JP5656125B2 - 希土類イオンの検出方法及び希土類イオン検出用キット - Google Patents
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Description
好ましくは、前記PCR反応により増幅されたDNA断片を検出する工程は、PCR産物をアガロースゲル電気泳動法及びアクリルアミドゲル電気泳動法の少なくともいずれか一方を用いて分離する工程と、前記分離されたDNA断片を検出する工程とからなる。
好ましくは、前記鋳型DNAは、配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
本発明の第2の態様では、上記第1の態様に係る方法に用いられる希土類イオン検出用キットであって、鋳型DNA、プライマー、及び核酸増幅用試薬を含んでなる希土類イオン検出用キットを提供する。
試料中の希土類イオンを検出する本実施形態の方法は、前記試料を鋳型DNAに接触させる工程と、前記試料を鋳型DNAに接触させる工程と同時又はその後に、前記鋳型DNAを用いてプライマーの存在下でPCR反応を行う工程と、前記PCR反応により増幅されたDNA断片を検出する工程とからなる。希土類イオンは、鋳型DNAとの接触により、DNAを基質として種々の触媒反応、例えばDNAの加水分解反応、及びDNAの組換え反応を起こす。したがって、かかる希土類イオンのDNAに対する触媒反応は、PCR反応を撹乱する。PCR反応の撹乱は、希土類イオンの非存在下で同じPCR反応が行われた場合に検出されるのと同じDNA断片が減少若しくは消失するのを検出するか、又は希土類イオンの非存在下で同じPCR反応が行われた場合に検出されるDNA断片とは異なる大きさのDNA断片を検出することにより確認することができる。本実施形態の方法では、PCR反応の撹乱をこうして確認することにより、試料中の希土類イオンの存在の有無を検出する。また、PCR反応により生じたPCR産物については、増幅されたDNA断片が発光、蛍光、着色及び放射性の少なくともいずれか一つを生じるプローブ導入反応に供することにより高感度検出を可能としている。
(1)本実施形態の方法によれば、PCR反応工程とDNA検出工程により希土類イオン(希土類金属)の検出が可能である。したがって、ICP−MSを用いた方法と比べ、高価な機器を使用することなく安価に且つ短時間で希土類イオンを検出することができる。
上記実施形態の希土類イオンの検出方法は、例えば、鋳型DNA、プライマー、及び核酸増幅用試薬を含んでなる希土類イオン検出用キットを使用して行ってもよい。核酸増幅用試薬は、例えば、DNAポリメラーゼ、dNTPs混合液、及び核酸増幅反応バッファを含んでなる。この場合、簡便に希土類イオンの検出を実施することができる。
上記実施形態の希土類イオンの検出方法で使用される鋳型DNAは、配列番号1に示す塩基配列のみからなるDNAであってもよいし、あるいは、配列番号1に示す塩基配列を一部に含むDNAであってもよい。配列番号1に示す塩基配列を一部に含むDNAの具体例としては、例えば、pBR322ベクター(4361bp)が挙げられる。
<試験例1:Tb及びEuによるPCR反応の撹乱の確認試験>
Tb及びEuがDNA及びPCR反応に影響を与えるか否かについて、PCRにより増幅するDNAを追跡することにより測定した。鋳型DNAとして配列番号1に示されるポリヌクレオチドからなるDNAを使用した。配列番号1のDNAは、pBR322ベクター由来の501bpの二本鎖DNAである。まず、リン酸カリウムバッファ(pH7.0)30mM中に鋳型DNAを150μM及び希土類イオン(Tb、Eu)をそれぞれ0.3mM,3mM,30mMの各濃度になるように添加し、反応液を調製した。その反応液を37℃で1時間インキュベートした。
Tb及びEuがDNA及びPCR反応に影響を与えるか否かについて、PCR反応後に鋳型DNA以外のDNAに由来するバンドを検出することにより測定した。
種々の希土類イオンのそれぞれがDNA及びPCR反応に影響を与えるか否かについて、鋳型DNA以外のDNAに由来するバンドを検出することにより測定した。
鋳型DNAに希土類イオンを接触させる時間の長さによる影響について検討した。
鋳型DNAとして配列番号1に示されるポリヌクレオチドからなるDNAを使用した。まず、超純水中に鋳型DNAを150pM、及び希土類イオン(La)をゼロ、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μMの各濃度になるように添加し、反応液を調製した。その反応液を37℃で0時間、1時間、2時間又は3時間インキュベートした。
鋳型DNAに希土類イオンを接触させるときに使用されるリン酸緩衝液の濃度による影響について検討した。
希土類イオンであるLa,Eu,Y,Tmのそれぞれの濃度がPCR反応に与える影響について、鋳型DNAに由来するバンドを検出することにより測定した。
希土類イオンLaが鋳型DNAに与える影響について、リアルタイムPCRを用いて増幅DNAを検出することにより測定した。
<試験例8:自然界で採取される試料によるPCR反応の撹乱の確認試験>
自然界で採取される試料液に溶解させた希土類イオンLaがPCR反応に与える影響について、鋳型DNAに由来するバンドを検出することにより測定した。
Claims (13)
- 試料中の希土類イオンを検出する方法であって、
前記試料を鋳型DNAに接触させる工程と、
前記試料を鋳型DNAに接触させる工程と同時又はその後に、前記鋳型DNAを用いてプライマーの存在下でPCR反応を行う工程と、
前記PCR反応により増幅されたDNA断片を検出する工程と
からなることを特徴とする方法。 - 前記希土類イオンは、原子番号57番〜71番のランタノイド(但し、61番のPmを除く)、原子番号21番のSc、及び原子番号39番のYから選ばれる少なくとも一種である、請求項1に記載の方法。
- 前記PCR反応により増幅されたDNA断片を検出する工程では、希土類イオンの非存在下で同じPCR反応が行われた場合に検出されるのと同じDNA断片が減少若しくは消失するのを検出するか、又は希土類イオンの非存在下で同じPCR反応が行われた場合に検出されるDNA断片とは異なる大きさのDNA断片を検出し、それにより、前記試料中の希土類イオンの有無又は濃度を決定する、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 前記PCR反応により増幅されたDNA断片を検出する工程は、リアルタイムPCRを用いて行われる、請求項1から請求項3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCR反応により増幅されたDNA断片を検出する工程は、
PCR産物をアガロースゲル電気泳動法及びアクリルアミドゲル電気泳動法の少なくともいずれか一方を用いて分離する工程と、
前記分離されたDNA断片を検出する工程と
からなる、請求項1から請求項3のいずれか一項に記載の方法。 - 前記PCR反応により増幅されたDNA断片を検出する工程は、増幅されたDNA断片が発光、蛍光、着色及び放射性の少なくともいずれか一つを生じるプローブ導入反応を用いて行われる、請求項1から請求項5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブ導入反応は、インターカレータ試薬及びシアニン系蛍光試薬の少なくともいずれか一方を用いて行われる、請求項6に記載の方法。
- 前記鋳型DNAは、配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項1から請求項7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーは、配列番号2に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドプライマーと配列番号3に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対からなる、請求項8に記載の方法。
- 前記PCR反応により増幅されたDNA断片を検出する工程では、アガロースゲル電気泳動法及びアクリルアミドゲル電気泳動法の少なくともいずれか一方によって求められる塩基対の大きさが100bp以下のDNA断片を検出する、請求項9に記載の方法。
- 前記試料は、上下水道、河川、湖沼、海又は土壌から採取したものである、請求項1から請求項10のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から請求項11のいずれか一項に記載の方法に用いられる希土類イオン検出用キットであって、
鋳型DNA、プライマー、及び核酸増幅用試薬を含んでなることを特徴とする希土類イオン検出用キット。 - 前記核酸増幅用試薬は、DNAポリメラーゼ、dNTPs混合液、及び核酸増幅反応バッファを含んでなる、請求項12に記載の希土類イオン検出用キット。
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JPN6010071182; 小宮山真: '希土類錯体による核酸の切断とその応用' 希土類 No.28, 1996, p.202-203 * |
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