WO2011076966A1 - Derivados de amida de acidos grasos con anfetaminas para el tratamiento de desordenes alimenticios - Google Patents

Derivados de amida de acidos grasos con anfetaminas para el tratamiento de desordenes alimenticios Download PDF

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WO2011076966A1
WO2011076966A1 PCT/ES2010/070854 ES2010070854W WO2011076966A1 WO 2011076966 A1 WO2011076966 A1 WO 2011076966A1 ES 2010070854 W ES2010070854 W ES 2010070854W WO 2011076966 A1 WO2011076966 A1 WO 2011076966A1
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alkyl
formula
general formula
alkenyl
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PCT/ES2010/070854
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Rafael De La Torre Fornell
Magin Farre Albadalejo
María Isabel COVAS PLANELLS
Montserrat Fito Colomert
Bruno Almeida Cotrim
Fernando Rodriguez De Foseca
Juan Manuel Decara Del Olmo
Manuel MACÍAS GONZÁLEZ
Miguel Romero Cuevas
Jesús JOGLAR TAMARGO
Pedro Clapes Saborit
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Fundació Imim
Fundación Imabis - Instituto Mediterraneo Para El Avance De La Biotecnologia Y La Investigación Sanitaria
Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C231/00—Preparation of carboxylic acid amides
    • C07C231/02—Preparation of carboxylic acid amides from carboxylic acids or from esters, anhydrides, or halides thereof by reaction with ammonia or amines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/02—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals
    • C07C233/11—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton containing six-membered aromatic rings

Definitions

  • the present invention relates to a new series of amide derivatives of fatty acids with amphetamines and their pharmaceutically acceptable salts, solvates and hydrates, which show an affinity for cannabinoid receptors type 1 (CB1) and the alpha subtype of the receptors activated by peroxisome proliferator (PPAR-alpha), and as potent antioxidant agents in the oxidation of Low Density Lipoprotein (LDL).
  • CBD1 cannabinoid receptors type 1
  • PPAR-alpha peroxisome proliferator
  • LDL Low Density Lipoprotein
  • the compounds can modulate the actions regulated by the aforementioned receptors, such as the induction of satiety and intake control, the decrease in body fat and the regulation of lipid metabolism.
  • the endocannabinoid system is composed of cannabinoid receptors, endogenous ligands (endocannabinoids) and the enzymatic systems necessary for their biosynthesis and degradation (Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2006 46: 101). So far, two types of cannabinoid receptors have been identified: CB1 and CB2.
  • the two cannabinoid receptors are coupled to the G protein through which they modulate the activity of adenylate cyclase (AC) and mitogen-activated protein kinase (MAPK), and intracellular events that lead to regulation in the expression of various genes .
  • the activation of CB1 receptors also regulates the dependent Ca +2 voltage channels and the potassium channels.
  • CB1 receptors are distributed in the central nervous system and in other organs such as adipose tissue, endocrine pancreas, muscle, lungs, liver and kidneys, while CB2 receptors are mainly expressed in the immune system and hematopoietic cells (Nature Reviews Drug Discovery 2004 3: 771).
  • the endocannabinoid system seems to be related to a large number of physiological and pathological conditions at the neurological, psychiatric, cardiovascular, cancer development, reproductive and eating disorders.
  • a better understanding of the biosynthetic pathways of endocannabinoids and the mechanisms of cell-level regulation of these pathways are considered the main priorities in the investigation of cannabinoids (Nature Reviews Drug Discovery 2004 3: 771).
  • the CB1 receptor was, within the endocannaninoid system, the therapeutic target that initially received the most attention in research for the treatment of obesity. It is well known that cannabinoid agonist substances increase appetite and therefore it was postulated that blocking this receptor could reduce food intake leading to weight loss. Rimonabant, also known as SR141716 or Acomplia®, was the first CB1 antagonist to be described and one of the first to be studied clinically for the treatment of obesity (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2006 46: 101, Nat Rev Drug Disc. 2004 3: 771).
  • PPARs peroxisome proliferator-activated receptors
  • NHRs hormonal nuclear receptors
  • the activation of the PPAR-alpha subtype by its natural ligands is related to the control of circulating lipid concentrations.
  • Medium, long chain and eicosanoid fatty acids have been described (PNAS 1997 94: 4312) that produce a substantial reduction in plasma triglycerides, a moderate reduction in cholesterol associated with low density lipoproteins (LDL) and a satiety effect. Therefore, the alpha subtype of this family of receptors is presented as a very interesting therapeutic target for the treatment of diseases related to metabolic disorders such as dyslipidemia, cardiovascular disease, diabetes and obesity (Nature Medicine 2004 10: 355)
  • Dyslipidemias are alterations of lipid metabolism, with its consequent alteration of lipid concentrations (eg cholesterol and triglycerides) and lipoproteins in the blood: low density lipoproteins (LDL), very low density (VLDL) and density intermediary (IDL).
  • LDL low density lipoproteins
  • VLDL very low density
  • IDL density intermediary
  • LDL-cholesterol concentrations An increase in LDL-cholesterol concentrations is directly related to the risk of coronary heart disease.
  • a smaller percentage of the cholesterol molecules is transported through high-density lipoproteins, the HDL, whose main function is to extract the cholesterol deposited in the arterial walls and transport it to the liver for intestinal elimination. It has been described that an elevated level of HDL-cholesterol is associated with the decreased risk of coronary heart disease.
  • Coronary heart disease is the leading cause of mortality in industrialized countries.
  • the oxidation of lipids present in low density lipoproteins (LDL) is a marker of the development of arteriosclerosis and coronary heart disease (Cell 2001 104: 503).
  • LDL low density lipoproteins
  • ROS reactive oxygen species
  • Arteriosclerosis can be considered as a form of chronic inflammation resulting from the interaction between modified lipoproteins, macrophages, T cells and natural cellular elements of the arterial wall.
  • the inflammatory process can lead to the development of complex lesions or plaques.
  • the rupture of plaques and thrombosis results in myocardial infarction (Cell 2001 104: 503).
  • Endocannabinoids have lower affinity for the PPAR-alpha receptor than synthetic ligands currently available such as thiazolidinediones (Anal. Biochem. 2005 344: 8). It is important to know that the US Food and Drug Administration dictated that, before starting clinical studies with PPAR agonists, a 2-year rodent study should be done (http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnfor mation / Guidances / ucm071624.pdf)
  • Dual ligands that exhibit CB1 receptor inhibitory activity and that, at the same time have a moderate affinity for the PPAR-alpha receptor, may be useful for the treatment of diseases such as obesity, since simultaneous action on both receptors can lead to synergistic action for negative appetite modulation (Neuropharmacology. 2008 54: 226-34). It is also believed that the fact that the affinity for the PPAR receptor is lower decreases the risk of observed side effects (Toxicology 2007 346: 2).
  • the invention relates to a new class of molecules, namely amide derivatives of amphetamine-conjugated fatty acids derived from 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA) as dual ligands of the PPAR-alpha and CB1 receptors, and oxidation inhibitors of the LDL, as well as its preparation procedure and its use.
  • MDMA 3,4-methylenedioxymethamphetamine
  • oxidation inhibitors of the LDL as well as its preparation procedure and its use.
  • These compounds can be used for the preparation of a drug for the induction of satiety and control of intake, modulation of body fat and regulation of lipid metabolism as well as the preparation of a drug for the treatment of diabetes, obesity, metabolic syndrome and cardiovascular diseases .
  • the present invention describes fatty acid derivatives with amphetamines for the treatment of eating disorders.
  • the present invention relates to a new family of compounds derived from fatty acids with amphetamines of general formula (I). These compounds have shown a clear inhibitory activity of the oxidation of low density lipoproteins (LDL) and appetite and with affinity for the CB1 and PPAR-alpha receptors. The fundamental role of previous receptors in diseases and conditions of a very diverse nature, especially food, is known.
  • LDL low density lipoproteins
  • a first aspect of the present invention relates to a new compound of general formula (I) (also referred to as the compound of the invention):
  • X and Y can be the same or different independently and are selected from H, halogen and methyl;
  • n is an integer from 1 to 4.
  • Ri and R 2 can be the same or different independently and are selected from H and C 1 -C 6 alkyl or can be linked by a simple bond between the two oxygen atoms, forming a new cycle;
  • R3 is selected from H, C1-C6 alkyl and C1-C4 alkenyl
  • R 4 is selected from H, halogen and C1-C4 alkyl
  • R5 is a compound of general formula (II):
  • R6 is selected from H and C1-C4 alkyl
  • R 7 is selected from C 8 -C 30 alkyl and alkenyl C 8 -C 30; and its salts, preferably any pharmaceutically acceptable salt, solvates and prodrugs thereof.
  • alkyl refers, in the present invention, to radicals of hydrocarbon chains, linear or branched, having 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 4, and which are attached to the rest of the molecule by a single bond, for example, methyl, ethyl, n-propyl, / - propyl, n-butyl, ferc-butyl, sec-butyl, n-pentyl, n-hexyl, etc.
  • the alkyl groups may optionally be substituted by one or more substituents such as halogen, hydroxyl, alkoxy, carboxyl, carbonyl, cyano, acyl, alkoxycarbonyl, amino, nitro, mercapto and alkylthio.
  • substituents such as halogen, hydroxyl, alkoxy, carboxyl, carbonyl, cyano, acyl, alkoxycarbonyl, amino, nitro, mercapto and alkylthio.
  • alkenyl refers to hydrocarbon chain radicals containing one or more double carbon-carbon bonds, for example, vinyl, 1-propenyl, allyl, isoprenyl, 2-butenyl, 1, 3-butadienyl, etc.
  • Alkenyl radicals may be optionally substituted by one or more substituents such as halo, hydroxy, alkoxy, carboxyl, cyano, carbonyl, acyl, alkoxycarbonyl, amino, nitro, mercapto and alkylthio.
  • Halogen refers to fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • X and Y may be the same or different independently and are selected from H and methyl.
  • n is an integer selected from 1 or 3.
  • Ri and F3 ⁇ 4 may be the same or different independently and are selected from H and methyl or may be linked by a simple bond between the two oxygen atoms, forming a new cycle.
  • R3 is selected from H and C 1 -C3 alkyl.
  • R 4 is selected from H and CH 3 .
  • R5 is a compound of formula (II):
  • R 6 is selected from H and CH 3 and R 7 is a C15-C25 alkenyl group.
  • R 7 has a number of unsaturations between 1 and 6.
  • the compound of general formula (I) refers to a compound that is selected from the following group:
  • the compounds of the present invention represented by the formula (I) may include isomers, depending on the presence of multiple bonds, including optical or enantiomeric isomers, depending on the presence of chiral centers.
  • the individual isomers, enantiomers or diastereoisomers and mixtures thereof fall within the scope of the present invention, that is, the term isomer also refers to any mixture of isomers, such as diastereomers, racemic, etc., even their optically isomers. assets or mixtures in different proportions thereof.
  • the individual enantiomers or diastereoisomers, as well as mixtures thereof, can be separated by conventional techniques. Also, within the scope of this invention are the prodrugs of the compounds of formula (I).
  • prodrug or "prodrug” as used herein includes any compound derived from a compound of formula (I) - for example and not limited to: esters (including carboxylic acid esters, amino acid esters, phosphate esters, esters of sulphonate of metal salts, etc.), carbamates, amides, etc. - that when administered to an individual can be transformed directly or indirectly into said compound of formula (I) in said individual.
  • said derivative is a compound that increases the bioavailability of the compound of formula (I) when administered to an individual or that enhances the release of the compound of formula (I) in a biological compartment.
  • the nature of said derivative is not critical as long as it can be administered to an individual and provides the compound of formula (I) in a biological compartment of an individual.
  • the preparation of said prodrug can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art.
  • the compounds of the invention may be in crystalline form as free compounds or as solvates.
  • solvate includes both pharmaceutically acceptable solvates, that is, solvates of the compound of formula (I) that can be used in the manufacture of a medicament, as pharmaceutically acceptable solvates, which may be useful in the preparation of pharmaceutically acceptable solvates or salts.
  • the nature of the pharmaceutically acceptable solvate is not critical as long as it is pharmaceutically acceptable.
  • the solvate is a hydrate.
  • Solvates can be obtained by conventional solvation methods known to those skilled in the art.
  • the compounds of formula (I), their salts, prodrugs or solvates will preferably be found in a pharmaceutically acceptable or substantially pure form, that is, having a pharmaceutically acceptable level of purity excluding pharmaceutical additives. normal such as diluents and carriers, and not including material considered toxic at normal dosage levels.
  • the purity levels for the active ingredient are preferably greater than 50%, more preferably greater than 70%, and still more preferably greater than 90%. In a preferred embodiment, they are greater than 95% of the compound of formula (I), or of its salts, solvates or prodrugs.
  • the compound of the general formula (I) is used as a medicament.
  • the present invention also relates to pharmaceutical compositions comprising at least one compound of the invention, or a tautomer, a pharmaceutically acceptable salt, a derivative or a prodrug thereof, together with a pharmaceutically acceptable carrier or carrier, an excipient or a vehicle, for administration to a patient.
  • the pharmaceutical composition further comprises another active ingredient.
  • compositions are the adjuvants and vehicles known to those skilled in the art and commonly used in the elaboration of therapeutic compositions.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of the agent or compound. capable of developing the therapeutic action determined by its pharmacological properties, calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics of the compounds, including age, patient's condition, severity of alteration or disorder, and the route and frequency of administration.
  • the compounds described in the present invention, their salts, prodrugs and / or solvates as well as the pharmaceutical compositions containing them can be used together with other drugs, or additional active ingredients, to provide a combination therapy.
  • Said additional drugs may be part of the same pharmaceutical composition or, alternatively, they may be provided in the form of a separate composition for simultaneous or non-simultaneous administration to the pharmaceutical composition comprising a compound of formula (I), or a salt, prodrug or solvate thereof.
  • the pharmaceutical compositions are suitable for oral administration, in solid or liquid form.
  • Possible forms for oral administration are tablets, capsules, syrups or solutions and may contain conventional excipients known in the pharmaceutical field, as aggregating agents (eg syrup, acacia, gelatin, sorbitol, tragacanth or polyvinyl pyrrolidone), fillers (eg lactose, sugar, corn starch, calcium phosphate, sorbitol or glycine), disintegrants (eg starch, polyvinyl pyrrolidone or microcrystalline cellulose) or a pharmaceutically acceptable surfactant such as sodium lauryl sulfate.
  • aggregating agents eg syrup, acacia, gelatin, sorbitol, tragacanth or polyvinyl pyrrolidone
  • fillers eg lactose, sugar, corn starch, calcium phosphate, sorbitol or glycine
  • disintegrants eg starch, polyviny
  • compositions for oral administration can be prepared by conventional methods of Galenic Pharmacy, as mixing and dispersion.
  • the tablets can be coated following methods known in the pharmaceutical industry.
  • the pharmaceutical compositions can be adapted for parenteral administration, as sterile solutions, suspensions, or lyophilized products of the invention, using the appropriate dose. Suitable excipients, such as pH buffering agents or surfactants, can be used.
  • the aforementioned formulations can be prepared using conventional methods, such as those described in the Pharmacopoeias of different countries and in other reference texts.
  • the administration of the compounds or compositions of the present invention can be performed by any suitable method, such as intravenous infusion and oral, intraperitoneal or intravenous routes. Oral administration is preferred for the convenience of patients and for the chronic nature of the diseases to be treated.
  • the amount administered of a compound of the present invention will depend on the relative efficacy of the compound chosen, the severity of the disease to be treated and the weight of the patient. However, the compounds of this invention will be administered one or more times a day, for example 1, 2, 3 or 4 times daily, with a total dose between 0.1 and 1000 mg / kg / day. It is important to keep in mind that it may be necessary to introduce variations in the dose, depending on the age and condition of the patient, as well as modifications in the route of administration.
  • the compounds and compositions of the present invention can be used together with other medicaments in combination therapies.
  • the other drugs may be part of the same composition or of a different composition, for administration at the same time or at different times.
  • the present invention relates to a process for obtaining a compound of formula (I) comprising the following steps:
  • R 7 is selected from C8-C30 alkyl and C8-C30 alkenyl and Rs is selected from NH 3 , NH 2 -CH 3 , NH 2 -CH 2 -CH 3 , NH- (CH 3 ) 2 , N- (CH 3 ) 3 NH- (CH 2 -CH 3 ) 2 and N- (CH 2 -CH 3 ) 3 ;
  • X and Y can be the same or different independently and are selected from H, halogen and methyl;
  • Ri and R2 can be the same or different independently and are selected from H and Ci-C 6 alkyl or can be linked by a simple bond between the two oxygen atoms, forming a new cycle;
  • R3 is selected from H, C1-C6 alkyl and C1-C4 alkenyl
  • R 4 is selected from H, halogen and C1-C4 alkyl
  • R6 is selected from H and C1-C4 alkyl
  • R 7 is selected from C 8 -C 30 alkyl and alkenyl C 8 -C 30;
  • R 8 is selected from NH 3 , NH 2 -CH 3 , NH 2 -CH 2 -CH 3 , NH- (CH 3 ) 2 , N- (CH 3 ) 3 NH- (CH 2 -CH 3 ) 2 and N - (CH 2 -CH 3 ) 3 ;
  • the present invention relates to the use of at least one compound of formula (I) for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of a disease or eating disorder.
  • the present invention relates to the use of at least one compound of formula (I) for the manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease mediated by the CB1 cannabinoid receptor and / or receptor mediated PPAR-alpha and / or for the inhibition of LDL oxidation.
  • eating disorders or disorders are selected from the list comprising: obesity, anorexia, lipid dysfunction, diabetes, cardiovascular diseases and metabolic syndrome.
  • the compound of formula (I) is used to reduce subcutaneous fat and / or to induce satiety and control intake.
  • Figure 4 Acute intake experiment with AAHHA (/ V-arachidonyl-3,4-dihydroxyanfetamine).
  • Figure 5 Acute intake experiment with AAHMA / V-arachidonyl-3-methoxy-4-hydroxyphemphamine.
  • Figure 6 Experiment of acute intake with AAHHMA (/ V-arachidonyl- / V-methyl-3,4-dihydroxyanfetamine).
  • Figure 7 Acute intake experiment with (/ V-oleyl-2-phenylethylamine).
  • Figure 8 Test of receptor ligand with OLHHA.
  • Figure 9 Test ligand receptor with OLHMA.
  • Figure 10 Assay ligand receptor with AAHHA.
  • Amphetamines HHA, HMA and HHMA, metabolites of MDMA were obtained by organic synthesis according to the methodology described in the literature (Bioorg. Med. Chem. 2002 10: 1085). All reagents and solvents used, except when indicated, were obtained from commercial suppliers and were used without prior purification. All 1 H and 13 C NMR analyzes were performed with Varian Anova 500 and Varian Mercury 400 spectrometers. The progress of all reactions was monitored by TLC (thin layer chromatography) on aluminum sheets with a silica gel layer. 60 (HF-254, Merck), with a thickness of 0.25 mm. Chemical synthesis
  • the reaction conversion was evaluated by TLC.
  • the DMF was removed under reduced pressure and the product was purified by flash chromatographic column using 20% ethyl acetate / hexane as eluent.
  • the product was obtained as a yellow oil with a yield of 43
  • the represented compound was prepared by following the procedure described above using the same starting reagents and the same molar amounts, substituting 3,4-dihydroxyanfetamine for 3-methoxy-4-hydroxyphemphamine.
  • the compound was prepared following the procedure described above using the same starting reagents, using the same molar amounts by replacing oleic acid with arachidonic acid.
  • the compound was prepared following the procedure described above using the same starting reagents, using the same molar amounts and substituting 3,4-dihydroxyethetamine for 3-methoxy-4-hydroxyphemphamine and oleic acid for arachidonic acid.
  • the compound was prepared following the procedure described above using the same molar amounts and substituting 3,4-dihydroxyethetamine for 3,4-dihydroxymethamphetamine and oleic acid with arachidonic acid.
  • the compound was prepared following the procedure described above using the same molar amounts of 2-phenylethylamine and oleic acid. The product was obtained as a white solid with 95% yield.
  • the receptor ligand assay for the CB1 receptor evaluates the ability of synthesized compounds to displace [ 3 H] SR141716 (known ligand with affinity for CB1 receptor) in a rat cerebellum homogenate.
  • the ligand receptor assay test was performed using the labeled CB1 antagonist [ 3 H] SR141716.
  • BSA Bovine serum
  • the " reporter gene assay" is an in vitro method used to determine and quantify the existence of physical interactions between proteins, being useful to confirm in our case the interaction of the PPAR-alpha transcription factor and the SRC-1 coativator in MCF cells -7.
  • Oleiletanolamide was used as a positive control and anandamide as a negative control.
  • Oleiletanolamide (OEA), GW7647, anandamide (AEA) and oleic acid were supplied by Tocris Bioscience (Cookson Lted. Bristol, UK).
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • DNA constructs The eukaryotic expression vector pSG5 was used as the cDNA expression vehicle for the human PPAR- ⁇ receptor (4100 base pairs, Stratagene Co.). This construct was used for in vivo overexpression of the protein in mammalian cells.
  • Human MCF-7 breast cancer cells were cultured in 6-well plates (10 5 cells / mL) and grown overnight for stabilization in a Dulbecco-modified Eagle medium (DMEM) free of phenol red supplemented with a 5% fetal bovine serum or carbon-treated FBS.
  • DMEM Dulbecco-modified Eagle medium
  • Liposomes containing DNA plasmids were formed by incubating 1 ⁇ g of an expression vector for PPAR-alpha, RXR-alpha and wild SRC-1 and 1 g of luciferase indicator plasmid with 10 ⁇ g of / V- [1 - (2,3- dioleoyloxy) propyl] - ⁇ /, ⁇ /, / V-trimethylammonium methyl sulfate (DOTAP, Roche) for 15 minutes at room temperature in a total volume of 100 ⁇ _. After dilution with 900 ⁇ _ of DMEM free of phenol red, liposomes were added to the cells.
  • Phenol-free DMEM supplemented with 500 ⁇ _ of 15% carbon-treated FBS was added 4 h after transfection.
  • the cells were treated 16 hours with different concentrations in DMSO (10 "9 , 10 “ 8 , 10 “7 , 10 “ 6 , 10 “5 and 10 “ 4 M) of OEA, GW7647, AEA, oleic acid and the different compounds on evaluation as indicated.
  • the cells were used 15 hours after stimulation using the lysis pH regulatory solution of the reporter gene following the manufacturer's instructions (Roche Diagnostics).
  • the chemiluminescence assay that allows quantitative determination of luciferase activity in transfected cells was also carried out following the supplier's instructions (Luciferase Repórter Gene Assay, constant light signal from Roche Diagnostics GmbH): The presence of this enzyme is detectable in extracts of cells transfected thanks to their bioluminescence: the reaction catalyzed by luciferase transforms luciferin into oxyluciferin in the presence of ATP, Mg 2+ and O2, and also produces photons of visible light.
  • Luciferase activity was normalized with respect to protein concentration (previously obtained following the Bradford method with the Bradford Protein Assay Kit 1x Quick Start reagent kit commercially supplied by Bio-Rad Laboratories Inc. and using a VERSAmax® microplate reader from Molecular Devices Corp.), and induction factors were calculated as the ratio of luciferase activity of ligand stimulated cells to solvents as shown in Table 1 corresponding to the results of receptor ligand and affinity assay experiments for PPAR- alpha.
  • the fatty acid amide hydrolase inhibition (FAAH) assay evaluates the ability of the described compounds to inhibit FAAH enzyme activity.
  • Rat brain cortex was used as a source of FAAH and tritiated anandamide as a substrate.
  • the inhibition of degradation of tritiated anandamide by the described compounds was monitored with a beta particle counter.
  • BSA bovine serum albumin
  • LDL was isolated according to a procedure described above (Med. Clin. (Barc.) 2000 1 15: 166). LDL oxidation monitoring.
  • a 96-well ELISA plate was used and in each well 140 [L of the diluted LDL (0.06 g / L) and 10 ⁇ of the product diluted in methanol were added and, with the same pipette, the content of Each well. Subsequently, 10 ⁇ of a 100 ⁇ solution of CuSO 4 was added (the final concentration in each well was: 0.1, 0.5, 1.0 ⁇ of product, 0.05 g / L of LDL and 5 ⁇ of CuSO 4 ) and the plate was placed on the spectrophotometer (Infinite Reader M200 - TECAN IBERICA, Mánnedorf, Switzerland). The absorbance at 234 nm was monitored at 15 minute intervals at 36.5 ° C.
  • the variable used to study the resistance of LDL to oxidation was "lag time” (minutes).
  • the oxidation curve profile of the dienes present in the LDL can be divided into three consecutive phases: slow phase, propagation phase and decomposition phase.
  • the "lag time” is determined by the intersection of the propagation phase with the extrapolation of the slow phase.
  • the “lag time” was calculated using the molar absorbance ⁇ for
  • the acute effect on the intake of all products was tested in fasting animals for 24 hours.
  • the 2-phenylethylamine amide with oleic acid (OLFEA) was used as a theoretical negative control due to the absence of the catechol group.
  • the compound OLHHA one of the most active compounds in the intake experiment was tested in an open-field experiment using the same doses.
  • the open-field test measures the animal's natural conflict between the tendency to explore and the self-protective reaction of suspicion.
  • the rats were acclimatized to the test room for 30 minutes before the behavioral test.
  • the animal was injected with the product and placed in the center of the board measuring 40 cm x 40 cm and 30 cm high walls.
  • the total displacement and time spent by the animal in the corners or the center of the board was recorded using a video tracking system (Smart® Panlab, Barcelona, Spain).
  • the OLHHA product showed no modulation in the animal's behavior in the open field test.

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Abstract

La presente invención se refiere a nuevos derivados amidas de ácidos grasos conjugados con anfetaminas, que se comportan como ligandos duales de los receptores cannabionides tipo 1 (CB1 ) y del subtipo alfa de los receptores activados por el proliferador de peroxisomas (PPAR-alfa), y como potentes agentes inhibidores de la oxidación de Ia Lipoproteína de Baja Densidad (LDL), así como a su procedimiento de preparación, y su utilización como herramienta farmacológica y como fármacos para modular las acciones reguladas por los citados receptores, como la inducción de la saciedad y control de ingesta, la disminución de la grasa corporal y la regulación del metabolismo lipídico.

Description

DERIVADOS DE AMIDA DE ACIDOS GRASOS CON ANFETAMINAS PARA EL TRATAMIENTO DE DESORDENES ALIMENTICIOS
La presente invención se refiere a una nueva serie de derivados de amida de ácidos grasos con anfetaminas y sus sales, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, que muestran una afinidad por receptores cannabinoides tipo 1 (CB1 ) y del subtipo alfa de los receptores activados por el proliferador de peroxisomas (PPAR-alfa), y como potentes agentes antioxidantes en la oxidación de la Lipoproteína de Baja Densidad (LDL). Los compuestos pueden modular las acciones reguladas por los citados receptores, como la inducción de la saciedad y control de ingesta, la disminución de la grasa corporal y la regulación del metabolismo lipídico.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El sistema endocannabinoide está compuesto por los receptores cannabinoides, ligandos endógenos (endocannabinoides) y los sistemas enzimáticos necesarios para su biosíntesis y degradación (Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2006 46: 101 ). Hasta el momento han sido identificados dos tipos de receptores cannabinoides: CB1 y CB2. Los dos receptores cannabinoides se encuentran acoplados a la proteína G a través de la cual modulan la actividad de las adenilato ciclasas (AC) y proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), y eventos intracelulares que llevan a la regulación en la expresión de diversos genes. La activación de los receptores CB1 también regula los canales de Ca+2 voltaje dependientes y los canales de potasio. Los receptores CB1 se encuentran distribuidos en el sistema nervioso central y en otros órganos como tejido adiposo, páncreas endocrino, músculo, pulmones, hígado y ríñones, mientras que los receptores CB2 se expresan principalmente en el sistema inmunológico y células hematopoyéticas (Nature Reviews Drug Discovery 2004 3:771 ). El sistema endocannabinoide parece estar relacionado con un gran número de condiciones fisiológicas y patológicas a nivel neurológico, psiquiátrico, cardiovascular, desarrollo del cáncer, trastornos reproductivos y alimentarios. Un mejor conocimiento de las vías de biosíntesis de los endocannabinoides y los mecanismos de regulación a nivel celular de dichas vías se consideran las principales prioridades en la investigación de los cannabinoides (Nature Reviews Drug Discovery 2004 3:771 ).
El receptor CB1 fue, dentro del sistema endocannaninoide, la diana terapéutica que inicialmente recibió mayor atención en las investigaciones para el tratamiento de la obesidad. Es bien conocido que sustancias agonistas cannabinoides aumentan el apetito y por tanto se postuló que bloqueando este receptor se podría disminuir la ingesta de comida llevando a una perdida de peso. El Rimonabant, también conocido como SR141716 o Acomplia®, fue el primer antagonista CB1 en ser descrito y uno de los primeros en ser estudiado clínicamente para el tratamiento de obesidad (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2006 46: 101 , Nat Rev Drug Disc. 2004 3:771 ). Los ensayos clínicos llamados RIO (Rimonabant In Obesity) (Lancet 2005 365: 1389; JAMA 2006 295:761 ; Lancet 2006) 368: 1 160) mostraron la eficacia de Rimonabant como agente anti-obesidad. Desafortunadamente algunos datos de los estudios clínicos han asociado el uso crónico del Rimonabant con un aumento de la depresión, ansiedad y un aumento de tendencias suicidas (Lancet 2007 370: 1706; Lancet 2008 371 :556; Lancet 2008 371 :555). Por lo que, en octubre de 2008, la Agencia Europea del Medicamento decide la suspensión temporal del mismo.
Por otro lado, los receptores activados por el proliferador de peroxisoma (PPAR) son una superfamilia perteneciente a los receptores nucleares hormonales (NHR), que son factores de transcripción activados por ligando que juegan un papel fundamental en la regulación del metabolismo de lípidos y de glúcidos. Tres subtipos de receptores PPAR han sido descritos: PPAR-alfa, PPAR-gamma y PPAR-delta (Pharmacol. Res. 2005 51 :85)
La activación del subtipo PPAR-alfa por sus ligandos naturales está relacionada con el control de las concentraciones de lípidos circulantes. Se han descrito ácidos grasos de cadena media, larga y eicosanoides (PNAS 1997 94:4312) que producen una reducción sustancial de los triglicéridos del plasma, una reducción moderada del colesterol asociado a lipoproteínas de baja densidad (LDL) y un efecto de saciedad. Por ello, el subtipo alfa de esta familia de receptores se presenta como una diana terapéutica muy interesante para el tratamiento de las enfermedades relacionadas con alteraciones metabólicas como las dislipemias, enfermedad cardiovascular, diabetes y obesidad (Nature Medicine 2004 10:355)
Las dislipemias son alteraciones del metabolismo de los lípidos, con su consecuente alteración de las concentraciones de lípidos (ej. colesterol y triglicéridos) y lipoproteínas en la sangre: lipoproteínas de baja densidad (LDL), de muy baja densidad (VLDL) y de densidad intermediaria (IDL). Normalmente, la molécula de colesterol es transportada ligada a las lipoproteínas LDL. Un incremento en las concentraciones LDL-colesterol está directamente relacionada con el riesgo de enfermedad coronaria. Un porcentaje más pequeño de las moléculas de colesterol es transportado a través de las lipoproteínas de alta densidad, las HDL, cuya función principal es extraer el colesterol depositado en las paredes arteriales y transportarlo hasta el hígado para su eliminación vía intestinal. Se ha descrito que un nivel elevado de HDL-colesterol está asociado con la disminución del riesgo de enfermedad coronaria. Por tanto, en el tratamiento de las dislipemias es igualmente importante reducir las concentraciones de LDL-colesterol como aumentar las de HDL-colesterol (Am. J. Med. 1977 62:707; N. England J. Med. 1991 325:373; Ann. Internal. Med. 1979 90:85) En la actualidad se están utilizando clínicamente los derivados del fibrato para el control de las dislipemias (Am J Med. 2009 122: 962), dando lugar a distintos métodos con derivados como el clofibrato y el fenofibrato (WO2007047880 2007; WO2007047724 2007), que se unen al receptor PPAR-alfa y regulan distintos factores de trascripción implicados en algunos de los procesos anteriormente descriptos (Curr. Atheroscler Rep 2000 2: 327). Además del tratamiento de las dislipemias, se están describiendo agentes agonistas duales de PPAR-alfa/gamma con potencial uso para el tratamiento de la diabetes tipo 2 (J Med Chem 2004 47:41 18).
La enfermedad coronaria es la principal causa de mortalidad en los países industrializados. La oxidación de los lípidos presentes en las lipoproteínas de baja densidad (LDL) es un marcador del desarrollo de arteriesclerosis y enfermedad coronaria (Cell 2001 104:503). Se postula que la producción excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) está implicada en la patogénesis de la arterioesclerosis y la hipertensión (Physiol. Rev. 2002 82:47), la oxidación del LDL por las ROS es uno de los primeros eventos en el desarrollo de la enfermedad. La arterioesclerosis puede ser considerada como una forma de inflamación crónica resultado de la interacción entre lipoproteínas modificadas, macrófagos, células T y elementos celulares naturales de la pared arterial. El proceso inflamatorio puede conducir al desarrollo de lesiones complejas o placas. La ruptura de las placas y la trombosis resulta en el infarto de miocardio (Cell 2001 104:503).
Se ha descrito que algunos de los endocannabinoides conocidos presentan además de afinidad por el receptor CB1 también por el receptor PPAR-alfa como por ejemplo el noladin éter y virodhamida (Br. J Pharmacol 2007 152:576; Biochem Soc Trans 2006 34: 1095). Algunos cannabinoides sintéticos también han demostrado afinidad por el receptor PPAR-alfa como el WIN55212-2. (Biochem Soc Trans 2006 34: 1095).
Los endocannabinoides tienen menor afinidad por el receptor PPAR-alfa que los ligandos sintéticos actualmente disponibles como las tiazolidindionas (Anal. Biochem. 2005 344:8). Es importante saber que la Food and Drug Administration de Estados Unidos dictó que, antes de empezar estudios clínicos con agonistas PPAR, debería ser hecho un estudio de 2 años en roedores (http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnfor mation/Guidances/ucm071624.pdf)
Ligandos duales que presentaran actividad inhibidora del receptor CB1 y que, al mismo tiempo tengan una afinidad moderada por el receptor PPAR- alfa, pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades como la obesidad, pues la acción simultánea en los dos receptores puede llevar a una acción sinérgica para la modulación negativa del apetito (Neuropharmacology. 2008 54: 226-34). También se cree que el hecho de que la afinidad por el receptor PPAR sea menor disminuye el riesgo de efectos colaterales observados (Toxicology 2007 346:2).
El hecho de que estos compuestos, además de regular la saciedad tengan un efecto protector sobre la oxidación de la LDL puede ser interesante ya que esta actividad se relaciona con una reducción del riesgo de problemas cardiovasculares que, muchas veces, están asociados a la obesidad.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a una nueva clase de moléculas, concretamente derivados amida de ácidos grasos conjugados con anfetaminas derivadas de la 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA) como ligandos duales de los receptores PPAR-alfa y CB1 , e inhibidores de la oxidación de la LDL, así como su procedimiento de preparación y su utilización. Estos compuestos pueden ser utilizados para la preparación de un medicamento para la inducción de saciedad y control de ingesta, modulación de la grasa corporal y regulación del metabolismo lipídico así como la preparación de un medicamento para el tratamiento diabetes, obesidad, síndrome metabólico y enfermedades cardiovasculares.
La presente invención describe derivados de ácidos grasos con anfetaminas para el tratamiento de desórdenes alimenticios.
Por lo tanto, la presente invención está referida a una nueva familia de compuestos derivados de ácidos grasos con anfetaminas de fórmula general (I). Estos compuestos han mostrado una clara actividad inhibitoria de la oxidación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) y del apetito y con afinidad por los receptores CB1 y PPAR-alfa. Es conocido el papel fundamental que tienen los receptores anteriores en enfermedades y condiciones de muy diversa naturaleza, especialmente alimenticia.
Por lo tanto un primer aspecto de la presente invención se refiere a un nuevo compuesto de fórmula general (I) (también referido como el compuesto de la invención):
Figure imgf000008_0001
(l )
donde
X e Y pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H, halógeno y metilo;
n es un número entero desde 1 a 4;
Ri y R2 pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H y alquilo C1 -C6 o pueden estar unidos por un enlace simple entre los dos átomos de oxígeno, formando un nuevo ciclo;
R3 se selecciona entre H, alquilo C1-C6 y alquenilo C1-C4;
R4 se selecciona entre H, halógeno y alquilo C1-C4;
R5 es un compuesto de fórmula general (II):
Figure imgf000008_0002
(II) donde:
R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C4;
R7 se selecciona entre alquilo C8-C30 y alquenilo C8-C30; y sus sales, preferiblemente cualquier sal farmacéuticamente aceptable, solvatos y prodrogas del mismo.
El término "alquilo" se refiere, en la presente invención, a radicales de cadenas hidrocarbonadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 4, y que se unen al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, /- propilo, n-butilo, ferc-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, etc. Los grupos alquilo pueden tener opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, ciano, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alquiltio.
El término "alquenilo" se refiere a radicales de cadenas hidrocarbonadas que contienen uno o más enlaces carbono-carbono dobles, por ejemplo, vinilo, 1 -propenilo, alilo, isoprenilo, 2-butenilo, 1 ,3-butadienilo, etc. Los radicales alquenilos pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halo, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alquiltio. Halógeno se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo.
En una realización preferida X e Y pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H y metilo. En una realización preferida n es un número entero seleccionado entre 1 ó 3.
En una realización preferida Ri y F¾ pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H y metilo o pueden estar unidos por un enlace simple entre los dos átomos de oxígeno, formando un nuevo ciclo. En una realización preferida R3 se selecciona entre H y alquilo C1 -C3.
En una realización preferida R4 se selecciona entre H y CH3.
En una realización preferida R5 es un compuesto de fórmula (II):
Figure imgf000010_0001
(II) donde R6 se selecciona entre H y CH3 y R7 es un grupo alquenilo C15-C25.
En una realización preferida R7 tiene un número de insaturaciones entre 1 y 6.
En otra realización preferida el compuesto de fórmula general (I) se refiere a un compuesto que se selecciona del siguiente grupo:
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Los compuestos de la presente invención representados por la fórmula (I) pueden incluir isómeros, dependiendo de la presencia de enlaces múltiples, incluyendo isómeros ópticos o enantiomeros, dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isómeros, enantiomeros o diastereoisómeros individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente invención, es decir, el término isómero también se refiere a cualquier mezcla de isómeros, como diastereómeros, racémicos, etc., incluso a sus isómeros ópticamente activos o las mezclas en distintas proporciones de los mismos. Los enantiómeros o diastereoisómeros individuales, así como sus mezclas, pueden separarse mediante técnicas convencionales. Asimismo, dentro del alcance de esta invención se encuentran los profármacos de los compuestos de fórmula (I). El término "prodroga" o "profármaco" tal como aquí se utiliza incluye cualquier compuesto derivado de un compuesto de fórmula (I) -por ejemplo y no limitativamente: ésteres (incluyendo ésteres de ácidos carboxílicos, ésteres de aminoácidos, ésteres de fosfato, ésteres de sulfonato de sales metálicas, etc.), carbamatos, amidas, etc.- que al ser administrado a un individuo puede ser transformado directa o indirectamente en dicho compuesto de fórmula (I) en el mencionado individuo. Ventajosamente, dicho derivado es un compuesto que aumenta la biodisponibilidad del compuesto de fórmula (I) cuando se administra a un individuo o que potencia la liberación del compuesto de fórmula (I) en un compartimento biológico. La naturaleza de dicho derivado no es crítica siempre y cuando pueda ser administrado a un individuo y proporcione el compuesto de fórmula (I) en un compartimento biológico de un individuo. La preparación de dicho profármaco puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.
Los compuestos de la invención pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos. En este sentido, el término "solvato", tal como aquí se utiliza, incluye tanto solvatos farmacéuticamente aceptables, es decir, solvatos del compuesto de fórmula (I) que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como solvatos farmacéuticamente no aceptables, los cuales pueden ser útiles en la preparación de solvatos o sales farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del solvato farmacéuticamente aceptable no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, el solvato es un hidrato. Los solvatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatación conocidos por los expertos en la materia. Para su aplicación en terapia, los compuestos de fórmula (I), sus sales, profármacos o solvatos, se encontrarán, preferentemente, en una forma farmacéuticamente aceptable o sustancialmente pura, es decir, que tiene un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable excluyendo los aditivos farmacéuticos normales tales como diluyentes y portadores, y no incluyendo material considerado tóxico a niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza para el principio activo son preferiblemente superiores al 50%, más preferiblemente superiores al 70%, y todavía más preferiblemente superiores al 90%. En una realización preferida, son superiores al 95% de compuesto de fórmula (I), o de sus sales, solvatos o profármacos.
En otra realización preferida el compuesto se fórmula general (I) se usa como medicamento.
En otro aspecto, la presente invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto de la invención, o un tautómero, una sal farmacéuticamente aceptable, un derivado o un profármaco del mismo, junto con un transportador o carrier farmacéuticamente aceptable, un excipiente o un vehículo, para la administración a un paciente.
En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende además otro principio activo.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar la acción terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración.
Los compuestos descritos en la presente invención, sus sales, profármacos y/o solvatos así como las composiciones farmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos, o principios activos, adicionales para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I), o una sal, profármaco o solvato del mismo.
En una realización preferida de la presente invención, las composiciones farmacéuticas son adecuadas para la administración oral, en forma sólida o líquida. Las posibles formas para la administración oral son tabletas, cápsulas, siropes o soluciones y pueden contener excipientes convencionales conocidos en el ámbito farmacéutico, como agentes agregantes (p.e. sirope, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto o polivinil pirrolidona), rellenos (p.e. lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato de calcio, sorbitol o glicina), disgregantes (p.e. almidón, polivinil pirrolidona o celulosa microcristalina) o un surfactante farmacéuticamente aceptable como el lauril sulfato de sodio.
Las composiciones para administración oral pueden ser preparadas por métodos los convencionales de Farmacia Galénica, como mezcla y dispersión. Las tabletas se pueden recubrir siguiendo métodos conocidos en la industria farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas se pueden adaptar para la administración parenteral, como soluciones estériles, suspensiones, o liofilizados de los productos de la invención, empleando la dosis adecuada. Se pueden emplear excipientes adecuados, como agentes tamponadores del pH o surfactantes.
Las formulaciones anteriormente mencionadas pueden ser preparadas usando métodos convencionales, como los descritos en las Farmacopeas de diferentes países y en otros textos de referencia.
La administración de los compuestos o composiciones de la presente invención puede ser realizada mediante cualquier método adecuado, como la infusión intravenosa y las vías oral, intraperitoneal o intravenosa. La administración oral es la preferida por la conveniencia de los pacientes y por el carácter crónico de las enfermedades a tratar.
La cantidad administrada de un compuesto de la presente invención dependerá de la relativa eficacia del compuesto elegido, la severidad de la enfermedad a tratar y el peso del paciente. Sin embargo, los compuestos de esta invención serán administrados una o más veces al día, por ejemplo 1 , 2, 3 ó 4 veces diarias, con una dosis total entre 0.1 y 1000 mg/Kg/día. Es importante tener en cuenta que puede ser necesario introducir variaciones en la dosis, dependiendo de la edad y de la condición del paciente, así como modificaciones en la vía de administración.
Los compuestos y composiciones de la presente invención pueden ser empleados junto con otros medicamentos en terapias combinadas. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o de otra composición diferente, para su administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de un compuesto de fórmula (I) que comprende las siguientes etapas:
- conjugación entre un compuesto de fórmula general (I I I) y cloroformiato de bencilo para dar lugar a un nuevo compuesto de fórmula general (IV), que comprende la siguiente reacción:
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Temperatura ambiente
t = 1 hora evaporación
(I I I) (IV) donde R7 se selecciona entre alquilo C8-C30 y alquenilo C8-C30 y Rs se selecciona entre NH3, NH2-CH3, NH2-CH2-CH3, NH-(CH3)2, N-(CH3)3 NH- (CH2-CH3)2 y N-(CH2-CH3)3;
- reacción del compuesto de fórmula general (IV) con un compuesto de fórmula general (V) para dar lugar al compuesto de fórmula general (I) usando dimetilformamida como disolvente:
Figure imgf000018_0002
(IV) (V) (I) donde
X e Y pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H, halógeno y metilo;
n es un número entero desde 1 a 4; Ri y R2 pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H y alquilo Ci-C6 o pueden estar unidos por un enlace simple entre los dos átomos de oxígeno, formando un nuevo ciclo;
R3 se selecciona entre H, alquilo C1-C6 y alquenilo C1-C4;
R4 se selecciona entre H, halógeno y alquilo C1-C4;
R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C4;
R7 se selecciona entre alquilo C8-C30 y alquenilo C8-C30;
R8 se selecciona entre NH3, NH2-CH3, NH2-CH2-CH3, NH-(CH3)2, N-(CH3)3 NH-(CH2-CH3)2 y N-(CH2-CH3)3;
- evaporación de la dimetilformamida y extracción con acetato de etilo y agua;
- tratamiento de la fase orgánica con sulfato de sodio anhidro y evaporación del disolvente;
- purificación del compuesto de fórmula (I) por cromatografía en columna de gel de sílice FLASH. Los compuestos de fórmula general (V) fueron sintetizadas de acuerdo con la metodología previamente descrita (Bioorg. Med. Chem. 2002 10: 1085).
En otro aspecto la presente invención se refiere al uso de al menos un compuesto de fórmula (I) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de una enfermedad o trastorno de la alimentación.
En otro aspecto la presente invención se refiere al uso de al menos un compuesto de fórmula (I) para la fabricación de un medicamento para para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad mediada por el receptor cannabinoide CB1 y/o mediada por los receptores PPAR-alfa y/o para la inhibición de la oxidación de LDL. Preferiblemente los desórdenes o trastornos de la alimentación se seleccionan de la lista que comprende: obesidad, anorexia, disfunción lipídica, diabetes, enfermedades cardiovasculares y síndrome metabólico. Adicionalmente el compuesto de fórmula (I) se usa para reducir la grasa subcutánea y/o para la inducción de saciedad y control de la ingesta.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 - Experimento de ingesta aguda con OLHHA (7V-oleil-3,4- dihidroxianfetamina).
Figura 2 - Experimento de ingesta aguda con OLHMA (/V-oleil-3-metoxi-4- hidroxianfetamina).
Figura 3 - Experimento de ingesta aguda con OLHHMA (/V-oleil-/V-metil-3,4- dihidroxianfetamina).
Figura 4 - Experimento de ingesta aguda con AAHHA (/V-araquidonil-3,4- dihidroxianfetamina). Figura 5 - Experimento de ingesta aguda con AAHMA /V-araquidonil-3- metoxi-4-hidroxianfetamina. Figura 6 - Experimento de ingesta aguda con AAHHMA (/V-araquidonil-/V- metil-3,4-dihidroxianfetamina).
Figura 7 - Experimento de ingesta aguda con (/V-oleil-2-feniletilamina). Figura 8 - Ensayo de ligando receptor con OLHHA. Figura 9 - Ensayo ligando receptor con OLHMA. Figura 10 - Ensayo ligando receptor con AAHHA. EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
A continuación se muestran una serie de ejemplos que en todo momento se exponen para ilustrar la síntesis de algunos compuestos particulares de la presente invención y para ejemplificar los procedimientos generales. De acuerdo con lo anterior, la siguiente sección de ejemplos no tiene la intención de ningún modo de limitar el alcance de la invención contemplada en la presente memoria descriptiva.
En esta memoria descriptiva los símbolos y convenciones usados en estos procedimientos, esquemas y ejemplos son consistentes con los usados en el Sistema Internacional y la bibliografía científica contemporánea, por ejemplo, el Journal of Medicinal Chemistry. Salvo que se indique otra cosa, todos los materiales de partida se obtuvieron de proveedores comerciales y se usaron sin purificación adicional. Específicamente, se pueden usar las siguientes abreviaturas en los ejemplos y a lo largo de toda la memoria descriptiva: g (gramos); mg (miligramos); kg (kilogramos); μg (microgramos); L (litros); ml_ (mililitros); μΙ_ (microlitros); mmol (milimoles); mol (moles); °C (grados Celsius); Hz (hertzio); MHz (megahertzio); δ (desplazamiento químico); s (singlete); d (doblete); t (triplete); q (cuartete); m (multiplete); RMN (resonancia magnética nuclear); M (molar); EtsN (trietilamina); DMF (dimetilformamida); DMSO (dimetilsulfóxido); ACN (acetonitrilo); PBS (búfer fosfato salino).
Las anfetaminas HHA, HMA y HHMA, metabolitos del MDMA, fueron obtenidas por síntesis orgánica de acuerdo con la metodología descrita en la literatura (Bioorg. Med. Chem. 2002 10:1085). Todos los reactivos y disolventes usados, salvo cuando se ha indicado, se obtuvieron de proveedores comerciales y fueron utilizados sin ninguna purificación previa. Todos los análisis de RMN de 1 H y 13C fueron realizadas con espectrómetros Varían Anova 500 y Varían Mercury 400. El progreso de todas las reacciones fue monitorizado por CCF (cromatografía de capa fina) en hojas de aluminio con una capa de gel de sílice 60 (HF-254, Merck), con un grosor de 0,25 mm. Síntesis química
Preparación del oleato de 3,4-dihidroxianfetamina.
En un balón de reacción bajo atmósfera de nitrógeno y equipado con agitador magnético se adicionó ácido oleico (45 mmol), acetonitrilo (5 mL), trietilamina (62 mmol) y cloroformiato de bencilo (54 mmol) y la mezcla fue agitada durante una hora a 4 °C. El acetonitrilo fue eliminado bajo presión reducida y el residuo seco fue redisuelto en dimetilformamida (DMF) (5 mL). Sobre la solución en DMF, bajo atmósfera de nitrógeno y a 4 °C se adicionó al balón trietilamina (46 mmol) y 3,4-dihidroxianfetamina (HHA) (49 mmol). Se agitó la reacción durante 24 horas a 25 °C. La conversión de la reacción fue evaluada por CCF. La DMF fue eliminada bajo presión reducida y el producto fue purificado por columna cromatográfica flash usando como eluyente acetato de etilo/hexano 20%. El producto fue obtenido como un aceite amarillo con un rendimiento del 43
%: 1H NMR (500 MHz, CDCI ) δ ppm: 0.86 (t, J = 6.95 Hz, 3H), 1.11 (d, J =
6.58 Hz, 3H), 1.19 - 1.34 (m, 20H), 1.50-1.60 (m, 2H), 1.96-2.03 (m, 4H), 2.12 (t, J = 7.78 Hz, 2H), 2.57 (A of an ABX syst., J = 7.08, 13.65 Hz, 1H), 2.66 (B of an ABX syst., J = 6.55, 13.70 Hz, 1H), 4.16 - 4.28 (X of an ABX syst., m, 1H), 5.28 - 5.39 ( m, 2H), 5.53 (d, J = 8.28 Hz, 1H), 6.51 (dd, J =
1.40, 8.00, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.76 (d, J = 8.0 Hz, 1H). C NMR (101 MHz, CDCI ) δ ppm: 14.34, 20.37, 22.92, 26.03, 27.41, 27.46, 29.34, 29.44, 29.56,
29.77, 29.95, 30.00, 32.14, 37.20, 42.26, 46.91, 114.97, 115.90, 121.34, 129.90, 129.96, 130.22, 143.51, 144.51, 174.11.
Preparación del oleato de 3-metoxi-4-hidroxianfetamina
El compuesto representado se preparó siguiendo el procedimiento descrito anteriormente utilizando los mismos reactivos de partida y las mismas cantidades molares, substituyendo 3,4-dihidroxianfetamina por 3-metoxi-4- hidroxianfetamina.
El producto fue obtenido como un aceite amarillo con un rendimiento del 30
%.1H NMR (500 MHz, CDCI ) δ ppm: 0.87 (t, J = 6.58 Hz, 3H), 1.09 (d, J = 6.61 Hz, 3H), 1.20-1.37 (m, 20H), 1.51-1.62 (m, 2H), 1.95-2.05 (m, 4H), 2.10 (t, J = 7.48, 7.48 Hz, 2H), 2.60 (A of an ABX syst., J = 7.34, 13.61 Hz, 1H), 2.76 (B of an ABX syst., J = 5.70, 13.59 Hz, 1H), 3.86 (s, 3H), 4.18-4.29 (X of an ABX syst., m, 1 H), 5.24-5.41 (m, 3H), 6.63 (dd, J = 1.28, 7.95 Hz, 2H),
6.69 (d, J = 1.39 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 7.97 Hz, 1H). C NMR (101 MHz, CDCI ) δ ppm: 14.36, 20.24, 22.92, 26.02, 27.40, 27.45, 29.36, 29.45, 29.51 ,
29.55, 29.75, 29.95, 29.99, 32.13, 37.25, 42.44, 46.25, 56.12, 111.87, 114.32, 122.34, 129.97, 130.04, 130.21, 144.45, 146.71, 172.72.
Preparación del oleato de 3,4-dihidroximetanfetamina El compuesto se preparó siguiendo el procedimiento descrito anteriormente utilizando los mismos reactivos de partida, utilizando las mismas cantidades molares y substituyendo 3,4-dihidroxianfetamina por 3,4- dihidroximetanfetamina.
El producto fue obtenido como un aceite amarillo con rendimiento 45 %. El
1
producto es una mezcla de dos rotámeros (cis y trans). H NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ ppm: 0.85 (t, J = 6.87 Hz, 3H), 0.95 (trans, d, J = 6.80 Hz, 3H), 1 .12 (cis, d, J = 6.50 Hz, 3H), 1 .19-1 .42 (m, 20 H), 1 .36 - 1 .42 (trans, m, 2H), 1 .80 - 1 .87 (cis, m, 2H) 1 .94-2.00 (m, 4H), 2.06 - 2.09 (cis, m, 2H), 2.1 1 - 2.19 (trans, m, 2H), 2.46 - 2.55 (m, 2H), 2.66 (cis, s, 3H), 2.74 (trans, s, 3H), 3.95 - 4.06 (cis, m, 1 H), 4.64 - 4.75 (trans, s, 1 H), 5.28 - 5.36 (m,
2H), 6.36 - 6.41 (m, 1 H), 6.52 - 6.54 (m, 1 H), 6.56 - 6.70 (m, 1 H). C NMR (101 MHz, CDCI ) 14.36, 14.41 , 15.57, 19.50, 21 .29, 22.92, 25.34, 25.52,
27.12, 27.45, 29,36, 29.40, 29.47, 29.55, 29,76, 29.96, 30.01 , 32.14, 33.24, 34.32, 39.68, 40.00, 55.42, 60.69, 1 14.94, 1 15.62, 1 15.98, 120.66, 120.80, 130.01 , 130.16, 143.43, 143.66, 143.65, 144.39, 144.76, 171 .53, 174.76, 175.21 .
Preparación del araquidonato de 3,4-dihidroxianfetamina.
El compuesto se preparó siguiendo el procedimiento descrito anteriormente utilizando los mismos reactivos de partida, utilizando las mismas cantidades molares substituyendo ácido oleico por ácido araquidónico.
1
El producto fue obtenido como un aceite amarillo con rendimiento 39 %. H NMR (500 MHz, CDCI ) δ ppm: 0.90 (t, J = 6.93 Hz, 3H), 1 .13 (d, J = 6.62
Hz, 3H), 1 .24-1 .42 (m, 6H), 1 .59-1 .74 (m, 2H), 2.03-2.1 1 (m, 4H), 2.17 (t, 7.73 Hz, 2H), 2.59 (A of na ABX syst., J = 7.26, 13.69 Hz, 1 H), 2.70 (B of na ABX syst., J = 6.48, 13.68 Hz, 1 H), 2.77-2.87 (m, 6H), 4.19-4.29 (X of an ABX syst., m, 1 H), 5.30 - 5.46 (m, 8H), 5.53 (d, J = 8.38 Hz, 1 H), 6.54 (dd, J = 1 .90, 8.02 Hz, 1 H), 6.78 (s, 1 H), 6.78 (d, J = 10.89, 1 H). NMR (101 MHz, CDCI ) δ ppm: 14.30, 20.34, 22.80, 25.81 , 25.85, 26.75, 27.44, 29.54,
31 .74, 36.49, 42.26, 47.03, 1 15.04, 1 15.93, 121 .39, 127.73, 128.05, 128.31 , 128.52, 128.85, 129.04, 129.17, 129.94, 130.76, 143.47, 144.48, 173.82. Preparación del araquidonato de 3-metoxi-4-hidroxianfetamina.
El compuesto se preparó siguiendo el procedimiento descrito anteriormente utilizando los mismos reactivos de partida, utilizando las mismas cantidades molares y substituyendo 3,4-dihidroxianfetamina por 3-metoxi-4- hidroxianfetamina y ácido oleico por ácido araquidónico.
1
El producto fue obtenido como un aceite amarillo con rendimiento 40 %. H NMR (500 MHz, CDCI ) δ ppm: 0.87 (t, J = 6.60 Hz, 3H), 1 .09 (d, J = 6.63
Hz, 3H), 1 .21 -1 .40 (m, 6H), 1 .61 -1 .76 (m, 2H), 1 .99-2.15 (m, 6H), 2.59 (A of an ABX syst., J = 7.48, 13.59 Hz, 1 H) 2.73-2.86 (m, 7 H, B of an ABX syst. + 6H), 3.85 (s, 3H), 4.15-4.27 (X of an ABX syst., m, 1 H), 5.27-5.43 (m, 9H), 6.62 (dd, J = 1 .50, 7.95 Hz, 1 H), 6.68 (d, J = 1 .40 Hz, 1 H), 6.81 (d, J = 7.98
Hz, 1 H). 13C NMR (101 MHz, CDCI ) δ ppm: 14.32, 20.18, 22.81 , 25.80,
25.85, 26.86, 27.44, 29.55, 31 .74, 36.52, 42.44, 46.33, 56.1 1 , 1 1 1 .89, 1 14.36, 122.33, 127.72, 128.06, 128.37, 128.44, 128.81 , 128.95, 129.31 , 130.01 , 130.74, 144.47, 146.73, 172.45.
Preparación del araquidonato de 3,4-dihidroximetanfetamina.
El compuesto se preparó siguiendo el procedimiento descrito anteriormente utilizando las mismas cantidades molares y substituyendo 3,4- dihidroxianfetamina por 3,4-dihidroximetanfetamina y ácido oleico por ácido araquidónico.
El producto fue obtenido como un aceite amarillo con rendimiento 42 %. El
1
producto es una mezcla de dos rotameros (cis and trans). H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 0.87 (t, J = 6.60 Hz, 3H), 0,95 (trans, d, J = 7,00 Hz, 3H), 1 .1 1 (cis, d, J = 6.5 Hz, 3H) 1 .20 - 1 .34 (m, 6H), 1 .43 - 1 .50 (trans, m, 2H), 1 .83 - 1 .94 (cis, m, 2H), 1 .98 - 2.03 (m, 4H), 2.08 - 2.37 (m, 4H), 2.65 (cis, s, 3H), 2.73 (trans, s, 3H), 2.74 - 2.82 (m, 6H), 3.95 - 4.01 (cis, m, 1 H), 4.65 - 4.72 (trans, m, 1 H), 5.25 - 5.38 (m, 8H), 6.36 - 6.40 (m, 1 H), 6.52 - 6.54 (m, 1 H), 6.57 - 6.61 (m, 1 H). C NMR (101 MHz, CDCI ) 17.57, 19.53,
22.81 , 25.06, 25.20, 25.85, 26.83, 26.87, 27.13, 27.45, 29.35, 29.56, 31 .74, 32.56, 33.65, 39.68, 39.97, 49.95, 55.37, 60.70, 1 14.97, 1 15.57, 1 15.99, 120.69, 120.83, 127.74, 127.77, 128.07, 128.13, 128.34, 128.39, 128.42, 128.52, 128.81 , 129.81 , 129.00, 129.32, 129.35, 130.05, 130.08, 130.73, 143.42, 143.67, 144.38, 144.67, 144.74, 174.42, 174.92.
Preparación del oleato de 2-feniletilamina.
El compuesto se preparó siguiendo el procedimiento descrito anteriormente utilizando las mismas cuantidades molares de 2-feniletilamina y ácido oleico. El producto fue obtenido como un sólido blanco con rendimiento del 95 %.
1 H NMR (500 MHz, CDCI ) δ ppm 0.87 (t, J = 6.93 Hz, 3H), 1 .21 -1 .37 (m,
20H), 1 .53-1 .63 (m, 2H), 1 .96-2.05 (m, 4H), 2.1 1 (t, J = 7.60 Hz, 2H), 2.81 (t, J = 6.94 Hz, 2H), 3.49-3.53 (m, 2H), 5.30-5.37 (m, 2H), 5,53 (br s, 1 H), 7.18-
7.33 (m, 5H). ). C NMR (101 MHz, CDCI ) δ ppm: 14.38, 22.93, 25.99, 27.41 , 27.46, 29.38, 29.48, 29.51 , 29.56, 29.77, 29.95, 30.01 , 32.14, 35.93, 37.05, 40.75, 126.72, 128.84, 128.99, 129.97, 130.22, 139.15, 173,47.
Ensayo de ligando receptor
El ensayo ligando receptor para el receptor CB1 , evalúa la capacidad de los compuestos sintetizados de desplazar [3H] SR141716 (conocido ligando con afinidad por receptor CB1 ) en un homogenado de cerebelo de ratas.
La prueba de ensayo ligando receptor fue realizada usando el antagonista CB1 marcado [3H] SR141716. En cada tubo fueron adicionados 450 μΙ_ de solución reguladora de pH A (50 mM Tris pH=7.4 con 0.5 % de albúmina de suero bovino (BSA)), 100-200 μ9 de membranas de cerebelo de ratas, el producto diluido y el antagonista CB1 marcado [3H] SR141716. Después de 60 minutos de incubación a 37 C°, la reacción fue paralizada con 1 ml_ del solución reguladora de pH A. La mezcla fue centrifugada a 5000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante fue descartado y el pellet lavado con 1 ml_ más de solución reguladora de pH A, centrifugado y una más vez el sobrenadante fue descartado. Se adicionó líquido de centelleo y las muestras fueron leídas en un contador de partículas beta (Liquid Scintillation Analyzer, Tri-Carb 2100 TR, PACKARD, a Packard Bioscience Company). Todos los productos fueron diluidos en solución reguladora de pH B (50 mM Tris pH=7,4 con 0,5 % de albúmina de suero bovino (BSA) y 0,3% de DMSO) en las concentraciones de 10"5, 10"6, 10"7, 10"8, 10"9, 10"10 y 10"11 M. Todas las concentraciones de cada producto fueron leídas por triplicado (Figuras 8 a 10).
Ensayo del "repórter gene assav"
El ensayo "repórter gene assay" es un método in vitro utilizado para determinar y cuantificar la existencia de interacciones físicas entre proteínas, siendo útil para confirmar en nuestro caso la interacción del factor de transcripción PPAR-alfa y el coativador SRC-1 en células MCF-7. La oleiletanolamida fue usada como un control positivo y la anandamida como control negativo. Oleiletanolamida (OEA), GW7647, anandamida (AEA) y ácido oleico fueron suministrados por Tocris Bioscience (Cookson Lted. Bristol, UK). Para los experimentos in vitro, con cultivo de células todos los compuestos fueron disueltos y diluidos en dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma Aldrich Spain). Constructos de DNA: Como vehículo de expresión del ADNc para el receptor PPAR-α humano se utilizó el vector de expresión eucariota pSG5 (4100 pares de bases, Stratagene Co. ). Esta construcción se utilizó para la sobreexpresión in vivo de la proteína en células mamíferas.
Cuatro copias del gen CPTI humano tipo DR1 RE (secuencia GTAGGGAAAAGGTCA) fueron individualmente fusionadas con el promotor de la timidina quinasa en el vector pGL-2 Basic (5598 pares de bases, Promega Co.) que carece de promotor eucariota y que contiene un gen indicador (traducción de repórter gene) luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis). Este vector es muy utilizado en el análisis cuantitativo de factores capaces de regular la expresión de genes en células mamíferas. Este vector pGL-2 Basic también presenta una región de resistencia a la ampicilina (gen para β-lactamasa).
Células humanas de cáncer de mama MCF-7 fueron cultivadas en placas de 6 pocilios (105 células/mL) y crecidas durante toda la noche para su estabilización en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) libre de rojo fenol suplementado con un 5% de suero bovino fetal o FBS tratado con carbón. Liposomas conteniendo plásmidos de DNA fueron formados incubando 1 μg de un vector de expresión para PPAR-alfa, RXR-alfa y SRC-1 salvaje y 1 g de plásmido indicador luciferasa con 10 μg de /V-[1 -(2,3-dioleoiloxi)propil]- Λ/,Λ/,/V-trimetilamonio metilsulfato (DOTAP, Roche) durante 15 minutos a temperatura ambiente en un volumen total de 100 μΙ_. Después de dilución con 900 μΙ_ de DMEM libre de rojo fenol, los liposomas fueron añadidos a las células. El DMEM libre de rojo fenol suplementado con 500 μΙ_ de FBS tratado con carbón al 15 % fue añadido 4 h después de la transfección. En este momento, las células fueron tratadas 16 horas con diferentes concentraciones en DMSO (10"9, 10"8, 10"7, 10"6, 10"5 y 10"4 M) de OEA, GW7647, AEA, ácido oleico y los diferentes compuestos sobre evaluación como indicado. Las células fueron Usadas 15 horas después de la estimulación usando la solución reguladora de pH de lisis del gen indicador siguiendo las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics).
El ensayo de quimioluminiscencia que permite una determinación cuantitativa de actividad luciferasa en células transfectadas se llevó a cabo siguiendo también las indicaciones del proveedor (Luciferase Repórter Gene Assay, constant light signal de Roche Diagnostics GmbH): La presencia de esta enzima es detectable en extractos de células transfectadas gracias a su bioluminiscencia: la reacción catalizada por la luciferasa transforma la luciferina en oxiluciferina en presencia de ATP, Mg 2+ y O2, y produce además fotones de luz visible.
La actividad luciferasa fue normalizada respecto a la concentración de proteína (obtenida previamente siguiendo el método de Bradford con el kit reactivo Quick Start Bradford Protein Assay Kit 1x suministrado comercialmente por Bio-Rad Laboratories Inc. y empleando un lector de microplacas VERSAmax® de Molecular Devices Corp.), y los factores de inducción se calcularon como la ratio de actividad luciferasa de las células estimuladas por ligando respecto a los solventes como se muestra en la tabla 1 correspondiente a los resultados de experimentos de ensayo ligando receptor y de afinidad para PPAR-alfa.
Compuesto CB1 Ki (M) CB1 pKi PPAR-α EC50
(nM)
SR141716 3,64E-10 9,44 -
Anandamida 1 ,7E-07 a 6,77 > 10.000
WIN55212-2 1 ,11 E-8 a 7,95 -
OLHHA 3,65E-07 6,44 698 ± 102
OLHMA 1.44E-06 5,84 1022 ± 206
AAHHA 2,02E-07 6,69 > 10.000 Oleato de 2- 1879 ± 384 feniletilamina
Acido Oleico - - 218 ± 150
OEA - - 148 ± 29
GW7647 - - 65 ± 1
Tabla 1 a valores recogidos en la literatura (British Journal Pharmacology 1999 128:684)
Ensayo de inhibición de la hidrolasa de amidas de ácido graso (FAAH)
El ensayo de inhibición de la hidrolasa de amidas de ácido graso (FAAH) evalúa la capacidad de los compuestos descritos de inhibir la actividad de la enzima FAAH. Se utilizó córtex de cerebro de ratas como fuente de FAAH y anandamida tritiada como sustrato. La inhibición de la degradación de la anandamida tritiada por los compuestos descritos fue monitorizada con un contador de partículas beta. En cada tubo se adicionaron 440 μΙ_ de solución reguladora de pH A (50 mM Tris pH=7.4 con 0.5 % albúmina de suero bovino (BSA)) 100-200 μg de membranas de córtex de cerebros de ratas, los productos diluidos (concentraciones de 10"5, 10"6, 10"7, 10"8, 10"9, 10"10 y 10"1 1 M), 0,025 μθϊ de [3H]anandamida y 10 μΜ de anandamida. Después de 60 minutos de incubación con agitación a 37 °C, se adicionó cloroformo (1 ml_). Los tubos fueron agitados en vortex y posteriormente centrifugados a 3000 RPM durante 5 minutos. Se transfirieron 0,25 mL de cada tubo a viales con líquido de centelleo y se analizaron en un contador de partículas beta (Liquid Scintillation Analyzer, Tri-Carb 2100 TR, PACKARD A Packard Bioscience Company). Todos los productos fueron diluidos en solución reguladora de pH B (50 mM Tris pH=7.4 con 0.5 % albúmina de suero bovino (BSA) and 0.3% DMSO). Todas las muestras fueron analizadas por triplicado.
Ninguno de los compuestos demostró actividad sobre el FAAH.
Experimento de inhibición de la oxidación de la LDL
Para probar el poder antioxidante de los compuestos sintetizados se monitorizó la cinética de oxidación de la LDL inducida por CuSO4 en presencia o ausencia de los compuestos sintetizados.
La LDL fue aislada de acuerdo con un procedimiento anteriormente descrito (Med. Clin. (Barc.) 2000 1 15: 166). Monitorizado de la oxidación de la LDL.
Se utilizó una placa de ELISA de 96 pocilios y en cada pocilio se añadieron 140 [ L de la LDL diluida (0,06 g/L) y 10 μί del producto diluido en metanol y, con la misma pipeta, se homogenizó el contenido de cada pocilio. Posteriormente se añadieron 10 μί de una solución 100 μΜ de CuSO4 (la concentración final en cada pocilio fue: 0, 1 ; 0,5; 1 ,0 μΜ de producto, 0,05 g/L de LDL y 5 μΜ de CuSO4) y la placa fue puesta en el espectrofotómetro (Lector Infinite M200 - TECAN IBERICA, Mánnedorf, Switzerland). Se monitorizó la absorbancia a 234 nm en intervalos de 15 minutos a 36,5 °C. La variable utilizada para estudiar la resistencia de la LDL a la oxidación fue el "lag time" (minutos). El perfil de la curva de oxidación de los dienos presentes en la LDL puede dividirse en tres fases consecutivas: fase lenta, fase de propagación y fase de descomposición. El "lag time" es determinado por la intersección de la fase de propagación con la extrapolación de la fase lenta. El "lag time" fue calculado usando la absorbancia molar ε para
3 234nm dienos conjugados (29.500 M"1cm"1 ). Para cada experimento se utilizaron 4 pocilios como control negativo sin añadir ninguno de los productos y un control positivo con hidroxitirosol. Todos estos resultados se muestran en la tabla 2.
Figure imgf000032_0001
Tabla 2
Experimentos in vivo Todos los experimentos in vivo fueron hechos usando ratas Wistar macho con 200-450 g de peso. Los animales fueron alojados en jaulas individuales en una habitación con temperatura (23 °C) y humedad (50 %) controladas con ciclo de luz y oscuridad de 12/12. Los animales disponían de agua y comida ad limitum excepto en procedimientos experimentales específicos. Los animales fueron manipulados una vez al día durante los dos días anteriores a las sesiones experimentales. Todos los productos fueron disueltos en una mezcla de DMSO 5%, Tween 60 5 % / salina 90 % y administrados intraperitonealmente. Experimento de ingesta
El efecto agudo sobre la ingesta de todos los productos fue probado en animales en ayuno de 24 horas. La amida de 2-feniletilamina con ácido oleico (OLFEA) fue usada como teórico control negativo debido a la ausencia del grupo catecol.
Treinta minutos después de la inyección la comida previamente pesada fue repuesta en la jaula. La comida fue pesada a los 30, 60, 120 y 240 minutos después del inicio de la prueba. Todos los experimentos de ingesta fueron realizados con grupos de 8 animales (n=8) (Figuras 1 a 7).
Prueba de campo abierto
Para confirmar que la modulación negativa en el experimento de ingesta no era debido a un efecto anestésico de los productos se probó el compuesto OLHHA (unos de los compuestos más activos en el experimento de ingesta) en un experimento de campo abierto usando las mismas dosis.
La prueba de campo abierto mide el conflicto natural del animal entre la tendencia de explorar y la reacción de recelo de auto protección. Las ratas fueron aclimatadas a la habitación de la prueba durante 30 minutos antes de la prueba comportamental. El animal fue inyectado con el producto y puesto en el centro del tablero de dimensiones de 40 cm x 40 cm y paredes de 30 cm de altura. El desplazamiento total y el tiempo gasto por el animal en las esquinas o el centro del tablero fue registrado usando un sistema de seguimiento en video (Smart® Panlab, Barcelona, Spain).
El producto OLHHA no demostró modulación en el comportamiento del animal en la prueba de campo abierto.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuesto de fórmula general (I):
Figure imgf000034_0001
(l )
donde
X e Y pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H, halógeno y metilo;
n es un número entero desde 1 a 4;
Ri y R2 pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H y alquilo C1 -C6 o pueden estar unidos por un enlace simple entre los dos átomos de oxígeno, formando un nuevo ciclo;
R3 se selecciona entre H, alquilo C1-C6 y alquenilo C1-C4;
R4 se selecciona entre H, halógeno y alquilo CrC4;
R5 es un compuesto de fórmula general (II):
Figure imgf000034_0002
(II) donde R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C4;
R7 se selecciona entre alquilo C8-C30 y alquenilo C8-C30;
y sus sales, preferiblemente cualquier sal farmacéuticamente aceptable, solvatos y prodrogas del mismo.
2. Compuesto según la reivindicación 1 , donde X e Y pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H y metilo.
3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde n es 1 ó 3.
4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde Ri y R2 pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H y metilo o pueden estar unidos por un enlace simple entre los dos átomos de oxígeno, formando un nuevo ciclo.
5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde R3 se selecciona entre H y alquilo C1-C3.
6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde R4 se selecciona entre H y CH3.
7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde R5 es un compuesto de fórmula (I I):
Figure imgf000035_0001
(I I) donde Re sé selecciona entre H y CH3 y R7 es un grupo alquenilo C15-
C25-
8. Compuesto según la reivindicación 7, donde R7 tiene un número de insaturaciones entre 1 y 6.
9. Compuesto según la reivindicación 1 , seleccionado entre
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000036_0002
Figure imgf000036_0003
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000037_0002
Figure imgf000037_0003
10
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000039_0001
1 1 . Composición farmacéutica que comprende al menos uno de los compuestos de fórmula (I) como se define en las reivindicaciones 1 a 10, o sus sales, solvatos o prodrogas del mismo, y al menos un transportador farmacéuticamente aceptable, adyuvante y/o vehículo.
12. Composición farmacéutica según la reivindicación 11 , que comprende además otro principio activo.
13. Uso del compuesto de fórmula (I) según reivindicación 1 , en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de una enfermedad o trastorno de la alimentación.
14. Uso del compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 13, para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad mediada por el receptor cannabinoide CB1 y/o mediada por los receptores PPAR-alfa y/o para la inhibición de la oxidación de LDL.
15. Uso del compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14 donde la enfermedad o trastorno de la alimentación se selecciona de la lista que comprende: obesidad, anorexia, disfunción lipídica, diabetes, enfermedades cardiovasculares y síndrome metabólico.
16. Uso del compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 13 para reducir la grasa subcutánea y/o para la inducción de saciedad y control de la ingesta.
17. Procedimiento de preparación de un compuesto de fórmula general (I) según la reivindicación 1 , que comprende las siguientes etapas: a. conjugación entre un compuesto de fórmula general (III) y cloroformiato de bencilo para dar lugar a un nuevo compuesto de fórmula general (IV), que comprende la siguiente reacción:
Figure imgf000040_0001
Temperatura ambiente
t = 1 hora evaporación
(III) (IV) donde R7 se selecciona entre alquilo C8-C30 y alquenilo C8-C3o y Rs se selecciona entre NH3, NH2-CH3, NH2-CH2-CH3, NH-(CH3)2, N- (CH3)3 NH-(CH2-CH3)2 y N-(CH2-CH3)3; b. reacción del compuesto de fórmula general (IV) con un compuesto de fórmula general (V) para dar lugar al compuesto de fórmula general I) usando como disolvente dimetilformamida:
Figure imgf000040_0002
(IV) (V) (I) donde X e Y pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H, halógeno y metilo;
n es un numero entero desde 1 a 4;
Ri y R2 pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H y alquilo C1-C6 o pueden estar unidos por un enlace simple entre los dos átomos de oxígeno, formando un nuevo ciclo;
R3 se selecciona entre H, alquilo C1-C6 y alquenilo C1-C4;
R4 se selecciona entre H, halógeno y alquilo C1-C4;
R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C4;
R7 se selecciona entre alquilo C8-C30 y alquenilo C8-C30;
R8 se selecciona entre NH3, NH2-CH3, NH2-CH2-CH3, NH-(CH3)2,
N-(CH3)3 NH-(CH2-CH3)2 y N-(CH2-CH3)3; evaporación de la dimetilformamida y extracción con acetato de etilo y agua;
tratamiento de la fase orgánica con sulfato de sodio anhidro y evaporación del disolvente: purificación del compuesto de fórmula (I) por cromatografía.
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