WO2011071118A1 - ニトロビンを含む多能性幹細胞の心筋細胞への分化促進剤 - Google Patents

ニトロビンを含む多能性幹細胞の心筋細胞への分化促進剤 Download PDF

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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Definitions

  • the present invention relates to an agent for promoting differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes, a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes, and a method for producing cardiomyocytes from pluripotent stem cells.
  • the method of inducing differentiation of pluripotent stem cells into desired cells is an essential technique for realizing regenerative medicine. Further, differentiation-induced cells obtained by such a method are expected to be useful not only for regenerative medicine but also for in vitro drug efficacy evaluation tests and drug safety tests. Since heart disease is currently the second leading cause of death in Japanese people, it is particularly important to establish a method for inducing differentiation into cardiomyocytes that can be used for regenerative medicine to treat heart disease and for evaluating the efficacy of heart disease. Expectation is put. In addition, since there are many drugs that cause serious side effects such as heart failure and arrhythmia on the heart, there is a need for a uniform supply of cardiomyocytes that can be used in cardiotoxicity tests.
  • Non-patent Document 1 a method of co-culturing END2 cells, which are mouse-derived support cells, and human ES cells has been reported (Non-patent Document 1).
  • END2 cells which are mouse-derived support cells
  • human ES cells has been reported (Non-patent Document 1).
  • its differentiation efficiency is not sufficient, and since mouse-derived END2 cells are easily mixed into human cardiomyocytes, there is a problem that it is difficult to obtain pure human cardiomyocytes.
  • cytokines fibroblast growth factor (bFGF), bone morphogenetic protein 4 (BMP4), vascular endothelial growth factor (VEGF), Dickkopf-
  • bFGF fibroblast growth factor
  • BMP4 bone morphogenetic protein 4
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • DKK1 vascular endothelial growth factor
  • DKK1 activin A
  • the present inventors examined the differentiation promoting effect from monkey ES cells to cardiomyocytes for 9600 kinds of library compounds. As a result, it was found that nitrobin, a low molecular weight compound known as a livestock antibiotic / growth promoter, exhibits a very high myocardial differentiation efficiency compared to known myocardial differentiation promoting factors, leading to the completion of the present invention. It was.
  • the present invention provides an agent for promoting differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes containing nitrobin.
  • the present invention also provides a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes, comprising culturing the pluripotent stem cells in a medium containing nitrobin.
  • the present invention also provides a method for producing cardiomyocytes from pluripotent stem cells, comprising culturing pluripotent stem cells in a medium containing nitrobin.
  • pluripotent stem cells can be induced to differentiate into cardiomyocytes without using feeder cells, and pure cardiomyocytes can be obtained.
  • the present invention makes it possible to produce cardiomyocytes by inducing differentiation into cardiomyocytes with high efficiency and low cost.
  • the present invention relates to mass production of homogeneous and mature human cardiomyocytes for use in high-throughput screening for QT prolongation tests important as drug safety tests, or for evaluation of drug efficacy against heart diseases, and transplanted cardiomyocytes for heart diseases etc. Is particularly useful in the production of
  • a screening screening method for a myocardial differentiation promoting substance Screening system and nitrobin detection.
  • GFP expression upon administration of nitrobin final concentrations 1, 5, 20 ⁇ M
  • the horizontal axis indicates the concentration of nitrobin.
  • the vertical axis of the left graph shows the amount of GFP fluorescence at the time of nitrobin administration when dimethyl sulfoxide (DMSO) administration (control) is 100%.
  • the vertical axis of the right graph shows the number of beating colonies per well.
  • GFP expression upon administration of nitrobin final concentration 5 ⁇ M in human ES cells.
  • nitrobin final concentration 5 ⁇ M
  • nitrobin final concentration 5 ⁇ M
  • cytokines bFGF, BMP4, VEGF, DKK1, activin A
  • expression of GFP upon administration of cytokine desame as above
  • nitrobin final concentration 5 ⁇ M
  • the vertical axis of the left graph shows the amount of GFP fluorescence when nitrobin and / or cytokine is administered when DMSO administration (control) is 100%.
  • the vertical axis of the right graph shows the number of beating colonies per well.
  • the vertical axis shows the expression level when nitrobin and / or cytokine is administered when DMSO administration (control) is 100%.
  • the present invention relates to an agent for promoting differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes, comprising nitrobin.
  • Nitrobin has the chemical formula It is a low molecular compound having (molecular formula: C14H12N6O6). Nitrobin is a known compound and can be produced by conventional organic synthesis methods. It can also be obtained from Kanto Chemical Co., Inc. (Tokyo, Japan).
  • pluripotency means pluripotency capable of differentiating into all cells constituting an adult and self-replication capable of maintaining the pluripotency even after cell division. It means a cell having an ability.
  • the “pluripotent stem cell” includes embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells), and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • the species of “pluripotent stem cells” is not particularly limited, but is preferably a mammal, more preferably a rodent or a primate.
  • the present invention is particularly suitable for monkey or human pluripotent stem cells.
  • ES cells are pluripotent stem cells derived from early embryos, and can be established from the inner cell mass of blastocysts or epiblasts of early embryos after implantation.
  • ES cells include humans (Thomson J. A. et al., Science 282: 1145-1147 (1998); primates such as rhesus monkeys and marmosets) (Thomson J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848 (1995); Thomson J. A. et al., Biol. Reprod. 55: 254-259 (1996)); rabbit (special table 2000-508919); hamster (Doetshman T. et al., Dev. Biol.
  • EG cells are pluripotent stem cells derived from primordial germ cells, and examples include human EG cells (Shamblott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 7844-7848 (1995)).
  • iPS cells mean pluripotent stem cells derived from cells other than pluripotent stem cells such as somatic cells and tissue stem cells.
  • pluripotent stem cells such as somatic cells and tissue stem cells.
  • iPS cells are included in the “iPS cells” of the present invention as long as they are artificially derived from cells other than pluripotent stem cells.
  • iPS cells have genetic information derived from somatic cells, for example. Therefore, cardiomyocytes differentiated from patient-derived iPS cells with the differentiation inducer of the present invention are useful not only for regenerative medicine, but also for studying the effectiveness and side effects of drugs for individual patients.
  • cardiomyocytes differentiated from iPS cells derived from heart disease patients are expected to have genetic information unique to patients with heart diseases, and are also used for screening drugs for heart diseases caused by gene abnormalities. Preferably used.
  • the differentiation promoting agent of the present invention is added to the myocardial differentiation medium of pluripotent stem cells so that the final concentration of nitrobin is 1 to 5 ⁇ M, for example.
  • the myocardial differentiation medium is not particularly limited as long as it is a composition generally used for myocardial differentiation of pluripotent stem cells.
  • myocardial differentiation medium based on IMDM medium used in the examples of the present application.
  • DMEM-based myocardial differentiation medium (DMEM / F12 medium (Sigma) 200 ml, fetal bovine serum (GIBCO) 50 ml, MEM non-essential amino acid solution (Sigma) 2.5 ml, penicillin-streptomycin (GIBCO) 2.5 ml, 200 mM L-glutamine 2.5 ml, 2-mercaptoethanol 2 ⁇ l, or StemPro-34SFM (GIBCO) + BMP4 (10 ng / ml) medium is exemplified. In this case, it is not necessary to use feeder cells such as END2 cells, etc.
  • the timing of addition of the differentiation promoting agent of the present invention depends on the type of pluripotent stem cell used.
  • the culture is started 6 to 6 after the start of the culture in the myocardial differentiation medium. It may be added on day 14.
  • the agent for promoting differentiation of the present invention may be used together with other substances having a myocardial differentiation promoting action, for example, cytokines such as bFGF, BMP4, VEGF, DKK1, and activin A.
  • cytokines such as bFGF, BMP4, VEGF, DKK1, and activin A.
  • the addition amount of other substances and the timing of addition may be appropriately determined.
  • the cardiomyocyte differentiation induction method and cardiomyocyte production method of the present invention are characterized by culturing pluripotent stem cells in a medium containing nitrobin.
  • the method of the present invention comprises culturing pluripotent stem cells in a myocardial differentiation medium, and adding nitrobin to a final concentration of 1 to 5 ⁇ M 6 to 14 days after the start of culture in the myocardial differentiation medium. And by confirming differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes on day 18 of culture.
  • what is necessary is just to determine suitably the optimal time according to the cell to be used for the time of nitrobin addition and the differentiation confirmation to a cardiac muscle cell.
  • cytokines such as bFGF, BMP4, VEGF, DKK1, and activin A
  • nitrobin cytokines
  • action a substance which has another myocardial differentiation promotion effect
  • action a substance which has another myocardial differentiation promotion effect
  • action a substance which has another myocardial differentiation promotion effect
  • action a substance which has another myocardial differentiation promotion effect
  • action a substance which has another myocardial differentiation promotion effect
  • the culture may be performed under normal animal cell culture conditions, for example, but not limited to, in an atmosphere of a temperature of 37 ° C., a humidity of 100%, and a carbon dioxide concentration of 5%.
  • Differentiation into cardiomyocytes can be confirmed by, for example, the number of beating cardiomyocytes and the expression level of the ⁇ -MHC gene, which is a myocardial differentiation marker.
  • the cardiomyocytes obtained by the method of the present invention can be used for in vitro drug safety tests or as transplanted cardiomyocytes for heart diseases and the like.
  • FIG. 1 Screening for Substances that Promote Myocardial Differentiation of Monkey ES Cells
  • GFP green fluorescent protein
  • nitrobin On the sixth day of culture, nitrobin was added so that the final concentrations were 1 ⁇ M, 5 ⁇ M, and 20 ⁇ M. On the 18th day of culture, the amount of GFP fluorescence and the number of heartbeat beating colonies were measured. By administration of nitrobin, the GFP fluorescence amount increased by about 5 times and the number of myocardial beating colonies increased by about 10 times (FIGS. 3-1, 3-2). A final concentration of 5 ⁇ M was most effective.
  • GFP green fluorescent protein
  • Nitrobin promotes myocardial differentiation in human ES cells
  • a vector expressing green fluorescent protein (GFP) was introduced into a human ES cell line (Kh-1 strain) in the same manner as Example 1 were used.
  • Human ES cells were seeded and cultured in 6-well plates (Asahi Glass / 5816-006: Ezview culture plate) at 1.2 ⁇ 10 6 cells / well. The same medium as in Example 1 was used.
  • nitrobin was added so that the final concentrations were 1 ⁇ M, 5 ⁇ M, and 20 ⁇ M.
  • the amount of GFP fluorescence was measured. As a result, an increase in the amount of GFP fluorescence was also observed in human ES cells by administration of nitrobin (FIGS. 4-1, 4-2).
  • cytokines bFGF, BMP4, VEGF, DKK1, Activin A
  • bFGF, BMP4, VEGF, DKK1, Activin A cytokines known as factors that promote myocardial differentiation and nitrobin
  • GFP fluorescence increase GFP fluorescence and increase myocardial beating colony count
  • the increase in the expression level of troponin T was compared.
  • cells in which a vector expressing green fluorescent protein (GFP) was introduced into monkey ES cells (cynomolgus monkey CMK6.4 strain) were used.
  • the same medium as in Example 1 was used.
  • Monkey ES cells were seeded in a 6-well plate, nitrobin (final concentration 5 ⁇ M) was cultured on days 6 to 14, and cytokine mixture (bFGF, BMP4, VEGF, DKK1, activin A) (final concentration) was cultured on days 1 to 14 5 ng / ml, 10 ng / ml, 10 ng / ml, 150 ng / ml, 3 ng / ml) were administered, and the amount of GFP fluorescence, the number of heartbeat beating colonies, and the expression level of troponin T were measured on the 18th day of culture.
  • bFGF, BMP4, VEGF, DKK1, activin A final concentration
  • the nitrobin alone administration group showed a higher effect than the cytokine mixture administration group (FIGS. 5-1 to 5-3). Further, when nitrobin and cytokine were used in combination, a synergistic effect was observed in the increase in the amount of GFP fluorescence and the increase in the expression level of troponin T (FIGS. 5-1, 5-3).

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Abstract

ニトロビンを含む多能性幹細胞の心筋細胞への分化促進剤、およびニトロビンを用いる多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導方法ならびに心筋細胞の製造方法を提供する。

Description

ニトロビンを含む多能性幹細胞の心筋細胞への分化促進剤
　本発明は、多能性幹細胞の心筋細胞への分化促進剤、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する方法、および多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法に関する。
　多能性幹細胞を所望の細胞へ分化誘導する方法は、再生医療の実現には必須の技術である。また、かかる方法で得られる分化誘導された細胞は再生医療のみならずインビトロでの薬効評価試験や薬剤安全性試験に有用であることが期待される。心疾患は現在日本人の死亡原因の第二位であることから、特に、心疾患を治療するための再生医療や心疾患の薬効評価に用いうる心筋細胞への分化誘導法の確立には大きな期待が寄せられている。また心臓に対して心不全や不整脈など重篤な副作用を引き起こす薬物が多いことからも、心毒性試験に用いることのできる均一な心筋細胞の供給が求められている。
　これまで、ヒトＥＳ細胞を心筋細胞へ分化させる手法として、マウス由来の支持細胞であるＥＮＤ２細胞とヒトＥＳ細胞を共培養する方法が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、その分化効率は十分ではなく、またマウス由来のＥＮＤ２細胞がヒト心筋細胞に混入しやすいため、純粋なヒト心筋細胞が得られにくいという問題がある。他の手法として、ＥＳ細胞から胚様体を形成し、そこに数種類のサイトカイン（維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、骨形態形成タンパク４（ＢＭＰ４）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、Dickkopf-1 （ＤＫＫ１）、アクチビンＡ））を添加し、心筋細胞への分化を誘導する方法も報告されている（非特許文献２、３）。しかしながら、この方法は大量のサイトカインを必要とするためコストがかかる上、その分化効率も十分ではない。
Mummery, C., et al., Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107(21),  2733-40 (2003). Yang, L., et al., Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453(7194),  524-8 (2008). Leschik, J., et al., Cardiac commitment of primate embryonic stem cells. Nat Protoc. 3(9),  1381-7 (2008).これらの文献は引用により本願に含まれる。
　本発明は高効率かつ低コストにて均一な心筋細胞を得る方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、９６００種類のライブラリー化合物について、サルＥＳ細胞から心筋細胞への分化促進効果を検討した。その結果、家畜用抗生物質・成長促進剤として知られる低分子化合物のニトロビンが、既知の心筋分化促進因子と比較して非常に高い心筋分化効率を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、ニトロビンを含む、多能性幹細胞の心筋細胞への分化促進剤を提供する。
　また、本発明は、ニトロビンを含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する方法を提供する。
　また、本発明は、ニトロビンを含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法を提供する。
　本発明により、支持細胞を使用することなく、多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導し、純粋な心筋細胞を得ることが可能となった。また、本発明により、高効率かつ低コストに心筋細胞への分化を誘導し、心筋細胞を製造することが可能となった。本発明は、薬剤安全性試験として重要なＱＴ延長試験をハイスループットスクリーニングで行うため、あるいは心疾患に対する薬効評価に用いる均一かつ成熟したヒト心筋細胞の大量生産や、心臓疾患などに対する移植用心筋細胞の生産に特に有用である。
心筋分化促進物質の探索スクリーニング方法。 スクリーニングシステムとニトロビンの検出。 サルＥＳ細胞におけるニトロビン（最終濃度１、５、２０μＭ）投与時のＧＦＰ発現。 サルＥＳ細胞におけるニトロビンによるＧＦＰ蛍光量および心筋拍動コロニー数の増加。横軸はニトロビンの濃度を示す。左グラフの縦軸はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）投与時（対照）を１００％とした場合のニトロビン投与時のＧＦＰ蛍光量を示す。右グラフの縦軸は１ウェルあたりの拍動コロニー数を示す。 ヒトＥＳ細胞におけるニトロビン（最終濃度５μＭ）投与時のＧＦＰ発現。 ヒトＥＳ細胞におけるニトロビン（最終濃度５μＭ）によるＧＦＰ蛍光量の増加。縦軸はＤＭＳＯ投与時（対照）を１００％とした場合のニトロビン投与時のＧＦＰ蛍光量を示す。 サルＥＳ細胞における、ニトロビン（最終濃度５μＭ）、サイトカイン（ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、アクチビンＡ）（最終濃度各５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ）、またはサイトカイン（同上）＋ニトロビン（最終濃度５μＭ）投与時のＧＦＰ発現。 サルＥＳ細胞におけるニトロビンによるＧＦＰ蛍光量および心筋拍動コロニー数の増加。左グラフの縦軸はＤＭＳＯ投与時（対照）を１００％とした場合のニトロビンおよび／またはサイトカイン投与時のＧＦＰ蛍光量を示す。右グラフの縦軸は１ウェルあたりの拍動コロニー数を示す。 サルＥＳ細胞におけるニトロビンによるＧＦＰおよびトロポニンＴの発現量の増加。縦軸はＤＭＳＯ投与時（対照）を１００％とした場合のニトロビンおよび／またはサイトカイン投与時の発現量を示す。
　本発明は、ニトロビンを含む、多能性幹細胞の心筋細胞への分化促進剤に関する。ニトロビンは、下記の化学式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 （分子式：Ｃ１４Ｈ１２Ｎ６Ｏ６）を有する低分子化合物である。ニトロビンは、公知化合物であり、常套的な有機合成方法により製造することができる。また、関東化学株式会社（日本国東京）などから入手可能である。
　本発明において「多能性幹細胞」とは、成体を構成する全ての細胞に分化することができる多分化能(pluripotency）と、細胞分裂を経てもその多分化能を維持することができる自己複製能を有する細胞を意味する。「多能性幹細胞」には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が含まれる。「多能性幹細胞」の生物種は特に限定はされないが、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは齧歯類または霊長類である。本発明は、サルまたはヒト多能性幹細胞に特に好適である。
　ＥＳ細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞であり、胚盤胞の内部細胞塊または着床後の初期胚のエピブラストから樹立することができる。ＥＳ細胞としては、ヒト（Thomson J. A. et al., Science 282: 1145-1147 (1998)；アカゲザルおよびマーモセット等の霊長類（Thomson J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848 (1995）；Thomson J. A. et al., Biol. Reprod. 55: 254-259 (1996)）；ウサギ（特表２０００－５０８９１９号）；ハムスター（Doetshman T. et al., Dev. Biol. 127: 224-227 (1988)）、ブタ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125128 (1990); Piedrahita J.A. et al., Theriogenology 34: 879-891 (1990); Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. 40: 51-56 (1990); Talbot N. C. et al., Cell. Dev. Biol. 29A: 546-554 (1993)）、ヒツジ（Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. Suppl. 43: 255-260 (1991)）、ウシ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125-128 (1990); Saito S. et al., Roux. Arch. Dev. Biol. 201: 134-141 (1992)）、ミンク（Sukoyan M. A. et al., Mol. Reorod. Dev. 33: 418-431 (1993)）などのＥＳ細胞が挙げられる（これらの文献は引用により本願に含まれる）。
　ＥＧ細胞は、始原生殖細胞に由来する多能性幹細胞であり、例えば、ヒトＥＧ細胞（Shamblott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 7844-7848 (1995))が挙げられる。
　本発明において「ｉＰＳ細胞」とは、体細胞や組織幹細胞などの多能性幹細胞以外の細胞から誘導された多能性幹細胞を意味する。ｉＰＳ細胞の作製方法は、例えば、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００８／１１８８２０、Cell Stem Cell 3(5): 568-574 (2008) 、Cell Stem Cell 4(5): 381-384 (2009)、Nature 454: 646-650 (2008) 、Cell 136(3) :411-419 (2009) 、Nature Biotechnology 26: 1269-1275 (2008) 、Cell Stem Cell 3: 475-479 (2008) 、Nature Cell Biology 11: 197-203 (2009) 、Cell 133(2): 250-264 (2008) に記載される（これらの文献は引用により本願に含まれる）。しかしながら、多能性幹細胞以外の細胞より人工的に誘導された多能性幹細胞であれば、いかなる方法で作製された細胞も本発明の「ｉＰＳ細胞」に含まれる。
　ｉＰＳ細胞は、例えば体細胞から作成される場合にはその体細胞由来の遺伝情報を有している。従って、本発明の分化誘導剤により患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞は、再生医療のみならず個別の患者に対する薬剤の有効性や副作用の検討等に有用である。また、心臓疾患患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞は心臓疾患を有する患者特有の遺伝情報を有していることが期待され、遺伝子異常に起因する心臓疾患に対する薬剤のスクリーニング等にも好適に用いられる。
　本発明の分化促進剤は、多能性幹細胞の心筋分化培地に、ニトロビンの最終濃度が例えば１～５μＭとなるよう添加される。心筋分化培地は、一般的に多能性幹細胞の心筋分化に使用される組成であればよく、特に限定はされないが、例えばＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地(本願実施例にて使用している組成のもの)、ＤＭＥＭを基本とした心筋分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Sigma）２００ｍｌ、ウシ胎児血清（GIBCO）５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution （Sigma）２．５ｍｌ、ペニシリン－ストレプトマイシン（GIBCO）２．５ｍｌ、２００ｍＭ　Ｌ－グルタミン２．５ｍｌ、２－メルカプトエタノール２μｌ、またはStemPro-34SFM（GIBCO）＋ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）のような培地が例示される。本発明の分化促進剤を使用する場合、ＥＮＤ２細胞のような支持細胞を使用する必要がない。本発明の分化促進剤の添加の時期は、使用する多能性幹細胞の種類や心筋分化培地の組成により適宜変更されうるが、例えばサルまたはヒトＥＳ細胞を実施例に記載のＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地で培養する場合、心筋分化培地での培養開始後６～１４日目に添加すればよい。本発明の分化促進剤は他の心筋分化促進作用を有する物質、例えばbＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１およびアクチビンＡなどのサイトカインと共に使用してもよい。他の心筋分化促進作用を有する物質を併用する場合、他の物質の添加量、添加の時期は適宜定めればよい。
　本発明の心筋細胞の分化誘導方法および心筋細胞の製造方法は、ニトロビンを含む培地中で多能性幹細胞を培養することを特徴とする。ある態様において、本発明の方法は、多能性幹細胞を心筋分化培地中で培養すること、心筋分化培地での培養開始後６～１４日目にニトロビンを最終濃度１～５μＭとなるよう添加すること、および培養１８日目に多能性幹細胞の心筋細胞への分化を確認することにより実施される。なお、ニトロビン添加並びに心筋細胞への分化確認の時期は、使用する細胞によって最適な時期を適宜定めればよい。
　本発明の方法においては、他の心筋分化促進作用を有する物質、例えばbＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１およびアクチビンＡなどのサイトカインをニトロビンと共に用いてもよい。他の心筋分化促進作用を有する物質の添加量、添加時期は適宜定めればよい。
　培養は通常の動物細胞の培養条件、例えばこれに限定されるわけではないが、温度３７℃、湿度１００％、炭酸ガス濃度５％の雰囲気中で行えばよい。
　心筋細胞への分化は、例えば、拍動心筋細胞の数、心筋分化マーカーであるα－ＭＨＣ遺伝子の発現量により確認することができる。
　本発明の方法により得られた心筋細胞は、インビトロにおける薬剤安全性試験に、あるいは心臓疾患などに対する移植用心筋細胞として、使用することができる。
サルＥＳ細胞の心筋分化を促進する物質の探索スクリーニング
　図１に示すように、サルＥＳ細胞の心筋分化を促進する物質の探索スクリーニングを実施した。サルＥＳ細胞株（カニクイザルＣＭＫ６．４株）に、心筋分化マーカーであるα－ＭＨＣ遺伝子のプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するベクターを導入し、９６ウェルプレート（Greiner/655090：96穴FIAブラックプレート）上に５．０×１０３細胞/ウェルにて播種し、ＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地（ＩＭＤＭ培地（Sigma l3390）２００ｍｌ、ウシ胎児血清（GIBCO 10099-141）５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution （Sigma M7145）２．５ｍｌ、ペニシリン－ストレプトマイシン（GIBCO 15140）２．５ｍｌ、２００ｍＭ　Ｌ－グルタミン　２．５ｍｌ、２－メルカプトエタノール（Sigma M7522）　２μｌ、５Ｎ　ＮａＯＨ　２５５μｌを混合したもの）で１４日間培養した。培養後６～１４日に、９６００種類のライブラリー化合物を、１ウェルあたり１化合物（約１～５μＭ）投与した。培養後１４日に、ＨＣＳ（high contents screening）システム（モレキュラーデバイス/MetaMorph イメージングシステム）を用いてＧＦＰ発現量を測定したところ、ニトロビンを投与したウェルのＧＦＰ蛍光値が高い値を示した（図２）。
サルＥＳ細胞におけるニトロビンの心筋分化促進効果
　実施例１と同じくサルＥＳ細胞（カニクイザルＣＭＫ６．４株）へ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するベクターを導入した細胞を用いた。サルＥＳ細胞を６ウェルプレート（旭硝子/ 5816-006 ：Ezview カルチャープレート）に４．０×１０５細胞/ウェルにて播種して培養した。培地は実施例１と同じものを用いた。培養６日目に、最終濃度が１μＭ、５μＭ、２０μＭとなるようにニトロビンを添加した。培養１８日目に、ＧＦＰ蛍光量と心筋拍動コロニー数とを測定した。ニトロビンの投与により、最大でＧＦＰ蛍光量は約５倍、心筋拍動コロニー数は約１０倍増加した（図３－１、３－２）。最終濃度５μＭが最も有効であった。
ヒトＥＳ細胞におけるニトロビンの心筋分化促進効果
　実施例１と同様にしてヒトＥＳ細胞株（Ｋｈ－1株）へ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するベクターを導入した細胞を用いた。ヒトＥＳ細胞を６ウェルプレート（旭硝子/ 5816-006 ：Ezview カルチャープレート）に１．２×１０６細胞/ウェルにて播種して培養した。培地は実施例１と同じものを用いた。培養６日目に、最終濃度が１μＭ、５μＭ、２０μＭとなるようにニトロビンを添加した。培養１８日目に、ＧＦＰ蛍光量を測定した。その結果、ヒトＥＳ細胞においても、ニトロビンの投与によりＧＦＰ蛍光量の増加が観察された（図４－１、４－２）。
ニトロビンとサイトカインとの比較
　心筋分化を促進する因子として知られているサイトカイン（bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、アクチビンＡ）とニトロビンとを用いて、ＧＦＰ蛍光量の増加、心筋拍動コロニー数の増加、心筋マーカー分子であるトロポニンＴの発現量増加を比較した。
　実施例１と同じくサルＥＳ細胞（カニクイザルＣＭＫ６．４株）へ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するベクターを導入した細胞を用いた。培地は実施例１と同じものを用いた。６ウェルプレートにサルＥＳ細胞を播種し、培養６～１４日目にニトロビン（最終濃度５μＭ）を、培養１～１４日目にサイトカイン混合物（bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、アクチビンＡ）（最終濃度各５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ）を投与し、培養１８日目にＧＦＰ蛍光量、心筋拍動コロニー数、トロポニンＴ発現量を測定した。ＧＦＰ蛍光量、心筋拍動コロニー数、トロポニンＴ発現量のいずれについても、ニトロビン単独投与群はサイトカイン混合物投与群よりも高い効果を示した（図５－１～５－３）。また、ニトロビンとサイトカインを併用することで、ＧＦＰ蛍光量の増加とトロポニンＴ発現量の増加に相乗効果が見られた（図５－１、５－３）。

Claims (7)

  1. 　ニトロビンを含む、多能性幹細胞の心筋細胞への分化促進剤。
  2. 　多能性幹細胞が哺乳類の細胞である、請求項１の分化促進剤。
  3. 　多能性幹細胞が霊長類の細胞である、請求項２の分化促進剤。
  4. 　多能性幹細胞がヒト由来の細胞である、請求項３の分化促進剤。
  5. 　ニトロビンを含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する方法。
  6. 　ニトロビンを含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法。
  7. 　請求項６の方法で製造された心筋細胞。
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