WO2011077958A1 - コラーゲン繊維の集合体およびその製造方法 - Google Patents

コラーゲン繊維の集合体およびその製造方法 Download PDF

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WO2011077958A1
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collagen
solution
aggregate
spinning
collagen fibers
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真希子 平岡
浩和 西村
文彦 梶井
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東洋紡績株式会社
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    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F4/00—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01D—MECHANICAL METHODS OR APPARATUS IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS
    • D01D5/00—Formation of filaments, threads, or the like
    • D01D5/0007—Electro-spinning
    • D01D5/0015—Electro-spinning characterised by the initial state of the material
    • D01D5/003—Electro-spinning characterised by the initial state of the material the material being a polymer solution or dispersion
    • D01D5/0038—Electro-spinning characterised by the initial state of the material the material being a polymer solution or dispersion the fibre formed by solvent evaporation, i.e. dry electro-spinning
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D04—BRAIDING; LACE-MAKING; KNITTING; TRIMMINGS; NON-WOVEN FABRICS
    • D04H—MAKING TEXTILE FABRICS, e.g. FROM FIBRES OR FILAMENTARY MATERIAL; FABRICS MADE BY SUCH PROCESSES OR APPARATUS, e.g. FELTS, NON-WOVEN FABRICS; COTTON-WOOL; WADDING ; NON-WOVEN FABRICS FROM STAPLE FIBRES, FILAMENTS OR YARNS, BONDED WITH AT LEAST ONE WEB-LIKE MATERIAL DURING THEIR CONSOLIDATION
    • D04H1/00—Non-woven fabrics formed wholly or mainly of staple fibres or like relatively short fibres
    • D04H1/70—Non-woven fabrics formed wholly or mainly of staple fibres or like relatively short fibres characterised by the method of forming fleeces or layers, e.g. reorientation of fibres
    • D04H1/72—Non-woven fabrics formed wholly or mainly of staple fibres or like relatively short fibres characterised by the method of forming fleeces or layers, e.g. reorientation of fibres the fibres being randomly arranged
    • D04H1/728—Non-woven fabrics formed wholly or mainly of staple fibres or like relatively short fibres characterised by the method of forming fleeces or layers, e.g. reorientation of fibres the fibres being randomly arranged by electro-spinning

Definitions

  • the present invention relates to an aggregate of collagen fibers and a method for producing the same.
  • films and fibers made of biodegradable polymers have been expected to be applied to cell scaffolding materials and medical materials.
  • Examples of medical materials include animal protein collagen, polysaccharides hyaluronic acid, chitin, chitosan, carboxymethylcellulose, dextrin, aliphatic polyester polyglycolic acid, glycolic acid / L-lactic acid copolymer, poly-L -Lactic acid, L-lactic acid / ⁇ -caprolactone copolymer, poly-p-dioxanone, and other synthetic polymers such as polyvinylpyrrolidone and polyethylene glycol have been used.
  • Collagen in particular has a feature of excellent cell adhesion.
  • the present invention was invented in view of the current state of the prior art, and the object thereof is an aggregate of collagen fibers having a collagen structure substantially maintaining a collagen structure, and having a fiber diameter of 10 nm or more and 1 ⁇ m or less. It is to provide a manufacturing method.
  • the present inventors have found that when a collagen solution prepared using an organic acid aqueous solution that does not contain a halogen in the molecular structure is subjected to charge spinning, the fiber diameter is 10 nm to 1 ⁇ m.
  • the present inventors have found that a collagen fiber assembly composed of collagen fibers substantially maintaining the collagen structure is obtained, and the present invention has been achieved.
  • the method for producing an aggregate of collagen fibers according to the present invention comprises a step of preparing a collagen solution by dissolving collagen in an organic acid aqueous solution that does not contain halogen in the molecular structure, and spinning by using the collagen solution by a charged spinning method. Including the step of:
  • the aggregate of collagen fibers according to the present invention is characterized in that the fiber diameter is 10 nm or more and 1 ⁇ m or less.
  • FIG. 1 is an electron micrograph of the collagen fiber assembly obtained in Example 1.
  • FIG. 2 is an electron micrograph of the collagen fiber assembly obtained in Example 3.
  • FIG. 3 is an electron micrograph of the collagen fiber assembly obtained in Example 4.
  • FIG. 4 is a circular dichroism dispersometer measurement result of the collagen fiber aggregate obtained in Example 4.
  • Collagen Solution Preparation Step collagen is dissolved in an organic acid aqueous solution that does not contain halogen in the molecular structure to prepare a collagen solution.
  • a fiber assembly composed of collagen fibers having a substantially maintained collagen structure can be obtained by carrying out charge spinning using an organic acid aqueous solution containing no halogen in the molecular structure.
  • a collagen solution is prepared using a fluorine-based organic solvent such as TFE or HFIP, and charged spinning is performed using this solution.
  • fluorine-based organic solvents such as TFE and HFIP have fluorine atoms in their molecular structure, they do not correspond to organic acid aqueous solutions that do not contain halogen in the molecular structure.
  • these fluorinated organic solvents are used, they may remain in the collagen fiber assembly, and depending on the intended use, they may affect the human body. In addition, they can be dissolved in a fluorinated organic solvent and charged.
  • the type of water contained in the organic acid aqueous solution not containing halogen in the molecular structure used in the present invention is not particularly limited.
  • tap water, well water, distilled water, purified water, pure water, ultrapure water, etc. can be used, and since they are low in impurities and suitable for the charged spinning method, distilled water, purified water, pure water, ultrapure water, etc. Water is preferred, and distilled water and purified water are more preferred.
  • the solvent for dissolving collagen may contain a solvent having good volatility such as ethanol, 1-propanol, 2-propanol and the like that is harmless to the human body as long as it does not inhibit collagen dissolution.
  • a mixed solvent of an aqueous organic acid solution and an alcohol is particularly preferable because it can easily stabilize the higher-order structure of collagen and can evaporate easily during charge spinning to obtain finer collagen fibers.
  • the content of alcohol or the like is preferably 1 wt% or more and 30 wt% or less with respect to the organic acid aqueous solution. If the said content rate is 1 wt% or more, a solvent will evaporate easily during spinning and it will become easy to obtain a better quality collagen fiber aggregate.
  • the content is too high, collagen may be difficult to dissolve, so 30 wt% or less is preferable.
  • As the said ratio 5 wt% or more is more preferable, 7 wt% or more is further more preferable, 25 wt% or less is more preferable, and 20 wt% or less is further more preferable.
  • organic acid contained in the aqueous organic acid solution used in the present invention those which do not contain a halogen in the molecular structure are preferred, like the solvent.
  • the organic acid is not particularly limited, and formic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, lactic acid, acetic acid, and the like can be used. Two or more of these may be mixed.
  • Inorganic acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid are not preferable because they are harmful to the human body. Further, in the case of hydrochloric acid, the chlorine ion Cl 2 ⁇ is heavy, so that it does not fly during spinning and may remain in the resulting fiber.
  • the concentration of these organic acids in the organic acid aqueous solution is preferably 5 to 99 wt%, more preferably 40 to 95 wt%, and still more preferably 50 to 90 wt%.
  • acetic acid is preferable as the organic acid not containing halogen in the molecular structure, and it is preferable to use an acetic acid aqueous solution or an acetic acid buffer as the organic acid aqueous solution.
  • the concentration of acetic acid in the acetic acid aqueous solution is preferably 5 to 99 wt%. When the concentration of acetic acid is less than 5 wt%, the viscosity becomes high and spinning may be difficult. If it exceeds 99 wt%, collagen may not be dissolved and spinning may be difficult.
  • the concentration is more preferably 40 to 95 wt%, still more preferably 50 to 90 wt%.
  • the collagen used in the present invention is, for example, type I, type II, type III, type IV, type V, type VI, type VII, type VIII, type IX, type X, type XI, type XII, type XIII, XIV.
  • Type, XV type, XVI type, XVII type, XVIII type and XIX type collagen are type I, type II and type III. Many of these types are distributed in the living body and can be easily obtained.
  • the structure of the collagen used in the present invention is not particularly limited, but it is desirable to be a so-called atelocollagen in which the telopeptide, which is the antigenic expression site of collagen, is removed to reduce immunotoxicity.
  • the concentration of collagen in the collagen solution is not particularly limited, but is preferably 3 to 20 wt%. If the concentration is less than 3 wt%, spinnability may be impaired. When the concentration exceeds 20 wt%, the viscosity becomes high, and it may be difficult to discharge from the nozzle.
  • the collagen solution can be prepared by using a normal dissolution method, but the solution temperature is preferably 0 ° C. or higher and 40 ° C. or lower. Below 0 ° C., the solution may freeze, and above 40 ° C., the collagen may be thermally denatured and gelatinized. The temperature is more preferably 3 ° C. or more and 35 ° C. or less, and further preferably 5 ° C. or more and 30 ° C. or less.
  • a collagen fiber aggregate is then obtained by spinning with a collagen solution using a charge spinning method.
  • the charged spinning method is a method of obtaining a fine fibrous material by charging the polymer solution while discharging the charged polymer solution from the nozzle tip while charging.
  • the nozzle side may be positive and the collecting part may be grounded or negative, and conversely, the nozzle may be grounded or negative and the collecting part may be positive.
  • the potential difference between the nozzle and the collection part is not particularly limited, it is generally preferable to set the potential difference between 3 kV and 100 kV. When the voltage is less than 3 kV, charge repulsion between polymers may be difficult to occur. If it exceeds 100 kV, discharge may occur, which may be unfavorable for safety.
  • the potential difference is more preferably 5 kV to 50 kV, and still more preferably 5 kV to 40 kV.
  • the inner diameter of the nozzle is not particularly limited, but is preferably 0.05 mm or more and 3 mm or less. If it is less than 0.05 mm, the amount of discharged solution may be small and productivity may be lacking. If it exceeds 3 mm, spinnability may be lacking.
  • the material of the nozzle is not particularly limited, and a metallic or non-metallic material can be used.
  • the discharge speed of the nozzle is not particularly limited, but is preferably 0.005 mm / min or more and 0.5 mm / min or less. If it is less than 0.005 mm / min, the production efficiency may not be good. If it exceeds 0.5 mm / min, the amount of the solution increases and the resulting sample may be easily formed into a film.
  • the temperature of the collagen solution during spinning is preferably 0 ° C or higher and 40 ° C or lower. If it is less than 0 ° C., the solution may freeze, and if it exceeds 40 ° C., collagen may be heat-denatured and gelatinized.
  • the temperature is more preferably 3 ° C. or more and 35 ° C. or less, and further preferably 5 ° C. or more and 30 ° C. or less.
  • the distance between the nozzle and the collection part is not particularly limited, but is preferably 1 cm or more and 40 cm or less. If it is less than 1 cm, solvent evaporation hardly occurs during spinning, and there is a possibility of film formation. If it exceeds 40 cm, the sample may be deposited not only on the collecting part but also on a conductive part other than the collecting part, and the production efficiency may be reduced.
  • the spinning atmosphere is not particularly limited, and may be performed in air or in a gas having a higher discharge start voltage than air, such as carbon dioxide.
  • the spinning atmosphere temperature is not particularly limited. Normally, the solvent evaporates when carried out at room temperature, but if the solvent evaporation is insufficient, the atmosphere temperature may be raised. However, the spinning atmosphere temperature is preferably 40 ° C. or lower so that the collagen fibers are not heat-denatured and gelatinized.
  • the fiber aggregate obtained by the present invention may be collected alone, but may be combined with other members depending on the handleability and application.
  • cloth nonwoven fabric, woven fabric, knitted fabric
  • a support substrate serving as a collection substrate
  • a belt-like conductive material made of metal or carbon serving as a support substrate
  • a non-polymer made of an organic polymer or the like.
  • Conductive materials can be used.
  • the collagen fiber aggregate of the present invention is insoluble in water, but may be further insolubilized for the purpose of improving the resistance to an acidic solution.
  • Insolubilization methods include methods using chemical reagents such as glutaraldehyde, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS), ultraviolet radiation, gamma irradiation, and thermal dehydration. Although there is no particular limitation, a method using thermal dehydration is preferable. When a chemical reagent is used, cytotoxicity due to the remaining reagent is considered, and ultraviolet radiation and ⁇ -ray radiation may destroy the structure of the collagen. A thermal dehydration method under reduced pressure (1 kPa or less) can be used in order to produce a collagen fiber aggregate that does not collapse the collagen structure and is acid resistant.
  • the temperature of the insolubilization treatment by thermal dehydration is preferably 100 to 160 ° C. If it is less than 100 degreeC, a dehydration reaction may not fully be performed but an insolubilization process may become inadequate. Further, when the temperature exceeds 160 ° C., the structure may change due to thermal degradation of collagen molecules, and there may be a problem that the color changes to yellow.
  • the insolubilization time is preferably 12 hours or longer. If the time is less than 12 hours, problems such as insufficient insolubilization and non-uniform dehydration may occur.
  • the aggregate of collagen fibers of the present invention is a fiber aggregate composed of collagen fibers having a fiber diameter of 10 nm to 1 ⁇ m and substantially maintaining the collagen structure.
  • the fiber diameter can be obtained by observing the surface of the fiber assembly with a scanning electron microscope, randomly selecting 10 to 20 fibers from the photograph, measuring the fiber diameter, and calculating the average value.
  • the fiber diameter of the aggregate of collagen fibers according to the present invention is 10 nm or more and 1 ⁇ m or less. If it is less than 10 nm, there is a problem that the fibers are too thin and cell recognition is poor. When it exceeds 1 ⁇ m, the effect as a cell scaffold material is hardly exhibited.
  • the maintenance of the collagen structure means that the triple helical structure, which is a structure unique to collagen, is maintained.
  • a material in which the triple helix structure is solved is called gelatin.
  • the collagen structure is maintained, and the ratio of gelatin can be kept lower than before.
  • a fiber aggregate having a gelatin structure is not preferable because of poor cell adhesion.
  • the maintenance rate of the collagen structure that is, the maintenance rate of the triple helical structure is preferably 30% or more, more preferably 40% or more, and still more preferably 50% or more. Of course, the upper limit is preferably 100%.
  • CD spectrum obtained by circular dichroism dispersion measurement shows a negative cotton effect at any wavelength in the wavelength range of 185 to 205 nm and a positive cotton effect at any wavelength in the wavelength range of 210 to 230 nm. By showing, it can confirm that at least one part or all of polypeptide maintains the triple helix structure.
  • the circular dichroism refers to a phenomenon in which a difference in absorbance occurs between the left circularly polarized light and the right circularly polarized light when the optically active substance absorbs the circularly polarized light.
  • the circular dichroism cotton effect refers to a phenomenon in which a difference in absorbance and transmission speed occurs simultaneously with respect to left and right circularly polarized light at a specific wavelength.
  • the basis weight of the collagen fiber aggregate of the present invention is determined according to the intended use and is not particularly limited, but is preferably 0.01 g / m 2 or more and 50 g / m 2 or less. If it is less than 0.01 g / m 2 , the strength may be low, and if it exceeds 50 g / m 2 , the cost may be high.
  • the basis weight can be adjusted by the discharge amount of the collagen solution in the charge spinning process, the spinning time, and the like.
  • the thickness of the collagen fiber aggregate of the present invention can be determined according to the intended use and is not particularly limited, but is preferably 0.1 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less. If the thickness is less than 0.1 ⁇ m, the strength may be low, and if it exceeds 500 ⁇ m, the cost may be high.
  • the thickness is more preferably 0.5 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, and still more preferably 1 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less.
  • an aggregate of collagen fibers composed of collagen fibers having a fiber diameter of 10 nm to 1 ⁇ m and substantially maintaining the collagen structure.
  • the aggregate of collagen fibers according to the present invention maintains a collagen structure and has excellent cell adhesion and biocompatibility because the fiber diameter is a size with excellent cell recognition.
  • assembly of the said collagen fiber can be provided, without using the organic solvent containing the halogen harmful
  • ⁇ CD spectrum obtained by a circular dichroism dispersometer, showing a negative cotton effect at any wavelength in the wavelength range of 185 to 205 nm, and showing a positive cotton effect at any wavelength in the wavelength range of 210 to 230 nm. And maintains a triple helix structure.
  • X The CD spectrum does not show the above effects, and the triple helical structure is not maintained.
  • the retention rate of the triple helical structure is based on the average residue ellipticity (deg ⁇ cm 2 ⁇ dmol ⁇ 1 ) at a wavelength of 222 nm of a solution obtained by dissolving collagen before charge spinning in an aqueous pH 3 hydrochloric acid solution.
  • Triple helical structure maintenance rate (%) ⁇ average residue ellipticity of aqueous solution of hydrochloric acid of fiber aggregate obtained in each example ( ⁇ 222) / collagen (before charge spinning) average residue ellipticity of aqueous solution of hydrochloric acid ( ⁇ 222) ⁇ ⁇ 100
  • the apparatus used was “Nanofiber Electrospinning Unit” manufactured by Kato Tech.
  • As the polymer solution discharge port an ejection nozzle having an inner diameter of 0.8 mm was used, and the solution supply speed was set to 0.05 cm / min.
  • the potential difference between the nozzle part and the ground part was set to 13 kV, and the distance (AG length) between the nozzle part and the ground part was 10 cm.
  • the produced fiber assembly was observed with a scanning electron microscope and measured by a circular dichroism dispersometer. An electron micrograph of the obtained collagen fiber aggregate is shown in FIG.
  • When observed with TEM no stripe pattern was observed. It is considered that no striped pattern is observed because collagen is dissolved before spinning.
  • Example 2 After spinning under the same spinning conditions as in Example 1, insolubilization treatment was carried out at 140 ° C. under reduced pressure for 24 hours.
  • the apparatus used was “Nanofiber Electrospinning Unit” manufactured by Kato Tech.
  • As the polymer solution discharge port an ejection nozzle having an inner diameter of 0.8 mm was used, and the solution supply speed was set to 0.05 cm / min.
  • the potential difference between the nozzle part and the ground part was set to 33 kV, and the distance (AG length) between the nozzle part and the ground part was 10 cm.
  • the produced fiber assembly was observed with a scanning electron microscope and measured by a circular dichroism dispersometer. An electron micrograph of the resulting collagen fiber aggregate is shown in FIG.
  • When observed with TEM no stripe pattern was observed. It is thought that the stripe pattern is not observed because collagen is dissolved before spinning.
  • the apparatus used was “Nanofiber Electrospinning Unit” manufactured by Kato Tech.
  • As the polymer solution discharge port an ejection nozzle having an inner diameter of 0.8 mm was used, and the solution supply speed was set to 0.05 cm / min.
  • the potential difference between the nozzle part and the ground part was set to 11 kV, and the distance (AG length) between the nozzle part and the ground part was 10 cm.
  • the produced fiber assembly was observed with a scanning electron microscope and measured by a circular dichroism dispersometer. An electron micrograph of the resulting collagen fiber aggregate is shown in FIG. 3, and the results of circular dichroism dispersometer measurement are shown in FIG.
  • when observed with TEM no stripe pattern was observed. It is considered that no striped pattern is observed because collagen is dissolved before spinning.
  • Comparative Example 1 Collagen powder (mixed type I and type III, porcine skin NMP collagen PS, manufactured by Nippon Ham) was added to HFIP and stirred while cooling to obtain a 5 wt% collagen solution. The solution was spun under the same spinning conditions as in Example 1.
  • Examples 1 to 4 use an aqueous acetic acid solution, and the resulting collagen fibers have a fiber diameter of 10 nm to 1 ⁇ m and maintain a triple helical structure. It was excellent in properties. In addition, there is no data of a triple helix structure maintenance factor in Example 2 because it was not able to be measured since it was insolubilized. However, since the fiber of Example 2 is obtained by insolubilizing the fiber of Example 1, it is considered that the triple helical structure is maintained as in Example 1.
  • an aggregate of collagen fibers composed of collagen fibers having a fiber diameter of 10 nm to 1 ⁇ m and substantially maintaining the collagen structure.
  • the aggregate of collagen fibers of the present invention maintains the collagen structure, and its fiber diameter is a size with excellent cell recognizability, so it has excellent cell adhesion and biocompatibility, and is used as a cell scaffold material, medical material, etc. Can be used.

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Abstract

　本発明の目的は、ゼラチン構造をほとんど含まず、実質的にコラーゲン構造が維持されたコラーゲン繊維からなり、繊維径が１０ｎｍ以上１μｍ以下のコラーゲン繊維の集合体とその製造方法を提供することである。本発明に係るコラーゲン繊維の集合体の製造方法は、分子構造中にハロゲンを含まない有機酸水溶液にコラーゲンを溶解してコラーゲン溶液を調製する工程と、該コラーゲン溶液を用いて荷電紡糸法により紡糸する工程を含むことを特徴とする。

Description

コラーゲン繊維の集合体およびその製造方法
　本発明は、コラーゲン繊維の集合体およびその製造方法に関する。
　これまで、生分解性ポリマーからなるフィルムや繊維は、細胞足場材料や医療用材料への応用が期待されてきた。
　医療用材料として、動物性たんぱく質であるコラーゲン、多糖類であるヒアルロン酸、キチン、キトサン、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、脂肪族ポリエステルであるポリグリコール酸、グリコール酸／Ｌ－乳酸共重合体、ポリ－Ｌ－乳酸、Ｌ－乳酸／ε－カプロラクトン共重合体、ポリ－ｐ－ジオキサノン、その他合成ポリマーであるポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールが用いられてきた。特にコラーゲンは細胞接着性に優れるという特長を有する。
　コラーゲン繊維集合体を作製する方法として、フッ素系有機溶媒、例えば、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）にコラーゲンを溶解し、荷電紡糸により、コラーゲン繊維を作製するという技術が知られている（特許文献１～２、非特許文献１参照）。
特表２００６－５０１９４９号公報 特開２００７－１３８３６４号公報
Jamil A．Mattews，Gary E．Wnek，David G．Simpson，and Gary L．Bowlin．，Biomacomolecules，2002，3，232
　上述したように、従来、コラーゲンを原料とした繊維が知られていた。しかし、かかる技術は、原料としてコラーゲンを使用してはいるが、ＨＦＩＰなどのフッ素系有機溶媒の溶液を使用していることから、得られた繊維はコラーゲンの構造が維持されておらずゼラチンからなる。よって、細胞接着性に劣るという問題点を有する。また、ハロゲンを含有した有機溶媒を用いると、人体や環境へ悪影響を与えるという問題がある。
　本発明はかかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、実質的にコラーゲン構造が維持されたコラーゲン繊維からなり、繊維径が１０ｎｍ以上１μｍ以下のコラーゲン繊維の集合体とその製造方法を提供することである。
　本発明者らは、かかる目的を達成するために鋭意検討した結果、分子構造中にハロゲンを含まない有機酸水溶液を用いて調製されたコラーゲン溶液を荷電紡糸した場合に、繊維径が１０ｎｍ以上１μｍ以下であり、実質的にコラーゲン構造が維持されたコラーゲン繊維からなるコラーゲン繊維集合体が得られることを見出し、本発明に到達した。
　本発明に係るコラーゲン繊維の集合体の製造方法は、分子構造中にハロゲンを含まない有機酸水溶液にコラーゲンを溶解してコラーゲン溶液を調製する工程と、該コラーゲン溶液を用いて荷電紡糸法により紡糸する工程を含むことを特徴とする。
　本発明に係るコラーゲン繊維の集合体は、繊維径が１０ｎｍ以上１μｍ以下であることを特徴とする。
図１は、実施例１で得られたコラーゲン繊維集合体の電子顕微鏡写真図である。 図２は、実施例３で得られたコラーゲン繊維集合体の電子顕微鏡写真図である。 図３は、実施例４で得られたコラーゲン繊維集合体の電子顕微鏡写真図である。 図４は、実施例４で得られたコラーゲン繊維集合体の円二色性分散計測定結果である。
　以下、本発明を詳述する。まず、本発明に係るコラーゲン繊維集合体の製造方法を説明する。
　１．　コラーゲン溶液の調製工程
　本発明方法では、分子構造中にハロゲンを含まない有機酸水溶液にコラーゲンを溶解し、コラーゲン溶液を調製する。
　分子構造中にハロゲンを含まない有機酸水溶液を用いて荷電紡糸をすることによって、実質的にコラーゲン構造が維持されたコラーゲン繊維からなる繊維集合体を得ることができる。背景技術で前述したとおり、これまでＴＦＥやＨＦＩＰ等のフッ素系有機溶媒を用いてコラーゲン溶液を調製し、この溶液を用いて荷電紡糸した例が紹介されている。これらＴＦＥやＨＦＩＰ等のフッ素系有機溶媒は、その分子構造中にフッ素原子を有するので、分子構造中にハロゲンを含まない有機酸水溶液には該当しない。これらのフッ素系有機溶媒を使用した場合には、コラーゲン繊維集合体中に残存する恐れがあり、使用用途によっては人体に影響を及ぼす恐れがあることに加え、フッ素系有機溶媒に溶解させて荷電紡糸をした場合にはほぼ全てのコラーゲンがゼラチンに変質するので、実質的にコラーゲン構造が維持されたコラーゲン繊維からなる繊維集合体を得ることができない。
　本発明で用いる分子構造中にハロゲンを含まない有機酸水溶液に含まれる水の種類は、特に制限されない。例えば、水道水、井戸水、蒸留水、精製水、純水、超純水などを用いることができ、さらに、不純物が少なく荷電紡糸法に適することから、蒸留水、精製水、純水、超純水が好適であり、蒸留水および精製水がより好適である。
　コラーゲンを溶解するための溶媒には、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノールといったアルコールなど、揮発性が良く、人体に無害な溶媒を、コラーゲンの溶解を阻害しない範囲で含んでいてもよい。溶媒としては、特に、コラーゲンの高次構造を安定化し易く、且つ荷電紡糸時に蒸発し易くより微細なコラーゲン繊維が得られることから、有機酸水溶液とアルコールの混合溶媒が好ましい。アルコールなどを添加する場合、アルコールなどの含有率としては有機酸水溶液に対して１ｗｔ％以上３０ｗｔ％以下が好ましい。当該含有率が１ｗｔ％以上であれば、紡糸中に溶媒が蒸発し易く、より良質なコラーゲン繊維集合体が得られ易くなる。一方、当該含有率が高過ぎるとコラーゲンが溶解し難くなる場合があり得るので、３０ｗｔ％以下が好ましい。当該割合としては、５ｗｔ％以上がより好ましく、７ｗｔ％以上がさらに好ましく、また、２５ｗｔ％以下がより好ましく、２０ｗｔ％以下がさらに好ましい。
　本発明で用いる有機酸水溶液に含まれる有機酸としては、溶媒と同様に、分子構造中にハロゲンを含まないものが好ましい。かかる有機酸としては、特に限定されるものではないが、ギ酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、乳酸、酢酸などを用いることができる。これらを２種以上混合しても良い。なお、塩酸、硫酸などの無機酸は、人体に有害であるため好ましくはない。また、塩酸の場合、塩素イオンＣｌ－は重いため、紡糸中に飛ばず、得られる繊維中に残る恐れがある。
　有機酸水溶液中におけるこれらの有機酸の濃度は、５～９９ｗｔ％が好ましく、より好ましくは４０～９５ｗｔ％、更に好ましくは５０～９０ｗｔ％である。
　なかでも分子構造中にハロゲンを含まない有機酸としては、酢酸が好ましく、酢酸水溶液や酢酸緩衝液を有機酸水溶液として用いることが好ましい。酢酸水溶液中の酢酸の濃度は、５～９９ｗｔ％が好ましい。酢酸の濃度が５ｗｔ％未満の場合は、粘度が高くなり、紡糸が困難となるおそれがあり得る。９９ｗｔ％を超えると、コラーゲンが溶解せず紡糸が困難となるおそれがあり得る。当該濃度は、より好ましくは４０～９５ｗｔ％、更に好ましくは５０～９０ｗｔ％である。
　本発明で使用するコラーゲンは、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、ＶＩＩ型、ＶＩＩＩ型、ＩＸ型、Ｘ型、ＸＩ型、ＸＩＩ型、ＸＩＩＩ型、ＸＩＶ型、ＸＶ型、ＸＶＩ型、ＸＶＩＩ型、ＸＶＩＩＩ型およびＸＩＸ型コラーゲンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいコラーゲンとしては、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型である。これらの型は生体内に多く分布し容易に入手することができる。
　本発明に使用するコラーゲンの構造は特に限定されないが、コラーゲンの抗原性発現部位であるテロペプチドを除去し、免疫毒性を低下させた、いわゆるアテロコラーゲンであることが望ましい。
　コラーゲン溶液中のコラーゲンの濃度は、特に限定されるものではないが、３～２０ｗｔ％が好ましい。濃度が３ｗｔ％未満の場合、紡糸性を損なう恐れがあり得る。濃度が２０ｗｔ％を超えると、粘度が高くなり、ノズルからの吐出が困難になるおそれがあり得る。
　コラーゲン溶液の調製は、通常の溶解方法を使用できるが、溶液温度を０℃以上４０℃以下とすることが好ましい。０℃未満では溶液が凍るおそれがあり得、４０℃を超えるとコラーゲンが熱変性し、ゼラチン化するおそれがあり得る。当該温度は、より好ましくは３℃以上３５℃以下、さらに好ましくは５℃以上３０℃以下である。
　２．　荷電紡糸工程
　本発明方法では、次に、コラーゲン溶液を用いて荷電紡糸法により紡糸することにより、コラーゲン繊維の集合体を得る。
　荷電紡糸法とは、荷電中で、帯電した高分子溶液をノズル先端より吐出しながら、その溶液の電荷反発力により、微細な繊維状物を得る方法である。電圧の印加方法は、ノズル側をプラスに、捕集部をアースまたはマイナスにしてもよいし、その逆にノズルをアースまたはマイナスに、捕集部をプラスのいずれの方法でも良い。ノズルと捕集部の電位差は特に限定されないが、一般に３ｋＶ以上１００ｋＶ以下にすることが好ましい。３ｋＶ未満の場合、ポリマー同士の電荷反発が生じずらいことがある。１００ｋＶを超えると放電が生じる場合があり、安全上好ましくない場合がある。当該電位差は、より好ましくは５ｋＶ以上５０ｋＶ以下、さらに好ましくは５ｋＶ以上４０ｋＶ以下である。
　ノズルの内径は特に限定されないが、０．０５ｍｍ以上３ｍｍ以下が好ましい。０．０５ｍｍ未満の場合、吐出溶液量が少なく生産性に欠ける場合がある。３ｍｍを超えると紡糸性に欠けることがある。ノズルの材質は、特に限定されず、金属製や非金属製のものを使用することができる。
　ノズルの吐出速度は、特に限定されないが、０．００５ｍｍ／ｍｉｎ以上０．５ｍｍ／ｍｉｎ以下が好ましい。０．００５ｍｍ／ｍｉｎ未満の場合、生産効率が良くない場合がある。０．５ｍｍ／ｍｉｎを超えると、溶液量が多くなり、得られるサンプルは膜化しやすくなるおそれがある。
　紡糸中のコラーゲン溶液の温度は０℃以上４０℃以下とすることが好ましい。０℃未満では溶液が凍るおそれがあり得、４０℃を超えるとコラーゲンが熱変性しゼラチン化する場合があり得る。当該温度は、より好ましくは３℃以上３５℃以下、さらに好ましくは５℃以上３０℃以下である。
　ノズルと捕集部間の距離は、特に限定されないが、１ｃｍ以上４０ｃｍ以下が好ましい。１ｃｍ未満の場合、紡糸中に溶媒蒸発が起こりにくく、膜化する可能性があり得る。４０ｃｍを超えると、サンプルが捕集部だけでなく、捕集部以外の導電性部位にサンプルが堆積し、生産効率が低下するおそれがあり得る。
　紡糸雰囲気は、特に限定されず、空気中や、二酸化炭素など空気よりも放電開始電圧の高い気体中で行ってもよい。
　荷電紡糸法では、高分子溶液が捕集部に到達する間に、条件に応じて溶媒が蒸発し繊維集合体が得られる。紡糸雰囲気温度は、特に限定されず、通常、室温下で行った場合、溶媒は蒸発するが、溶媒蒸発が不十分な場合は、雰囲気温度を上げてもよい。但し、紡糸雰囲気温度は、コラーゲン繊維が熱変性してゼラチン化しないように４０℃以下とすることが好ましい。
　本発明によって得られる繊維集合体は単体で捕集してもよいが、取扱性や用途に応じ、他の部材と組み合わせてもよい。例えば、捕集基板として支持基材となる布帛（不織布、織物、編物）や、フィルム、ドラム、ネット、平板、ベルト形状を有する、金属やカーボンからなる導電性材料、有機高分子などからなる非導電性材料を使用することができる。その上に繊維集合体を形成することで、支持基材と繊維集合体を組み合わせた部材を作製することもできる。
　３．　不溶化処理工程
　本発明のコラーゲン繊維集合体は、水に対して不溶であるが、酸性溶液への耐性を向上させる目的で、さらに不溶化処理がされていても良い。不溶化処理法は、グルタルアルデヒド、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride（ＥＤＣ）やN-hydroxysuccinimide（ＮＨＳ）といった化学試薬を用いた方法や、紫外線放射、γ線照射、熱脱水方法があり、特に限定されるものはないが、熱脱水による方法が好ましい。化学試薬を使用した場合は、残存試薬による細胞毒性が考えられ、紫外線放射やγ線放射は、コラーゲンの構造が破壊される恐れがある。コラーゲンの構造が崩れず、耐酸性であるコラーゲン繊維集合体を作製するために、減圧下（１ｋＰａ以下）での熱脱水方法を用いることができる。
　熱脱水による不溶化処理の温度は１００～１６０℃が好ましい。１００℃未満では脱水反応が十分に行なわれず、不溶化処理が不十分になるおそれがあり得る。また、１６０℃を超えるとコラーゲン分子の熱劣化等で構造が変化し、黄色に変色する等の問題が生じるおそれがあり得る。不溶化処理の時間は１２時間以上であることが好ましい。１２時間未満では不溶化処理が十分になされない、脱水反応が不均一になる等の問題が生じる場合があり得る。
　本発明のコラーゲン繊維の集合体は、繊維径が１０ｎｍ以上１μｍ以下であり、実質的にコラーゲン構造が維持されたコラーゲン繊維からなる繊維集合体である。繊維径は、繊維集合体の表面を走査型電子顕微鏡により観察し、その写真から１０～２０本の繊維をランダムに選び繊維径を測定しその平均値を算出して求めることができる。
　本発明に係るコラーゲン繊維の集合体の繊維径は１０ｎｍ以上１μｍ以下である。１０ｎｍ未満であれば、繊維が細すぎて、細胞の認識が劣る問題がある。１μｍを超えると細胞足場材料としての効果が発揮されにくい。
　コラーゲン構造が維持されたとは、コラーゲン特有の構造である３重らせん構造が維持されていることを意味する。３重らせん構造が解けたものはゼラチンと呼ばれる。本発明のコラーゲン繊維集合体は、コラーゲン構造が維持されており、ゼラチンの割合を従来よりも低く抑えることができる。ゼラチン構造からなる繊維集合体では、細胞接着性に劣るため、好ましくない。なお、コラーゲン構造の維持率、即ち３重らせん構造の維持率は、３０％以上が好ましく、より好ましくは４０％以上、更に好ましくは５０％以上である。なお、上限としては当然に１００％が好ましい。
　コラーゲン繊維が３重らせん構造を維持していることの確認は、円二色性分散計測定により確認することができる。円二色性分散計測定により得られるＣＤスペクトルで、１８５～２０５ｎｍの波長範囲のいずれかの波長に負のコットン効果を示し、２１０～２３０ｎｍの波長範囲のいずれかの波長に正のコットン効果を示すことにより、ポリペプチドの少なくとも一部または全部が３重らせん構造を維持していることを確認することができる。なお、円偏光二色性とは、光学活性物質が、円偏光を吸収する際に左円偏光と右円偏光に対して吸光度に差が生じる現象のことをいう。また、円偏光二色性のコットン効果とは、特定の波長で左右の円偏光に対する吸光度および透過速度の相違が同時に起こる現象をいう。
　本発明のコラーゲン繊維集合体の目付量は、使用用途に応じて決められるものであり、特に限定されるものではないが、０．０１ｇ／ｍ2以上５０ｇ／ｍ2以下が好ましい。０．０１ｇ／ｍ2未満の場合、強度が低くなるおそれがあり得、５０ｇ／ｍ2を超えると高コストとなり得る。なお、目付量は、荷電紡糸工程におけるコラーゲン溶液の吐出量や紡糸時間などにより調節することが可能である。
　本発明のコラーゲン繊維集合体の厚みは、使用用途に応じて決めることができ、特に限定されるものではないが、０．１μｍ以上５００μｍ以下が好ましい。０．１μｍ未満の場合は強度が低くなるおそれがあり得、５００μｍを超えると高コストとなり得る。当該厚みは、より好ましくは０．５μｍ以上４００μｍ以下、更に好ましくは１μｍ以上３００μｍ以下である。
　本発明によれば、繊維径が１０ｎｍ以上１μｍ以下であり、実質的にコラーゲン構造が維持されたコラーゲン繊維からなるコラーゲン繊維の集合体を提供することができる。本発明のコラーゲン繊維の集合体は、コラーゲン構造が維持されており、その繊維径が細胞認識性に優れるサイズであるので細胞接着性、生体適合性に優れる。また、本発明によれば、人体に有害なハロゲンを含有した有機溶媒を使用せずに前記コラーゲン繊維の集合体を製造する方法を提供することができる。
　以下に実施例および比較例を示して、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
　以下に、実施例で用いた測定方法について説明する。
　１．　繊維径の測定
　イオンスパッター（Ｅ－１０３０，日立製作所製）を用い、得られた繊維集合体にプラチナスパッタを施した。当該繊維集合体の表面を、電界放射型走査電子顕微鏡（Field Emission Scanning Electron Microscope，ＦＥ－ＳＥＭ，Ｓ－８００，Ｓ－４５００，日立製作所製）を用い、加速電圧１０ｋＶ、倍率１００００倍にて観察し、写真を撮影した。その写真から１０～２０本の繊維をランダムに選び、繊維径を測定した。測定した繊維径の平均値を算出し、繊維径とした。
　２．　円二色性分散計測定
　円二色性分散計（日本分光（株）社製，Ｊ－８２０）を用い測定した。セル光路長は０．２ｍｍ、測定温度は４℃、測定波長範囲は２６０～１８５ｎｍ、走査速度は５０ｎｍ／ｍｉｎ、バンド幅は１ｎｍ、レスポンスは２ｓｅｃ、感度はｓｔａｎｄａｒｄ、データ取込間隔は０．１ｎｍ、積算回数は１、蛍光側感度は０Ｖ、溶液濃度は１ｍｇ／ｍＬ、溶媒は塩酸水溶液（ｐＨ３）の条件下にて測定した。表２中、○、×は下記のように評価したものである。
○：円二色性分散計によるＣＤスペクトルで、波長範囲１８５～２０５ｎｍのうちいずれかの波長で負のコットン効果を示し、波長範囲２１０～２３０ｎｍのうちいずれかの波長で正のコットン効果を示しており、３重らせん構造を維持している。
×：ＣＤスペクトルが上記のような効果を示しておらず、３重らせん構造を維持していない。
　３．　３重らせん構造の維持率
　荷電紡糸前のコラーゲンと各実施例で得られた繊維集合体の円二色性分散計測定を上記２に従って行い、得られたＣＤスペクトルから、３重らせん構造、即ちコラーゲン構造の維持率を評価した。
　３重らせん構造、即ちコラーゲン構造の維持率は、荷電紡糸前のコラーゲンをｐＨ３塩酸水溶液に溶解した溶液の、波長２２２ｎｍにおける平均残基楕円率（ｄｅｇ・ｃｍ2・ｄｍｏｌ-1）の値を基準にして、下記式により算出した。
３重らせん構造維持率（％）＝｛各実施例で得られた繊維集合体の塩酸水溶液の平均残基楕円率（λ２２２）／コラーゲン（荷電紡糸する前）塩酸水溶液の平均残基楕円率（λ２２２）｝×１００
　なお、平均残基楕円率：［θ］（ｄｅｇ・ｃｍ2・ｄｍｏｌ-1）は以下の式を用いて求めた。
［θ］＝θ／（１０・Ｃｒ・ｌ）
［式中、Ｃｒ＝ｎＣｐであり、θは楕円率（ｍｄｅｇ）であり、Ｃｒは平均残基モル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）であり、ｌはセル長（ｃｍ）であり、ｎは高分子の構成残基数であり、Ｃｐは高分子のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）である］
　４．　ＴＥＭ観察
　試料をＯｓＯ4の１％水溶液中で一晩固定し、水洗後にエタノール脱水し、樹脂に包埋することにより包埋試料を得た。この包埋試料から超薄切片を作成し、１％リンタングステン酸水溶液で、室温で３０分間染色を行った。観察は日本電子製ＪＥＭ２０１０透過電子顕微鏡で、加速電圧２００ｋＶ、直接倍率５，０００倍及び４０，０００倍で行った。
　実施例１
　コラーゲン粉末（Ｉ型とＩＩＩ型の混合，ブタ皮膚製ＮＭＰコラーゲンＰＳ，日本ハム社製）を酢酸水混合溶液（酢酸／水＝９／１（ｗｔ比））に加え、５℃に冷却しながら攪拌し、１０ｗｔ％溶液のコラーゲン溶液を得た。このコラーゲン溶液を用いて、荷電紡糸を行った。
　紡糸は、以下の条件にて実施した。装置はカトーテック社製「ナノファイバー・エレクトロスピニング・ユニット」を用いた。ポリマー溶液吐出口は、内径０．８ｍｍの噴出ノズルを用い、溶液供給速度は０．０５ｃｍ／ｍｉｎとした。ノズル部とアース部との電位差を１３ｋＶに設定し、ノズル部とアース部間の距離（ＡＧ長）は１０ｃｍとした。また、温度２７℃、相対湿度４２ＲＨ％条件下で実施した。作製した繊維集合体について、走査型電子顕微鏡による観察、円二色性分散計測定を行った。得られたコラーゲン繊維集合体の電子顕微鏡写真を図１に示す。また、ＴＥＭにより観察したところ、縞模様は観察されなかった。紡糸前にコラーゲンが溶解しているため縞模様が観察されないと考えられる。
　実施例２
　実施例１と同様の紡糸条件下にて紡糸を実施したのち、１４０℃、減圧条件下で２４時間不溶化処理を実施した。
　実施例３
　コラーゲン粉末（Ｉ型とＩＩＩ型の混合，ブタ皮膚製ＮＭＰコラーゲンＰＳ，日本ハム社製）を酢酸水混合溶液（酢酸／水＝１／１（ｗｔ比））に加え、５℃に冷却しながら攪拌し、１０ｗｔ％溶液のコラーゲン溶液を得た。このコラーゲン溶液を用いて、荷電紡糸を行った。
　紡糸は、以下の条件にて実施した。装置はカトーテック社製「ナノファイバー・エレクトロスピニング・ユニット」を用いた。ポリマー溶液吐出口は、内径０．８ｍｍの噴出ノズルを用い、溶液供給速度は０．０５ｃｍ／ｍｉｎとした。ノズル部とアース部との電位差を３３ｋＶに設定し、ノズル部とアース部間の距離（ＡＧ長）は１０ｃｍとした。また、温度２７℃、相対湿度４４ＲＨ％条件下で実施した。作製した繊維集合体について、走査型電子顕微鏡による観察、円二色性分散計測定を行った。得られたコラーゲン繊維集合体の電子顕微鏡写真を図２に示す。また、ＴＥＭにより観察したところ、縞模様は観察されなかった。紡糸前にコラーゲンが溶解しているため縞模様が観察されないと考えられる。
　実施例４
　コラーゲン（Ｉ型とＩＩＩ型の混合，ブタ皮膚製ＮＭＰコラーゲンＰＳ，日本ハム社製）粉末を酢酸水エタノール混合溶液（酢酸／水／エタノール＝９／１／１．３（ｗｔ比））に加え、５℃に冷却しながら攪拌し、１０ｗｔ％溶液のコラーゲン溶液を得た。このコラーゲン溶液を用いて、荷電紡糸を行った。
　紡糸は、以下の条件にて実施した。装置はカトーテック社製「ナノファイバー・エレクトロスピニング・ユニット」を用いた。ポリマー溶液吐出口は、内径０．８ｍｍの噴出ノズルを用い、溶液供給速度は０．０５ｃｍ／ｍｉｎとした。ノズル部とアース部との電位差を１１ｋＶに設定し、ノズル部とアース部間の距離（ＡＧ長）は１０ｃｍとした。また、温度２６℃、相対湿度３８ＲＨ％条件下で実施した。作製した繊維集合体について、走査型電子顕微鏡による観察、円二色性分散計測定を行った。得られたコラーゲン繊維集合体の電子顕微鏡写真を図３に、また、円二色性分散計測定の結果を図４に示す。また、ＴＥＭにより観察したところ、縞模様は観察されなかった。紡糸前にコラーゲンが溶解しているため縞模様が観察されないと考えられる。
　比較例１
　コラーゲン粉末（Ｉ型とＩＩＩ型の混合，ブタ皮膚製ＮＭＰコラーゲンＰＳ，日本ハム社製）をＨＦＩＰに加え、冷却しながら攪拌し、５ｗｔ％溶液のコラーゲン溶液を得た。この溶液を実施例１と同様の紡糸条件下にて紡糸を実施した。
　比較例２
　コラーゲン粉末（Ｉ型とＩＩＩ型の混合，ブタ皮膚製ＮＭＰコラーゲンＰＳ，日本ハム社製）を塩酸（ｐＨ３）に加え、冷却しながら攪拌し、コラーゲン溶液を得た。この溶液を実施例１と同様の紡糸条件下にて荷電紡糸を実施したが、紡糸はできなかった。
　以下に、各繊維の測定結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例１～４は、酢酸水溶液を使用しており、得られたコラーゲン繊維は、繊維径が１０ｎｍ以上１μｍ以下であって、３重らせん構造を維持しているので、細胞接着性、生体適合性に優れるものであった。なお、実施例２で３重らせん構造維持率のデータが無いのは、不溶化処理をしたため測定ができなかったことによる。但し、実施例２の繊維は実施例１の繊維を不溶化したものであるため、実施例１と同様に３重らせん構造は維持されていると考えられる。
　一方、比較例１は溶媒としてＨＦＩＰを使用しているため、繊維は３重らせん構造を維持しておらず、ゼラチン構造であるため、細胞接着性に劣るものであった。
　また、比較例２は、塩酸を使用しており、コラーゲン繊維を得ることができなかった。
　本発明によれば、繊維径が１０ｎｍ以上１μｍ以下であり、実質的にコラーゲン構造が維持されたコラーゲン繊維からなるコラーゲン繊維の集合体を提供することができる。本発明のコラーゲン繊維の集合体は、コラーゲン構造が維持されており、その繊維径が細胞認識性に優れるサイズであるので細胞接着性や生体適合性に優れ、細胞足場材料や医療用材料等として利用することができる。

Claims (8)

  1. 　分子構造中にハロゲンを含まない有機酸水溶液にコラーゲンを溶解してコラーゲン溶液を調製する工程と、
    　該コラーゲン溶液を用いて荷電紡糸法により紡糸する工程を含むことを特徴とするコラーゲン繊維の集合体の製造方法。
  2. 　前記コラーゲン溶液が、有機酸として酢酸を含む請求項１に記載のコラーゲン繊維の集合体の製造方法。
  3. 　前記コラーゲン溶液が、酢酸を５～９９ｗｔ％含む溶媒にコラーゲンを溶解したものである請求項２に記載のコラーゲン繊維の集合体の製造方法。
  4. 　前記有機酸水溶液が、さらにアルコールを含む請求項１～３のいずれかに記載のコラーゲン繊維の集合体の製造方法。
  5. 　繊維径が１０ｎｍ以上１μｍ以下であることを特徴とするコラーゲン繊維の集合体。
  6. 　円二色性分散計によるＣＤスペクトルで、波長範囲１８５～２０５ｎｍのうちいずれかの波長で負のコットン効果を示し、波長範囲２１０～２３０ｎｍのうちいずれかの波長で正のコットン効果を示す請求項５に記載のコラーゲン繊維の集合体。
  7. 　３重らせん構造維持率が５０％以上である請求項５または６に記載のコラーゲン繊維の集合体。
  8. 　不溶化処理されたものである請求項５～７のいずれかに記載のコラーゲン繊維の集合体。
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