WO2011034199A1 - グリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素 - Google Patents
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Definitions
- Non-Patent Document 5 For GPAT from Mortierella ramanniana, an endoplasmic reticulum type GPAT has been isolated and shown to use oleic acid (18: 1) as an acyl donor with 5.4 times higher selectivity than palmitic acid (16: 0) (Non-Patent Document 5). Regarding GPAT derived from Mortierella alpina (hereinafter sometimes referred to as “M. alpina”), it has been reported that the microsomal fraction has glycerol-3-phosphate acyltransferase activity (non-patented). Reference 6).
- Protein of the present invention provides the following proteins.
- One or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 include an amino acid sequence that is deleted, substituted, inserted, and / or added, and has glycerol-3-phosphate acyltransferase activity protein.
- the cosmetic composition of the present invention may further contain other fats and oils and / or dyes, fragrances, preservatives, surfactants, pigments, antioxidants and the like as necessary. These blending ratios can be appropriately determined by those skilled in the art according to the purpose (for example, fats and oils in the composition are 1 to 99.99% by weight, preferably 5 to 99.99% by weight, more preferably 10 to 99.95). % May be contained).
- the pharmaceutical composition of the present invention may further contain other pharmaceutically active ingredients (for example, anti-inflammatory ingredients) or auxiliary ingredients (for example, lubricating ingredients, carrier ingredients) as necessary.
- MaGPAT1-D and MaGPAT3-D strains were each applied to a YPD agar medium and cultured at 30 ° C. for 2 days.
- the grown cells were spread on a spore-forming agar medium (0.5% potassium acetate, 2% agar) and cultured at 25 ° C. for 4 days.
- After scraping an appropriate amount of the obtained microbial cells suspended in 100 ⁇ l of zymolyase solution (0.125 mg / ml zymolyase 100T, 1M sorbitol, 40 mM potassium phosphate buffer (pH 6.8)), and incubated at room temperature for 30 minutes.
- uracil non-requiring and leucine-requiring strain uracil non-requiring and leucine-requiring strain
- uracil-requiring and leucine-requiring strain is approximately 1: 1. It was 1. Moreover, a uracil-requiring and leucine-unrequiring strain was not obtained.
- uracil-requiring and leucine-requiring strains were amplified by PCR in (1) and not amplified in (2), indicating that these strains were SCT1. Moreover, since amplification was not seen in (3) or (4), it was shown that MaGPAT1 or MaGPAT3 derived from M. alpina was not inserted.
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Abstract
Description
[1] 以下の(a)~(e)よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド:
(a)配列番号1又は4の塩基配列を含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号2のアミノ酸配列において、1~100個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2のアミノ酸配列に対して、85%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;及び
(e)配列番号1又は4の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、グリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[2] 以下の(f)又は(g)のいずれかに記載の前記[1]に記載のポリヌクレオチド:
(f)配列番号2のアミノ酸配列において1~10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;及び
(g)配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[3] 配列番号1又は4の塩基配列を含有する、前記[1]に記載のポリヌクレオチド。
[4] 配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、前記[1]に記載のポリヌクレオチド。
[5] DNAである、前記[1]~[4]のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
[6] 前記[1]~[5]のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
[7] 前記[1]~[5]のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
[8] 前記[1]~[5]のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
[9] 前記[7]に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
[10] 前記形質転換体が脂質生産菌である、前記[8]又は[9]に記載の形質転換体。
[11] 前記脂質生産菌が、モルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)である、前記[10]に記載の形質転換体。
[12] 前記[8]~[11]のいずれかに記載の形質転換体の培養物から、脂質又は脂肪酸組成物を採取することを特徴とする、脂質又は脂肪酸組成物の製造方法。
[13] 前記[12]に記載の製造方法により採取された脂質又は脂肪酸組成物を含有する食品、医薬品、化粧品又は石鹸。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2009年9月18日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願(特願2009-217646号)の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
まず、本発明は、以下の(a)~(e)よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチドを提供する。
(a)配列番号1又は4の塩基配列を含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号2のアミノ酸配列において、1~100個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2のアミノ酸配列に対して、85%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;及び
(e)配列番号1又は4の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、グリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号1又は4の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号2のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"及び"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
本発明は、次に示すタンパク質を提供する。
(i)上記(a)~(e)のいずれかのポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
(ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(iii)配列番号2のアミノ酸配列における1若しくは複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質。
(iv)配列番号2のアミノ酸配列に対して85%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン;B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸;C群:アスパラギン、グルタミン;D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸;E群:プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン;F群:セリン、スレオニン、ホモセリン;G群:フェニルアラニン、チロシン。
本発明はまた、別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを提供する。
本発明のベクターは、通常、(i)宿主細胞内で転写可能なプロモーター;(ii)該プロモーターに結合した、上記(a)~(g)のいずれかに記載のポリヌクレオチド;及び
(iii)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。このように構築されるベクターは、宿主細胞に導入される。本発明において使用される適切な宿主細胞の例としては、脂質生産菌、酵母等が挙げられる。
脂質生産菌に導入する際に用いるベクターとしては、例えば、pDura5(Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 419-425, (2004))が利用可能であるが、これに限定されない。
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、栄養要求性マーカー(ura5、niaD)、薬剤耐性マーカー(hygromycine、ゼオシン)、ジェネチシン耐性遺伝子(G418r)、銅耐性遺伝子(CUP1)(Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984)、セルレニン耐性遺伝子(fas2m, PDR4)(それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et et al., gene, 101, 149, 1991)等が利用可能である。
本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換脂質生産菌又は酵母を用いる脂質又は脂肪酸組成物の製造方法を提供する。
本明細書中、「脂質」とは、脂肪酸とアルコールとがエステル結合した化合物(例えば、グリセリド)又はその類似体(例えば、コレステロールエステル)等を含む単純脂質、単純脂質の一部にさらにリン酸、アミノ酸、糖等が結合した複合脂質、及び脂質の加水分解物で水に溶けない誘導脂質をいうものとする。
本明細書中、「油脂」とは、グリセロールと脂肪酸のエステル(グリセリド)のことをいう。
本明細書中、「脂肪酸」とは、一般式RCOOH(Rはアルキル基)で表される脂肪族モノカルボン酸(カルボキシル基を一個有し、炭素原子が鎖状に連結したカルボン酸)のことをいう。脂肪酸には、炭化水素鎖中に二重結合を有さない飽和脂肪酸と、二重結合を含む不飽和脂肪酸とが含まれる。
本発明の製造方法によって得られた脂質又は脂肪酸組成物は、常法に従って、例えば、油脂を含む食品、医薬品、工業原料(化粧料、石鹸等の原料)の製造等の用途に使用することができる。
栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等を含む。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用途食品と同義である。幼児用食品とは、約6歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。乳児用調製乳とは、約1歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約6ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。
さらに、当該遺伝子の発現量を指標にして、脂肪酸生産を効率よく行うための培養条件の検討、培養管理、等にも利用できる。
M.alpina 1S-4株を100 mlのGY2:1培地(2%グルコース、1%酵母エキス pH6.0)に植菌し、28℃で2日間振とう培養した。濾過により菌体を集菌し、DNeasy(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを調製した。
上記ゲノムDNAの塩基配列を、 Roche 454 Genome Sequencer FLX Standard を用いて決定した。その際、フラグメントライブラリーの塩基配列決定を2ラン分、メイトペアライブラリーの塩基配列決定を3ラン分行った。得られた塩基配列をアッセンブリすることにより、300個のSuper Contigを得た。
M.alpina 1S-4株を4 mlの培地(2%グルコース、1%酵母エキス、pH6.0)に植菌し、4日間28℃で培養した。菌体をろ過により回収し、RNeasy plant kit(QIAGEN)を用いてRNAを抽出した。SuperScript First Strand System for RT-PCR(Invitrogen)を用いてcDNAを合成した。
MaGPAT1(ATCC#16266)のアミノ酸配列をM.alpina 1S-4株のゲノム塩基配列に対し、tblastn検索した結果、配列番号4、配列番号5に示す配列を含むSuper contigがヒットした。配列番号5は、M.alpina 1S-4株由来のGPAT1(以下、本明細書ではMaGPAT1と記載する)のゲノム配列であると考えられた。一方、配列番号4は、開始コドン、終止コドンの出現やMaGPAT1との比較から、新たなGPATホモログをコードする配列であると考えられた。更に、配列番号4の1-3番目の残基がこのホモログの開始コドンであり、そして3278-3280番目の残基が終止コドンであると推定された。この遺伝子をMaGPAT3と命名した。
MaGPAT3遺伝子のCDSをクローン化するために、以下のプライマーを作製した。
Eco-MaGPAT3-F:5’-GAATTCATGGGTCTCCAGATCTATGACTTCGTCTC-3’(配列番号6)
Sal-MaGPAT3-R:5’-GTCGACTTATGCCTCCTTAGACTTGACTGCATCC-3’(配列番号7)
上記のcDNAを鋳型として、プライマーEco-MaGPAT3-FとプライマーSal-MaGPAT3-Rを用いて、KOD-Plus(TOYOBO)によりPCR増幅を行ったところ、約2.2kbのDNA断片が増幅された。これをZero Blunt TOPO PCRクローニングキット(Invitrogen)を用いてクローン化し、得られたプラスミドをpCR-MAGPAT3とした。このプラスミドのインサートの配列、すなわち、MaGPAT3遺伝子のCDS配列を配列番号3に示す。さらに、MaGPAT3遺伝子のORF配列を配列番号1に示す。
MaGPAT3遺伝子のゲノム配列(配列番号4)とCDS配列(配列番号3)を比較したところ、本遺伝子のゲノム配列は、エクソン7つ、イントロン6つからなり、753個のアミノ酸残基からなるタンパク質をコードしていると推定される(図1及び図2)。MaGPAT3と、M.alpina由来の公知のGPATホモログの配列を比較した。MaGPAT3のCDS配列は、GPAT1(ATCC#16266)と73.7%、GPAT1(1S-4)と73.2%の同一性を示した。また、MaGPAT3タンパク質のアミノ酸配列は、GPAT1(ATCC#16266)と82.9%、GPAT1(1S-4) と83.7%の同一性を示した(図3)。なお、MaGPAT3タンパク質のアミノ酸配列は、GPAT2(1S-4)のアミノ酸配列とは、14.4%の同一性を示した。
[実施例2]酵母S.cerevisiae(Δsct1、Δgpt2)の相補実験
酵母S.cerevisiaeでは、GPAT活性を担う遺伝子としてSCT1とGPT2が知られており、これらを同時に欠失させると致死であることが知られている。M.alpina由来のMaGPAT1、MaGPAT3にコードされるタンパク質がGPAT活性を有するかどうかを確認するため、Δsct1、Δgpt2の相補実験をおこなった。表1に、本実験で作製した株の遺伝子型をまとめた。
yeast knock out strain collection(Open Biosystems)のΔgpt2ホモ接合2倍体酵母(カタログNo.YSC1021-663938)のSCT1遺伝子を以下の方法で破壊した。最初に、S.cerevisiae S288C株の菌体から、Genとるくん(酵母用)(TAKARA BIO)を用いてDNAを抽出した。これを鋳型として、プライマーXba1-Des-SCT1-F:5’-TCTAGAATGCCTGCACCAAAACTCAC-3(配列番号8)とプライマーXba1-Des-SCT1-R:5’-TCTAGACCACAAGGTGATCAGGAAGA-3’(配列番号9)を用いて、KOD-Plus(TOYOBO)によってSCT1遺伝子の部分配列をPCR増幅した。増幅された約1.3kbpのDNA断片を、Zero Blunt TOPO PCRクローニングキット(Invitrogen)を用いてクローン化し、得られたプラスミドをpCR-SCT1Pとした。続いて、プラスミドYEp13を制限酵素SalI及びXhoIで消化して得られたLEU2遺伝子のCDSを含む約2.2kbpのDNA断片と、プラスミドpCR-SCT1PをSalIで消化して得られた約4.4kbpのDNA断片を、ligation high(TOYOBO)を用いて連結し、SCT1遺伝子に対してLEU2遺伝子が逆方向に挿入されたプラスミドを作製し、このプラスミドをpCR-Δsct1:LEU2とした。pCR-Δsct1:LEU2を制限酵素XbaIで消化し、上記Δgpt2ホモ接合2倍体酵母を酢酸リチウム法により形質転換して、SD-Leu(1Lあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)6.7g、グルコース20g、アミノ酸パウダー(アデニン硫酸塩1.25g、アルギニン0.6g、アスパラギン酸3g、グルタミン酸3g、ヒスチジン0.6g、リジン0.9g、メチオニン0.6g、フェニルアラニン1.5g、セリン11.25g、チロシン0.9g、バリン4.5g、スレオニン6g、トリプトファン1.2g、ウラシル0.6gを混合したもの)1.3g))寒天培地(2%アガー)で生育できるものを形質転換体として選抜した。得られた形質転換株の菌体から上述の方法でDNAを抽出した。(1)プライマーSCT1outORF-F:5’-AGTGTAGGAAGCCCGGAATT-3(配列番号10)及びプライマーSCT1inORF-R:5’-GCGTAGATCCAACAGACTAC-3’(配列番号11)の組み合わせ(0.5kbp)、及び (2)プライマーSCT1outORF-F1とプライマーLEU2 in ORF-F: 5’-TTGCCTCTTCCAAGAGCACA-3’(配列番号12)の組み合わせ(1.2kbp)を用いてPCR増幅を行うことで遺伝子型、すなわち、SCT1/Δsct1:LEU2であることを確認し、この遺伝子型を有する形質転換酵母細胞をGP-1株とした。
M.alpinaのGPAT遺伝子であるMaGPAT1及びMaGPAT3を、酵母の染色体上に挿入するために、プラスミドpUC-URA3-MAGPAT1と、プラスミドpUC-URA3-MAGPAT3を以下のように作製した。
プラスミドpUC18マルチクローニングサイトをHindIIIサイトのみを含むようにに改変し、そのHindIIIサイトに、pURA34(WO0131000)をHindIIIで消化して得られた約1.2kbpのDNA断片を挿入し、プラスミドpUC-URA3を作製した。pYE-MAGPAT1(WO2008156026)を制限酵素HindIIIで消化した後に、Blunting Kit(TAKARA BIO)を用いて末端部分を平滑化して得られた約3.5kbpのDNA断片を、プラスミドpUC-URA3のSmaIサイトに挿入し、GPAT1遺伝子とURA3遺伝子が同じ向きに挿入されたプラスミドを作製し、このプラスミドをpUC-URA3-MAGPAT1とした。
プラスミドpCR-MAGPAT3を制限酵素EcoRIとSalIで消化して得られた約2.3kbpのDNA断片を、酵母発現用ベクターpYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)のEcoRI、SalIサイトに挿入し、プラスミドpYE-MAGPAT3を構築した。続いて、プラスミドpYE-MAGPAT3を制限酵素HindIIIで消化した後に、Blunting Kit(TAKARA BIO)を用いて末端部分を平滑化して得られた約3.6kbpのDNA断片を、プラスミドpUC-URA3のSmaIサイトに挿入し、GPAT3遺伝子とURA3遺伝子が同じ向きに挿入されたプラスミドを作製し、このプラスミドをpUC-URA3-MAGPAT3とした。
MaGPAT1-D株とMaGPAT3-D株をそれぞれYPD寒天培地に塗布し、30℃で2日間培養した。生育した菌体を、胞子形成用寒天培地(0.5%酢酸カリウム、2%アガー)に塗布し、25℃で4日間培養した。得られた菌体を適当量掻きとって、100μlのザイモリアーゼ溶液(0.125mg/ml ザイモリアーゼ100T、1M ソルビトール、40mM リン酸カリウムバッファー(pH6.8))に懸濁し、室温で30分間インキュベートした後に、ザイモリアーゼ溶液及び菌体を含むチューブを氷中に移した。顕微鏡下で、子嚢胞子が形成されていることを確認した後、YPD寒天培地上でマイクロマニピュレーションにより4個の子嚢胞子を分離し、30℃で2日間インキュベートし、それぞれの胞子に由来するコロニーを得た。得られた胞子クローンを、SD-Ura寒天培地、SD-Leu寒天培地にレプリカし、30℃で3日間インキュベートして、ウラシル要求性とロイシン要求性を調べた。各プレートでの生育の可否とクローン数を表2に示す。
[実施例3]酵母の脂肪酸分析
上述のようにして得られた株、GP-12(#1、2、3)、MaGPAT1-11(#3b、#4a、#8a)、MaGPAT3-11(#2d、#19a、#32a)、GP-22(#1、#2、#3)、MaGPAT1-21(#1a、#2d、#13a)、MaGPAT3-21(#10a、#20c、#26b)を以下のように培養した。
SD-Ura、Leu液体培地10mlに各株を1白金耳植菌し、30℃で1日間振とう培養した。得られた培養液100μlを、SD-Ura、Leu液体培地10mlに植菌し、30℃で2日間振とう培養した。酵母の培養液を遠心分離することにより、菌体を回収した。菌体を10mlの滅菌水で洗浄し、再度遠心分離を行って菌体を回収し、凍結乾燥した。塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後、ヘキサンで抽出して、ヘキサンを留去して、ガスクロマトグラフィーにより分析を行った。脂肪酸組成分析の結果を表3~8に示す。
[実施例4]酵母の脂質分析
脂肪酸生産量に差のあったmet15,lys2酵母であるGP-12(#1、2、3)、MaGPAT1-11(#3b、#4a、#8a)、MaGPAT3-11(#2d、#19a、#32a)で、各脂質の量や脂肪酸組成を調べた。
SD-Ura、Leu液体培地 10mlに各株を1白金耳植菌し、30℃で1日間振とう培養した。得られた培養液1mlを、SD-Ura、Leu液体培地 10 mlに、各株2本ずつ植菌し、30℃で1日間振とう培養した。酵母の培養液を遠心分離することにより、菌体を回収した。10 mlの滅菌水で洗浄し、遠心分離により再び菌体を回収し、凍結乾燥した。各株1本ずつを塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後、ヘキサンで抽出して、ヘキサンを留去して、ガスクロマトグラフィーにより分析を行った。
また、各株1本ずつから以下の通り、脂質を抽出した。すなわち、1 mlのクロロホルム:メタノール(2:1)とガラスビーズを加え、ビーズビーターにて菌体を破砕したあと、遠心分離して上清を回収した。残った菌体にさらに1 mlのクロロホルム:メタノール(2:1)を加え、同様にして、上清を回収することを繰り返し、総量4 mlのクロロホルム:メタノール(2:1)で脂質を回収した。スピードバックを使って、溶媒を留去し、残渣を少量のクロロホルムに溶かした。シリカゲル60プレート(Merck)、展開溶媒ヘキサン:ジエチルエーテル:酢酸70:30:1の条件で薄層クロマトグラフィーを行い、脂質を分画した。プリムリン溶液を噴霧し、紫外線を照射することにより脂質を検出した。トリグリセリド画分とリン脂質画分をそれぞれかきとって試験管に集め、塩酸メタノール法により脂肪酸をメチルエステルに誘導し、ガスクロマトグラフィーにより、脂肪酸分析を行った。
結果を以下の表に示す。
リン脂質の脂肪酸量と脂肪酸組成は、GPAT遺伝子により、影響を受けなかった。一方、トリグリセリドの量は、GPAT遺伝子としてSCT1のみを持つGP-12株と比べて、モルティエレラ アルピナ由来のGPAT遺伝子を持つMaGPAT1-11株で約1.6倍、MaGPAT3-11株で約2倍であった。
総脂肪酸の生産量が、MaGPAT1-11株やMaGPAT3-11株で増加しているのは、主に、トリグリセリドの生産量が増加しているためであることが判明した。また、トリグリセリド中の脂肪酸組成を比較すると、MaGPAT3-11株では、GP-12株と比べて、飽和脂肪酸の比率が高まっていた。
MaGPAT3遺伝子を発現させることで、特にトリグリセリドの生産性を向上させることができることが分かった。
Claims (13)
- 以下の(a)~(e)よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド:
(a)配列番号1又は4の塩基配列を含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号2のアミノ酸配列において、1~100個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2のアミノ酸配列に対して、85%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;及び
(e)配列番号1又は4の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、グリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 以下の(f)又は(g)のいずれかに記載の請求項1に記載のポリヌクレオチド:
(f)配列番号2のアミノ酸配列において1~10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;及び
(g)配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 配列番号1又は4の塩基配列を含有する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- DNAである、請求項1~4のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1~5のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
- 請求項1~5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
- 請求項1~5のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
- 請求項7に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
- 前記形質転換体が脂質生産菌である、請求項8又は9に記載の形質転換体。
- 前記脂質生産菌が、モルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)である、請求項10に記載の形質転換体。
- 請求項8~11のいずれかに記載の形質転換体の培養物から、脂質又は脂肪酸組成物を採取することを特徴とする、脂質又は脂肪酸組成物の製造方法。
- 請求項12に記載の製造方法により採取された脂質又は脂肪酸組成物を含有する食品、医薬品、化粧品又は石鹸。
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