WO2011056021A2 - 벤조헤테로사이클 유도체의 암 예방 및 치료 또는 암 전이 억제를 위한 용도 - Google Patents

벤조헤테로사이클 유도체의 암 예방 및 치료 또는 암 전이 억제를 위한 용도 Download PDF

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    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics

Definitions

  • the present invention relates to a novel use of benzoheterocycle derivatives, and more particularly, to a composition for preventing and treating cancer or inhibiting cancer metastasis comprising bezoheterocycle derivatives or pharmaceutically acceptable salts thereof as an active ingredient. It is about.
  • Cancer is the product of abnormal, uncontrolled and disordered cell proliferation. In particular, if there is destructive growth, permeability and metastasis, it is classified as malignant. Permeability is the property of infiltrating or destroying surrounding tissue, which generally means that the tumor is spread locally by destroying the basal layer that forms the boundary of the tissue and often enters the circulatory system of the body. Metastasis usually refers to the spread of tumor cells by lymphotic or blood vessels away from their original location. Metastasis also refers to the movement of tumor cells by elongation directly through serous body cavity or other spaces.
  • cancer is treated mainly through three therapies: one or a combination of surgical, radiation and chemotherapy.
  • Surgery involves removing most of the diseased tissue. Such surgery is effective in removing tumors located in certain areas, such as breasts, colons, and skin, but can be used to treat tumors in some areas, such as the spine, or to treat diffuse tumor diseases, such as leukemia. none.
  • Chemotherapy disrupts cell replication or cell metabolism, and is often used to treat cancers of the breast, lungs, and testes.
  • the side effects of systemic chemotherapy used to treat tumor diseases have been found in patients treated with cancer. It is the most trouble to me. These side effects Nausea and vomiting are the most common and serious side effects.
  • Chemotherapy side effects have a major impact on the patient's life and can dramatically change the patient's qualities for treatment.
  • side effects associated with chemotherapeutic agents generally include Dose Limiting Toxicity (DLT), which should be noted when administering such drugs.
  • DLT Dose Limiting Toxicity
  • mucositis is dose limiting toxic to various anticancer agents such as 5-fluorouracil, mesotrexate and anti-tumor antibiotics (eg doxorubicin), which are anti-metabolizer cytotoxins.
  • various anticancer agents such as 5-fluorouracil, mesotrexate and anti-tumor antibiotics (eg doxorubicin), which are anti-metabolizer cytotoxins.
  • doxorubicin anti-tumor antibiotics
  • Many of these chemotherapy-derived side effects may require hospitalization or painkillers to treat pain.
  • side effects caused by chemotherapeutic agents and radiation therapy are becoming major problems in the clinical treatment of cancer patients.
  • 67 kDa laminin receptor is a non-integrin-type receptor embedded in the plasma membrane and is associated with cancer invasion (invasion) and metastasis (Nelson, J. et al. The 67 kDa laminin receptor: structure, function and role in disease.Biosci.Rep. 28, 33-48 (2008)).
  • 67LR is produced by the dimerization of their 37kDa precursor (37LRP), and the molecular details of this change process are not well known.
  • 37 LRP is identical to the ribosomal subunit p40 involved in polysome formation (Auth, D. & Brawerman, G.
  • 67LR is often observed at high concentrations in various types of cancer (Nelson, J. et al. The 67 kDa laminin receptor: structure, function and role in disease.Biosci. Rep. 28, 33-48 (2008); Menard, S ., Castronovo, V., Tagliabue, E. & Sobel, ME New insights into the metastasis one associated 67 kD laminin receptor.J. Cell.Biochem. 67, 155-165 (1997)). However, neither the modulator nor the molecular mechanism of the 67LR's intracellular presence has yet been elucidated.
  • KRS belongs to aminoacyl-t-RNA synthetases (ARSs) that conjugate cognate amino acids and tRNAs for protein synthesis. These primitive enzymes have pleiotropic features in addition to catalytic activity (Park, SG, Ewalt. KL & Kim, S. Functional expansion of aminoacyl-tRNA synthetases and their interacting factors: new perspectives on housekeepers. Trends Biochem. Sci. 30, 569-574 (2005)). In contrast, some mammalian ARSs, including KRS, are involved in various To regulate the activity, Ray, PS, Arif, A. & Fox, P. Macromolecular com lexes as depots for releasable regulatory proteins.Trends Biochem.
  • ARSs aminoacyl-t-RNA synthetases
  • KRS identified 37LRP / p40 as one of the proteins capable of binding to this protein and stabilized the laminin receptor (67LR) in the plasma membrane formed by the integration of 37LRP.
  • 67LR laminin receptor
  • the present invention provides a benzoheterocycle derivative. Or it provides a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer comprising a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis comprising a benzoheterocycle derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a use of the benzoheterocycle derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the production of cancer prevention and treatment.
  • the present invention provides a use for the preparation of a cancer metastasis inhibitor of the benzoheterocycle derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention is a method for preventing and treating cancer, characterized in that the benzoheterocycle derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered to an individual in need thereof.
  • the present invention provides a method for inhibiting cancer metastasis, comprising administering an effective amount of a benzoheterocycle derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof to an individual in need thereof. to provide.
  • KRS affects cancer metastasis or cancer cell migration through laminin receptor (67LR) of plasma membrane.
  • 67LR laminin receptor
  • a substance that inhibits the interaction between KRS and 67LR can be used for the purpose of preventing and treating cancer by inhibiting metastasis of cancer. Selected.
  • KRS KRS protein or KRS polypeptide
  • KRS polypeptide ' refers to a polypeptide known as a lysyl tRNA synthetase.
  • the KRS polypeptide may be a KRS polypeptide known in the art, but preferably Genbank Accessi on No. It may be a polypeptide having an amino acid sequence shown in NP_005539.
  • the KRS of the present invention is Includes functional equivalents.
  • the functional equivalent refers to Genbank Accession No.
  • NP_005539 refers to a polypeptide that exhibits substantially homogeneous physiological activity with a polypeptide having the amino acid sequence indicated.
  • substantially homogeneous physiological activity means interacting with laminin receptors of the plasma membrane and regulating cancer metastasis or cancer cell migration.
  • the laminin receptor or "67 kDa laminin receptor (67LR)" is a non-integrin-type receptor embedded in the plasma membrane, for example, Genbank Accession No. NM_002295, S37431, AF284768. , S37431, AF284768, J03799, XP # 370865, XP_001083023. Also, in the present invention, the laminin receptor includes a functional equivalent thereof.
  • Inhibition of the interaction of KRS and 67LR in the present invention may use a method for detecting protein-protein interactions known in the art, for example, in vitro protein-protein binding assays (in vitro). Pull-down assays), electro electrophoretic mobility shift assays (SAs), immunoassays for protein binding, functional assays (eg, phosphorylation assays), non-immunoprecipitation assays, immunoprecipitation Western BL3 ⁇ 4 assays, immunity Immuno-co-localization, cross-linking, affinity chromatography, immunoprecipitation (IP), yeast two-hybrid , Y2H), fluorescence resonance energy transfer (FRET), bimolecular fluorescence complementation (Bi-FC), and the like, can be performed by various methods known in the art.
  • IP immunoprecipitation
  • yeast two-hybrid yeast two-hybrid , Y2H
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • Bi-FC bimol
  • Methods of screening for compounds of the invention include, for example, transactivation of the DNA-binding domains of the bacterial refresher LexA or yeast GAL4 and the homo GAL4 protein.
  • Yeast-2 hybrid assays can be performed using yeast expressing KRS and 67LR, or some or homologues of these proteins, each fused to a (transact ivato) domain (KIM, MJ et al. , Nat. Gent., 34: 330-336, 2003).
  • KIM MJ et al. , Nat. Gent., 34: 330-336, 2003.
  • the interaction of KRS with 67LR allows the reactivation of transactivators to induce the expression of reporter genes under the control of a promoter having a regulatory sequence bound to the LexA protein or DNA-binding domain of GAL4.
  • the reporter gene may be a gene encoding any detectable pullipeptides known in the art as described above (eg, CAKchloraniphenicol acetyltransferase), luciferase, beta-galactosidase, beta-glucosidase. Alkaline phosphatase and GFP (green fluorescent protein) may be used. If the interaction of KRS with 67LR or some or homologues of these proteins is facilitated or enhanced by the test agent, the expression of the reporter gene is further increased compared to normal conditions. Conversely, when the interaction is inhibited or weakened by the test agent, the reporter gene is not expressed or is less expressed than normal conditions.
  • any detectable pullipeptides known in the art as described above (eg, CAKchloraniphenicol acetyltransferase), luciferase, beta-galactosidase, beta-glucosidase. Alkaline phosphatase and GFP (green fluorescent protein) may
  • the reporter gene may be selected to encode a protein that enables the growth of the yeast (that is, the growth of the yeast is inhibited when the reporter gene is not expressed).
  • it may be an axoxotropic gene (e.g., a yeast gene such as ADE3, HIS3 or the like, or an equivalent gene from another species) that encodes an appeal related to the biosynthesis process for amino acids or nitrogen bases. If the interaction of AIMP2 and P53, or some or homologs of these proteins, expressed in this system is inhibited or attenuated by the test agent, the reporter gene is not expressed or is less expressed. Thus, under the above conditions, the growth of yeast is stopped or slowed down. The effect of expression of these reporter genes can be observed with the naked eye or through a device (eg microscope).
  • the present invention provides a banjo heterocycle derivative represented by the following general formula (1) or It provides a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer comprising the pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • A is selected from the group consisting of 0, NH and S;
  • X is C or N
  • 3 ⁇ 4 is hydrogen, unsubstituted or substituted by halogen alkyl, alkoxy, halogen, nit
  • 3 ⁇ 4 is hydrogen or unsubstituted or substituted by halogen
  • 3 ⁇ 4 is unsubstituted or substituted by halogen aryl or unsubstituted or substituted by halogen;
  • alkyl is a straight chain or containing from about 1 to about 20 carbon atoms in the chain
  • ⁇ Means an aliphatic hydrocarbon group which may be a chain.
  • Preferred alkyl groups contain from about 1 to about 12 carbon atoms in the chain. More preferred alkyl groups contain about 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbon atoms in the chain.
  • side chain is meant one or more lower alkyl groups, for example methyl, ethyl or propyl, are attached to the linear alkyl chain.
  • Lower alkyl means a group having from about 1 to about 6 carbon atoms in the chain, which may be straight or branched.
  • Alkyl may be unsubstituted or optionally substituted by one or more substituents which may be the same or different and each substituent is halogen, alkyl, aryl, cycloalkyl, cyano, hydroxy, alkoxy, alkyl Thio, amino, carboxy and the like.
  • substituents which may be the same or different and each substituent is halogen, alkyl, aryl, cycloalkyl, cyano, hydroxy, alkoxy, alkyl Thio, amino, carboxy and the like.
  • the alkyl may be methyl, ethyl, butyl or isobutyl.
  • Alkoxy '' means an alkyl -0- group, in which the alkyl group is as previously described.
  • alkoxy groups include methoxy, epoxy, n-propoxy, isopropoxy and n-butoxy. Binding to the parent moiety is through oxygen. Preferably alkoxy may be methoxy or especial.
  • Aryl means an aromatic hydrocarbon ring system, examples of which include phenyl, indenyl, indanyl, naphthyl, fluorenyl and the like.
  • Halogen may include a fluorine atom, a chlorine atom, a brom atom and an iodine atom, preferably a fluorine atom, a chlorine atom or a bromine atom.
  • Alkyl substituted by halogen means an alkyl group substituted by one to three halogen atom (s), for example polomethyl, chloromethyl, difluoromethyl, dichloro- Methyl, dibromomethyl, trifluoromethyl, trichloromethyl, fluoroethyl, chloroethyl, trifluoroethyl, trichloroethyl, fluoropropyl, fluorobutyl, fluoronuclear chamber, and the like. May be (CI— C6) alkyl substituted with halogen, more preferably (C1-C6) alkyl substituted with chlorine or fluorine. Most preferably trifluoromethyl.
  • Aryl 1 'substituted by halogen is substituted by 1 to 3 halogen atom (s)
  • Aryl group for example, polorophenyl, difluorophenyl, tripulolophenyl, chlorophenyl, dichlorophenyl, trichlorophenyl, bromophenyl, dibromophenyl, tribromophenyl , Difulurobenzyl, dichlorobenzyl, dibromobenzyl and the like, preferably chlorophenyl.
  • Aryl substituted by alkyl or "arylalkyl '” means an aryl group substituted by one to three alkyl substituents, for example benzyl, ethylphenyl, propylphenyl, dimethyl phenyl, diethyl Phenyl, trimethylphenyl, triethylphenyl and the like, preferably benzyl.
  • the compound of the present invention may be silver hydrogen, methyl trifluomethyl, methoxy, ecoxy, chloro, nitro or amine in Formula 1, 3 ⁇ 4 is hydrogen, 2,4,6-trimethyl, 6-Trimetliyl-phenyl), 2,6-dimethicphenyl (2,6— Dimethoxy-
  • phenyl phenyl
  • -NH-R 5 3 ⁇ 4 is hydrogen or trifluoromethyl
  • 3 ⁇ 4 is phenyl, 4-ethyl-phenyl, 3, 4-dichloro-phenyl (3, 4-Dichloro-phenyl), 4-phenylazo-phenyl (4— Phenylazo-phenyl)
  • Turic acid vric acid 16 2- (2,6-Dimethoxy- Choi, Suk june June; Park, Hyen Joo; Lee, Ci-phenyl) -benzosa phenyl) -benzothi a Sang Kook; Kim, Sang Woong; Han, Iazole zole Gyoonhee; Choo, Hea 'Young Park.
  • the present invention relates to N- (6-methoxy-benzooxazol-2-yl) -benzamide (N- (6-Methoxy— benzooxazol-2—yl) -benzamide) , N_ (5-Methoxy-benzoxazol-2-yl) -benzamide of formula 3 (N- (5-Methoxy-benzooxazol-2-yl) -berizami (le), (5-chloro of formula 4) -Benzooxazol-2-yl) -phenyl-amine ((5-Chloro-benzooxazol-2-yl) -phenyl-amine), (5—Chloro-benzooxazol-2-yl)-(4 -Ethyl-phenyl) -amine ((5-Ch 1 or o-benzooxazo 1-2-y 1)-(4-et hy 1 -phenyl) -am i ne), (5-ch
  • the compounds screened through the screening method of the present invention can be applied to various cancers because they inhibit the metastasis of primary tumor cells.
  • colon cancer lung cancer, liver cancer, stomach cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, cervical cancer, endometrial cancer, chorionic cancer, ovarian cancer, breast cancer, May be thyroid cancer, brain cancer, head and neck cancer, malignant melanoma, lymphoma, aplastic anemia.
  • the cancer prevention and treatment is performed by inhibiting the metastasis of cancer cells because the migration or metastasis of cancer cells is reduced by inhibition of the interaction of KRS and 67LR of the present invention.
  • the compounds of the present invention may be used on their own or in the form of salts, preferably pharmaceutically acceptable salts.
  • 'pharmaceutically acceptable refers to a physiologically acceptable and, when administered to a human, usually does not cause allergic reactions or similar reactions.
  • Acid addition salts formed by (free acid) are preferred.
  • Organic acids and inorganic acids may be used as the free acid.
  • the organic acid is not limited thereto, citric acid, acetic acid, 3 ⁇ 4 acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, trifluoroacetic acid, benzoic acid, gluconic acid, metasulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, 4-toluene Sulfonic acid, glutamic acid and aspartic acid.
  • the inorganic acid includes, but is not limited to, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid.
  • the composition of the present invention may be formulated into a unit dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • diluents or excipients such as commonly used layering agents, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, The gel is mixed with Latin and prepared. Also in addition to simple excipients magnesium styrate talc The same lubricants are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, include May be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, ointments, creams.
  • the non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used.
  • the compound of the present invention or a composition containing the same may be administered parenterally, and parenteral administration may be by subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intrathoracic injection.
  • parenteral administration may be by subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intrathoracic injection.
  • the compounds of Formula 1 to Formula 17 of the present invention are mixed in water with stabilizers or buffers to prepare solutions or suspensions and formulated into unit dosage forms of ampoules or vials.
  • Dosage units may contain, for example, one, two, three or four times the individual dose, or one, two, one third, or one quarter times.
  • the individual dosage preferably contains the amount in which the effective drug is administered at one time, which usually corresponds to all, 1/2, 1/3 or 1/4 times the daily dose.
  • Dosage levels for a particular patient may vary depending on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method and excretion, drug combination and severity of disease.
  • the compound of the present invention inhibits the interaction of KRS and 67LR and thus prevents the migration or metastasis of primary tumor cells or cancer cells. It provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis comprising a pharmaceutically acceptable salt thereof as a favorable component.
  • the compound may be one of the compounds represented by Formula 1 to Formula 17.
  • the composition of the present invention is a compound of the present invention, that is, It may be a composition containing the compound described in the 0.001 to 99.999 weight carrier in an amount of 99.999 to 0.001% by weight.
  • the carrier may be a pharmaceutically acceptable carrier.
  • composition of the present invention may be administered in parallel with a known compound having an effect of preventing and treating cancer or a known compound having an effect of inhibiting cancer metastasis.
  • the present invention provides a use of the benzoheterocycle derivative represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the preparation of a cancer prevention and treatment agent.
  • the present invention also provides a use for the preparation of a cancer metastasis inhibitor of the benzoheterocycle derivative represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention also provides a method for preventing and treating cancer, which is characterized by administering an benzoheterocycle derivative represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof to an individual in need thereof in an effective amount.
  • the present invention is a benzoheterocycle derivative represented by the formula (1) or a drug thereof
  • It provides a method for inhibiting cancer metastasis, which is characterized by administering an effective amount of a scientifically acceptable salt to an individual in need thereof.
  • the benzoheterocycle derivative may be one of the compounds machined as Formula 1 to Formula 17.
  • the benzoheterocycle derivatives of the present invention and pharmaceutically acceptable salts thereof may be administered in an effective amount via various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular.
  • the term 'effective amount 1 ' refers to an amount that exhibits a therapeutic and prophylactic effect or a cancer metastasis suppression effect when administered to a patient
  • the term 'subject' includes an animal, preferably a mammal, especially a human. It may be an animal, cells, tissues, organs, etc. derived from the animal. The subject may be a patient in need of treatment.
  • the benzoheterocycle derivatives of the present invention and pharmaceutically acceptable salts thereof may be administered as they are or prepared and administered in various formulations as described above, and preferably, desired effects, ie cancer prevention And until a therapeutic effect or cancer metastasis suppression effect is derived.
  • the compounds of the present invention and their pharmaceutically acceptable salts can be administered by various routes according to methods known in the art.
  • Oral or parenteral such as oral, intramuscular, intravenous, intradermal, intraarterial, intramedullary, intradural, intraperitoneal, intranasal, intravaginal, rectal, sublingual or subcutaneous, or by gastrointestinal tract, mucosal or respiratory Can be.
  • a method of directly applying the compound of the present invention and a pharmaceutically acceptable salt thereof to the skin, or preparing the polypeptide in an injectable formulation and injecting a predetermined amount into the lower layer of the skin with a 30 gauge thin needle or It can be administered by lightly pricking the skin. Preferably it may be applied directly to the skin.
  • the compounds of the present invention and pharmaceutically acceptable salts thereof may also be administered in a form encapsulated within or encapsulated within a molecule that induces high affinity binding to a target cell or tissue (eg, skin cells or skin tissue).
  • Compounds of the present invention and pharmaceutically acceptable salts thereof can be prepared using techniques known in the art, such as sterols (e.g.
  • lipids e.g. cationic lipids, virosomes or liposomes
  • target cell specific binding agents e.g., : Ligand recognized by target cell specific receptor
  • Suitable coupling or crosslinking agents can include, for example, Protein A, carbodiimides, N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propioate (SPDP) and the like. These formulations are formulated in Rej ' ngton's, a prescription generally known in pharmaceutical chemistry.
  • FIG. 1 to 6 confirm the specific interaction of human KRS with laminin receptors.
  • FIG. 1 the interaction between full length human KRS and 37LRP / p40 was carried out via East to Hybrid analysis.
  • Two components of the multi-ARS complex, AIMP1 and AIMP2 were used as positive and negative controls, respectively. Positive interactions were labeled by the formation of blue colonies in yeast media containing X-gal.
  • 37LRP is 35S Synthesized by in vitro translation in the presence of methionine and reacted with GST-KRS or GST (puU-down). Co-precipitated 37 LRP with GST ⁇ KRS was measured using autoradiography.
  • Peptide sites involved in the interaction of KRS and 37LRP in FIG. 3 were measured via east to hybrid analysis.
  • immunoprecipitation was performed with 67LR-recognized antibody (abeam, cat # ab2508), and the IgG label on the left was used as a negative control as a total IgG obtained from rabbits. 1 (»SDS PAGE was performed, and then transferred to PVDF membrane, and immunoblot was performed with antibodies recognizing KRS and 67LR, respectively.
  • FIG. 7 to 12 confirm laminin-induced membrane translocation and phosphorylation of KRS.
  • A549 cells were treated with laminin (lOiig / ml), and the levels of 67LR, 37LRP, and KRS were observed by time zone using a Western bowl. Hs P 90 and Khedherin (Cad) were used as markers of cytoplasm and membrane, respectively.
  • FIG. 8 A549 cells were treated with laminin for 1 hour or untreated to perform immunofluorescence staining with anti-67 LR (MLuC5, Santacruz, sc-59732) (red) and KRS antibody (green). .
  • MuC5 anti-67 LR
  • sc-59732 Santacruz
  • KRS antibody green
  • A549 cells were treated with U73122 (U), staurosporin (ST) and LY294002 (LY), which inhibit PLC-gamma, PKC, and PI3K, respectively, for 3 hours, and then treated with laminin for 1 hour.
  • These kinase inhibitors are cytoplasmic and membrane of 67LR and KRS
  • A549 cells were infected with Myc-KRS and cultured for 24 hours. Thereafter, it was treated with the indicated drug and treated with laminin as above. Myc-KRS was immunoprecipitated and immunoblotted with anti-p-Thr, -Ser, and -Tyr antibodies.
  • U U73122
  • ST staurosporin
  • LY294002 LY
  • A549 cell cells were infected with Myc-KRS and cultured for 24 hours. Infected cells were pretreated with LY294002 for 3 hours and treated with laminin for 1 hour. Myc ⁇ KRS was immunoprecipitated and 67LR coprecipitation was examined by Western blot. IgG was used as a control for immunoprecipitation.
  • FIG. 12 as described above, A549 cells were cultured in the presence or absence of laminin and LY294002.
  • EPRS glutamyl-prolyl-tRNA synthetase
  • AbCam specific antibody
  • coprecipitation of KRS was confirmed by Western blot. Western blots with anti-KRS and EPRS antibodies were performed with immuno-depleted supernatant (ID).
  • FIG. 13-17 confirm that the level of membrane-binding 67LR depends on KRS.
  • A549 cells were infected with EV or KRS or si-cont or si-KRS, the cells were divided into cytoplasm and membrane fractions, and the amount of 67LR and KRS in each fraction was western blot. Confirmed. Khedherin (red) and hsp90 were used as markers of the cell membrane and cytoplasm, respectively.
  • FIG. 14 A549 cells infected with EV (vaccine) or KRS were selected for 1 week with G418, and the intracellular distribution of 67LR was confirmed using immunofluorescence staining with anti-LR antibody (MluC5). LR distributed in the membrane is highlighted by an arrow.
  • MluC5 anti-LR antibody
  • 67LR was immunoprecipitated with an antibody that specifically reacted with 67LR (F-18, Santacruz), separated by SDS-PAGE, and then subjected to autoradiography. Inhibition of KRS by specific siRNA was performed by Western blot and tubulin was used as loading control.
  • FIG. 17 to 20 show that KRS is a cell migration (cel l migrat ion) and cancer through the 67LR It is confirmed that it promotes metastasis.
  • A549 cells were infected with the indicated plasmids and cultured in the absence (FIG. 21) or presence of laminin (FIG. 17), and their effect on cell migration was measured in cells transferred in the Transwell chamber. Confirmed by. The number of cells that passed through the membrane was counted and displayed on each panel. The experiment was repeated three times.
  • FIG. 18 the cells treated as above were used to perform zymography (upper) and western blot (middle), respectively, to measure the activity and amount of MMP-2. Actin was used as loading control.
  • FIG. 18 the cells treated as above were used to perform zymography (upper) and western blot (middle), respectively, to measure the activity and amount of MMP-2. Actin was used as loading control.
  • 4T-1 cells which are breast cancer cell lines, were infected with the indicated siRNA and injected subcutaneously in the back of Balb / C mice. After 27 days, the lungs of the mice were removed and the tumor nodules 1 mm or larger in diameter were counted.
  • FIG. 20 two different 4T-1 cells expressing exogenous KRS (KRS-1, and KRS-2) were inoculated as above and tumor nodules were counted after 4-5 weeks. Empty infected cells were used as a control.
  • Infected cells were cultured for 48 hours and 24 hours, and cultured for 1 hour in methionine-free medium to form a malnourished state, and then labeled with radiolabeled methionine for 2 hours. After washing, cells were incubated for 4 hours, lysed with 0.5% Triton X-100 lysate and radioactive activity was measured with a liquid scintillation counter.
  • A549 cells were infected as indicated, fixed, stained with Propidhim iodide and analyzed on a flow cytometer.
  • siRNA-infected cells (1 ⁇ 10 6 ) were injected as described above, and the effects of KRS and DRS inhibition on primary tumor proliferation were examined by measuring tumor size and volume after 21 days. Ha It was.
  • Each group used 6 mice (1 in FIG. 19, 5 in FIG. 27).
  • the lungs extracted from the mice were fixed in 10% formalin solution. Metastatic tumor nodules and numbers are as shown.
  • FIG. 28 overexpression of KRS-1 and KRS-2 cell lines was observed by Western blot.
  • FIG. 29 the effects of KRS overexpression on primary tumor proliferation were compared with each other.
  • FIG. 30 the effect of KRS overexpression on tumor metastasis was examined 30 days after inoculation. Each group used 4 mice (1 representative in FIG. 20. 4 marks in FIG. 30).
  • 31-36 show inhibition by compounds of the interaction between IiRS and 67LR and
  • FIG. 31 shows growth inhibition of yeast cells comprising the indicated pairs of proteins at 50 y g / ml of the compound of Formula 15 (CAND-KLl, KL1).
  • the control group is represented by the 0D value of the cells treated with DMS0.
  • FIG. 32 is a photograph showing cell growth in wells containing yeast cells with the indicated interaction pairs in the presence or absence of CAND-KL1.
  • FIG. 33 the dose-dependent effect of KL1 on the interaction between K S and 67LR by co-immunoprecipitation in 293 cells was tested.
  • GST-KRS was attached to a CM5 Sensor Chip and binding was measured by a resonance unit (RU) at the indicated concentrations (indicated in different colors).
  • RU resonance unit
  • GST protein was used as a control to measure KRS-specific binding affinity. Apparent binding constants were obtained using the BIAeva iat ion program.
  • ⁇ 160> 37 to 43 show that inhibition of KRS-laminin receptors inhibits cell migration and cancer metastasis.
  • the dose-dependent effect of KL1 on P2 activity (FIG. 37) and cell migration (FIGS. 38 and 39) was measured.
  • cells were treated with KL1 for 8 hours.
  • 40 to confirm the effect of KL1 on protein synthesis of cells, A549 cells were treated at the concentrations indicated by KL1, and then starved with methionine-free medium.
  • the present inventors have found that KRS interacts with 67LR to promote cancer (or tumor) cell migration, thereby affecting metastasis of cancer, and inhibits the interaction of KRS and 67LR. It was confirmed that cancer can be prevented and treated by inhibiting the metastasis of cancer cells. Accordingly, the compositions of the present invention inhibit metastasis and thus provide new means for cancer prevention and treatment.
  • FIG. 1 confirms the interaction between human KRS and 37LRP / p40 through east-to-hybrid analysis.
  • Figure 5 is infected with Myc-KRS to confirm the binding of KRS with 67LR and 37LRP
  • FIG. 7 shows the levels of 67LR, 37LRP, and KRS when treated with laminin in A549 cells using a West turn blot.
  • FIG. 8 shows the expression of 67 LR and K S by immunofluorescent staining when A549 cells were treated with or without laminin.
  • FIG. 10 shows the degree of phosphorylation when treated with laminin and kinase inhibitors in A549 cells expressing KRS by immunization with p-Thr, -Ser, and -Tyr antibodies.
  • FIG. 11 shows Western blot binding of phosphorylated KRS with 67LR in A549 cells expressing K S.
  • Figure 12 shows the effect of laminin on the binding of KRS and EPRS by Western blot.
  • FIG. 13 shows Western blots of 67L and KRS in transfection of s i -control or s i-K S
  • FIG. 14 shows the intracellular distribution of 67LR on A549 cells infected with EV (blank vector) or KRS by immunofluorescence staining.
  • FIG. 18 shows MMP-2 activity and amount upon inhibition of expression of KRS and / or 67LR by zymography and western blot.
  • 19 shows the number of tumor nodules upon suppression of KRS expression in mice transplanted with 4T-1 cell line.
  • Figure 21 measures the migration of A549 cells cultured in the absence of laminin.
  • FIG. 23 shows the amount of KRS and total protein synthesis in cells according to the introduction of siRNA and exogenous KRS in A549 cells.
  • FIG. 24 shows the amount of K S and the cell cycle according to the introduction of siRNA and exogenous KRS in A549 cells.
  • Figure 25 shows the effect of si-KRS and si-DRS on the expression of the target protein confirmed by Western blot.
  • FIG. 26 confirms the effects of KRS and DRS inhibition on primary tumor proliferation following tumor cell transplantation.
  • FIG. 28 shows Western expression of KRS-1 and KRS-2 cell lines overexpression of KRS.
  • FIG. 29 confirms the effects of KRS overexpression on primary tumor proliferation following tumor cell transplantation.
  • Figure 30 shows the metastatic tumor nodules and number following tumor cell transplantation.
  • FIG. 31 shows KRS and 67LR (KRS- at 50 u g / ml of a compound of the invention (CAND-KL1, KL1).
  • 35 shows the effect of the compound of the present invention on the intracellular levels of 67LR and 37LRP in A549 cells by Western blot.
  • 41 shows the cytotoxicity of the compounds of the present invention using A549 cells.
  • A549 and HEK293 cells were purchased from ATCC.
  • Mouse breast carcinoma 4T-1 cell line was obtained from Dr. Sung-Jin Kim (Gachon University College of Medicine). Cells containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% antibody, for RPMKA549 cells and 4T-1 cells) and DMEM (Dulbecco's Modi f ied Eagle Medium, for other cells) Used for incubation.
  • FBS fetal bovine serum
  • DMEM Dulbecco's Modi f ied Eagle Medium, for other cells
  • a pcDNA3.1 vector encoding 37LRP was obtained from Dr. Tachibana Hirofumi (Kyushu University). Myc-tagged human KRS and DRS were cloned into the EcoRI / XhoI restriction enzyme site of the pcDNA3 vector.
  • Rodent KRS cDNA was obtained by RT-PCR and cloned into Hindi ⁇ / Xhol restriction site of pcDNA3.1 vector.
  • SiRNAs targeting to rodent and human KRS and DRS were purchased from Iiwitrogen. A sequence of siRNAs will be provided upon request.
  • Gene porter (GTS) and lipofectamine 2000 (invitrogen) were used as transfection reagents.
  • LY294002, U73122 and staurosporin were purchased from Calbiochem and cycloheximide and laminin (laminin, Engelbreth—Holm- Swarm murine sarcoma) were purchased from Sigma.
  • the cultured cells were transfected or treated with the indicated vector or compound, fixed at 4 ° C. with 70% ethanol for 1 hour and then washed twice with iced PBS. Cells were then stained for 40 minutes with propidi un iodide (50 y g / ml), 0.1% sodium citrate, 0.3% NP40 and RNaseA (50yg / ml), followed by flow cytometry (FACS Calibur, Beckton-Dickinson) Was performed. For each sample, 20000 cells were analyzed using Cell Quest Pro software.
  • A549 cells on the cover slip were fixed with 70% methyl alcohol and then cold.
  • 293 cells were transfected with si-KRS or 3 ′ control ( ⁇ 1 0 ⁇ ⁇ ) using liposutamine 2000. This was incubated for 1 hour in a medium containing no methionine.
  • [S] methionine 50nCi / ml was removed and incubated for 1 hour. After washing radioactive methionine with fresh medium, 67LR was immunoprecipitated with its specific antibody (Santacruz), isolated by 12% SDS-PAGE, and exposed using BAS (FLA-3000, Fujifilm) (autoradiography). ). The amount of 67LR was measured using the Multi-gauge program (V3.0, Fujifilm).
  • ⁇ 229> cDNA encoding several fragments of human KRS using the corresponding primers
  • PCR products for KRS were cleaved into EcoRI and Xh teeth and linked to the corresponding positions of pEG202 vector (for the production of LexA—fusion protein) and pJG4-5 vector (for the production of B42-fusion protein).
  • the cDNA encoding the 37LRP fragment was obtained from Dr. Barbara J. Ba Hermann (University of Alberta) and inserted into the EcoRI and Xhol sites of the pJG4-5 vector. The interaction between the two fusion proteins was analyzed by the formation of blue colonies on X—gal-containing yeast medium.
  • GST-KRS or GST was expressed in E. coli Rosetta (DE3) strain, and the protein extracts were maintained at 4 ° C for 2 hours in PBS buffer containing 13 ⁇ 4 Triton X-100 and 0.5% N-laurylsacocine. It was compatible with glutathione-sepharose.
  • Human 37LRP uses TNT Quick cou led Transcription / Translation system (Promega), pcDNA3 ⁇ 37LRP
  • A549 cells transfected with plasmid encoding the indicated siR A and recombinant KRS (or DRS) were incubated for 48 hours and 24 hours, respectively, and then inoculated in RPMI medium containing 10% FBS (1 ⁇ 10 5). Cells / well). The cells were starved for 2 hours in serum-free RPMI medium and then incubated for 24 hours at 10 yg / ml with laminin. 20 ⁇ l of culture medium is mixed with 5 ⁇ F0D buffer (0.125M Tris-HCl, pH 6.8 containing 4% SDS, 20% glycerol and 0.01% bromophenol blue), followed by lmg / ml of gelatin.
  • 5 ⁇ F0D buffer (0.125M Tris-HCl, pH 6.8 containing 4% SDS, 20% glycerol and 0.01% bromophenol blue
  • Mouse breast cancer cells (ma ⁇ ary carcinoma) 4T-1 cells were si-KRS, si -DRS or Transfected with si-control and incubated for 24 hours.
  • Cells (1 ⁇ 10) were injected subcutaneously into the back of 6 week old female cut Balb / c mice.
  • the effect of si-RNA on the expression of the target gene was tested in the remaining cells 48 hours after transfection, and the si-RNA in Western blot using antibodies bounced from primary tumors every 2 days after injection until 3 to 10 days. The effect of was tested. Tumor growth was observed by measuring tumor size three times a week. Total weight was also measured at the same time. Mice were sacrificed 21 days after injection and primary tumors and lungs were removed from the mice.
  • Lungs were fixed for 24 hours with 10% formalin. The number and size of metastatic tumor nodules in the lungs were measured, and tumor nodules larger than 1 mm in diameter were separately characterized. The primary tumor weight was also measured.
  • rodent KRS and vaccinia were transfected into 4T-1 cells, and a stable transfectant was selected by incubation for 3 weeks in the presence of G418. Several single colonies were then picked up and compared with expression of KRS by western blot. Two different colonies (KRS-1 and KRS-2) expressing KRS at higher levels than control cells were selected and used for infusion. All procedures were performed as above except that mice were rendered 30 days after infusion.
  • the degree of inhibition of the interaction between KRS and laminin receptor (67LR) with respect to the compound of the present invention obtained by screening the compound library was confirmed as follows according to the East to Hybrid method.
  • the necessary vector was prepared by cloning KRS, LR, AIMP2, AIMP3 and MRS, respectively, in LexA vector (clontedi) and B42 vector (clontech).
  • LexA—KRS and B42-LR vectors are co-transformed into yeast EGY / SH cells, and the yeast cells are then uracil (Ura), histidine (His), tryptophan (Trp) and leucine.
  • KS and the compound of Formula 15 were examined using BIAcore3000 (GE healthcare).
  • GST and GST-KRS were diluted and adjusted to 20 g / ml in lOmM sodium acetate (H 5.0). Each protein was then attached to the surface of a CM5 sensor chip (GE healthcare).
  • CAND-KL1 was diluted at the concentration indicated in PBS with Vh DMS0, injected at a rate of 20 ⁇ 1 / min at 25 ° C. and then the binding was measured by the change in resonance unit (RU).
  • Specific binding activity of GAND-KL1 to GST-KRS was measured after subtracting the binding to GST from the sensorgram. The apparent binding constant was obtained by 1: 1 binding by shifting the baseline using the BIAevaluation program.
  • LexA—KRS is known as a partner of KRS (Kim, JY et al. P38 is essential for the assembly and stability of macromolecular tR A synthetase com lex: Implications for its physiological significance, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 7912 -7916 (2002)) paired with B42-37LRP as well as AIMP2 to form blue colonies, but not for AIMP1 (FIG. 1).
  • Laminin-dependent membrane translocation of KRS is freely involved in phosphorylation and multiple -tRNA synthetase complexes.
  • the inventors investigated whether the intracellular distribution of KRS in A549 cells was changed by laminin treatment through cell fractionation and immunofluorescence staining. After laminin treatment, the intra-membrane abundance of KRS and 67LR gradually increased with little change in the amount of KRS and 37LRP in cells 3 ⁇ 4 or their expression (FIG. 7 and results not shown). In immunofluorescence staining, it was also demonstrated that 67LR and KRS migrated to the membrane by laminin treatment (FIG. 8, red and green, respectively). The inventors then investigated whether the membrane translocation of KRS is physiologically regulated by signaling triggered by laminin. It was.
  • Phosphoinositide 3-OH kinase (PI3K) (Sha, LM, Rabinovitz, I., Wang, HH, Toker, A. & Mericurio. AM Activation of phosphoinositide 3 ⁇ OH kinase by the alpha6beta4 integrin promotes carcinoma invasion. Cell 91, 949-960 (1997)), protein kinase C, PKC) (Li, YQ et al.
  • Protein kinase C mediates the signal for i nt er f er on-garama mRNA expression in cytotoxic T eel Is after their adhesion to laminin.Immunology 93, 455-461 (1998)), and phosphol ipase C- gamma, PLC-ganima (Vossmeyer, D., Hofmann, f., Loster, K., Reutter, W. & Danker, K. Phosphol ipase C-garama binds alphalbetal integrin and modulates alphalbetal integr in-specific adhesion.J. Biol. Chem.
  • KRS is required for intracellular stabilization of 67LR.
  • the present inventors confirmed whether KRS influences the amount of 67LR in the membrane in A549 cells.
  • Plasma membrane (plasma membrane) 67LR amount increases up by the KRS on in, but (FIG. 13, left), laminin effects to decay when be KRS is inhibited by specific siRNA for it (Figure 13, right) which 67LR et It suggests the importance of KRS in laminin dependent promotion.
  • the intracellular distribution of laminin receptors was compared via immunofluorescence staining between A549 cells transfected with voids (EV) or KS. Laminin receptors were strongly stained at the membrane site of KRS overexpressing cells compared to the control (FIG. 14).
  • the inventors also examined 67LR present in the membrane via flow cytometry. The amount of 67LR was "present in the film increases when supplying KRS from the outside, when suppresses the KRS with si-KRS, was decreased (FIG. 15).
  • KRS KRS could promote 67LR through transcription or conversion from 37LRP.
  • transfection of KS did not increase LR transcription except for the tentative role of LR transcription regulation (results not shown).
  • 37LRP modification of 37LRP is a prerequisite for converting 37LRP to 67LR.
  • 67LR was dramatically reduced when KRS was inhibited by siRNA However, this value is in contrast to that maintained over time intervals for the si-control (FIG. 16): Thus, KRS appears to increase the half-life of 67LR by binding to 67LR in the plasma membrane.
  • KRS promotes cell migration and cancer metastasis through 67LR.
  • the fragrance was examined via transwell membrane analysis. Migration of control cells was promoted by an average of 6-fold by laminin treatment (FIGS. 21 and 17). However, laminin-dependent cell migration showed that KRS was determined by si-RNA. Decreased when inhibited (FIG. 17, si-control and si-KRS). Conversely, KRS overexpression increased mobilization of cells promoted by laminin treatment (FIG. 17, EV and KRS). The effects of KRS disappear in the event that laminin receptors are inhibited by si-RNA ( Figure 1 si-LR, lower panel), because KRS is secreted into cytokines in some cancer cells (Park, SG et al. Human lysyl-tR).
  • MMP-2 activity was activated by laminin, which was inhibited in the presence of si-KRS (FIG. 18 left) but was further enhanced by overexpression of KRS (right of FIG. 18).
  • KRS polyhydry—aspartyl-tRNA synthetase
  • DRS polyhydry—aspartyl-tRNA synthetase
  • KRS overexpression in the constructed cell lines was confirmed by Western blot, and two different cells (KRS-1 and KRS-2) expressing KRS in large amounts were selected as compared to cells transfected with empty vectors (FIG. 28). . These cells also produced primary tumors of similar mass and size (FIG. 29). When the lungs were examined 30 days after injection of these cells, both KRS-overexpressing cells produced more nodules compared to control cells (FIGS. 20 and 30). Imply that
  • the present inventors treated the compounds of the present invention to examine the interaction between K S and 67LR in order to examine whether the compounds of the present invention regulate the interaction between KRS and laminin receptors.
  • the present inventors made a yeast two hybrid system in which cell growth occurs when the interaction between KRS and laminin receptor occurs, and examined whether the compound inhibits the interaction. If the compound inhibits the interaction between KRS and laminin receptors, it will inhibit yeast cell growth.
  • the growth inhibition was about 503 ⁇ 4) compared to the control cells, indicating that the interaction between KRS and 67LR was well inhibited.
  • KRS-AIMP2 KRS-AIMP2
  • JY et al. P38 is essential for the assembly and stability of macromolecular tRNA synthetase complex: Implications for its physiological significance.Proc. Natl ' .Acad. Sci. USA 99, 7912-7916 (2002); Han, JM et al. Hierarchical network between the components of the multi-tR A synthetase com 1 ex: Implications for com lex formation .. J. Biol. Chew. 281, 38663-38667 ( 2006)) and MRS-AIMP3 (Quevi 1 Ion, S. & Mirande, M.
  • the pl8 component of the mult i synthetase complex shares a protein motif with the beta and gamma subunits of eukaryot ic elongation factor 1.FEBS Lett. 395, 63-67 (1996); Kim, KJ et al. Determination of three dimensional structure and residues of novel tumor suppressor, AIMP3 / pl8, required for the interaction with ATM.J. Biol. Chem. (2008)) Other interaction pairs were also processed. Through these tests, the inventors selected compounds that inhibited only K S-LR interactions (see Table 3 below).
  • KRS and the compound of Formula 15 also represented as CAND-Ll and KL1 Tests also inhibited the intracellular interaction of 67LR.
  • A549 cells were treated with different concentrations of KL1, 67LR was immunoprecipitated with their antibodies, and the co-immunoprecipitation of KRS was examined.
  • the amount of KRS co-precipitated with 67LR decreased with increasing KL1 amount, and the intracellular amounts of KRS and 67LR remained unchanged (FIG. 33).
  • In vitro interactions between the laminin receptor and GST-KRS synthesized using radioisotopes resulted in different amounts of KL1.
  • the amount of laminin receptor pulled down with GST-KRS decreased as the amount of KL1 compound added (FIG.
  • KRS-67LR inhibits cell migration and cancer metastasis.
  • KL1 affects cell migration and cancer metastasis as described above.
  • liLl inhibited MMP2 activity and cell migration depending on the amount treated (FIGS. 37-39).
  • Intracellular protein synthesis and viability were unaffected by KL1 treatment under the same experimental conditions (FIGS. 40 and 41), suggesting that the inhibition of copper by the compound treatment is not due to protein synthesis and cell viability.
  • KL1 was injected into mice once a day for 3 weeks in an amount of 30 mg / kg, the number of transferred nodes decreased significantly (FIG. 42). In contrast, KL1 did not affect tumor growth (FIG. 43).
  • the present inventors have found that KRS interacts with 6 LR to promote the migration of cancer (or tumor) cells, thereby affecting metastasis of cancer. It was confirmed that the substance that inhibits the interaction of KS and 67LR can prevent and treat cancer by inhibiting the metastasis of cancer cells. Thus, the composition of the present invention inhibits cancer metastasis and thus provides new means for cancer prevention and treatment.

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Abstract

본 발명은 벤조헤테로사이클 유도체의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 벤조헤테로사이클 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 KRS가 67LR과 상호작용함으로써 암(또는 종양) 세포의 이동을 촉진하여 암의 전이(metastasis)에 영향을 미친다는 것을 규명하였으며, KRS 및 67LR의 상호작용을 저해하는 물질이 암세포의 전이를 억제하여 암을 예방 및 치료할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 조성물은 암의 전이를 억제하므로 암 예방 및 치료를 위한 새로운 수단을 제공하여 준다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
벤조헤테로사이클 유도체의 암 예방 및 치료 또는 암 전이 억제를 위한 용도 【기술분야】
<1> 본 출원은 2009년 11월 5일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2009-0106350 호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
<2>
<3> 본 발명은 벤조헤테로사이클 유도체의 신규한 용도에 관한 것으로 보다 상세 하게는, 벧조헤테로사이클 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성 분으로 포함하는 암 예방 및 치료 또는 암 전이 억제용 조성물에 관한 것이다.
<4>
【배경기술】
<5> 암 (또는 종양)은 비정상적이고 비제어성 이며 무질서한 세포증식의 산물이다 . 특히 , 파괴 적인 성장성， 침투성 및 전이성이 있다면 악성으로 분류된다. 침투성 이 란 주위 조직을 침투 또는 파괴하는 성 질로서 , 일반적으로 조직의 경 계를 이루는 기저층을 파괴시켜 종양이 국부적으로 전파되는 것을 의미하며 , 종종 체내의 순환 계로도 유입된다. 전이 란 일반적으로 림프관 ( lymphot ic) 또는 혈관에 의해 원발 위 치와는 다른 곳으로 종양 세포가 퍼지는 것을 의미한다. 전이는 또한 장액성 체강 또는 다른 공간을 통해 직 접 신장하여 종양 세포를 이동시키는 것을 의미하기도 한 다.
<6>
<7> 현재 , 암은 주로 3가지 치료법， 즉 외과적인 수술， 방사선조사 및 화학요법 중 1가지 또는 이들의 조합을 통해 치료되고 있다. . 수술은 질병 조직을 대부분 제 거하는 것을 포함한다. 이 러한 외과적 수술은 특정 부위 , 예컨대 유방, 결장 및 피 부에 위치한 종양을 제거하는 데에는 효과적 이지만， 척추와 같이 일부 구역에 있는 종양을 치료하거나 백혈병과 같은 분산성 종양질환을 치료하는 데는 사용할 수 없 다.
<8>
<9> 화학요법은 세포 복제 또는 세포 대사를 붕괴시키며， 흔히 유방， 폐 및 정소 의 암을 치료하는데 많이 사용되는테， 종양 질병을 치료하는데 사용되는 전신성 화 학요법의 부작용은 암 치료를 받는 환자들에 게 가장 문제가 된다. 이러한 부작용 중에서 멀미와 구토는 가장 일반적이며 심각한 부작용이다. 화학요법에 의한 부작 용은 환자의 생명에 큰 영향을 미치며 치료에 대한환자의 순웅성을 급격하게 변화 시킬 수 있다. 또한， 화학치료제와 관련된 부작용으로는 일반적으로 이러한 약물의 투여시 주의해야 하는 용량 제한 독성 (DLT, Dose Limiting Toxicity)이 있다. 예를 들어 , 점막염은 여러 항암제， 예컨대 항 대사물질 세포독소제인 5-플루오로우라실， 메소트렉세이트 및 항종양항생제 (예, 독소루비신) 등에 대한 용량 제한 독성이 있 다. 이러한 화학요법 유래의 부작용 중 대부분은 심한 경우 입원을 요하거나 통증 을 치료하기 위해 진통제를 필요로 하기도 한다. 이와 같이 화학치료제 및 방사선 치료에 의한부작용들은 암환자의 임상적 처치시 주요문제가되고 있다.
<10>
<ιι> 한편， 종양의 전이는 암 치료의 생존를에 있어서 결정적인 요소이다. 67 kDa 의 라미닌 수용체 (67LR)는 원형질막에 포매된 (embedded) 비 -인테그린형 수용체로 서, 암의 침습 (침윤) 및 전이와 연관이 있다 (Nelson, J. et al . The 67 kDa laminin receptor: structure, function and role in disease. Biosci . Rep. 28, 33-48 (2008)). 67LR은 이들의 37kDa 전구체 (37LRP)의 증합 (dimerization)에 의해 생성되는데 이러한 변화 과정에 대한 분자적인 세부기작은 잘 알려져 있지 않다. 37LRP는 폴리좀 형성에 관여하는 리보좀 서브유닛 p40과 동일하다 (Auth, D. & Brawerman,G. A 33ᅳ kDa polypeptide with homology to the laminin receptor： component of translation machinery. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4368-4372 (1992)). 67LR은 종종 다양한 종류의 암에서 고농도로 관찰된다 (Nelson, J. et al .The 67 kDa laminin receptor： structure, function and role in disease. Biosci . Rep. 28， 33-48 (2008)； Menard, S.， Castronovo, V. , Tagliabue, E. & Sobel , M. E.New insights into the metastasis一 associated 67 kD laminin receptor. J. Cell. Biochem. 67， 155-165 (1997)). 그러나， 67LR의 막내 존재에서 의 조절자나분자적 기작은 아직 밝혀지지 않았다.
<12>
<i3> KRS는 단백질 합성을 위하여 동족의 (cognate) 아미노산 및 tRNA를 접합시키 는 aminoacyl-t-RNA synthetases (ARSs) 속한다. 이들 원시 효소들은 촉매적 활성 외에도 다면적 (pleiotropic) 특징을 갖는다 (Park, S. G., Ewalt.K. L. & Kim, S. Functional expansion of aminoacyl-tRNA synthetases and their interacting factors: new perspectives on housekeepers. Trends Biochem. Sci . 30 , 569-574 (2005)). 이에 반해， KRS를 포함한 몇몇 포유류의 ARS는 구성 단백질의 다양한 기 능을 조절하기 위하여, 분자 저장소 (molecular reservoir)로서 작용하는 (Ray, P. S. , Arif , Α. & Fox, P. Macromolecular com lexes as depots for releasable regulatory proteins. Trends Biochem. Sci. 32, 158-164 (2007)) 거대분자복합체 를 형성한다 (Lee, S. W. , Cho, B. H..Park, S. G. & Kim, S. Aminoacyl-tRNA synthetase complexes: beyond translation. J. Cell . Sci . 117, 3725-3734 (2004)； Han, J. M. , Kim, J. Y. & Kim, S. Molecular network and functional implications of macromolecular tR A synthetase com lex. Biochem. Biophys . Res. Commn. 303, 985-993 (2003)). 인간 KRS는 腿와 기타 단백질간의 상호작용 에 관여하는 고유한 N말단 연장부위를 함유하고 있다 (Rho, S. B. et al . Genetic dissect ion of proteinrprotein interact ions in mult i -tRNA synthetase com lex. Proc. Natl. Sci. Acad. USA 96， 4488-4493 (1999)； Francin, M. , Kaminska, M. , Ker jan,P. SMirande. M. The N-terminal domain of mammal i an Lysyl-tRNA synthetase is a functional tRNA-binding domain. J. Biol . Chew. 277， 1762-1769 (2002)).
<14>
【발명의 상세한설명】
【기술적 과제】
<15> 이에 본 발명자들은 인간 라이실 t-RNA 합성효소 (lysyl-t-RNA synthetase,
KRS)의 기능적 다양성과 관련하여 연구하던 중 이 단백질과 결합 가능성이 있는 단 백질의 하나로서 37LRP/p40을 확인하였고， K S가 37LRP의 증합으로 형성되는 원형 질 막에 있는 라미닌 수용체 (67LR)를 안정화시킴으로써 세포 이동 및 암 전이를 촉 진하는 등 KRS가 원형질 막의 라미닌 수용체를 통해서 암 전이 또는 암 세포 이동 에 영향을 미친다는 것올 알아내고， KRS와 67LR의 상호작용을 저해하는 물질이 암 전이를 억제함으로써 암 예방 및 치료효과를 가지므로 이를 저해하는 벤조헤테로 사이클 유도체의 새로운용도를 알아내어 본발명을 완성하였다.
<16>
<17> 따라서 본 발명의 목적은 KRS 및 67LR의 상호작용을 저해하여 암의 전이를 억제함으로써 암을 예방 및 치료하는 벤조헤테로 사이클 유도체의 용도를 제공하 는 것이다.
<18>
[기술적 해결방법】
<19> 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 벤조헤테로사이클 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물 을 제공한다.
<20> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 벤조헤테로사이클 유도 체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암 전이 저해용 약학적 조성물 을 제공한다.
<21>
<22> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 벤조헤테로사이클 유도 체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 암 예방 및 치료제 제조를 위한 용도를 제공한다.
<23> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 벤조헤테로사이클 유도 체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 암 전이 저해제 제조를 위한 용도를 제 공한다 .
<24>
<25> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 벤조헤테로사이클 유도 체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투 여하는 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료 방법을 제공한다.
<26> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 벤조헤테로사이클 유도 체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투 여하는 것을 특징으로 하는 암 전이 저해 방법을 제공한다.
<27>
<28> 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
<29> 본 발명자들은 K S가 암 전이 또는 암 세포 이동에 미치는 영향을 처음으로 규명하였다. 즉， 본 발명은 KRS가 원형질 막의 라미닌 수용체 (67LR)를 통해서 암 전이 또는 암 세포 이동에 영향을 미친다는 것을 규명하였다 . 또한, KRS와 67LR의 상호작용을 저해하는 물질이 암의 전이를 억제하여 암 예방 및 치료의 목적으로 사 용할 수 있음을 처음으로 규명하고， 화합물의 라이브러리를 스크리닝하여 벤조해테 로 사이클 유도체 화합물을 선별하였다 .
<30>
<3i> 본 발명에서 "KRS" , "KRS 단백질 또는 "KRS 폴리펩티드' '는 라이실 tRNA 합성 효소로 알려져 있는 플리펩티드를 말한다. 상기 KRS 플리펩티드는 당업계에 알려진 KRS 폴리 펩티드일 수 있으나 , 바람직하게는 Genbank Accessi on No . NP_005539에 표 시된 아미노산 서 열을 갖는 플리펩티드일 수 있다 . 또한 본 발명의 KRS는 이의 기 능적 동등물을포함한다.
<32>
<33> 본 발명에서 기능적 동등물이란 Genbank Accession No. NPJ305539에 표시된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상， 바람직하게는 80% 이상， 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성 (즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, Genbank Accession No. NP_005539 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 생리 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서， "실질적으로 동질의 생리활성' '이란 원형질막의 라미닌 수용체와 상호작용하며， 암 전이 또는 암 세포 이동을 조절하는 것을의미한다.
<34>
<35> 본 발명에서 "라미닌 수용체'' 또는 "67 kDa의 라미닌 수용체 (67LR)"는 원형 질막에 포매된 (embedded) 비 -인테그린형 수용체로서 예를 들어， Genbank Accession No. NM_002295, S37431, AF284768, S37431, AF284768, J03799, XPᅳ 370865, XP_001083023.에 기재된 염기서열 또는 아미노산서열을 가질 수 있다. 또한 본 발 명에서 라미닌 수용체는 이의 기능적 동등물을포함한다.
<36>
<37> 본 발명에서의 KRS 및 67LR의 상호작용의 저해는 당업계에 공지된 단백질-단 백질 상호작용의 검출 방법을 이용할 수 있으며， 예를 들어， 시험관 내 단백질一단 백질 결합 어세이 (시험관 내 풀 -다운 어세이), 腿 SA(electrophoretic mobility shift assays), 단백질 결합을 위한 면역어세이， 기능적 어세이 (인산화 어세이 등 ), 비면역침전 어세이， 면역침전 웨스턴 블¾ 어세이, 면역-공동-위치화 어세이 (immuno-co-localization) , 교차결합 (cross-linking) , 친화크로마토그래피 (affinity chromatography) , 면역침강법 (immunoprecipitation, IP), 이스트 투 하 이브리드 (yeast two-hybrid, Y2H), 형광공명에너지전이 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) , 분할 단백질의 재결합 (bimolecular fluorescence complementation, Bi-FC) 등당업계에 공지된 다양한방법으로수행될 수 있다.
<38>
<39> 본 발명의 화합물의 스크리닝 방법은 예를들어 , 박테리아리프레서 LexA또 는 효모 GAL4의 DNA-결합 도메인 및 호모 GAL4 단백질의 트랜스액티베이션 (transact ivato ) 도메인에 각각 융합된， KRS와 67LR, 또는 이들 단백질의 일부 또 는 상동체 (homologues)를 발현하는 효모를 이용하여 효모 -2 하이브리드 어세이를 수행할 수 있다 (KIM, M. J. et al., Nat. Gent. , 34:330-336， 2003) . KRS와 67LR의 상호작용은 LexA 단백질 또는 GAL4의 DNA-결합 도메인에 결합된 조절 서열을 가지 고 있는 프로모터의 통제 하에서 리포터 유전자의 발현을 유도하는 트랜스액티베이 터를 재구성하게 한다.
<40>
<41> 상기 리포터 유전자로는 위에서 기재한 바와 같이 당업계에 공지된 임의의 검출가능한 풀리펩티드를 암호화하는 유전자 (예: CAKchloraniphenicol acetyltransferase), 루시퍼라제， 베타-갈락토시다제， 베타-글루코시타제， 알칼린 포스파타제 및 GFP(green fluorescent protein) 등 를 사용할수 있다. 만약 KRS와 67LR, 또는 이들 단백질의 일부 또는 상동체의 상호작용은 시험 제제에 의해 촉진 되거나 강화되는 경우, 상기 리포터 유전자의 발현은 정상 조건에 비해 더욱 증가 된다. 반대로， 상기 상호작용이 시험 제제에 의해 저해되거나 약화되는 경우， 상기 .리포터 유전자는 발현되지 않거나정상조건에 비해 덜 발현된다.
<42>
<43> 또한 리포터 유전자로는 효모의 성장을 가능하게 하는 단백질 (즉 , 상기 리포 터 유전자가 발현되지 않을 때 효모의 성장이 억제된다)을 암호화하는 것으로 선택 될 수 있다. 예를 들면， 아미노산또는 질소 염기를 위한 생합성 과정에 관계 있는 호소를 암호화하는 영양요구성 (auxotropic) 유전자 (예: ADE3, HIS3 등의 효모 유전 자 또는 다른 종 유래의 동등 유전자)일 수 있다. 이 시스템에서 발현된 AIMP2와 P53, 또는 이들 단백질의 일부 또는 상동체의 상호작용은 시험 제제에 의해 억제되 거나 약화되는 경우， 리포터 유전자는 발현되지 않거나 덜 발현된다. 따라서， 상기 조건 하에서 효모의 성장은 정지되거나 느려진다. 이러한 리포터 유전자의 발현에 의한효과는육안이나장치 (예: 현미경)를통하여 관찰될 수 있다.
<44>
<45> 본 발명에서는 상기 스크리닝 방법을 이용하여， 화합물 라이브러리를 '스크리 닝하였고， 벤조옥사졸， 밴조싸이아졸, 벤조피를 유도체 화합물이 KRS 및 67LR의 상 호작용을 저해하여 암의 전이를 저해함으로써 암을 예방 /치료하는 효과가 있음을 확인하였다.
<46>
<47> 따라서 , 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 밴조해테로사이클유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 적 조성물을 제공한다. 1】
Figure imgf000009_0001
[상기 식에서，
는 원자가 요건에 의해 허용되는 이중결합 또는 단일결합을나타내
A는 0， NH 및 S로 이루어진 군에서 선택된 것이고;
X는 C또는 N이고;
¾은 수소, 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 알킬， 알콕시， 할로겐， 니트
Figure imgf000009_0002
및 -NH-R5로 0 루어진 군에서 선택된 것이고，
¾는수소또는 비치환되거나할로겐에 의해 치환된 알킬이고;
¾는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 아릴 또는 비치환되거나 할로겐에 의해 고;
Figure imgf000009_0003
된 것이다. <6i> "알킬''은 쇄 내에 약 1개 내지 약 20개의 탄소 원자를 포함하는， 직쇄 또는
^쇄일 수 있는 지방족 탄화수소 그룹을 의미한다. 바람직한 알킬 그룹은 상기 쇄 내에 약 1개 내지 약 12개의 탄소 원자를 포함한다. 보다 바람직한 알킬 그룹은 상 기 쇄 내에 약 1개， 2개 , 3개， 4개 , 5개 또는 6개의 탄소 원자를 포함한다. 측쇄는 하나 이상의 저급 알킬 그룹， 예를 들면， 메틸， 에틸 또는 프로필이 선형 알킬 쇄 에 부착되어 있는 것을 의미한다. "저급 알킬"은 직쇄 또는 측쇄일 수 있는 쇄 내 에 약 1개 내지 약 6개의 탄소 원자를 갖는 그룹을 의미한다. "알킬"은 치환되지 않을 수 있거나 또는， 동일하거나또는 상이할 수 있는 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있고，각 치환체는 할로겐， 알킬， 아릴， 사이클로알킬， 시아노， 하이드톡시， 알콕시， 알킬티오, 아미노, 카르복시 등일 수 있다. 바람직하게 알킬 은 메틸， 에틸， 부틸 또는 이소부틸일 수 있다..
<62>
<63> "알콕시 ' '는 알킬 그룹이 앞서 기재된 바와 같은， 알킬 -0-그룹을 의미한다.
적합한 알콕시 그룹의 예로는 메톡시， 에특시， n-프로폭시， 이소프로폭시 및 n-부 록시를 포함한다. 모 잔기에 대한 결합은 산소를 통한다. 바람직하게는 알콕시는 메톡시 또는 에특시일 수 있다.
<64>
<65> "아릴 "은 방향족 탄화수소 고리계를 의미하며， 이의 예로는 페닐， 인데닐， 인다닐, 나프틸 및 플루오레닐 등이 있다.
<66>
<67> "할로겐"은 블소 원자， 염소 원자， 브름 원자 및 요오드 원자를 포함할 수 있고, 바람직하게는불소원자， 염소원자또는브롬 원자일 수 있다.
<68
<69> "할로겐에 의해 치환된 알킬"은 1 내지 3개의 할로겐 원자 (들)에 의해 치환 된 알킬기를 의미하며, 예를 들어, 폴루오로메틸， 클로로메틸， 디플루오로메틸, 디 클로로-메틸， 디브로모메틸， 트리풀루오로메틸, 트리클로로메틸， 플루오로에틸, 클 로로에틸, 트리플루오로에틸, 트리클로로에틸, 플루오로프로필 , 플루오로부틸 , 플 루오로핵실 등이고， 바람직하게는 할로겐으로 치환된 (CI— C6)알킬, 더욱 바람직하 게는 염소 또는 불소로 치환된 (C1-C6)알킬일 수 있다. 가장 바람직하게는 트리플 루오로메틸일 수 있다.
<70>
<71> "할로겐에 의해 치환된 아릴1 '은 1 내지 3개의 할로겐 원자 (들)에 의해 치환 된 아릴기를 의미하며， 예를 들어 , 폴루오로페닐， 디플루오로페닐， 트리풀루오로페 닐， 클로로폐닐, 디클로로페닐, 트리클로로페닐， 브로모페닐, 디브로모페닐, 트리 브로모페닐， 디풀루오로벤질, 디클로로벤질， 디브로모벤질 등이 있으며， 바람직하 게는클로로페닐일 수 있다.
<72>
<73> "알킬에 의해 치환된 아릴 " 또는 "아릴알킬 ' '은 1 내지 3개의 알킬 치환체에 의해 치환된 아릴기를 의미하며, 예를 들어, 벤질， 에틸페닐， 프로필페닐， 디메틸 페닐， 디에틸페닐， 트리메틸페닐， 트리에틸페닐 등이 있으몌 바람직하게는 벤질일 수 있다.
<74>
<75> 바람직하게 본 발명의 화합물은 화학식 1에서 은 수소, 메틸 트리풀루오 로메틸, 메록시， 에특시 , 클로로， 니트로 또는 아민일 수 있고， ¾는 수소， 2,4,6- 트리메틸 ,6-Trimetliyl-phenyl), 2, 6-디메특시페닐 (2,6— Dimethoxy-
phenyl),
Figure imgf000011_0001
， 또는 -NH-R5로서， ¾는 수소 또는 트리플루오로메틸이고， ¾는 페닐 (Phenyl), 4-에틸 -페닐 (4-Ethyl-phenyl) , 3， 4-디 클로로 -페닐 (3,4-Dichloro-phenyl), 4-페닐아조 -페닐 (4— Phenylazo-phenyl)일 수
있다. 또한, Rs는수소,
Figure imgf000011_0002
일 수 있다ᅳ
<76>
<77> 보다 구체적으로， KRS 및 67LR의 상호작용을 저해하여 항암 효과를 보이는 것으로 확인된 화합물 및 이의 출처는 다음과표 1과같다.
<78>
<79> 【표 1】 한글명칭 영문명칭 화합물 참고문헌 또는 등록번호
N-(6-메특시 -벤조 N- (6-Met hoxy—benz Pandeya, Surendra N.； Shankar , Vinod. 옥사졸—2—일) -벤 ooxazol-2-yl )-ben Synthesis of benzothiazole
자마이드 zamide derivatives and their insect icidal and larvicidal activities. Indian Drugs (1985), 23(3)， 146-51.
C0DEN: INDRBA ISSN:0019-462X. CAN 104:124989 AN 1986:124989 CAPLUS
N-(5-메특시 -벤조 N- ( 5-Methoxy-benz Pandeya , Surendra N.； Shankar , Vinod. 옥사졸 -2-일) -벤 ooxazol-2-yl )—ben Synthesis of benzothiazole
자마이드 zamide derivatives and their insect icidal and larvicidal activities. Indian Drugs (1985), 23(3), 146-51.
C0DEN: INDRBA ISSN:0019-462X. CAN 104:124989 AN 1986:124990 CAPLUS
(5-클로로—벤조옥 (5—Chlor으 benzoox Yoon, Ju Hee; Song, Hyunmin; Kim, 사졸 -2-일)—페닐— azol -2-y 1 ) -pheny 1 Sang Wong; Han, Gyoonhee； Choo, 아민 -amine Heaᅳ Young Park. A faci le' synthesis of 2ᅳ aminothiazolo [5, 4HD] pyridines and 2-aminobenzoxazo 1 es via
cyclization of thioureas.
Heterocycles (2005), 65(11), 2729-2740. C0DEN: HTCYAM
ISSN :0385-5414. CAN 144:88204 AN 2005:1225849 CAPLUS
(5-클로로—벤조옥 ( 5-Ch 1 or o— benzoox Yoon, Ju Hee; Song, Hyunmin; Kim, 사졸 -2-일) -(4-에 azol-2-yl)-(4-eth Sang Wong; Han, Gyoonhee； Choo, 틸-페닐) -아민 y 1 -pheny l)-amine Heaᅳ Young Park. A faci le synthesis of 2-arainothiazolo[5,4-b]pyridines and 2-am inobenzoxazo 1 es via
cyclization of thioureas.
Heterocycles (2005) , 65(11), 2729-2740. C0DEN: HTCYAM
ISSN :0385-5414. CAN 144:88204 AN 2005:1225849 CAPLUS (5-클로로-벤조옥 (5-Chloro-benzoox Yoon, Ju Hee; Song, Hyunmin; Kim, 사졸 -2-일) -(3,4- azol-2-yl)-(3,4-d Sang Wong； Han, Gyoonhee； Choo, 다이클로로- ichlor o-pheny 1 ) _a Hea-Young Park. A faci le synthesis 페닐) -아민 mine of 2-aminothiazolo[5,4-b]pyridines and 2-am i nobenzoxazo 1 es via
cyclization of thioureas.
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(5-니트로-벤조옥 ( 5-N i t ro-benzooxa Park, Choo Hea Young! Chang, Hyeun 사졸 -2-일) -(4-페 zol-2-yl)-(4-phen ook; Yoon, Ju Hee; Ju, Hye Kyung. 닐아조-페닐) -아 ylazo-phenyl )—ami Method for inhibiting 5-1 ipoxygenase 민 ne using a benzoxazole derivative or an analogue thereof . U.S. Pat . Ap l . Publ. (2004) , 11 pp. C0DEN: USXXC0 US 2004198768 Al 20041007 CAN 141:332184 AN 2004:825136 CAPLUS
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N-(6-니트로 -벤조 N-(6-Nitro-benzot Song, Eun Young; Kaur , Navneet； Park, 싸이 아졸 -2- hiazol-2-yl )-4-tr Mi -Young; Jin, Yinglan; Lee, Kyeong； 일) -4-트리플루오 i f luoromethyl— ben Kim, Guncheo 1； Lee, Ki Youn; Yang, 르메틸-벤자마이 zamide Jee Sun; Shin, Jae Hong; Nam,
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Gyoon ee . Synthesis of amide and urea derivat ives of benzothiazole as Raf-1 inhibi tor . European Journal of Medicinal Chemistry (2008) , 43(7)， 1519-1524. CODEN: EJMCA5 ISSN :0223-5234. CAN 149:267949 AN 2008:798757 CAPLUS
[2-(5-메틸—벤조 [2-(5-Methyl-benz 1004065-64-8
옥사졸 -2-일) -페 ooxazol-2-yl)-phe
녹시 1-아서ᅵ트산 noxvl -acet ic acid
2-(2 ,4，6-트리 메 2-(2,4,6-Trimethy 1019441-52-1
틸-페닐) -벤조옥 1 -phenyl )-benzoox
사좀 -5-¾아1? 1 azol-5-vl amine
2-[2-(4-메틸-벤 2-[2-(4-Methyl-be 1043705-09-4
조일이미노) -벤조 nzoyl imino)ᅳ benzo
싸이아졸 -3-일 ] - t iazol-3-yl]-but
튜티릭산 vric acid 16 2-(2,6-다이메특 2-(2,6-Dimethoxy- Choi , Suk一 June; Park, Hyen Joo; Lee, 시-페닐) -벤조싸 phenyl )-benzothi a Sang Kook; Kim, Sang Woong; Han, 이아졸 zole Gyoonhee； Choo, Heaᅳ Young Park.
Solid phase combinatorial synthesis of benzothiazoles and evaluation of topoisomerase II inhibitory activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry (2006), 14(4) , 1229-1235. C0DEN: BMECEP I SSN： 0968-0896. CAN
144:163516 AN 2006:19703 CAPLUS
17 (2-클로로 -4-플루 (2-Chloro-4-fluor 1048142-01-3
오로-벤질) -(5-플으 benzyl )-(5-f luo
루오로 -1H- r으 IH- i ndo 1-3-ylm
인돌 -3-일메틸) - ethyl)— amine
아 ?1
<80>
<81> 【화학식 2】
Figure imgf000015_0001
<83> 【화 식 3】
Figure imgf000015_0002
<85> 4】
Figure imgf000015_0003
<87> 【화학식 5】
Figure imgf000016_0001
<92>
<93> 【화학식 8】
Figure imgf000016_0002
<95> 【화학식 9]
Figure imgf000016_0003
<97> 【화학식 10]
Figure imgf000016_0004
<99> 【화학식 11】
Figure imgf000017_0001
<101>
Figure imgf000017_0002
<103> 【화학식 13】
Figure imgf000017_0003
<i05> 【화학식 14】
Figure imgf000017_0004
<107> 【화학식 15】
Figure imgf000017_0005
<109> 【화학식 16】
Figure imgf000018_0001
<in> 【화학식 17】
Figure imgf000018_0002
<112>
<113>
<H4> 보다 구체적으로는 본 발명은 화학식 2의 N-(6-메특시 -벤조옥사졸 -2-일) -벤 자마이드 (N-(6-Methoxy— benzooxazol-2— yl)-benzamide), 화학식 3의 N_(5-메특시- 벤조옥사졸 -2-일) -벤자마이드 (N-(5-Methoxy-benzooxazol-2-yl)-berizami(le) , 화학 식 4의 (5-클로로 -벤조옥사졸 -2-일) -페닐 -아민 ((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)- phenyl-amine), 화학식 5의 (5—클로로 -벤조옥사졸 -2-일) -(4-에틸-페닐) -아민 ((5- Ch 1 or o-benzooxazo 1 -2-y 1 )- ( 4-et hy 1 -phenyl ) -am i ne ) , 화학식 6의 (5-클로로-벤조옥 사졸 -2—일) -(3 , 4—다이클로로-페닐；)—아민 ( (5-Chloro-benzooxazol -2-yl )-(3,4- dichloro-phenyD-amine), 화학식 7의 (5-니트로 -벤조옥사졸 -2-일) -(4-페닐아조-페 닐)一아민 ( ( 5-N i t r o-benzooxazo 1 -2-y 1 ) - ( 4-pheny 1 azo-pheny 1 ) -am i ne ) , 화학식 8의 N-벤조옥사졸 -2-일 -벤자마이드 (N-Benzooxazol-2-yl-benzamide), 화학식 9의 N— (5一 니트로 -벤조옥사졸—2-일) -벤자마이드 (N-(5-Nitro-benzooxazol-2-yl)-benzamide), 화학식 10의 N-(5-메특시ᅳ벤조옥사졸 -2-일) -벤자마이드 (N-(5-Methoxy- benzooxazol-2-yl )-benzamide) , 화학식 11의 Ν-(5—메틸 -벤조옥사졸 -2-일 ) -벤자마이 드 (Ν— (5— Methyl-bexizooxazol-2ᅳ yl)-benzai de), 화학식 12의 N-(6-니트로-벤조싸 이아졸 -2-일) -4-트리플투오르메틸 -벤자마이드 (N-(6-Nitro— benzothiazol-S-y - - trifluoromethyl— benzamide), 화학식 13의 [2-(5-메틸 -벤조옥사졸 -2-일) -페녹시] - 아세트산 ( [2- ( 5-Methy 1 -benzooxazo 1 -2-y 1 )-phenoxy ] -ace t i c acid), 화학식 14의
2- (2， 4， 6-트리메틸-페닐) -벤조옥사졸 -5-일아민 (2-(2 ,4,6-Tr i methyl -phenyl ) - benzooxazol-5-ylamine), 화학식 15의 2-[2-(4-메틸-벤조일이미노) -벤조싸이아졸ᅳ
3-일] -뷰티릭산 ( 2- [ 2- ( 4-Me t hy 1 -benzoy limino) -benzot hiazol-3-yl] -but yr i c acid), 화학식 16의 2-(2, 6-다이메특시-페닐) -벤조싸이아졸 (2-(2,6_D iethoxy- p enyD-benzothiazole) 및 화학식 17의 (2-클로로 -4-플루오로-벤질) -(5-플루오로- 1H-인돌 -3-일메틸) -아민 ((2— Chloro-4-fluoro-benzyl)-(5-fluor(-lH-indol-3- ylmethyD-amine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
<115> 본 발명의 스크리닝 방법을 통하여 스크리닝되는 화합물은 1차 종양 세포의 전이를 억제하므로 다양한 암에 적용할 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 예를 들 어 대장암, 폐암， 간암, 위암， 식도암, 췌장암， 담낭암， 신장암， 방광암, 전립선 암， 고환암, 자궁경부암， 자궁내막암， 융모암， 난소암, 유방암, 갑상선암， 뇌암， 두경부암， 악성흑색종， 림프종， 재생불량성 빈혈일 수 있다. 아을러， 상기 암 예방 및 치료는 본 발명의 KRS 및 67LR의 상호작용의 저해로 암 세포의 이동 또는 전이 가감소하므로 암세포의 전이를 억제하는 것에 의해 수행된다.
<116>
<117> 본 발명의 화합물은 그 자체 또는 염 , 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에서 '약학적으로 허용가능한'이란 생리학적 으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반웅 또는 이와 유사한 반웅을 일으키지 않는 것을 말하몌 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한유리산
(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산 과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나， 구연산, 초산， ¾산， 주석산， 말레인산， 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산， 트리플로 오로아세트산， 벤조산， 글루콘산， 메타술폰산， 글리콜산， 숙신산, 4-틀루엔술폰산， 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아 니나， 염산, 브름산， 황산및 인산을포함한다.
<118>
<119> 본발명의 화합물 또는 이를 포함하는 조성물을 임상적으로투여되는 경우에 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여에 적합한 단위투여형의 약제학적 제 형으로 제제화시켜 사용할 수 있다. 일반적인 의약품의 형태로 제제화할 경우에는 보통 사용하는 층진제， 증량제， 결합제, 습윤제， 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제， 환제， 산제, 과립제， 캡슐제 등이 포함되며， 이러한 고형 제제는 본 발명의 화합물에 적 어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘， 수크로스 또는 락토오스， 젤 라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제， 내용액제, 유 제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 회석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외 에 여러 가지 부형제， 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제， 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제， 유제, 동 결건조제제， 연고제, 크림제가 포함된다. 비수성용제， 현탁용제로는 프로필렌글리 콜， 폴리에틸렌 글리콜， 올리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸올레이트와 같은주 사가능한 에스테르등이 사용될 수 있다.
<120>
<121> 또한， 본 발명의 화합물 또는 이를 포함하는 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며， 비경구 투여는 피하주사， 정맥주사， 근육내 주사또는 흉부내 주사주입방 식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 화학식 1 내 지 화학식 17의 화합물을 안정제 또는 완충제와 함깨 물에서 흔합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다. 투약 단위는， 예를 들면 개별 투약량의 1， 2， 3 또는 4배로， 또는 1/2， 1/3 또는 1/4배 를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양 을 함유하며， 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2， 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 특 정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이， 투여 시간， 투여방법 및 배설 그리고 약제 흔합 및 질환의 증증도에 따라 변화시킬 수 있다.
<122>
<123> 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌
(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, East on, Pennsylvania 18042 , Chapter 87: Blaug, Seymour)어 1 기재되어 있다.
<124>
<125> 아을러， 상기한바와 같이 본 발명의 화합물은 KRS및 67LR의 상호작용을 저 해하여 1차 종양 세포 또는 암세포의 이동이나 전이가 잘 이루어지지 못하도록 하 므로 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유호성분 으로 포함하는 암 전이 저해용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 화합물은 화학식 1 내지 화학식 17로 기재된 화합물의 하나일 수 있다.
<126>
<127> 한편， 본 발명의 조성물은본 발명의 화합물, 즉 화학식 1 내지 화학식 17로 기재된 화합물을 0.001 내지 99.999증량 담체를 99.999 내지 0.001중량 %로 함유 한조성물일 수 있다. 상기 담체는 약학적으로 허용 가능한담체일 수 있다.
<128>
<129> 나아가， 본 발명의 약학적 조성물은 암을 예방 및 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물 또는 암 전이를 억제하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할수 있다.
<130>
<131> 본 발명은 화학식 1로 표시되는 벤조헤테로사이클 유도체 또는 이의 약학적 으로허용가능한 염의 암 예방 및 치료제 제조를위한용도를 제공한다.
<132> 또한 본 발명은 화학식 1로 표시되는 벤조헤테로사이클 유도체 또는 이의 약 학적으로 허용가능한 염의 암전이 저해제 제조를위한용도를 제공한다.
<133> 또한 본 발명은 화학식 1로 표시되는 벤조헤테로사이클 유도체 또는 이의 약 학적으로 허용 가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 것을 특 징으로 하는 암 예방 및 치료 방법을 제공한다.
<134> 또한본 발명은 화학식 1로표시되는 벤조헤테로사이클 유도체 또는 이의 약
. 학적으로 허용 가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 것을특 징으로 하는 암 전이 저해 방법을 제공한다.
<135> 상기 벤조헤테로사이클 유도체는 화학식 1 내지 화학식 17로 기계된 화합물 의 하나일 수 있다.
<136>
<137> 본 발명의 벤조헤테로사이클 유도체 및 이의 약학적으로허용가능한 염은유 효량으로 경구， 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량1 이란 환자에게 투여하였을 때， 암의 치료 및 예방 효과 또는 암 전이 억제효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 '개체 (subject)'란 동물, 바 람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포， 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료가 필요한환자 (patient)일 수 있다.
<138> 상기 본 발명의 벤조해테로사이클 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염 은 그 자체를 그대로 투여하거나상술한 바와 같은 여러 제형으로 제조되어 투여될 수 있으며, 바람직하게는 원하는 효과 즉， 암 예방 및 치료 효과 또는 암 전이 억 제효과가 도출될 때까지 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 이의 약학적으로 허 용가능한 염은 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 경로로 투여될 수 있다. 즉， 경구 또는 비경구， 예컨대 구강， 근육내， 정맥내， 피내， 동맥내, 골수내， 경막내， 복강내, 비강내， 질내, 직장내， 설하또는 피하 투여되거나， 위장관， 점막 또는호 흡기로 투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 피부에 직접적으로 도포하는 방법 또는 상기 폴리펩티드를 주사용 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부 아래층에 일정량을 주입하거나 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자 (prick)하는 방법으로 투여될 수 있다. 바람직하게 는 피부에 직접 도포될 수 있다. 또한 본 발명의 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 표적 세포나 조직 (예: 피부 세포나 피부 조직)에 고친화성 결합을 유 발하는 분자와 결합되거나 상기 분자 내에 캡술화된 형태로 투여될 수도 있다. 본 발명의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 당업계에 공지된 기술을 이용 하여 스테를 (예: 콜레스테롤), 지질 (예: 양이온 지질, 비로좀 또는 리포좀) 또는 표적 세포 특이적 결합제 (예: 표적세포 특이적 수용체에 의해 인지되는 리간드)와 결합될 수 있다. 적합한 커플링제 또는 가교제로는 예컨대 단백질 A, 카보디이미 드, N-숙신이미딜 -3-(2-피리딜디티오)프로피오테.이트 (SPDP) 등을포함할수 있다. <139> 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌 (Rej 'ngton's
Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, East on, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
<140>
<141> 참고로， 본 명세서에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문 헌을 참조할 수 있다 (Maniatis et al .， Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor , N.Y. (1982)； Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)； Deutscher , M. , Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol . 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)) .
<142>
<143> 본 발명에 기재된 도면에 대해서 다음과 같이 설명한다.
<144>
<145> 도 1내지 도 6은 인간 KRS와라미닌 수용체의 특이적 상호작용을 확인한 것 이다. 도 1에서, 전체 길이의 인간 KRS와 37LRP/p40간의 상호작용은 이스트 투 하 이브리드 분석을 통하여 수행되었다. 다중 -ARS 복합체의 두 구성요소인 AIMP1 및 AIMP2는 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용되었다. 양성 상호작용은 X-gal을 함유 한 효모배지에서 청색 콜로니의 형성에 의해 표지되었다. 도 2에서, 37LRP는 35S 메티오닌의 존재하에서 in vitro 번역에 의해 합성되었고， 이들을 GST-KRS 또는 GST와 반응하였다 (puU-down) . GSTᅳ KRS와 공침전된 (co-precipitated) 37LRP은 자가 방사촬영법을 이용하여 측정하였다. 도 3에서 KRS 및 37LRP의 상호작용에 연관된 펩티드 부위는 이스트 투 하이브리드 분석을 통하여 측정되었다. N말단의 세포내 부위 (54 내지 113번째 아미노산) 및 C말단의 세포외 부위 (137 내지 210번째 아미노 산)를 가지고 있는 296개 아미노산을 가진 37L P는 막간 도메인 (113 내지 137번째 아미노산)에 의해 구분되어 진다. 인간 KRS(597개의 아미노산)의 N말단 특이적 확 장 (약 70개의 아미노산)부위 다음에 OB-fold 안티코돈-결합성 도메인 (약 70 내지 214 아미노산)과 촉매 도메인 (약 220 내지 574 아미노산)이 위치해 있다. 도 4에 서， Myc-KRS에 감염된 A549 세포를 용해하여 표시된 항체로 면역블롯을 실시하였다 (WCL ： whole cell lysate) . 세포는 세포질 및 막분획으로 나누었고, 항 -Myc 항체 로 면역침전하였다. 그리고， 67LR 및 37LRP의 공침전은 웨스턴 블¾으로 확인하였 다. IgG는 대조군으로 사용하였다. 도 5에서, Myc-KRS로 감염된 A549 세포의 용해 물을 지시한 항체로 웨스턴블롯을 시행하였다. 세포는 세포질 (C) 및 막 분획 (M)으 로 분리되어 항 -Myc 항체로 면역침전되었고， 37LRP 및 67LR로 공침전된 것은 웨스 턴블롯으로 조사하였다. 대조군으로서 IgG를 사용하였다. 도 6에서 KRS 및 67LR의 라미닌-의존성 상호작용을 공침전으로 확인하였다. 라미닌 (10yg/nil, lh) 처리했 을 경우, 67LR과 KRS 간의 결합이 늘었음을 확인하였다. 이를 보기 위해, 67LR를 인식하는 antibody (abeam, cat # ab2508)로 면역침전 ( imunoprecipitation)을 하였 고, 왼쪽의 IgG라벨은 토끼 으로부터 얻은 전체 IgG(total IgG)로서 음성대조군으 로 사용되었다. 1(» SDS PAGE를 수행한 다음， PVDF 막에 옮긴 뒤， KRS와 67LR을 인식하는항체로각각면역블럿을하였다.
<146>
<147> 도 7 내지 도 12는 라미닌-유도성 막 전좌 (trans location) 및 KRS의 인산화 에 대해서 확인한 것이다. 도 7에서， A549 세포를 라미닌 (lOiig/ml)으로 처리하여 웨스턴블릇을 이용하여 67LR, 37LRP 및 KRS의 양 (level)을 시간대별로 관찰하였다. HsP90 및 케드헤린 (Cad)을 각각 세포질 및 막의 마커로 사용하였다. 도 8에서， A549 세포를 1시간동안 라미닌으로 처리， 또는 무처리하여 항 -67 LR(MLuC5, Santacruz, sc-59732) (적색) 및 KRS 항체 (녹색)을 사용하여 면역형광염색을 실시하 였다. 도 9에서, A549 세포를 PLC-감마， PKC 및 PI3K를 각각 억제하는 U73122(U), 스타우로스포린 (staurosporin, ST) 및 LY294002(LY)로 3시간동안 처리하고 라미닌 으로 1시간동안 처리한후， 이들 인산화효소 억제제가 67LR 및 KRS의 세포질 및 막 에 어떠한 영향을 끼치는지를 확인하였다 . 도 10에서， A549세포를 Myc-KRS로 감염 시켜 24시간동안 배양하였다. 이후, 표시된 (indicated) 약물로 처리하고， 상기와 같이 라미닌으로 처 리하였다. Myc-KRS을 면역침전하고, 항 -p-Thr , -Ser , 및 -Tyr 항체로 면역블롯을 실시하였다. 도 11에서 , A549 세포 세포를 Myc-KRS로 감염시켜 24시간동안 배양하였다. 감염된 세포를 LY294002로 3시간동안 전처리하고 , 라미닌 으로 1시간동안 처리하였다. Mycᅳ KRS는 면역 침전되었고， 67LR의 공침전은 웨스턴블 릇으로 조사하였다. 면역침전법의 대조군으로서 IgG를 사용하였다. 도 12에서， 상 기한 바와 같이 A549세포를 라미닌 및 LY294002의 존재 또는 부재 하에 배양하였 다. EPRS(glutamyl-prolyl-tRNA synthetase)는 이에 특이적 인 항체 (AbCam)와면역침 전되 었고， KRS의 공침전은 웨스턴블롯으로 확인하였다 (상) . 면역 -소진 상층액 ( mune-depleted supernatant： ID)으로 항 -KRS 및 EPRS 항체와 웨스턴블롯을 수행 하였다.
<148>
<149> 도 13 내지 도 17은 막—결합 67LR의 수준 ( level )은 KRS에 의존한다는 점을 확인한 것이다. 도 13에서 , A549 세포를 EV 또는 KRS 또는 si-대조군 (si-cont ) 또 는 si-KRS로 감염시키고， 세포를 세포질과 막 분획으로 나눈 다음 각각의 분획에서 의 67LR 및 KRS의 양을 웨스턴블롯으로 확인하였다 . 케드헤린 (적색 ) 및 hsp90을 각 각 세포막 및 세포질의 마커로 사용하였다. 도 14에서， EV (공백터 ) 또는 KRS로 감 염시 킨 A549 세포를 G418로 1주일간 선별하고 항 -LR 항체 (MluC5)를 이용한 면역형 광 염색을 이용하여 67LR의 세포내 분포를 확인하였다 . 막에 분포한 LR은 화살표로 강조하였다. 도 15에서， A549 세포에 있어서 막-결합성 67LR의 양은 항 -LR 항체 (MluC5)를 이용하여 유세포 분석기로 관찰되었다. 공백터 또는 KRS 플라스미드로 감염된 세포들을 24시간동안 배양하였다. (상) 67LR의 양에 있어서 KRS 억제의 효과 를 보기 위하여， 세포를 si-KRS 또는 si-대조군로 감염시키고 48시간동안 배양하였 다. (하) 도 16에서 , 67LR의 세포적 안정성에 있어서 KRS의 중요성은 필스—체이스 실험을 통하여 조사되 었다. 293 세포를 si-KRS 또는 si-대조군로 감염시키고 방사 성 메티오닌을 1시간동안 반웅시켰다 . 67LR을 67LR에 특이적으로 반웅하는 항체 (F- 18 , Santacruz)와 면역침전 시키고, SDS-PAGE에 의해 분리시킨 후， 자가방사촬영법 을 실시하였다. 특이성 siRNA에 의한 KRS의 억제는 웨스턴블롯에 의해 수행되었으 몌 로딩 대조군으로서 튜불린을 사용하였다.
<150>
<151> 도 17 내지 도 20은 KRS는 67LR을 통하여 세포 이동 (cel l migrat ion) 및 암 전이를 촉진한다는 점을 확인한 것이다. 도 17에서， A549 세포를 표시된 (indicated) 플라스미드로 감염시키고 라미닌의 부존재 (도 21) 또는 존재 (도 17) 하에서 배양하였고, 이들의 세포 이동에 대한 효과는 트렌스웰 챔버에서 이동한 세 포를 측정하여 확인하였다. 막을 통과한 세포의 수를 계수하여 각 패널에 표시하였 다. 실험은 3희 반복하였다. 도 18에서 , 상기와 같이 처 리한 세포들을 MMP-2의 활 성 및 양 측정을 위하여 각각 자이모그래피 (상) 및 웨스턴블롯 (중)을 실시하는데 사용하였다. 액틴은 로딩 대조군으로 사용하였다. 도 19에서， 유방암 세포주인 4T- 1 세포를 표시된 (indicated) siRNA로 감염시키고 , Balb/C 마우스의 등에 피하주사 하였다. 27일 경과후， 마우스의 폐를 적출하여 직경 1醒 이상의 종양 결절을 계수 하였다. 도 20에서， 외 인성 KRS(KRS-1, 및 KRS-2)를 발현하는 2종의 서로 다른 4T- 1 세포를 상기와 같이 접종하고 4-5주 경과후 종양 결절을 계수하였다. 공백터를 감염시킨 세포를 대조군으로 사용하였다 .
<152>
<153> . 도 21 내지 도 24는 세포이동， 단백질 합성 및 세포주기에 있어서 세포내 및 세포외 KRS의 효과를 확인한 것 이다. 도 21에서， 라미닌 부존재 하에서 배양된 A549 세포의 이동은 트렌스웰 챔버에서 이동한 세포를 측정하여 도 17에서와 같이 확인하였다. 도 22에서， KRS의 세포외 화학주성적 (chemotactic) 활성을 보고자, 표 시된 농도로 KRS를 함유한 무혈청 배지를 트랜스웰 챔버의 아래 챔버에 넣고， A549 세포를 위 챔버에 넣어 배양한 다음 이동한 세포를 계수하였다 . 도 23에서， A549 세포에서 KRS의 양은 siRNA와 외 인성 KRS의 도입에 의해 하락 조절 또는 상승 조절 되 었다. 감염된 세포는 각각 48시간 및 24시간 배양되고 무-메티오닌 배지 에서 1시 간동안 배양하여 영양결핍상태를 만든 후 방사성 표지가 된 메티오닌으로 2시간동 안 표지하였다. 세척후, 세포를 4시간동안 배양하고 0.5% 트리톤 X-100 용해 액으로 용해시키고 방사성 활성을 액상 섬광 계수기 ( l iquid scinti l lat ion count ing)로 측 정하였다. 도 24에서 , A549 세포를 표시된 바와 같이 감염시키고， 고정시켜 프로피 디움 아이오다이드 (Propidhim iodide)로 염색하여 유세포 분석기에서 분석하였다.
<154>
<155> 도 25 내지 도 27은 암 전이에 있어서 K S 억제의 효과를 확인한 것이다. 도
25에서， 표적 단백질의 발현에 있어서 si-KRS 및 si-DRS의 효과는 웨스턴블롯에 의 해 조사되었다. 로딩 대조군으로서는 튜불린을 사용하였다. 도 26에서， siRNA가 감 염된 세포 (1 X 106)을 상기의 방법과 같이 주사하였고 , 21일 경과 후 종양의 크기 및 부피를 측정함으로써 1차 종양 증식에 있어서 KRS 및 DRS 억제의 효과를 조사하 였다. 각각의 그룹은 6마리 의 마우스를 사용하였다 (도 19에서 1마리 , 도 27에서 5 마리 표시 ) . 도 27에서， 상기의 마우스에서 적출된 폐는 10% 포르말린 용액에 고정 되 었다. 전이성 종양 결절 및 수는 보여지는 바와 같다.
<156>
<157> 도 28 내지 도 30은 암 전이 에 있어서 KRS 과발현의 호과를 확인한 것이다.
도 28에서， KRS-1 및 KRS-2세포주의 과발현은 웨스턴블롯에 의해 관찰되었다 . 도 29에서， 1차 종양 증식에 있어서의 KRS 과발현의 효과는 서로 비교되었다 . 도 30에 서 , 종양 전이에 있어서의 KRS 과발현의 효과는 접종후 30일째에 조사되었다. 각각 의 그룹은 4마리 의 마우스를 사용하였다 (도 20에서 대표적인 1마리 . 도 30에서 4마 리 표시 )
<158>
<159> 도 31 내지 도 36은 IiRS 및 67LR간의 상호작용의 화합물에 의한 저해 및
67LR의 세포내 안정성에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 31에서는 화학식 15의 화합물 (CAND-KLl , KL1) 50 y g/ml에서 표시된 ( indicated) 쌍의 단백질을 포함하는 효모 세포의 생장 저해를 나타낸다. 대조군은 DMS0를 처리한 세포의 0D값으로 나타 내었다. 도 32은 CAND-KL1의 존재 또는 부존재하에서 표시된 상호작용 쌍을 가지는 효모세포를 포함하는 웰에서의 세포 생장을 나타내는 사진이다. 도 33에서 293세포 에서 공 -면역침전에 의해 K S 및 67LR간의 상호작용에 대한 KL1의 용량-의존성 효 과를 시험하였다. 세포는 KL1으로 3시간동안 처리하고 , 67LR을 면역침전하였으며， KRS의 공-침전은 웨스턴 블¾으로 확인하였다. 도 34에서 표시된 양으로 KL1이 존 재하는 가운데， 방사선 동위원소로 합성된 라미닌 수용체를 GST— K S( l u g)과 흔합 하였다. GST-KRS를 글루타치온-세파로스 비드 (glutathione-Sepharose beads)로 침 전시키고 , 공—침전된 라미닌 수용체를 방사선 촬영 (autoradiography)으로 검출하였 다. 도 35에서는 A549세포에서 67LR 및 37LRP의 세포내 수준에 KL1이 미치는 영향 을 웨스턴 블¾으로 검사하였다. 도 36에서는 KRS 및 CAND-KL1간의 상호작용올 실 험방법에 기재된 것과 같이 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance) 방법 으로 검사하였다 . GST-KRS는 CM5 센서 칩 (CM5 Sensor Chip)에 부착하였고 , 표시된 농도 (서로다른 색으로 표시 )에서 공명 유닛 (resonance unit , RU)에 의해서 결합을 측정하였다. GST 단백질은 KRS-특이적 결합 친화도를 측정하기 위하여 대조군으로 사용하였다. 외견 결합상수 (apparent binding constant)는 BIAeva iat ion 프로그램 을 이용하여 얻었다.
<160> <161> 도 37 내지 도 43은 KRS-라미닌 수용체의 저해가 세포 이동 및 암 전이를 억 제함을 나타낸다 . 麗 P2 활성 (도 37) 및 세포 이동 (도 38 및 도 39)에 대한 KL1의 용량-의존적 효과를 측정하였다 . 세포 이동에 대해서는 세포를 KL1으로 8시간동안 처 리하였다. 도 40에서는 세포의 단백질 합성 에 대한 KL1의 효과를 확인하기 위하 여， A549 세포를 KL1으로 표시된 농도로 처리한 다음, 무-메티오닌 배지로 기아처
35
리하였다 (starved) . 그런 다음 [ S] 메티오닌을 2시간 동안 첨가하였다 . 이 후， 세 포를 완전 배지 (complete medium)에서 4시간동안 배양한 다음, 신틸레이션 계수기 로 첨가된 메티오닌의 양을 측정하였다. 도 41에서 KL1의 용량-의존적 세포 독성을 A549 세포를 이용하여 측정하였다. 도 42에서 암 전이에 대한 KL1의 효과를 상기에 기재된 방법에 따라 축정하였다 . 각각의 그룹은 6마리 마우스로 이루어 졌고， KL1은 3주 동안 1일 1회 30mg/kg의 용량으로 복강내에 주사되 었다 . 그런 다음 마우스를 희생시키고， 직경 1mm 이상의 전이된 종양 결절의 수를 계수하여， 평균을 내었다 ( 좌측) . 대표적인 폐의 사진은 우측에 나타내었다. 도 43에서 KL1을 처리한 군과 처 리하지 않은 군의 1차 종양 (pr imary tumor )을 관찰한 결과, 무게와 크기는 큰 차이 가 없는 것으로 확인하였다.
<162>
【유리한 효과】
<163> 본 발명자들은 KRS가 67LR과 상호작용함으로써 암 (또는 종양) 세포의 이동을 촉진하여 암의 전이 (metastasi s)에 영향을 미친다는 것을 규명하였으며， KRS 및 67LR의 상호작용을 저해하는 물질이 암세포의 전이를 억제하여 암을 예방 및 치료 할 수 있음을 확인하였다. 따라서 , 본 발명의 조성물은 암의 전이를 억제하므로 암 예방 및 치료를 위한 새로운 수단을 제공하여 준다.
<164>
【도면의 간단한 설명】
<165> 도 1은 인간 KRS와 37LRP/p40간의 상호작용을 이스트 투 하이브리드 분석을 통하여 확인한 것이다 .
<166> 도 2는 인간 KRS와 37LRP의 상호작용을 풀 다운 분석을 통해서 확인한 것이 다.
<167> 도 3은 인간 KRS와 37LRP의 상호작용 부위를 확인한 것이다.
<168> 도 4는 KRS의 67LR 및 37LRP와의 결합을 확인하기 위하여 Myc-KRS에 감염된
A549 세포에 대해서 항 -Myc 및 항ᅳ라미닌 수용체 항체를 이용하여 면역블롯 분석을 한 결과이다. <169> 도 5는 KRS의 67LR 및 37LRP와의 결합을 확인하기 위하여 Myc-KRS로 감염된
A549 세포의 용해물에 대한 웨스턴블릇 분석올 한 결과이다.
<170> 도 6은 라미닌 서리에 따른 KRS 및 67LR의 결합을 면역 침전으로 확인한 것 이다.
<171> 도 7은 A549 세포에 라미닌 처리시 67LR, 37LRP 및 KRS의 양 ( level )을 웨스 턴블롯으로 확인한 것이다.
<172> 도 8은 A549 세포를 라미닌으로 처리 또는 무처리시 67 LR 및 K S의 발현을 면역형광염색으로 확인한 것이다.
<173> 도 9는 인산화효소 억제제가 67LR 및 KRS의 세포질 및 막에서의 발현에 미치 는 영향을 확인한 것이다 .
<174> 도 10은 KRS를 발현하는 A549세포에서 라미닌 및 인산화효소 억제제 처리시 인산화 정도를 p-Thr , -Ser , 및 -Tyr 항체로 면역블릇을 실시하여 확인한 것이다. <175> 도 11은 K S를 발현하는 A549세포에서 인산화된 KRS의 67LR과의 결합여부를 웨스턴 블¾으로 확인한 것이다.
<176> 도 12는 KRS와 EPRS의 결합에 라미닌이 미치는 영향을 웨스턴 블¾으로 확인 한 것이다.
<177> 도 13은 s i -대조군 또는 s i-K S의 형질감염시 67L 및 KRS의 양을 웨스턴 블
¾으로 확인한 것 이다.
<178> 도 14는 EV (공백터 ) 또는 KRS로 감염시 킨 A549 세포에 대해서 67LR의 세포내 분포를 면역형광 염색으로 확인한 것 이다.
<179> 도 15는 A549 세포에 있어서 막-결합성 67LR의 양을 유세포 분석기로 확인한 것이다 .
<180> 도 16은 67LR의 세포적 안정성에 KRS이 미치는 영향을 펄스-체이스 실험으로 확인한 것이다.
<181> 도 17은 KRS 및 /또는 67LR의 발현 억제시 세포 이동에 미치는 영향을 확인한 것이다 .
<182> 도 18은 KRS 및 /또는 67LR의 발현 억제시 MMP— 2 활성 및 양을 자이모그래피 및 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다 .
<183> 도 19는 4T-1 세포주가 이식된 마우스에서 KRS발현 억제시 종양 결절의 수를 나타낸 것이다 .
<184> 도 20은 4T— 1 세포주가 이식된 마우스에서 KRS발현 증진시 종양 결절의 수를 나타낸 것 이다. <i85> 도 21은 라미닌 부존재 하에서 배양된 A549 세포의 이동을 측정한 것이다.
<186> 도 22는 세포이동에 대한 KRS의 화학주성 적 (chemotact i c) 활성을 측정한 것 이다.
<187> 도 23은 A549 세포에서 siRNA와 외 인성 KRS의 도입에 따른 KRS의 양 및 세포 내 전체 단백질 합성량을 확인한 것이다.
<188> 도 24는 A549 세포에서 siRNA와 외 인성 KRS의 도입에 따른 K S의 양 및 세포 주기를 확인한 것 이다.
<189> 도 25는 표적 단백질의 발현에 있어서 si-KRS 및 si-DRS의 효과를 웨스턴블 롯으로 확인한 것 이다.
<190> 도 26은 종양세포 이식에 따른 1차 종양 증식에 있어서 KRS 및 DRS 억제의 효과를 확인한 것이다.
<191> 도 27은 종양세포 이식에 따른 전이성 종양 결절 및 수를 확인한 것이다 .
<192> 도 28은 K S-1 및 KRS-2세포주의 KRS의 과발현을 웨스턴블롯으로 확인한 것 이다.
<193> 도 29는 종양세포 이식에 따른 1차 종양 증식에 있어서 KRS 과발현의 효과를 확인한 것이다 .
<194> 도 30은 종양세포 이식에 따른 전이성 종양 결절 및 수를 확인한 것 이다.
<195> 도 31은 본 발명의 화합물 (CAND-KLl, KL1) 50 u g/ml에서 KRS 및 67LR(KRS-
LR) ; KRS 및 AIMP2CKRS-AIMP2) ; 및 MRS 및 AIMP3(MRS-AIMP3) 단백질을 포함하는 효 모 세포의 생장 저해를 나타낸 것이다.
<196> 도 32는 본 발명의 화합물의 존재 또는 부존재하에서 효모세포의 생장을 나 타낸 것이다.
<197> 도 33은 293세포에서 공 -면역침전에 의해 KRS 및 67LR간의 상호작용에 대한
KL1의 용량-의존성 효과를 시험한 것이다.
<198> 도 34는 본 발명의 화합물의 양에 따른 KRS 및 6 LR의 상호작용을 67LR을
KRS와 공침전시켜 확인한 것이다.
<199> 도 35는 A549세포에서 67LR 및 37LRP의 세포내 수준에 본 발명의 화합물이 미치는 영향을 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다 .
<200> 도 36은 KRS 및 본 발명의 화합물간의 상호작용을 표면 플라스몬 공명
(surface plasmon resonance) 방법으로 확인한 것이다.
<20i> 도 37은 본 발명의 화합물이 MMP2 활성에 미치는 영향을 확인한 것이다.
<202> 도 38은 본 발명의 화합물이 세포이동에 미치는 영향을 확인한 것이다 . <203> 도 39는 본 발명의 화합물이 세포이동에 미치는 영향올 정량적으로 확인한 것이다.
<204> 도 40은 본 발명의 화합물이 세포의 단백질 합성 에 미치는 영향을 확인한 것 이다.
<205> 도 41은 본 발명 의 화합물이 가지는 세포 독성을 A549세포를 이용하여 확인 한 것이다.
<206> 도 42는 본 발명의 화합물이 암 전이에 미치는 영향을 확인한 것 이다 .
<207> 도 43은 본 발명의 화합물이 1차 종양의 무게 및 부피에 미치는 영향을 확인 한 것이다.
<208>
【발명의 실시를 위한 형 태】
<209> 이하， 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다.
<210> 단， 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 , 본 발명의 내용이 하기 실 시 예에 한정되는 것은 아니다.
<211>
<212> <실험 방법 >
<213> 1. 세포배양 및 재료들
<2i4> A549 및 HEK293 세포는 ATCC로부터 구입하였다 . 마우스 유방암 (mammary carcinoma) 4T-1 세포주는 김성진 박사 (가천의대 )로부터 얻었다. 10% 우태아 혈청 (Fetal bovine serum, FBS) 및 1% 항체를 포함하는 , RPMKA549 세포 및 4T-1 세포 에 대한) 및 DMEM(Dulbecco' s Modi f ied Eagle Medium, 다른 새포에 대한) 배지를 세포 배양에 사용하였다 . 37LRP를 암호화하는 pcDNA3.1 백터는 타치바나 히로푸미 박사 (큐슈 대학)로부터 얻었다. Myc이 부착된 (Myc-tagged) 인간 KRS 및 DRS는 pcDNA3 백터의 EcoRI/XhoI 제한효소 부위에 클로닝하였다. 설치류 KRS cDNA는 RT- PCR로 확보하였으며， pcDNA3.1 백터의 Hindi Π/Xhol 제한효소 부위에 클로닝하였 다. 설치류 및 인간 KRS 및 DRS에 타겟팅 (target ing)하는 siRNA는 Iiwitrogen사로 부터 구입하였다. siRNA의 서 열은 요청하면 제공될 것이다. 유전자 포터 (Gene porter , GTS) 및 리포펙타민 2000( invitrogen)은 형질감염 시 약으로 사용되었다. LY294002 , U73122 및 스타우로스포린 (staurosporin)은 Calbiochem으로부터 구입하 였고 싸이클로핵시마이드 (cycloheximide) 및 라미닌 ( laminin, Engelbreth— Holm- Swarm murine sarcoma)은 Sigma로부터 구입하였다.
<215> <216> 2. 면역침강 및 웨스턴 블¾
<217> 세포를 150mM NaCl, 0.5% 트리톤 X-100, 0.1% SDS 및 단백질 분해효소 저해 제를 포함하는 20mM Tris-HCl 버퍼 (pH 7.4, 용해버퍼 )로 용해하였다. 단백질 추출 물을 정상 IgG 및 단백질 G 아가로스와 2시간동안 배양한 다음 (incubation), 비특 이적으로 IgG에 결합한 단백질을 제거하기 위해 원심분리하였다. 상등액을 정제도 니 67LR 항체 (Fᅳ 18， Santacruz)와 흔합한 다음， 흔들어 주면서 4°C에서 2시간 동안 배양하고, 단백질 A 아가로스를 흔합하였다. 얼음으로 차갑게 냉각한 용해버퍼를 이용하여 3회 세척한 다음, 침전물을 SDS-샘플 버퍼에 녹이고， SDS— PAGE로 분리하 였다. 서로 다른 세포 분획에서 KRS 및 LR의 결합을 확인하기 위하여， PCDNA3.1- Myc-KRS로 형질감염을 하고, proteoextract 키트 (Calbiochem)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 플라스마 멤브레인과 싸이토플라즘 분획을 분리한 다음, 상기와 같이 공동 -면역침강을 수행하였다. 단백질 수준을 분석하기 위해， 단백질을 세포에서 추 출한 다음 10% SDS-PAGE로 분리하였다. 따로 언급하지 않는 한 항 -LR 항체 (Abeam, ab2508)을 37LRP 및 67LR의 동시 면역 블롯팅에 사용하였다. hsp90 및 팬-캐드헤린 (Pan-cadherin)에 대한항체는 Santacruz로부터 구입하였다.
<218>
<219> 3. 유세포분석 (flow cytometry)
<220> 세포싸이클을 address하기 위하여 , 배양된 세포를 표시된 백터 또는화합물 로 형질감염 또는 처리하고, 70% 에탄올로 4°C에서 1시간동안 고정한 다음 얼음으 로 넁각한 PBS로 2회 세척하였다. 그런 다음 세포를 propidi un iodide(50yg/ml) , 0.1% sodium citrate, 0.3% NP40 및 RNaseA(50yg/ml)로 40분간 염색한 다음， 플로 우 싸이토메트리 (FACS Calibur, Beckton-Dickinson)를 수행하였다. 각각의 샘플에 대해서， Cell Quest Pro소프트웨어를 사용하여 20000 세포를 분석하였다. 세포 표 면의 67kD LR의 양을 분석하기 위하여 , 1 X 106 세포를 IgG또는 67LR의 세포외 도 메인을 인식하는 항 -LR항체 (MLuC5, ig)와 배양한 다음, FITC 2차항체와 배양하 였다. PBS로세척한다음 샘플을 FACS로 스캔하였다.
<221>
<222> 4. 면역형광염색
<223> 9麵커버 슬립 (cover slip)위의 A549 세포를 70% 메틸알콜로 고정한다음 찬
PBS로 간단히 세척하였다. 1% CAS, 3% BSA 및 0.5% triton X-100을 포함하는 블로 킹 버퍼로 30분간 처리한 (incubation) 다음 세포를 KRS에 대한 항체 (Abeam), 및 M C-5에 대한 항체 (Santacruz)로 1시간 동안 배양하였다. 알롁사 488 및 568(invitrogen)을 첨가한 다음 실온에서 30분간 처리하였다. 찬 PBS로 30분간 세 척한다음， 표본을 레이저 스캐닝 마이크로스코피로관찰하였다.
<224>
<225> 5. 필스一체이스실험 (Pulse一 chase experiment)
<226> 293세포를 리포꿰타민 2000을 이용하여 si-KRS 또는 3卜대조군(^1 0§^) 으로 형질감염시켰다. 이를 메티오닌이 들어 있지 않은 배지에서 1시간동안 배양한
35
다음, [ S] 메티오닌 (50nCi/ml)을 철가하고 1시간동안 배양하였다. 신선한 배지로 방사선 메티오닌을 씻어낸 다음， 67LR을 이에 특이적인 항체 (Santacruz)로 면역 침 강시키고， 12% SDS-PAGE로 분리한 다음， BAS(FLA-3000, Fujifilm)을 이용하여 노출 시켰다 ( autoradiography ). 67LR의 양은 Multi-gauge 프로그램 (V3.0, Fujifilm)을 이용하여 측정하였다.
<227>
<228> 6. 이스트투 하이브리드 (yeast two hybrid) 분석
<229> 인간 KRS의 여러 단편을 암호화하는 cDNA를 상응하는 프라이머를 이용하여
PCR로 얻었다. KRS에 대한 PCR 산물을 EcoRI 및 Xh이으로 절단하고， pEG202 백터 (LexA—융합 단백질의 제조를 위함) 및 pJG4-5 백터 (B42-융합 단백질의 제조를 위 함)의 상응하는 위치에 연결하였다. 37LRP 단편을 암호화하는 cDNA는 Barbara J. Ba Hermann 박사 (알버타 대학)로부터 얻었고, 이를 pJG4-5 백터의 EcoRI 및 Xhol 부위에 삽입하였다. 두 융합 단백질간의 상호작용은 X— gal-함유 효모 배지상에서 파란색 콜로니의 형성여부로분석하였다.
<230>
<23i> 7. In vitro결합분석
<232> GST-KRS 또는 GST를 대장균 로제타 (DE3) 스트레인에서 발현시키고, 상기 단 백질 추출물을 1¾ Triton X-100 및 0.5% N-라우릴사코신이 함유된 PBS 버퍼에서 4 °C에서 2시간동안 글루타치온 -세파로스와 흔합하였다. 인간 37LRP는 TNT Quick cou led Transcription/Translation system(Promega)를 사용하고， pcDNA3一 37LRP를
35
주형으로 사용하며， [ S]메티오닌의 존재하에서 in vitro translation에 의해 합성 하였다. 합성된 37LRP는 상기 GST 단백질 흔합물에 첨가하고， 1% Triton X-100, 0.5% N-라우릴사코신， ImM DTT, 2mM EDTA 및 300 μΜ 페닐메 ¾설포닐 플루오라이드 가 함유된 PBS 버퍼에서 교반을 하면서 4°C에서 4시간 동안 배양한 다음， 0.5% Triton X-100을 함유하는 같은 버퍼로 6회 세척하였다. 그런 다음 세파로스 비드에 결합된 단백질을 SDS 샘플 버퍼로 용출하고, SDS-PAGE로 분리하고， 방사선을 측정 하였다 (autoradiograph) .
<233>
<234> 8. 세포 이동 (cell migration) 분석
<235> 세포 이동은선행 문헌 (Park, S. G. et al . Human lysyl-tR A synthetase is secreted to trigger pro- inflammatory response , Proc. Natl . Acad. Sci . U S A 102, 6356-6361 (2005))에 기재한 바와 같이 폴리카보네이트 막 (8.0μπι 공극 싸이 즈, Costar)를 가진 24-웰 트랜스웰 챔버로 측정하였다. A549 세포를 무혈청
(serum-free) RPMI 배지에 현탁한다음각 웰당 1 x 10¾세포의 농도로 상위 챔버에 넣었다. 표시된 농도의 정제된 인간 KRS, 라미닌 (10pg/ml) 또는 젤라틴 (10yg/nil) 을 하위 웰에 넣고, 세포가 C02배양기에서 37°C에서 6시간동안 이동하도록 하였다. 세포는 70% 메틸알콜을 포함하는 PBS로 30분간 고정한 다음 PBS로 3회 세척하였다. 세포를 헤마토실린 (Sigma)로 10분간 염색한 다음， 증류수로 세척하였다. 면봉으로 막의 윗 부분에서 이동하지 않은 세포를 제거하였다. 막을 챔버로부터 분리해 낸 다음 Gel Mount (Biomeda, 미국)에 을려 놓았다 (mount). 이동한 세포 (막의 하위 면 에 부착된 것들)를 현미경 하에서 (x20) 4곳을 임의로 선별하여 계측하는 방식으로 측정하였다.
<236> 9. 자이모그래피 (zymography)
<237> 표시된 siR A 및 재조합 KRS (또는 DRS)를 암호화하는 플라스미드로 형질감염 된 A549 세포를 각각 48시간 및 24시간도안 배양한 다음 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지에 접종하였다 (1 X 105 세포 /웰). 세포를 무혈청 RPMI 배지에서 2시간동안 기 아처리 (starving)한 다음, 라미닌을 첨가하여 10yg/ml로 24시간동안 배양하였다. 20μ 1의 배양 배지를 5x F0D 버퍼 (4% SDS, 20%글리세를 및 0.01%브로모페놀 블루 를 함유하는 0.125M Tris-HCl, pH 6.8)와 혼합한 다음， lmg/ml의 젤라틴을 함유하 는 10¾ SDS-PAGE를 수행하였다. 젤을 2.5%트리톤 X-100으로 각각 20분씩 2회 세척 하고, 증류수로 각각 20분씩 2회 세척한 다음 반응버퍼 (lOraM CaCl2, 150mM NaCl， 1 μΜ ZnCl2) 1% Triton X-100, 0.002% sodium azide를 함유하는 50mM Tris-HCl, pH
7.5)와 37°C에서 24시간동안 배양하였다. 젤을 증류수로 세척하고, 쿠마시 블루 R250으로 염색한 다음 35%메탄올로 탈염 (destain)하였다.
<238>
<239> 10. 생체내 암 전이 실험
<240> 마우스 유방암 세포 (ma醒 ary carcinoma) 4T-1 세포를 si-KRS, si -DRS 또는 s i -대조군으로 형질감염시키고 , 24시간 동안 배양하였다. 세포 (1 X 10 )를 6주령 암 컷 Balb/c 마우스의 등으로 피하 주사하였다 . 목표 유전자의 발현에 대한 si-RNA의 효과는 형질감염 48시간 후에 남은 세포에서 시험하고 , 3 내지 10일까지 주입 후 2 일간격으로 1차 종양에서도 상웅하는 항체를 사용한 웨스턴 블럿으로 상기 si-RNA 의 효과를 시험하였다. 종양의 성장은 1주에 3회 종양 크기를 측정함으로써 관찰하 였다 . 전체 체증도 동시에 측정하였다 . 주입 후 21일째에 마우스를 희생시키고， 1 차 종양 및 폐를 마우스에서 적출하였다. 폐는 10% 포르말린으로 24시간동안 고정 하였다. 폐에서 전이성 종양 결절의 수 및 크기를 측정하고， 직경 1腿 이상의 종양 결절은 별도로 기특하였다. 1차 종양의 무게도 측정하였다. 암 전이에 대한 KRS 과 발현의 효과를 검사하기 위하여， 설치류 KRS 및 공백터를 4T— 1 세포에 형질감염시 키 고 ᅳ 안정적 인 형질감염체를 G418의 존재하에서 3주간 배양하여 선별하였다. 그런 다음 여러개의 단일 콜로니를 집어 웨스턴 블럿으로 KRS의 발현을 비교하였다 . KRS 를 대조군 세포에 비해 높은 수준으로 발현하는 2개의 서로 다른 콜로니 (KRS-1 및 KRS-2)를 선별하고， 주입에 이용하였다 . 모든 과정은 주입후 30일후에 마우스를 희 생시켰다는 것을 제외하고는 상기 에서와 같이 수행하였다 .
<241>
<242> 11. 암 전이 억제활성 테스트
<243> 화합물 라이브러리를 스크리닝 하여 얻은 본 발명의 화합물에 대해서 KRS 및 라미닌 수용체 (67LR)간의 상호작용을 저해 정도를 이스트 투 하이브리드 방법에 따 라 다음과 같이 확인하였다 . LexA 백터 (clontedi) 및 B42 백터 (clontech)에 각각 KRS, LR, AIMP2, AIMP3 및 MRS를 각각 클로닝하여 필요로하는 백터를 제조하였다 . 그 증 LexA— KRS 및 B42-LR 백터를 효모 EGY/SH 세포에 공동 형질전환 (co- transformat ion)시키고， 그런 다음 상기 효모 세포를 우라실 (Ura) , 히스티딘 (His) , 트립토판 (Trp) 및 류신 (Leu)이 없는 갈락토스 배지로 흡광도 (540nm파장)가 0.2 되 도록 희석 후 200u 씩 96wel l plate에 넣었다. 10mg/ml 농도의 각각의 화합물 Ι μ ΐ 를 각각의 웰에 넣고， 6일간 배양 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 발명자들 은 대조군의 성장에 비해서 50% 이상 성장이 감소하는 화합물을 선별하였다 . 선별 된 화합물의 저해 특이성은 LexA-KRS/B42-AIMP2 및 LexA— MRS/B42-AIMP3와 같은 다 론 2개의 상호작용 쌍을 사용하여 테스트하였다 .
<244>
<245> 12. 세포 단백질 합성
<246> A549 세포를 표시한 ( indicated) 놓도의 화학식 15의 화합물 (2-[2-(4—메틸—벤 조일이미노) -벤조싸이아졸 -3-일] -뷰티릭산, CAND-KL1 또는 KL1으로 표시)로 처리하 였다. 그런 다음 세포를 무-메티오닌 배지에서 30분간 배양하고, [ S]메티오닌
(10mCi/ml)을 첨가하여 2시간 동안 배양하였다. 세포를 다시 완전 배지 (completed medium)로 4시간 동안 배양한 다음 세포를 모았다. 이를 분해하고 분해된 세포의 방사선량을신틸레이션 계수기로측정하였다.
<247>
<248> 13. 세포독성 분석
<249> 104 A549 세포를 96웰 플레이트에 넣고， 표시된 농도의 화학식 15의 화합물 로 24시간동안 처리하였다. 이후 제조사의 지침에 따라 EZ-cytox(Daeil Lab, Korea) 화합물을 각각의 웰에 ΙΟμΙ씩 넣고, 2시간 동안 배양하였다. 마이크로플레 이트 리더를 이용하여 흡광도를 420nm에서 측정하였다.
<250>
<25i> 14. 표면 플라스몬 공명 분석 (surface plasmon resonance assay)
<252> K S 및 화학식 15의 화합물간의 상호작용을 BIAcore3000(GE healthcare)을 이용하여 검사하였다. GST 및 GST-KRS를 회석하고 lOmM 아세트산 나트륨 (sodium acetate, H 5.0)에서 20 g/ml로 맞추었다. 그런 다음 각각의 단백질을 CM5 센서 칩 (CM5 sensor chip, GE healthcare)의 표면에 붙였다. CAND-KL1을 Vh DMS0를 포함 하는 PBS로 표시된 농도로 회석하고， 25°C에서 20μ1/분의 속도로 주입한 다음 결 합을 공명 유닛 (resonance unit, RU)의 변화로 측정하였다. CAND— KL1의 GST-KRS에 대한 특이적 결합 활성은 센서그램 (sensorgram)에서 GST에 대한 결합을 뺀 후에 측 정하였다. 외견 결합 상수는 BIAevaluation프로그램을 사용하여 기저선 (baseline) 을 이동시켜 1:1결합시키는 것에 의해 얻어졌다.
<253>
<254> <실험 결과 >
<255> 1. KRS및 67LR간의 특이적 상호작용
<256> 전체 길이의 S와 37LRP와의 특이적 상호작용은 이스트투 하이브리드분석 에 의하여 확인되었다. LexA— KRS는 KRS의 파트너로 알려진 (Kim, J.Y. et al . p38 is essential for the assembly and stability of macromolecular tR A synthetase com lex: Implications for its physiological significance, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 7912-7916 (2002)) AIMP2 뿐만 아니라, B42-37LRP와 결합 (paired)하 여 청색 콜로니를 형성하였으며， AIMP1에 대해서는 그러하지 않았다 (도 1). 인비트 로 바인딩 어세이에 대해서는, [ S]메티오닌으로 표지된 37LRP를 GST-KRS 또는 GST 와 흔합하고， 글루타티온 -세파로즈로 침전시킨후， 자가방사선촬영을 하였다. 37LRP 는 GST-KRS와 함께 침전하였으나, GST와는 아니었다 (도 2). 이스트 투 하이드리드 분석에 의한 소실 지도 (deletion mapping)로 인간 KRS의 N말단 연장부위와 LR의 C- 말단세포외 도메인이 그들의 결합에 관여함을 확인하였다 (도 3).
<257> 세포질내 37LRP는 막-포매성 67LR로 전환되므로， 본 발명자들은 KRS가 37LRP 및 67LR에 서로 다르게 결합하는지를 확인하였다. Myc-KRS를 폐암세포주 A549 세포 에 도입하여 항 -Myc 항체와 면역침전시켰다. 세포 용해물의 웨스턴블롯 결과， 67LR 은 37LRP보다 적은 양으로 존재하였다 (도 4우측 컬럼). 하지만， Myc-KRS는 37LRP 보다 67LR에 더 우선적으로 결합하였다 (도 4 가운데 컬럼). 본 발명자들은 이후， A549세포를 세포질과 원형질 막 분획으로 분리하여 Myc-KRS와 37LRP 및 67LR의 상 호작용을 확인하였다. 37LRP은 세포질에서 67LR은 원형질 막에서 각각 우세하게 관 찰된 반면 (도 5 우측)， KRS는 세포질에서 더 많은 양이 관찰되었지만， 두 분획 모 두에서 존재하였다. 두 분획 모두를 항 -Myc 항체와 면역침전 시켰을 때， 비록 세포 질 내 소량의 37LRP도 침전되었지만, 막에 존재하는 67LR가 주로 KRS와 함께 침전 되었다 (도 5 좌측). 이러한 결과는 KRS가 라미닌 수용체의 두 형태 모두와 잠재적 으로 결합할 '수 있지만， 세포내에서 67LR과의 결합을 선호하는 것을 암시한다. 이 후， 본 발명자들은 라미닌 처리에 의해 내재하는 KRS 및 67LR의 상호작용이 영향을 받는지 확인하였다. 이들 두 단백질의 상호작용은 라미닌 처리에 의해서 증가되었 다 (도 6 참조)
<258>
<259> 2. KRS의 라미닌-의존성 막전좌는 인산화및 다중 -tRNA합성효소복합체로 부터의 유리가관여된다.
<260> 본 발명자들은 이후， A549 세포에서 KRS의 세포내 분포가 라미닌 처리에 의 해 변화하는지를 세포 분획과 면역형광염색법을 통하여 조사하였다. 라미닌 처리 후 KRS와 67LR의 막내 존재량은 세포 ¾ 내의 KRS 및 37LRP 양이나 이들의 발현에 는 거의 변화없이 점차적으로 증가하였다 (도 7 및 결과 미도시). 면역형광염색에서 도 또한 67LR 및 KRS가 라미닌 처리에 의해 막 쪽으로 이동함을 설명해 주었다 (도 8, 각각 적색 및 녹색). 발명자들은 이후 KRS의 막 전좌 (translocation)가 라미닌 에 의해서 촉발된 (triggered) 신호전달에 의해서 생리적으로 조절되는 것인지 조사. 하였다. 포스포이노시티드 3-0H 카이네이즈 (phosphoinositide 3-OH kinase, PI3K)(Sha , L. M. , Rabinovitz, I., Wang, H. H. , Toker , A. & Mericurio. A.M. Activation of phosphoinositide 3ᅳ OH kinase by the alpha6beta4 integrin promotes carcinoma invasion. Cell 91， 949-960 (1997)), 단백질 인산화효소 Protein kinase C, PKC)(Li , Y. Q. et al . Protein kinase C mediates the signal for i nt er f er on-garama mRNA expression in cytotoxic T eel Is after their adhesion to laminin. Immunology 93, 455-461 (1998)), 및 포스포리페이즈 C-감마 (phosphol ipase C— gamma, PLC-ganima) (Vossmeyer , D. , Hofmann, f . , Loster , K. , Reutter, W. & Danker, K. Phosphol ipase C-garama binds alphalbetal integrin and modulates alphalbetal integr in-specific adhesion. J. Biol . Chem. 277, 4636- 4643 (2002)； Kanner, S. B. , Grosmaire, L. S. , Ledbetter, J. A. & Damle, N. K. Beta 2ᅳ integrin LFA-1 signaling through phosphol ipase C-gamma 1 activation. Proc .Natl. Acad. Sci. USA 90, 7099-7103 (1993))와 같은 몇몇 서로 다른 인산화 효소들이 라미닌에 의해 활성화된다고 알려져 있다. 이러한 인산화효소들 중 어떠 한 것들이 KRS의 라미닌 의존성 막 전좌에 관여하는 지를 알아보고자, 본 발명자들 은 각각의 카이네이즈에 특이적인 억제제로 각각의 인산화효소를 차단하고, 이 처 리가 어떻게 KRS의 라미닌 의존성 막 전좌에 영향을주는지를 확인하였다. 막 분획 에서 KRS와 67LR의 라미닌 의존적 증가는 PI3K 억제제인 LY294002의 존재하에서 억 제되는테 반해서， U73122 또는 스타우로스포린으로 처리한 세포들은 대조군 세포와 마찬가지로 67LR의 라미닌 의존적 증가를 보였다 (도 9 상 및 결과 미도시). 이들 인산화효소들 중 어떤 것도 세포내 KRS의 양에 영향을 준 것은 없었다 (도 9 하). 이들 결과는 PI3K가 KPS의 라미닌 유도성 인산화에 연관된 것임을 암시한다. 사실， 티로신이 아닌 트레오닌과 세린에서 인산화된 K S는 라미닌 처리에 의해 증가된 반 면， LY294002의 존재하에서는 억제되었으며， 스타우로스포린은 어떠한 영향도 주지 못했다 (도 10). 본 발명자들은 또한， KRS의 라미닌 유도성 인산화가 67LR과의 상호 작용에 필요한지를 조사하였다. LY294002 처리는 KRS와 67LR의 라미닌 유도성 결합 을 억제하였다 (도 11) 세포질 KRS가 다중 -ARS 복합체에 고정되어 있으므로, 본 발 명자들은 또한 KRS의 라미닌 의존적 인산화가 KRS와 복합체의 다른 호소 구성성분 인 글루타밀—프롤릴— tR A 합성효소 (glutamyl-prolyl-tRNA synthetase, EPRS)와 공- 면역침전함으로써 다중 -ARS 복합체와의 결합에 영향을 주는지를 조사하였다. LY 화 합물 (LY294002)의 부재 하에서， 라미닌 처리는 KRS와 EPRS의 결합을 감소시켰고， 동시에 면역-소진된 용해성 분획 (i匪 un으 depleted soluble fraction)의 KRS를 증가 시켰다 (도 12 상，하 패널의 좌측 레인). 이에 반해, EPRS에 결합한 KRS는 세포가 LY294002로 전처리 되었을 때 라미닌 처리에 영향을 받지 않았는데 (도 12 상,하 패 널의 우측 레인) 이는 KRS의 인산화가 KRS와 복합체의 라미닌-의존적 유리에 필요 함을 시사한다.
<261>
<262> 3. KRS는 67LR의 세포내 안정에 필요하다.
<263> 본 발명자들은 이후， KRS가 A549 세포에 있어서 67LR의 막 내 존재량에 영향 을 주는지 확인하였다. 원형질막 (plasma membrane)에서의 67LR의 양은 KRS에 의해 서 증가되지만 (도 13， 좌측)， 라미닌 효과는 KRS가 이에 대한 특이적 siRNA에 의해 억제될 때에는사라지는데 (도 13， 우측) 이는 67LR외 라미닌 의존적 촉진에 있어서 KRS의 중요성을 시사한다. 라미닌 수용체의 세포내 분포는 공백터 (EV) 또는 K S에 형질감염된 A549 세포간에서 면역형광염색을 통하여 비교되었다. 라미닌 수용체는 대조군과 비교하여 KRS 과발현 세포의 막 부위에 강하게 염색되었다 (도 14). 본 발 명자들은 또한, 유세포 분석기를 통하여 막에 존재하는 67LR을 조사하였다. 막에 존재하는 67LR의'양은 외부에서 KRS를 공급할 때 증가하였으며， si-KRS로 KRS를 억 제하였을 때， 감소하였다 (도 15).
<264>
<265> 본 발명자들은， KRS가 어떻게 67LR의 막내 존재량을 증가시키는지를조사하 였다. 이론적으로 KRS는 37LRP로부터 전사 또는 전환 (conversion) 을 통하여 67LR 을 촉진할 수 있다. 그러나， K S의 형질감염은 LR 전사조절의 잠정적 역할을 제외 하고는 LR 전사를 증가시키지 않았다 (결과 미도시). 본 발명자들은 또한, 37LRP의 변형이 37LRP가 67LR로 전환되는테 있어서 선행요건으로 알려져 있으므로 (Landowski , T. H. , Dratz, Ε. ,Α. & Starkey, J. R. Studies of the structure of the metastasisᅳ associated 67 kDa laminin binding protein: fatty acid acylat ion and evidence supporting dinierization of the 32 kDa gene product to form the mature protein. Biochemistry 34, 11276-11287 (1995)； Buto, S. et al . Formation of t e 67-kDa laminin receptor by acy 1 at i on of the precursor . J . Cell. Biochem. 69, 244-251 (1998))， KRS가 37LRP의 지방족 아실화 (fatty acylat ion)를 매개하는지를 조사하였다. 그 결과， KRS는 37LRP의 지방족 아실화에 전혀 영향을 주지 않았다 (결과 미도시). 본 발명자들은 또한， 필스-체이스 (pulse- chase) 실험을 통하여 67LR의 대사전환 (turn over)에 있어서 KRS의 효과를 조사하 였다. 초기 단백질 합성은 방사성 메티오닌으로 표지되었고, 이후 시클로핵시미드 로 억제되었다. 이후, 67LR의 소멸 (disappearance)는 시간적 간격을 두고 자가방사 촬영에 의해 관찰되었다. 67LR은 KRS가 siRNA에 의해 억제될 때 급격하게 감소되었 으나, 이 수치는 si-대조군에 있어서는 시간 간격에 따라유지된 것과 대조적이다 ( 도 16): 따라서 , KRS는 원형질 막에서 67LR과 결합함으로써 67LR의 반감기를 증가 시키는 것으로 보인다.
<266>
<267> 4. KRS는 67LR을통하여 세포 이동 및 암전이를증진시킨다.
<268> 본 연구자들은 이후， KRS의 발현정도가 라미닌-의존적 A549 세포 이동에 영
" 향을 주는지를 트랜스웰 멤브레인 분석을 통하여 조사하였다. 대조군 세포의 이동 은 라미닌 처리에 의해 평균 6배 가량촉진되었다 (도 21 및 도 17) 그러나, 라미닌 의존적 세포 이동은 KRS가 si-RNA에 의해 억제되었을 때 감소하였다 (도 17， si-대 조군 및 si-KRS). 이와는 반대로, KRS 과발현은 라미닌 처리에 의해 촉진된 세포이 동을 증가시켰다 (도 17, EV 및 KRS). 그러나, 세포 이동에 있어서 KRS의 효과는 라 미닌 수용체가 si-RNA에 의해 억제되면 사라진다 (도 1그 si-LR, 아래 패널). KRS는 몇몇 암세포에서 사이토카인으로 분비되므로 (Park, S. G. et al. Human lysyl-tR A synthetase is secreted to trigger pro-inflammatory response, Proc. Natl . Acad. Sci. U S A 102, 6356-6361 (2005)), 본 발명자들은 세포외인성 KRS가 세포 이동에 영향을 주는지를 조사하였다. A549 세포를 서로 다른 농도의 정제된 KRS로 처리하였을 때， 이 분석에서 KRS의 세포외인성 효과를 제의하면， 세포 이동은 거의 영향을 받지 않았다 (도 22). 반면, 세포 단백질의 합성 및 세포 주기는 실험하는 동안 KRS의 억ᅳ제 및 과발현에 영향을 받지 않았는테， 이는 KRS-의존적 세포 이동이 상기 과정의 효과에 기인하지 않음을 시사한다 (도 23 및 도 24). 라미닌 처리가 MMP-2 (matrix met 1 lo-proteinase-2)의 활성화를 초래하므로 (Givant-Horwitz, V. , Davidson, B. & Reich, R. Larainin-induced signaling in tumor cells the role of the M(r) 67,000 laminin receptor. Cancer Res. 64, 3572-3579 (2004)), MMP-2의 라미닌 의존적 활성화에 있어서 RS의 역할을 in vitro 자이모그래피 분석을 통하 여 조사하였다. MMP-2 활성은 라미닌에 의해 활성화 되었고， 이는 si-KRS의 존재 하에서 억제되었지만 (도 18 좌측)ᅳ KRS의 과발현에 의해 한층 더 증진되었다 (도 18 우측).
<269>
<270> KRS가 암 전이와 관련된 67LR을 통해 세포 이동을 촉진할 수 있기 때문에， 폐로 전이가 잘되는 마우스 유방암 4T-1 세포를 사용하여 KRS의 발현 수준에 의해 암 전이가 '영향을 받을 수 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 IiRS 또는 다증— ARS 복합체의 다른 구성요소인 DRS(aspartyl-tRNA synthetase)를 그들에 특이적인 s iRNA로 발현을 억제하고， 어떻게 KRS 및 DRS의 발현 감소가 암 전이에 영향을 미 치는지 비교하였다. si-KRS 및 s i-DRS의 억제 효과를 웨스턴 블럿으로 확인한 다음 에 (도 25)， 이들 세포 각각 및 si-대조군으로 처리한 세포를 Balb/c 마우스의 등 피부에 피하 주사로 주입하였다. 주입된 3종 모두 유사한 질량 및 부괴의 종양을 발생시켜 (도 26) , KRS의 수준이 1차 종양의 성장에는 영향을 미치지 않음을 알려주 었다 . 폐를 주입 후 21일째 분리하였으며 , 전이성 종양 결절 (직경 1麵보다 큰 것 ) 의 수를 3 그룹간에 비교하였다. 전이성 결절의 수는 대조군 및 DRS가 억제된 세포 에서 얻은 것에 비해 KRS의 억제에 의해 크게 감소하였다 (도 19 및 도 27) . 역으 로 , 상기 방법에 따라 KRS의 과발현이 암 전이를 증진하는지를 조사하였다. 우리는 KRS를 암호화하는 플라스미드의 형질감염 및 G418 스크리닝에 의해 K S를 안정 적으 로 과발현하는 4T-1 세포주를 처음으로 구축하였다 . 구축된 세포주에서 KRS 과발현 은 웨스턴 블럿으로 확인하였고 , 공 백터로 형질감염된 세포들에 비해서 많은 양으 로 KRS를 발현하는 2개의 서로 다른 세포 (KRS-1 및 KRS-2)를 선별하였다 (도 28) . 이들 세포도 유사한 질량과 크기의 1차 종양을 생성하였다 (도 29) . 이들 세포를 주 입한 후 30일째 폐를 검사하였을 때， KRS-과발현 세포 둘 다 대조군 세포에 비해서 더 많은 결절을 생성하였다 (도 20 및 도 30) · 이러 한 결과는 KRS가 생체 내에서 암 전이를 유도한다는 것을 암시한다.
<271>
<272> 5. 본 발명의 화합물의 KRS 및 라미닌 수용체간의 상호작용 저해확인
<273> 본 발명자들은 본 발명의 화합물에 의해서 KRS와 라미닌 수용체간의 상호작 용을 조절되는지 살펴보기 위하여 본 발명의 화합물을 처리하여 K S와 67LR간의 상 호작용을 확인하였다. 이를 위하여，. 본 발명자들은 KRS 및 라미닌 수용체간의 상호 작용이 일어나면 세포 성장이 되도특 하여 이스트 투 하이브리드 (yeast two hybrid) 시스템을 만들고， 화합물이 상호작용을 저해하는지 살피보았다. 만약 화합 물이 KRS 및 라미닌 수용체간 상호작용을 저해한다면 , 이는 효모 세포의 성장을 저 해할 것이다.
<274>
<275> 그 결과 하기 표 2에서와 같이 대조군 세포에 비해서 50¾) 내외의 성장 저해 를 보여 , KRS와 67LR의 상호작용을 잘 저해함을 알 수 있었다.
<276>
<277> 【표 2】 화함물 종류 저해을(«
화학식 2의 화합물 54.22
희—한식 3의 화합물 59.98
화학싀 4의 화합물 51.78
화학싀 5의 화합물 47.55
화학싀 6의 화합물 52.79
―한싀 7의 화합물 47.63
화한싀 8의 화합물 47.28
화학식 9의 화합물 36.88
화학식 10의 화합물 60.04
화학식 11의 화합물 49.09
하한식 12의 화합물 52.46
화한식 ^의 화합물 55.22
화학식 14의 화합물 49.27
하한식 15의 화합물 52.10
화한싀 16의 화합물 47.56
화학식 17의 화합물 36.49
<278>
<279> 이 후， 각각의 화합물을 KRS-AIMP2(Kim, J.Y. et al. p38 is essential for the assembly and stability of macromolecular tRNA synthetase complex: Implications for its physiological significance. Proc. Natl'. Acad. Sci. USA 99, 7912-7916 (2002)； Han, J.M. et al. Hierarchical network between the components of the multi-tR A synthetase com 1 ex： Implications for com lex formation.. J. Biol . Chew. 281， 38663-38667 (2006)) 및 MRS-AIMP3(Quevi 1 Ion, S. & Mirande, M. The pl8 component of the mult i synthetase complex shares a protein motif with the beta and gamma subunits of eukaryot i c elongation factor 1. FEBS Lett. 395, 63-67 (1996)； Kim, K.J. et al. Determination of three dimensional structure and residues of novel tumor suppressor , AIMP3/pl8, required for the interaction with ATM. J. Biol . Chem. (2008))와 같 은 2개의 다른 상호작용 쌍에 대해서도 처리를 하였다. 이러한 테스트를 통해 본 발명자들은 K S-LR상호작용만을저해하는 화합물을선별하였다 (하기 표 3 참조).
<280>
<281> 【표 3】
Figure imgf000041_0001
<282>
<283> 이들 중， 화학식 15의 화합물 (CAND- Ll, KL1으로도 표시)에 대해서 KRS 및 67LR의 세포내 상호작용도 저해하는지 시험하였다. A549 세포를 서로다른 농도의 KL1로 처리하고 , 67LR을 이의 항체로 면역침 전시 킨 후 KRS의 공-면역침전 (co- i醒 unoprecipitat ion)을 살펴보았다 . 67LR와 공침전된 KRS의 양은 KL1 양의 증가에 따라 감소하였으며 , KRS 및 67LR의 세포내 양은 변함이 없었다 (도 33) . 방사선 동 위원소를 이용하여 합성된 라미닌 수용체 및 GST-KRS간의 in vitro 상호작용이 이 루어지도록 하여， 여기에 서로 다른 양의 KL1을 첨가하였다. GST-KRS와 풀 -다운 (pul l-down)된 라미닌 수용체의 양은 KL1 화합물의 첨가량이 증가함에 따라 감소하 였다 (도 34) . 67LR의 세포내 안정성은 KRS의 결합에 달린 것이므로， 이들 두 단백 질의 결합을 저해하는 KL1의 처 리에 의해서 67LR의 세포내 수준이 영향을 받는지 확인하였다 . 67LR의 수준은 KL1의 첨가량에 따라서 감소하였으며， 세포질내 37LRP 는 영향이 없었다 (도 35) . 본 발명자들은 KL1이 KRS와 직접적으로 결합하는지를 BIAcore 3000을 이용하여 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance)에 의해 검사하였다. KRS에 KL1이 결합하는 것은 KL1의 양이 증가함에 따라 증가하였으며 , Kd는 약 2.6 μΜ로 측정되었다 (도 36) . KL1이 KRS의 표면에 자리잡아 라미닌 수용체 에 접근하는 것을 입 체적으로 방해하는 것으로 보인다.
<284>
<285> 6. KRS-67LR의 저해는 세포 이동 및 암 전이를 억제한다.
<286> 본 발명자들은 KL1이 상기와 같이 세포 이동 및 암 전이에 영향을 미치는지 를 시험하였다 . 세포 이동에 미치는 영향을 확인하기 위하여 , 본 발명자들은 ΜΡ2 및 트랜스웰 막 분석 (transwel l membrane assay)에 서로다른 양의 KL1을 첨가하였 다 . 두 분석에서 liLl은 MMP2 활성 및 세포이동을 처리된 양에 따라 저해하였다 (도 37 내지 도 39) . 세포내 단백질 합성 및 생존능은 동일한 실험 조건에서 KL1이 처 리에 의해 영향을 받지 않았고 (도 40 및 도 41)， 이는 화합물 처리로 인한 세포이 동의 저해가 단백질 합성 및 세포 생존능에 의한 것이 아니라는 점을 암시한다. 본 발명자들은 KL1의 존재 및 부존재시 상기에 기술한 바와 같은 암 전이 실험을 수행 하였다. KL1을 30mg/kg의 양으로 하루 1회로 3주동안 마우스에 주입하였을 때， 전 이된 노들 (nodule)의 수는 현저하게 감소하였다 (도 42) . 반면에 KL1은 종양 성장에 영향을 미치지는 않았다 (도 43) .
<287>
【산업상 이용가능성】
<288> 이상 살펴본 바와 같이 , 본 발명자들은 KRS가 6 LR과 상호작용함으로써 암( 또는 종양) 세포의 이동을 촉진하여 암의 전이 (metastasi s)에 영향을 미친다는 것 을 규명하였으며, K S 및 67LR의 상호작용을 저해하는 물질이 암세포의 전이를 억 제하여 암을 예방 및 치료할 수 있음을 확인하였다. 따라서 , 본 발명의 조성물은 암의 전이를 억제하므로 암 예방 및 치료를위한새로운수단을 제공하여 준다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
하기 화학식 1로 표시되는 벤조헤테로사이클 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물:
<화학식 1>
Figure imgf000044_0001
[상기 식에서，
==는 원자가 요건에 의해 허용되는 이증결합 또는 단일결합을 나타내 고;
A는 0， 丽 및 S로 이루어진 군에서 선택된 것이고;
X는 C또는 N이고;
¾은 수소， 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 알킬， 알콕시， 할로겐， 니트 아민으로 이루어진 군에 이고;
¾는 수소, 아릴알킬,
Figure imgf000044_0002
, 및 -NH-
¾로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
R4는 수소 또는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 알킬이고;
¾는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 아릴 또는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 아릴알킬이고; ¾는 수소，
Figure imgf000045_0001
서 선택된 것이다. ]
【청구항 2]
제 1항에 있어서， 화학식 2의 N-(6-메특시 -벤조옥사졸 -2-일) -벤자마이드 (N- (6-Methoxy-benzooxazol-2-yl )-benzamide) , 화학식 3의 Ν-(5—메특시 -벤조옥사졸 -2- 일 ) -밴자마이드 (N-(5— Methoxy— benzooxazol-2-yl )-benzamide) , 화학직 4의 (5-클로 로 -벤조옥사졸 -2-일) -페닐 -아민 ( (5-Chloro-benzooxazoI-2-yl )-phenyl— amine) , 화 학식 5의 (5-클로로 -벤조옥사졸 -2-일) -(4-에틸-페닐) -아민 ((5-Chloro- benzooxazol-2-yl )- (4-e thy 1 -phenyl )-amine) , 화학식 6의 (5一클로로一벤조옥사졸一2一 일 )-(3， 4-다이클로로-페닐 ) -아민 ( (5-Chloro-benzooxazol-2-yl )-(3， 4-di chloro- phenyl )— amine) , 화학식 7의 (5-니트로 -벤조옥사졸 -2-일 ) -(4-페닐아조-페닐) -아민 ( ( 5-N i t r o-benzooxazo 1 -2-y 1 ) - ( -pheny 1 azo-pheny 1 ) -am i ne ) , 화학식 8의 N一벤조옥 사졸 -2-일 -벤자마이드 (N-Benzooxazol-2-yl-benzamide) , 화학식 9의 N-(5-니트로- 벤조옥사졸 _2_일 ) _벤자마이드 (N-(5-Nitro-benzooxazol-2-yl )-benzamide)， 화학식 10의 N-(5-메특시 -벤조옥사졸 -2-일；) -벤자마이드 (N-(5-Methoxy-benzooxazol-2— yl ) - benzamide) , 화학식 11의 N-(5-메틸 -벤조옥사졸 -2-일 ) -벤자마이드 (N-(5-Methyl- benzooxazol-2-yl )-benzamide) , 화학식 12의 Ν-(6-니트로-벤조싸이아졸 -2-일 ) -4-트 리플루오르메틸-벤자마이드 (N_(6-Ni tro-benzothi azol-2-yl )-4-tri f luoromethyl- benzamide) , 화학식 13의 [2-(5-메틸 -벤조옥사졸 -2-일) -페녹시 ] -아세트산 ( [2-(5- Methyl-benzooxazol-2-yl )-phenoxy]-acet ic acid) , 화학식 14의 2一 (2,4,6—트리메틸 -페닐；) -벤조옥사졸 -5—일아민 (2-(2 , 4 , 6-Triraethyl-phenyl ) -benzooxazol -5- ylamine) , 화학식 15의 2-[2-(4-메틸-벤조일이미노) -벤조싸이아졸 -3-일] -뷰티릭산 ( 2- [ 2- ( 4-Met hy 1 -benzoy 1 i m i no ) -benzo t h i azo 1 -3-y 1 ] -but yr i c acid) , 화학식 16의 2-(2, 6-다이메록시 -페닐；) -벤조싸이아졸 (2-(2 , 6-Dimethoxy-phenyl )-benzothi azole) 및 화학식 17의 (2-클로로 -4_플루오로-벤질) -(5-플루오로 -1H-인돌 -3-일메틸) -아민 ( (2-Chloro-4-f luoro— benzyl )—(5_f luoro—ΙΗ一 indol—3— ylmethyl )— amine)으로 이루어 진 군에서 선택된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함 유하는 암 예방 및 치료용 약학작 조성물 . <화학식 2>
Figure imgf000046_0001
<화학식 Ί> oen oen
Figure imgf000047_0001
<화학식 8>
Figure imgf000047_0002
<화학식 9〉
Figure imgf000047_0003
<화학식 10>
Figure imgf000047_0004
<화학식 11>
Figure imgf000047_0005
< 12>
Figure imgf000047_0006
<화학식 13>
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000048_0002
Figure imgf000048_0003
Figure imgf000048_0004
<화학식 17>
Figure imgf000048_0005
【청구항 3】
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 암은 대장암， 폐암， 간암, 위암， 식도암ᅳ 췌장암， 담낭암， 신장암， 방광암, 전립선암， 고환암， 자궁경부암, 자궁내막암， 융 모암， 난소암， 유방암， 갑상선암, 뇌암， 두경부암， 악성흑색종， 림프종， 재생블량 성 빈혈로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 4】
제 1항또는 제 2항에 있어서， 상기 암 예방 및 치료는 암 세포의 전이를 억제 하는 것에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 5]
하기 화학식 1로 표시되는 벤조헤테로사이클 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 전이 저해용 약학적 조성물:
<화학식 1>
Figure imgf000049_0001
[상기 식에서， 는 원자가 요건에 의해 허용되는 이증결합 또는 단일결합을 나타내 고;
A는 0, 丽 및 S로 이루어진 군에서 선택된 것이고;
X는 C또는 N이고;
¾은 수소, 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 알킬， 알콕시， 할로겐， 니트 로 및 아민으로 이루어진 군에 고;
R2는 수소， 아릴알킬
Figure imgf000049_0002
및 -NH-R5로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
R4는 수소또는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 알킬이고;
R5는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 아릴 또는 비치환되거나 할로겐에 치환된 아릴알킬이고;
¾는 수소，
Figure imgf000050_0001
택된 것이다.]
【청구항 6】
제 5항에 있어서， 화학식 2의 N-(6-메록시 -벤조옥사졸 -2-일) -벤자마이드 (N- (6-Methoxy-benzooxazol-2-yl )-benzamide) , 화학식 3의 Ν-(5-메록시 -벤조옥사졸—2- 일) -벤자마이드 (N-(5-Methoxy-benzooxazol-2-yl)-benzamide), 화학식 4의 (5-클로 로—벤조옥사졸 -2-일) -페닐 -아민 ((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)-phenyl-amine), 화 학식 5의 (5-클로로 -벤조옥사졸 -2-일) -(4-에틸-페닐) -아민 ((5-Chloro- benzooxazol-2-yl )-(4-ethyl-phenyl )-amine) , 화학식 6의 (5-클로로 -벤조옥사졸 -2- 일 )-(3 ,4-다이클로로-페닐) -아민 ( (5-Chloro-benzooxazoI-2-yl )-(3 ,4-dichloro- phenyD-amine), 화학식 7의 (5-니트로 -벤조옥사졸 -2-일) -(4-페닐아조-페닐) -아민 ( ( 5-N i t r o-benzooxazo 1 -2-y 1 ) - ( -pheny 1 azo-pheny 1 ) -am i ne ) , 화학식 8의 N—벤조옥 사졸 -2-일 -벤자마이드 (N-Benzooxazol-2-yl-benzamide), 화학식 9의 N-(5-니트로- 벤조옥사졸 -2-일) -벤자마이드 (N-(5_Nitro-benzooxazol-2-yl)-benzamide)， 화학식 10의 N-(5-메특시 -벤조옥사졸 -2—일 ) -벤자마이드 (N_(5-Methoxy— benzooxazol-2-yl ) - benzamide), 화학식 11의 N-(5-메틸 -벤조옥사졸 -2ᅳ일) -벤자마이드 (N-(5-Methyl- benzooxazol-2-yl )-benzamide) , 화학식 12의 Ν-(6-니트로-벤조싸이아졸 -2-일) -4-트 리플루오르메틸 -벤자마이드 (N-(6— Nitro-benzothiazol-S-yU-^trifluoromethyl- benzamide), 화학식 13의 [2-(5-메틸 -벤조옥사졸 -2-일) -페녹시] -아세트산 ([2-(5- Methyl-benzooxazol-2-yl )-phenoxy]-acet ic acid), 화학식 14의 2— (2,4,6一트리메틸 -페닐) -벤조옥사졸 -5-일아민 (2-(2,4,6-Trimethyl-phenyl)-benzooxazol-5- ylamine), 화학식 15의 2-[2-(4-메틸-벤조일이미노) -벤조싸이아졸 -3—일] -뷰티릭산 ( 2- [ 2- ( 4-Me t hy 1 -benzoy 1 i m i no ) -benzot h i azo 1 -3-y 1 ] -but yr i c acid) , 화학식 16의 2-(2, 6-다이메록시-페닐) -밴조싸이아졸 (2-(2,6-Dimethoxy-phenyl)-benzothiazole) 및 화학식 17의 (2-클로로 _4-풀루오로-벤질) -(5-플루오로 -1H-인돌 -3-일메틸) -아민
( ( 2-Ch 1 or 0-4- f 1 uor o-benzy 1 )一 ( 5—f 1 uor o_ 1H_ i ndo 1—3—y lmethyl)-amine)으로 이루어 진 군에서 선택된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함 유하는 암 전이 저해용 약학적 조성물.
【청구항 7】
하기 화학식 1로 표시되는 벤조헤테로사이클 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 암 예방 및 치료제 제조를 위한 용도:
< 1>
Figure imgf000051_0001
[상기 식에서，
는 원자가 요건에 의해 허용되는 이중결합 또는 단일결합을 나타내
A는 0， NH 및 S로 이루어진 군에서 선택된 것이고;
X는 C또는 N이고; ¬은 수소， 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 알킬， 알콕시， 할로겐, 니트 ¬고;
Figure imgf000051_0002
로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
R4는 수소 또는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 알킬이고;
¾는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 아릴 또는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 아릴알킬이고;
Figure imgf000052_0001
¾는 수소, 으로 이루어진 군에 서 선택된 것이다.]
【청구항 8】
하기 화학식 1로 표시되는 벤조헤테로사이클 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 암 전이 저해제 제조를 위한 용도:
<화학식 1>
/쟤
[상기 식에서, 는 원자가 요건에 의해 허용되는 이중결합 또는 단일결합을 나타내 고;
A는 0， NH 및 S로 이루어진 군에서 선택된 것이고;
X는 C또는 N이고;
¾은 수소， 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 알킬, 알콕시ᅳ 할로겐, 니트 로 및 아민으로 이루어진 군 이고;
¾는 수소， 아릴알킬 ,
Figure imgf000052_0002
， 및 -NH-R5 로 이루어진 군에서 선택된 것이고，
R4는 수소 또는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 알킬이고; ¾는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 아릴 또는 비치환되거나 할로겐에 치환된 아릴 고;
¾는 수소，
Figure imgf000053_0001
으로 이루어진 군에 서 선택된 것이다.]
【청구항 9]
하기 화학식 1로 표시되는 벤조헤테로사이클 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 것을 특징으로 하 는 암 예방 및 치료 방법 .
< 1>
Figure imgf000053_0002
[상기 식에서， 는 원자가 요건에 의해 허용되는 이중결합 또는 단일결합을 나타내 고;
A는 0， NH 및 S호 이루어진 군에서 선택된 것이고;
X는 C또는 N이고;
¾은 수소, 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 알킬， 알콕시， 할로겐， 니트 로 및 아민으로 이루어진 군 이고;
R2는 수소, 아릴알킬，
Figure imgf000053_0003
및 -NH-R5 로 이루어진 군에서 선택된 것이고，
¾는수소또는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 알킬이고;
¾는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 아릴 또는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 아릴알 고; .
¾는 수소 ,
Figure imgf000054_0001
으로 이루어진 군에 서 선택된 것이다.]
【청구항 10】
하기 화학식 1로 표시되는 벤조해테로사이클 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 것을 특징으로 하 는 암 전이 저해 방법 .
<화 1>
Figure imgf000054_0002
[상기 식에서，
는 원자가 요건에 의해 허용되는 이중결합 또는 단일결합을 나타내
A는 0， NH 및 S로 이루어진 군에서 선택된 것이고;
X는 C또는 N이고;
¾은 수소， 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 알킬, 알콕시， 할로겐， 니트 로 및 아민으로 이루어진 군에서 선택된 것이고; R2는 수소， 아릴알킬，
Figure imgf000055_0001
및 -NH-R5 로 이루어진 군에서 선택된 것이고，
R4는 수소 또는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 알킬이고;
¾는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 아릴 또는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 아릴알킬이고;
¾는 수소，
Figure imgf000055_0002
으로 이루어진 군에 서 선택된 것이다.]
【청구항 11】
제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 벤조헤테로사이클 유 도체는 화학식 2의 N-(6-메특시 -벤조옥사졸 -2-일) -벤자마이드 (N-(6-Methoxy- benzooxazol-2-yl )-benzamide) , 화학식 3의 Ν-(5-메록시—벤조옥사졸 -2—일) -벤자마 이드 (N-(5-Methoxy-benzooxazol-2-yl)— benzamide), 화학식 4의 (5-클로로-벤조옥 사졸 -2-일) -페닐 -아민 ((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)-phenyl-amine), 화학식 5의 (5-클로로 -벤조옥사졸 -2-일 )-(4-에틸-페닐 ) -아민 ( (5-Chloro— benzooxazol_2-yl )— (4-ethyl-phenyl )-amine) , 화학식 6의 (5-클로로—벤조옥사졸 -2-일) -(3, 4-다이클로 로一페닐)ᅳ아민 (( 5-Ch 1 oro-benzooxazo 1 -2-y 1 )ᅳ ( 3， 4-d i ch 1 oro-pheny l)-amine) , 화학 식 7의 (5-니트로 -벤조옥사졸 -2-일) -(4-페닐아조-페닐) -아민 ((5-NitiO- benzooxazol-2-yl )-(4-phenylazo-phenyl )-amine) , 화학식 8의 Ν-벤조옥사졸 -2-일- 벤자마이드 (N-Benzooxazol-2-yl-benzamide), 화학식 9의 Ν-(5-니트로-벤조옥사졸- 2ᅳ일) -벤자마이드 (N-(5-Nitro-benzooxazol-2-yl)-benzami(le), 화학식 10의 . N-(5- 메톡시 -벤조옥사졸 -2-일 ) -벤자마이드 (N-(5-Methoxy-benzooxazol-2-yl ) - benz amide), 화학식 11의 N-(5-메틸 -벤조옥사졸 -2_일) -벤자마이드 (N-(5-Methyl- benzooxazol -2-yl )-benzamide) , 화학식 12의 N-(6-니트로-벤조싸이아졸 -2-일 ) -4-트 리플루오르메틸-벤자마이드 (N-(6-Ni tro-benzothi azol-2-yl )-4-tri f luoromethyl- benzamide) , 화학식 13의 [2-(5-메틸 -벤조옥사졸 -2-일 ) -페녹시 ] -아세트산 ( [2-(5- Methyl-benzooxazol-2-yl )-phenoxy]-acet ic acid) , 화학식 14의 2-(2,4,6-트리메틸 -페닐 ) -벤조옥사졸 -5-일아민 (2-(2，4, 6-Tr i met hy 1 -phenyl ) -benzooxazo 1 -5- ylamine) , 화학식 15의 2-[2-(4-메틸-벤조일이미노) _벤조싸이아졸 -3-일] -뷰티릭산 ( 2- [ 2- ( -Me t hy 1 -benzoy 1 i m i no ) -benzo t h i azo 1 -3-y 1 ] -but yr i c acid) , 화학식 16의 2- (2 , 6-다이메특시 -페닐；卜벤조싸이아졸 (2-(2 , 6-Dimethoxy-phenyl )-benzothi azole) 및 화학식 17의 (2-클로로 -4-플루오로—벤질) -(5-플루오로 -1H-인돌 -3-일메틸) -아민 ( ( 2-Ch 1 or 0-4- f 1 uor o—benzy l )-(5-f luoro- ΙΗ-i ndo 1 -3-y 1 me t hy 1 )— am i ne )으로 이루어 진 군에서 선택된 화합물인 것을 특징으로 하는 용도 .
【청구항 12】
제 9항 또는 제 10항에 있어서， 상기 화학식 1로 표시되는 벤조헤테로사이클 유도체는 화학식 2의 N-(6-메록시 -벤조옥사졸 -2-일 ) -벤자마이드 (N-(6-Methoxy- benzooxazol-2-yl )-benzamide) , 화학식 3의 Ν-(5-메특시 -벤조옥사졸 -2-일) -벤자마 이드 (N-(5-Methoxy-benzooxazol-2-yl )— benzamide) , 화학식 4의 (5-클로로-벤조옥 사졸 -2-일) -페닐 -아민 ((5-Chlon)-benzooxazol-2-yl )— phenyl-amine) , 화학식 5의 (5-클로로 -벤조옥사졸 -2-일 )-(4-에틸-페닐 ) -아민 ( (5-Chloro-benzooxazol_2-yl ) - (4-ethyl-p enyD-amine) , 화학식 6의 (5-클로로 -벤조옥사졸 -2-일 ) _(3, 4-다이클로 로一페닐)一아민 ( ( 5-Ch 1 or o-benzooxazo 1 -2-y 1 ) - ( 3 , 4-d i ch 1 or o-pheny 1 ) -am i ne ) , 화학 식 7의 (5-니트로 -벤조옥사졸 -2-일) -(4-페닐아조-페닐) -아민 ((5-Nitro- benzooxazol-2-yl )-(4-phenylazo-phenyl ) -amine) , 화학식 8의 Ν_벤조옥사졸一 2一일一 벤자마이드 (N-Benzooxazol— 2_yl-benzamide) , 화학식 9의 N-(5-니트로-벤조옥사졸- 2-일) -벤자마이드 (N-(5-Nitro-benzooxazol-2-yl )-benzamide) , 화학식 10의 N-(5- 메특시 -벤조옥사졸 -2-일) -벤자마이드 (N-(5-Methoxy-benzooxazol-2-yl )一 benzamide) , 화학식 11의 N-(5-메틸 -벤조옥사졸 -2_일 ) -벤자마이드 (N-(5-Methyl- benzooxazol-2-yl )-benzamide) , 화학식 12의 Ν-( 6-니트로-벤조싸이아졸 -2-일 ) -4-트 리플루오르메틸—벤자마이드 (N-(6-Nitro-benzothiazol-2-yl )_4-tri f luoromethyl- benzamide) , 화학식 13의 [2-(5-메틸—벤조옥사졸 -2-일) -페녹시 ] -아세트산 ( [2-(5- Methyl -benzooxazol -2-yl ) -phenoxy] -acet ic acid) , 화학식 14의 2-(2,4，6-트리메틸 -페닐)ᅳ벤조옥사졸 -5-일아민 (2-(2,4, 6-T methyl-plienyl )— benzooxazol-5- ylamine) , 화학식 15의 2-[2-(4-메틸-벤조일이미노) -밴조싸이아졸 -3-일] -뷰티릭산 ( 2- [ 2- ( 4-Me t hy 1 -benzoy 1 i m i no ) -benzot hi azo 1 -3-y 1 ] -but yr i c acid) , 화학식 16의 2-(2, 6-다이메록시ᅳ페닐；) -벤조싸이아졸 (2-(2 , 6-Dimethoxy-phenyl )-benzothi azole) 및 화학식 17의 (2-클로로 -4-플루오로-벤질) -(5-폴루오로 -1H-인돌 -3-일메틸) -아민 ( (2-Chloro-4-f luoro-benzyl )-(5-f luoro-lH-indol-3-ylmethyl )-amine) ≤. 이루어 진 군에서 선택된 화합물인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 13]
제 7항 또는 제 8항에 있어서 , 상기 암은 대장암, 폐암, 간암， 위암， 식도암， 췌장암， 담낭암 신장암， 방광암， 전립선암, 고환암， 자궁경부암， 자궁내막암， 융 모암, 난소암， 유방암， 갑상선암， 뇌암, 두경부암， 악성흑색종， 림프종， 재생불량 성 빈혈로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 용도.
【청구항 14]
겨 19항 또는 제 10항에 있어서 , 상기 암은 대장암， 폐암， 간암， 위암, 식도암, 췌장암， 담낭암， 신장암， 방광암， 전립선암， 고환암, 자궁경부암， 자궁내막암， 융 모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암， 두경부암, 악성흑색종， 림프종， 재생불량 성 빈혈로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법 .
PCT/KR2010/007806 2009-11-05 2010-11-05 벤조헤테로사이클 유도체의 암 예방 및 치료 또는 암 전이 억제를 위한 용도 WO2011056021A2 (ko)

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