WO2011043365A1 - 遺伝子型判定方法 - Google Patents

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aldh2
adh1b
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pcr
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健司 木下
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Mukogawa Gakuin Educational Institution
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Daicel Chemical Industries Ltd
Mukogawa Gakuin Educational Institution
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the genotype of a gene contained in a solid test sample from a solid test sample containing a gene related to sensitivity to alcohol (alcohol sensitivity-related gene).
  • Alcohol dehydrogenase ADH is an enzyme involved in the decomposition of alcohol into acetaldehyde in the body, and a plurality of types are known. Among them, the gene of ADH1B (former name ADH2) has a genotype ADHB1 * 1 / * 1, which is called a low activity type with a slow alcohol metabolism rate. People with such a genotype have face flushing, palpitation, etc. after drinking alcohol The so-called flushing symptom is exhibited, and since the rate of alcohol decomposition is slow, alcohol is likely to remain in the body, and it is said that the constitution tends to cause alcoholism.
  • Aldehyde dehydrogenase is one of the enzymes involved in the degradation of acetaldehyde to acetic acid in the body, and a plurality of types are known.
  • the ALDH2 gene that acts when the blood concentration of acetaldehyde is low is also known as the inactive genotypes ALDH2 * 1 / * 2 and ALDH2 * 2 / * 2, and such genes People with molds are said to have a constitution that tends to cause a hangover due to red drinking due to the slow degradation rate of acetaldehyde.
  • Esophageal cancer, liver cancer, breast cancer, colorectal cancer and other cancers tend to develop, especially those who have both genotype ADHB1 * 1 / * 1 and genotype ALDH2 * 1 / * 2 will double their risk (For example, Akira Yokoyama et al., “Genetic polymorphisms of alcohol and aldehyde dehydrogenases and glutathionee S-transferase M1 and drinking, smoking, and diet in Japanese men with esophageal squamous cell, carcinoma, Vol 23 11, (2002), pp.
  • Non-Patent Document 1 Akira Yokoyama et al., “Alcohol and aldehyde dehydrogenase gene polymorphisms and oropharyngolaryngeal, esophageal and stomach cancers in Japanese alcoholics, Carcinogenesis, Vol. 22, no. 3, (2001), pp. 433-439
  • Non-patent literature 2 Akira Yokoyama et al., "Macrocytosis, afor new predictor esophageal squamous cell carcinoma in Japanese alcoholic men, Carcinogenesis, Vol. 24, no.
  • Non-patent literature 3 Takahiro Asakage et al., “Genetic polymorphisms of alcohol and aldehydedehydrogen. , And drinking, smoking and diet in Japanese men with oral and pharyngeal squamous cell carcinoma, Carcinogenesis, Vol. 28, no. 4, (2007), pp. 865-874 (non-patent document 4). ).
  • Cytochrome CYP2E1 (Cytochrome P450 2E1) is known to be related to alcohol metabolism in the liver microsomal oxidation system called the second alcohol metabolism pathway, and two genotypes CYP2E1 * c1 and CYP2E1 differing in alcohol sensitivity. * C2 is known to exist (for example, Fumio Nomura, “Second Alcohol Metabolic Pathway Microsomal Ethanol-Oxidizing System (MEOS) and Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1)”, Chiba Medical, 78, (2002), pp.
  • MEOS Microsomal Ethanol-Oxidizing System
  • Non-Patent Document 5 Yuichi Yamada “Relationship between Genetic Polymorphisms of Japanese Alcohol Metabolizing Enzymes and Alcohol-Drinking Behaviors and Health Disorders”, Kinki University Journal, 30, (2005), pp.448 -455
  • Non-Patent Document 6 Yuichi Yamada “Relationship between Genetic Polymorphisms of Japanese Alcohol Metabolizing Enzymes and Alcohol-Drinking Behaviors and Health Disorders”, Kinki University Journal, 30, (2005), pp.448 -455
  • Non-Patent Document 6 Yan-Mel Guo et al., “Genetic polymorphisms in cytochrome P4502E1, alcohol and aldehyde dehydrogenases and the risk of es ophageal squamous cell carcinoma in Gansu Chinese males, World J Gastroenterol, 14 (9), (2008), pp.1444-1449 (see Non-Patent Document 7).
  • genotype determination of alcohol sensitivity-related genes such as the above-mentioned alcohol dehydrogenase ADH gene, aldehyde dehydrogenase ALDH gene, and cytochrome CYP2E1 gene is particularly useful for diseases and carcinogenesis related to Japanese alcohol consumption. It is considered to be important for risk avoidance and personal health management.
  • Patent Document 1 describes an aldehyde dehydrogenase gene polymorphism
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-245272
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-75134
  • Akira Yokoyama et al. "Genetic polymorphisms of alcohol andaldehyde dealdehydeases and glutathionee S-transferase M1 and drinking, smoking, and diet in Japanese men with esophageal squamous cell carcinoma, 2002, Carcinogenesis, Vol. pp. 1851-1859
  • Akira Yokoyama et al. “Alcohol and aldehyde dehydrogenase gene polymorphisms and oropharyngolaryngeal, esophageal and stomach cancers in Japanese alcoholics”, Carcinogenesis, Vol. 22, no. 3, (2001), pp.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and an object of the present invention is to provide a method for determining the genotype of a gene related to susceptibility to alcohol safely, quickly and inexpensively. It is.
  • the present invention relates to a method for determining the genotype of an alcohol sensitivity-related gene, wherein a solid test sample containing the gene is directly applied to a solution containing a buffer and a DNA polymerase, and a primer DNA for amplifying the gene.
  • Polymerase chain reaction, LAMP method, strand displacement amplification, reverse transcriptase strand displacement amplification, reverse transcriptase polymerase chain reaction, reverse transcriptase LAMP method nucleic acid sequence-based amplification, transcription-mediated amplification and rolling circle amplification method
  • the method includes a step of amplifying the gene by applying a method selected from the following, and a step of determining the genotype of the gene from the amplified gene.
  • the alcohol sensitivity-related gene is preferably at least one of the gene for alcohol dehydrogenase ADH1B, the gene for aldehyde dehydrogenase ALDH2, and the gene for cytochrome CYP2E1.
  • the solid test sample in the present invention is preferably blood dried, hair root, or saliva dried.
  • the genotyping method of the present invention is capable of simultaneously amplifying at least any two selected from the gene of alcohol dehydrogenase ADH1B, the gene of aldehyde dehydrogenase ALDH2, and the gene of cytochrome CYP2E1 to simultaneously determine the genotype. ,preferable.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a preferred example of the present invention.
  • the present invention relates to a method for determining the genotype of an alcohol sensitivity-related gene, wherein a solid test sample containing the gene is directly applied to a solution containing a buffer and a DNA polymerase, and a primer DNA for amplifying the gene.
  • a solid test sample is collected directly or a liquid sample is dried to collect a solid test sample containing an alcohol sensitivity-related gene from the test object.
  • the hair root is not particularly limited as long as it is derived from all body hairs including hair, eyebrows, nasal hair, whiskers, pubic hair, and eyelashes. Since the hair root is obtained by removing the hair from the root, it can be collected without pain, and the oral mucosa can be collected without pain by lightly rubbing the skin with a cotton swab etc. It is. Further, the oral mucosa may be in a solid state dried by being left at room temperature after being collected.
  • the cell tissue is preferably dried to such an extent that it can be used as it is, and the water content is particularly preferably 0% or more and less than 50%. In addition, the cell tissue is preferably finely pulverized.
  • the oral mucosa when collecting a solid test sample by drying the liquid material, nasal discharge, nasal rinse, eye conjunctival wipe, throat swab, sputum, feces, blood, serum, plasma, spinal fluid, saliva ( Usually, the oral mucosa is included), and a solid obtained by drying a liquid selected from urine, sweat, semen and cellular tissue is subjected to the next step.
  • the cell tissue contained in the liquid material shall have a water content of 50% or more.
  • a known drying method such as a method of allowing the liquid material to soak into the filter paper and evaporating water, natural drying or freeze drying can be selected.
  • a plant fiber body it is preferable to apply stool to a plant fiber body, air-dry the plant fiber body, and then seal it with silica gel and hold it for 1 hour or longer.
  • the plant fiber body refers to plant fiber bodies such as paper and cotton.
  • the number of cells that can be collected is constant, a stable amount of template can be used for genotyping, and from the viewpoint of excellent reproducibility, It is preferable that the test sample is dried blood or saliva, or a hair root, and since it is obtained by removing hair from the root as described above, it is possible to collect relatively without pain. Therefore, it is particularly preferable that the solid test sample is a hair root.
  • the solid test sample is obtained by drying blood, there is an advantage that the amount of collected blood can be reduced as compared with the conventional genotype determination method for alcohol sensitivity-related genes.
  • FIG. 1 shows an example in which the hair 1 including the hair root 2 is carefully extracted from the test object and collected as a solid test sample.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the process until alcohol is decomposed in the body and excreted outside the body.
  • Alcohol taken into the body is usually first decomposed into acetaldehyde by alcohol dehydrogenase ADH, liver microsomal oxidation system cytochrome CYP2E1, and the like.
  • Acetaldehyde is broken down into acetic acid by aldehyde dehydrogenase (ALDH). Thereafter, acetic acid is decomposed into water and carbon dioxide and then excreted outside the body.
  • ADH aldehyde dehydrogenase
  • the “alcohol sensitivity-related gene” in the present invention refers to the gene of such an enzyme related to alcohol metabolism.
  • the gene of alcohol dehydrogenase ADH1B, the gene of aldehyde dehydrogenase ALDH2, and the gene of cytochrome CYP2E1 At least one of the genes.
  • the gene of alcohol dehydrogenase ADHB1 includes genotype ADHB1 * 1 (base sequence shown in SEQ ID NO: 1) and genotype ADHB1 * 2 (base sequence shown in SEQ ID NO: 2), About 60% of Japanese people have the allele ADHB1 * 2 / * 2 in which alcohol dehydrogenase ADH has normal activity (enzyme activity: 200), and about 35% of Japanese people have normal alcohol dehydrogenase ADH Allele ADHB1 * 1 / * 2 with high activity (enzyme activity: 100), about 5% of Japanese allele ADHB1 * 1 with low activity (enzyme activity: 1) of alcohol dehydrogenase ADH It is known to have / * 1.
  • the gene for aldehyde dehydrogenase ALDH2 has genotype ALDH2 * 1 (base sequence shown in SEQ ID NO: 3) and genotype ALDH2 * 2 (base sequence shown in SEQ ID NO: 4). About 56% of Japanese whose enzyme ALDH2 has normal activity (enzyme activity: 100) has the allele ALDH2 * 1 / * 1 and has low activity of alcohol dehydrogenase ADH (enzyme activity: 6) about 40 % Of Japanese have the allele ALDH2 * 1 / * 2 and alcohol dehydrogenase ADH is inactive (enzyme activity: 0) About 4% of Japanese have the allele ALDH2 * 2 / * 2 It is known to have.
  • genotype CYP2E1 * c1 (base sequence shown in SEQ ID NO: 5) and the genotype CYP2E1 * c2 (base sequence shown in SEQ ID NO: 6) are known as the genes of cytochrome CYP2E1.
  • the alcohol sensitivity-related gene in the present invention is usually applicable to a length of about 20 to several hundred thousand bases, but is preferably 50 to 3000 bases.
  • the solid test sample collected as described above is directly contacted with a solution containing a buffer and a DNA polymerase, and a primer DNA for amplifying a specific gene, and then the polymerase.
  • Chain reaction LAMP method, strand displacement amplification, reverse transcriptase strand displacement amplification, reverse transcriptase polymerase chain reaction, reverse transcription LAMP method, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-mediated amplification and rolling circle amplification method And amplify the alcohol sensitivity related gene contained in the solid test sample.
  • a reagent is placed on a plate-like or tube-like carrier.
  • a reagent is put into the inside thereof, and in the case of a plate-shaped carrier, the reagent is placed on the surface thereof.
  • This reagent contains a solution containing a buffer and DNA polymerase and primer DNA.
  • the solid test sample is placed on the carrier so that the reagent and the solid test sample are in direct contact with each other, and the polymerase chain reaction, LAMP method, strand displacement amplification, reverse transcriptase strand displacement amplification, reverse transcriptase are performed by known methods.
  • the gene is amplified by a method selected from polymerase chain reaction, reverse transcription LAMP method, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-mediated amplification, and rolling circle amplification method. Note that a solid test sample may be placed on a carrier, and then a reagent may be placed on the carrier. In FIG.
  • the PCR reaction solution 4 is introduced into the inside of the tubular carrier 3, and the hair 1 as the solid test sample is further introduced into the carrier 3, so that the solid test sample is brought into contact with the PCR reaction solution.
  • the tube-shaped carrier 3 is covered with a lid 5 and then a PCR reaction is performed.
  • the DNA polymerase is not particularly limited as long as it is a thermostable DNA polymerase represented by Taq DNA polymerase, but KOD DNA polymerase is preferably used.
  • the buffer is not particularly limited as long as DNA can be amplified even in the presence of a substance that inhibits the PCR reaction contained in the solid test sample, but EzWay TM (KOMA Biotechnology), Ampdirect TM (Shimadzu Corporation) ), Phusion (registered trademark) Blood Direct PCR kit buffer (New ENGLAND Bio-Labs), KOD FX buffer (Toyobo), etc. are preferably used, and KOD FX buffer (Toyobo) developed for KOD DNA polymerase is used. It is particularly preferable to use it.
  • the nucleic acid constituting the alcohol sensitivity-related gene is DNA
  • a direct PCR method or a LAMP method can be performed.
  • a reverse transcription reaction is performed in the case of an RNA chain fragment, followed by polymerase chain reaction (PCR), LAMP method, strand displacement amplification (SDA), reverse transcriptase.
  • PCR polymerase chain reaction
  • SDA strand displacement amplification
  • RT Strand displacement amplification
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • RT-LAMP reverse transcription LAMP method
  • NASBA Nucleic Acid Sequence-Based Amplification
  • Amplification can be performed using gene amplification methods such as transcription-mediated amplification (TMA) and rolling circle amplification.
  • TMA transcription-mediated amplification
  • the amplification conditions such as PCR are not particularly limited as long as specific amplification occurs, and can be set as appropriate.
  • At least two selected from the gene for alcohol dehydrogenase ADH1B, the gene for aldehyde dehydrogenase ALDH2, and the gene for cytochrome CYP2E1 are simultaneously amplified and simultaneously genotyped. Is preferred.
  • the primer DNA used in the PCR method in the present invention is not particularly limited as long as it can specifically amplify an alcohol sensitivity-related gene, and can be appropriately designed by a known method. Since the genotype can be determined by a simple procedure, among the PCR methods, allele specific primer (ASP) -PCR method and PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism: Restriction Fragment Length Polymorphism) method is preferably used, and primer DNA designed for that purpose is preferably used.
  • ASP allele specific primer
  • PCR-RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism: Restriction Fragment Length Polymorphism
  • the TaqMan method can also be used as the PCR method.
  • the TaqMan method is a method using PCR using a fluorescently labeled allele-specific oligonucleotide (TaqMan probe) and Taq DNA polymerase (for example, Genet. Anal., 14143-149 (1999), J. Clin. Microbiol., 34, (See 2933-2936 (1996).)
  • Primers are designed in a region containing the target sequence, and a TaqMan probe is set between them.
  • the prober fluorescent dye (R) is labeled on the 5 'end side of this probe, and the quencher fluorescent dye (Q) is labeled on the 3' end side.
  • the probe hybridizes first. Then, the primer hybridizes, and the TaqMan probe is hydrolyzed one by one by the 5'-3 'exonuclease activity of DNA polymerase to release the reporter fluorescent dye. This is based on the fact that the intensity of the released reporter dye is proportional to the PCR product.
  • the two fluorescent labeling substances may be any combination that can be distinguished from each other, and such combinations of fluorescent labeling substances are known to each other. Can be used. Suitable specific examples include any combination of 6-FAM®, VIC®, and TET®.
  • the target amplification reaction can be performed without any problem if an oligonucleotide primer is used
  • the target hybridization reaction can be performed without any problem if the oligonucleotide probe is used.
  • some base sequences may be modified such as deletion, substitution, insertion and / or addition.
  • the number of bases involved in the modification is, for example, 1 to 5, preferably 1 to 3. Such modification is generally performed at a portion other than the base corresponding to the polymorphic site.
  • the polymorphism analysis oligonucleotide a DNA fragment or an RNA fragment is appropriately used depending on the analysis method.
  • the nucleotide length of the oligonucleotide for polymorphism analysis is not particularly limited as long as each function is exhibited. Examples of the nucleotide length when used as a primer are 15 to 30 nucleotides, preferably 18 to 25 nucleotides. Degree.
  • the length of the polynucleotide to be amplified is appropriately set according to the detection method to be used, but is generally 20 to 500 bases, preferably 20 to 200 bases.
  • Primers and probes of the present invention include those to which an appropriate label for detection is added at the end of the sequence.
  • the label include ROX (registered trademark), FITC (registered trademark; fluorescein), TET (registered trademark), Cy5 (registered trademark), HEX (registered trademark), NED ((registered trademark)), 6-FAM ( (Registered trademark), ROX (registered trademark), TAMRA (registered trademark), rhodamine (rhodamine), and other fluorescent dyes, enzymes, proteins, radioactive substances, biotin, thiols, etc. can be mentioned, but are not limited thereto .
  • a method of labeling a base with a fluorescent dye a known method can be used. Commercially available fluorescent labeling kits can also be used.
  • oligonucleotides for polymorphism analysis can be synthesized by chemical synthesis methods such as the usual phosphoramidite method and phosphate triester method, or commercially available automated oligonucleotide synthesis. It can also be synthesized using an apparatus (for example, Pharmacia LKB Gene Assembler Plus: Pharmacia). Alternatively, a custom-synthesized one can be used.
  • examples of the “insoluble carrier” in the present invention include a 96-well well in addition to a tube made of plastic, glass, or the like.
  • the tube shape means a hollow state, and may be a shape such as a PCR tube with a bottom or an Eppendorf tube.
  • the probe DNA is immobilized on the surface of the carrier.
  • the alcohol sensitivity-related gene in the solid test sample can be captured by hybridization via an oligo DNA (probe DNA) immobilized on a tube-shaped carrier, and can be amplified by RT-PCR, or Amplify a specific gene in the liquid phase on the carrier, and simultaneously detect specific genes of various organisms or comprehensively detect genetic polymorphisms (SNPs) using multiple types of probe DNA immobilized on a plate-like carrier. This is because there is an advantage.
  • the genotype of the gene is then determined from the gene amplified as described above.
  • the analysis method in this step is not particularly limited as long as the amplified gene can be detected or quantified.
  • the gel electrophoresis method the amount and the size of the PCR amplification product can be evaluated.
  • the real-time PCR method the PCR amplification product can be quickly quantified.
  • the change in fluorescence intensity is generally a noise level and is equal to zero until the number of amplification cycles is 1 to 10. Therefore, these are regarded as sample blanks with zero amplification products, and their standard deviation SD is calculated.
  • the fluorescence value multiplied by 10 is used as a threshold value, and the number of PCR cycles that first exceeds the threshold value is referred to as a cycle threshold value (Ct value). Therefore, the larger the initial DNA template amount in the PCR reaction solution, the smaller the Ct value, and the smaller the template DNA amount, the larger the Ct value. Further, even if the amount of template DNA is the same, the Ct value of the PCR reaction in the same region becomes larger as the rate of cleavage of the specific gene of PCR in the template increases.
  • the genotype of an alcohol susceptibility-related gene can be determined safely, quickly, and inexpensively.
  • a test system for alcohol sensitivity-related genes that is much safer, quicker, and cheaper than in the past.
  • Such genetic testing systems are useful for alcohol health education to prevent underage drinking, educational activities for the spread and understanding of personalized medicine through genetic diagnosis, health management for safety and security against alcohol, etc. it is conceivable that.
  • the hair roots were directly put into a PCR reaction solution in a tube-shaped carrier.
  • a PCR reaction solution a PCR kit KOD FX (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used, and a 25 ⁇ L reaction solution containing the following reagents was prepared according to the attached protocol.
  • PCR reaction solution for ADH1B gene 2 ⁇ PCR Buffer for KOD FX: 7.5 ⁇ L, DNTPs: 1.5 ⁇ L, Primer 1 (ADH1B-F) (10 ⁇ M): 0.6 ⁇ L Primer 2 (ADH1B-R) (10 ⁇ M): 0.6 ⁇ L, -KOD FX: 0.3 ⁇ L, DW (distilled water): 4.5 ⁇ L.
  • PCR reaction solution for ALDH2 gene 2 ⁇ PCR Buffer for KOD FX: 7.5 ⁇ L, DNTPs: 1.5 ⁇ L, Primer 3 (ALDH2-F) (10 ⁇ M): 0.6 ⁇ L, Primer 4 (ALDH2-R) (10 ⁇ M): 0.6 ⁇ L, -KOD FX: 0.3 ⁇ L, DW (distilled water): 4.5 ⁇ L.
  • Primer 1 (ADH1B-F): 5′-CCTTGGGGATAAACTGAATCTT-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
  • Primer 2 (ADH1B-R): 5′-GAAATCCTGGATGGTGAACC-3 ′ (SEQ ID NO: 8).
  • Primer 3 (ALDH2-F): 5′-TCAAATTACAGGGTCAACTGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 9)
  • Primer 4 (ALDH2-R): 5′-GGCTGGGGTCTTTACCCTCTC-3 ′ (SEQ ID NO: 10).
  • the tube-shaped carrier was covered and a PCR reaction was performed under the following amplification conditions.
  • (Amplification conditions) Thermal denaturation: 95 ° C., 5 minutes, 98 ° C, 10 seconds ⁇ 60 ° C, 30 seconds ⁇ 74 ° C, 45 seconds, 40 cycles, Extension reaction: 74 ° C., 2 minutes.
  • the amplification product of the ADH1B gene obtained after the PCR reaction was 349 bp.
  • the amplification product of this ADH1B gene was subjected to a restriction enzyme reaction at 37 ° C. for 1 hour in a reaction solution having the following composition.
  • the amplification product of ALDH2 gene obtained after the PCR reaction was 430 bp.
  • the amplification product of this ALDH2 gene was subjected to a restriction enzyme reaction at 37 ° C. for 1 hour in a reaction solution having the following composition.
  • FIG. 3 is an electrophoretogram showing the results of Example 1. It can be seen from FIG. 3 that 189 bp and 160 bp ADH1B gene restriction enzyme-treated pieces, 296 bp and 134 bp ALDH2 gene restriction enzyme-treated pieces were obtained, respectively.
  • each lane shows the following results.
  • -Lane 1 ADH1B * 2 / * 2 (blood)
  • -Lane 2 ADH1B * 2 / * 2 (saliva)
  • -Lane 3 ADH1B * 2 / * 2 (hair root)
  • -Lane 4 ALDH2 * 2 / * 2 (blood)
  • -Lane 5 ALDH2 * 2 / * 2 (saliva)
  • Lane 6 ALDH2 * 2 / * 2 (hair root).
  • each lane shows the following results.
  • -Lane 1 ADH1B * 2 / * 2 (blood)
  • -Lane 2 ADH1B * 2 / * 2 (saliva)
  • -Lane 3 ADH1B * 2 / * 2 (hair root)
  • -Lane 4 ALDH2 * 1 / * 1 (blood)
  • -Lane 5 ALDH2 * 1 / * 1 (saliva)
  • Lane 6 ALDH2 * 1 / * 1 (hair root).
  • each lane shows the following results.
  • -Lane 1 ADH1B * 2 / * 2 (blood)
  • -Lane 2 ADH1B * 2 / * 2 (saliva)
  • -Lane 3 ADH1B * 2 / * 2 (hair root)
  • -Lane 4 ALDH2 * 1 / * 2 (blood)
  • -Lane 5 ALDH2 * 1 / * 2 (saliva)
  • Lane 6 ALDH2 * 1 / * 2 (hair root).
  • each lane shows the following results.
  • -Lane 1 ADH1B * 1 / * 1 (blood)
  • -Lane 2 ADH1B * 1 / * 1 (saliva)
  • -Lane 3 ADH1B * 1 / * 1 (hair root)
  • -Lane 4 ALDH2 * 1 / * 1 (blood)
  • -Lane 5 ALDH2 * 1 / * 1 (saliva)
  • Lane 6 ALDH2 * 1 / * 1 (hair root).
  • each lane shows the following results.
  • -Lane 1 ADH1B * 1 / * 1 (blood)
  • -Lane 2 ADH1B * 1 / * 1 (saliva)
  • -Lane 3 ADH1B * 1 / * 1 (hair root)
  • -Lane 4 ALDH2 * 1 / * 2 (blood)
  • -Lane 5 ALDH2 * 1 / * 2 (saliva)
  • Lane 6 ALDH2 * 1 / * 2 (hair root).
  • each lane shows the following results.
  • -Lane 1 ADH1B * 1 / * 2 (blood)
  • -Lane 2 ADH1B * 1 / * 2 (saliva)
  • -Lane 3 ADH1B * 1 / * 2 (hair root)
  • -Lane 4 ALDH2 * 1 / * 1 (blood)
  • -Lane 5 ALDH2 * 1 / * 1 (saliva)
  • Lane 6 ALDH2 * 1 / * 1 (hair root).
  • each lane shows the following results.
  • -Lane 1 ADH1B * 1 / * 2 (blood)
  • -Lane 2 ADH1B * 1 / * 2 (saliva)
  • -Lane 3 ADH1B * 1 / * 2 (hair root)
  • -Lane 4 ALDH2 * 1 / * 2 (blood)
  • -Lane 5 ALDH2 * 1 / * 2 (saliva)
  • Lane 6 ALDH2 * 1 / * 2 (hair root).
  • Example 2 As in Example 1, the sample was soaked in filter paper (Advantech Qualitative Filter Paper No. 2), air-dried and collected as a solid test sample, and a punch piece of 1 mm in diameter of the dry filter paper was used as it was in PCR in a tube-shaped carrier. The reaction solution was charged. As a PCR reaction solution, a PCR kit KOD FX (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used, and a 25 ⁇ L reaction solution containing the following reagents was prepared according to the attached protocol.
  • a PCR reaction solution a PCR kit KOD FX (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used, and a 25 ⁇ L reaction solution containing the following reagents was prepared according to the attached protocol.
  • Primer 5 (ADH1B-F): 5′-GGAAGGTAGAGAGGGCTTTAGACTTG-3 ′ (SEQ ID NO: 11)
  • Primer 6 (ADH1B-R): 5′-GTGCAAGCACTTTCGTCCTCTATTTG-3 ′ (SEQ ID NO: 12).
  • Primer 7 (ALDH2-F): 5′-TGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATAGACT-3 ′ (SEQ ID NO: 13)
  • Primer 8 (ALDH2-R): 5′-CCGGCAGGTCCTGAACCTCTGGCAGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 14).
  • the tube-shaped carrier was covered, and PCR reaction of the ADH1B gene and ALDH2 gene was performed independently under the following amplification conditions.
  • the amplification product of the ADH1B gene obtained after the PCR reaction was 428 bp.
  • the amplification product of this ADH1B gene was subjected to a restriction enzyme reaction at 37 ° C. for 1 hour in a reaction solution having the following composition.
  • the amplification product of the ALDH2 gene obtained after the PCR reaction was 169 bp.
  • the amplification product of this ALDH2 gene was subjected to a restriction enzyme reaction at 37 ° C. for 1 hour in a reaction solution having the following composition.
  • FIG. 4 is an electrophoretogram showing the results of Example 2.
  • FIG. 4 shows that 217 bp and 211 bp ADH1B gene restriction fragments and 48 bp and 121 bp ALDH2 gene restriction fragments were obtained, respectively.
  • each lane shows the following results.
  • -Lane 1 ADH1B * 1 / * 2
  • -Lane 2 ADH1B * 1 / * 1
  • -Lane 3 ADH1B * 1 / * 2
  • Lane 4 DW.
  • each lane shows the following results.
  • -Lane 1 ALDH2 * 1 / * 2
  • -Lane 2 ALDH2 * 2 / * 2
  • -Lane 3 ALDH2 * 2 / * 2
  • Lane 4 DW.
  • Example 3 The ADH1B gene and ALDH2 gene amplification products obtained in the same manner as in Example 2 were simultaneously subjected to a restriction enzyme reaction at 37 ° C. for 1 hour using the following restriction enzyme reaction solution.
  • FIG. 5 is an electrophoretogram showing the results of Example 3.
  • each lane shows the following results.
  • -Lane 1 ADH1B * 1 / * 2
  • ALDH2 * 1 / * 2 ALDH2 * 1 / * 2
  • -Lane 2 ADH1B * 1 / * 1, ALDH2 * 2 / * 2
  • Lane 3 ADH1B * 1 / * 2
  • Lane 4 DW.
  • Example 4 As in Example 1, the sample was soaked in filter paper (Advantech Qualitative Filter Paper No. 2), air-dried and collected as a solid test sample, and a punch piece of 1 mm in diameter of the dry filter paper was used as it was in PCR in a tube-shaped carrier. The reaction solution was charged. As a PCR reaction solution, a PCR kit KOD FX (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used to prepare a 25 ⁇ L reaction solution containing the following reagents according to the attached protocol.
  • a PCR kit KOD FX manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • the tube-shaped carrier was covered, and PCR reaction was simultaneously performed on the ADH1B gene and the ALDH2 gene under the following amplification conditions.
  • the obtained PCR amplification product was subjected to a restriction enzyme reaction at 37 ° C. for 1 hour at the same time using the following restriction enzyme reaction solution.
  • FIG. 6 is an electrophoretogram showing the results of Example 4.
  • each lane shows the following results.
  • -Lane 1 ADH1B * 1 / * 2
  • ALDH2 * 1 / * 2 ALDH2 * 1 / * 2
  • -Lane 2 ADH1B * 1 / * 1, ALDH2 * 2 / * 2
  • Lane 3 ADH1B * 1 / * 2
  • Lane 4 DW (distilled water).
  • Example 5 As in Example 1, the sample was soaked in filter paper (Advantech Qualitative Filter Paper No. 2), air-dried and collected as a solid test sample, and a punch piece of 1 mm in diameter of the dry filter paper was used as it was in PCR in a tube-shaped carrier. The reaction solution was charged. As a PCR reaction solution, a PCR kit KOD FX (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used, and 25 ⁇ L reaction solutions containing the following reagents were prepared according to the attached protocol.
  • a PCR reaction solution a PCR kit KOD FX (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used, and 25 ⁇ L reaction solutions containing the following reagents were prepared according to the attached protocol.
  • PCR reaction solution 2 ⁇ PCR Buffer for KOD FX: 12.5 ⁇ L, DNTPs: 2.5 ⁇ L, Primer 9 (CYP2E1-F) (10 ⁇ M): 1 ⁇ L, Primer 10 (CYP2E1-R) (10 ⁇ M): 1 ⁇ L, -KOD FX: 0.5 ⁇ L, DW (distilled water): 7.5 ⁇ L.
  • PCR-RFLP primers for the CYP2E1 gene were used.
  • Primer 9 (CYP2E1-F): 5′-CCAGTCCGAGTCTACATTGTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 15)
  • Primer 10 (CYP2E1-R): 5′-TTCATTCTGTCTCTCACTACTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 16).
  • the tube-shaped carrier was covered and a PCR reaction of the CYP2E1 gene was performed under the following amplification conditions.
  • the amplification product of CYP2E1 gene obtained after the PCR reaction was 410 bp.
  • the amplification product of this CYP2E1 gene was subjected to a restriction enzyme reaction at 37 ° C. for 1 hour in a reaction solution having the following composition.
  • FIG. 7 is an electrophoretogram showing the results of Example 5.
  • each lane shows the following results.
  • Lane 1 CYP2E1 * c1 / * c1
  • Lane 2 CYP2E1 * c1 / * c2
  • Lane 3 CYP2E1 * c2 / * c2.
  • Example 6 In the following procedure, for saliva (including oral cells) or blood collected from each test subject (subjects A, B, C, D), the gene for alcohol dehydrogenase ADH1B and the gene for aldehyde dehydrogenase ALDH2 Detection of the gene polymorphism was performed by a TaqMan (registered trademark) method using a real-time PCR apparatus ABI7300 (manufactured by Applied Biosystems). Saliva or blood was soaked in filter paper (Advantech Qualitative Filter Paper No. 2), air dried, and collected as a solid test sample.
  • filter paper Advancedtech Qualitative Filter Paper No. 2
  • Tth DNA polymerase is more advantageous than Taq DNA polymerase
  • inhibitors in blood are Hemoglobin and Lactoferrin.
  • BSA and Betaine are useful as additives to avoid the influence. It has been reported that.
  • heparin an anticoagulant, is also known to inhibit PCR (eg, Michael P. and Andrew L., Nucleic Acids Research, 19, 1151, (1991) (Non-Patent Document 8), Henke W., Herdel K., Jung K., Schnorr D. and Loening A. S., Nucleic Acids Research, 25, 3957, (1997) (Non-Patent Document 9), Waled A. A. and Peter R., J .clin. Microbiol., 39, 485-493, (2001) (see Non-Patent Document 10), etc.).
  • the probe and primer set are TaqMan (registered trademark) SNP Genotyping Assays kit from Applied Biosystems, and PCR amplification is Taqman Genotyping Master Mix (Made by Applied Biosystems Migrant, Res. )) Or RNA-direct RT-PCR Master Mix (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), 20 ⁇ L reaction solutions containing the following reagents were prepared. Genotyping was determined by the fluorescence intensity of two colors detected according to the attached protocol as a result of this reaction.
  • TaqMan reaction solution for ADH1B gene ⁇ When using Taqman Genotyping Master Mix (Applied Biosystems)> Taqman Genotyping Master Mix: 10 ⁇ l, Taqman Assay Mix C_2688467_20: 1 ⁇ l, -Dry filter paper saliva heat treatment supernatant: 5 ⁇ l, DW (distilled water): 4 ⁇ l.
  • Realtime PCR Master Mix 10 ⁇ l
  • Taqman Assay Mix C_2688467_20 1 ⁇ l
  • -Dry filter paper saliva heat treatment supernatant 5 ⁇ l
  • DW distilled water
  • Realtime PCR Master Mix 10 ⁇ l
  • Taqman Assay Mix C_2688467_20 1 ⁇ l
  • -Dry filter paper blood heat treatment supernatant 5 ⁇ l
  • DW distilled water
  • RNA-direct RT-PCR Master Mix 10 ⁇ l, 25 mM MgSO 4 : 1 ⁇ l, Taqman Assay Mix C_2688467_20: 1 ⁇ l, -Dry filter paper saliva heat treatment supernatant: 5 ⁇ l, DW (distilled water): 3 ⁇ l.
  • RNA-direct RT-PCR Master Mix 10 ⁇ l, 25 mM MgSO 4 : 1 ⁇ l, Taqman Assay Mix C_2688467_20: 1 ⁇ l, -Dry filter paper blood heat treatment supernatant: 5 ⁇ l, DW (distilled water): 3 ⁇ l.
  • Taqman Genotyping Master Mix 10 ⁇ l
  • Taqman Assay Mix C 117033892 — 10 ⁇ l
  • -Dry filter paper saliva heat treatment supernatant 5 ⁇ l
  • DW distilled water
  • Realtime PCR Master Mix 10 ⁇ l
  • Taqman Assay Mix C 10 ⁇ l
  • -Dry filter paper saliva heat treatment supernatant 5 ⁇ l
  • DW distilled water
  • Realtime PCR Master Mix 10 ⁇ l
  • Taqman Assay Mix C 10 ⁇ l
  • -Dry filter paper blood heat treatment supernatant 5 ⁇ l
  • DW distilled water
  • RNA-direct RT-PCR Master Mix 10 ⁇ l, 25 mM MgSO 4 : 1 ⁇ l, Taqman Assay Mix C — 117033892 — 10 ⁇ l, -Dry filter paper saliva heat treatment supernatant: 5 ⁇ l, DW (distilled water): 3 ⁇ l.
  • RNA-direct RT-PCR Master Mix 10 ⁇ l, 25 mM MgSO 4 : 1 ⁇ l, Taqman Assay Mix C — 117033892 — 10 ⁇ l, -Dry filter paper blood heat treatment supernatant: 5 ⁇ l, DW (distilled water): 3 ⁇ l.
  • the sample was as follows.
  • FIG. 8 is a diagram showing the determination result of ADH1B by TaqMan method using Taqman Genotyping Master Mix (Applied Biosystems)
  • FIG. 9 is a diagram using Taqman Genotyping Master Mix (Applied by Applied Bios). It is a figure which shows the determination result of ALDH2 by TaqMan method.
  • FIG. 10 is a diagram showing the determination result of ADH1B by TaqMan method using Realtime PCR Master Mix (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) (using dry filter paper saliva)
  • FIG. 11 is Realtime PCR Master Mix (Toyobo).
  • FIG. 12 is a diagram showing the determination result of ADH1B by TaqMan method using Realtime PCR Master Mix (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) (using dry filter paper blood)
  • FIG. 13 is Realtime PCR Master Mix (Toyobo ( It is a figure which shows the determination result of ALDH2 by TaqMan method using the product made from Co., Ltd. (Dry filter paper blood use).
  • FIG. 12 is a diagram showing the determination result of ADH1B by TaqMan method using Realtime PCR Master Mix (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) (using dry filter paper blood)
  • FIG. 13 is Realtime PCR Master Mix (Toyobo ( It is a figure which shows the determination result of ALDH2 by TaqMan method using the product made from Co., Ltd. (Dry filter paper blood use).
  • FIG. 14 is a diagram showing the determination result of ADH1B by TaqMan method using RNA-direct RT-PCR Master Mix (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) (using dry filter paper saliva), and FIG. 15 is RNA-direct RT.
  • -It is a figure which shows the determination result of ALDH2 by TaqMan method using PCR Master Mix (made by Toyobo Co., Ltd.) (using dry filter paper saliva).
  • FIG. 16 is a diagram showing the determination result of ADH1B by TaqMan method using RNA-direct RT-PCR Master Mix (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) (using dry filter paper blood), and FIG. 17 is RNA-direct RT.
  • -It is a figure which shows the determination result of ALDH2 by TaqMan method using PCR Master Mix (made by Toyobo Co., Ltd.) (Dry filter paper blood use).

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Abstract

　アルコール感受性関連遺伝子の遺伝子型を判定する方法であって、前記遺伝子を含む固形被検試料を、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および前記遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して、前記遺伝子を増幅する工程と、前記増幅された遺伝子から、当該遺伝子の遺伝子型を判定する工程とを含む、遺伝子型を判定する方法によって、安全、迅速、かつ安価にアルコールに対する感受性に関連する遺伝子の遺伝子型を判定する方法が提供できる。

Description

遺伝子型判定方法
　本発明は、アルコールに対する感受性に関連する遺伝子（アルコール感受性関連遺伝子）を含む固形被検試料から、当該固形被検試料に含まれる遺伝子の遺伝子型を判定する方法に関する。
　アルコール脱水素酵素ＡＤＨ（Alcohol　Dehydrogenase）は、体内におけるアルコールからアセトアルデヒドへの分解に関与する酵素であり、複数種類が知られている。そのうちＡＤＨ１Ｂ（旧名ＡＤＨ２）の遺伝子には、アルコール代謝速度が遅い低活性型と呼ばれる遺伝子型ＡＤＨＢ１　＊１／＊１があり、そのような遺伝子型を有する人は、飲酒後の顔面紅潮、動悸などのいわゆるフラッシング症状を呈し、アルコールの分解速度が遅いために体内にアルコールが残りやすく、アルコール依存症になりやすい体質であるといわれている。
　またアルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ（Aldehyde　Dehydrogenase）は、体内におけるアセトアルデヒドから酢酸への分解に関与する酵素の一つであり、複数種類が知られている。このうち、アセトアルデヒドの血中濃度が低い場合に作用するＡＬＤＨ２の遺伝子にも不活性型と呼ばれる遺伝子型ＡＬＤＨ２　＊１／＊２、ＡＬＤＨ２　＊２／＊２とが知られており、そのような遺伝子型を有する人は、アセトアルデヒドの分解速度が遅いために飲酒で赤くなり二日酔いを起こしやすい体質であるといわれている。
　遺伝子型ＡＤＨＢ１　＊１／＊１については日本人の５％程度、遺伝子型ＡＬＤＨ２　＊１／＊２については日本人のほぼ４０％程度存在することが分かっている。アルコール、アルデヒドには発癌性があり、上述した遺伝子型ＡＤＨＢ１　＊１／＊１や遺伝子型ＡＬＤＨ２　＊１／＊２を有する人は、飲酒量の増加を介して口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、肝臓癌、乳癌、直腸結腸癌など発癌しやすい傾向にあり、特に、遺伝子型ＡＤＨＢ１　＊１／＊１と遺伝子型ＡＬＤＨ２　＊１／＊２とを併せ持つ人は、その危険性は倍増するといわれている（たとえば、Akira　Yokoyama　et　al.,　"Genetic　polymorphisms　of　alcohol　and　aldehyde　dehydrogenases　and　glutathione　S-transferase　M1　and　drinking,　smoking,　and　diet　in　Japanese　men　with　esophageal　squamous　cell　carcinoma",　Carcinogenesis,　Vol.　23,　no.　11,　(2002),　pp.　1851-1859（非特許文献１）、Akira　Yokoyama　et　al.,　"Alcohol　and　aldehyde　dehydrogenase　gene　polymorphisms　and　oropharyngolaryngeal,　esophageal　and　stomach　cancers　in　Japanese　alcoholics",　Carcinogenesis,　Vol.　22,　no.　3,　(2001),　pp.433-439（非特許文献２）、Akira　Yokoyama　et　al.,　"Macrocytosis,　a　new　predictor　for　esophageal　squamous　cell　carcinoma　in　Japanese　alcoholic　men",　Carcinogenesis,　Vol.　24,　no.　11,　(2003),　pp.1773-1778（非特許文献３）、Takahiro　Asakage　et　al.,　"Genetic　polymorphisms　of　alcohol　and　aldehyde　dehydrogenases,　and　drinking,　smoking　and　diet　in　Japanese　men　with　oral　and　pharyngeal　squamous　cell　carcinoma",　Carcinogenesis,　Vol.　28,　no.　4,　(2007),　pp.865-874（非特許文献４）などを参照。）。
　また、チトクロームＣＹＰ２Ｅ１（Cytochrome　P450　2E1）は、第２のアルコール代謝経路と呼ばれる肝ミクロソーム酸化系においてアルコールの代謝に関連することが知られており、アルコール感受性の異なる２つの遺伝子型ＣＹＰ２Ｅ１　＊ｃ１、ＣＹＰ２Ｅ１　＊ｃ２が存在することが知られている（たとえば、野村文夫「第２のアルコール代謝経路Microsomal　Ethanol-Oxidizing　System（MEOS）とチトクロームP450　2E1（CYP2E1）」、千葉医学、78,　(2002),　pp.69-73（非特許文献５）、山田裕一「日本人のアルコール代謝酵素の遺伝的多形と飲酒行動および飲酒による健康障害の関係」、金医大誌、30,　(2005),　pp.448-455（非特許文献６）、Yan-Mel　Guo　et　al.,　"Genetic　polymorphisms　in　cytochrome　P4502E1,　alcohol　and　aldehyde　dehydrogenases　and　the　risk　of　esophageal　squamous　cell　carcinoma　in　Gansu　Chinese　males",　World　J　Gastroenterol,　14(9),　(2008),　pp.1444-1449（非特許文献７）などを参照。）。
　したがって、上述したアルコール脱水素酵素ＡＤＨの遺伝子、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨの遺伝子およびチトクロームＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子などのアルコール感受性関連遺伝子の遺伝子型の判定は、特に、日本人の飲酒に関連する疾患や発癌のリスクの回避、また、個人の健康管理の上で重要な意義があると考えられる。
　このように個体の基礎代謝、性質、疾患などの差異を生じさせる、生物の個体間での野生型とは異なる塩基配列を有する遺伝子多型（ＳＮＰ：Single　Nucleotide　Polymorphism）の検出は、従来よりＰＣＲ（Polymerase　Chain　Reaction）法などを利用した遺伝子解析として様々な研究が進められている。たとえば特開２００５－２４５２７３号公報（特許文献１）にはアルデヒド脱水素酵素遺伝子多型について、また、特開２００５－２４５２７２号公報（特許文献２）、特開２００６－７５１３４号公報（特許文献３）にはアルコール脱水素酵素遺伝子多型について、検出する方法がそれぞれ開示されている。しかしながら、これら特許文献１～３に開示された方法はいずれも、ＰＣＲ法に利用するためのＤＮＡの精製などが煩雑であり、より簡便な方法が求められている。
特開２００５－２４５２７３号公報 特開２００５－２４５２７２号公報 特開２００６－７５１３４号公報
Akira　Yokoyama　et　al.,　"Genetic　polymorphisms　of　alcohol　andaldehyde　dehydrogenases　and　glutathione　S-transferase　M1　and　drinking,　smoking,　and　diet　in　Japanese　men　with　esophageal　squamous　cell　carcinoma",　Carcinogenesis,　Vol.　23,　no.　11,　(2002),　pp.　1851-1859 Akira　Yokoyama　et　al.,　"Alcohol　and　aldehyde　dehydrogenase　gene　polymorphisms　and　oropharyngolaryngeal,　esophageal　and　stomach　cancers　in　Japanese　alcoholics",　Carcinogenesis,　Vol.　22,　no.　3,　(2001),　pp.433-439 Akira　Yokoyama　et　al.,　"Macrocytosis,　a　new　predictor　for　esophageal　squamous　cell　carcinoma　in　Japanese　alcoholic　men",　Carcinogenesis,　Vol.　24,　no.　11,　(2003),　pp.1773-1778 Takahiro　Asakage　et　al.,　"Genetic　polymorphisms　of　alcohol　and　aldehyde　dehydrogenases,　and　drinking,　smoking　and　diet　in　Japanese　men　with　oral　and　pharyngeal　squamous　cell　carcinoma",　Carcinogenesis,　Vol.　28,　no.　4,　(2007),　pp.865-874 野村文夫「第２のアルコール代謝経路Microsomal　Ethanol-Oxidizing　System（MEOS）とチトクロームP450　2E1（CYP2E1）」、千葉医学、78,　(2002),　pp.69-73 山田裕一「日本人のアルコール代謝酵素の遺伝的多形と飲酒行動および飲酒による健康障害の関係」、金医大誌、30,　(2005),　pp.448-455 Yan-Mel　Guo　et　al.,　"Genetic　polymorphisms　in　cytochrome　P4502E1,　alcohol　and　aldehyde　dehydrogenases　and　the　risk　of　esophageal　squamous　cell　carcinoma　in　Gansu　Chinese　males",　World　J　Gastroenterol,　14(9),　(2008),　pp.1444-1449 Michael　P.　and　Andrew　L.,　Nucleic　Acids　Reserch,　19,　1151,(1991) Henke　W.,　Herdel　K.,　Jung　K.,　Schnorr　D.　and　Loening　A.　S.,　Nucleic　Acids　Reserch,　25,　3957,(1997) Waleed　A.　A.　and　Peter　R.,　J.clin.　Microbiol.,　39,　485-493,　(2001)
　本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、安全、迅速、かつ安価にアルコールに対する感受性に関連する遺伝子の遺伝子型を判定する方法を提供することである。
　本発明は、アルコール感受性関連遺伝子の遺伝子型を判定する方法であって、前記遺伝子を含む固形被検試料を、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および前記遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して、前記遺伝子を増幅する工程と、前記増幅された遺伝子から、当該遺伝子の遺伝子型を判定する工程とを含むことを特徴とする。
　本発明におけるアルコール感受性関連遺伝子は、アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂの遺伝子、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子およびチトクロームＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子であることが、好ましい。
　本発明における固形試験試料は、血液を乾燥させたものであるか、毛根であるか、または、唾液を乾燥させたものであることが望ましい。
　本発明の遺伝子型判定方法は、アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂの遺伝子、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子およびチトクロームＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子から選ばれる少なくともいずれか２つを同時に増幅し、同時に遺伝子型を判定することが、好ましい。
　本発明によれば、安全、迅速、かつ安価にアルコールに対する感受性に関連する遺伝子の遺伝子型を判定する方法が提供される。
本発明の好ましい一例を模式的に示す図である。 アルコールが体内で分解されて体外へ排泄されるまでを模式的に示す図である。 実施例１の結果を示す電気泳動写真である。 実施例２の結果を示す電気泳動写真である。 実施例３の結果を示す電気泳動写真である。 実施例４の結果を示す電気泳動写真である。 実施例５の結果を示す電気泳動写真である。 実施例６におけるＴａｑｍａｎ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図である。 実施例６におけるＴａｑｍａｎ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である。 実施例６におけるＲｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図である（乾燥ろ紙唾液使用）。 実施例６におけるＲｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である（乾燥ろ紙唾液使用）。 実施例６におけるＲｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図である（乾燥ろ紙血液使用）。 実施例６におけるＲｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である（乾燥ろ紙血液使用）。 実施例６におけるＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図である（乾燥ろ紙唾液使用）。 実施例６におけるＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である（乾燥ろ紙唾液使用）。 実施例６におけるＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図である（乾燥ろ紙血液使用）。 実施例６におけるＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である（乾燥ろ紙血液使用）。
　図１は、本発明の好ましい一例を模式的に示す図である。本発明は、アルコール感受性関連遺伝子の遺伝子型を判定する方法であって、前記遺伝子を含む固形被検試料を、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および前記遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated　Isothermal　Amplification）法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して、前記遺伝子を増幅する工程と、前記増幅された遺伝子から、当該遺伝子の遺伝子型を判定する工程とを含む。以下、図１を参照しながら、本発明の方法について詳細に説明する。
　図１に示す例では、まず、直接固形被検試料を採取するか、または液状物を乾燥することで、検査対象から、アルコール感受性関連遺伝子を含む固形被検試料を採取する。
　直接固形被検試料を採取する場合、検査対象の毛根、口腔粘膜および細胞組織から選ばれる固形物を、固形被検試料として直接次の工程に供する。なお、毛根は、毛髪、眉毛、鼻毛、ひげ、陰毛、腋毛を含む全ての体毛由来のものであれば特に限定されない。毛根は、根元から毛を抜くことで得られるため、比較的痛みをともなわない採取が可能であり、口腔粘膜は口中に皮膚を綿棒などで軽くこすることで痛みをともなわず採取することが可能である。また、口腔粘膜は、採取後そのまま室温に置くことで乾燥させた固形状態のものであってもよい。細胞組織については、そのまま用いられる程度に乾燥していることが好ましく、水分含有量は０％以上５０％未満であることが特に好ましい。また、細胞組織については、細かく粉砕されることが好ましい。
　また液状物を乾燥させることで固形被検試料を採取する場合、検査対象の鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、血液、血清、血漿、髄液、唾液（通常、口腔粘膜が含まれる）、尿、汗、精液および細胞組織から選ばれる液状物を乾燥させることで得られる固形物を次の工程に供する。ここで、液状物に含まれる細胞組織は、水分含有量が５０％以上のものを示すものとする。なお、上述した口腔粘膜も、適宜乾燥させた後に用いても良い。
　ここで、液状物を乾燥させる方法としては、ろ紙に液状物をしみこませ、水分を蒸発させる方法や、自然乾燥または凍結乾燥など、公知の乾燥方法を選ぶことができる。ただし、糞便由来の固形被検試料を得るためには、糞便を植物繊維体に塗布し、植物繊維体を自然乾燥した後にシリカゲルとともに密閉し１時間以上保持することが好ましい。植物繊維体とは、紙、綿などの植物性の繊維体をいうものとする。
　液状物を乾燥させて固形被検試料とすることで、液状物にもともと含まれるプロテアーゼ、アミラーゼおよびヌクレアーゼなどの酵素活性を阻害することができ、生体組織細胞、微生物およびウイルスを完全に死滅させることなく生命活動を休止させることができる。したがって、固形被検試料の輸送、保存などは室温で行なうことができ、より簡便となる利点がある。
　本発明の遺伝子型判定方法においては、上述した中でも、採取され得る細胞の数が一定しており、安定した量の鋳型を遺伝子型判定に供することができ、再現性に優れる観点から、固形被検試料が血液または唾液を乾燥させたものであるか、または、毛根であることが好ましく、また、上述したように根元から毛を抜くことで得られるため、比較的痛みを伴わない採取が可能であることから、固形被検試料が毛根であることが特に好ましい。なお、固形被検試料が血液を乾燥させたものである場合、従来のアルコール感受性関連遺伝子の遺伝子型の判定方法と比較すると、血液の採取量が少なくて済むという利点がある。図１には、検査対象から、毛根２を含む頭髪１を注意深く引き抜き、固形被検試料として採取した例が示されている。
　ここで、図２は、アルコールが体内で分解されて体外へ排泄されるまでを模式的に示す図である。体内に摂取されたアルコールは、通常、まず、アルコール脱水素酵素ＡＤＨ、肝ミクロソーム酸化系のチトクロームＣＹＰ２Ｅ１などによってアセトアルデヒドに分解される。アセトアルデヒドはアルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）によって酢酸に分解される。その後、酢酸は水と二酸化炭素に分解された後、体外へ排泄される。本発明における「アルコール感受性関連遺伝子」は、このようなアルコールの代謝に関連する酵素の遺伝子を指し、好ましくは、アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂの遺伝子、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子およびチトクロームＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子である。
　上述したように、アルコール脱水素酵素ＡＤＨＢ１の遺伝子には、遺伝子型ＡＤＨＢ１　＊１（配列番号１に示す塩基配列）と、遺伝子型ＡＤＨＢ１　＊２（配列番号２に示す塩基配列）とが存在し、日本人の約６０％はアルコール脱水素酵素ＡＤＨが正常な活性（酵素活性：２００）を有する対立遺伝子ＡＤＨＢ１　＊２／＊２を有し、日本人の約３５％はアルコール脱水素酵素ＡＤＨが正常な活性（酵素活性：１００）を有する対立遺伝子ＡＤＨＢ１　＊１／＊２を有し、日本人の約５％はアルコール脱水素酵素ＡＤＨが低い活性（酵素活性：１）を有する対立遺伝子ＡＤＨＢ１　＊１／＊１を有することが知られている。
　また、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子には、遺伝子型ＡＬＤＨ２　＊１（配列番号３に示す塩基配列）と、遺伝子型ＡＬＤＨ２　＊２（配列番号４に示す塩基配列）とが存在し、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２が正常な活性（酵素活性：１００）を有する約５６％の日本人は対立遺伝子ＡＬＤＨ２　＊１／＊１を有し、アルコール脱水素酵素ＡＤＨの活性が低い（酵素活性：６）約４０％の日本人は対立遺伝子ＡＬＤＨ２　＊１／＊２を有し、アルコール脱水素酵素ＡＤＨが不活性型である（酵素活性：０）約４％の日本人は対立遺伝子ＡＬＤＨ２　＊２／＊２を有することが知られている。
　さらに、チトクロームＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子には、遺伝子型ＣＹＰ２Ｅ１　＊ｃ１（配列番号５に示す塩基配列）と、遺伝子型ＣＹＰ２Ｅ１　＊ｃ２（配列番号６に示す塩基配列）とが知られている。
　なお、本発明におけるアルコール感受性関連遺伝子は、その長さとしては、通常２０～数十万塩基程度まで適用できるが、５０～３０００塩基であることが好ましい。
　本発明の遺伝子型判定方法では、次に、上述したようにして採取した固形被検試料をバッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および特定遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して、固形被検試料に含まれるアルコール感受性関連遺伝子を増幅する。
　本工程では、プレート状またはチューブ状の担体上で、上述した遺伝子を増幅することが好ましい。具体的には、まず、プレート状またはチューブ状の担体上に試薬を置く。チューブ状の担体である場合には、その内部に試薬を投入し、プレート状の担体である場合には、その表面に試薬を置く。この試薬は、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液とプライマーＤＮＡとを含有する。そして試薬と固形被検試料とが直接接触するように担体上に固形被検試料を配置し、公知の方法によってポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法で遺伝子を増幅する。なお、担体上に固形被検試料を置き、その後に担体上に試薬を置いてもよい。図１には、チューブ状の担体３の内部にＰＣＲ反応液４を投入し、さらに、担体３に固形被検試料である頭髪１を投入することで、固形被検試料をＰＣＲ反応液と接触させた後、チューブ状の担体３に蓋５をして、ＰＣＲ反応を行なう例が示されている。
　本工程においては、ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼに代表される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのものであれば特に制限されないが、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。バッファーは固形被検試料中に含まれるＰＣＲ反応を阻害する物質存在下でもＤＮＡ増幅可能なものであれば、特に制限されないが、ＥｚＷａｙ（商標）（ＫＯＭＡ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（登録商標）（島津製作所）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ　Ｄｉｒｅｃｔ　ＰＣＲ　ｋｉｔバッファー（Ｎｅｗ　ＥＮＧＬＡＮＤ　Ｂｉｏ－Ｌａｂｓ）、ＫＯＤ　ＦＸバッファー（東洋紡績）などを用いることが好ましく、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ用に開発されたＫＯＤ　ＦＸバッファー（東洋紡績）を用いることが特に好ましい。
　アルコール感受性関連遺伝子を構成する核酸がＤＮＡの場合においては、直接ＰＣＲ法またはＬＡＭＰ法などを行なうことができる。また、該核酸がＲＮＡ断片の場合においては、ＲＮＡ鎖断片の場合は逆転写反応を行なった後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅（ＳＤＡ：Strand　Displacement　Amplification）、逆転写酵素鎖置換増幅（ＲＴ（Reverse　Transcription）－ＳＤＡ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、逆転写ＬＡＭＰ法（ＲＴ－ＬＡＭＰ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ：Nucleic　Acid　Sequence-Based　Amplification）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ：Transcription-Mediated　Amplification）、ローリングサークル型増幅などの遺伝子増幅法を用いて増幅することができる。なお、ＰＣＲなどの増幅の条件は、特異的な増幅が起こる限り特に制限されず、適宜設定することができる。なお、本発明においては、アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂの遺伝子、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子およびチトクロームＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子から選ばれる少なくともいずれか２つを同時に増幅し、同時に遺伝子型を判定するようにすることが好ましい。
　本発明においてＰＣＲ法に用いるプライマーＤＮＡは、アルコール感受性関連遺伝子を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されず、また、適宜公知の方法で設計することができる。なお、簡便な手順で遺伝子型の判定が可能となることから、ＰＣＲ法の中でも、対立遺伝子増幅（ＡＳＰ：Allele　Specific　Primer）－ＰＣＲ法およびＰＣＲ－ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型：Restriction　Fragment　Length　Polymorphism）法を利用することが好ましく、そのために設計されたプライマーＤＮＡを用いることが好ましい。
　また本発明においては、ＰＣＲ法としてＴａｑＭａｎ法を利用することもできる。ＴａｑＭａｎ法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）とＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲを利用した方法である（たとえばGenet.　Anal.,　14143-149(1999),　J.　Clin.　Microbiol.,　34,　2933-2936(1996)などを参照。）。目的の配列を含む領域にプライマーを設計し、ＴａｑＭａｎプローブをその間に設定する。このプローブの５’末端側にリポーター蛍光色素（Ｒ）を３’末端側にクレンチャー蛍光色素（Ｑ）をラベルする。プローブのＴｍ値をプライマーのＴｍ値より１０℃位高めに設計することで、プローブが先にハイブリダイズする。そしてプライマーがハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの５’－３’エキソヌクレアーゼ活性によって、ＴａｑＭａｎプローブが一塩基ずつ加水分解され、レポーター蛍光色素を遊離する。この遊離したリポーター色素の強度が、ＰＣＲ産物に比例することを利用している。
　ＴａｑＭａｎ法で遺伝子解析する場合には、プライマーとプローブの具体的なヌクレオチド配列は、適宜決定することができる。５’末端側のリポーター蛍光色素と３’末端側にクレンチャー蛍光色素の２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれに公知のものを用いることができる。好適な具体例として、６－ＦＡＭ（登録商標）、ＶＩＣ（登録商標）、およびＴＥＴ（登録商標）のいずれかの組合せが挙げられる。
　なお、上述したプライマーおよびプローブは、単なる一例であって、オリゴヌクレオチドプライマーであれば目的の増幅反応を支障なく行なえる限度において、他方オリゴヌクレオチドプローブであれば目的のハイブリダイゼーション反応を支障なく行なえる限度において、一部の塩基配列に欠失、置換、挿入および／または付加などの改変がされていてもよい。改変にかかる塩基数は、たとえば１～５個、好ましくは１～３個である。なお、このような改変は、原則として多型部位に対応する塩基以外の部分において行なわれる。
　多型解析用オリゴヌクレオチド（プローブ、プライマー）には、解析方法に応じて適宜ＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片が用いられる。多型解析用オリゴヌクレオチドの塩基長はそれぞれの機能が発揮される長さであればよく、プライマーとして用いられる場合の塩基長の例としては、１５～３０塩基長、好ましくは１８～２５塩基長程度である。
　増幅するポリヌクレオチドの長さは、用いられる検出方法に応じて適宜設定されるが、一般的には２０～５００塩基長、好ましくは２０～２００塩基長である。
　本発明のプライマーおよびプローブには、その配列の末端に、検出のための適当な標識が付加されたものも含むものとする。標識としては、たとえば、ＲＯＸ（登録商標）、ＦＩＴＣ（登録商標；フルオレセイン）、ＴＥＴ（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、ＨＥＸ（登録商標）、ＮＥＤ（（登録商標））、６－ＦＡＭ（登録商標）、ＲＯＸ（登録商標）、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎ）またはその誘導体などの蛍光色素、酵素、タンパク、放射性物質、ビオチン、チオールなどを挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素で塩基を標識する方法は、公知の方法を用いることができる。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる。
　多型解析用オリゴヌクレオチド（プライマー、プローブ）の合成は、具体的には通常のホスホルアミダイト法、リン酸トリエステル法などの化学合成法によることもでき、また市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置（たとえば、Pharmacia　LKB　Gene　Assembler　Plus：ファルマシア社製）などを使用して合成することもできる。あるいは、custom-synthesizedされたものを用いることもできる。
　ここで、本発明でいう「不溶性担体」としては、プラスチック、ガラスなどからなるチューブのほか、９６穴ウェルなどを挙げることができる。チューブ状とは、中空状態のものをいい、底があるＰＣＲチューブや、エッペンドルフチューブのような形状であってもよい。
　上述のように、担体表面にはプローブＤＮＡが固定化されていることが特に好ましい。これは、固形被検試料中のアルコール感受性関連遺伝子をチューブ状の担体に固定したオリゴＤＮＡ（プローブＤＮＡ）を介してハイブリダイゼーションで捕捉して、ＲＴ－ＰＣＲ法にて遺伝子増幅ができ、または、担体上の液相で特定遺伝子を増幅し、同時に、プレート状担体に固定した複数種のプローブＤＮＡで多種の生物の特異的遺伝子を検出したり、遺伝子多型（ＳＮＰ）を網羅的に検出できるという利点があるためである。
　そして、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法によって、アルコール感受性関連遺伝子が増幅される。
　本発明の遺伝子型判定方法では、次に、上述したようにして増幅された遺伝子から、当該遺伝子の遺伝子型を判定する。本工程における解析法は、増幅された遺伝子の検出または定量が可能なものであれば特に制限されず、ＤＮＡシーケンス法、ゲル電気泳動法、平板状のＤＮＡチップまたはビーズによるハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ法、およびプローブＤＮＡを利用した伸張反応またはハイブリダイゼーションによる遺伝子検出法から選ばれるいずれかの方法が挙げられる。ゲル電気泳動法によれば、ＰＣＲ増幅産物の量、およびその大きさを評価することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、迅速にＰＣＲ増幅産物の定量を行なうことができる。リアルタイムＰＣＲ法を採用する場合、一般に増幅サイクル数１～１０までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差ＳＤを算出しその１０を乗じた蛍光値をスレショルド値とし、そのスレッショルド値を最初に上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレショルド値（Ｃｔ値）という。したがって、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、鋳型ＤＮＡ量が同じでも、その鋳型内のＰＣＲの特定遺伝子に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のＰＣＲ反応のＣｔ値は大きな値となる。
　本発明によれば、アルコール感受性関連遺伝子の遺伝子型を安全、迅速、かつ安価に判定することができる。これによって、従来と比較して格段に安全、迅速、かつ安価なアルコール感受性関連遺伝子の検査システムの構築が可能となる。このような遺伝子検査システムは、未成年者飲酒防止のためのアルコール健康教育、遺伝子診断によるオーダーメイド医療普及・理解に向けた啓蒙活動、アルコールに対する安心・安全のための健康管理などに有用であると考えられる。
　以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　＜実施例１＞
　〔１〕ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法による遺伝子型の判定
　以下の手順で、検査対象からそれぞれ採取した血液（全血）、唾液（口腔内細胞を含む）、毛根について、アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂの遺伝子およびアルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子の遺伝子多型の検出を行なった。血液および唾液については、ろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）にしみこませ、自然乾燥させて、固形被検試料として採取した。通常行なうＤＮＡの抽出・精製する過程を省略し、この乾燥ろ紙の直径１ｍｍのパンチ片をそのまま、チューブ状の担体内のＰＣＲ反応液に投入した。また、毛根についてはそのまま、チューブ状の担体内のＰＣＲ反応液に投入した。ＰＣＲ反応液は、ＰＣＲキットＫＯＤ　ＦＸ（東洋紡績（株）製）を使用して、添付のプロトコールに従って、それぞれ以下の試薬を含む２５μＬ反応液を調整した。
　（ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用ＰＣＲ反応液）
　・２×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ　ＦＸ：７．５μＬ、
　・ｄＮＴＰｓ：１．５μＬ、
　・プライマー１（ＡＤＨ１Ｂ－Ｆ）（１０μＭ）：０．６μＬ、
　・プライマー２（ＡＤＨ１Ｂ－Ｒ）（１０μＭ）：０．６μＬ、
　・ＫＯＤ　ＦＸ：０．３μＬ、
　・ＤＷ（distilled　water）：４．５μＬ。
　（ＡＬＤＨ２遺伝子用ＰＣＲ反応液）
　・２×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ　ＦＸ：７．５μＬ、
　・ｄＮＴＰｓ：１．５μＬ、
　・プライマー３（ＡＬＤＨ２－Ｆ）（１０μＭ）：０．６μＬ、
　・プライマー４（ＡＬＤＨ２－Ｒ）（１０μＭ）：０．６μＬ、
　・ＫＯＤ　ＦＸ：０．３μＬ、
　・ＤＷ（distilled　water）：４．５μＬ。
　なお、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用のＰＣＲ－ＲＦＬＰプライマーとしては、以下の２種類を用いた。
　・プライマー１（ＡＤＨ１Ｂ－Ｆ）：５’－ＣＣＴＴＧＧＧＧＡＴＡＡＡＣＴＧＡＡＴＣＴＴ－３’（配列番号７）、
　・プライマー２（ＡＤＨ１Ｂ－Ｒ）：５’－ＧＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＣ－３’（配列番号８）。
　またＡＬＤＨ２遺伝子用のＰＣＲ－ＲＦＬＰプライマーとしては、以下の２種類を用いた。
　・プライマー３（ＡＬＤＨ２－Ｆ）：５’－ＴＣＡＡＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＣＴ－３’（配列番号９）、
　・プライマー４（ＡＬＤＨ２－Ｒ）：５’－ＧＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＡＣＣＣＴＣＴＣ－３’（配列番号１０）。
　チューブ状の担体に蓋をして、以下の増幅条件でＰＣＲ反応を行なった。
　（増幅条件）
　　熱変性：９５℃、５分、
　　９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→７４℃、４５秒を４０サイクル、
　　伸長反応：７４℃、２分。
　ＰＣＲ反応後に得られたＡＤＨ１Ｂ遺伝子の増幅産物は３４９ｂｐであった。このＡＤＨ１Ｂ遺伝子の増幅産物を以下の組成の反応液で３７℃、１時間の制限酵素反応を行なった。
　（ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用制限酵素反応液）
　・１０×ＮＥＢ　Ｂｕｆｆｅｒ　４：２μＬ、
　・ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の増幅産物：６μＬ、
　・Ｍｓｌ　１：０．２５μＬ、
　・ＤＷ（distilled　water）：１１．７５μＬ。
　またＰＣＲ反応後に得られたＡＬＤＨ２遺伝子の増幅産物は４３０ｂｐであった。このＡＬＤＨ２遺伝子の増幅産物を以下の組成の反応液で３７℃、１時間の制限酵素反応を行なった。
　（ＡＬＤＨ２遺伝子用制限酵素反応液）
　・１０×ＮＥＢ　Ｂｕｆｆｅｒ　４：２μＬ、
　・８×ＳＡＭ：２．５μＬ、
　・ＡＬＤＨ２遺伝子の増幅産物：６μＬ、
　・Ａｃｕ　１：０．２５μＬ、
　・ＤＷ（distilled　water）：９．２５μＬ。
　反応後のＡＤＨ１Ｂ遺伝子、ＡＬＤＨ２遺伝子の制限酵素処理片をそれぞれアガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された遺伝子を確認した。図３は、実施例１の結果を示す電気泳動写真である。なお、図３から、１８９ｂｐ、１６０ｂｐのＡＤＨ１Ｂ遺伝子の制限酵素処理片、２９６ｂｐ、１３４ｂｐのＡＬＤＨ２遺伝子の制限酵素処理片がそれぞれ得られていることが分かる。
　図３（ａ）において、各レーンは以下の結果を示している。
　・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ　＊２／＊２（血液）、
　・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ　＊２／＊２（唾液）、
　・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ　＊２／＊２（毛根）、
　・レーン４：ＡＬＤＨ２　＊２／＊２（血液）、
　・レーン５：ＡＬＤＨ２　＊２／＊２（唾液）、
　・レーン６：ＡＬＤＨ２　＊２／＊２（毛根）。
　図３（ｂ）において、各レーンは以下の結果を示している。
　・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ　＊２／＊２（血液）、
　・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ　＊２／＊２（唾液）、
　・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ　＊２／＊２（毛根）、
　・レーン４：ＡＬＤＨ２　＊１／＊１（血液）、
　・レーン５：ＡＬＤＨ２　＊１／＊１（唾液）、
　・レーン６：ＡＬＤＨ２　＊１／＊１（毛根）。
　図３（ｃ）において、各レーンは以下の結果を示している。
　・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ　＊２／＊２（血液）、
　・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ　＊２／＊２（唾液）、
　・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ　＊２／＊２（毛根）、
　・レーン４：ＡＬＤＨ２　＊１／＊２（血液）、
　・レーン５：ＡＬＤＨ２　＊１／＊２（唾液）、
　・レーン６：ＡＬＤＨ２　＊１／＊２（毛根）。
　図３（ｄ）において、各レーンは以下の結果を示している。
　・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊１（血液）、
　・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊１（唾液）、
　・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊１（毛根）、
　・レーン４：ＡＬＤＨ２　＊１／＊１（血液）、
　・レーン５：ＡＬＤＨ２　＊１／＊１（唾液）、
　・レーン６：ＡＬＤＨ２　＊１／＊１（毛根）。
　図３（ｅ）において、各レーンは以下の結果を示している。
　・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊１（血液）、
　・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊１（唾液）、
　・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊１（毛根）、
　・レーン４：ＡＬＤＨ２　＊１／＊２（血液）、
　・レーン５：ＡＬＤＨ２　＊１／＊２（唾液）、
　・レーン６：ＡＬＤＨ２　＊１／＊２（毛根）。
　図３（ｆ）において、各レーンは以下の結果を示している。
　・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊２（血液）、
　・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊２（唾液）、
　・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊２（毛根）、
　・レーン４：ＡＬＤＨ２　＊１／＊１（血液）、
　・レーン５：ＡＬＤＨ２　＊１／＊１（唾液）、
　・レーン６：ＡＬＤＨ２　＊１／＊１（毛根）。
　図３（ｇ）において、各レーンは以下の結果を示している。
　・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊２（血液）、
　・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊２（唾液）、
　・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊２（毛根）、
　・レーン４：ＡＬＤＨ２　＊１／＊２（血液）、
　・レーン５：ＡＬＤＨ２　＊１／＊２（唾液）、
　・レーン６：ＡＬＤＨ２　＊１／＊２（毛根）。
　＜実施例２＞
　実施例１と同様にろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）にしみこませ、自然乾燥させて固形被検試料として採取した血液を乾燥ろ紙の直径１ｍｍのパンチ片をそのまま、チューブ状の担体内のＰＣＲ反応液に投入した。ＰＣＲ反応液は、ＰＣＲキットＫＯＤ　ＦＸ（東洋紡績（株）製）を使用して、添付のプロトコールに従って、それぞれ以下の試薬を含む２５μＬ反応液を調整した。
　（ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用ＰＣＲ反応液）
　・２×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ　ＦＸ：１０μＬ、
　・ｄＮＴＰｓ：２μＬ、
　・プライマー５（ＡＤＨ１Ｂ－Ｆ）（１０μＭ）：０．８μＬ、
　・プライマー６（ＡＤＨ１Ｂ－Ｒ）（１０μＭ）：０．８μＬ、
　・ＫＯＤ　ＦＸ：０．４μＬ、
　・ＤＷ（distilled　water）：６μＬ。
　（ＡＬＤＨ２遺伝子用ＰＣＲ反応液）
　・２×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ　ＦＸ：１０μＬ、
　・ｄＮＴＰｓ：２μＬ、
　・プライマー７（ＡＬＤＨ２－Ｆ）（１０μＭ）：０．８μＬ、
　・プライマー８（ＡＬＤＨ２－Ｒ）（１０μＭ）：０．８μＬ、
　・ＫＯＤ　ＦＸ：０．４μＬ、
　・ＤＷ（distilled　water）：６μＬ。
　なお、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用のＰＣＲ－ＲＦＬＰプライマーとしては、以下の２種類を用いた。
　・プライマー５（ＡＤＨ１Ｂ－Ｆ）：５’－ＧＧＡＡＧＧＴＡＧＡＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＡＧＡＣＴＧ－３’（配列番号１１）、
　・プライマー６（ＡＤＨ１Ｂ－Ｒ）：５’－ＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＴＴＴＣＧＴＣＴＣＴＣＡＴＴＧ－３’（配列番号１２）。
　またＡＬＤＨ２遺伝子用のＰＣＲ－ＲＦＬＰプライマーとしては、以下の２種類を用いた。
　・プライマー７（ＡＬＤＨ２－Ｆ）：５’－ＴＧＧＧＣＧＡＧＴＡＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＧＡＣＴ－３’（配列番号１３）、
　・プライマー８（ＡＬＤＨ２－Ｒ）：５’－ＣＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＣＴＣＴＧＧＣＡＧＧＣ－３’（配列番号１４）。
　チューブ状の担体に蓋をして、以下の増幅条件で、それぞれ別個に独立してＡＤＨ１Ｂ遺伝子、ＡＬＤＨ２遺伝子のＰＣＲ反応を行なった。
　（増幅条件）
　　熱変性：９５℃、１０分、
　　９８℃、１０秒→６２℃、３０秒→７４℃、３０秒を４０サイクル、
　　伸長反応：７４℃、２分。
　ＰＣＲ反応後に得られたＡＤＨ１Ｂ遺伝子の増幅産物は４２８ｂｐであった。このＡＤＨ１Ｂ遺伝子の増幅産物を以下の組成の反応液で３７℃、１時間の制限酵素反応を行なった。
　（ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用制限酵素反応液）
　・１０×ＮＥＢ　Ｂｕｆｆｅｒ　４：２μＬ、
　・ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の増幅産物：６μＬ、
　・Ｍｓｌ　１：０．５μＬ、
　・ＤＷ（distilled　water）：１１．５μＬ。
　またＰＣＲ反応後に得られたＡＬＤＨ２遺伝子の増幅産物は１６９ｂｐであった。このＡＬＤＨ２遺伝子の増幅産物を以下の組成の反応液で３７℃、１時間の制限酵素反応を行なった。
　（ＡＬＤＨ２遺伝子用制限酵素反応液）
　・１０×ＮＥＢ　Ｂｕｆｆｅｒ　４：２μＬ、
　・８×ＳＡＭ：２．５μＬ、
　・ＡＬＤＨ２遺伝子の増幅産物：６μＬ、
　・Ａｃｕ　１：０．５μＬ、
　・ＤＷ（distilled　water）：９．２５μＬ。
　反応後のＡＤＨ１Ｂ遺伝子、ＡＬＤＨ２遺伝子の制限酵素処理片をそれぞれアガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された遺伝子を確認した。なお、コントロールとして、ＤＷもアプライした。図４は、実施例２の結果を示す電気泳動写真である。なお、図４から、２１７ｂｐ、２１１ｂｐのＡＤＨ１Ｂ遺伝子の制限酵素処理片、４８ｂｐ、１２１ｂｐのＡＬＤＨ２遺伝子の制限酵素処理片がそれぞれ得られていることが分かる。
　図４（ａ）において、各レーンは以下の結果を示している。
　・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊２、
　・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊１、
　・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊２、
　・レーン４：ＤＷ。
　図４（ｂ）において、各レーンは以下の結果を示している。
　・レーン１：ＡＬＤＨ２　＊１／＊２、
　・レーン２：ＡＬＤＨ２　＊２／＊２、
　・レーン３：ＡＬＤＨ２　＊２／＊２、
　・レーン４：ＤＷ。
　＜実施例３＞
　実施例２と同様にして得られたＡＤＨ１Ｂ遺伝子、ＡＬＤＨ２遺伝子の増幅産物を、以下の制限酵素反応液を用いて同時に３７℃、１時間の制限酵素反応を行なった。
　（制限酵素反応液）
　・１０×ＮＥＢ　Ｂｕｆｆｅｒ　４：２μＬ、
　・ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の増幅産物：３μＬ、
　・ＡＬＤＨ２遺伝子の増幅産物：３μＬ、
　・８×ＳＡＭ：２．５μＬ、
　・Ｍｓｌ　１：０．５μＬ、
　・Ａｃｕ　１：０．５μＬ、
　・ＤＷ（distilled　water）：８．５μＬ。
　反応後のＡＤＨ１Ｂ遺伝子、ＡＬＤＨ２遺伝子の制限酵素処理片をそれぞれアガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された遺伝子を確認した。なお、コントロールとして、ＤＷもアプライした。図５は、実施例３の結果を示す電気泳動写真である。
　図５において、各レーンは以下の結果を示している。
　・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊２、ＡＬＤＨ２　＊１／＊２、
　・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊１、ＡＬＤＨ２　＊２／＊２、
　・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊２、ＡＬＤＨ２　＊２／＊２、
　・レーン４：ＤＷ。
　＜実施例４＞
　実施例１と同様にろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）にしみこませ、自然乾燥させて固形被検試料として採取した血液を乾燥ろ紙の直径１ｍｍのパンチ片をそのまま、チューブ状の担体内のＰＣＲ反応液に投入した。ＰＣＲ反応液は、ＰＣＲキットＫＯＤ　ＦＸ（東洋紡績（株）製）を使用して、添付のプロトコールに従って、以下の試薬を含む２５μＬ反応液を調整した。
　（ＰＣＲ反応液）
　・２×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ　ＦＸ：１０μＬ、
　・ｄＮＴＰｓ：２μＬ、
　・プライマー５（ＡＤＨ１Ｂ－Ｆ）（１０μＭ）：０．４μＬ、
　・プライマー６（ＡＤＨ１Ｂ－Ｒ）（１０μＭ）：０．４μＬ、
　・プライマー７（ＡＬＤＨ２－Ｆ）（１０μＭ）：０．８μＬ、
　・プライマー８（ＡＬＤＨ２－Ｒ）（１０μＭ）：０．８μＬ、
　・ＫＯＤ　ＦＸ：０．４μＬ、
　・ＤＷ（distilled　water）：５．２μＬ。
　チューブ状の担体に蓋をして、以下の増幅条件で、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子、ＡＬＤＨ２遺伝子について同時にＰＣＲ反応を行なった。
　（増幅条件）
　　熱変性：９５℃、１０分、
　　９８℃、１０秒→６２℃、３０秒→７４℃、３０秒を４０サイクル、
　　伸長反応：７４℃、２分。
　得られたＰＣＲ増幅産物を、以下の制限酵素反応液を用いて同時に３７℃、１時間の制限酵素反応を行なった。
　（制限酵素反応液）
　・１０×ＮＥＢ　Ｂｕｆｆｅｒ　４：２μＬ、
　・ＰＣＲ増幅産物：６μＬ、
　・８×ＳＡＭ：２．５μＬ、
　・Ｍｓｌ　１：０．５μＬ、
　・Ａｃｕ　１：０．５μＬ、
　・ＤＷ（distilled　water）：８．５μＬ。
　反応後の制限酵素処理片をそれぞれアガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された遺伝子を確認した。なお、コントロールとして、ＤＷもアプライした。図６は、実施例４の結果を示す電気泳動写真である。
　図６において、各レーンは以下の結果を示している。
　・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊２、ＡＬＤＨ２　＊１／＊２、
　・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊１、ＡＬＤＨ２　＊２／＊２、
　・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ　＊１／＊２、ＡＬＤＨ２　＊２／＊２、
　・レーン４：ＤＷ（distilled　water）。
　＜実施例５＞
　実施例１と同様にろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）にしみこませ、自然乾燥させて固形被検試料として採取した血液を乾燥ろ紙の直径１ｍｍのパンチ片をそのまま、チューブ状の担体内のＰＣＲ反応液に投入した。ＰＣＲ反応液は、ＰＣＲキットＫＯＤ　ＦＸ（東洋紡績（株）製）を使用して、添付のプロトコールに従って、それぞれ以下の試薬を含む２５μＬ反応液を調整した。
　（ＰＣＲ反応液）
　・２×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ　ＦＸ：１２．５μＬ、
　・ｄＮＴＰｓ：２．５μＬ、
　・プライマー９（ＣＹＰ２Ｅ１－Ｆ）（１０μＭ）：１μＬ、
　・プライマー１０（ＣＹＰ２Ｅ１－Ｒ）（１０μＭ）：１μＬ、
　・ＫＯＤ　ＦＸ：０．５μＬ、
　・ＤＷ（distilled　water）：７．５μＬ。
　なお、ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子用のＰＣＲ－ＲＦＬＰプライマーとしては、以下の２種類を用いた。
　・プライマー９（ＣＹＰ２Ｅ１－Ｆ）：５’－ＣＣＡＧＴＣＧＡＧＴＣＴＡＣＡＴＴＧＴＣＡ－３’（配列番号１５）、
　・プライマー１０（ＣＹＰ２Ｅ１－Ｒ）：５’－ＴＴＣＡＴＴＣＴＧＴＣＴＴＣＴＡＡＣＴＧＧ－３’（配列番号１６）。
　チューブ状の担体に蓋をして、以下の増幅条件で、ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子のＰＣＲ反応を行なった。
　（増幅条件）
　　熱変性：９５℃、１０分、
　　９８℃、１０秒→５５℃、３０秒→７４℃、３０秒を４０サイクル、
　　伸長反応：７４℃、２分。
　ＰＣＲ反応後に得られたＣＹＰ２Ｅ１遺伝子の増幅産物は４１０ｂｐであった。このＣＹＰ２Ｅ１遺伝子の増幅産物を以下の組成の反応液で３７℃、１時間の制限酵素反応を行なった。
　（制限酵素反応液）
　・１０×ＮＥＢ　Ｂｕｆｆｅｒ　４：２μＬ、
　・ＰＣＲ増幅産物：６μＬ、
　・８×ＳＡＭ：２．５μＬ、
　・Ｐｓｔ　１：０．５μＬ、
　・ＤＷ（distilled　water）：１１．５μＬ。
　反応後の制限酵素処理片をそれぞれアガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された遺伝子を確認した。図７は、実施例５の結果を示す電気泳動写真である。
　図７において、各レーンは以下の結果を示している。
　・レーン１：ＣＹＰ２Ｅ１　＊ｃ１／＊ｃ１、
　・レーン２：ＣＹＰ２Ｅ１　＊ｃ１／＊ｃ２、
　・レーン３：ＣＹＰ２Ｅ１　＊ｃ２／＊ｃ２。
　＜実施例６＞
　以下の手順で、検査対象（被検者Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）からそれぞれ採取した唾液（口腔内細胞を含む）または血液について、アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂの遺伝子およびアルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子の遺伝子多型の検出をリアルタイムＰＣＲ装置ＡＢＩ７３００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＴａｑＭａｎ（登録商標）法により行なった。唾液または血液については、ろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）にしみこませ、自然乾燥させて、固形被検試料として採取した。Ｔａｑｍａｎ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）の場合、通常行うＤＮＡの抽出・精製過程を省略し、この乾燥ろ紙の直径２ｍｍのパンチ片１枚を水１０μＬの入っているエッペンドルフチューブに投入し、９０℃で１０分間加熱した。その上清５μＬをＴａｑＭａｎ反応液に投入した。
　Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）およびＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合、乾燥ろ紙唾液または乾燥ろ紙血液加熱処理上清は以下のように調整した。乾燥ろ紙唾液または乾燥ろ紙血液の直径２ｍｍのパンチ片１枚を１Ｍ　ベタインを含むＰＣＲ用緩衝液１０μＬの入っているエッペンドルフチューブに投入し、９０℃で１０分間加熱した。その上清５μＬをＴａｑＭａｎ反応液に投入した。ここで、血液中にはＰＣＲを阻害する物質が多く含まれており、これらを鋳型としたＰＣＲは成功しないことが知られている。これまでに血液をサンプルとしたＰＣＲにおいてはＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅよりもＴｔｈ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅが有利なことや、血液中の阻害物質はＨｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎであり、その影響を回避する添加剤としてＢＳＡやＢｅｔａｉｎｅが有用であることが報告されている。一方、抗血液凝固剤であるヘパリンもＰＣＲを阻害することが知られている（たとえば、Michael　P.　and　Andrew　L.,　Nucleic　Acids　Reserch,　19,　1151,(1991)（非特許文献８）、Henke　W.,　Herdel　K.,　Jung　K.,　Schnorr　D.　and　Loening　A.　S.,　Nucleic　Acids　Reserch,　25,　3957,(1997)（非特許文献９）、Waleed　A.　A.　and　Peter　R.,　J.clin.　Microbiol.,　39,　485-493,　(2001)（非特許文献１０）などを参照。）。
　ＴａｑＭａｎ法による遺伝子判定には、プローブおよびプライマーセットはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＴａｑＭａｎ（登録商標）　ＳＮＰ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ａｓｓａｙｓキット、ＰＣＲ増幅はＴａｑｍａｎ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）またはＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用して、それぞれ以下の試薬を含む２０μＬ反応液を調整した。遺伝子型判定は、本反応の結果、添付のプロトコールに従って、検出される２色の蛍光強度により判定した。
　（ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用ＴａｑＭａｎプローブ・プライマーセット）
　・ＴａｑＭａｎ（登録商標）　Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
　・Ｇｅｎｅ　Ｎａｍｅ：　ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　１Ｂ（ｃｌａｓｓ　Ｉ），　ｂｅｔａ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、
　・ＴａｑＭａｎ（登録商標）　ＳＮＰ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ａｓｓａｙ　Ｍｉｘ　ＩＤ：　Ｃ＿２６８８４６７＿２０。
　（ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用ＴａｑＭａｎ反応液）
　＜Ｔａｑｍａｎ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した場合＞
　・Ｔａｑｍａｎ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ：１０μｌ、
　・Ｔａｑｍａｎ　Ａｓｓａｙ　Ｍｉｘ　Ｃ＿２６８８４６７＿２０：１μｌ、
　・乾燥ろ紙唾液加熱処理上清：５μｌ、
　・ＤＷ（distilled　water）：４μｌ。
　＜Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合＞
　・Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ：１０μｌ、
　・Ｔａｑｍａｎ　Ａｓｓａｙ　Ｍｉｘ　Ｃ＿２６８８４６７＿２０：１μｌ、
　・乾燥ろ紙唾液加熱処理上清：５μｌ、
　・ＤＷ（distilled　water）：４μｌ。
　＜Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合＞
　・Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ：１０μｌ、
　・Ｔａｑｍａｎ　Ａｓｓａｙ　Ｍｉｘ　Ｃ＿２６８８４６７＿２０：１μｌ、
　・乾燥ろ紙血液加熱処理上清：５μｌ、
　・ＤＷ（distilled　water）：４μｌ。
　＜ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合＞
　・ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ：１０μｌ、
　・２５ｍＭ　ＭｇＳＯ4：１μｌ、
　・Ｔａｑｍａｎ　Ａｓｓａｙ　Ｍｉｘ　Ｃ＿２６８８４６７＿２０：１μｌ、
　・乾燥ろ紙唾液加熱処理上清：５μｌ、
　・ＤＷ（distilled　water）：３μｌ。
　＜ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合＞
　・ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ：１０μｌ、
　・２５ｍＭ　ＭｇＳＯ4：１μｌ、
　・Ｔａｑｍａｎ　Ａｓｓａｙ　Ｍｉｘ　Ｃ＿２６８８４６７＿２０：１μｌ、
　・乾燥ろ紙血液加熱処理上清：５μｌ、
　・ＤＷ（distilled　water）：３μｌ。
　（ＡＬＤＨ２遺伝子用ＴａｑＭａｎプローブ・プライマーセット）
　・ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
　・Ｇｅｎｅ　Ｎａｍｅ：ａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　２　ｆａｍｉｌｙ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ）、
　・ＴａｑＭａｎ（登録商標）　ＳＮＰ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ａｓｓａｙ　Ｍｉｘ　ＩＤ：Ｃ＿１１７０３８９２＿１０。
　＜Ｔａｑｍａｎ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した場合＞
　・Ｔａｑｍａｎ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ：１０μｌ、
　・Ｔａｑｍａｎ　Ａｓｓａｙ　Ｍｉｘ　Ｃ＿１１７０３８９２＿１０：１μｌ、
　・乾燥ろ紙唾液加熱処理上清：５μｌ、
　・ＤＷ（distilled　water）：４μｌ。
　＜Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合＞
　・Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ：１０μｌ、
　・Ｔａｑｍａｎ　Ａｓｓａｙ　Ｍｉｘ　Ｃ＿１１７０３８９２＿１０：１μｌ、
　・乾燥ろ紙唾液加熱処理上清：５μｌ、
　・ＤＷ（distilled　water）：４μｌ。
　＜Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合＞
　・Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ：１０μｌ、
　・Ｔａｑｍａｎ　Ａｓｓａｙ　Ｍｉｘ　Ｃ＿１１７０３８９２＿１０：１μｌ、
　・乾燥ろ紙血液加熱処理上清：５μｌ、
　・ＤＷ（distilled　water）：４μｌ。
　＜ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合＞
　・ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ：１０μｌ、
　・２５ｍＭ　ＭｇＳＯ4：１μｌ、
　・Ｔａｑｍａｎ　Ａｓｓａｙ　Ｍｉｘ　Ｃ＿１１７０３８９２＿１０：１μｌ、
　・乾燥ろ紙唾液加熱処理上清：５μｌ、
　・ＤＷ（distilled　water）：３μｌ。
　＜ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合＞
　・ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ：１０μｌ、
　・２５ｍＭ　ＭｇＳＯ4：１μｌ、
　・Ｔａｑｍａｎ　Ａｓｓａｙ　Ｍｉｘ　Ｃ＿１１７０３８９２＿１０：１μｌ、
　・乾燥ろ紙血液加熱処理上清：５μｌ、
　・ＤＷ（distilled　water）：３μｌ。
　（増幅条件）
　　熱変性：９５℃、１０分、
　　９５℃、１５秒→６０℃、１分を４０サイクル。
　サンプルは以下のとおりであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ここで、図８は、Ｔａｑｍａｎ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図であり、図９は、Ｔａｑｍａｎ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である。また、図１０は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図であり（乾燥ろ紙唾液使用）、図１１は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である（乾燥ろ紙唾液使用）。図１２は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図であり（乾燥ろ紙血液使用）、図１３は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である（乾燥ろ紙血液使用）。図１４は、ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図であり（乾燥ろ紙唾液使用）、図１５は、ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である（乾燥ろ紙唾液使用）。図１６は、ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図であり（乾燥ろ紙血液使用）、図１７は、ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である（乾燥ろ紙血液使用）。
　今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

Claims (6)

  1. 　アルコール感受性関連遺伝子の遺伝子型を判定する方法であって、
    　前記遺伝子を含む固形被検試料を、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および前記遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して、前記遺伝子を増幅する工程と、
    　前記増幅された遺伝子から、当該遺伝子の遺伝子型を判定する工程とを含む、遺伝子型を判定する方法。
  2. 　前記アルコール感受性関連遺伝子が、アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂの遺伝子、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子およびチトクロームＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子である、請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 　前記固形試験試料が血液を乾燥させたものである、請求の範囲第１項に記載の方法。
  4. 　前記固形試験試料が毛根である、請求の範囲第１項に記載の方法。
  5. 　前記固形試験試料が唾液を乾燥させたものである、請求の範囲第１項に記載の方法。
  6. 　アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂの遺伝子、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子およびチトクロームＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子から選ばれる少なくともいずれか２つを同時に増幅し、同時に遺伝子型を判定する、請求の範囲第２項に記載の方法。
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