. 강원대학교 학생식당에서 배출된 음식물 쓰레기 1,000 g을 음식물 쓰레기 처리기에 투입한 다음 nATS-AG 및 비교 균주 10㎖을 각각 접종하였다. 12 시간 후에 음식물 쓰레기 1,000 g을 추가로 투입한 다음부터 8시간 및 16시간 주기로 84시간까지 음식물 쓰레기 1,000 g을 추가로 투입하였다. 20시간, 44시간, 68시간 및 96시간에는 음식물 쓰레기 투입에 앞서 분해 후 남아있는 음식물 쓰레기의 중량을 측정하여 감량율을 다음의 식으로 계산하였다.
(1 - 음식물 쓰레기 잔류량/음식물 쓰레기 투입량) × 100 (%)
그 결과는 다음의 표 4에 나타내었다.
표 4
Figure PCTKR2010009274-appb-T000004
상기 표 4의 결과로부터 볼 수 있듯이, nATS-AG가 비교 균주에 비하여 더 음식물 분해를 잘하고, 그 분해 활성을 장시간에 걸쳐 잘 유지함을 알 수 있었다.
실험예 3: 난분해성 음식물의 분해 활성
분해가 잘 되지 않은 것으로 알려진 음식물에 대한 분해 활성을 측정하였다. 분해 활성이 높기 위하여는 균주가 음식물에 잘 부착되어 그 조직에 침투를 잘 하는지 여부에 달려있기에 이를 알아보기 위하여 난분해성 음식물로 당근, 다시마 및 부추를 선택하여 nATS-AG 및 비교 균주를 처리 후 24시간 및 48시간 후에 음식물을 DAPI로 염색한 다음 형광 현미경(BX-60, Olympus)으로 촬영하여 그 결과를 비교하였다(도 13 내지 18).
도 13 내지 18로부터 볼 수 있듯이 nATS-AG가 비교 균주에 비하여 음식물에 훨씬 더 부착이 잘 되고, 조직으로 침투도 잘하는 것을 알 수 있었다.
실험예 4: 균주의 동결건조 및 생존율 실험
nATS-AG를 5ℓ의 배지(효모추출물 0.5%, 펩톤 1%, 덱스트로스 2%, nutrient broth 0.8%, 맥아 추출물 0.5%)에 접종하여 배양 후 동결보호제로 탈지유(skim milk) 10% w/v를 첨가한 다음 동결건조하여 311.26 g의 분말을 회수하였다. 회수된 동결건조 균주 0.1 g을 1× PBS에 현탁하여 nutrient agar 및 potato dextrose agar 배지에 평판도말을 한 후 37℃ 배양기에서 24시간 배양한 다음 생성된 colony를 계수하여 생존율을 측정하였고 그 결과는 다음의 표 4와 같다.
표 5
Figure PCTKR2010009274-appb-T000005
상기 표 5의 결과로부터 볼 수 있듯이, 본 발명의 nATS-AG가 동결건조 후에도 비교적 높은 생존율을 유지함을 알 수 있었다.
Figure PCTKR2010009274-appb-I000001

Claims (3)

  1. 기탁번호 KCTC 11585BP로 기탁된 음식물 쓰레기 처리용 Brevibacillus borstelensis, Bacillus licheniformis 및 Kazachstania telluris의 혼합 균주.
  2. 기탁번호 KCTC 11585BP로 기탁된 Brevibacillus borstelensis, Bacillus licheniformis 및 Kazachstania telluris의 혼합 균주를 사용하여 음식물 쓰레기를 처리하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 음식물 쓰레기 처리가 30 내지 60℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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