WO2011034185A1 - 希土類イオンの検出方法及び希土類イオン検出用キット - Google Patents

希土類イオンの検出方法及び希土類イオン検出用キット Download PDF

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WO2011034185A1
WO2011034185A1 PCT/JP2010/066255 JP2010066255W WO2011034185A1 WO 2011034185 A1 WO2011034185 A1 WO 2011034185A1 JP 2010066255 W JP2010066255 W JP 2010066255W WO 2011034185 A1 WO2011034185 A1 WO 2011034185A1
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rare earth
dna
pcr reaction
earth ions
dna fragment
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PCT/JP2010/066255
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智謙 河野
憲 陽川
一也 上江洲
貴志 角野
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財団法人 北九州産業学術推進機構
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the present invention relates to a rare earth ion detection method and a rare earth ion detection kit, and more particularly to a rare earth ion detection method and a rare earth ion detection kit using a PCR (Polymerase® Chain Reaction) method.
  • PCR Polymerase® Chain Reaction
  • ICP-MS inductively coupled plasma mass spectrometer
  • a detection device for detecting low-concentration rare earth ions with high sensitivity see Patent Documents 1 and 2.
  • ICP-MS is a measuring device that can identify and quantify elements by introducing atoms ionized by inductively coupled plasma (ICP) into a mass spectrometer. ICP-MS can be applied to the detection of a wide variety of elements.
  • ICP-MS since a mass spectrometer is used, it is possible to perform an extremely sensitive analysis at the ppt level.
  • ICP-MS is not easy to introduce because the equipment is very expensive.
  • an object of the present invention is to provide a method capable of detecting rare earth ions with high sensitivity and low cost, and a kit therefor.
  • a method for detecting rare earth ions in a sample the step of contacting the sample with template DNA, and the step of contacting the sample with template DNA.
  • a method comprising a step of performing a PCR reaction in the presence of a primer using the template DNA and a step of detecting a DNA fragment amplified by the PCR reaction is provided.
  • the rare earth ions are, for example, at least one selected from lanthanoids having atomic numbers 57 to 71 (except Pm having 61), Sc having atomic numbers 21 and Y having atomic numbers 39.
  • the step of detecting the DNA fragment amplified by the PCR reaction it is detected that the same DNA fragment that is detected when the same PCR reaction is performed in the absence of rare earth ions is reduced or eliminated. Or detecting a DNA fragment having a size different from that detected when the same PCR reaction is performed in the absence of rare earth ions, whereby the presence or concentration of rare earth ions in the sample is detected. To decide.
  • the step of detecting the DNA fragment amplified by the PCR reaction is performed using real-time PCR.
  • the step of detecting the DNA fragment amplified by the PCR reaction comprises separating the PCR product using at least one of agarose gel electrophoresis and acrylamide gel electrophoresis, and the separated DNA. And detecting a fragment.
  • the step of detecting the DNA fragment amplified by the PCR reaction is performed using a probe introduction reaction in which the amplified DNA fragment generates at least one of luminescence, fluorescence, coloring, and radioactivity.
  • the probe introduction reaction is performed using at least one of an intercalator reagent and a cyanine fluorescent reagent.
  • the template DNA is a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the primer comprises a primer pair which is a combination of a polynucleotide primer containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a polynucleotide primer containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • a DNA fragment having a base pair size of 100 bp or less determined by at least one of agarose gel electrophoresis and acrylamide gel electrophoresis is detected. To do.
  • the sample is collected from a water and sewage system, a river, a lake, the sea, or soil.
  • a rare earth ion detection kit for use in the method according to the first aspect, comprising a template DNA, a primer, and a nucleic acid amplification reagent. To do.
  • the nucleic acid amplification reagent comprises a DNA polymerase, a dNTPs mixture, and a nucleic acid amplification reaction buffer.
  • a method capable of detecting rare earth ions with high sensitivity and low cost and a kit for the method can be provided.
  • FIG. 1 shows an agarose gel electrophoresis gel photograph of a PCR product obtained by PCR using a template DNA contacted with terbium (Tb) or europium (Eu). Incidentally, the photograph is subjected to black-and-white reversal processing to clarify the band.
  • FIG. 2 shows an agarose gel electrophoresis gel photograph of a PCR product obtained by PCR using a template DNA contacted with terbium (Tb) or europium (Eu). Incidentally, the photograph is subjected to black-and-white reversal processing to clarify the band.
  • FIG. 3 shows photographs of agarose gel electrophoresis gels of PCR products by PCR reaction using template DNA contacted with various rare earth ions.
  • FIG. 4 (a) shows an agarose gel electrophoresis gel photograph in which the length of time for which the rare earth ions are brought into contact with the template DNA is zero or one hour.
  • FIG. 4 (b) shows an agarose gel electrophoresis gel photograph when the length of time in which the rare earth ions are contacted with the template DNA is 2 hours or 3 hours. Note that these photographs have been subjected to black and white reversal processing to clarify the band.
  • FIG. 4 (b) shows an agarose gel electrophoresis gel photograph in which the length of time for which the rare earth ions are brought into contact with the template DNA is zero or one hour.
  • FIG. 4 (b) shows an agarose gel electrophoresis gel photograph when the length of time in which the rare earth ions are contacted with the template DNA is 2 hours or 3 hours. Note that these photographs have been subjected to black and white reversal processing to clarify the band.
  • FIG. 4 (b) shows an agarose gel electrophoresis gel
  • FIG. 5 (a) shows an agarose gel electrophoresis gel photograph in the case where ultrapure water or 30 mM potassium phosphate buffer is used when the rare earth ions are brought into contact with the template DNA.
  • FIG. 5 (b) shows an agarose gel electrophoresis gel photograph in the case of using 60 mM potassium phosphate buffer or 120 mM potassium phosphate buffer when contacting rare earth ions with template DNA. Note that these photographs have been subjected to black and white reversal processing to clarify the band.
  • FIG. 6A shows an agarose gel electrophoresis gel photograph when the rare earth ion is La or Eu.
  • FIG. 6B shows an agarose gel electrophoresis gel photograph when the rare earth ion is Y or Tm.
  • FIG. 7A shows monitoring data of fluorescence intensity with respect to the number of PCR cycles.
  • FIG. 7B is a graph showing the relationship between La concentration and fluorescence intensity when the number of PCR cycles is 12, 14, and 16.
  • FIG. 8A is a table showing the composition of main ions in each sample solution.
  • FIG.8 (b) shows the agarose gel electrophoresis gel photograph at the time of using the ultrapure water, tap water, or the water of the upstream area of a river.
  • FIG. 8 (c) shows an agarose gel electrophoresis gel photograph when water A or B in the middle stream of the river or water A or B in the downstream of the river is used. In these photographs, the image is subjected to black and white reversal processing to clarify the band.
  • the perturbation of the PCR reaction detects the same DNA fragment being reduced or disappeared when the same PCR reaction is performed in the absence of rare earth ions, or the same in the absence of rare earth ions. This can be confirmed by detecting a DNA fragment having a size different from that of the DNA fragment detected when the PCR reaction is performed. In the method of this embodiment, the presence or absence of rare earth ions in the sample is detected by confirming the disturbance of the PCR reaction in this way.
  • the PCR product generated by the PCR reaction is subjected to a probe introduction reaction in which the amplified DNA fragment generates at least one of luminescence, fluorescence, coloring, and radioactivity, thereby enabling high-sensitivity detection.
  • the step of bringing the sample into contact with the template DNA is performed in an aqueous solution (buffer solvent) in order to cause various catalytic reactions to the DNA by rare earth ions.
  • a step may be performed before the PCR reaction, may be performed during the PCR reaction, or may be performed both before the PCR reaction and during the PCR reaction. Preferably, it is performed only during the PCR reaction from the viewpoint of shortening the time required for the detection process.
  • the step of contacting the sample with the template DNA is performed before the PCR reaction, the step of contacting is preferably performed at a temperature of 25 to 45 ° C., more preferably 35 to 40 ° C., for a period of several minutes to several hours. It is preferably carried out under a pH of 5 to 9, more preferably 6 to 8. In this case, from the viewpoint of improving detection sensitivity, it is preferable to use a known buffer solution such as a phosphate buffer solution.
  • the rare earth ions (rare earth elements) detected by the method of the present embodiment are, for example, lanthanoids having atomic numbers 57 to 71 (except Pm (promethium) having 61 atoms), Sc (scandium) having atomic numbers 21. And Y (yttrium) having an atomic number of 39.
  • lanthanoids other than Pm are La (lanthanum), Ce (cerium), Pr (praseodymium), Nd (neodymium), Sm (samarium), Eu (europium), Gd (gadolinium), Tb (terbium).
  • Dy dysprosium), Ho (holmium), Er (erbium), Tm (thulium), Yb (ytterbium), and Lu (lutetium).
  • the type of template DNA used is not particularly limited, and naturally-derived DNA may be used, or artificially synthesized DNA may be used.
  • the template DNA is preferably a DNA in which rare earth ions can cause various catalytic reactions such as hydrolysis and recombination reactions using DNA as a substrate.
  • An example of such DNA is a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a 501 bp double-stranded DNA derived from the pBR322 vector.
  • a pair of synthetic polynucleotides corresponding to the base sequences at both ends of the amplification part of the template DNA is used.
  • a polynucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is used as the template DNA, it is a combination of a polynucleotide primer containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a polynucleotide primer containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Primer pairs can be used.
  • Such a primer pair is a primer complementary to both ends of each of the polynucleotides containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the primer corresponds to a part of the template DNA sequence.
  • the primer amplifies the template DNA in the PCR reaction in the absence of rare earth ions.
  • the primer sequence can be confirmed at least partially in the DNA fragment to be amplified, or as a repetitive or inverted sequence derived by recombination.
  • rare earth ions disrupts DNA amplification by PCR reaction (for example, through degradation of DNA or recombination of DNA), and as a result, a primer is formed in a portion that forms a weak bond of DNA newly generated by degradation or recombination. It is considered that a fragment of a certain length is amplified by binding.
  • the presence or absence of rare earth ions can be detected by detecting such low molecular weight amplified DNA fragments.
  • the case where the PCR reaction is performed in the presence of rare earth ions includes the case where the rare earth ions are previously contacted with the template DNA before the PCR reaction. This is because even in such a case, the rare earth ions act on the template DNA and thus have some influence on the PCR reaction.
  • the step of contacting the template DNA with an unknown sample containing rare earth ions is performed in a buffer solution such as phosphate buffer before the PCR reaction, the same PCR is performed in the absence of rare earth ions. It is possible to improve the detection sensitivity of a low molecular weight amplified DNA fragment having a size (100 bp or less) different from the DNA fragment (about 500 bp) generated when the reaction is performed.
  • Amplification of genomic DNA using PCR can be performed by appropriately adopting known methods.
  • the PCR reaction is performed by repeating a DNA replication cycle consisting of dissociation of the template DNA, annealing of the primer and the template DNA, and synthesis of a complementary strand by a DNA polymerase starting from the primer, according to a conventional method.
  • the PCR reaction solution is, for example, a template DNA, a primer pair consisting of a partial sequence of the template DNA, a heat-resistant DNA polymerase (for example, Tag polymerase), dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), and a reaction buffer.
  • a heat-resistant DNA polymerase for example, Tag polymerase
  • dNTPs dATP, dTTP, dCTP, dGTP
  • the template DNA dissociation step is preferably performed at 94 ° C. for several seconds to several minutes.
  • the annealing step between the primer and the template DNA is preferably performed at 56 to 64 ° C. for several seconds to several minutes.
  • the complementary strand synthesis step using DNA polymerase is preferably performed at 60 to 72 ° C. for several seconds to several minutes.
  • the number of repetitions of the DNA replication cycle is not particularly limited, but is preferably 15 to 60 times, more preferably 20 to 30 times.
  • the DNA replication cycle can be performed using a commercially available PCR apparatus.
  • the target PCR product (amplified genomic DNA) can be obtained by repeating the replication cycle. PCR products are detected by a DNA separation step and a DNA detection step.
  • the DNA separation step can be performed using, for example, agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, or capillary electrophoresis.
  • the DNA detection step performed after the DNA separation step is performed, for example, using a probe introduction reaction in which the amplified DNA fragment generates at least one of luminescence, fluorescence, coloring, and radioactivity.
  • the probe introduction reaction can be performed using, for example, an intercalator reagent composed of a phenanthridine dye such as ethidium bromide. Ethidium bromide binds to nucleic acid and emits fluorescence proportional to the amount of DNA when irradiated with ultraviolet light.
  • the probe introduction reaction may be performed using a primer synthesized using a label molecule such as a fluorescent molecule, a dye molecule, a luminescent molecule, and a radioisotope, or a primer to which these label molecules are added.
  • a primer molecule that is fluorescently labeled in advance using a cyanine fluorescent reagent such as Cy3 or Cy5 can be used.
  • Whether or not rare earth ions are contained in the measurement sample is determined based on a fraction pattern obtained through the steps of separation and detection of PCR products generated by the replication cycle. Comparative analysis of the PCR product fractionation pattern is performed based on, for example, the presence or absence of amplified genomic DNA, molecular weight (number of bases), amount, and base sequence. More specifically, the PCR product can be electrophoresed and the presence / absence of the band, light / dark, moving distance, and base sequence can be compared with those of the control.
  • the detection of the DNA fragment amplified by the PCR reaction may be performed using real-time PCR.
  • Real-time PCR is one of quantitative PCR, and by measuring amplification by PCR over time, not only detection of DNA serving as a template but also quantification of template DNA can be performed based on the amplification rate.
  • Rare earth ions perturb the PCR reaction by catalysis against DNA and reduce or eliminate the same DNA fragments that are detected when the same PCR reaction is performed in the absence of rare earth ions, or When the same PCR reaction is performed in the absence, a DNA fragment having a different size from the DNA fragment detected is generated. It has been confirmed that the amount of decrease or disappearance of such DNA fragments depends on the concentration of rare earth ions and increases as the concentration of rare earth ions increases. Similarly, it has been confirmed that the amount of DNA fragments having different sizes depends on the concentration of rare earth ions and increases as the concentration of rare earth ions increases. Therefore, when the DNA fragment amplified by the PCR reaction is detected using real-time PCR, the concentration of rare earth ions in the sample can be calculated from the detected amount of the DNA fragment.
  • the real-time PCR method can be performed by a known method.
  • a commercially available real-time PCR apparatus in which a thermal cycler and a spectrofluorometer are integrated may be used.
  • an intercalator method using an intercalator reagent that emits fluorescence by binding to double-stranded DNA, or a fluorescently labeled probe in which a fluorescent dye is bound to an oligonucleotide specific to the DNA sequence to be amplified It can be performed by a method using Examples of intercalator reagents that can be used in the intercalator method include SYBR Green I.
  • rare earth ions (rare earth metals) can be detected by the PCR reaction step and the DNA detection step. Therefore, compared with the method using ICP-MS, rare earth ions can be detected at a low cost and in a short time without using expensive equipment.
  • Detection of the DNA fragment amplified by the PCR reaction is performed using a probe introduction reaction in which the amplified DNA fragment generates at least one of luminescence, fluorescence, coloring, and radioactivity. In this case, it is possible to detect the rare earth ions with higher sensitivity.
  • rare earth metals such as lanthanoids have characteristic properties, industrial and industrial utility values have been found. It has also been reported that rare earth metals have physiological activity at the biomolecule level. Therefore, the rare earth ion detection method of the present embodiment is useful in each of these fields.
  • the rare earth ion detection method of the above embodiment may be performed using, for example, a rare earth ion detection kit comprising a template DNA, a primer, and a nucleic acid amplification reagent.
  • the reagent for nucleic acid amplification includes, for example, a DNA polymerase, a dNTPs mixture, and a nucleic acid amplification reaction buffer. In this case, it is possible to easily detect rare earth ions.
  • the PCR product may be electrophoresed, and the density of the detection band may be compared with a control to determine not only the presence or absence of rare earth ions in the sample, but also quantify or qualify the rare earth ions in the sample.
  • the PCR reaction may be performed using an ultra-high speed or high amplification PCR apparatus.
  • an ultrahigh-speed or high-amplification PCR apparatus a disk enclosing a PCR container is contact-rotated on a hot plate with a fixed temperature. In this case, the time required for detection of rare earth ions can be further shortened.
  • the rare earth ion detection method of the above embodiment may be used for detection of rare earth ions in a sample collected from, for example, water and sewage, rivers, lakes, seas, or soil.
  • the template DNA used in the rare earth ion detection method of the above embodiment may be a DNA consisting only of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a DNA partially containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It may be. Specific examples of the DNA partially including the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 include pBR322 vector (4361 bp).
  • the DNA fragment amplified by the PCR method is a DNA fragment generated by a novel PCR disruption effect due to the catalytic activity of rare earth ions using a nucleic acid as a substrate, such as a nucleic acid cleavage reaction, and is not necessarily a sequence contained in the template DNA. Absent.
  • Tb and Eu affect the DNA and PCR reaction was measured by following the DNA amplified by PCR.
  • DNA consisting of the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1 was used as the template DNA.
  • the DNA of SEQ ID NO: 1 is a 501 bp double-stranded DNA derived from the pBR322 vector.
  • reaction solution 150 ⁇ M template DNA and rare earth ions (Tb, Eu) were added to 30 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) so as to have concentrations of 0.3 mM, 3 mM, and 30 mM, respectively, to prepare a reaction solution. .
  • the reaction was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • a PCR reaction was performed by adding a PCR reaction reagent to the reaction solution after the incubation.
  • a PCR reaction reagent Takara ExTaq (10 ⁇ PCR buffer, dNTP mixture, and ExTaq polymerase) manufactured by Takara Bio Inc. was used.
  • a primer a primer pair consisting of the polynucleotides of SEQ ID NOs: 2 and 3 was used at a concentration of 0.2 to 1 ⁇ M. Others followed the protocol described in the product.
  • PCR is performed using a thermal cycler (Gene
  • a thermal cycler Gene
  • the PCR product was electrophoresed on a 2.0% agarose gel in 0.5 ⁇ TBE buffer, stained with ethidium bromide, and then a band was detected under UV light. The results are shown in FIG.
  • the incubation time after mixing the template DNA and the rare earth ions is 1 hour, and the PCR reaction time by the thermal cycler is about 2.5 hours. Including rare earth ions, it is possible to detect rare earth ions in about 4 hours in total.
  • the band near 500 bp (template DNA) becomes thinner as the rare earth ion concentration increases, suggesting that it is possible to quantify rare earth ions by creating a calibration curve.
  • DNA consisting of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 was used.
  • 15 pM of template DNA and rare earth ions (Tb, Eu) were added to a concentration of 300 pM, 3 nM, and 30 nM, respectively, in 30 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) to prepare a reaction solution.
  • the reaction was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • the band indicated by a circled number 1 is for a control without addition of rare earth ions
  • the band surrounded by a circled number 2 is for a Tb concentration of 300 pM
  • the band indicated by the numeral 3 surrounded by 3 is the one when the concentration of Tb is 3 nM
  • the band indicated by the numeral 4 surrounded by the circle is the one when the concentration of Tb is 30 nM
  • the band is when the Eu concentration is 300 pM
  • the band indicated by the circled number 6 is when the Eu concentration is 3 nM
  • the band indicated by the circled number 7 is when the Eu concentration is 30 nM. Shows when.
  • DNA consisting of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 was used.
  • a reaction solution was prepared by adding 15 pM of template DNA and 30 nM of each rare earth ion shown in FIG. 3 to 30 mM of potassium phosphate buffer (pH 7.0). The reaction was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • a PCR reaction was performed by adding a PCR reaction reagent to the reaction solution after the incubation, and then a band was detected by agarose gel electrophoresis.
  • GeneLadder100 manufactured by Nippon Gene was used as a molecular weight marker. The results are shown in FIG.
  • the non-specific band of 100 bp or less varies in density depending on the type of rare earth ions, and the comparison of the density of such bands suggests the possibility of qualitative rare earth ions.
  • ⁇ Test Example 4 Examination of conditions for contacting rare earth ions with template DNA (part 1)> The influence of the length of time for which rare earth ions were brought into contact with the template DNA was examined.
  • As the template DNA DNA consisting of the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1 was used.
  • 150 pM of template DNA and rare earth ions (La) were added to ultrapure water so that each concentration was zero, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, and 6 ⁇ M, thereby preparing a reaction solution. The reaction was incubated at 37 ° C. for 0 hour, 1 hour, 2 hours or 3 hours.
  • FIG. 4 (a) shows an electrophoresis photograph when the incubation time is zero or 1 hour
  • FIG. 4 (b) shows an electrophoresis photograph when the incubation time is 2 hours or 3 hours.
  • the step of bringing the rare earth ions into contact with the template DNA is preferably performed during the PCR reaction rather than as a pretreatment of the PCR reaction. It was suggested that it is preferable to make it as short as possible.
  • DNA consisting of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 was used.
  • 150 pM of template DNA in ultrapure water, 30 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 60 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), or 120 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), and Rare earth ions (La) were added at concentrations of zero, 0.5 ⁇ M, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, and 5 ⁇ M to prepare reaction solutions. The reaction was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • a PCR reaction was performed by adding a PCR reaction reagent to the reaction solution after the incubation, and then a band was detected by agarose gel electrophoresis.
  • Fig. 5 (a) shows an electrophoretic photograph when ultrapure water or 30 mM potassium phosphate buffer is used in the preparation of the reaction solution, and 60 mM potassium phosphate buffer or 120 mM potassium phosphate buffer is used in the preparation of the reaction solution.
  • FIG. 5B shows an electrophoretic photograph in the case of the above.
  • template DNA DNA consisting of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 was used.
  • template DNA is added to ultrapure water at 150 pM and La, Eu, Y, and Tm rare earth ions so as to have respective concentrations of zero, 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M, and 100 ⁇ M, A reaction solution was prepared. The reaction was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • FIG. 6A shows an electrophoretic photograph when the rare earth ion used is La or Eu
  • FIG. 6B shows an electrophoretic photograph when the rare earth ion used is Y or Tm.
  • the disappearance of the 500 bp band corresponding to the template DNA depends on the rare earth ion concentration. Was confirmed to happen. Therefore, it was confirmed that the presence or absence of rare earth ions could be detected by detecting the disappearance of the template DNA strand, and that the rare earth ions could be quantified by measuring the band density. Moreover, since the density of the band differs depending on the type of rare earth ions, the comparison of the density of the bands suggests the possibility of qualitative properties of the rare earth ions.
  • ⁇ Test Example 7 Detection test of amplified DNA using real-time PCR> The effect of rare earth ions La on the template DNA was measured by detecting amplified DNA using real-time PCR.
  • DNA consisting of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 was used.
  • 150 pM of template DNA and rare earth ions La are added to ultrapure to a concentration of zero, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, and 6 ⁇ M to each PCR reaction.
  • a liquid was prepared.
  • a reagent for real-time PCR iQ SYBR Green Supermix manufactured by Bio-Rad Laboratories was used.
  • a primer pair consisting of the polynucleotides of SEQ ID NOs: 2 and 3 was used at a concentration of 0.2 to 1 ⁇ M. Others followed the protocol described in the product.
  • FIG. 7B shows a graph showing the relationship between the La concentration and the fluorescence intensity when the number of cycles is 12, 14, or 16.
  • DNA consisting of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 was used.
  • the template DNA was added to each of these sample solutions at 150 pM and La at concentrations of 0, 2 ⁇ m, and 6 ⁇ M to prepare reaction solutions. The reaction was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • FIG. 8A shows the composition of main ions in each sample solution excluding ultrapure water.
  • FIG. 8B shows an electrophoretogram when ultrapure water, tap water, or water in the upstream area of the river is used in the preparation of the reaction solution.
  • FIG. 8C shows an electrophoretic photograph in the case of using water A or B in the middle basin of the river or water A or B in the downstream of the river in the preparation of the reaction solution.
  • the rare earth ion detection method of the present invention also suggests the possibility of detecting rare earth ions existing in nature.

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Abstract

　試料中の希土類イオンを検出する本発明の方法は、試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程と、試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程と同時又はその後に、鋳型ＤＮＡを用いてプライマーの存在下でＰＣＲ反応を行う工程と、ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程とからなる。

Description

希土類イオンの検出方法及び希土類イオン検出用キット
　本発明は、希土類イオンの検出方法及び希土類イオン検出用キットに関し、詳しくは、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法を利用した希土類イオンの検出方法及び希土類イオン検出用キットに関する発明である。
　従来より、低濃度の希土類イオンを高感度に検出するための検出装置として、誘導結合プラズマ質量分析装置（ＩＣＰ－ＭＳ）が知られている（特許文献１，２参照）。ＩＣＰ－ＭＳとは、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）によってイオン化された原子を質量分析計に導入することにより、元素の同定及び定量を行うことができる測定装置である。ＩＣＰ－ＭＳは、幅広い種類の元素の検出に適用することができる。また、質量分析計を使用するため、ｐｐｔレベルの超高感度の分析を行うことができる。ところが、ＩＣＰ－ＭＳは、通常の化学分析と異なり、機材が非常に高価なため、導入が容易ではない。
特開平１０－２８０３７８号公報（特許請求の範囲等参照） 特開２００３－２１６１９号公報（請求項２２等参照）
　そこで、本発明の目的とするところは、高感度かつ安価に希土類イオンを検出することができる方法及びそのためのキットを提供することにある。
　上記目的を達成するために、本発明の第１の態様では、試料中の希土類イオンを検出する方法であって、前記試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程と、前記試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程と同時又はその後に、前記鋳型ＤＮＡを用いてプライマーの存在下でＰＣＲ反応を行う工程と、前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程とからなることを特徴とする方法を提供する。
　前記希土類イオンは、例えば、原子番号５７番～７１番のランタノイド（但し、６１番のＰｍを除く）、原子番号２１番のＳｃ、及び原子番号３９番のＹから選ばれる少なくとも一種である。
　好ましくは、前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程では、希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるのと同じＤＮＡ断片が減少若しくは消失するのを検出するか、又は希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるＤＮＡ断片とは異なる大きさのＤＮＡ断片を検出し、それにより、前記試料中の希土類イオンの有無又は濃度を決定する。
　好ましくは、前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程は、リアルタイムＰＣＲを用いて行われる。
　好ましくは、前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程は、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動法及びアクリルアミドゲル電気泳動法の少なくともいずれか一方を用いて分離する工程と、前記分離されたＤＮＡ断片を検出する工程とからなる。
　好ましくは、前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程は、増幅されたＤＮＡ断片が発光、蛍光、着色及び放射性の少なくともいずれか一つを生じるプローブ導入反応を用いて行われる。
　請好ましくは、前記プローブ導入反応は、インターカレータ試薬及びシアニン系蛍光試薬の少なくともいずれか一方を用いて行われる。
　好ましくは、前記鋳型ＤＮＡは、配列番号１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
　好ましくは、前記プライマーは、配列番号２に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドプライマーと配列番号３に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対からなる。
　好ましくは、前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程では、アガロースゲル電気泳動法及びアクリルアミドゲル電気泳動法の少なくともいずれか一方によって求められる塩基対の大きさが１００ｂｐ以下のＤＮＡ断片を検出する。
　好ましくは、前記試料は、上下水道、河川、湖沼、海又は土壌から採取したものである。
　本発明の第２の態様では、上記第１の態様に係る方法に用いられる希土類イオン検出用キットであって、鋳型ＤＮＡ、プライマー、及び核酸増幅用試薬を含んでなる希土類イオン検出用キットを提供する。
　好ましくは、前記核酸増幅用試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ混合液、及び核酸増幅反応バッファを含んでなる。
　本発明によれば、高感度かつ安価に希土類イオンを検出することができる方法及びそのためのキットを提供することができる。
図１は、テルビウム（Ｔｂ）又はユウロピウム（Ｅｕ）に接触させた鋳型ＤＮＡを用いたＰＣＲ反応によるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動ゲル写真を示す。尚、写真はバンドの明瞭化のために白黒反転処理している。 図２は、テルビウム（Ｔｂ）又はユウロピウム（Ｅｕ）に接触させた鋳型ＤＮＡを用いたＰＣＲ反応によるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動ゲル写真を示す。尚、写真はバンドの明瞭化のために白黒反転処理している。 図３は、各種の希土類イオンに接触させた鋳型ＤＮＡを用いたＰＣＲ反応によるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動ゲル写真を示す。尚、写真はバンドの明瞭化のために白黒反転処理している。 図４（ａ）は、鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させる時間の長さがゼロ又は１時間の場合のアガロースゲル電気泳動ゲル写真を示す。図４（ｂ）は、鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させる時間の長さが２時間又は３時間の場合のアガロースゲル電気泳動ゲル写真を示す。尚、これらの写真はバンドの明瞭化のために白黒反転処理している。 図５（ａ）は、鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させるときに超純水又は３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液を使用した場合のアガロースゲル電気泳動ゲル写真を示す。図５（ｂ）は、鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させるときに６０ｍＭリン酸カリウム緩衝液又は１２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液を使用した場合のアガロースゲル電気泳動ゲル写真を示す。尚、これらの写真はバンドの明瞭化のために白黒反転処理している。 図６（ａ）は、希土類イオンがＬａ又はＥｕの場合のアガロースゲル電気泳動ゲル写真を示す。図６（ｂ）は、希土類イオンがＹ又はＴｍの場合のアガロースゲル電気泳動ゲル写真を示す。尚、これらの写真はバンドの明瞭化のために白黒反転処理している。 図７（ａ）は、ＰＣＲサイクル数に対する蛍光強度のモニタリングデータを示す。図７（ｂ）は、ＰＣＲサイクル数が１２回、１４回、１６回におけるＬａ濃度と蛍光強度の関係を示すグラフである。 図８（ａ）は、各試料液における主なイオンの組成を示す表である。図８（ｂ）は、超純水、水道水、又は河川の上流域の水を使用した場合のアガロースゲル電気泳動ゲル写真を示す。図８（ｃ）は、河川の中流域の水Ａ又はＢ若しくは河川の下流域の水Ａ又はＢを使用した場合のアガロースゲル電気泳動ゲル写真を示す。尚、これらの写真はバンドの明瞭化のためにイメージを白黒反転処理している。
　以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
　試料中の希土類イオンを検出する本実施形態の方法は、前記試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程と、前記試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程と同時又はその後に、前記鋳型ＤＮＡを用いてプライマーの存在下でＰＣＲ反応を行う工程と、前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程とからなる。希土類イオンは、鋳型ＤＮＡとの接触により、ＤＮＡを基質として種々の触媒反応、例えばＤＮＡの加水分解反応、及びＤＮＡの組換え反応を起こす。したがって、かかる希土類イオンのＤＮＡに対する触媒反応は、ＰＣＲ反応を撹乱する。ＰＣＲ反応の撹乱は、希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるのと同じＤＮＡ断片が減少若しくは消失するのを検出するか、又は希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるＤＮＡ断片とは異なる大きさのＤＮＡ断片を検出することにより確認することができる。本実施形態の方法では、ＰＣＲ反応の撹乱をこうして確認することにより、試料中の希土類イオンの存在の有無を検出する。また、ＰＣＲ反応により生じたＰＣＲ産物については、増幅されたＤＮＡ断片が発光、蛍光、着色及び放射性の少なくともいずれか一つを生じるプローブ導入反応に供することにより高感度検出を可能としている。
　鋳型ＤＮＡに試料を接触させる工程は、希土類イオンによるＤＮＡに対する種々の触媒反応を生じさせるために水溶液（緩衝溶媒）中で行われる。かかる工程は、ＰＣＲ反応の前に行ってもよいし、ＰＣＲ反応中に行ってもよいし、あるいはＰＣＲ反応の前及びＰＣＲ反応中のいずれにおいても行うようにしてもよい。好ましくは、検出処理にかかる時間の短縮の観点から、ＰＣＲ反応中にのみ行われる。鋳型ＤＮＡに試料を接触させる工程をＰＣＲ反応の前に行う場合、この接触の工程は、好ましくは２５～４５℃、より好ましくは３５～４０℃の温度で、数分～数時間程度の時間にわたり、好ましくは５～９、より好ましくは６～８のｐＨのもとで行われる。この場合、検出感度向上の観点から、例えばリン酸緩衝液などの公知の緩衝液を使用することが好ましい。
　本実施形態の方法で検出する希土類イオン（希土類元素）は、例えば、原子番号５７番～７１番のランタノイド（但し、６１番のＰｍ（プロメチウム）を除く）、原子番号２１番のＳｃ（スカンジウム）、及び原子番号３９番のＹ（イットリウム）から選ばれる少なくとも一種である。Ｐｍを除くランタノイドは、具体的には、Ｌａ（ランタン）、Ｃｅ（セリウム）、Ｐｒ（プラセオジム）、Ｎｄ（ネオジム）、Ｓｍ（サマリウム）、Ｅｕ（ユウロピウム）、Ｇｄ（ガドリニウム）、Ｔｂ（テルビウム）、Ｄｙ（ジスプロシウム）、Ｈｏ（ホルミウム）、Ｅｒ（エルビウム）、Ｔｍ（ツリウム）、Ｙｂ（イッテルビウム）、及びＬｕ（ルテチウム）である。
　使用される鋳型ＤＮＡの種類は、特に限定されず、天然由来のＤＮＡを使用してもよく、人工的に合成したＤＮＡを使用してもよい。鋳型ＤＮＡは、希土類イオンがＤＮＡを基質として種々の触媒反応、例えば加水分解反応及び組換え反応を起こすことができるＤＮＡであることが好ましい。かかるＤＮＡとして、例えば配列番号１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号１に示す塩基配列は、ｐＢＲ３２２ベクター由来の５０１ｂｐの二本鎖ＤＮＡである。
　ＰＣＲ反応に用いられるプライマーとしては、鋳型ＤＮＡの増幅部両端の塩基配列に対応した一対の合成ポリヌクレオチドが用いられる。例えば、鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドを使用する場合、配列番号２に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドプライマーと配列番号３に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対を使用することができる。かかるプライマー対は、配列番号１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドのそれぞれの両端に相補的なプライマーである。すなわち、プライマーは、鋳型ＤＮＡの配列の一部に相当する。プライマーは、希土類イオンの非存在下でのＰＣＲ反応では、鋳型ＤＮＡを増幅する。一方、希土類イオンの存在下でのＰＣＲ反応では、プライマーの配列は、増幅されるＤＮＡ断片中に少なくとも部分的に、あるいは組換えにより派生した繰り返し配列または反転した配列として確認することができる。
　鋳型ＤＮＡとして配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチドを使用し、配列番号２及び配列番号３の組み合わせからなるプライマー対及び希土類イオンの存在下でＰＣＲ反応が行われた場合、希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に生じるＤＮＡ断片（約５００ｂｐ）とは異なる大きさ（１００ｂｐ以下）の低分子量の増幅ＤＮＡ断片が検出される。これは、希土類イオンの存在により、ＰＣＲ反応によるＤＮＡ増幅が撹乱（例えばＤＮＡの分解やＤＮＡの組み換えを通じて）され、その結果、分解又は組み換えにより新たに生じたＤＮＡの弱い結合を形成する部分にプライマーが結合して、ある長さの断片が増幅されて生じているものと考えられる。かかる低分子量の増幅ＤＮＡ断片の検出により、希土類イオンの存在の有無を検出することができる。尚、希土類イオンの存在下でＰＣＲ反応が行われた場合とは、ＰＣＲ反応の前に予め鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させた場合を含むものとする。かかる場合であっても、希土類イオンが鋳型ＤＮＡに作用することにより、ＰＣＲ反応に何らかの影響を与えるからである。希土類イオンを含むか否か未知の試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程を、ＰＣＲ反応の前に例えばリン酸緩衝液などの緩衝液中で行った場合には、希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に生じるＤＮＡ断片（約５００ｂｐ）とは異なる大きさ（１００ｂｐ以下）の低分子量の増幅ＤＮＡ断片の検出感度を向上させることができる。
　ＰＣＲを用いたゲノムＤＮＡの増幅は、公知の方法を適宜採用して行うことができる。ＰＣＲ反応は、常法に従い、鋳型ＤＮＡの解離、プライマーと鋳型ＤＮＡとのアニーリング、そしてプライマーを開始点としたＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖の合成からなるＤＮＡの複製サイクルを繰り返すことにより行われる。ＰＣＲ反応液は、例えば、鋳型ＤＮＡ、該鋳型ＤＮＡの一部の配列からなるプライマー対、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｇポリメラーゼ）、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、及び反応用緩衝液から調製される。ＰＣＲ反応液は、市販品を適宜使用することもできる。
　鋳型ＤＮＡの解離工程は、好ましくは９４℃で数秒から数分程度の間で行われる。プライマーと鋳型ＤＮＡとのアニーリング工程は、好ましくは５６～６４℃で数秒から数分程度の間で行われる。ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成工程は、好ましくは６０～７２℃で数秒から数分程度の間で行われる。ＤＮＡの複製サイクルの繰り返し回数は、特に限定されないが、好ましくは１５～６０回、より好ましくは２０～３０回行われる。尚、ＤＮＡの複製サイクルは、市販のＰＣＲ装置を用いて行うことができる。
　上記複製サイクルを繰り返すことにより、目的とするＰＣＲ産物（増幅ゲノムＤＮＡ）を得ることができる。ＰＣＲ産物の検出は、ＤＮＡの分離工程及びＤＮＡの検出工程により行われる。ＤＮＡの分離工程は、例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動を用いて行うことができる。
　上記ＤＮＡの分離工程後に行われるＤＮＡの検出工程は、例えば、増幅されたＤＮＡ断片が発光、蛍光、着色及び放射性の少なくともいずれか一つを生じるプローブ導入反応を用いて行われる。プローブ導入反応は、例えば、エチジウムブロマイド等のフェナントリジン系の色素からなるインターカレータ試薬を用いて行うことができる。エチジウムブロマイドは、核酸に結合して紫外線照射によりＤＮＡ量に比例した蛍光を発する。あるいは、プローブ導入反応は、蛍光分子、色素分子、発光分子及び放射性同位元素等の標識分子を用いて合成されたプライマー又はそれらの標識分子が付加されたプライマーを用いて行われてもよい。具体的には、シアニン系蛍光試薬、例えばＣｙ３又はＣｙ５を用いて予め蛍光標識されたプライマー分子を使用することができる。
　希土類イオンが測定試料中に含まれるか否かの判定は、上記複製サイクルにより生成したＰＣＲ産物の分離及び検出の各工程を経ることにより得られる分画パターンに基づいて判断される。ＰＣＲ産物の分画パターンの比較解析は、例えば、増幅ゲノムＤＮＡの有無、分子量（塩基数）、量、及び塩基配列に基づいて行われる。より具体的には、ＰＣＲ産物を電気泳動してバンドの有無や濃淡、移動距離及び塩基配列をコントロールと比較することにより行うことができる。
　また、ＰＣＲ反応により増幅されるＤＮＡ断片の検出は、リアルタイムＰＣＲを用いて行ってもよい。リアルタイムＰＣＲは、定量ＰＣＲの一つで、ＰＣＲによる増幅を経時的に測定することで増幅率に基づいて鋳型となるＤＮＡの検出のみならず鋳型ＤＮＡの定量を行うこともできる。
　希土類イオンは、ＤＮＡに対する触媒反応によりＰＣＲ反応を撹乱し、希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるのと同じＤＮＡ断片を減少若しくは消失させるか、あるいは希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるＤＮＡ断片とは異なる大きさのＤＮＡ断片を生じさせる。かかるＤＮＡ断片の減少量又は消失量は、希土類イオンの濃度に依存し、希土類イオンの濃度が高くなるほど増大することを確認している。同様に、前記異なる大きさのＤＮＡ断片が生じる量も、希土類イオンの濃度に依存し、希土類イオンの濃度が高くなるほど増大することを確認している。したがって、ＰＣＲ反応により増幅されるＤＮＡ断片の検出を、リアルタイムＰＣＲを用いて行った場合には、ＤＮＡ断片の検出量から試料中の希土類イオンの濃度を算出することができる。
　リアルタイムＰＣＲ法は、公知の方法で行うことができる。例えば、サーマルサイクラー及び分光蛍光光度計を一体化した市販のリアルタイムＰＣＲ装置を使用してもよい。ＤＮＡの検出は、例えば、二重鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発するインターカレータ試薬を用いたインターカレータ法や、増幅するＤＮＡ配列に特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させた蛍光標識プローブを用いる方法で行うことができる。インターカレータ法で使用することができるインターカレータ試薬は、例えばＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉが挙げられる。
　本実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
　（１）本実施形態の方法によれば、ＰＣＲ反応工程とＤＮＡ検出工程により希土類イオン（希土類金属）の検出が可能である。したがって、ＩＣＰ－ＭＳを用いた方法と比べ、高価な機器を使用することなく安価に且つ短時間で希土類イオンを検出することができる。
　（２）鋳型ＤＮＡに試料を接触させる工程と同時に、鋳型ＤＮＡを用いてプライマーの存在下でＰＣＲ反応を行った場合には、試料中の希土類イオンの検出にかかる時間の短縮を図ることができる。
　（３）ＰＣＲ反応により増幅されるＤＮＡ断片の検出をリアルタイムＰＣＲにより行った場合には、試料中の希土類イオンの有無の検出のみならず、希土類イオンの定量を行うことができる。
　（４）ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片の検出は、増幅されたＤＮＡ断片が発光、蛍光、着色及び放射性の少なくともいずれか一つを生じるプローブ導入反応を用いて行われる。この場合、希土類イオンのより高感度の検出が可能となる。
　（５）ランタノイド等の希土類金属は、特徴的な性質を有しているために、工業・産業上の利用価値が見出されている。また、生体分子レベルで希土類金属が生理活性を有することも多数報告されている。したがって、本実施形態の希土類イオンの検出方法は、これらの各分野において有用である。
　なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
　上記実施形態の希土類イオンの検出方法は、例えば、鋳型ＤＮＡ、プライマー、及び核酸増幅用試薬を含んでなる希土類イオン検出用キットを使用して行ってもよい。核酸増幅用試薬は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ混合液、及び核酸増幅反応バッファを含んでなる。この場合、簡便に希土類イオンの検出を実施することができる。
　ＰＣＲ産物を電気泳動して例えば検出バンドの濃淡をコントロールと比較することにより、試料中の希土類イオンの有無の検出のみならず、試料中の希土類イオンの定量又は定性をしてもよい。
　ＰＣＲ反応は、超高速又は高増幅ＰＣＲ装置を用いて行ってもよい。超高速又は高増幅ＰＣＲ装置では、温度を固定した熱板の上で、ＰＣＲ容器を封入したディスクを接触回転させることが行われる。この場合、希土類イオンの検出にかかる時間のさらなる短縮を図ることができる。
　上記実施形態の希土類イオンの検出方法は、例えば、上下水道、河川、湖沼、海又は土壌から採取した試料中の希土類イオンの検出に使用されてもよい。
　上記実施形態の希土類イオンの検出方法で使用される鋳型ＤＮＡは、配列番号１に示す塩基配列のみからなるＤＮＡであってもよいし、あるいは、配列番号１に示す塩基配列を一部に含むＤＮＡであってもよい。配列番号１に示す塩基配列を一部に含むＤＮＡの具体例としては、例えば、ｐＢＲ３２２ベクター（４３６１ｂｐ）が挙げられる。
　ＰＣＲ法により増幅されるＤＮＡ断片は、核酸切断反応などの核酸を基質とした希土類イオンの触媒活性による新規なＰＣＲ撹乱効果により生じるＤＮＡ断片であって、必ずしも鋳型ＤＮＡに含まれる配列である必要はない。
　次に、実施例を挙げて前記実施形態を更に具体的に説明する。
　＜試験例１：Ｔｂ及びＥｕによるＰＣＲ反応の撹乱の確認試験＞
　Ｔｂ及びＥｕがＤＮＡ及びＰＣＲ反応に影響を与えるか否かについて、ＰＣＲにより増幅するＤＮＡを追跡することにより測定した。鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。配列番号１のＤＮＡは、ｐＢＲ３２２ベクター由来の５０１ｂｐの二本鎖ＤＮＡである。まず、リン酸カリウムバッファ（ｐＨ７．０）３０ｍＭ中に鋳型ＤＮＡを１５０μＭ及び希土類イオン（Ｔｂ、Ｅｕ）をそれぞれ０．３ｍＭ，３ｍＭ，３０ｍＭの各濃度になるように添加し、反応液を調製した。その反応液を３７℃で１時間インキュベートした。
　次に、上記インキュベート後の反応液にＰＣＲ反応試薬を添加することにより、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応試薬は、タカラバイオ社製のＴａｋａｒａ　ＥｘＴａｑ（１０×ＰＣＲバッファ、ｄＮＴＰ混合物、及びＥｘＴａｑポリメラーゼ）を使用した。プライマーとしては、配列番号２，３のポリヌクレオチドからなるプライマー対を０．２～１μＭの濃度で使用した。その他は製品記載のプロトコルに従った。
　ＰＣＲは、サーマルサイクラー（PERKIN ELMER CETUS社製Gene Amp PCR System）を用い、９４℃に２分間保持した後、９４℃で１分間の解離工程、５９．５℃で１分間のアニーリング工程、そして７０℃で１分間のポリメラーゼ反応（相補鎖伸長反応）工程というサイクルを２５回繰り返し、最後に再度伸長反応を７２℃で１０分間行うことにより実施した。
　反応後のＰＣＲ産物を０．５×ＴＢＥバッファ中、２．０％アガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、ＵＶ光下でバンドを検出した。結果を図１に示す。
　図１に示されるように、希土類イオンの濃度に依存して５００ｂｐ付近のバンド（鋳型ＤＮＡに対応）が薄くなる、すなわち次第に消失することが確認された。これは、希土類イオンによる鋳型ＤＮＡの分解が原因と考えられる。したがって、このバンドの濃淡により、希土類イオンの存在の有無を検出できることが分かる。この試験例に記載の方法に従うと、鋳型ＤＮＡと希土類イオンを混合した後のインキュベートにかかる時間が１時間で、サーマルサイクラーによるＰＣＲ反応にかかる時間が約２時間半なので、電気泳動によるチェックの時間を含めても、合計４時間程度で希土類イオンの検出が可能である。
　また、図１に示されるように、５００ｂｐ付近のバンド（鋳型ＤＮＡ）は希土類イオンの濃度が高くなるにつれて薄くなるため、検量線を作成することにより希土類イオンの定量も可能となることが示唆される。
　＜試験例２：Ｔｂ及びＥｕによるＰＣＲ反応の撹乱の確認試験＞
　Ｔｂ及びＥｕがＤＮＡ及びＰＣＲ反応に影響を与えるか否かについて、ＰＣＲ反応後に鋳型ＤＮＡ以外のＤＮＡに由来するバンドを検出することにより測定した。
　鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。まず、リン酸カリウムバッファ（ｐＨ７．０）３０ｍＭ中に鋳型ＤＮＡを１５ｐＭ、及び希土類イオン（Ｔｂ、Ｅｕ）をそれぞれ３００ｐＭ、３ｎＭ、３０ｎＭの各濃度になるように添加し、反応液を調製した。その反応液を３７℃で１時間インキュベートした。
　次に、試験例１に記載の方法に従い、上記インキュベート後の反応液にＰＣＲ反応試薬を添加することによりＰＣＲ反応を行い、その後にアガロースゲル電気泳動によりバンドの検出を行った。結果を図２に示す。尚、図２中、丸で囲んだ数字の１で示すバンドは希土類イオンを添加していないコントロールのもの、丸で囲んだ数字の２で示すバンドはＴｂの濃度が３００ｐＭのときのもの、丸で囲んだ数字の３で示すバンドはＴｂの濃度が３ｎＭのときのもの、丸で囲んだ数字の４で示すバンドはＴｂの濃度が３０ｎＭのときのもの、丸で囲んだ数字の５で示すバンドはＥｕの濃度が３００ｐＭのときのもの、丸で囲んだ数字の６で示すバンドはＥｕの濃度が３ｎＭのときのもの、丸で囲んだ数字の７で示すバンドはＥｕの濃度が３０ｎＭのときのものを示す。
　図２に示されるように、希土類イオンを溶液中に含まない場合では、５００ｂｐ付近のバンド（鋳型ＤＮＡ）が増幅された（丸で囲んだ数字の１で示すバンドを参照）。一方、希土類イオンを添加した試料について、特に、Ｔｂの濃度が３００ｐＭの場合（丸で囲んだ数字の２で示すバンドを参照）、Ｅｕの濃度が３００ｐＭの場合（丸で囲んだ数字の５で示すバンドを参照）、及びＥｕの濃度が３ｎＭの場合（丸で囲んだ数字の６で示すバンドを参照）において、図２中に白色矢印で示すように、鋳型ＤＮＡ由来のバンドとは異なる１００ｂｐ以下の長さの（非特異的な）バンドが出現することが確認された。これは、Ｔｂ及びＥｕの添加によりＰＣＲ反応が撹乱されたためと考えられる。かかる短いＤＮＡ鎖を検出することにより、希土類イオンの存在の有無を検出することが可能である。
　＜試験例３：種々の希土類イオンによるＰＣＲ反応の撹乱の確認試験＞
　種々の希土類イオンのそれぞれがＤＮＡ及びＰＣＲ反応に影響を与えるか否かについて、鋳型ＤＮＡ以外のＤＮＡに由来するバンドを検出することにより測定した。
　鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。まず、リン酸カリウムバッファ（ｐＨ７．０）３０ｍＭ中に鋳型ＤＮＡを１５ｐＭ及び図３中に示されている各希土類イオンをそれぞれ３ｎＭの濃度になるように添加することにより反応液を調製した。その反応液を３７℃で１時間インキュベートした。
　次に、試験例１に記載の方法に従い、上記インキュベート後の反応液にＰＣＲ反応試薬を添加することによりＰＣＲ反応を行い、その後にアガロースゲル電気泳動によりバンドの検出を行った。尚、分子量マーカーとしてニッポンジーン社製のGene Ladder100を使用した。結果を図３に示す。
　図３に示されるように、希土類イオンを溶液中に含まない場合（コントロール）では、５００ｂｐ付近のバンド（鋳型ＤＮＡ）が増幅された。一方、希土類イオンを添加した全ての試料について、鋳型ＤＮＡとは異なる１００ｂｐ以下の長さの（非特異的な）バンドが出現することが確認された（Ｙ，Ｇｄ，Ｙｂの場合、図３中不明瞭ではあるが存在する）。これは、希土類イオンの添加によりＰＣＲ反応が撹乱されたためと考えられる。かかる短いＤＮＡ鎖を検出することにより、希土類イオンの存在の有無を検出することが可能である。
　また、図３に示されるように、１００ｂｐ以下の非特異的なバンドは、希土類イオンの種類により濃淡が相違するため、かかるバンドの濃淡の比較により希土類イオンの定性の可能性も示唆される。
　＜試験例４：鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させる工程の条件検討（その１）＞
　鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させる時間の長さによる影響について検討した。
　鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。まず、超純水中に鋳型ＤＮＡを１５０ｐＭ、及び希土類イオン（Ｌａ）をゼロ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭの各濃度になるように添加し、反応液を調製した。その反応液を３７℃で０時間、１時間、２時間又は３時間インキュベートした。
　次に、試験例１に記載の方法に従い、上記インキュベート後の反応液にＰＣＲ反応試薬を添加することによりＰＣＲ反応を行い、その後にアガロースゲル電気泳動によりバンドの検出を行った。インキュベート時間がゼロ又は１時間の場合の電気泳動写真を図４（ａ）、インキュベート時間が２時間又は３時間の場合の電気泳動写真を図４（ｂ）に示す。
　図４（ａ）及び図４（ｂ）に示されるように、Ｌａの濃度が同じであれば、鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させる時間の長さにより、５００ｂｐのバンドの消失量に差がないことが確認された。したがって、希土類イオンの検出時間の短縮の観点から、鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させる工程は、ＰＣＲ反応の前処理として行うよりもＰＣＲ反応中に行うことが好ましいこと、また前処理として行うとしてもできるだけ短時間で済ませるのが好ましいことが示唆された。
　＜試験例５：鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させる工程の条件検討（その２）＞
　鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させるときに使用されるリン酸緩衝液の濃度による影響について検討した。
　鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。まず、超純水、３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、６０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、又は１２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に鋳型ＤＮＡを１５０ｐＭ、及び希土類イオン（Ｌａ）をゼロ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭの各濃度になるように添加し、反応液をそれぞれ調製した。その反応液を３７℃１時間でインキュベートした。
　次に、試験例１に記載の方法に従い、上記インキュベート後の反応液にＰＣＲ反応試薬を添加することによりＰＣＲ反応を行い、その後にアガロースゲル電気泳動によりバンドの検出を行った。反応液の調製において超純水又は３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液を使用した場合の電気泳動写真を図５（ａ）、反応液の調製において６０ｍＭリン酸カリウム緩衝液又は１２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液を使用した場合の電気泳動写真を図５（ｂ）に示す。
　図５（ａ）及び図５（ｂ）に示されるように、鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させるときには超純水よりも３０ｍＭ程度の濃度のリン酸カリウム緩衝液を使用した方が、１００ｂｐのバンドの検出感度が優れることが確認された。
　＜試験例６：種々の希土類イオンによるＰＣＲ反応の撹乱の確認試験＞
　希土類イオンであるＬａ，Ｅｕ，Ｙ，Ｔｍのそれぞれの濃度がＰＣＲ反応に与える影響について、鋳型ＤＮＡに由来するバンドを検出することにより測定した。
　鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。まず、超純水中に鋳型ＤＮＡを１５０ｐＭ及びＬａ，Ｅｕ，Ｙ，Ｔｍの各希土類イオンをそれぞれゼロ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭの各濃度になるように添加し、反応液を調製した。その反応液を３７℃で１時間インキュベートした。
　次に、試験例１に記載の方法に従い、上記インキュベート後の反応液にＰＣＲ反応試薬を添加することによりＰＣＲ反応を行い、その後にアガロースゲル電気泳動によりバンドの検出を行った。尚、分子量マーカーとしてニッポンジーン社製のGene Ladder100を使用した。使用した希土類イオンがＬａ又はＥｕの場合の電気泳動写真を図６（ａ）、使用した希土類イオンがＹ又はＴｍの場合の電気泳動写真を図６（ｂ）に示す。
　図６（ａ）及び図６（ｂ）に示されるように、Ｌａ，Ｅｕ，Ｙ，Ｔｍのいずれを使用した場合も、希土類イオンの濃度に依存して鋳型ＤＮＡに対応する５００ｂｐのバンドの消失が起こることが確認された。したがって、鋳型ＤＮＡ鎖の消失を検出することにより、希土類イオンの存在の有無を検出できること、また、バンドの濃さを測定することにより、希土類イオンの定量も可能であることが確認された。また、希土類イオンの種類によりバンドの濃淡が相違するため、かかるバンドの濃淡の比較により希土類イオンの定性の可能性も示唆される。
　＜試験例７：リアルタイムＰＣＲを用いた増幅ＤＮＡの検出試験＞
　希土類イオンＬａが鋳型ＤＮＡに与える影響について、リアルタイムＰＣＲを用いて増幅ＤＮＡを検出することにより測定した。
　鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。まず、超純粋中に、リアルタイムＰＣＲ用試薬の他、鋳型ＤＮＡを１５０ｐＭ、及び希土類イオンＬａをゼロ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭの各濃度になるように添加し、各ＰＣＲ反応液を調製した。リアルタイムＰＣＲ用試薬は、バイオラッド・ラボラトリーズ社製のiQ SYBR Green Supermixを使用した。プライマーとしては、配列番号２，３のポリヌクレオチドからなるプライマー対を０．２～１μＭの濃度で使用した。その他は製品記載のプロトコルに従った。
　次に、リアルタイムＰＣＲ測定器（バイオラッド・ラボラトリーズ社製のリアルタイムＰＣＲ装置（Ｃｈｒｏｍｏ４））を使用し、各反応液毎にＰＣＲ反応により増幅されるＤＮＡ産物をインターカレータ試薬（ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ）由来の蛍光強度によりリアルタイムで測定した。リアルタイムＰＣＲを用いて得られたＰＣＲサイクル数に対する蛍光強度のモニタリングデータを図７（ａ）に示す。サイクル数が１２回、１４回又は１６回におけるＬａ濃度と蛍光強度との関係を示すグラフを図７（ｂ）に示す。
　図７（ｂ）に示されるように、Ｌａ濃度と蛍光強度との間には直線的な相関関係が認められた。したがって、希土類イオンの検量線を予め作成することにより、未知試料中の希土類イオンの濃度を測定することも可能である。リアルタイムＰＣＲによる増幅途中の蛍光強度を指標にすることで、短時間且つ細かい濃度範囲で正確な希土類イオンの濃度の測定が可能であることが示唆された。
　尚、リアルタイムＰＣＲ用試薬として、バイオラッド・ラボラトリーズ社製のSsoFast EvaGreen Supermixを使用した場合にも同様の結果を得ている。
　＜試験例８：自然界で採取される試料によるＰＣＲ反応の撹乱の確認試験＞
　自然界で採取される試料液に溶解させた希土類イオンＬａがＰＣＲ反応に与える影響について、鋳型ＤＮＡに由来するバンドを検出することにより測定した。
　鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。試料液として超純水、水道水、河川の上流域の水、河川の中流域において採取場所の異なる水Ａ及び水Ｂ、並びに河川の下流域において採取場所の異なる水Ａ及び水Ｂをまず用意し、これらの試料液のそれぞれに鋳型ＤＮＡを１５０ｐＭ及びＬａをゼロ、２μｍ、６μＭの各濃度になるように添加し、反応液を調製した。その反応液を３７℃で１時間インキュベートした。
　次に、試験例１に記載の方法に従い、上記インキュベート後の反応液にＰＣＲ反応試薬を添加することによりＰＣＲ反応を行い、その後にアガロースゲル電気泳動によりバンドの検出を行った。尚、分子量マーカーとしてニッポンジーン社製のGene Ladder100を使用した。図８（ａ）は、超純水を除く各試料液における主なイオンの組成について示す。反応液の調製において超純水、水道水、又は河川の上流域の水を使用した場合の電気泳動写真を図８（ｂ）に示す。反応液の調製において河川の中流域の水Ａ又はＢ若しくは河川の下流域の水Ａ又はＢを使用した場合の電気泳動写真を図８（ｃ）に示す。
　図８（ｂ）及び図８（ｃ）に示されるように、いずれの反応液を使用した場合も、Ｌａの濃度が同じであれば、５００ｂｐのバンドの消失量に差がないことが確認された。したがって、希土類イオンによるＰＣＲ反応の撹乱は、反応液中に存在する無機イオンの影響を受けにくいことが確認された。つまり、本発明の希土類イオンの検出方法により、自然界に存在する希土類イオンの検出の可能性も示唆される。

Claims (13)

  1. 　試料中の希土類イオンを検出する方法であって、
    　前記試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程と、
    　前記試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程と同時又はその後に、前記鋳型ＤＮＡを用いてプライマーの存在下でＰＣＲ反応を行う工程と、
    　前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程と
    からなることを特徴とする方法。
  2. 　前記希土類イオンは、原子番号５７番～７１番のランタノイド（但し、６１番のＰｍを除く）、原子番号２１番のＳｃ、及び原子番号３９番のＹから選ばれる少なくとも一種である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程では、希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるのと同じＤＮＡ断片が減少若しくは消失するのを検出するか、又は希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるＤＮＡ断片とは異なる大きさのＤＮＡ断片を検出し、それにより、前記試料中の希土類イオンの有無又は濃度を決定する、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  4. 　前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程は、リアルタイムＰＣＲを用いて行われる、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程は、
    　ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動法及びアクリルアミドゲル電気泳動法の少なくともいずれか一方を用いて分離する工程と、
    　前記分離されたＤＮＡ断片を検出する工程と
    からなる、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程は、増幅されたＤＮＡ断片が発光、蛍光、着色及び放射性の少なくともいずれか一つを生じるプローブ導入反応を用いて行われる、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記プローブ導入反応は、インターカレータ試薬及びシアニン系蛍光試薬の少なくともいずれか一方を用いて行われる、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記鋳型ＤＮＡは、配列番号１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記プライマーは、配列番号２に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドプライマーと配列番号３に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対からなる、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程では、アガロースゲル電気泳動法及びアクリルアミドゲル電気泳動法の少なくともいずれか一方によって求められる塩基対の大きさが１００ｂｐ以下のＤＮＡ断片を検出する、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記試料は、上下水道、河川、湖沼、海又は土壌から採取したものである、請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の方法に用いられる希土類イオン検出用キットであって、
    　鋳型ＤＮＡ、プライマー、及び核酸増幅用試薬を含んでなることを特徴とする希土類イオン検出用キット。
  13. 　前記核酸増幅用試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ混合液、及び核酸増幅反応バッファを含んでなる、請求項１２に記載の希土類イオン検出用キット。
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