WO2011054353A1 - Vorrichtung zur durchführung einer pcr - Google Patents

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WO2011054353A1
WO2011054353A1 PCT/DE2010/075120 DE2010075120W WO2011054353A1 WO 2011054353 A1 WO2011054353 A1 WO 2011054353A1 DE 2010075120 W DE2010075120 W DE 2010075120W WO 2011054353 A1 WO2011054353 A1 WO 2011054353A1
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sample cell
temperature
pcr
nucleic acid
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PCT/DE2010/075120
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Inventor
Gerhard Hartwich
Norbert Persike
Original Assignee
Friz Biochem Gesellschaft Für Bioanalytik Mbh
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Publication date
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    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • B01L7/525—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples with physical movement of samples between temperature zones
    • B01L7/5255—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples with physical movement of samples between temperature zones by moving sample containers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L2300/18—Means for temperature control
    • B01L2300/1805—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks

Definitions

  • the present invention relates to a device for carrying out the polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • PRIOR ART PCR is a basic method for molecular biology that replicates DNA molecules and allows rapid, sensitive direct detection of minute amounts of DNA or RNA. In recent years, this method has conquered the laboratories, as their application is very broad and complex. PCR has found its way into almost all areas of science and medicine, including forensic medicine, prenatal diagnostics, oncology and, not least, microbiological diagnostics. For example, PCR in the field of clinical diagnostics is usually the method of choice for z. B. detect pathogens. It is also used in the food industry as a detection method for harmful germs.
  • the PCR is an enzymatic reaction for the amplification of nucleic acid molecules, which essentially takes place in an aqueous or liquid reaction mixture with very small volumes.
  • the reaction mixture contains a nucleic acid-containing sample and the primers, nucleotides and a polymerase necessary for the reaction.
  • buffers and preferably bivalent ions such as B. Mg 2+
  • the reaction mixture is adjusted so that prevail for the respective application optimum reaction conditions.
  • the polymerase chain reaction is based on a cycle of three steps occurring at different temperatures, namely denaturation, hybridization and extension. In the denaturation, the reaction mixture is heated to a temperature greater than 90 ° C, preferably 94 ° C to 95 ° C.
  • the two complementary strands of a double-stranded DNA separate, the DNA is "melted” or denatured and is present in single strands.
  • the denaturation is a very fast process and is usually completed within seconds.
  • the temperature is lowered to a so-called “annealing temperature”.
  • annealing temperature depends on the length and sequence of the primers and can be determined from these properties specifically for each primer.As a rule, the "annealing temperatures” in a temperature range of 55 ° C to 65 ° C, can but also lower or higher depending on the application. The hybridization takes little time and takes place within seconds.
  • the temperature is further increased, preferably to 70 ° C. to 74 ° C. This is the ideal working temperature for the polymerases which are generally used, which nucleotides start from the bound primers In the given temperature range, loose connections between primers and those template DNA segments which are not completely complementary break again.
  • the extension step is the step of the PCR, which usually involves the greatest amount of time.
  • the working or reaction rate of the polymerase is time-limited, that is, the shorter the optimal temperature of about 70 ° C to 74 ° C, the shorter the newly synthesized DNA strands remain.
  • several seconds (15 to 60 seconds) are sufficient in the extension step, but in Standard PCR procedure for very long DNA molecules to be synthesized a period of time in the range of minutes (from one to several minutes) for DNA extension.
  • Each repetition of the above three steps doubles the number of copied DNA molecules. After 20 cycles, about one million molecules are formed from a single DNA double strand.
  • the number of cycles can be selected according to the type of application, the nature of the sample and the specific requirements and reaction conditions. Likewise, the setting of the time intervals for the individual steps is adapted to the specific requirements of certain types of applications.
  • the information given above essentially refers to standard PCR methods in which copies are made from a double-stranded sample DNA. However, there are a whole series of special PCR procedures for which the conditions have to be adapted in individual cases.
  • An example of a very special PCR application is the so-called RT-PCR (reverse transcriptase PCR). In this case, an amplification is carried out with the aid of a reverse transcriptase starting from a sample RNA.
  • a hybrid double-stranded RNA DNA is generated by the reverse transcriptase synthesizing a complementary to the present sample RNA DNA strand.
  • a "usual" PCR the resulting DNA can be used again as a template after denaturation of the hybrid.
  • This quantification is usually done via a fluorescent label of the newly synthesized DNA molecules. Especially in medical diagnostics but also in the target search and in basic research, a quantification of the sample DNA is unavoidable, which is why a quantification option in real time is very much in demand in these areas.
  • the reaction mixture namely a nucleic acid-containing sample ("template DNA"), primer, nucleotides, polymerase and buffer are mixed in a reaction vessel, wherein usually between 10 ⁇ and 100 ⁇ reaction mixture are used in the reaction vessel
  • the reaction vessel is fixed in a holding unit and subjected to a number of temperature cycles.
  • the receiving units are usually temperature-controlled metal blocks equipped with wells for holding the reaction vessels 500 ⁇ volume, these are usually individual, closable vessels or strips or plates with multiple wells, so-called multi-well strips or plates, the number and relative spacing of the wells of the multi-well plates or Stripes are on the wells of the temper Tunable metal blocks matched so that a fixation in the metal blocks is possible.
  • the temperature cycles are generated by a recurring heating and cooling of the temperature-controllable blocks, the control usually taking place via Peltier elements.
  • a major disadvantage of these repetitive heating and cooling phases is the time required for this.
  • the available devices have significant differences in heating and cooling rates of temperature-controlled blocks.
  • a rate of about 1 ° C to 10 ° C per second can be specified, the cooling rates are still slightly lower.
  • a time required between 15 seconds and 2 minutes is required, which results in 30 cycles for heating and cooling, a time requirement of up to one hour.
  • this expenditure of time represents a limitation of their efficiency.
  • WO 90/05023 discloses a device for selectively setting the temperature of a sample to various values comprising a sample receiving block with high thermal conductivity and a device for adjusting the temperature with at least two thermostattable bodies.
  • the sample receiving block is brought into contact with one of the bodies via a transport device.
  • the movement of the sample receiving block is in the form of a shift, so that at a defined time each sample is exposed to a certain temperature.
  • WO 2008/034896 A2 provides a device for performing a real-time PCR, in which each sample can be brought into contact sequentially with different temperature zones by the sample vessel, namely the reaction chamber, by means of a stepping motor gradually from a temperature zone a different temperature zone is moved.
  • US 2002/01 10899 A1 describes a "rotary thermocycler" having a plurality of stations for holding sample vessels, wherein the stations are designed to set different temperatures, and the samples can be moved stepwise from one station to the next with means for moving the sample vessels This allows each sample to be sequentially exposed to different temperatures.
  • US 6,875,602 B2 discloses a portable thermal cycler in which a plurality of heating blocks are arranged on a rotating plate.
  • the sample containers may be in the form of capillary tubes and arranged in cassettes and are moved incrementally to the heating blocks.
  • the capillary tubes with the recorded samples are moved by the stepwise movement of the cassettes from one temperature zone to another temperature zone and thus exposed successively to the different temperatures.
  • the temperature control of the samples due to the transfer of the samples from one temperature to the next unit is faster than in conventional devices in which a repeated heating and cooling of a single temperature control unit is provided, but there is a constant problem that the heat transfer from the temperature control unit into the sample vessel and thus to the sample is not optimal. Due to the usually small contact surfaces between the sample vessel and tempering unit, for example in flat bottom vessels, which are placed on a temperature-controlled station, longer incubation times are necessary to ensure a temperature transfer to the sample, so that at any point of the sample volume, the desired temperature is reached and for the Duration of the desired reaction time prevails. Ultimately, therefore, the described devices do not lead to any noticeable time savings compared to conventional PCR devices.
  • reaction mixture is passed through a channel which repeatedly repeats
  • B be defined by means of two infrared ring heaters. A channel passes through these temperature zones in a zig-zag shape. The reaction mixture is through
  • DE 694 29 038 T2 discloses a device for nucleic acid amplification which comprises a capillary tube reaction chamber, a first and second heating device and a positioning device.
  • the sample is brought into contact with different temperature ranges inter alia by "pumping" the sample through the capillary tube or by a movement of the heating device. ⁇ br /> ⁇ br/> Both pumping the sample through the capillary tubes and moving the heating device is cumbersome and requires relatively high technical effort.
  • dNTP deoxyribonucleoside triphosphate a mix of dATP
  • Nucleic Acid Nucleic Acid of Unspecified Base Length e.g., Oligomer Nucleic Acid Octamer: A nucleic acid of any type
  • Oligomer equivalent to nucleic acid oligomer Oligomer equivalent to nucleic acid oligomer.
  • Oligonucleotide equivalent to oligomer or nucleic acid oligomer e.g. a DNA, PNA or RNA fragment of unspecified base length.
  • Oligo Abbreviation for oligonucleotide Oligo Abbreviation for oligonucleotide.
  • Nucleic acid at least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine (eg cytosine, thymine or uracil) or purine bases (eg adenine or guanine).
  • the term nucleic acid refers to any "backbone" of the covalently linked pyrimidine or purine bases, such as the sugar-phosphate backbone of the DNA, cDNA or RNA, to a peptide backbone of the PNA, or to analogous structures (eg, phosphoramid , Thio-phosphate or dithio-phosphate backbone).
  • An essential feature of a nucleic acid according to the present invention is that it can bind naturally occurring cDNA or RNA sequence-specific.
  • Template nucleic acid molecule equivalent to
  • Sample sample nucleic acid, sample DNA or template.
  • the primer attaches itself in a so-called hybridization step (also: annealing) to complementary sections of the sample nucleic acid present in single strands, whereby a short, double-stranded DNA section is available to which the polymerase attaches and by adding further complementary nucleotides second DNA strand synthesized.
  • Polymerase Enzyme that synthesizes double-stranded nucleic acid molecules by using a single stranded template as template and following its sequence the nucleotides for the complementary strand adjoins one another.
  • a thermostable polymerase eg Taq polymerase (which was originally isolated from a thermophilic organism Thermus aquaticus) is used, the optimum working temperature in a range of 70 ° C to 74 ° C and also against temperatures up to 100 ° C and more tolerant.
  • the two single strands hybridize such that the base A (or C) of one strand forms hydrogen bonds with the base T (or G) of the other strand (in the case of RNA, T is replaced by uracil). Any other base pairing does not form hydrogen bonds, distorts the structure, and is referred to as a "mismatch.”
  • the present invention provides a device for carrying out a PCR method, wherein the device comprises at least one sample cell with a cavity for receiving a sample and at least one first, one second and one third temperature control unit which can be regulated independently of one another.
  • the three temperature control units define three spatially separated temperature zones.
  • the device comprises a means for performing a rotational movement of the sample cell, wherein the cavity provided for receiving the sample can be moved due to the rotational movement through the three spatially separated temperature zones.
  • the cavity provided for receiving the sample is in contact with at least two temperature zones in at least one position of the sample cell. Due to the rotational movement of the sample cell and the associated movement of the sample received in the cavity through the three temperature zones, the time-consuming, repeated heating and cooling steps during a PCR are avoided.
  • the means for performing a rotational movement is preferably an axis which is set in rotation by a corresponding drive.
  • the sample cell is preferably fixed on the axis such that the axis penetrates the sample cell in a substantially perpendicular direction. Most preferably, the axis penetrates the sample cell approximately in an area around its center.
  • rotationally symmetrical arrangement of the individual temperature control units about this rotatable axis the sample cell is moved evenly through the temperature zones by means of a rotary motion.
  • the simultaneous contact of the invention provided for receiving the sample cavity with at least two temperature zones has a positive effect on the effectiveness and speed of a PCR reaction.
  • Individual sections of the cavity, each of which receives a partial volume of the sample are each in contact with a temperature zone.
  • the temperature adjustment of these lower partial volumes to the temperatures necessary for carrying out the PCR reaction takes place very rapidly due to the reduced volume.
  • different temperatures can be set simultaneously in different cavity sections.
  • the reduction of the volume to be tempered and the parallelization of the heating and cooling steps for individual partial volumes lead to a time saving of up to two minutes per PCR cycle.
  • the cavity provided for receiving the sample is in contact with at least two temperature zones, regardless of the position of the sample cell. This ensures that the PCR reaction is more effective and faster at each point in time and at each sample cell rotational position due to the positive effects mentioned above.
  • the sample cell preferably has the shape of a disk and the cavity provided for receiving the sample particularly preferably extends over a circular sector with a center angle of 180 ° and particularly preferably over a circular sector with a center angle of approximately 360 °.
  • the cavity provided for receiving the sample extends over a circular sector with a center angle of approximately 225 ° or approximately 270 °.
  • the cavity is defined by a circular sector with a center angle of approximately 45 °, extends around 90 ° or around 135 °.
  • the surface / volume ratio is optimally designed for the fastest possible heat transfer.
  • the cavity provided for receiving the sample in the sample cell in the embodiments in which it extends over a circular sector with a center angle of approximately 360 ° substantially has the shape of a hollow cylinder.
  • the cavity preferably takes the form of parts of a hollow cylinder.
  • the radii of the hollow cylinder are chosen so that the reaction volume necessary for a PCR can be absorbed by the hollow cylinder.
  • the hollow cylinder usually ends in two openings, which serve to fill the samples. When filling the sample through an opening, the air contained in the hollow cylinder can escape through the second opening and the sample is thereby evenly distributed. After filling, the openings can be closed in a liquid-tight manner by means of suitable stoppers or by laboratory fat and cyanoacrylate.
  • Particularly preferred embodiments are those in which a plurality of hollow cylinders are formed concentrically in the sample cell, or a plurality of parts of a hollow cylinder are arranged concentrically and / or on a circular line in the sample cell. This allows multiple PCR applications to be performed in parallel using a single sample cell.
  • the sample cell is formed in two parts in the form of a holding device for a capillary and a capillary for receiving the sample, wherein the capillary is connected in compression fit with the holding device.
  • the holding device has substantially the shape of a disc with an upper side, a lower side and a disc edge, and for receiving the capillary, a recess is provided on the upper side, on the underside or on the edge of the pane.
  • a circumferential recess since in this case offers the possibility, for example, a longer capillary or two or more shorter capillaries clamp in any arrangement, which in turn several PCR applications in parallel by means of a single sample cell can be performed.
  • the capillary is secured in the most favorable case in the press fit in the recess of the holding device, that only at most half the circumference of the capillary wall is received by the recess.
  • the capillaries connected to the holding device are made, for example, from polypropylene, from polycarbonate or from Teflon and can, for example, be tightly closed after being filled with the sample by being sealed at both ends over a small flame.
  • the first, the second and the third temperature control unit each have at least one temperature-controllable block.
  • the heatable blocks are made of a good thermal conductivity material, preferably made of metal, particularly preferably made of aluminum.
  • These blocks can be brought to the desired temperatures by means of a suitable component for energy transmission, preferably for example by means of a heating mat or a Peltier element and by means of a suitable component for temperature measurement, for example by means of a platinum resistor with the aid of suitable control electronics (eg a PID controller).
  • a suitable component for energy transmission preferably for example by means of a heating mat or a Peltier element
  • a suitable component for temperature measurement for example by means of a platinum resistor with the aid of suitable control electronics (eg a PID controller).
  • the temperature zones defined by the tempering units can be expanded or expanded with suitable insulating materials.
  • suitable insulating materials for example, over one, over two or all three temperature-controllable blocks a larger-sized, open hollow body made of polystyrene foam (Styrofoam), be slipped, whereby a desired temperature in almost the entire hollow body interior can be adjusted by means of the temperature block and thus the temperature zone be extended can.
  • the individual temperature zones are isolated from each other.
  • styrofoam are suitable as insulating materials many known from the thermal insulation materials such as mineral fibers in the form of rock wool or glass wool, but also wood wool, hemp, felt or cork.
  • the temperature-controllable blocks of the first, the second and the third temperature control unit each have a notch for at least partially receiving the sample cell.
  • the indentations at least the edge regions of the sample cell are received by the heatable blocks in such a way that they are surrounded on three sides by the temperature-controllable block and the cavity with the sample is inserted between the blocks.
  • the cavity is arranged in the edge region of the sample cell such that the wall of the sample cell surrounding the cavity has a thickness of less than 500 ⁇ m both on the upper side of the preferably disc-shaped sample cell and on the underside and on the wafer edge. The sample is thus in close contact with the respective heatable block on three sides, which leads to a rapid temperature adaptation of the sample in the cavity.
  • the gap width of the notch can be varied by a suitable adjustment unit, such as elongated holes, and thereby the contact between the sample cell and the block can be optimally adjusted.
  • a suitable adjustment unit such as elongated holes
  • sample cells of different dimensions and geometries can be used.
  • Additional introduction of lubricant, preferably mineral oil allows a low-friction movement of the sample cell and also leads to improved heat transfer.
  • the wall of the sample cell facing a tempering unit at least in the region of the cavity provided for receiving the sample, has a thickness of less than 500 ⁇ m, very particularly preferably less than 300 ⁇ m and particularly preferably less than 200 ⁇ m.
  • the thickness of the wall of the sample cell influences the rate of heat transfer, that is, the thinner the wall, the faster the heat is transferred from the tempering units to the sample. At the same time, however, the wall thickness can not be arbitrarily reduced for reasons of stability. Both heat transfer and stability are in turn dependent on the type of Therefore, the wall thickness is determined according to the material and geometry of the sample cell.
  • the sample cell has a diameter between 10 mm and 50 mm, more preferably a diameter between 20 mm and 30 mm.
  • the thickness of the sample cell is preferably between 0.2 mm and 1.5 mm, particularly preferably around 1 mm.
  • the cavity provided for receiving the sample preferably has a depth of 0.1 mm to 0.8 mm, particularly preferably a depth of 0.5 mm, and terminates in two openings.
  • the cavity 8 preferably has a volume between 1 ⁇ and 50 ⁇ , more preferably a volume of 20 ⁇ and can thus accommodate the required reaction volume of a PCR approach.
  • a sensor set up and designed for the detection of nucleic acid oligomer hybridization events in particular a sensor set up and designed for surface-sensitive detection of nucleic acid oligomer hybridization events, is provided in the cavity of the sample cell provided for receiving the sample.
  • the sensor consists essentially of a modified surface, wherein the modification consists in the connection of at least one type of probe nucleic acid oligomers.
  • the term "surface” refers to any support material which is suitable for binding derivatized or non-derivatized probe nucleic acid oligomers covalently or via other specific interactions, directly or after appropriate chemical modification.
  • the solid support may be made of conductive or non-conductive material. Methods for immobilizing nucleic acid oligomers on a surface are known to those skilled in the art.
  • the modified surface has at least 2 spatially substantially separated regions, preferably at least 4 and in particular at least 12 spatially substantially separated regions.
  • the modified surface has at least 32, in particular at least 64, very particularly preferably at least 96 spatially substantially separated regions.
  • spatially substantially separated regions areas of the surface which are predominantly modified by attachment of a particular type of probe nucleic acid oligomer. Only in areas where two such spatially substantially separated regions are contiguous may a mixture of different types of probe nucleic acid oligomers occur.
  • a very particular advantage results from the fact that in addition a fourth temperature control unit is provided, wherein the fourth temperature control unit defines a fourth temperature zone which is spatially separated from the three temperature zones.
  • a fourth defined by a fourth temperature and spatially separated from the three temperature zones of the device temperature zone, it is possible to suspend portions of the sample cell, in particular the interior of the sample cell to a temperature that differs from the temperatures required to perform the PCR .
  • the geometry of the temperature-controllable block of the fourth temperature control unit and by choosing the arrangement in the device the area of the sample cell located in the fourth temperature zone can be determined.
  • the duration and frequency of incubation in the fourth temperature zone can be freely selected by adjusting the rotational speed of the sample cell.
  • the fourth temperature zone proves to be particularly advantageous for detection of nucleic acid oligomer hybridization events by means of a sensor.
  • the region of the sample cell in which the sensor is located is positioned in the fourth temperature zone, thereby providing optimum temperature conditions for detection.
  • a favorable temperature of about 50 ° C for this type of detection can be set.
  • the present invention also encompasses the use of the device according to the invention for carrying out a PCR, in particular for carrying out a real-time PCR.
  • the wall of the sample cell in a region in which the cavity is formed preferably has a circular predetermined breaking point
  • the predetermined breaking point is adapted exactly to the diameter of the capillary, so that the wall of the sample cell is broken at this point by pressing the capillary to the predetermined breaking point, the capillary thereby liquid-tight can penetrate into the wall of the sample cell and the liquid in the cavity through Capillary forces is drawn into the capillary.
  • the device according to the invention for carrying out a PCR can be used in a particularly advantageous manner in combination with a method for detecting nucleic acid oligomer hybridization events as an endpoint display and / or in real time.
  • the detection of the PCR products is carried out by a designed and designed for the detection of Nukleinklareoligomer- hybridization events sensor, which is provided in the space provided for receiving the sample cavity of the sample cell.
  • Particularly preferred is one for surface-sensitive Detection of Sensor Established and Designed by Nucleic Acid Oligomer Hybridization Events.
  • the method for detecting nucleic acid oligomer hybridization events is particularly preferably an endpoint method for detecting the PCR products, comprising the steps of providing a modified surface, wherein the modification consists in the attachment of at least one type of probe nucleic acid oligomers, providing at least one species of signal nucleic acid oligomers wherein the signal nucleic acid oligomers are modified with at least one detection label and the signal nucleic acid oligomers have a complementary or substantially complementary portion to the probe nucleic acid oligomers, providing a sample with target nucleic acid oligomers, contacting a defined amount of the signal nucleic acid oligomers with the modified surface and contacting the sample and the target nucleic acid oligomers contained therein with the modified surface, detection of the signal nucleic acid olig and comparison of the values obtained with the detection of the signal nucleic acid oligomers with reference values.
  • the signal nucleic acid oligomers in this case have a greater number of bases than the probe nucleic acid oligomers and have at least one docking section, wherein the docking section does not have a complementary or substantially complementary structure to a portion of the probe nucleic acid oligomers and wherein the target nucleic acid oligomers to the docking section have complementary or largely complementary section.
  • the docking section associates the target nucleic acid oligomers to the signal nucleic acid oligomers at a very high rate.
  • probe nucleic acid oligomers and signal nucleic acid oligomers are present as hybridized double strand upon addition of the target nucleic acid oligomers or probe nucleic acid oligomers and target nucleic acid oligomers upon addition of the signal nucleic acid oligomers.
  • Nucleic acid oligomer component Before binding the added Nucleic acid oligomer component must be solved in accordance with the bonds of the hybridized duplex.
  • the two nucleic acid oligomer components have probe nucleic acid oligomers and signal nucleic acid oligomers according to the method described above a different number of bases.
  • the signal nucleic acid oligomers have a greater number of bases and provide a docking portion which is in a non-hybridized state since it does not have a complementary or substantially complementary structure to a portion of the probe nucleic acid oligomers.
  • the target nucleic acid oligomers now have a section which is complementary or largely complementary to the docking section.
  • the target nucleic acid oligomers can bind directly to this docking section without prior displacement of a hybridized component.
  • this displacement is due to the already done hybridization with the docking section at a much higher speed.
  • Another method for the detection of nucleic acid oligomer hybridization events comprises the steps of providing a modified surface, wherein the modification in the attachment at least one type of probe nucleic acid oligomer, providing a sample with target nucleic acid oligomers, providing a solution with at least one type of signal nucleic acid oligomers, wherein the signal nucleic acid oligomers are modified with at least one detection label, the signal nucleic acid oligomers one to the probe nucleic acid oligomers have complementary or largely complementary section and the signal nucleic acid oligomers have a complementary or substantially complementary to the target nucleic acid oligomers section, mixing the Solution with signal nucleic acid oligomers and the sample with target nucleic acid oligomers, contacting the mixture of signal nucleic acid oligomers and target nucleic acid oligomers with the
  • a "substantially complementary structure” is understood as meaning sequence sections in which a maximum of 20% of the base pairs form mismatches. the base pairs form mismatches.
  • a “substantially complementary structure” is a sequence segment in which a maximum of 10% of the base pairs form mismatches and very particularly preferably sequence segments in which a maximum of 5% of the base pairs form mismatches spectroscopic, electrochemical and electrochemiluminescent methods are particularly preferred in this context, as a spectroscopic method is particularly a detection of fluorescence, in particular total internal reflection fluorescence by a surface-sensitive detection method, since in this case only the signal-nucleic acid oligomers bound to the surface (TIRF) of the signal nucleic acid oligomers preferred.
  • TIRF surface-sensitive detection method
  • cyclic voltammetry, amperometry, chronocoulometry, impedance measurement or scanning electrochemical microscopy are preferably used.
  • the present invention also includes a method for performing PCR using the device according to the invention, wherein Sample cell is moved by the spatially separated temperature zones by means of a rotary motion.
  • Sample cell is moved by the spatially separated temperature zones by means of a rotary motion.
  • the rotational speed of the sample cell By selecting the rotational speed of the sample cell and matching it to the geometry of the temperature-controllable blocks, the residence time of the sample in the various temperature zones and thus the duration of the steps of a PCR cycle are determined. Since the different temperatures are already specified by the temperature control units, all parameters necessary for the PCR cycles can be set with a single parameter setting, namely the setting of the rotational speed of the sample cell. This leads to a user-friendly use of the device, as a complicated and time-consuming programming is eliminated.
  • the sample cell is moved at a constant speed.
  • Particularly preferred is a method for carrying out a PCR using the device according to the invention, in which the DNA chip is in the fourth temperature zone during the performance of an electrochemical detection of nucleic acid oligomer hybridization events.
  • the temperatures favorable for electrochemical detection with the aid of a DNA chip generally differ from the temperatures required for the PCR steps.
  • PCR and detection can take place at the respectively advantageous temperatures.
  • a particular advantage results from the use of the device according to the invention in one of the methods presented above in that the PCR reaction and z.
  • Show it 1 is a schematic representation of an embodiment of the device according to the invention for carrying out a PCR
  • Fig. 2a is a schematic representation of a sample cell with four
  • Fig. 2b is a schematic representation of a plurality of sample cells with
  • Fig. 3 is a perspective view of an embodiment of a
  • Fig. 4 is a perspective view of a sample cell with integrated
  • 5a shows a plan view of an embodiment of a two-part sample cell
  • FIG. 5b is a schematic representation of a vertical section of the sample cell of Figure 5a
  • Fig. 5c is a schematic representation of a vertical section of another
  • FIG. 6 shows the result of a comparative PCR in a standard PCR thermocycler and the device according to the invention.
  • the device 1 shows a schematic representation of an embodiment of the device 1 according to the invention for carrying out a PCR.
  • the device 1 according to the invention comprises a first 2a, a second 2b and a third 2c independently adjustable temperature control unit, whereby three temperature zones, in the present example 96 ° C, 55 ° C and 72 ° C, are defined.
  • the three temperature control units 2a, 2b, 2c each have one temperable block 6 on.
  • the three blocks 6 are made of a good thermal conductivity material, preferably aluminum, but they can also consist of other suitable metal compounds.
  • the device 1 has a suitable means for energy transfer 13, preferably a heating mat or a Peltier element and a means for measuring temperature, preferably a platinum resistor or a digital thermometer.
  • a suitable control electronics eg PI or PID controller
  • the three blocks 6 can be controlled exactly and thus the temperature zones are defined so that there are favorable temperatures for a PCR reaction.
  • the tempering units 2a, 2b, 2c are arranged on a base plate 10 so that they essentially describe the vertices of a triangle and their relative distance and / or their relative position to each other is freely adjustable. In principle, however, the tempering units can also be arranged in any other geometries. Centered between the temperature control units 2a, 2b, 2c is a means 3, 4 for carrying out rotational movement of the sample cell 5.
  • the means for performing a rotational movement comprises an axis 4 which is connected to the sample cell 5, and an electric motor 3.
  • the sample cell 5 of the illustrated example is, as is apparent from Figure 3, substantially disc-shaped, wherein the cavity 8 provided for receiving the sample extends over a circular sector with a center angle of approximately 360 °.
  • Each block 6 of the three tempering units 2 a, 2 b, 2 c has a notch 7, which is designed for at least partially receiving the sample cell 5.
  • the sample cell 5 fixed to the axis 4 is partially inserted into each block 6, so that the sample cell 5 is arranged in one or more subareas in the three temperature zones and the cavity 8 is independent of the position of the sample cell 5 is in contact with three temperature zones.
  • the temperature control units 2a, 2b, 2c have a suitable adjustment unit 15, preferably oblong holes, over which the gap width of the notches 7 varies and can be adapted exactly to the thickness of the sample cell 5.
  • a suitable adjustment unit 15 preferably oblong holes, over which the gap width of the notches 7 varies and can be adapted exactly to the thickness of the sample cell 5.
  • the sample cell 5 is set in rotation, so that the individual portions of the sample cell 5 are guided through the three temperature zones.
  • a lubricant e.g., mineral oil
  • the introduction of a lubricant causes low friction rotation of the sample cell 5 as well as improved heat transfer.
  • the rotational speed or rotational frequency By varying the rotational speed or rotational frequency, the time in which the critical temperatures for the PCR reaction applied to the individual portions of the sample cell 5, can be varied.
  • the embodiment shown in FIG. 2a has a fourth temperature control unit 2d, which defines a fourth temperature zone that is spatially separated from the three temperature zones.
  • the fourth temperature control unit 2d can hold a sensor 12 (see FIG. 4) contained in the sample cell 5, preferably a DNA chip, at a specific temperature.
  • FIG. 2b A further embodiment of the device 1 with a plurality of indentations 7 in each temperature-controllable block 6 is shown in FIG. 2b. By means of this embodiment, several separate PCR reactions can be performed in parallel in one device.
  • the sample cell 5 has a flat basic shape, preferably a cylindrical shape and consists of a plastic which has a temperature resistance up to at least 100 ° C. To observe the Sample behavior, it is advantageous if it is a transparent plastic.
  • the sample cell 5 preferably has a diameter d between 10 mm and 50 mm and a thickness b between 0.2 mm and 1.5 mm.
  • the intended for receiving the sample cavity 8 extends over a circular sector with a center angle of approximately 360 ° and has substantially the shape of a hollow cylinder with a preferred depth t of 0.1 mm to 0.8 mm, which in two openings 1 ends.
  • the cavity 8 has a volume between 1 ⁇ and 50 ⁇ , preferably 20 ⁇ and can thus accommodate the required reaction volume of a PCR approach.
  • the sample cell 5 has a bore 9, by means of which the sample cell 5 in the device 1 according to the invention is attached to a means 3,4 for carrying out a rotational movement of the sample cell 5, preferably on a rotatable axis 4.
  • the openings 1 1 of the cavity 8 after filling with the PCR reaction mixture with laboratory grease, eg glisseal ® N and cyanoacrylate or by a suitable stopper 16, preferably made of rubber or plastic.
  • the cylindrical sample cell 5 has a cavity 8 for receiving the samples.
  • a bore 9 is provided, by means of which the sample cell 5 in the device according to the invention is attached to a means for carrying out a rotational movement of the sample cell, preferably on a rotatable axis.
  • the sensor 12 is in the present embodiment, a DNA chip.
  • the cavity 8, which has the shape of a hollow cylinder and contains the PCR reaction mixture, is widened by a branching channel 8.1, which communicates with the sensor surface. As a result, the sample to be analyzed, the PCR reaction mixture, reaches the sensor 12.
  • FIGS. 5a, 5b and 5c show further embodiments of a sample cell 5 with cavity 8, namely two-part embodiments.
  • the sample cell 5 is designed as a holding device for a capillary, and the cavity 8 provided for receiving the sample is formed by a capillary.
  • the holding device 5 has for receiving the capillary 8 has a recess 18 into which the capillary 8 is clamped for clamping connection.
  • FIG. 5a shows a plan view of a two-part embodiment
  • FIG. 5b shows a vertical section through the sample cell shown in FIG.
  • FIG. 5a shows a vertical section through a further two-part embodiment, in which a circumferential recess 18 for the clamp-locking reception of the capillary 8 extends on the disk edge of the holding device 5.
  • Example 1 Production of a Sample Cell
  • the sample cell is constructed from two plastic parts, namely a lower part containing the cavity intended to receive the sample, and an upper part.
  • the bottom, cavity-containing plastic part of a sample cell having an approximate diameter of 15 mm and a thickness of about 1 mm is made of a polymethylmethacrylate blank, with an approximately 0.5 mm deep cavity 8 in Is milled into a hollow cylinder, which in two through openings 1 1 ends. In the center of the lower part of the sample cell, a bore 9 is introduced.
  • a piece of acrylic glass is glued to the lower plastic part with a suitable adhesive.
  • the acrylic glass sheet is thereby liquid-tightly connected to the lower, forming acrylic glass part.
  • an adhesive for acrylic glass for example, cyanoacrylate or dichloromethane can be used, for other polymers, some other adhesives may be necessary.
  • materials with higher thermal conductivity can be used or the wall thicknesses of the materials can be reduced.
  • other methods of connecting the lower molding plastic part of the sample cell 5 to the upper plastic disk such as e.g. Welding process such as laser plastic welding conceivable.
  • Alternative void geometries with optional sensors 12 may be fabricated in machining processes, by molding processes (e.g., injection molding techniques), by stereolithographic or other suitable methods.
  • An integrated sensor 12 can be contacted, for example, via an outgoing PCB circuit board 17, as shown in FIG.
  • a plurality of separate cavities 8 with a plurality of separate openings 11 can be introduced into a sample cell 5, as a result of which several PCR reactions in a sample cell 5 can take place in parallel. Also in this case it is possible to analyze the samples via a common or several sensors 12, (for example, per cavity 8 a sensor 12).
  • a sample cell 5 enable a contamination-free "quasi-closed" liquid transfer from the cavity 8 of the sample cell 5 to an external detection system, for example a miniaturized gel electrophoresis capillary in a region in which the cavity 8 is formed, a substantially circular predetermined breaking point.
  • the predetermined breaking point can be introduced, for example, by tailor-made reduction of the wall thickness.
  • embodiments which additionally have a "female" connection side (inner cone) of a Luer-Lock connection at the predetermined breaking point Pierce predetermined breaking point and create a "quasi-closed" system between the cavity of the sample cell and the interior of the syringe.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • a so-called master mix is prepared.
  • a reaction vessel e.g. A 2 ml micro screw cap tube labeled accordingly and placed in a cooling rack (0 ° C - 4 ° C).
  • the primers concentration mostly 10 ⁇
  • standard PCR buffer and MgAc 100 mM
  • the DNA template to be amplified ie the isolated, purified and duplicated DNA material
  • the DNA template to be amplified is collected in 0.2 ml or 0.5 ml PCR reaction tubes, also PCR tubes (in the cooling rack at about 0 ° C - 4 ° C) submitted (usually 5 to 10 ⁇ ) and supplemented with a master mix to usually 20 ⁇ to 50 ⁇ .
  • water DNA-free
  • Mastermix ie the isolated, purified and duplicated DNA material
  • the polymerase is added to the provided PCR tubes (with template and master mix or with water and master mix in the case of the negative sample) and mixed by repeatedly aspirating and emptying the pipette.
  • the steps denaturation, annealing (primer hybridization) and elongation are repeated.
  • the double-stranded DNA templates are heated to 94-96 ° C to separate the strands.
  • the DNA is often heated for a long time (initialization) to ensure that both the starting DNA and the primer have completely separated from each other and only single strands are present.
  • a temperature is set for about 30 seconds, which allows a specific attachment of the primer to the DNA. The exact temperature is determined by the length and the sequence of the primers (usually in the temperature range of about 55-65 ° C).
  • the DNA polymerase fills in the missing strands with free nucleotides.
  • the temperature depends on the working optimum of the DNA polymerase used (usually about 68 - 72 ° C). This step takes about 30 seconds per 500 base pairs, but varies depending on the DNA polymerase used.
  • a BioRad thermocycler (model iCycler) was used. 100 ⁇ of common master mix was used for all reactions carried out, as listed in Table 1 below. 20 ⁇ template (DNA extract from Legionella pneumophila, approximately 100 DNA copies / 5 ⁇ ) were mixed with 80 ⁇ M master mix, mixed with Taq polymerase (BioTaq from BIOLINE) and in 4 batches of 25 ⁇ each split (one for the PCR in the standard PCR thermocycler, three for the PCR using the device according to the invention). In addition, a negative control (5 ⁇ water plus 20 ⁇ master mix with polymerase, standard thermal cycler) was used. All PCR conditions are given in Table 1. The apparatus used for carrying out the PCR and the sample cell are described in connection with FIGS. 1 to 4 and Example 1.
  • reaction time of the PCR of about 45 min (standard PCR) could be shortened to 25 min.
  • Optimized heater block geometries and minimized wall thicknesses of the sample cell should allow a further reduction of the reaction time for PCR to approximately 10 minutes or less.
  • the result of the PCR was checked by agarose gel electrophoresis.
  • Agarose gel electrophoresis is a method by which DNA fragments, in particular the PCR products, can be identified by their size.
  • the DNA is introduced into an agarose gel and then applied a voltage. As a result, shorter DNA fragments move faster towards the positive pole than longer DNA fragments.
  • the length of the PCR product can be determined by comparison with a DNA ladder containing DNA fragments of known size and co-running with the sample in the gel.
  • FIG. 6 shows a photograph of the PCR products analyzed by gel electrophoresis, which were obtained in the experiments summarized in Table 1.
  • A the gel electrophoretic analysis by means of a standard PCR reaction in PCR products obtained in a standard cycler
  • B The negative control by standard PCR reaction performed in a standard cycler
  • the gel electrophoretic analysis of the PCR products obtained using the device according to the invention are dependent on the rotation speed of the sample cell at C (0.5 revolutions per minute), D (1 revolute per minute) and E (2 revolutions per minute) designated.
  • F denotes a DNA ladder.

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Abstract

Beschrieben wird eine Vorrichtung (1) zur Durchführung eines PCR-Verfahrens, wobei die Vorrichtung wenigstens eine Probenzelle (5) mit einem Hohlraum (8) zur Aufnahme einer Probe und mindestens eine erste (2a), eine zweite (2b) und eine dritte (2c) unabhängig voneinander regulierbare Temperiereinheit umfasst. Die drei Temperiereinheiten (2a, 2b, 2c) definieren dabei drei räumlich voneinander getrennte Temperaturzonen. Es ist mindestens ein Mittel (3, 4) zur Durchführung einer Drehbewegung der Probenzelle (5) vorgesehen. Der zur Aufnahme der Probe vorgesehene Hohlraum (8) kann aufgrund der Drehbewegung der Probenzelle (5) durch die drei räumlich voneinander getrennten Temperaturzonen bewegt werden, wobei der Hohlraum in wenigstens einer Position der Probenzelle (5) mit zumindest zwei Temperaturzonen in Kontakt steht.

Description

Vorrichtung zur Durchführung einer PCR
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung der Polymerasen-Kettenreaktion (PCR).
Stand der Technik Die PCR ist eine für die Molekularbiologie grundlegende Methode, die der Vervielfältigung von DNA-Molekülen dient und den schnellen, empfindlichen Direktnachweis kleinster Mengen von DNA oder RNA erlaubt. In den vergangenen Jahren hat diese Methode die Labors erobert, da ihre Anwendung sehr breit und vielschichtig ist. Die PCR hat in fast allen Bereichen der Wissenschaft und Medizin, einschließlich der forensischen Medizin, der pränatalen Diagnostik, der Onkologie und nicht zuletzt in der mikrobiologischen Diagnostik Einzug gehalten. Beispielsweise ist die PCR auf dem Sektor der klinischen Diagnostik meist die Methode der Wahl um z. B. Krankheitserreger nachzuweisen. Ebenso wird sie in der Lebensmittelindustrie als Nachweismethode für belastende Keime angewandt.
Bei der PCR handelt es sich um eine enzymatische Reaktion zur Amplifikation von Nukleinsäuremolekülen, die im Wesentlichen in einem wässrigen bzw. flüssigen Reaktionsgemisch mit sehr kleinen Volumina abläuft. Im Reaktionsgemisch befindet sich eine Nukleinsäure enthaltende Probe und die für die Reaktion notwendigen Primer, Nukleotide und eine Polymerase. Durch Zugabe von Puffern und vorzugsweise zweiwertigen Ionen wie z. B. Mg2+ wird das Reaktionsgemisch so eingestellt, dass die für die jeweilige Anwendungsart optimalen Reaktionsbedingungen herrschen. Die Polymerase-Kettenreaktion beruht auf einem Zyklus aus drei, bei unterschiedlichen Temperaturen ablaufenden Schritten, nämlich Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung. Bei der Denaturierung wird das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur größer 90°C, vorzugsweise 94°C bis 95°C erhitzt. Dadurch trennen sich die beiden komplementären Stränge einer doppelsträngigen DNA, die DNA wird „aufgeschmolzen" bzw. denaturiert und liegt in Einzelsträngen vor. Die Denaturierung ist ein sehr schneller Prozess und ist in der Regel innerhalb von Sekunden abgeschlossen.
Bei der Hybridisierung (auch„Annealing") wird die Temperatur auf eine sogenannte „Annealing-Temperatur" herabgesetzt. Bei dieser Temperatur verbinden sich die Primer mit der DNA, sie hybridisieren. Die „Annealing-Temperatur" richtet sich dabei nach Länge und Sequenz der Primer und kann aus diesen Eigenschaften spezifisch für jeden Primer bestimmt werden. In der Regel liegen die„Annealing- Temperaturen" in einem Temperaturbereich von 55°C bis 65°C, können anwendungsspezifisch jedoch auch niedriger oder höher eingestellt werden. Die Hybridisierung hat einen geringen Zeitbedarf und erfolgt innerhalb von Sekunden.
Für die Verlängerung, dem an das „Annealing" anschließenden Schritt, wird die Temperatur weiter erhöht, vorzugsweise auf 70°C bis 74°C. Dies ist die ideale Arbeitstemperatur für die in der Regel verwendeten Polymerasen, welche beginnend an den gebundenen Primern weitere Nukleotide an die entstehenden DNA-Stränge anbauen. Im angegebenen Temperaturbereich brechen zudem lose Verbindungen zwischen Primern und solchen Template-DNA-Abschnitten wieder auf, die nicht vollständig komplementär sind.
Der Verlängerungsschritt ist derjenige Schritt der PCR, der in der Regel den größten Zeitbedarf mit sich bringt. So ist beispielsweise die Arbeits- bzw. Reaktionsgeschwindigkeit der Polymerase zeitlimitierend, das heißt je kürzer die optimale Temperatur von etwa 70°C bis 74°C herrscht, desto kürzer bleiben auch die neu synthetisierten DNA-Stränge. In der Regel reichen auch im Verlängerungsschritt mehrere Sekunden (15 bis 60 Sekunden) aus, jedoch wird in Standard-PCR-Verfahren bei sehr langen zu synthetisierenden DNA-Molekülen eine Zeitspanne im Minutenbereich (von einer bis zu mehreren Minuten) zur DNA- Verlängerung gewählt. Bei jeder Wiederholung obiger drei Schritte verdoppelt sich die Anzahl an kopierten DNA-Molekülen. Nach 20 Zyklen entstehen auf diese Weise aus einem einzigen DNA-Doppelstrang etwa eine Million Moleküle.
Die Anzahl der Zyklen kann je nach Anwendungsart, Beschaffenheit der Probe und den spezifischen Anforderungen und Reaktionsbedingungen entsprechend gewählt werden. Ebenso wird die Einstellung der Zeitspannen für die einzelnen Schritte an die spezifischen Anforderungen bestimmter Anwendungsarten angepasst. Die oben aufgeführten Angaben beziehen sich im Wesentlichen auf Standard- PCR-Verfahren, in denen von einer doppelsträngig vorliegenden Proben-DNA Kopien erstellt werden. Es gibt jedoch eine ganze Reihe besonderer PCR- Verfahren, für die im Einzelfall die Bedingungen angepasst werden müssen. Ein Beispiel einer ganz speziellen PCR-Anwendung stellt die sogenannte RT-PCR (Reverse Transkriptase PCR) dar. Hierbei erfolgt mit Hilfe einer Reversen Transkriptase eine Amplifikation ausgehend von einer Proben-RNA. Dabei wird in einem ersten Schritt ein Hybrid-Doppelstrang RNA DNA erzeugt, indem die Reverse Transkriptase einen zur vorliegenden Proben-RNA komplementären DNA- Strang synthetisiert. In einem zweiten Schritt, einer„gewöhnlichen" PCR, kann die so entstandene DNA nach Denaturierung des Hybrids wieder als Matrize verwendet werden.
Erwähnenswert ist in diesem Zusammenhang noch eine besondere Art der PCR, die Real-Time-PCR. Diese quantitative PCR Methode erfreut sich in den molekularbiologischen Labors immer größerer Beliebtheit, da sie eine Detektion der Proben-DNA bzw. der Amplifikationsprodukte in Echtzeit und zugleich die Bestimmung der Menge einer Proben-DNA erlaubt. Die Bestimmung der DNA-Menge am Ende einer PCR lässt aus vielerlei Gründen nicht direkt Rückschlüsse auf die Zahl der ursprünglich vorliegenden Moleküle zu, da z.B. am Anfang wie auch am Ende der PCR die Bedingungen für die Polymerasen nicht unbedingt optimal sind und daher die Amplifikation nicht über die ganze Reaktionszeit gleichmäßig abläuft. Daher kann die Quantifizierung am Ende einer PCR sehr ungenau sein. Wesentlich genauere Quantifizierungen sind möglich, wenn die Anzahl gebildeter DNA-Moleküle schon während der Reaktion, also nach jedem einzelnen Zyklus, erfasst wird. Diese Quantifizierung geschieht in der Regel über eine Fluoreszenzmarkierung der neu synthetisierten DNA-Moleküle. Besonders in der medizinischen Diagnostik aber auch in der Targetsuche und in der Grundlagenforschung ist eine Mengenbestimmung der Proben-DNA unumgänglich, weshalb in diesen Bereichen eine Quantifizierungsmöglichkeit in Echtzeit sehr gefragt ist. Bei einer herkömmlichen PCR-Anwendung wird das Reaktionsgemisch, nämlich eine Nukleinsäure enthaltende Probe („Template-DNA"), Primer, Nukleotide, Polymerase und Puffer in einem Reaktionsgefäß gemischt, wobei üblicherweise zwischen 10 μΙ und 100 μΙ Reaktionsgemisch im Reaktionsgefäß eingesetzt werden. Das Reaktionsgefäß wird in einer Aufnahmeeinheit fixiert und einer Anzahl an Temperaturzyklen ausgesetzt. Bei den Aufnahmeeinheiten handelt es sich in der Regel um temperierbare Metallblöcke, die mit Vertiefungen zur Aufnahme der Reaktionsgefäße ausgestattet sind. Bei den Reaktionsgefäßen, deren Fassungsvermögen in einem Bereich von etwa 200 μΙ bis 500 μΙ Volumen liegt, handelt es sich in der Regel um einzelne, verschließbare Gefäße oder um Streifen oder Platten mit mehreren Vertiefungen, sogenannte Multi-Well-Streifen bzw. - Platten. Anzahl und relative Abstände der Vertiefungen der Multi-Well-Platten oder -Streifen sind dabei auf die Vertiefungen der temperierbaren Metallblöcke abgestimmt, so dass eine Fixierung in den Metallblöcken möglich ist. Bei allen in diesen herkömmlichen PCR-Anwendungen in der Regel eingesetzten Vorrichtungen werden die Temperaturzyklen durch ein immer wiederkehrendes Aufheizen und Abkühlen der temperierbaren Blöcke generiert, wobei die Steuerung meist über Peltier-Elemente erfolgt. Ein großer Nachteil an diesen sich wiederholenden Aufheiz- und Abkühlphasen ist der dafür notwendige Zeitaufwand. Je nach Anbieter, Qualität und Preisklasse weisen die erhältlichen Vorrichtungen deutliche Unterschiede in Heiz- und Kühlraten der temperierbaren Blöcke auf. Als Faustwert für die Aufheizphase kann eine Rate von ca. 1 °C bis 10°C pro Sekunde angegeben werden, die Kühlraten liegen noch etwas niedriger. Für das Erreichen der jeweilig gewünschten Zieltemperaturen pro Zyklus ist also ein Zeitaufwand zwischen 15 Sekunden und 2 Minuten erforderlich, womit sich bei 30 Zyklen für das Heizen und Kühlen ein Zeitbedarf von bis zu einer Stunde ergibt. Gerade für Labors mit hohem Probendurchsatz stellt dieser Zeitaufwand eine Limitierung ihrer Effizienz dar.
Bestrebungen zur Entwicklung alternativer, vor allem schnellerer und effizienterer Vorrichtungen zur Temperatur-Zyklisierung haben zum Beispiel dazu geführt, mehrere Temperiereinheiten bereitzustellen und die Proben zwischen den Temperiereinheiten zu bewegen. So offenbart beispielseise die WO 90/05023 ein Gerät zum wahlweisen Einstellen der Temperatur einer Probe auf verschiedene Werte umfassend einen Probenaufnahmeblock mit hoher Wärmeleitfähigkeit und eine Vorrichtung zur Einstellung der Temperatur mit mindestens zwei thermostatisierbaren Körpern. Der Probenaufnahmeblock wird über eine Transporteinrichtung in Kontakt mit einem der Körper gebracht. Die Bewegung des Probenaufnahmeblockes erfolgt in Form einer Verschiebung, so dass zu einer definierten Zeit jede Probe einer bestimmten Temperatur ausgesetzt ist.
Daneben stellt die WO 2008/034896 A2 eine Vorrichtung zur Durchführung einer real-time PCR zur Verfügung, bei der jede Probe sequentiell mit unterschiedlichen Temperaturzonen in Kontakt gebracht werden kann, indem das Probengefäß, nämlich die Reaktionskammer, mittels eines Schrittmotors schrittweise von einer Temperaturzone zu einer anderen Temperaturzone bewegt wird.
Ferner beschreibt die US 2002/01 10899 A1 einen „Rotations-Thermocycler" mit mehreren Stationen zur Aufnahme von Probengefäßen, wobei die Stationen zur Einstellung verschiedener Temperaturen ausgelegt sind. Die Proben können mit Mitteln zur Bewegung der Probengefäße schrittweise von einer Station zur nächsten bewegt werden. Damit kann jede Probe aufeinander folgend den verschiedenen Temperaturen ausgesetzt werden. Die US 6,875,602 B2 offenbart einen tragbaren Thermocycler, bei dem mehrere Heizblöcke auf einer rotierenden Platte angeordnet sind. Die Probengefäße können in Form von Kapillarröhrchen ausgebildet und in Kassetten angeordnet sein und werden schrittweise zu den Heizblöcken bewegt. Die Kapillarröhrchen mit den aufgenommenen Proben werden durch die schrittweise Bewegung der Kassetten von einer Temperaturzone zu einer anderen Temperaturzone bewegt und damit aufeinanderfolgend den verschiedenen Temperaturen ausgesetzt.
Zwar geht bei allen genannten Vorrichtungen zur Durchführung einer PCR die Temperierung der Proben aufgrund des Transfers der Proben von einer Temperiereinheit zur nächsten schneller als bei herkömmlichen Vorrichtungen, bei denen ein wiederholtes Aufheizen und Abkühlen einer einzigen Temperiereinheit vorgesehen ist, jedoch stellt sich durchwegs das Problem, dass der Wärmeübertrag von der Temperiereinheit in das Probengefäß und damit auf die Probe nicht optimal ist. Durch die meist geringen Kontaktflächen zwischen Probengefäß und Temperiereinheit, beispielsweise bei Flachbodengefäßen, die auf einer temperierbaren Station abgestellt werden, sind längere Inkubationszeiten notwendig, um einen Temperaturübertrag auf die Probe zu gewährleisten, damit an jeder Stelle des Probenvolumens die gewünschte Temperatur erreicht wird und für die Dauer der gewünschten Reaktionszeit vorherrrscht. Letztlich führen die beschriebenen Vorrichtungen also zu keiner deutlich spürbaren Zeitersparnis gegenüber herkömmlicher PCR-Geräte.
Bei einem weiteren alternativen Verfahren zur Durchführung einer PCR wird das Reaktionsgemisch durch einen Kanal bewegt, der wiederholt verschiedene
Temperaturzonen durchläuft. Ein derartiges PCR-Verfahren und eine Vorrichtung zu dessen Durchführung wird beispielsweise in der EP 1 584 692 B1 offenbart.
Hier werden Scheiben beschrieben, auf denen konzentrische Temperaturzonen z.
B. mittels zweier Infrarot-Ringheizgeräte definiert werden. Ein Kanal durchläuft diese Temperaturzonen in Zick-Zack-Form. Das Reaktionsgemisch wird durch
Rotation der Scheibe mittels Fliehkraft durch den Kanal bewegt und passiert somit die verschiedenen Temperaturzonen. Nachteilig an der in der EP 1 584 692 B1 beschriebenen Vorrichtung ist, dass die Flussrate des Reaktionsgemisches und somit die Verweildauer in den einzelnen Temperaturzonen über die Rotationsgeschwindigkeit der Scheibe eingestellt wird. Diese Flussrate kann jedoch je nach Viskosität der eingesetzten Probe sehr unterschiedlich ausfallen, wodurch eine sinnvolle und gleichmäßige Thermozyklisierung für jede Probe neu ermittelt werden müsste. Die beschriebenen Scheiben stellen zudem ein sehr aufwändiges und damit teueres Verbrauchsmaterial dar. Schließlich wird in der DE 694 29 038 T2 eine Vorrichtung zur Nukleinsäurevervielfältigung offenbart, die eine Kapillarröhren-Reaktionskammer, eine erste und zweite Heizeinrichtung sowie eine Positioniervorrichtung umfasst. Das Inkontaktbringen der Probe mit unterschiedlichen Temperaturbereichen erfolgt u.a. durch ein„Hindurchpumpen" der Probe durch die Kapillarröhre oder durch eine Bewegung der Heizeinrichtung. Sowohl ein Hindurchpumpen der Probe durch die Kapillarröhrchen als auch eine Bewegung der Heizeinrichtung ist umständlich und erfordert einen relativ hohen technischen Aufwand.
Darstellung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung zur Durchführung einer PCR zur Verfügung zu stellen, die eine sehr schnelle Thermozyklisierung erlaubt und dabei einfach in der Handhabung und zugleich kostengünstig und universell einsetzbar ist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Vorrichtung gemäß dem unabhängigen Patentanspruch 1 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden folgende Abkürzungen und Begriffe benutzt: PCR Polymerase-Kettenreaktion
A Adenin
G Guanin
C Cytosin
T Thymin
u Uracil
Base A, G, T, C oder U
bp Basenpaar
dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat; eine Mischung aus dATP
(Desoxyadenosintriphosphat), dCTP (Desoxycytosin- triphosphat), dGTP (Desoxyguanintriphosphat) und dTTP (Desoxythymintriphosphat) als Bausteine für die DNA- Synthese; äquivalent zu Nukleotide
Nukleinsäure- Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z.B. Oligomer Nukleinsäure-Oktamer: Eine Nukleinsäure mit beliebigem
Rückgrat, bei der 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind).
ns-Oligomer Nukleinsäure-Oligomer
Oligomer Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer.
Oligonukleotid Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z.B. ein DNA-, PNA- oder RNA-Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge.
Oligo Abkürzung für Oligonukleotid.
Basenabfolge Äquivalent zu Sequenz.
Nukleotide Äquivalent zu dNTP.
Sequenz Genaue Abfolge der einzelnen Basen A, C, G, T (oder U) innerhalb eines Nukleinsäuremoleküls.
Nukleinsäure Wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z.B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z.B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z.B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid- Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z.B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat- oder Dithio-Phosphat- Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist es, dass sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann.
Matrize Als„Vorlage" dienendes Nukleinsäuremolekül; äquivalent zu
Probe, Proben-Nukleinsäure, Proben-DNA oder Template.
DNA Desoxyribonukleinsäure
RNA Ribonukleinsäure
Template Proben-Nukleinsäure, die mittels der PCR amplifiziert wird;
äquivalent zu Matrize
Primer Kurzes, einzelsträngiges Oligonukleotid mit einer
Basenabfolge komplementär zu einem Abschnitt der Proben-Nukleinsäure, das der Polymerase als Startpunkt für die Synthese dient; der Primer lagert sich in einem sog. Hybridisierungsschritt (auch: Annealing) an komplementäre Abschnitte der in Einzelsträngen vorliegenden Proben- Nukleinsäure an, wodurch ein kurzer, doppelsträngiger DNA-Abschnitt zur Verfügung steht, an dem die Polymerase ansetzt und durch Anfügen weiterer komplementärer Nukleotide den zweiten DNA-Strang synthetisiert.
Polymerase Enzym, das doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle synthetisiert, indem es einen vorliegenden Einzelstrang als Matrize nutzt und nach dessen Sequenz die Nukleotide für den komplementären Strang aneinanderfügt. In der PCR Methode wird eine thermostabile Polymerase, z.B. Taq- Polymerase (die ursprünglich aus einem thermophilen Organismus Thermus aquaticus isoliert wurde) eingesetzt, deren optimale Arbeitstemperatur in einem Bereich von 70°C bis 74°C liegt und die auch gegenüber Temperaturen von bis zu 100°C und mehr tolerant ist.
Zur Ausbildung der Watson Crick Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, dass die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet.
Single Strand (Einzelstrang)
double Strand (Doppelstrang)
Aufeinanderfolge von Denaturierung, Hybridisierung (auch Annealing) und Verlängerung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung zur Durchführung eines PCR- Verfahrens zur Verfügung, wobei die Vorrichtung wenigstens eine Probenzelle mit einem Hohlraum zur Aufnahme einer Probe und mindestens eine erste, eine zweite und eine dritte unabhängig voneinander regulierbare Temperiereinheit umfasst. Die drei Temperiereinheiten definieren dabei drei räumlich voneinander getrennte Temperaturzonen. Die Vorrichtung umfasst ein Mittel zur Durchführung einer Drehbewegung der Probenzelle, wobei der zur Aufnahme der Probe vorgesehene Hohlraum aufgrund der Drehbewegung durch die drei räumlich voneinander getrennten Temperaturzonen bewegt werden kann. Der zur Aufnahme der Probe vorgesehene Hohlraum steht in wenigstens einer Position der Probenzelle mit zumindest zwei Temperaturzonen in Kontakt. Aufgrund der Drehbewegung der Probenzelle und der damit verbundenen Bewegung der im Hohlraum aufgenommenen Probe durch die drei Temperaturzonen werden die zeitraubenden, wiederholten Aufheiz- und Abkühlschritte während einer PCR vermieden. Bei dem Mittel zur Durchführung einer Drehbewegung handelt es sich bevorzugt um eine Achse, die durch einen entsprechenden Antrieb in Rotation versetzt wird. Die Probenzelle wird bevorzugt so auf der Achse fixiert, dass die Achse in einer im Wesentlichen senkrechten Richtung die Probenzelle durchdringt. Ganz besonders bevorzugt durchdringt die Achse die Probenzelle näherungsweise in einem Bereich um deren Mittelpunkt. Durch eine beispielsweise rotationssymmetrische Anordnung der einzelnen Temperiereinheiten um diese rotierbare Achse wird die Probenzelle mittels einer Drehbewegung gleichmäßig durch die Temperaturzonen hindurch bewegt.
Der erfindungsgemäße gleichzeitige Kontakt des zur Aufnahme der Probe vorgesehenen Hohlraumes mit zumindest zwei Temperaturzonen wirkt sich positiv auf Effektivität und Schnelligkeit einer PCR-Reaktion aus. Einzelne Abschnitte des Hohlraumes, welche jeweils ein Teilvolumen der Probe aufnehmen, stehen mit je einer Temperaturzone in Kontakt. Der Temperaturangleich dieser geringeren Teilvolumina an die zur Durchführung der PCR-Reaktion notwendigen Temperaturen erfolgt aufgrund des verminderten Volumens sehr schnell. Zudem können sich in verschiedenen Hohlraumabschnitten gleichzeitig unterschiedliche Temperaturen einstellen. Die Verminderung des zu temperierenden Volumens und die Parallelisierung der Heiz- und Kühlschritte für einzelne Teilvolumina führen zu einer Zeitersparnis von bis zu zwei Minuten pro PCR-Zyklus.
Aufgrund der schnellen Temperaturwechsel können zudem unerwünschte Nebenreaktionen minimiert werden. So werden beispielsweise die bei langsamer Abkühlung immer wieder auftretenden, "zufälligen" Hybridisierungen von Primern und/oder Template-DNA drastisch reduziert, was dazu führt, dass die PCR während der gesamten Reaktionszeit gleichmäßig abläuft. Ebenso wird durch die schnellen Temperaturwechsel die Fehlerhäufigkeit der Polymerase vermindert, da sich bei langsamen Temperaturübergängen über längere Zeiträume vorherrschende Temperaturen ergeben, bei denen die Polymerase zwar aktiv ist, aber nicht optimal arbeiten kann und daher fehleranfällig ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung steht der zur Aufnahme der Probe vorgesehene Hohlraum unabhängig von der Position der Probenzelle mit zumindest zwei Temperaturzonen in Kontakt. Dadurch wird gewährleistet, dass die PCR-Reaktion zu jedem Zeitpunkt und bei jeder Umdrehungsposition der Probenzelle aufgrund der oben erwähnten positiven Effekte effektiver und schneller abläuft.
Bevorzugt weist die Probenzelle die Form einer Scheibe auf und der zur Aufnahme der Probe vorgesehene Hohlraum erstreckt sich besonders bevorzugt über einen Kreissektor mit einem Mittelpunktswinkel von 180° und insbesondere bevorzugt über einen Kreissektor mit einem Mittelpunktswinkel von näherungsweise 360°. Ebenso bevorzugt sind Ausführungsformen bei denen sich der zur Aufnahme der Probe vorgesehene Hohlraum über einen Kreissektor mit einem Mittelpunktswinkel von rund 225° oder rund 270° erstreckt. Solange sichergestellt ist, dass der Hohlraum in wenigstens einer Umdrehungsposition der Probenzelle mit zumindest zwei Temperaturzonen in Kontakt steht, sind je nach Ausdehnung und relativer Anordnung der Temperaturzonen auch Ausführungsformen möglich, bei denen sich der Hohlraum über einen Kreissektor mit einem Mittelpunktswinkel von rund 45°, rund 90° oder rund 135° erstreckt. Durch die flache Grundform der Scheibe und dem in der Scheibe angeordneten Hohlraum, welcher beispielsweise über ein spanendes Fertigungsverfahren, wie z. B. Fräsen in die Scheibe eingebracht ist, ist das Oberfläche/Volumen-Verhältnis für einen möglichst schnellen Wärmeübertrag optimal ausgelegt. Besonders vorteilhaft weist der zur Aufnahme der Probe in der Probenzelle vorgesehene Hohlraum in den Ausführungsformen, in denen er sich über einen Kreissektor mit einem Mittelpunktswinkel von näherungsweise 360° erstreckt, im Wesentlichen die Form eines Hohlzylinders auf. Unter dem Ausdruck „im Wesentlichen die Form eines Hohlzylinders aufweisend" ist zu verstehen, dass die Form des zur Aufnahme der Probe vorgesehenen Hohlraums von einem idealen Hohlzylinder abweicht, da zumindest eine, in der Regel aber zwei Öffnungen zum Einfüllen der Probe vorgesehen sind. Der Hohlraum weist also zwei Enden auf und ist nicht zu einem idealen Hohlzylinder geschlossen. In Ausführungsformen, in denen sich der Hohlraum über einen Kreissektor mit einem Mittelpunktswinkel kleiner 360° erstreckt, nimmt der Hohlraum entsprechend bevorzugt die Form von Teilen eines Hohlzylinders ein.
Durch die Wahl eines Hohlzylinders bzw. von Teilen eines Hohlzylinders wird ein gutes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen erreicht. Die Radien des Hohlzylinders sind dabei so gewählt, dass das für eine PCR notwendige Reaktionsvolumen vom Hohlzylinder aufgenommen werden kann. Der Hohlzylinder endet in der Regel in zwei Öffnungen, die dem Einfüllen der Proben dienen. Bei Einfüllen der Probe durch eine Öffnung kann die im Hohlzylinder enthaltene Luft durch die zweite Öffnung entweichen und die Probe wird dadurch gleichmäßig verteilt. Nach dem Befüllen können die Öffnungen durch geeignete Stopfen oder durch Laborfett und Cyanoacrylat flüssigkeitsdicht verschlossen werden.
Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, bei denen mehrere Hohlzylinder konzentrisch in der Probenzelle ausgebildet sind, oder aber mehrere Teile eines Hohlzylinders konzentrisch und/oder auf einer Kreislinie in der Probenzelle angeordnet sind. Dadurch können mehrere PCR-Anwendungen parallel mittels einer einzigen Probenzelle durchgeführt werden. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probenzelle zweiteilig in Form einer Haltevorrichtung für eine Kapillare und einer Kapillare zur Aufnahme der Probe ausgebildet ist, wobei die Kapillare im Klemmsitz mit der Haltevorrichtung verbunden ist. Insbesondere bevorzugt weist die Haltevorrichtung dabei im Wesentlichen die Form einer Scheibe mit einer Oberseite, einer Unterseite und einem Scheibenrand auf und zur Aufnahme der Kapillare ist eine Ausnehmung an der Oberseite, an der Unterseite oder am Scheibenrand vorgesehen. Besondere Vorteile ergeben sich, wenn es sich um eine umlaufende Ausnehmung handelt, da sich in diesem Fall die Möglichkeit bietet, beispielsweise eine längere Kapillare oder aber zwei oder mehrere kürzere Kapillaren in beliebiger Anordnung einzuklemmen, wodurch wiederum mehrere PCR-Anwendungen parallel mittels einer einzigen Probenzelle durchgeführt werden können. Die Kapillare ist im günstigsten Fall so im Klemmsitz in der Ausnehmung der Haltevorrichtung befestigt, dass lediglich höchstens der halbe Umfang der Kapillarenwand von der Ausnehmung aufgenommen ist. Dadurch ist gewährleistet, dass zumindest der halbe Umfang der Kapillarenwand an der Oberseite, an der Unterseite oder am Scheibenrand der Haltevorrichtung mit deren Oberfläche bzw. deren Rand abschließen oder darüber hinausragen, wodurch ein ausreichender Kontakt zu den Temperiereinheiten und der damit verbundene optimale Wärmeübertrag sichergestellt wird. Die mit der Haltevorrichtung verbundenen Kapillaren sind beispielsweise aus Polypropylen, aus Polycarbonat oder aus Teflon hergestellt und können zum Beispiel nach dem Befüllen mit der Probe dicht verschlossen werden, indem sie an beiden Enden über einer kleinen Flamme zugeschmolzen werden. Vorteilhaft weisen die erste, die zweite und die dritte Temperiereinheit jeweils mindestens einen temperierbaren Block auf. Die temperierbaren Blöcke sind dabei aus einem gut wärmeleitfähigen Material, vorzugsweise aus Metall, besonders bevorzugt aus Aluminium, gefertigt. Diese Blöcke können mittels eines geeigneten Bauteils zur Energieübertragung, bevorzugt z.B. mittels einer Heizmatte oder eines Peltierelementes und mittels eines geeigneten Bauteils zur Temperaturmessung, z.B. mittels eines Platinwiderstands mit Hilfe einer geeigneten Regelelektronik (z.B. einem PID-Regler) auf die gewünschten Temperaturen gebracht werden.
Die mittels der Temperiereinheiten definierten Temperaturzonen können mit geeigneten, isolierenden Materialien ausgedehnt oder erweitert werden. So kann beispielsweise über einen, über zwei oder über alle drei temperierbaren Blöcke ein größer dimensionierter, offener Hohlkörper aus Polystyrolschaumstoff (Styropor), gestülpt sein, wodurch eine gewünschte Temperatur in nahezu dem gesamten Hohlkörperinnenraum mittels des temperierbaren Blockes eingestellt werden und damit die Temperaturzone erweitert werden kann. Gleichzeitig werden die einzelnen Temperaturzonen dadurch gegeneinander isoliert. Neben Styropor eignen sich als isolierende Materialien etliche aus der Wärmedämmung bekannte Stoffe wie zum Beispiel mineralische Fasern in Form von Steinwolle oder Glaswolle, aber auch Holzwolle, Hanf, Filz oder Kork. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung weisen die temperierbaren Blöcke der ersten, der zweiten und der dritten Temperiereinheit jeweils eine Einkerbung zur wenigstens teilweisen Aufnahme der Probenzelle auf. Durch die Einkerbungen werden zumindest die Randbereiche der Probenzelle von den temperierbaren Blöcken derart aufgenommen, dass sie von drei Seiten vom temperierbaren Block umgeben sind und der Hohlraum mit der Probe zwischen die Blöcke eingeschoben vorliegt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Hohlraum so im Randbereich der Probenzelle angeordnet, dass die den Hohlraum umgebende Wand der Probenzelle sowohl auf der Oberseite der vorzugsweise scheibenförmigen Probenzelle, als auch auf der Unterseite und am Scheibenrand eine Dicke von weniger als 500 μηη aufweist. Die Probe steht somit auf drei Seiten in engem Kontakt mit dem jeweiligen temperierbaren Block, was zu einer schnellen Temperaturanpassung der im Hohlraum befindlichen Probe führt.
Besonders bevorzugt kann die Spaltbreite der Einkerbung durch eine geeignete Verstelleinheit wie z.B. Langlöcher variiert und dadurch der Kontakt zwischen Probenzelle und Block optimal eingestellt werden. Dadurch wird zum einen ein guter Wärmeübertrag gewährleistet, zum anderen können Probenzellen unterschiedlicher Abmessungen und Geometrien verwendet werden. Zusätzliches Einbringen von Schmiermittel, vorzugsweise Mineralöl ermöglicht eine reibungsarme Bewegung der Probenzelle und führt zudem zu einer verbesserten Wärmeübertragung. Besonders bevorzugt weist die einer Temperiereinheit zugewandte Wand der Probenzelle zumindest im Bereich des zur Aufnahme der Probe vorgesehenen Hohlraums eine Dicke von weniger als 500 μηη, ganz besonders bevorzugt von weniger als 300 μηη und insbesondere bevorzugt von weniger als 200 μηη auf. Die Dicke der Wand der Probenzelle nimmt Einfluss auf die Rate der Wärmeübertragung, das heisst, je dünner die Wand, desto schneller wird die Wärme von den Temperiereinheiten auf die Probe übertragen. Gleichzeitig kann aber aus Stabilitätsgründen die Wanddicke nicht beliebig reduziert werden. Sowohl Wärmeübertrag als auch Stabilität sind wiederum abhängig von der Art des verwendeten Materials, weshalb die Wanddicke je nach Material und Geometrie der Probenzelle festgelegt wird.
Bevorzugt weist die Probenzelle einen Durchmesser zwischen 10 mm und 50 mm, besonders bevorzugt einen Durchmesser zwischen 20 mm und 30 mm auf. Die Dicke der Probenzelle beträgt bevorzugt zwischen 0,2 mm und 1 ,5 mm, besonders bevorzugt rund 1 mm. Der zur Aufnahme der Probe vorgesehene Hohlraum besitzt bevorzugt eine Tiefe von 0,1 mm bis 0,8 mm, besonders bevorzugt eine Tiefe von 0.5 mm, und endet in zwei Öffnungen. Der Hohlraum 8 weist bevorzugt ein Volumen zwischen 1 μΙ und 50 μΙ, besonders bevorzugt ein Volumen von 20 μΙ auf und kann somit das benötigte Reaktionsvolumen eines PCR Ansatzes aufnehmen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist in dem zur Aufnahme der Probe vorgesehenen Hohlraum der Probenzelle ein zur Detektion von Nukleinsäureoligomer- Hybridisierungsereignissen eingerichteter und ausgelegter Sensor, insbesondere ein zur oberflächensensitiven Detektion von Nukleinsäureoligomer- Hybridisierungsereignissen eingerichteter und ausgelegter Sensor vorgesehen. Der Sensor besteht dabei im Wesentlichen aus einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von Sonden- Nukleinsäureoligomeren besteht. Mit dem Begriff "Oberfläche" wird jedes Trägermaterial bezeichnet, das geeignet ist direkt oder nach entsprechender chemischer Modifizierung derivatisierte oder nicht-derivatisierte Sonden- Nukleinsäureoligomere kovalent oder über andere spezifische Wechselwirkungen zu binden. Der feste Träger kann aus leitfähigem oder nicht leitfähigem Material bestehen. Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäureoligomeren an einer Oberfläche sind dem Fachmann bekannt.
Vorteilhaft handelt es sich um einen zur spektroskopischen, elektrochemischen oder elektrochemolumineszenten Detektion von Nukleinsäureoligomer- Hybridisierungsereignissen eingerichteten und ausgelegten Sensor. Eine oberflächensensitive Detektion ermöglicht die Detektion von ausschließlich an die Oberfläche gebundenen Signal-Nukleinsäureoligomeren. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Sensor um einen zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen eingerichteten und ausgelegten DNA-Chip. In diesem Fall weist die modifizierte Oberfläche zumindest 2 räumlich im Wesentlichen abgetrennte Bereiche, bevorzugt zumindest 4 und insbesondere zumindest 12 räumlich im Wesentlichen abgetrennte Bereiche auf. Besonders bevorzugt weist die modifizierte Oberfläche zumindest 32, insbesondere zumindest 64, ganz besonders bevorzugt zumindest 96 räumlich im Wesentlichen abgetrennte Bereiche auf. Unter "räumlich im Wesentlichen abgetrennten Bereichen" werden Bereiche der Oberfläche verstanden, die ganz überwiegend durch Anbindung einer bestimmten Art von Sonden-Nukleinsäureoligomeren modifiziert sind. Lediglich in Gebieten, in denen zwei solche räumlich im Wesentlichen abgetrennte Bereiche aneinander grenzen, kann es zu einer Vermischung von verschiedenen Arten von Sonden- Nukleinsäureoligomeren kommen.
Ein ganz besonderer Vorteil ergibt sich dadurch, dass zusätzlich eine vierte Temperiereinheit vorgesehen ist, wobei die vierte Temperiereinheit eine vierte räumlich von den drei Temperaturzonen getrennte Temperaturzone definiert.
Durch das Bereitstellen einer vierten, durch eine vierte Temperiereinheit definierten und räumlich von den drei Temperaturzonen der erfindungsgemäßen Vorrichtung getrennten Temperaturzone wird es ermöglicht, Teilbereiche der Probenzelle, insbesondere den Innenbereich der Probenzelle einer Temperatur auszusetzen, die sich von den zur Durchführung der PCR erforderlichen Temperaturen unterscheidet. Durch die Wahl der Geometrie des temperierbaren Blocks der vierten Temperiereinheit und durch die Wahl der Anordnung in der Vorrichtung kann der Bereich der Probenzelle, der sich in der vierten Temperaturzone befindet, festgelegt werden. Ebenso kann die Dauer und die Häufigkeit der Inkubation in der vierten Temperaturzone durch die Einstellung der Drehgeschwindigkeit der Probenzelle, frei gewählt werden.
Die vierte Temperaturzone erweist sich als besonders vorteilhaft für eine Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen mittels eines Sensors. Dabei wird der Bereich der Probenzelle, in dem sich der Sensor befindet, in der vierten Temperaturzone positioniert, wodurch optimale Temperaturbedingungen für eine Detektion geschaffen werden. Insbesondere bei der Verwendung eines DNA-Chips als Sensor kann eine für diese Art der Detektion günstige Temperatur von rund 50°C eingestellt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung einer PCR, insbesondere zur Durchführung einer Real-Time PCR.
Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung einer PCR, kann besonders vorteilhaft ein Analyseverfahren in einem externen Detektionssystem an die PCR angeschlossen werden. Als externes Detektionssystem kommt beispielsweise eine miniaturisierte Gelelektrophorese- Kapillare in Frage. Um Kontaminationsgefahren durch einen Flüssigkeitstransfer von der Probenzelle zur Gelelektrophorese-Kapillare weitestgehend auszuschließen, ist es sinnvoll ein„quasi geschlossenes" System auszubilden. Zu diesem Zweck weist die Wand der Probenzelle in einem Bereich, in dem der Hohlraum ausgebildet ist, bevorzugt eine kreisförmige Sollbruchstelle auf. Die Sollbruchstelle ist dabei genau an den Durchmesser der Kapillare angepasst, so dass durch Aufdrücken der Kapillare auf die Sollbruchstelle die Wand der Probenzelle an dieser Stelle durchbrochen wird, die Kapillare dadurch flüssigkeitsdicht in die Wand der Probenzelle eindringen kann und die im Hohlraum befindliche Flüssigkeit durch Kapillarkräfte in die Kapillare gezogen wird.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung einer PCR kann in ganz besonders vorteilhafter Weise in Kombination mit einem Verfahren zur Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen als Endpunktanzeige und/oder in Echtzeit eingesetzt werden. Die Detektion der PCR-Produkte erfolgt dabei durch einen zur Detektion von Nukleinsäureoligomer- Hybridisierungsereignissen eingerichteten und ausgelegten Sensor, der in dem zur Aufnahme der Probe vorgesehenen Hohlraum der Probenzelle vorgesehen ist. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen zur oberflächensensitiven Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen eingerichteten und ausgelegten Sensor.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Verfahren zur Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen um ein Endpunktverfahren zur Detektion der PCR-Produkte umfassend die Schritte Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von Sonden-Nukleinsäureoligomeren besteht, Bereitstellen wenigstens einer Art von Signal-Nukleinsäureoligomeren, wobei die Signal-Nukleinsäureoligomere mit zumindest einem Detektionslabel modifiziert sind und die Signal- Nukleinsäureoligomere einen zu den Sonden-Nukleinsäureoligomeren komplementären oder weitgehend komplementären Abschnitt besitzen, Bereitstellen einer Probe mit Target-Nukleinsäureoligomeren, Inkontaktbringen einer definierten Menge der Signal-Nukleinsäureoligomere mit der modifizierten Oberfläche und Inkontaktbringen der Probe und der darin enthaltenen Target- Nukleinsäureoligomere mit der modifizierten Oberfläche, Detektion der Signal- Nukleinsäureoligomere und Vergleich der bei der Detektion der Signal- Nukleinsäureoligomere erhaltenen Werte mit Referenzwerten. Die Signal- Nukleinsäureoligomere besitzen dabei eine größere Anzahl an Basen als die Sonden-Nukleinsäureoligomere und weisen zumindest einen Andockabschnitt auf, wobei der Andockabschnitt keine zu einem Abschnitt der Sonden- Nukleinsäureoligomere komplementäre oder weitgehend komplementäre Struktur aufweist und wobei die Target-Nukleinsäureoligomere einen zu dem Andockabschnitt komplementären oder weitgehend komplementären Abschnitt besitzen.
Durch den Andockabschnitt erfolgt die Assoziation der Target- Nukleinsäureoligomere an die Signal-Nukleinsäureoligomere mit sehr hoher Rate. In anderen aus dem Stand der Technik bekannten Verdrängungsassays zur Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen liegen Sonden- Nukleinsäureoligomere und Signal-Nukleinsäureoligomere bei Zugabe der Target- Nukleinsäureoligomere bzw. Sonden-Nukleinsäureoligomere und Target- Nukleinsäureoligomere bei Zugabe der Signal-Nukleinsäureoligomere als hybridisierter Doppelstrang vor. Vor einer Bindung der zugegebenen Nukleinsäureoligomer-Komponente müssen entsprechend die Bindungen des hybridisierten Doppelstrangs gelöst werden.
Im Gegensatz dazu besitzen die beiden Nukleinsäureoligomer-Komponenten Sonden-Nukleinsäureoligomere und Signal-Nukleinsäureoligomere gemäß dem oben beschriebenen Verfahren eine unterschiedliche Anzahl an Basen. Die Signal- Nukleinsäureoligomere weisen eine größere Zahl an Basen auf und stellen einen Andockabschnitt zur Verfügung, der in einem nicht-hybridisierten Zustand vorliegt, da er keine zu einem Abschnitt der Sonden-Nukleinsäureoligomere komplementäre oder weitgehend komplementäre Struktur aufweist.
Gleichzeitig weisen nun aber die Target-Nukleinsäureoligomere einen zu dem Andockabschnitt komplementären oder weitgehend komplementären Abschnitt auf. Bei Zugabe der Target-Nukleinsäureoligomere können diese direkt ohne vorherige Verdrängung einer hybridisierten Komponente an diesen Andockabschnitt binden. Im Zuge der nachfolgenden Hybridisierung mit den Signal-Nukleinsäureoligomeren muss zwar die hybridisierte Nukleinsäureoligomer-Komponente verdrängt werden, allerdings erfolgt diese Verdrängung aufgrund der bereits erfolgten Hybridisierung mit dem Andockabschnitt mit einer deutlich höheren Geschwindigkeit.
Ein weiteres Verfahren zur Detektion von Nukleinsäureoligomer- Hybridisierungsereignissen, das in besonders vorteilhafter Weise unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung einer PCR, insbesondere einer real-time PCR durchgeführt werden kann, umfasst die Schritte Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von Sonden-Nukleinsäureoligomeren besteht, Bereitstellen einer Probe mit Target-Nukleinsäureoligomeren, Bereitstellen einer Lösung mit wenigstens einer Art von Signal-Nukleinsäureoligomeren, wobei die Signal-Nukleinsäureoligomere mit zumindest einem Detektionslabel modifiziert sind, die Signal-Nukleinsäureoligomere einen zu den Sonden- Nukleinsäureoligomeren komplementären oder weitgehend komplementären Abschnitt besitzen und die Signal-Nukleinsäureoligomere einen zu den Target- Nukleinsäureoligomeren komplementären oder weitgehend komplementären Abschnitt besitzen, Vermischen der Lösung mit Signal-Nukleinsäureoligomeren und der Probe mit Target-Nukleinsäureoligomeren, Inkontaktbringen des Gemisches von Signal-Nukleinsäureoligomeren und Target- Nukleinsäureoligomeren mit der modifizierten Oberfläche, Detektion der Signal- Nukleinsäureoligomere durch eine oberflächensensitive Detektionsmethode, Amplifizierung der Target-Nukleinsäureoligomere, Detektion der Signal- Nukleinsäureoligomere durch eine oberflächensensitive Methode, Vergleich der bei den beiden Detektionen der Signal-Nukleinsäureoligomere erhaltenen Werte.
Unter einer „weitgehend komplementären Struktur" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Sequenzabschnitte verstanden, bei denen maximal 20% der Basenpaare Mismatches ausbilden. Bevorzugt handelt es sich bei einer „weitgehend komplementären Struktur" im Rahmen der vorliegenden Erfindung um Sequenzabschnitte, bei denen maximal 15% der Basenpaare Mismatches ausbilden. Besonders bevorzugt handelt es sich bei einer „weitgehend komplementären Struktur" um Sequenzabschnitte, bei denen maximal 10% der Basenpaare Mismatches ausbilden und ganz besonders bevorzugt um Sequenzabschnitte, bei denen maximal 5% der Basenpaare Mismatches ausbilden. Die Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere erfolgt besonders bevorzugt durch eine oberflächensensitive Detektionsmethode, da in diesem Fall ausschließlich die an die Oberfläche gebundenen Signal-Nukleinsäureoligomere detektiert werden. Besonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang spektroskopische, elektrochemische und elektrochemolumineszente Methoden. Als spektroskopisches Verfahren wird besonders eine Detektion der Fluoreszenz, insbesondere der Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) der Signal- Nukleinsäureoligomere bevorzugt.
Zur oberflächensensitiven elektrochemischen Detektion werden bevorzugt Cyclovoltametrie, Amperometrie, Chronocoulometrie, Impedanzmessung oder Scanning Electrochemical Microscopy (SECM) eingesetzt.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Durchführung PCR unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei Probenzelle durch die räumlich voneinander getrennten Temperaturzonen mittels einer Drehbewegung bewegt wird. Mit der Wahl der Drehgeschwindigkeit der Probenzelle und deren Abstimmung auf die Geometrie der temperierbaren Blöcke wird die Verweildauer der Probe in den verschiedenen Temperaturzonen und damit die Dauer der Schritte eines PCR-Zyklus festgelegt. Da die verschiedenen Temperaturen bereits durch die Temperiereinheiten vorgegeben sind, können mit einer einzigen Parametereinstellung, nämlich der Einstellung der Drehgeschwindigkeit der Probenzelle alle notwendigen Parameter für die PCR- Zyklen festgelegt werden. Dies führt zu einer anwenderfreundlichen Benutzung der Vorrichtung, da eine komplizierte und aufwändige Programmierung entfällt. Bevorzugt wird die Probenzelle mit konstanter Geschwindigkeit bewegt.
Insbesondere bevorzugt wird ein Verfahren zur Durchführung einer PCR unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung bereitgestellt, in dem sich der DNA-Chip während der Durchführung einer elektrochemischen Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen in der vierten Temperaturzone befindet. Die zur elektrochemischen Detektion mit Hilfe eines DNA-Chips günstigen Temperaturen unterscheiden sich in der Regel von den für die PCR-Schritte erforderlichen Temperaturen. Durch die vierte Temperaturzone können PCR und Detektion bei den jeweils vorteilhaften Temperaturen ablaufen.
Ein besonderer Vorteil ergibt sich aus der Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einem der oben dargestellten Verfahren dadurch, dass PCR- Reaktion und z. B. die Detektion von DNA-Molekülen in einer einzigen Probenzelle durchgeführt werden können und kein Pipettierschritt zum Probentransfer, also kein sogenanntes "liquid handling" notwendig ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Figuren näher erläutert werden. Es wird aber ausdrücklich darauf hingewiesen, dass die Erfindung nicht auf die angegebenen Beispiele beschränkt sein soll. Es zeigen Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung einer PCR,
Fig. 2a eine schematische Darstellung einer Probenzelle mit vier
Temperiereinheiten,
Fig. 2b eine schematische Darstellung mehrerer Probenzellen mit
Temperiereinheiten zur parallelen Durchführung mehrerer getrennter PCR-Reaktionen,
Fig. 3 eine perspektivische Darstellung einer Ausführungsform einer
Probenzelle,
Fig. 4 eine perspektivische Darstellung einer Probenzelle mit integriertem
Sensor,
Fig. 5a in Draufsicht eine Ausführungsform einer zweiteiligen Probenzelle,
Fig. 5b eine schematische Darstellung eines vertikalen Schnittes der Probenzelle aus Figur 5a,
Fig. 5c eine schematische Darstellung eines vertikalen Schnittes einer weiteren
Ausführungsform einer zweiteiligen Probenzelle und
Fig. 6 das Ergebnis einer vergleichenden PCR in einem Standard-PCR- Thermocycler und der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Die Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung 1 zur Durchführung einer PCR. Im vorliegenden Beispiel umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung 1 eine erste 2a, eine zweite 2b und eine dritte 2c unabhängig voneinander regulierbare Temperiereinheit, wodurch drei Temperaturzonen, im vorliegenden Beispiel 96°C, 55°C und 72°C, definiert werden. Die drei Temperiereinheiten 2a, 2b, 2c weisen jeweils einen temperierbaren Block 6 auf. Die drei Blöcke 6 sind aus einem gut wärmeleitfähigen Material, vorzugsweise Aluminium gefertigt, sie können aber auch aus anderen geeigneten Metallverbindungen bestehen. Zur Einstellung der gewünschten Temperatur eines jeden Blockes 6 weist die Vorrichtung 1 ein geeignetes Mittel zum Energieübertrag 13, vorzugsweise eine Heizmatte oder ein Peltierelement und ein Mittel zur Temperaturmessung, vorzugsweise einen Platinwiderstand oder ein Digitalthermometer auf. Mittels einer geeigneten Regelelektronik (z.B. PI- oder PID- Regler) können die drei Blöcke 6 exakt temperiert und damit die Temperaturzonen so definiert werden, dass die für eine PCR-Reaktion günstigen Temperaturen herrschen.
Die Temperiereinheiten 2a, 2b, 2c sind auf einer Bodenplatte 10 so angeordnet, dass sie im Wesentlichen die Eckpunkte eines Dreiecks beschreiben und ihr relativer Abstand und/oder ihre relative Position zueinander frei einstellbar ist. Grundsätzlich können die Temperiereinheiten aber auch in beliebigen anderen Geometrien angeordnet sein. Mittig zwischen den Temperiereinheiten 2a, 2b, 2c ist ein Mittel 3, 4 zur Durchführung einr Drehbewegung der Probenzelle 5 vorgesehen. Im dargestellten Beispiel umfasst das Mittel zur Durchführung einer Drehbewegung eine Achse 4, die mit der Probenzelle 5 verbunden ist, und einen Elektromotor 3. Die Probenzelle 5 des dargestellten Beispieles ist, wie es beispielhaft aus der Figur 3 ersichtlich ist, im Wesentlichen scheibenförmig ausgebildet, wobei sich der zur Aufnahme der Probe vorgesehene Hohlraum 8 über einen Kreissektor mit einem Mittelpunktswinkel von annähernd 360° erstreckt. Jeder Block 6 der drei Temperiereinheiten 2a, 2b, 2c weist eine Einkerbung 7 auf, die zur wenigstens teilweisen Aufnahme der Probenzelle 5 ausgebildet ist. In der erfindungsgemäßen Vorrichtung 1 liegt die an der Achse 4 fixierte Probenzelle 5 in jeden Block 6 teilweise eingeschoben vor, so dass die Probenzelle 5 in jeweils einem oder mehreren Teilbereichen in den drei Temperaturzonen angeordnet ist und der Hohlraum 8 unabhängig von der Position der Probenzelle 5 mit drei Temperaturzonen in Kontakt steht.
Die Temperiereinheiten 2a, 2b, 2c weisen eine geeignete Verstelleinheit 15, vorzugsweise Langlöcher auf, über die die Spaltbreite der Einkerbungen 7 variiert und genau an die Dicke der Probenzelle 5 angepasst werden kann. Durch die geeignete Wahl der Geometrie der Blöcke 6 und durch die freie Einstellung des Abstandes der Blöcke 6 zueinander kann der Einschubbereich und die Einschubtiefe der Probenzelle 5 in die einzelnen Einkerbungen 7 reguliert werden. Dadurch kann die Größe und Anzahl der Teilbereiche der Probenzelle 5, die sich in den einzelnen Temperaturzonen befinden, festgelegt werden. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wurde ein Verhältnis 2:1 des Bereiches der Temperaturzone mit 72°C zu den Bereichen der Temperaturzonen mit 96°C bzw. 55°C gewählt. Zwischen den Blöcken 6 ist jeweils ein Luftspalt vorgesehen, um einen Wärmeübertrag zwischen den Blöcken 6 zu verhindern.
Über den Antrieb 3 und die Achse 4 wird die Probenzelle 5 in Rotation versetzt, so dass die einzelnen Teilbereiche der Probenzelle 5 durch die drei Temperaturzonen geführt werden. Das Einbringen eines Schmiermittels (z.B. Mineralöl) bewirkt eine reibungsarme Rotation der Probenzelle 5 sowie einen verbesserten Wärmeübertrag.
Durch Variation der Drehgeschwindigkeit bzw. Rotationsfrequenz kann die Zeit, in der die kritischen Temperaturen für die PCR-Reaktion an den einzelnen Teilbereichen der Probenzelle 5 anliegen, variiert werden.
Die in Figur 2a dargestellte Ausführungsform weist eine vierte Temperiereinheit 2d auf, wodurch eine vierte, räumlich von den drei Temperaturzonen getrennte Temperaturzone definiert wird. Die vierte Temperiereinheit 2d kann einen in der Probenzelle 5 enthaltenen Sensor 12 (siehe Figur 4), vorzugsweise einen DNA- Chip auf einer bestimmten Temperatur halten. Eine weitere Ausführungsform der Vorrichtung 1 mit mehreren Einkerbungen 7 in jedem temperierbaren Block 6 ist in der Figur 2b gezeigt. Mittels dieser Ausführungsform können mehrere getrennte PCR-Reaktionen parallel in einer Vorrichtung durchgeführt werden.
Die Figur 3 zeigt eine perspektivische Darstellung einer Ausführungsform einer Probenzelle 5. Die Probenzelle 5 weist eine flächige Grundform, vorzugsweise eine Zylinderform auf und besteht aus einem Kunststoff, der eine Temperaturbeständigkeit bis zumindest 100°C aufweist. Zur Beobachtung des Probenverhaltens ist es vorteilhaft, wenn es sich um einen transparenten Kunststoff handelt.
Die Probenzelle 5 weist bevorzugt einen Durchmesser d zwischen 10 mm und 50 mm und eine Dicke b zwischen 0,2 mm und 1 ,5 mm auf. Der zur Aufnahme der Probe vorgesehene Hohlraum 8 erstreckt sich über einen Kreissektor mit einem Mittelpunktswinkel von annähernd 360° und besitzt im Wesentlichen die Form eines Hohlzylinders mit einer bevorzugten Tiefe t von 0,1 mm bis 0,8 mm, welcher in zwei Öffnungen 1 1 endet. Der Hohlraum 8 weist ein Volumen zwischen 1 μΙ und 50 μΙ, bevorzugt 20 μΙ auf und kann somit das benötigte Reaktionsvolumen eines PCR Ansatzes aufnehmen.
Die Probenzelle 5 weist eine Bohrung 9 auf, mittels derer die Probenzelle 5 in der erfindungsgemäßen Vorrichtung 1 an einem Mittel 3,4 zur Durchführung einer Drehbewegung der Probenzelle 5, bevorzugt an einer rotierbaren Achse 4, befestigt ist.
Zum Abdichten der Probenzelle 5 werden die Öffnungen 1 1 des Hohlraumes 8 nach Befüllen mit dem PCR-Reaktionsgemisch mit Laborfett, z.B. glisseal®N und Cyanoacrylat oder durch einen geeigneten Stopfen 16, vorzugsweise aus Gummi oder Kunststoff verschlossen.
Die Figur 4 zeigt eine perspektivische Darstellung einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Probenzelle 5 mit einem integrierten Sensor 12. Die zylinderförmige Probenzelle 5 weist einen Hohlraum 8 zur Aufnahme der Proben auf. Daneben ist eine Bohrung 9 vorgesehen, mittels derer die Probenzelle 5 in der erfindungsgemäßen Vorrichtung an einem Mittel zur Durchführung einer Drehbewegung der Probenzelle, bevorzugt an einer rotierbaren Achse, befestigt ist. Bei dem Sensor 12 handelt es sich im vorliegenden Ausführungsbeispiel um einen DNA-Chip. Der das PCR-Reaktionsgemisch enthaltende, im Wesentlichen die Form eines Hohlzylinders aufweisende Hohlraum 8, ist durch einen abzweigenden Kanal 8.1 , der mit der Sensoroberfläche in Verbindung steht, erweitert. Dadurch gelangt die zu analysierende Probe, das PCR- Reaktionsgemisch, zu dem Sensor 12. Im dargestellten Ausführungsbeispiel wird mit Hilfe des integrierten Sensors 12 eine elektrochemische Detektion der PCR- Produkte durchgeführt und der Sensor 12 dazu über eine herausgeführte PCB- Leiterplatte 17 kontaktiert. In den Figuren 5a, 5b und 5c sind weitere Ausführungsformen einer Probenzelle 5 mit Hohlraum 8, nämlich zweiteilige Ausführungsformen dargestellt. In der zweiteiligen Ausführungsform ist die Probenzelle 5 als Haltevorrichtung für eine Kapillare ausgebildet und der zur Aufnahme der Probe vorgesehene Hohlraum 8 ist durch eine Kapillare gebildet. Die Haltevorrichtung 5 weist zur Aufnahme der Kapillare 8 eine Ausnehmung 18 auf, in welche die Kapillare 8 zur klemmschlüssigen Verbindung eingeklemmt ist. Die Figur 5a zeigt eine Draufsicht auf eine zweiteilige Ausführungsform während die Figur 5b einen vertikalen Schnitt durch die in Figur 5a gezeigte Probenzelle darstellt, bei der eine umlaufende Ausnehmung 18 zur klemmschlüssigen Aufnahme der Kapillare 8 auf der Oberseite der scheibenförmigen Haltevorrichtung 5 verläuft. Die im Klemmsitz mit der Haltevorrichtung 5 verbundene Kapillare 8 nimmt einen Kreissektor mit einem Mittelpunktswinkel α von rund 170° ein. Die Figur 5c zeigt einen vertikalen Schnitt durch eine weitere zweiteilige Ausführungsform, bei der eine umlaufende Ausnehmung 18 zur klemmschlüssigen Aufnahme der Kapillare 8 am Scheibenrand der Haltevorrichtung 5 verläuft.
Beispiel 1 : Herstellung einer Probenzelle Die Probenzelle wird aus zwei Kunststoffteilen, nämlich einem den zur Aufnahme der Probe vorgesehenen Hohlraum enthaltenden, unteren Teil und einem oberen Teil aufgebaut.
Durch ein spanendes Fertigungsverfahren wie zum Beispiel Fräsen wird aus einem Polymethylmethacrylat-Rohling das untere, den Hohlraum enthaltende Kunststoffteil einer Probenzelle mit einem ungefähren Durchmesser von 15 mm und einer Dicke von rund 1 mm gefertigt, wobei ein ungefähr 0,5 mm tiefer Hohlraum 8 in Form eines Hohlzylinders eingefräst wird, welcher in zwei durchgehenden Öffnungen 1 1 endet. Im Zentrum des unteren Teils der Probenzelle wird eine Bohrung 9 eingebracht.
Zur Fertigstellung der Probenzelle wird eine Acrylglasscheibe mit einem geeigneten Klebstoff auf das untere Kunststoffteil aufgeklebt. Die Acrylglasscheibe wird dabei flüssigkeitsdicht mit dem unteren, formgebenden Acrylglasteil verbunden. Als Klebstoff für Acrylglas kann z.B. Cyanoacrylat oder Dichlormethan verwendet werden, für andere Polymere können z.T. andere Klebstoffe notwendig sein. Nach Befüllen der Zelle mit dem PCR-Reaktionsgemisch können die Öffnungen 1 1 des Hohlraumes 8 durch Laborfett (z.B. glisseal®N) und Cyanoacrylat oder durch einen geeigneten Gummistopfen verschlossen werden.
Für Ausführungsformen mit verbesserter Wärmeübertragung von den Temperiereinheiten 2a, 2b, 2c auf die Probenzelle 5 können Materialien mit höherer Wärmeleitfähigkeit verwendet oder die Wandstärken der Materialien reduziert werden. Ebenso sind andere Verfahren zur Verbindung des unteren, formgebenden Kunststoffteiles der Probenzelle 5 mit der oberen Kunststoffscheibe wie z.B. Schweißverfahren wie Laser-Kunststoffschweißen denkbar. Alternative Hohlraum-Geometrien mit gegebenenfalls eingebauten Sensoren 12 können in spanenden Fertigungsverfahren, über urformende Verfahren (z.B. Spritzgusstechnik), durch stereolithographische oder andere geeignete Verfahren hergestellt werden. Ein integrierter Sensor 12 kann beispielsweise über eine herausgeführte PCB-Leiterplatte 17 kontaktiert werden, wie in Figur 4 dargestellt ist. Daneben können in eine Probenzelle 5 mehrere getrennte Hohlräume 8 mit mehreren separaten Öffnungen 1 1 eingebracht werden, wodurch mehrere PCR- Reaktionen in einer Probenzelle 5 parallel ablaufen können. Auch in diesem Fall ist es möglich über einen gemeinsamen oder mehrere Sensoren 12, (z.B. pro Hohlraum 8 ein Sensor 12) die Proben zu analysieren.
Weitere alternative Ausführungsformen einer Probenzelle 5 ermöglichen einen kontaminationsfreien „quasi geschlossenen" Flüssigkeitstransfer vom Hohlraum 8 der Probenzelle 5 zu einem externen Detektionssystem, beispielsweise einer miniaturisierten Gelelektrophorese-Kapillare. Dazu weist die Wand der Probenzelle in einem Bereich, in dem der Hohlraum 8 ausgebildet ist, eine im Wesentlichen kreisförmige Sollbruchstelle auf. Die Sollbruchstelle kann z.B. durch passgenaue Verringerung der Wandstärke eingeführt werden. Durch Aufdrücken der Kapillare an dieser Stelle wird die Wand der Probenzelle 5 durchstoßen und die Kapillare gelangt in Verbindung mit dem Hohlraum 8 und der darin befindlichen Probe, welche durch Kapillarkräfte in die Kapillare gesogen wird.
Ebenso möglich sind Ausführungsformen, die an der Sollbruchstelle zusätzlich eine „weibliche" Verbindungsseite (Innenkegel) einer Luer-Lock Verbindung aufweisen. Durch Aufbringen der „männlichen" Gegenseite (Außenkegel) einer Luer-Lock- Verbindung, beispielsweise einer Spritze oder Kanüle, kann die Sollbruchstelle durchstoßen und ein „quasi geschlossenes" System zwischen Hohlraum der Probenzelle und Innenraum der Spritze geschaffen werden.
Beispiel 2: Durchführung einer vergleichenden PCR
Die PCR (= Polymerase Chain Reaction) stellt eine Standardmethode der Molekularbiologie dar, die 1984 von Kary Mullis entwickelt wurde. Sie erlaubt es, durch einfache Versuchsanordnungen spezifische DNA-Sequenzen zu amplifizieren (= vermehren). Somit kann aus einem großen Gen eine bestimmte Sequenz (die z.B. für ein Stoffwechsel-Protein codiert) isoliert und vermehrt werden. Als Marker, die diese spezifische Sequenz eingrenzen, werden Primer verwendet, an die die DNA-Polymerase andocken kann.
Für eine Standard PCR Reaktion wird ein sog. Mastermix vorbereitet. Dazu wird ein Reaktionsgefäß, z.B. ein 2 ml Mikro-Schraubdeckel-Röhrchen entsprechend gekennzeichnet und in einem Kühlrack (0°C - 4°C) platziert. Die Primer (Konzentration meist 10 μΜ), der dNTP-Mix (c je dNTP 25 μΜ; dNTP = Desoxyribonukleosidtriphosphate, i.e. DNA-Bausteine), Standard PCR-Puffer und MgAc (100 mM) werden in den Röhrchen vorgelegt und gründlich durchmischt.
Das zu vervielfältigende DNA-Template (i.e. das isolierte, aufgereinigte und zur Vervielfältigung vorgesehene DNA-Material) wird in 0,2 ml oder 0,5 ml fassende PCR-Reaktionsgefäße, auch PCR-Tubes (im Kühl-Rack bei ca. 0°C - 4°C) vorgelegt (i.d.R. 5 bis 10 μΙ) und mit Mastermix auf i.d.R. 20 μΙ bis 50 μΙ ergänzt. Für eine Negativprobe wird in einem PCR-Tube statt des DNA-Templates (DNA- freies) Wasser vorgelegt und mit Mastermix auf das entsprechende Endvolumen aufgefüllt.
Unmittelbar vor Start der PCR-Reaktion wird die Polymerase in die bereitgestellten PCR-Tubes (mit Template und Mastermix bzw. mit Wasser und Mastermix im Falle der Negativprobe) gegeben und durch mehrmaliges Ansaugen und Entleeren der Pipette durchmischt.
Im Thermocycler werden die Schritte Denaturierung, Annealing (Primerhybridisierung) und Elongation wiederholt durchgeführt. Zur Denaturierung werden die doppelsträngigen DNA-Templates auf 94 - 96°C erhitzt, um die Stränge zu trennen. Im ersten Zyklus wird die DNA oft für längere Zeit erhitzt (Initialisierung), um sicherzustellen, dass sich sowohl die Ausgangs-DNA als auch die Primer vollständig voneinander getrennt haben und nur noch Einzelstränge vorliegen. Bei der Primerhybridisierung wird ca. 30 Sekunden lang eine Temperatur eingestellt, die eine spezifische Anlagerung der Primer an die DNA erlaubt. Die genaue Temperatur wird hierbei durch die Länge und die Sequenz der Primer bestimmt (meist im Temperaturbereich von ca. 55 - 65°C). Die DNA-Polymerase füllt die fehlenden Stränge mit freien Nukleotiden auf. Sie beginnt am 3'-Ende des angelagerten Primers und folgt dann dem DNA-Template-Strang. Der Primer wird nicht wieder abgelöst, er bildet den Anfang des neuen Einzelstrangs. Die Temperatur hängt vom Arbeitsoptimum der verwendeten DNA-Polymerase ab (in der Regel ca. 68 - 72°C). Dieser Schritt dauert etwa 30 Sekunden je 500 Basenpaare, variiert aber in Abhängigkeit von der verwendeten DNA- Polymerase.
Für den hier beschriebenen Vergleich der Standard-PCR wurde ein BioRad Thermocycler (Modell iCycler) verwendet. Es wurden 100 μΙ gemeinsamer Mastermix für alle durchgeführten Reaktionen angesetzt, wie in der unten stehenden Tabelle 1 aufgeführt. 20 μΙ Template (DNA-Extrakt von Legionella pneumophila, ca. 100 DNA-Kopien / 5 μΙ) wurden mit 80μΙ Mastermix, versetzt mit Taq-Polymerase (BioTaq von BIOLINE), gemischt und in 4 Ansätze zu je 25 μΙ aufgeteilt (einer für die PCR im Standard-PCR Thermocycler, drei für die PCR unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung). Daneben wurde eine Negativ-Kontrolle (5μΙ Wasser plus 20 μΙ Mastermix mit Polymerase, Standard- Thermocycler) angesetzt. Sämtliche PCR Bedingungen sind in Tabelle 1 angegeben. Die verwendete Vorrichtung zur Durchführung der PCR und die Probenzelle sind im Zusammenhang mit den Figuren 1 bis 4 und dem Beispiel 1 beschrieben.
Tabelle 1 :
Figure imgf000034_0001
(v/v), Bicine = N,N-Bis(2-hydroxyethyl) Glycine) Durch Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung konnte die Reaktionszeit der PCR von ca. 45 min (Standard-PCR) auf 25 min verkürzt werden. Optimierte Heizblockgeometrien und minimierte Wanddicken der Probenzelle sollten eine weitere Reduktion der Reaktionszeit für eine PCR auf ca. 10 min oder darunter erlauben.
Das Ergebnis der PCR wurde anhand einer Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Die Agarose-Gelelektrophorese ist ein Verfahren, bei dem DNA-Fragmente, im speziellen Beispiel die PCR-Produkte, anhand ihrer Größe identifiziert werden können. Die DNA wird dabei in ein Agarosegel eingebracht und anschließend eine Spannung angelegt. Daraufhin bewegen sich kürzere DNA-Fragmente schneller auf den Pluspol zu als längere DNA-Fragmente. Die Länge des PCR-Produkts kann durch einen Vergleich mit einer DNA-Leiter, die DNA-Fragmente bekannter Größe enthält und parallel zur Probe im Gel mitläuft, bestimmt werden.
Die Figur 6 zeigt eine Fotografie der mittels Gelelektrophorese analysierten PCR- Produkte, die in den in Tabelle 1 zusammengefassten Versuchen erhalten wurden. In der Figur 6 ist die gelelektrophoretische Analyse mittels Standard-PCR Reaktion in einem Standard Cycler erhaltenen PCR Produkte mit A bezeichnet. Die in einem Standard Cycler durchgeführte Negativkontrolle mittels Standard-PCR Reaktion ist mit B bezeichnet. Die gelelektrophoretische Analyse der PCR Produkte, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung erhalten wurden, sind in Abhängigkeit von der Rotationsgeschwindigkeit der Probenzelle mit C (0,5 Umdrehungen pro Minute), D (1 Umdrehung pro Minute) und E (2 Umdrehungen pro Minute) bezeichnet. Mit F ist eine DNA-Leiter gekennzeichnet.
Aus der Figur 6 geht eindeutig hervor, dass durch eine Standard-PCR Reaktion in einem Standard Cycler das selbe erwartete ca. 150 Basen lange PCR-Produkt erhalten wie bei Durchführung der PCR in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung bei drei verschiedenen Rotationsgeschwindigkeiten der Probenzelle. Bezugszeichenliste
1 Vorrichtung zur Durchführung einer PCR
2a erste Temperiereinheit
2b zweite Temperiereinheit
2c dritte Temperiereinheit
2d vierte Temperiereinheit
3 Elektromotor
4 Achse
5 Probenzelle
6 temperierbarer Block
7 Einkerbung
8 Hohlraum
8.1 abzweigender Kanal
9 Bohrung
10 Bodenplatte
1 1 Öffnungen
12 Sensor
13 Mittel zum Energieübertrag
14 Mittel zur Temperaturmessung
15 Verstelleinheit
16 Stopfen
17 PCB-Leiterplatte
18 Ausnehmung
d Durchmesser
b Dicke der Probenzelle
t Tiefe des Hohlraums

Claims

Patentansprüche
Vorrichtung (1 ) zur Durchführung eines PCR-Verfahrens umfassend
- wenigstens eine Probenzelle (5) mit einem Hohlraum (8) zur Aufnahme einer Probe,
- mindestens eine erste (2a), eine zweite (2b) und eine dritte (2c) unabhängig voneinander regulierbare Temperiereinheit (2a, 2b, 2c), wobei die drei Temperiereinheiten (2a, 2b, 2c) drei räumlich voneinander getrennte Temperaturzonen definieren und
- mindestens ein Mittel (3, 4) zur Durchführung einer Drehbewegung der Probenzelle (5), wobei der zur Aufnahme der Probe vorgesehene Hohlraum (8) aufgrund der Drehbewegung der Probenzelle (5) durch die drei Temperaturzonen bewegt werden kann, wobei
- der zur Aufnahme der Probe vorgesehene Hohlraum (8) in wenigstens einer Position der Probenzelle (5) mit zumindest zwei Temperaturzonen in Kontakt steht.
Vorrichtung (1 ) nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der zur Aufnahme der Probe vorgesehene Hohlraum (8) unabhängig von der Position der Probenzelle (5) mit zumindest zwei Temperaturzonen in Kontakt steht.
Vorrichtung (1 ) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenzelle (5) im Wesentlichen die Form einer Scheibe aufweist.
Vorrichtung (1 ) nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der zur Aufnahme der Probe vorgesehene Hohlraum (8) sich über einen Kreissektor der Probenzelle (5) mit einem Mittelpunktswinkel von zumindest 180° erstreckt.
5. Vorrichtung (1 ) nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der zur Aufnahme der Probe vorgesehene Hohlraum (8) sich über einen Kreissektor der Probenzelle (5) mit einem Mittelpunktswinkel von annähernd 360° erstreckt.
6. Vorrichtung (1 ) nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der zur Aufnahme der Probe in der Probenzelle (5) vorgesehene Hohlraum (8) näherungsweise die Form eines Hohlzylinders aufweist. 7. Vorrichtung (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenzelle (5) zweiteilig in Form einer Haltevorrichtung für eine Kapillare und einer Kapillare zur Aufnahme der Probe ausgebildet ist, wobei die Kapillare im Klemmsitz mit der Haltevorrichtung verbunden ist.
8. Vorrichtung (1 ) nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Haltevorrichtung für die Kapillare im Wesentlichen in Form einer Scheibe mit einer Unterseite, einer Oberseite und einem Scheibenrand ausgebildet ist, wobei zur Aufnahme der Kapillare eine Ausnehmung an der Oberseite und/oder an der Unterseite und/oder am Scheibenrand vorgesehen ist.
9. Vorrichtung (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste (2a), die zweite (2b) und die dritte (2c) Temperiereinheit jeweils mindestens einen temperierbaren Block (6) aufweisen.
10. Vorrichtung (1 ) nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die temperierbaren Blöcke (6) der ersten (2a), der zweiten (2b) und der dritten (2c) Temperiereinheit jeweils eine Einkerbung (7) zur wenigstens teilweisen Aufnahme der Probenzelle (5) aufweisen.
1 1 . Vorrichtung (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die einer Temperiereinheit (2a, 2b, 2c) zugewandte Wand der Probenzelle (5) zumindest im Bereich des zur Aufnahme der Probe vorgesehenen Hohlraums eine Dicke von weniger als 500 μηη aufweist.
12. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem zur Aufnahme der Probe vorgesehenen Hohlraum (8) der Probenzelle (5) ein zur Detektion von Nukleinsäureoligomer- Hybridisierungsereignissen eingerichteter und ausgelegter Sensor (12), insbesondere ein zur oberflächensensitiven Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen eingerichteter und ausgelegter Sensor (12) vorgesehen ist. 13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen zur spektroskopischen, elektrochemischen oder elektrochemolumineszenten Detektion von Nukleinsäureoligomer- Hybridisierungsereignissen eingerichteten und ausgelegten Sensor (12) handelt.
H. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäureoligomer- Hybridisierungs-ereignissen eingerichteten und ausgelegten DNA-Chip (12) handelt.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine vierte Temperiereinheit (2d) vorgesehen ist, wobei die vierte Temperiereinheit (2d) eine vierte räumlich von den anderen Temperaturzonen getrennte Temperaturzone definiert.
16. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Durchführung einer PCR, insbesondere zur Durchführung einer Real-Time PCR. 17. Verfahren zur Durchführung einer PCR unter Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenzelle (5) mit konstanter Geschwindigkeit durch die räumlich voneinander getrennten Temperaturzonen bewegt wird. 18. Verfahren zur Durchführung einer PCR unter Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass sich der DNA-Chip (12) während der Durchführung einer elektrochemischen Detektion von Nuklein- säureoligomer-Hybridisierungsereignissen in der vierten Temperaturzone befindet.
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