WO2011074717A1 - 단량체에 접착특이성이 있는 접착체의 반복사슬과 다수단량체의 복합체 내에서의 결합 가교의 생성 증가를 통한 이량체 및 다량체의 생산방법 - Google Patents

단량체에 접착특이성이 있는 접착체의 반복사슬과 다수단량체의 복합체 내에서의 결합 가교의 생성 증가를 통한 이량체 및 다량체의 생산방법 Download PDF

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최무현
이용찬
원재선
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Choe Muhyeon
Lee Yongchan
Won Jaeseon
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Definitions

  • the present invention relates to a process for producing dimers and multimers at high yields from monomers.
  • a repeating chain-multimeric monomer complex is produced by using a repeating chain of an adhesive having adhesive specificity, and a multimer is produced by facilitating the formation of a bond crosslink between monomers in the complex.
  • the present invention relates to a method for maximizing the formation of a repeating chain-multimeric monomer complex by using the repeating chain of an adhesive as a skeleton and increasing the production of disulfide bond crosslinks from the formed repeating chain-multimeric monomer complex, thereby mass-producing dimers and multimers. .
  • Antibody-toxins are synthesized by binding toxins to antibodies that specifically bind to cancer cells (Pastan I. et al., Annu Rev Med. 58 (2007) 221-237).
  • Monoclonal antibody (MAb) B3 is a carbohydrate antigen, Le Y ) (L.H. Pai, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 88 (1991) 3358-3362; I. Pastan, et al., Cancer Res. 51 (1991) 3781-3787).
  • PE38 is a Pseudomonas exotoxin ( Pseudomonas exotoxin (PE) is one of the derivatives (J. Hwang, et al., Cell. 48 (1987) 129-136; V.K. Chaudhary, et al., J Biol Chem 265 (1990) 16306-16310).
  • Fab is a Fd chain (V H And C H1 ) And light chain chains (V L And C L ).
  • Fab antibody-toxins are identified by the Fd chain (V H And C H1 ) And light chain chains (V L And C L ).
  • Fab-toxins have two advantages over single-chain Fv (scFv) -toxins. First, Fab-toxin yield is 10 times higher than scFv-toxin (J. Buchner, et al., Biotechnology (N Y). 9 (1991) 157-162; J. Buchner, et al., Biotechnology 10 (1992) 682-685). Second, the stability of Fab-toxins in mouse plasma is improved (M. Choe, et al., Cancer Res. 54 (1994) 3460-3467).
  • Disulfide-bound bivalent Fab-toxin dimers have been reported to have higher cytotoxicity than monovalent scFv-toxins (S.H. Choi, et al., Bull. Kor. Chem. Soc. 22 (2001) 1361-1365; J.H. Park, et al., Mol Cells 12 (2001) 398-402; M.H. Yoo, et al., J. Microbiol. Biotechnol . 16 (2006) 1097-1103).
  • Disulfide linked dimers are prepared via disulfide bonds of cysteine (Cys) residues located between the Fab domain of the monomeric Fab-toxin and PE38.
  • Dimer antibody-toxins are expected to have several advantages over antibody-toxins that are monomers. For example, the two antigenic adhesion domains of the dimers increase adhesion, resulting in high avidity.
  • the bivalent dimeric antibody-toxin carries two toxin domains simultaneously to the target cell, thereby killing the target cell with higher cytotoxicity compared to the monovalent monomeric antibody-toxin.
  • Fab-toxins have higher stability than scFv-toxins, which are often used for the production of recombinant antibody-toxins (D. Rothlisberger, et al., J Mol Biol 347 (2005) 773-789).
  • B3 (Fab) -ext-PE38 is a disulfide-linked dimer [B3 (Fab) -ext-PE38] 2 Shows the Fab domain of monoclonal antibody B3 in Pseudomonas exotoxin A [ Pseudomonas Aexotoxin A] derivatives can be prepared by combining PE38 (Korea Patent 10-0566091), [B3 (Fab) -ext-PE38] 2 Has been reported to have about 11 times higher cytotoxicity against the CRL-1739 cell line, a gastric cancer cell line, compared to B3 (Fab) -ext-PE38 (J.H. Park, et al., Mol cells 12 (2001) 398-402).
  • disulfide bonded dimers were only purified after refolding (S.H. Choi, et al., Bull. Kor. Chem. Soc. 22 (2001) 1361-1365; J.H. Park, et al., Mol cells 12 (2001) 398-402; M.H. Yoo, et al., J. Microbiol. Biotechnol . 16 (2006) 1097-1103).
  • the previously reported refolding process of disulfide bonded dimers increased yields between 0.014% and 0.25%.
  • disulfide bound dimers were formed by random access of cysteine residues located at the site between the Fab domain of the antibody-toxin of the two monomers and PE38.
  • the yield of dimers is very high in that the yield of Fab-toxin, a monomer that is the main product of the refolding reaction, is about 10%. Low. Since the antibody-toxin, which is a monomer, has no self-binding-affinity between them, the binding crosslinker dimer is generated by random collisions between cysteine residues of the monomeric antibody-toxin in the refolding reaction. Therefore, the very low yield of dimers produced during the refolding process is very low, since the collision frequency between cysteine residues is very low. Is caused.
  • the present inventors have tried various production methods of disulfide-bonded dimers including reduction and oxidation and production of disulfide-linked dimers from monomeric antibody-toxins through chemical cross-linkers.
  • the reduction, oxidation, and chemical crosslinking methods did not improve dimer yield.
  • the inventors have found that the monomer B3 (Fab) -ext-PE38 is a disulfide-linked dimer [B3 (Fab) -ext-PE38]. 2 Looking for a way to produce more, Streptococcus ( Streptococcal A repeat chain recombinant protein in which the Fab adhesion domain of protein G) is repeated two or more times was prepared, and a complex to which a plurality of monomeric antibody-toxins were simultaneously bonded was used as a scaffold. The third domain of protein G (domain III) can adhere to the Fab fragment of IgG and C of the Fab fragment H1 It has been reported that domains can adhere with high affinity to the domain of protein G (J.P.
  • the repetitive chain of the present invention has the following advantages over the refolding process.
  • the domains that make up the repeating chain adhere to the monomeric antibody-toxin with high affinity.
  • the repeating chain was used to increase the local concentration of monomeric antibody-toxins in the resulting repeating chain-multimeric complex. This increases the frequency of access of the cysteine residues of the monomeric antibody-toxin, thereby facilitating disulfide bonds between monomers, thereby enabling mass production of disulfide bond crosslinked dimers.
  • Representative examples of such effects include a marked increase in the rate of enzymatic reactions due to the proximity effect described in enzyme kinetics (Nicholas C. Price and Lewis Stevens.
  • the complex could be easily prepared by simply mixing the repeating chain with the monomeric antibody-toxin, and by promoting the disulfide bond of the cysteine residue between the Fab domain and PE38 by reducing and oxidizing the cysteine residue of the monomeric antibody-toxin in the complex [ B3 (Fab) -ext-PE38] 2
  • the present invention was completed by confirming that mass production was possible.
  • An object of the present invention is to mass-produce multimers from monomers by using crosslinking between monomers, using a repeating chain of an adhesive having a specificity of adhesion to the monomers as a scaffold, thereby adhering with the monomers.
  • Mass production of repeating chain-multimeric monomer complexes of monomers and formation of binding crosslinks between monomers constituting the produced repeating chain-multimeric monomer complexes result in unpaired cysteines in the chains of monomers compared to the conventional methods for producing linked crosslinking multimers. It is to provide a method of maximizing the production of the multimer of the monomer by promoting the formation of the binding cross-linking by increasing the access frequency of the residue.
  • step 2) mixing the repeating chain and the monomer of step 1) to prepare a repeating chain-multimer monomer complex of the repeating chain and monomer;
  • step 3) providing a method for producing a bonded cross-linking multimer comprising the step of separating the multimers that form the binding cross-linking between monomers in the repeating chain-multimeric multimer complex of step 2).
  • the yield of the monomeric antibody-toxin disulfide-linked crosslinked dimer was compared with that of the previously reported refolding method. By increasing about 208 times, the dimer production could be maximized.
  • the dimers produced by the present invention have high antigen adhesion, toxicity and stability compared to previously reported monomeric antibody-toxins, and are particularly known to have about 11 times higher cytotoxicity against gastric cancer cell lines. It can be usefully used to develop therapeutics.
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic diagram of a multimer production method using the binding crosslinking of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results confirmed by the SDS-polyacrylamide gel purified protein in the present invention:
  • Figure 2A is a result of mixing the repetitive chain recombinant protein of protein G with reducing SDS-sample buffer and confirmed by reducing 16% SDS-polyacrylamide gel, lines 1 to 7 are TR1 ⁇ TR7 protein, respectively;
  • Figure 2B is a non-reducing 8% SDS-polyacrylamide gel of the antibody-toxins B3 (Fab) -ext-PE38 (M) and [B3 (Fab) -ext-PE38] 2 (D) produced in the present invention.
  • the arrow indicates the result [B3 (Fab) -ext-PE38] 2 , B3 (Fab) -ext-PE38 and B3 (Fd) -ext-PE38, respectively, from above (H6-B3 (L) is a small molecular weight) (Not shown in the figure because it has approximately 25 kDa).
  • FIG. 3 shows the results of confirming the formation of [B3 (Fab) -ext-PE38] 2 from the complex of B3 (Fab) -ext-PE38 and TR1 to TR7 proteins by SDS-polyacrylamide gel:
  • FIG. 3A shows protein samples (10 g each) adhered to metal chelating agarose beads (1) reduced with 40 mM 2-mercaptoethanol for 30 minutes at room temperature (2), and the protein complexes oxidized from GSSG. Oxidation with 5 mM glutathione at 37 ° C. for 2 hours (3), and then half of each sample was separated using a non-reducing 8% SDS-polyacrylamide gel (arrows from above).
  • Each represent [B3 (Fab) -ext-PE38] 2 , B3 (Fab) -ext-PE38 and B3 (Fd) -ext-PE38);
  • Fab Fab
  • FIG. 3B is the result of separation of the other half of each sample using a reduced 12% SDS-polyacrylamide gel (arrow shows TR protein adhered to B3 (Fab) -ext-PE38 and TR1 protein ( The molecular weight 8 kDa) is not shown in the figure because it is too small to separate).
  • the present invention uses a repeating chain of an adhesive having an adhesive specificity for a monomer as a scaffold for the purpose of mass production of multimers formed by bond crosslinking.
  • the process of making a multimer by connecting a plurality of monomers by crosslinking determines the yield of the multimer by how efficient the formation of the crosslinking is.
  • the crosslinks forming the multimers must be covalent to maintain the stability of the multimers without being decomposed into monomers in vivo.
  • these chemical functional groups are very small compared to the total size of the protein molecule. Therefore, when large protein molecules move freely in the reaction solution, the probability of contacting each other with very small portions of chemical functional groups is very small. Production of efficient multimers is difficult without a method of dramatically increasing the probability of contact of these functional groups.
  • the present invention is to create a repeating chain of adhesive adhesive to the monomer in order to significantly increase the formation of cross-linking between the monomers having low production efficiency, and to bond the monomer to the monomer to a distance of several nanometers to several tens or
  • the monomers are fixed in a confined space, moving and contacting each other in a space of molecular size, as opposed to free movement in contact with the solution.
  • the local concentration of the monomers becomes very high, and the contact frequency between the monomers to which they are attached is very high, thereby contacting chemical functional periods that can form crosslinks. It is also possible to increase the formation of multimers significantly.
  • the object of the present invention is not limited to only protein monomers and disulfide covalent crosslinking, monomers such as organic compounds, biomolecules, proteins and amide bonds, ester bonds, glycidic bonds, ether bonds, etc. It is obvious that this also applies to covalent bonds.
  • Covalent crosslinks are crosslinks that increase the stability of most multimers, but the crosslinks are not necessarily limited to covalent bonds. That is, the idea of the present invention can be applied even when the multimer is formed by crosslinking such as ionic bond.
  • the idea of the present invention may be applied to increase the formation efficiency of the multimer (Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques.Academic Press, Inc., 1995; Wong SS, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking.CRC Press, Inc., 1991.).
  • the method according to the invention is preferably performed by a method comprising the following steps:
  • step 2) mixing the repeating chain and the monomer of step 1) to prepare a repeating chain-multimer monomer complex of the repeating chain and monomer;
  • the adhesive of the monomer and the monomer specifically bonded to the monomer of step 1) is preferably derived from a protein, but is not limited thereto. That is, the monomer and the adhesive may be used for all molecules having adhesion specificity between them. For example, proteins and small organic compounds that specifically adhere to them can be used by the methods of the invention as monomers and adhesion specific adhesives to them, respectively.
  • step 1) in the preparation of the repeating chain of the adhesive specific adhesive in step 1), it is possible to prepare the repeating chain having different adhesive specific adhesives. Through this, it is possible to prepare heterodimers and heteromultimers between different monomers that specifically adhere to respective adhesives.
  • the protein monomer of step 1) and its adhesion specific protein are preferably derived from the native form of the protein, but are not limited thereto. That is, the recombinant monomer may also be used to produce a crosslinked multimer by the method of the present invention if there is a partner having adhesive specificity.
  • DNA fragments encoding the genetic information of the protein is more preferably prepared by cloning by PCR using a forward and reverse primer pair from the chromosomal DNA or mRNA of the organism expressing the protein, but is not limited thereto.
  • the binding crosslinking of step 3) is not only a protein monomer and a disulfide covalent crosslinking bond, but also an amide bond, an ester bond, a glycosidic bond or an ether bond with a monomer of an organic compound, a biomolecule or a protein. Covalent bonds are also included. Covalent crosslinking is a crosslinking that increases the stability of the most multimers, but the crosslinking is not limited to covalent bonds, and multimers may be formed by ionic bonding.
  • the repeating chain of step 1) is preferably manufactured by a manufacturing method including the following steps, but not always limited thereto:
  • step 2) preparing a transformant by transforming the construct of step 1) into a host cell
  • step 3 culturing the transformant of step 2), and separating and purifying the expressed repeat chain by chromatography.
  • the construct preferably has a structure in which the adhesive protein in the repeating chain is repeated three or more times, but is not limited thereto.
  • the construct is an adhesive protein is linked through a linker (linker), the G 4 GGGGS may be used as the S linker, but is not limited thereto.
  • the linker may be extended to be GGGGSGGGGS or GGGGSGGGGSGGGGS, but is not limited thereto. G above 4
  • the S linker is a very flexible structure (R. Arai, et al., Protein Eng 14 (2001) 529-532).
  • the DNA fragment encoding the adhesive protein and the linker was cleaved with Nde I and EcoR I, and then cloned into the vector site of pCW1 digested with the above enzyme to prepare plasmid pTR1.
  • the DNA fragment encoding the adhesive protein and G 4 S was further cleaved with Nde I and Bsp EI to obtain the adhesive protein DNA fragment and a 226 bp polynucleotide fragment encoding one G 4 S as a linker between the domains.
  • the plasmid pTR2 was prepared by cloning pTR1 into Nde I and Age I and then cloning the plasmid site.
  • the above cloning method was repeated up to seven times to prepare a plasmid pTR7 having a construct in which the adhesive protein was repeated seven times (see Table 1).
  • the plasmid was transformed and overexpressed in E. coli BL21 (DE3), and then separated and purified by chelating sepharose fast flow chromatography and size-exclusion chromatography. It was.
  • the monomer of step 2) has a site (adhesive domain (B) (binding sequence)) that specifically adheres to the above-described adhesive protein.
  • the use of a repeating chain of different adhesive specific adhesives in the formation of the repeating chain-multimeric polymer complex of step 2) is a heterodimer between different monomers that specifically adheres to each adhesive. ) And heteromultimers are possible.
  • the above method it is preferable to include but not limited to matchless-cysteine in the chain for the production of the binding cross-linking multimer from the monomer complex of step 2). That is, as a method that can be used for the crosslinking of monomers, various types of chemical cross-linkers that are widely used other than the disulfide bond crosslinking between unpaired cysteines in the chain may be used.
  • the monomer comprises cysteine
  • the monomer of step 2) may be used as a new monomer by connecting the above-described monomer and the functional protein by an extension sequence (Ext).
  • the functional protein may be any functional group such as an enzyme, a toxin functional protein, a virus or the like, a drug compound for drug action, a liposome, a biosensor, a prodrug, or the like.
  • the extension chain (Ext) extends from the monomer to the functional protein, fusion of the monomer and the functional protein, the extension chain (Ext) may contain a matchless-cysteine in the chain between the two monomers
  • the disulfide bond crosslink is formed by the oxidation of unpaired cysteine in the chain of dimers, and this extension chain (Ext) also has the last cysteine and the heterologous in the unchained cysteine which forms a dimer by disulfide bond crosslinking.
  • GASQEND glycine, alanine, serine, glutamine, glutamic acid, arparagine, It is preferably composed of a flexible amino acid sequence including aspartic acid), but is not limited thereto.
  • step 2) is preferably carried out by mixing with the monomer, then incubated overnight at 3 ⁇ 5 °C, then incubated for 1 to 2 hours at 35 ⁇ 40 °C, at 4 °C After culturing overnight, it is more preferably carried out by incubating for 1 hour at 37 °C, but is not limited thereto.
  • the fixing of step 3) is preferably fixed to the metal chelating sepharose bead (protein chelating sepharose bead) bonded to the repeating chain in which the monomer is a skeleton.
  • fixing to the bead is preferably fixed for 1 hour at 10 °C but is not limited thereto.
  • the formation of the binding crosslinking heteromer is achieved by forming the binding crosslinking between the different monomers in the heteromonomer complex formed by the repeating chains of the adhesives having different adhesion specificities. Production is possible.
  • the formation of the binding crosslink of step 3 is possible through various existing methods (Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques. Academic Press, Inc., 1995; Wong SS, Chemistry of Protein Conjugation and Cross) -Linking.CRC Press, Inc., 1991.).
  • the reduction is preferably carried out by adding the protein complex to a reducing buffer containing 2-mercaptoethanol.
  • the amount of 2-mercaptoethanol added for complete reduction of the cysteine residue of the monomer is preferably 20 to 40 mM, but is not limited thereto.
  • a multimer is produced by disulfide bond crosslinking by oxidation of the reduced cysteine residue of each monomer. Oxidation between the monomers is preferably performed by adding the reduced protein complex to an oxidation buffer containing glutathione oxidized form (GSSG), but is not limited thereto.
  • GSSG glutathione oxidized form
  • the protein complex is preferably reduced at room temperature by adding TrisHCl (pH8.2) added with 2-mercaptoethanol (Merchaptoethanol), but is not limited thereto.
  • the reduced protein complex is washed once with a washing buffer containing MOPS (pH 6.5), but is not limited thereto. After washing three more times with TrisHCl (pH8.2), and then oxidized by addition of an oxidation buffer containing GSSG and TrisHCl (pH8.2), and then incubated for 2 hours at 37 °C.
  • the culture temperature and time are preferably 37 ° C. and 2 hours, but are not limited thereto.
  • the separation of the binding cross-linking multimer of step 3) is preferably performed using SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), but is not limited thereto. Is all possible.
  • the multimer of step 3) is preferably a disulfide bond dimer of a monomer, but is not limited thereto.
  • the monomer in the form of a fusion protein molecule is made in the form of an 'adhesive domain-extension chain (Ext) -functional protein', wherein the extension chain is an adhesive domain-extension-functional chain when the chain contains an unpaired cysteine.
  • Ext 'adhesive domain-extension-functional protein
  • disulfide bond crosslinking is made between two domains of adhesion domain-extension-chain (Ext) -functional protein by unchained cysteine of protein structure. It is done.
  • the inventors used the Fab adhesion domain of protein G of Streptococcus as an adhesion-specific adhesive protein and an antibody-toxin having Fab as the protein fragment of the antibody as the adhesion domain of the monomer to complete the invention.
  • As a monomer all the antibody molecules (antibody molecule monomer) containing Fab which is a fragment of an antibody besides the form of antibody-toxin are possible.
  • the antibody chain monomer proteins are mixed with the repeating chains to prepare repeat chain-antibody molecule monomer complexes in which several antibody molecule monomers are non-covalently linked to one recombinant protein, and then the cysteine residue in the antibody molecule monomer is reduced and [Antibody molecular monomer] 2 was prepared by oxidation to form disulfide bonds of cysteine residues between Fab fragments and toxins.
  • the antibody was separated by SDS-PAGE and then analyzed by density analysis [antibody molecule monomer].
  • the yield of [antibody molecule monomer] 2 by the method of the present invention was significantly higher than the yield by refolding reported previously. That is, the yield of [antibody molecule monomer] 2 ranges from about 36 to 52% of the total antibody molecule monomer attached to the recombinant protein where the Fab adhesion domain of protein G of Streptococcus is repeated two or more times, which has been reported previously. It was found to be about 144 to 208 times higher than the refold yield.
  • the present invention also provides a gene construct encoding the expression of adhesion protein repeat chain recombinant protein having adhesion specificity.
  • a gene construct encoding a recombinant protein in which domain G of protein G (Fab adhesion domain) is repeated is prepared.
  • the recombinant protein preferably includes, but is not limited to, one linker G 4 S (GGGGS) between two Fab adhesion domains.
  • the recombinant protein is preferably a structure in which domain III of the protein G (Fab adhesion domain) is repeated 3 to 7 times, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides an expression vector comprising the gene construct according to the present invention.
  • the expression vector has a specific nucleic acid sequence having regulatory information on transcription and translation into the mRNA of the gene to the desired gene is linked to the desired gene so that the gene of the desired protein is well expressed and the production of the protein is possible. It is desirable to have.
  • the present invention provides a transformant transformed into a host cell with the expression vector according to the present invention.
  • Introduction of the expression vector into a host cell may include transformation, transfection, conjugation, protoplast fusion, electroporation, and calcium phosphate. It can be introduced into a suitable host cell by one of several suitable methods, such as -precipitation, direct microinjection, and the like.
  • the host cell may be a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • [antibody molecular monomer] 2 can be mass-produced from the antibody molecular monomer using a recombinant protein in which the Fab adhesion domain of Streptococcus protein G is repeated 3 to 7 times as a backbone.
  • the repeating chain of the adhesive specific adhesive of the present invention can be used to significantly increase the production of dimers between monomers, gene constructs encoding the expression vector, an expression vector comprising the gene construct, and the expression.
  • the transformants transformed with the vector may be usefully used for mass production of the crosslinking multimers between the antibody molecule monomers.
  • P1 [from the chromosomal DNA of Streptococcus (KCTC 3098), which received domain III of protein G from the Korea Collection for Type Cultures (KCTC). Cloning directly via PCR using 5'-GGG CATATG CATCACCATCACCATCAC ACCGGT ACACCAGCCGTGACAA-3 '(SEQ ID NO: 1)] and P2 [5'-CCC GAATTC TTA TCCGGA CCCGCCTCCACCTTCAGTTACCGTAAA-3' (SEQ ID NO: 2)] primer It was.
  • the PCR product (243 bp) was cut with Nde I and EcoR I, and then cloned into the vector portion of pCW1 cut with the above enzyme.
  • the coding sequence of the domain III was then confirmed by dideoxy DNA sequencing.
  • G 4 S linker between each domain III was added as a spacer.
  • the resulting plasmid pTR1 was cut again with Nde I and Bsp EI.
  • the 225 bp fragment encoding domain III and one G 4 S was then pasted into large fragments of the same plasmid cut with Nde I and Age I.
  • the resulting plasmid pTR2 was cut into Nde I and Age I, and then the large cut fragment was attached to a 226 bp fragment, which was called 'pTR3'.
  • domain III of protein G (pTR10) was repeated up to 10 times (Table 1).
  • pMC75H encoding H6-B3 (L) was prepared (see Republic of Korea Patent Registration 10-0566091).
  • pTR1-10 TR1 ⁇ 10: (His) 6- (DG 4 S) n , n 1 ⁇ 10 c
  • SKPSIST modified sequence of wild type hinge sequence (CKPCICT);
  • KASG 4 C (G 4 S) 2 extended peptide chain with cysteine residues
  • G 4 amino acid sequence of GGGG;
  • PE38 38 kD truncated Pseudomonas Exotoxin
  • B3 (Fab) -ext-PE38 was prepared by internal chain disulfide bonds between B3 (Fd) -ext-PE38 and H6-B3 (L). Two cysteine residues involved in internal chain disulfide bonds were located in the C H1 domain of B3 (Fd) -ext-PE38 and the C L domain of H6-B3 (L). [B3 (Fab) -ext-PE38] 2 was also prepared by internal chain disulfide bonds between two cysteine residues located at ext in B3 (Fab) -ext-PE38 during the refolding process.
  • V e is the elution volume of the peak and V o is the void volume of the column, which is the elution volume of blue dextran 2000; V t is the bed volume of the Superdex-200 column.
  • Complexes from TR3 to TR6 were shown as dimers, while TR7 ⁇ 10 complexes were shown as trimers.
  • the present inventors have used glutathione oxidized form (GSSG) to produce [B3 (Fab) -ext-PE38] 2 using the purified TR1-10 protein and B3 (Fab) -ext-PE38 adhered thereto. After oxidation, the immobilized molecules were separated by non-reducing (FIG. 2A) and reducing (FIG. 2B) SDS-PAGE.
  • GSSG glutathione oxidized form
  • the protein complex was fixed in metal chelating sepharose beads at 10 ° C. for 1 hour. After addition of 10 ⁇ l of metal chelating Sepharose beads [50% suspension in 100 mM TrisHCl (pH8.2)] to each reaction mixture, the immobilized protein complex was added to 40 mM 2-mercaptoethanol (Merchaptoethanol) at room temperature. ) Was added by addition of 100 mM TrisHCl (pH8.2).
  • 2-mercaptoethanol Merchaptoethanol
  • [B3 (Fab) -ext-PE38] band the intensity of the 2 [B3 (Fab) -ext- PE38] 2 and B3 (Fab) -
  • the yield of [B3 (Fab) -ext-PE38] 2 was calculated using the value divided by the total band intensity, which is the sum of the intensities of ext-PE38 (Table 2).
  • B3 (Fab) -ext-PE38 alone and B3 (Fab) -ext-PE38 adhered to TR1 were used as negative controls.
  • [B3 (Fab) -ext-PE38] 2 was not detected in three samples of B3 (Fab) -ext-PE38 alone, TR1, and TR2 complex.
  • the interaction of the TR3 to TR7 complexes showed significant production of disulfide bonded dimers.
  • [B3 (Fab) -ext-PE38] from samples of TR3 to TR7 complex 2 Yields were 47%, 44%, 48%, 36% and 52%, respectively.
  • the present invention can promote the formation of a repeating chain-multimeric monomer complex by using a repeating chain of an adhesive that specifically bonds with a monomer through affinity as a method of producing a crosslinking multimer, and further, generates a repeating chain-multiple.
  • the monomer complex can be produced in the form of a bond crosslinking multimer. This causes a significantly higher production rate compared to the conventional method for producing a crosslinked crosslinking polymer, so that the crosslinked dimer can be mass produced, and thus it can be industrially useful.
  • the monomer can be made from several kinds of materials and examples thereof include ligands, or some fragments having adhesive properties thereof, for example TGF alpha, TGF beta, IL2, IL6, TNF, GMSCF and the like, and also various ligand receptors or their Some fragments with adhesive properties of the receptor, such as various receptors such as TBP1, TBP2, IFN alpha or beta receptors, gonadotropin receptors, etc. can be used to make monomers (Nienhaus, G. Ulrich. Protein-ligand interactions: methods and applications.Humana Press, 2005).
  • the adhesive specificity repeating chain produced by the method of the present invention has a property of forming a repeating chain-multimeric monomer complex, it is possible to fix the repeating chain in a resin, thereby purifying useful protein molecules in the bioindustry and medical industry. High efficiency affinity purification for separation purification will be possible (Zachariou M., Affinity Chromatography: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Humana Press; 2nd edition).

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Abstract

본 발명은 단량체에 접착특이성이 있는 접착체가 반복-연결되어 있는 반복사슬을 제작하고 이를 이용하여 반복사슬과 여러 단량체들에 의해 만들어진 반복사슬-다수단량체 복합체를 만들어, 복합체 내에서 단량체사이의 결합 가교의 형성이 용이하게 함으로써, 다수의 단량체들이 결합 가교로 연결된 다량체의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 단백질 단량체에 접착 특이성을 갖는 접착단백질이 반복 연결되어 있는 반복사슬 재조합 단백질을 제작하고 이를 이용하여 반복사슬과 여러 단량체들에 의해 만들어진 반복사슬-다수단량체 복합체를 만들어, 복합체 내에서 단량체사이의 결합 가교의 형성이 용이하게 함으로써, 다수의 단량체들이 결합 가교로 연결된 다량체의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 단백질 단량체에 접착 특이성을 갖는 접착단백질이 반복 연결되어 있는 반복사슬 재조합 단백질을 제작하고 이를 이용하여 반복사슬과 여러 단량체들에 의해 만들어진 반복사슬-다수단량체 복합체를 만들어, 복합체 내에서 단량체사이의 이황화 결합 가교의 형성이 용이하게 함으로써, 다수의 단량체들이 이황화 결합 가교로 연결된 다량체의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 연쇄상 구균(Streptococcal)의 단백질 G(protein G)의 도메인 Ⅲ(Fab 접착 도메인)가 반복-연결되는 재조합 반복사슬 단백질을 골격으로 이용하여 항체 단백질의 단량체로부터 반복사슬과 그의 다수단량체 복합체를 만들어, 복합체 내에서 단량체사이의 이황화 결합 가교의 형성이 용이하게 함으로써, 다수의 단량체들이 이황화 결합 가교로 연결된 이량체 및 다량체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 기존에 알려진 재접힘(refolding) 방법에 비해 이황화 결합 가교 이량체의 수득률을 기존의 재접힘 방법에 비해 최대 200배 향상시킴으로써 이황화 결합 가교 이량체를 대량 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

단량체에 접착특이성이 있는 접착체의 반복사슬과 다수단량체의 복합체 내에서의 결합 가교의 생성 증가를 통한 이량체 및 다량체의 생산방법
본 발명은 단량체로부터 이량체 및 다량체를 높은 수득률로 생산하는 방법에 관한 것이다. 이를 위하여 접착특이성이 있는 접착체의 반복사슬을 이용하여 반복사슬-다수단량체 복합체를 생산하고 복합체내의 단량체들 사이의 결합 가교 형성이 용이함을 이용하여 다량체를 생산하는 것이다. 이는 접착체의 반복사슬을 골격으로 이용하여 반복사슬-다수단량체 복합체의 형성을 극대화하고 형성된 반복사슬-다수단량체 복합체로부터 이황화 결합 가교의 생성을 높여 이량체 및 다량체를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
항체-독소(Antibody-toxin)는 암세포에 특이적으로 접착하는 항체에 독소를 결합시킴으로써 합성된다(Pastan I. et al., Annu Rev Med. 58 (2007) 221-237).
단일클론항체(monoclonal antibody, MAb) B3은 대장암, 위암, 난소암, 유방암 및 폐암 등의 표면에서 과발현되는 탄수화물 항원(carbohydrate antigen, LeY)에 접착한다(L.H. Pai, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 88 (1991) 3358-3362; I. Pastan, et al., Cancer Res. 51 (1991) 3781-3787). PE38은 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin, PE)의 유도체 중 하나이다(J. Hwang, et al., Cell. 48 (1987) 129-136; V.K. Chaudhary, et al., J Biol Chem 265 (1990) 16306-16310).
항체의 항원 접착부위를 포함하는 단편으로서 Fab는 Fd 사슬(VH 및 CH1) 및 경쇄 사슬(VL 및 CL)를 포함한다. Fab 항체-독소는 Fd 사슬(VH 및 CH1) 및 경쇄 사슬(VL 및 CL)를 포함한다. Fab-독소는 단일 사슬 Fv(scFv)-독소에 비해 두 가지 이점을 가진다. 첫째로, Fab-독소의 수득률이 scFv-독소에 비해 10배 높다(J. Buchner, et al., Biotechnology (N Y). 9 (1991) 157-162; J. Buchner, et al., Biotechnology 10 (1992) 682-685). 둘째로, 마우스 혈장에서 Fab-독소의 안정성이 개선된다(M. Choe, et al., Cancer Res. 54 (1994) 3460-3467).
이황화 결합된 2가의 Fab-독소 이량체는 1가의 scFv-독소에 비해 높은 세포독성을 가진다고 보고된 바 있다(S.H. Choi, et al., Bull. Kor. Chem. Soc. 22 (2001) 1361-1365; J.H. Park, et al., Mol Cells 12 (2001) 398-402; M.H. Yoo, et al., J. Microbiol. Biotechnol. 16 (2006) 1097-1103). 이황화 결합된 이량체는 단량체인 Fab-독소의 Fab 도메인 및 PE38 사이에 위치하는 시스테인(Cystein, Cys) 잔기의 이황화 결합을 통해 제조된다.
이량체인 항체-독소는 단량체인 항체-독소에 비해 여러 가지 이점을 가지는 것으로 기대된다. 예를 들면, 이량체의 두 개의 항원 접착 도메인은 접착을 증가시켜 높은 복합도 (avidity)를 갖게 한다. 또한, 2가의 이량체 항체-독소는 표적 세포에 동시에 두 개의 독소 도메인을 운반하여, 1가의 단량체 항체-독소에 비해 높은 세포독성으로 표적세포를 사멸시키는 것이 가능하다. 아울러, Fab-독소는 재조합 항체-독소의 생산을 위해 종종 이용되는 scFv-독소에 비해 높은 안정성을 가진다(D. Rothlisberger, et al., J Mol Biol 347 (2005) 773-789).
B3(Fab)-ext-PE38가 이황화 결합된 이량체인 [B3(Fab)-ext-PE38]2는 단일클론항체 B3의 Fab 도메인을 슈도모나스 외독소 A[Pseudomonas Aexotoxin A] 유도체인 PE38를 결합시켜 제조할 수 있으며(대한민국 등록특허 10-0566091), [B3(Fab)-ext-PE38]2는 B3(Fab)-ext-PE38에 비해 위암 세포주인 CRL-1739 세포주에 대해 약 11배 높은 세포독성을 가지는 것으로 보고된 바 있다(J.H. Park, et al., Mol Cells 12 (2001) 398-402).
기존에는 이황화 결합된 이량체를 단지 재접힘 후 정제하였다(S.H. Choi, et al., Bull. Kor. Chem. Soc. 22 (2001) 1361-1365; J.H. Park, et al., Mol Cells 12 (2001) 398-402; M.H. Yoo, et al., J. Microbiol. Biotechnol. 16 (2006) 1097-1103). 기존에 보고된, 이황화 결합된 이량체의 재접힘 공정(refolding process)은 0.014% ~ 0.25% 수득률을 증가시켰다. 상기 재접힘 공정 동안, 이황화 결합된 이량체는 2개의 단량체의 항체-독소의 Fab 도메인 및 PE38 사이 부위에 위치하는 시스테인 잔기의 무작위적 접근에 의해 형성되었다. 상기 재접힘 공정이 이황화 결합된 이량체의 수득률을 증가시킴에도 불구하고, 재접힘 반응의 주요 산물인 단량체인 Fab-독소의 수득률이 약 10%에 달하는 점에 비추어 볼 때 이량체의 수득률은 매우 낮았다. 단량체인 항체-독소가 자신들 사이의 자체적인 접착 친화성 (self-binding-affinity)이 없으므로 결합가교 이량체는 재접힘 반응에서 단량체 항체-독소의 시스테인 잔기 상호간의 무작위적인 충돌에 의해서 생성되는 것이다. 그러므로 재접힘 과정중에 생성되는 이량체의 매우 낮은 수득률은 시스테인 잔기 상호간의 충돌빈도(collision frequency)가 매우 낮기 때문에 상기 재접힘 공정에서 단량체내의 시스테인 간의 접근에 의한 이황화 결합 가교의 형성이 용이하지 않음에 기인한다.
따라서 지금까지 본 발명자들은 환원 및 산화, 및 화학적 가교제 (chemical cross-linker)를 통해 단량체인 항체-독소로부터 이황화 결합된 이량체의 생산을 포함하는 이황화 결합된 이량체의 다양한 생산방법을 시도하였지만 단순히 환원, 산화, 및 화학적 가교제의 방법을 통해서 이량체 수득률을 향상시키지는 못하였다.
이에, 본 발명자들은 단량체 B3(Fab)-ext-PE38가 이황화 결합된 이량체인 [B3(Fab)-ext-PE38]2를 더 많이 생산하기 위한 방법을 찾던 중, 연쇄상 구균(Streptococcal)의 단백질 G(protein G)의 Fab 접착 도메인이 2번이상 반복되는 반복사슬 재조합 단백질을 제작하였으며 이를 골격(scaffold)으로 이용하여 복수의 단량체 항체-독소가 동시에 접착하는 복합체를 제작하였다. 단백질 G의 세번째 도메인(도메인 Ⅲ)은 IgG의 Fab 단편에 접착할 수 있으며, Fab 단편의 CH1 도메인이 단백질 G의 도메인에 높은 친화도로 접착할 수 있음이 보고된 바 있다(J.P. et al., Nature 359 (1992) 752-754). 상기 재접힘 공정에 비해 본 발명의 상기 반복사슬은 하기의 이점을 가지고 있다. 상기 반복사슬을 구성하는 도메인들은 단량체 항체-독소에 대해 높은 친화도로 접착한다. 반복사슬을 이용하여 생성된 반복사슬-다수단량체 복합체내의 단량체 항체-독소들의 국부농도(local concentration)을 높일 수 있었다. 이는 단량체 항체-독소의 시스테인 잔기의 접근빈도를 높이게 되어 단량체간의 이황화 결합을 촉진시킬 수 있고, 그 결과 이황화 결합 가교 이량체의 대량생산을 가능케 하였다. 이와 같은 효과의 대표적인 예로서는 효소 반응 속도론에서 설명하는 접근효과(proximity effect)에 의해 효소 반응의 속도가 현저히 증가하는 것이 있다(Nicholas C. Price and Lewis Stevens. Fundamentals of Enzymology, 3rd Ed. Oxford University Press). 따라서 상기 반복사슬을 단량체 항체-독소와 단순히 혼합함으로서 복합체를 손쉽게 제조할 수 있었으며, 상기 복합체내 단량체 항체-독소의 시스테인 잔기를 환원 및 산화시킴으로써 Fab 도메인과 PE38 사이 시스테인 잔기의 이황화 결합을 촉진하여 [B3(Fab)-ext-PE38]2를 대량 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 단량체들 사이에 가교결합을 이용하여 단량체로부터 다량체를 대량 생산하는 것으로서 단량체에 대해 접착 특이성을 갖는 접착체의 반복사슬을 골격(scaffold)으로 이용하여, 단량체들과 접착시켜 상기 단량체의 반복사슬-다수단량체 복합체를 대량 생산하고 생산된 반복사슬-다수단량체 복합체를 구성하는 단량체들 사이에 결합 가교를 형성하여 기존의 결합 가교 다량체 생산 방법에 비해 단량체의 사슬내 짝이 없는 시스테인 잔기의 접근빈도를 높임으로서 결합 가교의 형성을 촉진하여 상기 단량체의 다량체를 생산을 극대화 하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 단량체에 특이적으로 접착하는 접착체의 반복사슬을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 반복사슬 및 단량체를 혼합하여, 상기 반복사슬과 단량체의 반복사슬-다수 단량체 복합체를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 반복사슬-다수단량체 복합체내의 단량체들간의 결합 가교를 형성한 다량체를 분리하는 단계를 포함하는, 결합 가교 다량체의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 생산방법을 이용한 예로서 항체-독소를 이황화 결합 가교로 연결한 이량체를 생산하였을 때 기존에 보고된 재접힘(refolding) 방법에 비해 단량체항체-독소의 이황화 결합 가교 이량체의 수득률을 약 208배 증가시킴으로써 이량체의 생산량을 극대화시킬 수 있었다. 본 발명에 의해 생산된 이량체는 기존에 보고된 단량체 항체-독소에 비해 높은 항원 접착력, 독성 및 안정성을 가지며, 특히 위암 세포주에 대해 약 11배 높은 세포독성을 가지는 것으로 알려져 있어 이를 대량 생산함으로써 항암 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 결합 가교를 이용한 다량체 생산 방법의 개요도를 나타내는 그림이다.
도 2는 본 발명에서 정제된 단백질을 SDS-폴리아크릴라마이드 겔로 확인한 결과를 나타내는 그림이다:
도 2A는 단백질 G의 반복사슬 재조합 단백질을 환원 SDS-시료 완충용액과 혼합한 뒤, 환원 16% SDS-폴리아크릴라마이드 겔로 확인한 결과이며, 1번부터 7번 줄은 각각 TR1 ~ TR7 단백질이다; 및
도 2B는 본 발명에서 생산한 항체-독소인 B3(Fab)-ext-PE38(M) 및 [B3(Fab)-ext-PE38]2(D)를 비환원 8% SDS-폴리아크릴라마이드 겔로 확인한 결과이며, 화살표는 위에서부터 각각 [B3(Fab)-ext-PE38]2, B3(Fab)-ext-PE38 및 B3(Fd)-ext-PE38을 나타낸다(H6-B3(L)은 작은 분자량(대략 25kDa)을 갖기 때문에 도면에 나타나지 않았다).
도 3은 B3(Fab)-ext-PE38와 TR1 ~ TR7 단백질의 복합체로부터 [B3(Fab)-ext-PE38]2의 형성을 SDS-폴리아크릴라마이드 겔로 확인한 결과를 나타내는 그림이다:
도 3A는 단백질 시료(각각 10 g)를 금속 킬레이팅 아가로스 비드에 접착시키고(1) 40 mM 2-멀캅토에탄올로 30분 동안 실온에서 환원한 다음(2), 단백질 복합체를 GSSG로부터 산화된 5 mM 글루타치온(Glutathione)으로 2시간 동안 37℃에서 산화한 다음(3), 각 시료의 1/2을 비환원 8% SDS-폴리아크릴라마이드 겔을 사용하여 분리한 결과이다(화살표는 위에서부터 각각 [B3(Fab)-ext-PE38]2, B3(Fab)-ext-PE38 및 B3(Fd)-ext-PE38을 나타낸다); 및
도 3B는 각 시료의 나머지 1/2을 환원 12% SDS-폴리아크릴라마이드 겔을 사용하여 분리한 결과이다(화살표는 B3(Fab)-ext-PE38에 접착된 TR 단백질을 나타내고, TR1 단백질(분자량 8 kDa)은 분리하는데 있어서 크기가 너무 작기 때문에 도면에 나타나지 않았다).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 결합가교에 의해 형성된 다량체의 대량 생산을 목적으로 하여 단량체에 대해 접착 특이성을 갖는 접착체의 반복사슬을 골격(scaffold)으로 이용하여, 단량체와 반복사슬의 복합체를 제작하면 복합체를 구성하는 단량체의 국부농도 (local concentration)을 높임으로써 단량체간의 충돌빈도를 높이고, 이로써 결합 가교의 생성을 촉진 시켜 결합 가교 다량체의 수득률을 향상시키는 방법을 제공한다.
다수의 단량체를 가교 결합으로 연결시켜 다량체를 만드는 과정은 가교 결합의 형성이 얼마나 효율적인가에 의해 다량체의 생산량이 결정된다. 생체 내에서 사용하고자 하는 물질의 경우 다량체를 형성하는 가교 결합은 공유결합이어야 생체 내에서 단량체로 분해되지 않고 다량체의 안정성을 유지할 수 있다. 이러한 공유결합성 가교결합을 형성하기 위해서는 공유결합을 형성할 수 있는 화학적 기능기들 간의 접촉이 있어야 하는데 단백질과 같은 거대 분자에서 이러한 화학적 기능기들은 단백질 분자 전체 크기에 비해 매우 작은 크기이다. 따라서 거대 단백질 분자가 반응 용액에서 자유로이 움직이고 있을 경우 매우 작은 부분인 화학적 기능기가 서로 접촉할 확률은 매우 작으며. 이러한 기능기가 접촉할 확률을 획기적으로 높이는 방법이 없이는 효율적인 다량체의 생산이 어렵다.
본 발명은 이러한 생성효율이 낮은 단량체 간의 가교 결합의 형성을 획기적으로 높이기 위하여 단량체에 접착성이 있는 접착체의 반복사슬을 만들어, 여기에 단량체를 접착시키어 단량체들 간의 거리를 수 나노미터에서 수십 또는 수백 나노미터 크기의 분자 크기의 수준으로 되게 함으로써, 단량체들이 용액에서 자유로이 운동하면서 접촉하는 것과는 달리, 한정된 공간에 고정되어 분자크기 정도의 공간에서 움직이며 상호 접촉하게 한다. 이러한 조건에서 다수의 단량체들이 붙어 있는 한 개의 반복사슬에서는 단량체의 국지적 농도가 매우 높은 상태가 되며, 같이 붙어 있는 단량체들 간의 접촉 빈도는 매우 높아지고 그에 따라 가교 결합을 형성할 수 있는 화학적 기능기간의 접촉도 증가하여 다량체의 형성을 획기적으로 증가시킬 수 있다.
본 발명이 적용될 수 있는 대상은 단지 단백질 단량체와 이황화 공유결합성 가교결합에만 국한 되지 않고, 유기 화합물, 생물분자, 단백질 등의 단량체들과 아마이드결합, 이스터결합, 글라이코시딕결합, 이써결합 등의 공유결합들에도 적용된다는 것은 명백하다. 공유결합성 가교 결합이 가장 다량체의 안정성을 높이는 가교 결합이지만 이 가교결합이 반드시 공유결합에만 국한되는 것은 아니다. 즉 이온결합 등의 가교결합으로 다량체를 형성하는 경우에도 본 발명의 사상이 적용될 수 있다. 또한 단량체 간의 가교를 형성하기 위하여 가교 사슬을 넣어 단량체-가교사슬-단량체의 형태로 다량체를 형성하는 경우에도 그 다량체의 형성효율을 증가시키기 위하여 본 발명의 사상이 적용될 수 있다(Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques. Academic Press, Inc., 1995; Wong S. S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking. CRC Press, Inc., 1991.).
구체적으로, 본 발명에 따른 방법은 하기의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 단량체에 특이적으로 접착하는 접착체의 반복사슬을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 반복사슬 및 단량체를 혼합하여, 상기 반복사슬과 단량체의 반복사슬-다수 단량체 복합체를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 반복사슬-다수단량체 복합체내의 단량체들간의 결합 가교를 형성한 다량체를 분리하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 단량체와 단량체에 특이적으로 접착하는 접착체는 단백질로부터 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 즉 상기 단량체와 접착체는 그들 상호간에 접착 특이성을 가지는 모든 분자들이 사용되어질 수 있다. 예를 들어 단백질과 그에 특이적으로 접착하는 작은 유기 화합물은 각각 단량체 및 그에 대한 접착 특이성 접착체로서 본 발명의 방법에 의해 사용되어질 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 접착특이성 접착체의 반복사슬의 제작함에 있어서 서로 다른 접착 특이성 접착체를 갖는 반복사슬의 제작이 가능하다. 이를 통해 각각의 접착체에 특이적으로 접착하는 서로 다른 단량체간의 이종이량체(heterodimer) 및 이종다량체 (heteromultimer)의 제작이 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 단백질 단량체 및 그의 접착특이성 단백질은 단백질의 native form으로부터 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 즉 재조합 형태의 단량체도 접착 특이성을 가지는 상대가 있으면 본 발명의 방법에 의해 결합가교 다량체 생산에 사용되어질 수 있다. 상기의 단백질의 유전정보를 암호화하는 DNA 단편은 그 단백질을 발현하는 생물체의 염색체 DNA 또는 mRNA로부터 정방향 및 역방향 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 통해 클로닝하여 제조하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 결합 가교는 단백질 단량체와 이황화 공유결합성 가교 결합 뿐만 아니라, 유기 화합물, 생물분자 또는 단백질의 단량체들과 아마이드결합, 이스터결합, 글라이코시딕결합 또는 이써결합의 공유결합들도 포함된다. 공유결합성 가교 결합이 가장 다량체의 안정성을 높이는 가교 결합이지만 상기 가교결합이 공유결합에만 한정되는 것은 아니며, 이온결합으로 다량체가 형성될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 반복사슬은 하기의 단계를 포함하는 제조방법으로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 접착특이성 접착체 단백질 및 그의 사이를 연결하는 링커를 암호화하는 DNA 단편을 발현벡터에 반복하여 클로닝하여, 접착체 단백질이 반복되는 컨스트럭트를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 컨스트럭트를 숙주세포에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 형질전환체를 배양한 후, 발현된 반복사슬을 크로마토그래피로 분리 및 정제하는 단계.
상기 컨스트럭트는 반복사슬내의 접착체 단백질이 3번 이상 반복되는 구조를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 컨스트럭트는 접착체 단백질은 링커(linker)를 통해 연결되어 있으며, 상기 G4S 링커로는 GGGGS가 사용될 수 있으나 이에 한정하지 않으며, 상기 링커는 더 연장되어 GGGGSGGGGS 또는 GGGGSGGGGSGGGGS일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 G4S 링커는 매우 유연성 있는 구조이다(R. Arai, et al., Protein Eng 14 (2001) 529-532).
본 발명에서는 접착체 단백질 및 링커를 암호화하는 DNA 단편을 NdeI과 EcoRI로 절단한 후, 상기와 같은 효소로 절단한 pCW1의 벡터 부위에 클로닝하여 플라스미드(plasmid) pTR1을 제조하였다. 다시 접착체 단백질 및 G4S를 암호화하는 DNA 단편을 NdeI과 BspEI로 절단하여 상기 접착체 단백질 DNA 단편, 및 상기 도메인 사이 링커로서 한개의 G4S를 암호화하는 226 bp의 폴리뉴클레오티드 단편을 제작하고 이를 pTR1을 NdeI과 AgeI으로 절단하여 얻어진 플라스미드의 부위에 클로닝하여 플라스미드 pTR2를 제조하였다. 상기와 같은 클로닝 방법을 7번까지 반복하여 접착체 단백질이 7번 반복되는 컨스트럭트를 갖는 플라스미드 pTR7를 제조하였다(표 1 참조). 상기 플라스미드를 E.coli BL21(DE3)에 형질전환하여 과발현시킨 후, 킬레이팅 세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피(chelating sepharose fast flow chromatography) 및 크기배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)를 이용하여 분리 및 정제하였다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단량체는 상기한 접착체 단백질에 특이적으로 접착하는 부위(접착도메인(B)(binding sequence))을 갖는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 반복사슬-다수단량체 복합체의 형성에 있어서 서로 다른 접착특이성 접착체들의 반복사슬을 사용하면 각각의 접착체에 특이적으로 접착하는 서로 다른 단량체간의 이종이량체(heterodimer) 및 이종다량체(heteromultimer)의 제작이 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단량체 복합체로부터 결합 가교 다량체의 제작을 위해 사슬내 짝이 없는 시스테인(matchless-cysteine)을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 즉 단량체간의 결합가교에 사용될 수 있는 방법으로는 상기한 사슬내 짝이 없는 시스테인간의 이황화 결합 가교 이외의 범용하게 사용되는 다양한 종류의 화학적 가교제(chemical cross-linker)들이 사용될 수 있다. 단량체가 시스테인을 포함하는 경우 한 개의 사슬내 짝이 없는 시스테인을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단량체는, 상기한 단량체와 기능성 단백질이 연장사슬(extension sequence, Ext)에 의해 연결되어 새로운 단량체로 사용될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 기능성 단백질은 효소, 독소작용기 단백질, 바이러스 등의 생체, 화합물, 약물작용을 위한 약물화합물, 라이포좀, 바이오센서, 프로드러그 등과 같은 작용기(functional group)는 모두 가능하다.
상기 연장사슬(Ext)은 단량체로부터 연장되어 기능성 단백질로 이어져, 단량체와 기능성 단백질을 융합시키며, 상기 연장사슬(Ext)에는 사슬내 짝이 없는 시스테인(matchless-cysteine)이 포함될 수 있어 두 개의 단량체 사이의 사슬내 짝이 없는 시스테인의 산화에 의해 이황화 결합 가교가 형성됨으로써 이량체가 이루어지며, 또한 이 연장사슬(Ext)에는 이황화 결합 가교로 이량체를 이루게 하는 사슬내짝이 없는 시스테인중의 마지막 시스테인과 이종작용기(F) 사이의 유연한 아미노산 서열(Flx, flexible sequence)이 포함되며, 이 유연사슬(Flx)은 벌키(bulky)하지 않은 아미노산인 GASQEND(글리신, 알라닌, 세린, 글루타민, 글루탐산, 아르파라긴, 아스파르트산)을 포함하는 유연한(flexible) 아미노산 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 혼합은 상기 단량체와을 혼합한 후, 3 ~ 5℃에서 밤새 배양한 다음, 35 ~ 40℃에서 1 ~ 2시간 동안 배양하는 것으로 수행되는 것이 바람직하고, 4℃에서 밤새 배양한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하는 것으로 수행되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 고정은 상기 단량체들이 골격인 반복사슬에 접착된 단백질 복합체를 금속 킬레이팅된 세파로스 비드(metal chelating sepharose bead)에 고정시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 비드에 고정할 경우 10℃에서 1시간 동안 고정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 결합 가교의 형성에 있어서 서로 다른 접착특이성을 갖는 접착체들의 반복사슬에 의해 형성된 이종 다수단량체 복합체내의 서로 다른 단량체들간의 결합 가교를 형성시킴으로서 결합 가교 이종다량체의 제작이 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 결합 가교의 형성은 기존에 존재하는 다양한 방법을 통해서 가능하다 (Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques. Academic Press, Inc., 1995; Wong S. S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking. CRC Press, Inc., 1991.). 이황화 결합 가교를 사용하는 경우, 사슬내 짝이 없는 시스테인의 작용기는 우선 환원되야 하는데, 이때 환원은 상기 단백질 복합체를 2-멀캅토에탄올(Merchaptoethanol)을 포함하는 환원 완충용액에 첨가시켜 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 즉 상기 환원에 있어서, 단량체의 시스테인 잔기의 완전한 환원을 위한 2-멀캅토에탄올의 첨가량은 20 ~ 40 mM인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 결합 가교의 형성에 있어서 이황화 결합 가교를 사용하는 경우, 각 단량체의 환원된 시스테인 잔기의 산화에 의해 이황화 결합 가교에 의한 다량체가 생산 된다. 단량체 간의 산화는 환원된 단백질 복합체를 글루타치온 산화 형태(glutathione oxidized form, GSSG)를 포함하는 산화 완충용액에 첨가시켜 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 단백질 복합체를 실온에서 2-멀캅토에탄올(Merchaptoethanol)을 첨가한 TrisHCl(pH8.2)을 첨가하여 환원시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 환원된 단백질 복합체를 MOPS(pH6.5)가 포함된 세척 완충용액으로 1회 세척하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. TrisHCl(pH8.2)로 3회 더 세척한 다음, GSSG 및 TrisHCl(pH8.2)가 포함된 산화 완충용액을 첨가하여 산화 반응시킨 다음, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 상기 방법에 있어서 배양온도와 시간은 37℃와 2시간이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 결합 가교 다량체의 분리는 SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 일반적인 단백질의 분리 및 정제를 위해 사용되는 방법은 모두 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 다량체는 단량체의 이황화 결합 이량체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 융합단백질 분자형태의 단량체는 '접착도메인-연장사슬(Ext)-기능성 단백질' 형태로 만들어진 것으로서, 상기한 연장사슬은 사슬내짝이 없는 시스테인을 포함하는 경우에 접착도메인-연장사슬(Ext)-기능성 단백질 구조의 사슬내짝이 없는 시스테인에 의해 두 분자의 접착도메인-연장사슬(Ext)-기능성 단백질사이에 이황화 결합 가교가 만들어짐으로써 [접착도메인-연장사슬(Ext)-기능성 단백질]2의 형태로 이루어진 것이다.
본 발명자들은 발명을 완성하기 위해 단량체의 접착도메인으로서 항체의 단백질 단편인 Fab를 가진 항체-독소와 접착특이성 접착체 단백질로서 연쇄상 구균(Streptococcus)의 단백질 G(protein G)의 Fab 접착 도메인을 사용하였다. 단량체로서는 항체-독소의 형태이외에 항체의 단편인 Fab를 포함하는 항체분자(항체분자 단량체)는 모두 가능하다. 단량체간의 이황화 결합 가교 이량체([항체분자 단량체]2)의 생산량을 최대화하기 위해, 연쇄상 구균(Streptococcal)의 단백질 G(protein G)의 Fab 접착 도메인이 2번 이상 반복되는 반복사슬 재조합 단백질을 각각 제조하여 이를 [항체분자 단량체]2를 제조하기 위한 골격으로 사용하였다. 구체적으로, 상기 반복사슬들에 항체분자 단량체 단백질들을 혼합하여 하나의 재조합 단백질에 여러 개의 항체분자 단량체들이 비공유 결합된 반복사슬-항체분자 단량체복합체들을 제조한 후, 항체분자 단량체내 시스테인 잔기를 환원 및 산화하여 Fab 단편과 독소 사이 시스테인 잔기의 이황화 결합을 형성시킴으로써 [항체분자 단량체]2를 제조하였다.
본 발명자들은 상기 방법에 의한 [항체분자 단량체]2의 생산 수준을 기존의 재접힘(refolding) 방법에 의한 생산 수준과 비교하기 위해, SDS-PAGE로 분리한 후 밀도분석을 통해 [항체분자 단량체]2의 수득율을 분석한 결과, 본 발명의 방법에 의한 [항체분자 단량체]2의 수득률이 기존에 보고된 재접힘(refolding)에 의한 수득률에 비해 현저하게 높았다. 즉, [항체분자 단량체]2의 수득률은 연쇄상 구균의 단백질 G의 Fab 접착 도메인이 2번 이상 반복되는 재조합 단백질에 접착된 총 항체분자 단량체의 약 36 내지 52%의 범위이며, 이는 기존에 보고된 재접힘 수득률에 비해 약 144 내지 208배 높은 수치임을 알 수 있었다.
결론적으로, 단백질 G의 Fab 접착 도메인의 반복사슬을 사용하여 접착된 항체분자 단량체들의 이황화 결합 가교 이량체를 형성시킬 수 있으며, 상기 반복사슬의 사용을 통해 [항체분자 단량체]2의 생산을 현저히 증가시키는 것을 알 수 있다. 단백질 G의 Fab 접착 도메인의 반복사슬 및 항체분자 단량체의 접착 특이성을 이용하면, 간단히 환원 및 산화에 의해 [항체분자 단량체]2를 효율적으로 대량 생산할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 접착특이성이 있는 접착단백질 반복사슬 재조합 단백질의 발현을 암호화하는 유전자 컨스트럭트를 제공한다.
본 발명에서는 단백질 G(protein G)의 도메인 Ⅲ(Fab 접착 도메인)가 반복된 재조합 단백질을 암호화하는 유전자 컨스트럭트를 제조하였다.
상기 재조합 단백질은 2개의 Fab 접착 도메인 사이에 1개의 링커인 G4S(GGGGS)를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 단백질은 단백질 G의 도메인 Ⅲ(Fab 접착 도메인)가 3 내지 7번 반복된 구조인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
상기 발현 벡터는 원하는 유전자에 그 유전자의 mRNA로의 전사 및 단백질로 번역에 대한 조절 정보를 가지고 있는 특정의 핵산 서열이 원하는 단백질의 유전자가 잘 발현이 되고 단백질의 생산이 가능하도록 원하는 유전자에 연결되어 있게 갖고 있는 것이 바람직하다.
아울러, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.
상기 발현벡터의 숙주세포로의 도입은 형질 전환(transformation), 트랜스펙션(transfection), 컨쥬게이션(conjugation), 원형질체 융합(protoplast fusion), 일렉트로포레이션(electroporation), 인산칼슘-침전(calcium phosphate-precipitation), 직접 현미주사(direct microinjection) 등과 같은 여러 가지 적절한 방법들 중의 한 방법에 의해 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
상기 숙주세포는 원핵 세포이거나 진핵 세포일 수 있다. 바람직한 것은 진핵세포, 예를 들면 CHO 세포와 같은 포유동물 세포이며, 정확한 부위에서 정확한 폴딩(folding)또는 글리코실화를 포함하는 단백질 분자들에 대한 단백질 생성 후의 변형을 제공하는 세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 연쇄상 구균의 단백질 G의 Fab 접착 도메인이 3 내지 7번 반복되는 재조합 단백질을 골격으로 이용하여 항체 분자 단량체로부터 [항체 분자 단량체]2를 대량 생산할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 접착특이성 접착체의 반복사슬은 단량체간의 이량체의 생산을 현저히 증가시키데 이용할 수 있으며, 이를 암호화하는 유전자 컨스트럭트, 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터를 형질전환시킨 형질전환체는 항체분자 단량체간의 결합가교 다량체의 대량 생산을 위해 유용하게 사용될 수 있다.
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이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 연쇄상 구균의 단백질 G의 Fab 접착 도메인의 반복사슬 컨스트럭트의 제조
본 발명자들은 단백질 G(protein G)의 도메인 Ⅲ(domain Ⅲ)를 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 받은 연쇄상구균(KCTC 3098)의 염색체 DNA(chromosomal DNA)로부터 P1[5'-GGGCATATGCATCACCATCACCATCACACCGGTACACCAGCCGTGACAA-3'(서열번호 1)]과 P2[5'-CCCGAATTCTTATCCGGACCCGCCTCCACCTTCAGTTACCGTAAA-3'(서열번호 2)] 프라이머(primer)를 이용하여 PCR을 통해 직접적으로 클로닝하였다. 상기 PCR 산물(243 bp)을 NdeI과 EcoRI으로 자른 후, 상기와 같은 효소로 자른 pCW1의 벡터 부분에 클로닝하였다. 그런 다음, 상기 도메인 Ⅲ의 암호화 서열을 디데옥시 DNA 서열화에 의해 확인하였다. 각 도메인 Ⅲ 사이 G4S 링커는 스페이서(spacer)로 첨가하였다. 상기 결과물인 플라스미드(plasmid) pTR1을 다시 NdeI과 BspEI로 잘랐다. 그런 다음, 도메인 Ⅲ 및 하나의 G4S를 암호화하는 225 bp 단편을, NdeI과 AgeI으로 자른 동일한 플라스미드의 큰 단편에 붙여 넣었다. 상기 결과물인 플라스미드인 pTR2를 NdeI과 AgeI로 자른 다음, 상기 잘려진 큰 단편을 226 bp 단편과 붙여, 이를 'pTR3'이라 하였다. 상기와 같은 클로닝 방법을 사용하여, 단백질 G의 도메인 Ⅲ를(pTR10) 10번까지 반복하여 제조하였다(표 1). 이전에 보고된 방법을 이용하여, H6-B3(L)를 암호화하는 pMC75H를 제조하였다(대한민국 등록특허 10-0566091 참조).
표 1 본 발명에서 사용된 플라스미드 및 단백질
플라스미드 단백질 명칭 참고문헌
pCW1 B3(Fd)-ext-PE38:Fd-SKPSIST-KASG4C(G4S)2GGPE-PE38a J.H. Park, et al., Mol Cells 12 (2001) 398-402
pMC75H H6-B3(L): (His)6 b-경쇄(Light chain) 본 명세서
pTR1~10 TR1~10: (His)6-(D-G4S)n, n=1~10c 본 명세서
aSKPSIST: 야생형 경첩서열(hinge sequence)의 변형된 서열(CKPCICT);
ext, KASG4C(G4S)2: 시스테인 잔기(Cys residue)를 갖는 연장 펩티드 사슬;
G4: GGGG의 아미노산 서열;
PE38: 38 kD의 절단된 슈도모나스 외독소(truncated Pseudomonas Exotoxin);
b(His)6: 6개의 히스티딘 태그(Histidine tag); 및
cDⅢ: 연쇄상 구균(Streptococcal) 단백질 G의 도메인 Ⅲ.
이전에 보고된 방법을 이용하여, 상기 반복사슬 컨스트럭트를 과발현시켰다(J.H. Park, et al., Mol Cells 12 (2001) 398-402).
순수한 용해물을 킬레이팅 세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피(chelating sepharose fast flow chromatography)(Amersham Bioscience, Sweden)로 분리한 후, Hiload Superdex-75 pg 또는 Hiload Superdex-200 pg(26/60)(Amersham Bioscience, Sweden)을 사용하여 크기배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)로 분리하였다. 모든 컨스트럭트는 순도 95% 이상이 되도록 정제하였다(도 2의 A).
<실시예 2> B3(Fab)-ext-PE38 및 [B3(Fab)-ext-PE38] 2 의 제조
본 발명자들은 B3(Fd)-ext-PE38 및 H6-B3(L)의 봉입체(inclusion body)의 과발현, 제조 및 재접힘(refolding)은 이전에 보고된 방법과 같이 수행하였다(J.H. Park, et al., Mol Cells 12 (2001) 398-402). 상기 재접힘된 단백질들을 Q-세파로스 FF(Q-sepharose FF), Hitrap 단백질 G HP(Hitrap protein G HP), 및 Hiload Superdex-200 pg(26/60)(Amersham Bioscience, Sweden) 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.
구체적으로, B3(Fab)-ext-PE38는 B3(Fd)-ext-PE38 및 H6-B3(L) 사이 내부사슬 이황화 결합에 의해 제조하였다. 내부사슬 이황화 결합에 관련된 두 개의 시스테인 잔기는 B3(Fd)-ext-PE38의 CH1 도메인 및 H6-B3(L)의 CL 도메인에 위치하였다. 또한, [B3(Fab)-ext-PE38]2는 재접힘 과정 동안 B3(Fab)-ext-PE38내 ext에 위치하는 2개의 시스테인 잔기 사이 내부사슬 이황화 결합에 의해 제조하였다. 크기 배제 크로마토그래피 후, B3(Fab)-ext-PE38 및 [B3(Fab)-ext-PE38]2의 정제는 비환원의 SDS-폴리아크릴아마이드 겔의 밀도분석을 이용하여 95% 이상으로 결정하였다(도 2의 B). [B3(Fab)-ext-PE38]2의 재접힘 수득률은 약 0.06%로 나타났다.
<실시예 3> 단백질 G의 반복사슬 컨스트럭트 및 B3(Fab)-ext-PE38의 접착
본 발명자들은 정제된 단백질 G의 반복사슬 컨스트럭트와 B3(Fab)-ext-PE38 사이 접착 반응을 유도하기 위해, B3(Fab)-ext-PE38(715 ㎍)와 TR 단백질(각 28 ㎍)을 혼합하여 4℃에서 밤새 배양한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 크기배제 크로마토그래피(Superdex-200TM HR)로 분리하였다. 용출된 단백질 복합체를 B3(Fab)-ext-PE38 단독(Kav=0.33) 또는 [B3(Fab)-ext-PE38]2 단독(Kav=0.20)을 대조군으로 사용하여 비교하였다. 용출된 단백질 피크의 Kav 값을 [수학식 1]을 사용하여 계산하였다.
수학식 1
Figure PCTKR2009007510-appb-M000001
여기서, Ve는 피크의 용출 부피(elution volume)이고, Vo는 컬럼의 빈공간 부피(void volume)이며, 이는 블루 덱스트란 2000(blue dextran 2000)의 용출 부피이며; Vt는 Superdex-200 컬럼의 층 부피(bed volume)이다.
TR3에 접착된 B3(Fab)-ext-PE38(Kav=0.22)가 [B3(Fab)-ext-PE38]2의 용리 부피에 근접하였다. 또한, TR2를 제외한 모든 복합체들은 동시에 적어도 둘 이상의 B3(Fab)-ext-PE38 분자들에 접착하였다. TR3로부터 TR6까지의 복합체들은 이량체로 나타났으며, TR7~10 복합체는 삼량체로 나타났다.
<실시예 4> 단백질 G의 반복사슬 재조합 단백질과 B3(Fab)-ext-PE38들이 접착된 복합체로부터 [B3(Fab)-ext-PE38] 2 의 제조
본 발명자들은 상기 정제된 TR1 ~ 10 단백질 및 이에 접착된 B3(Fab)-ext-PE38들을 이용하여 [B3(Fab)-ext-PE38]2를 생산하기 위해, 글루타치온 산화 형태(glutathione oxidized form, GSSG)로 산화시킨 후 고정된 분자를 비환원(도 2A) 및 환원(도 2B) SDS-PAGE에 의해 분리하였다.
구체적으로, 단백질 복합체를 금속 킬레이팅 세파로스 비드(metal chelating sepharose bead)에 10℃에서 1시간 동안 고정시켰다. 10 μl의 금속 킬레이팅 세파로스 비드[100 mM TrisHCl (pH8.2)에 50% 현탁]를 각각의 반응 혼합물에 첨가한 후, 고정된 단백질 복합체를 실온에서 40 mM의 2-멀캅토에탄올(Merchaptoethanol)을 첨가한 100 mM TrisHCl(pH8.2)을 첨가하여 환원하였다. B3(Fab)-ext-PE38의 시스테인 잔기를 환원시키는데 필요한 2-멀캅토에탄올의 농도를 결정하기 위해 수행한 예비실험에서, B3(Fab)-ext-PE38의 시스테인 잔기의 완전한 환원은 20 ~ 40 mM의 2-멀캅토에탄올의 첨가에 의해 이루어졌다. 그런 다음, 환원된 단백질 복합체를 100 mM MOPS(pH6.5)가 포함된 세척 완충용액으로 1회 세척한 후, 100 mM TrisHCl(pH8.2)로 3회 더 세척하였다. 상기 세척 단계 후, 단백질 복합체를 5 mM GSSG 및 100 mM TrisHCl(pH8.2)가 포함된 산화 완충용액을 첨가하여 산화 반응시킨 다음, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 상기 산화 반응 후, 2X SDS 시료 완충용액을 첨가한 다음, SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 분석한 후, 농도계측기를 이용하여 밀도분석을 통해 [B3(Fab)-ext-PE38]2의 수득율을 분석하였다. 또한, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에서, [B3(Fab)-ext-PE38]2의 밴드의 강도를 [B3(Fab)-ext-PE38]2 및 B3(Fab)-ext-PE38의 강도의 합인 총 밴드 강도로 나눈 값을 이용하여 [B3(Fab)-ext-PE38]2의 수득율을 산출하였다(표 2). B3(Fab)-ext-PE38 단독 및 TR1에 접착된 B3(Fab)-ext-PE38를 음성 대조군으로 사용하였다.
표 2 [B3(Fab)-ext-PE38] 2 의 수득율
항체-독소 수득률 (%)
B3(Fab)-ext-PE38 검출되지 않음
B3(Fab)-ext-PE38: TR1 검출되지 않음
B3(Fab)-ext-PE38: TR2 검출되지 않음
B3(Fab)-ext-PE38: TR3 47% ± 0.25
B3(Fab)-ext-PE38: TR4 44% ± 0.19
B3(Fab)-ext-PE38: TR5 48% ± 0.12
B3(Fab)-ext-PE38: TR6 36% ± 0.02
B3(Fab)-ext-PE38: TR7 52% ± 0.11
그 결과, [B3(Fab)-ext-PE38]2는 B3(Fab)-ext-PE38 단독, TR1, 및 TR2 복합체의 3개의 시료에서 검출되지 않았다. TR3 ~ TR7 복합체의 상호작용은 이황화 접착된 이량체의 상당한 생산을 나타내었다. TR3 ~ TR7 복합체의 시료에서 [B3(Fab)-ext-PE38]2의 수득률은 각각 47%, 44%, 48%, 36% 및 52%를 나타내었다. [B3(Fab)-ext-PE38]2의 생산은 산화제 첨가 후 2시간 내에 이루어졌으며, 추가적인 배양에 대해 유의적인 증가가 나타나지 않았다. 이는 TR 단백질에 접착되는 B3(Fab)-ext-PE38 분자의 ext내 시스테인 잔기는 반복사슬을 통해 가까히 근접하여 함께 접착되었음을 알 수 있었다. [B3(Fab)-ext-PE38]2에 상응하는 밴드가 비환원성 겔에서 엷은 밴드를 나타내었다. 상기 엷은 밴드는 B3(Fd)-ext-PE38가 환원성 겔에서 유의적인 분해가 일어나지 않아서 B3(Fd)-ext-PE38 및 H6-B3(L) 사이 이황화 결합이 완벽하게 형성되지 않은 [B3(Fab)-ext-PE38]2의 또 다른 형태임을 알 수 있었다. 이는 기존에 보고된 정제된 항체의 환원성 절단의 관찰에 의해 알 수 있는 것이었다(T. Brody, et al., Anal Biochem 247 (1997) 247-256).
본 발명은 결합가교 다량체를 생산하는 방법으로 단량체와 친화도를 통해 특이적으로 접착하는 접착체의 반복사슬을 이용함으로서 반복사슬-다수단량체 복합체의 형성을 촉진시킬수 있으며 나아가 생성된 반복사슬-다수단량체 복합체를 결합 가교 다량체의 형태로 제작할 수 있다는 것이다. 이는 기존의 결합가교 다량체 생산방법에 비교해 현저하게 높은 생산율을 야기하여 결합 가교 이량체를 대량 생산할 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용할 수 있다.
단량체는 여러 종류의 물질로부터 만들 수 있으며 그에 대한 예로서는 리간드, 또는 그 리간드의 접착성을 갖는 일부 조각, 예를 들어 TGF alpha, TGF beta, IL2, IL6, TNF, GMSCF 등등, 또한 각종 리간드 수용체 또는 그 수용체의 접착성을 갖는 일부 조각, 예를 들어 TBP1, TBP2, IFN alpha 또는 beta 수용체, 고나도트로핀 수용체 등의 각종 수용체 등이 단량체를 만드는데 이용될 수 있다 (Nienhaus, G. Ulrich. Protein-ligand interactions : methods and applications. Humana Press , 2005). 약물전구체변환, 물질검출, 물질분해, 물질생성 등의 작용을 하는 각종 효소, 세포살상효과를 갖는 독소작용기 등을 포함하는 단백질, 유전자치료를 위한 바이러스 등의 생체, DNA 전달을 위한 양이온꼬리체 화합물, 약물작용을 위한 약물화합물 등의 화합물, 약물전달을 위해 만든 화공학적 산물인 라이포좀(liposome), 표적분자의 실시간 검출을 위한 바이오쎈서, 또는 프로드러그 등과 같은 작용기(F, functional group)등이 단량체를 만드는데 이용될 수 있다. [참조: (Farah, R. A., et al., Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 8, 321-356, 1998)(Trail, P. A., et al., Science 261, 212-215, 1993)(Hinman, L. M., et al., Cancer Res. 53, 3336-3342, 1993)(Pastan, I. Biochim. Biophys. Acta 1333, C1-C6, 1997)(Kreitman, P. J., et al., J. Clin. Oncol. 18, 1622-1636, 2000)(Zalutsky, M. R. & Vaidyanathan, G. Curr. Pharm. Des. 6, 1433-1455, 2000)(Goldenberg, D. M. in Clinical Uses of Antibodies (eds Baum, R. P., et al.)1-13(Kluwer academic, The Netherlands, 1991))(Lode, H. N. & Reisfeld, R. A. Immunol. Res. 21, 279-288, 2000)(Penichet, M. L. & Morrison, S. L. J. Immmunol. Methods 248, 91-101, 2001)(Lasic, D.D. & Papahadjopoulos, D. Science 267, 1275-1276, 1995)(Park. J. W., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 92, 1327-1331, 1995)(Niculescu-Davaz, I., et al., Anticancer Drug Des. 14, 517-538,1999)(SToldt, H. S., et al., Eur. J. Cancer 33, 186-192, 1997)].
상기한 바와 같이 자연계에는 리간드와 수용체, 항체와 항원, 및 동종이량체(homodimer) 또는 이종이량체(heterodimer), 나아가 다량체(multimer)를 형성하는 단백질 등 알려진 접착 친화관계를 갖는 물질들의 종류가 매우 다양하다. 이러한 경우들에 대한 상호 접착 친화성을 갖는 물질들을 각각 단량체와 접착체로서 이용하여 본 출원의 방법에 의해 단량체로부터 결합가교 다량체를 대량 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제작된 접착 특이성 반복사슬은 반복사슬-다수단량체 복합체를 형성하는 특성이 있으므로 이 반복사슬을 수지(resin)에 고정화시킴으로서 상기한 바이오산업 및 의료산업 분야의 유용 단백질 분자의 순수 분리 정제를 위한 고효율의 친화도순수분리(affinity purification)가 가능할 것이다(Zachariou M., Affinity Chromatography: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Humana Press; 2nd edition).

Claims (8)

1) 단량체에 특이적으로 접착하는 접착체의 반복사슬을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 반복사슬 및 단량체를 혼합하여, 상기 반복사슬과 단량체의 반복사슬-다수 단량체 복합체를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 반복사슬-다수단량체 복합체내의 단량체들간의 결합 가교를 형성한 다량체를 분리하는 단계를 포함하는, 결합 가교를 이용한 다량체의 생산 방법.
제 1항에 있어서, 단량체에 접착특이성이 있는 접착체가 반복되어 연결되어 있는 반복사슬 과 여러 개의 단량체가 접착하여 형성된 단량체들 사이에 결합 가교가 형성되어 이루어진 다량체를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 단량체가 단백질인 경우, 그 단량체에 접착특이성이 있는 접착단백질이 반복되어 연결되어 있는 반복사슬 재조합 단백질과 단량체와 혼합하여, 상기 반복사슬과 여러 개의 단량체가 접착하여 형성된 반복사슬-다수단량체 복합체내의 단량체들 사이에 결합 가교가 형성되어 이루어진 다량체를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반복사슬은 단백질 G(protein G)의 Fab 접착 도메인인 도메인 Ⅲ가 반복되어 연결되어 있는 도메인 Ⅲ의 반복사슬 재조합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 단량체는 항체, 리간드, 수용체 또는 그들의 조각, 또는 그들의 재조합체, 또는 그들의 유도체, 또는 그들과 생물화학 작용기의 융합체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 단량체는 Fab 단편 또는 Fab 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 생물화학 작용기는 효소, 독소작용기 단백질, 바이러스 등의 생체, 화합물, 약물작용을 위한 약물화합물, 라이포좀, 바이오센서, 프로드러그와 같은 작용기(functional group)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 다량체는 이량체 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
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