JP5656125B2 - 希土類イオンの検出方法及び希土類イオン検出用キット - Google Patents
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Description
本発明は、希土類イオンの検出方法及び希土類イオン検出用キットに関し、詳しくは、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法を利用した希土類イオンの検出方法及び希土類イオン検出用キットに関する発明である。
従来より、低濃度の希土類イオンを高感度に検出するための検出装置として、誘導結合プラズマ質量分析装置（ＩＣＰ−ＭＳ）が知られている（特許文献１，２参照）。ＩＣＰ−ＭＳとは、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）によってイオン化された原子を質量分析計に導入することにより、元素の同定及び定量を行うことができる測定装置である。ＩＣＰ−ＭＳは、幅広い種類の元素の検出に適用することができる。また、質量分析計を使用するため、ｐｐｔレベルの超高感度の分析を行うことができる。ところが、ＩＣＰ−ＭＳは、通常の化学分析と異なり、機材が非常に高価なため、導入が容易ではない。
そこで、本発明の目的とするところは、高感度かつ安価に希土類イオンを検出することができる方法及びそのためのキットを提供することにある。
上記目的を達成するために、本発明の第１の態様では、試料中の希土類イオンを検出する方法であって、前記試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程と、前記試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程と同時又はその後に、前記鋳型ＤＮＡを用いてプライマーの存在下でＰＣＲ反応を行う工程と、前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程とからなることを特徴とする方法を提供する。
前記希土類イオンは、例えば、原子番号５７番〜７１番のランタノイド（但し、６１番のＰｍを除く）、原子番号２１番のＳｃ、及び原子番号３９番のＹから選ばれる少なくとも一種である。
好ましくは、前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程では、希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるのと同じＤＮＡ断片が減少若しくは消失するのを検出するか、又は希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるＤＮＡ断片とは異なる大きさのＤＮＡ断片を検出し、それにより、前記試料中の希土類イオンの有無又は濃度を決定する。
好ましくは、前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程は、リアルタイムＰＣＲを用いて行われる。
好ましくは、前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程は、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動法及びアクリルアミドゲル電気泳動法の少なくともいずれか一方を用いて分離する工程と、前記分離されたＤＮＡ断片を検出する工程とからなる。
好ましくは、前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程は、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動法及びアクリルアミドゲル電気泳動法の少なくともいずれか一方を用いて分離する工程と、前記分離されたＤＮＡ断片を検出する工程とからなる。
好ましくは、前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程は、増幅されたＤＮＡ断片が発光、蛍光、着色及び放射性の少なくともいずれか一つを生じるプローブ導入反応を用いて行われる。
請好ましくは、前記プローブ導入反応は、インターカレータ試薬及びシアニン系蛍光試薬の少なくともいずれか一方を用いて行われる。
好ましくは、前記鋳型ＤＮＡは、配列番号１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
好ましくは、前記鋳型ＤＮＡは、配列番号１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
好ましくは、前記プライマーは、配列番号２に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドプライマーと配列番号３に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対からなる。
好ましくは、前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程では、アガロースゲル電気泳動法及びアクリルアミドゲル電気泳動法の少なくともいずれか一方によって求められる塩基対の大きさが１００ｂｐ以下のＤＮＡ断片を検出する。
好ましくは、前記試料は、上下水道、河川、湖沼、海又は土壌から採取したものである。
本発明の第２の態様では、上記第１の態様に係る方法に用いられる希土類イオン検出用キットであって、鋳型ＤＮＡ、プライマー、及び核酸増幅用試薬を含んでなる希土類イオン検出用キットを提供する。
本発明の第２の態様では、上記第１の態様に係る方法に用いられる希土類イオン検出用キットであって、鋳型ＤＮＡ、プライマー、及び核酸増幅用試薬を含んでなる希土類イオン検出用キットを提供する。
好ましくは、前記核酸増幅用試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ混合液、及び核酸増幅反応バッファを含んでなる。
本発明によれば、高感度かつ安価に希土類イオンを検出することができる方法及びそのためのキットを提供することができる。
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
試料中の希土類イオンを検出する本実施形態の方法は、前記試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程と、前記試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程と同時又はその後に、前記鋳型ＤＮＡを用いてプライマーの存在下でＰＣＲ反応を行う工程と、前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程とからなる。希土類イオンは、鋳型ＤＮＡとの接触により、ＤＮＡを基質として種々の触媒反応、例えばＤＮＡの加水分解反応、及びＤＮＡの組換え反応を起こす。したがって、かかる希土類イオンのＤＮＡに対する触媒反応は、ＰＣＲ反応を撹乱する。ＰＣＲ反応の撹乱は、希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるのと同じＤＮＡ断片が減少若しくは消失するのを検出するか、又は希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるＤＮＡ断片とは異なる大きさのＤＮＡ断片を検出することにより確認することができる。本実施形態の方法では、ＰＣＲ反応の撹乱をこうして確認することにより、試料中の希土類イオンの存在の有無を検出する。また、ＰＣＲ反応により生じたＰＣＲ産物については、増幅されたＤＮＡ断片が発光、蛍光、着色及び放射性の少なくともいずれか一つを生じるプローブ導入反応に供することにより高感度検出を可能としている。
試料中の希土類イオンを検出する本実施形態の方法は、前記試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程と、前記試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程と同時又はその後に、前記鋳型ＤＮＡを用いてプライマーの存在下でＰＣＲ反応を行う工程と、前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程とからなる。希土類イオンは、鋳型ＤＮＡとの接触により、ＤＮＡを基質として種々の触媒反応、例えばＤＮＡの加水分解反応、及びＤＮＡの組換え反応を起こす。したがって、かかる希土類イオンのＤＮＡに対する触媒反応は、ＰＣＲ反応を撹乱する。ＰＣＲ反応の撹乱は、希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるのと同じＤＮＡ断片が減少若しくは消失するのを検出するか、又は希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるＤＮＡ断片とは異なる大きさのＤＮＡ断片を検出することにより確認することができる。本実施形態の方法では、ＰＣＲ反応の撹乱をこうして確認することにより、試料中の希土類イオンの存在の有無を検出する。また、ＰＣＲ反応により生じたＰＣＲ産物については、増幅されたＤＮＡ断片が発光、蛍光、着色及び放射性の少なくともいずれか一つを生じるプローブ導入反応に供することにより高感度検出を可能としている。
鋳型ＤＮＡに試料を接触させる工程は、希土類イオンによるＤＮＡに対する種々の触媒反応を生じさせるために水溶液（緩衝溶媒）中で行われる。かかる工程は、ＰＣＲ反応の前に行ってもよいし、ＰＣＲ反応中に行ってもよいし、あるいはＰＣＲ反応の前及びＰＣＲ反応中のいずれにおいても行うようにしてもよい。好ましくは、検出処理にかかる時間の短縮の観点から、ＰＣＲ反応中にのみ行われる。鋳型ＤＮＡに試料を接触させる工程をＰＣＲ反応の前に行う場合、この接触の工程は、好ましくは２５〜４５℃、より好ましくは３５〜４０℃の温度で、数分〜数時間程度の時間にわたり、好ましくは５〜９、より好ましくは６〜８のｐＨのもとで行われる。この場合、検出感度向上の観点から、例えばリン酸緩衝液などの公知の緩衝液を使用することが好ましい。
本実施形態の方法で検出する希土類イオン（希土類元素）は、例えば、原子番号５７番〜７１番のランタノイド（但し、６１番のＰｍ（プロメチウム）を除く）、原子番号２１番のＳｃ（スカンジウム）、及び原子番号３９番のＹ（イットリウム）から選ばれる少なくとも一種である。Ｐｍを除くランタノイドは、具体的には、Ｌａ（ランタン）、Ｃｅ（セリウム）、Ｐｒ（プラセオジム）、Ｎｄ（ネオジム）、Ｓｍ（サマリウム）、Ｅｕ（ユウロピウム）、Ｇｄ（ガドリニウム）、Ｔｂ（テルビウム）、Ｄｙ（ジスプロシウム）、Ｈｏ（ホルミウム）、Ｅｒ（エルビウム）、Ｔｍ（ツリウム）、Ｙｂ（イッテルビウム）、及びＬｕ（ルテチウム）である。
使用される鋳型ＤＮＡの種類は、特に限定されず、天然由来のＤＮＡを使用してもよく、人工的に合成したＤＮＡを使用してもよい。鋳型ＤＮＡは、希土類イオンがＤＮＡを基質として種々の触媒反応、例えば加水分解反応及び組換え反応を起こすことができるＤＮＡであることが好ましい。かかるＤＮＡとして、例えば配列番号１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号１に示す塩基配列は、ｐＢＲ３２２ベクター由来の５０１ｂｐの二本鎖ＤＮＡである。
ＰＣＲ反応に用いられるプライマーとしては、鋳型ＤＮＡの増幅部両端の塩基配列に対応した一対の合成ポリヌクレオチドが用いられる。例えば、鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドを使用する場合、配列番号２に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドプライマーと配列番号３に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対を使用することができる。かかるプライマー対は、配列番号１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドのそれぞれの両端に相補的なプライマーである。すなわち、プライマーは、鋳型ＤＮＡの配列の一部に相当する。プライマーは、希土類イオンの非存在下でのＰＣＲ反応では、鋳型ＤＮＡを増幅する。一方、希土類イオンの存在下でのＰＣＲ反応では、プライマーの配列は、増幅されるＤＮＡ断片中に少なくとも部分的に、あるいは組換えにより派生した繰り返し配列または反転した配列として確認することができる。
鋳型ＤＮＡとして配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチドを使用し、配列番号２及び配列番号３の組み合わせからなるプライマー対及び希土類イオンの存在下でＰＣＲ反応が行われた場合、希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に生じるＤＮＡ断片（約５００ｂｐ）とは異なる大きさ（１００ｂｐ以下）の低分子量の増幅ＤＮＡ断片が検出される。これは、希土類イオンの存在により、ＰＣＲ反応によるＤＮＡ増幅が撹乱（例えばＤＮＡの分解やＤＮＡの組み換えを通じて）され、その結果、分解又は組み換えにより新たに生じたＤＮＡの弱い結合を形成する部分にプライマーが結合して、ある長さの断片が増幅されて生じているものと考えられる。かかる低分子量の増幅ＤＮＡ断片の検出により、希土類イオンの存在の有無を検出することができる。尚、希土類イオンの存在下でＰＣＲ反応が行われた場合とは、ＰＣＲ反応の前に予め鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させた場合を含むものとする。かかる場合であっても、希土類イオンが鋳型ＤＮＡに作用することにより、ＰＣＲ反応に何らかの影響を与えるからである。希土類イオンを含むか否か未知の試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程を、ＰＣＲ反応の前に例えばリン酸緩衝液などの緩衝液中で行った場合には、希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に生じるＤＮＡ断片（約５００ｂｐ）とは異なる大きさ（１００ｂｐ以下）の低分子量の増幅ＤＮＡ断片の検出感度を向上させることができる。
ＰＣＲを用いたゲノムＤＮＡの増幅は、公知の方法を適宜採用して行うことができる。ＰＣＲ反応は、常法に従い、鋳型ＤＮＡの解離、プライマーと鋳型ＤＮＡとのアニーリング、そしてプライマーを開始点としたＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖の合成からなるＤＮＡの複製サイクルを繰り返すことにより行われる。ＰＣＲ反応液は、例えば、鋳型ＤＮＡ、該鋳型ＤＮＡの一部の配列からなるプライマー対、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｇポリメラーゼ）、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、及び反応用緩衝液から調製される。ＰＣＲ反応液は、市販品を適宜使用することもできる。
鋳型ＤＮＡの解離工程は、好ましくは９４℃で数秒から数分程度の間で行われる。プライマーと鋳型ＤＮＡとのアニーリング工程は、好ましくは５６〜６４℃で数秒から数分程度の間で行われる。ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成工程は、好ましくは６０〜７２℃で数秒から数分程度の間で行われる。ＤＮＡの複製サイクルの繰り返し回数は、特に限定されないが、好ましくは１５〜６０回、より好ましくは２０〜３０回行われる。尚、ＤＮＡの複製サイクルは、市販のＰＣＲ装置を用いて行うことができる。
上記複製サイクルを繰り返すことにより、目的とするＰＣＲ産物（増幅ゲノムＤＮＡ）を得ることができる。ＰＣＲ産物の検出は、ＤＮＡの分離工程及びＤＮＡの検出工程により行われる。ＤＮＡの分離工程は、例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動を用いて行うことができる。
上記ＤＮＡの分離工程後に行われるＤＮＡの検出工程は、例えば、増幅されたＤＮＡ断片が発光、蛍光、着色及び放射性の少なくともいずれか一つを生じるプローブ導入反応を用いて行われる。プローブ導入反応は、例えば、エチジウムブロマイド等のフェナントリジン系の色素からなるインターカレータ試薬を用いて行うことができる。エチジウムブロマイドは、核酸に結合して紫外線照射によりＤＮＡ量に比例した蛍光を発する。あるいは、プローブ導入反応は、蛍光分子、色素分子、発光分子及び放射性同位元素等の標識分子を用いて合成されたプライマー又はそれらの標識分子が付加されたプライマーを用いて行われてもよい。具体的には、シアニン系蛍光試薬、例えばＣｙ３又はＣｙ５を用いて予め蛍光標識されたプライマー分子を使用することができる。
希土類イオンが測定試料中に含まれるか否かの判定は、上記複製サイクルにより生成したＰＣＲ産物の分離及び検出の各工程を経ることにより得られる分画パターンに基づいて判断される。ＰＣＲ産物の分画パターンの比較解析は、例えば、増幅ゲノムＤＮＡの有無、分子量（塩基数）、量、及び塩基配列に基づいて行われる。より具体的には、ＰＣＲ産物を電気泳動してバンドの有無や濃淡、移動距離及び塩基配列をコントロールと比較することにより行うことができる。
また、ＰＣＲ反応により増幅されるＤＮＡ断片の検出は、リアルタイムＰＣＲを用いて行ってもよい。リアルタイムＰＣＲは、定量ＰＣＲの一つで、ＰＣＲによる増幅を経時的に測定することで増幅率に基づいて鋳型となるＤＮＡの検出のみならず鋳型ＤＮＡの定量を行うこともできる。
希土類イオンは、ＤＮＡに対する触媒反応によりＰＣＲ反応を撹乱し、希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるのと同じＤＮＡ断片を減少若しくは消失させるか、あるいは希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるＤＮＡ断片とは異なる大きさのＤＮＡ断片を生じさせる。かかるＤＮＡ断片の減少量又は消失量は、希土類イオンの濃度に依存し、希土類イオンの濃度が高くなるほど増大することを確認している。同様に、前記異なる大きさのＤＮＡ断片が生じる量も、希土類イオンの濃度に依存し、希土類イオンの濃度が高くなるほど増大することを確認している。したがって、ＰＣＲ反応により増幅されるＤＮＡ断片の検出を、リアルタイムＰＣＲを用いて行った場合には、ＤＮＡ断片の検出量から試料中の希土類イオンの濃度を算出することができる。
リアルタイムＰＣＲ法は、公知の方法で行うことができる。例えば、サーマルサイクラー及び分光蛍光光度計を一体化した市販のリアルタイムＰＣＲ装置を使用してもよい。ＤＮＡの検出は、例えば、二重鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発するインターカレータ試薬を用いたインターカレータ法や、増幅するＤＮＡ配列に特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させた蛍光標識プローブを用いる方法で行うことができる。インターカレータ法で使用することができるインターカレータ試薬は、例えばＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉが挙げられる。
本実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
（１）本実施形態の方法によれば、ＰＣＲ反応工程とＤＮＡ検出工程により希土類イオン（希土類金属）の検出が可能である。したがって、ＩＣＰ−ＭＳを用いた方法と比べ、高価な機器を使用することなく安価に且つ短時間で希土類イオンを検出することができる。
（１）本実施形態の方法によれば、ＰＣＲ反応工程とＤＮＡ検出工程により希土類イオン（希土類金属）の検出が可能である。したがって、ＩＣＰ−ＭＳを用いた方法と比べ、高価な機器を使用することなく安価に且つ短時間で希土類イオンを検出することができる。
（２）鋳型ＤＮＡに試料を接触させる工程と同時に、鋳型ＤＮＡを用いてプライマーの存在下でＰＣＲ反応を行った場合には、試料中の希土類イオンの検出にかかる時間の短縮を図ることができる。
（３）ＰＣＲ反応により増幅されるＤＮＡ断片の検出をリアルタイムＰＣＲにより行った場合には、試料中の希土類イオンの有無の検出のみならず、希土類イオンの定量を行うことができる。
（４）ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片の検出は、増幅されたＤＮＡ断片が発光、蛍光、着色及び放射性の少なくともいずれか一つを生じるプローブ導入反応を用いて行われる。この場合、希土類イオンのより高感度の検出が可能となる。
（５）ランタノイド等の希土類金属は、特徴的な性質を有しているために、工業・産業上の利用価値が見出されている。また、生体分子レベルで希土類金属が生理活性を有することも多数報告されている。したがって、本実施形態の希土類イオンの検出方法は、これらの各分野において有用である。
なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
上記実施形態の希土類イオンの検出方法は、例えば、鋳型ＤＮＡ、プライマー、及び核酸増幅用試薬を含んでなる希土類イオン検出用キットを使用して行ってもよい。核酸増幅用試薬は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ混合液、及び核酸増幅反応バッファを含んでなる。この場合、簡便に希土類イオンの検出を実施することができる。
上記実施形態の希土類イオンの検出方法は、例えば、鋳型ＤＮＡ、プライマー、及び核酸増幅用試薬を含んでなる希土類イオン検出用キットを使用して行ってもよい。核酸増幅用試薬は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ混合液、及び核酸増幅反応バッファを含んでなる。この場合、簡便に希土類イオンの検出を実施することができる。
ＰＣＲ産物を電気泳動して例えば検出バンドの濃淡をコントロールと比較することにより、試料中の希土類イオンの有無の検出のみならず、試料中の希土類イオンの定量又は定性をしてもよい。
ＰＣＲ反応は、超高速又は高増幅ＰＣＲ装置を用いて行ってもよい。超高速又は高増幅ＰＣＲ装置では、温度を固定した熱板の上で、ＰＣＲ容器を封入したディスクを接触回転させることが行われる。この場合、希土類イオンの検出にかかる時間のさらなる短縮を図ることができる。
上記実施形態の希土類イオンの検出方法は、例えば、上下水道、河川、湖沼、海又は土壌から採取した試料中の希土類イオンの検出に使用されてもよい。
上記実施形態の希土類イオンの検出方法で使用される鋳型ＤＮＡは、配列番号１に示す塩基配列のみからなるＤＮＡであってもよいし、あるいは、配列番号１に示す塩基配列を一部に含むＤＮＡであってもよい。配列番号１に示す塩基配列を一部に含むＤＮＡの具体例としては、例えば、ｐＢＲ３２２ベクター（４３６１ｂｐ）が挙げられる。
上記実施形態の希土類イオンの検出方法で使用される鋳型ＤＮＡは、配列番号１に示す塩基配列のみからなるＤＮＡであってもよいし、あるいは、配列番号１に示す塩基配列を一部に含むＤＮＡであってもよい。配列番号１に示す塩基配列を一部に含むＤＮＡの具体例としては、例えば、ｐＢＲ３２２ベクター（４３６１ｂｐ）が挙げられる。
ＰＣＲ法により増幅されるＤＮＡ断片は、核酸切断反応などの核酸を基質とした希土類イオンの触媒活性による新規なＰＣＲ撹乱効果により生じるＤＮＡ断片であって、必ずしも鋳型ＤＮＡに含まれる配列である必要はない。
次に、実施例を挙げて前記実施形態を更に具体的に説明する。
＜試験例１：Ｔｂ及びＥｕによるＰＣＲ反応の撹乱の確認試験＞
Ｔｂ及びＥｕがＤＮＡ及びＰＣＲ反応に影響を与えるか否かについて、ＰＣＲにより増幅するＤＮＡを追跡することにより測定した。鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。配列番号１のＤＮＡは、ｐＢＲ３２２ベクター由来の５０１ｂｐの二本鎖ＤＮＡである。まず、リン酸カリウムバッファ（ｐＨ７．０）３０ｍＭ中に鋳型ＤＮＡを１５０μＭ及び希土類イオン（Ｔｂ、Ｅｕ）をそれぞれ０．３ｍＭ，３ｍＭ，３０ｍＭの各濃度になるように添加し、反応液を調製した。その反応液を３７℃で１時間インキュベートした。
＜試験例１：Ｔｂ及びＥｕによるＰＣＲ反応の撹乱の確認試験＞
Ｔｂ及びＥｕがＤＮＡ及びＰＣＲ反応に影響を与えるか否かについて、ＰＣＲにより増幅するＤＮＡを追跡することにより測定した。鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。配列番号１のＤＮＡは、ｐＢＲ３２２ベクター由来の５０１ｂｐの二本鎖ＤＮＡである。まず、リン酸カリウムバッファ（ｐＨ７．０）３０ｍＭ中に鋳型ＤＮＡを１５０μＭ及び希土類イオン（Ｔｂ、Ｅｕ）をそれぞれ０．３ｍＭ，３ｍＭ，３０ｍＭの各濃度になるように添加し、反応液を調製した。その反応液を３７℃で１時間インキュベートした。
次に、上記インキュベート後の反応液にＰＣＲ反応試薬を添加することにより、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応試薬は、タカラバイオ社製のＴａｋａｒａ ＥｘＴａｑ（１０×ＰＣＲバッファ、ｄＮＴＰ混合物、及びＥｘＴａｑポリメラーゼ）を使用した。プライマーとしては、配列番号２，３のポリヌクレオチドからなるプライマー対を０．２〜１μＭの濃度で使用した。その他は製品記載のプロトコルに従った。
ＰＣＲは、サーマルサイクラー（PERKIN ELMER CETUS社製Gene Amp PCR System）を用い、９４℃に２分間保持した後、９４℃で１分間の解離工程、５９．５℃で１分間のアニーリング工程、そして７０℃で１分間のポリメラーゼ反応（相補鎖伸長反応）工程というサイクルを２５回繰り返し、最後に再度伸長反応を７２℃で１０分間行うことにより実施した。
反応後のＰＣＲ産物を０．５×ＴＢＥバッファ中、２．０％アガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、ＵＶ光下でバンドを検出した。結果を図１に示す。
図１に示されるように、希土類イオンの濃度に依存して５００ｂｐ付近のバンド（鋳型ＤＮＡに対応）が薄くなる、すなわち次第に消失することが確認された。これは、希土類イオンによる鋳型ＤＮＡの分解が原因と考えられる。したがって、このバンドの濃淡により、希土類イオンの存在の有無を検出できることが分かる。この試験例に記載の方法に従うと、鋳型ＤＮＡと希土類イオンを混合した後のインキュベートにかかる時間が１時間で、サーマルサイクラーによるＰＣＲ反応にかかる時間が約２時間半なので、電気泳動によるチェックの時間を含めても、合計４時間程度で希土類イオンの検出が可能である。
また、図１に示されるように、５００ｂｐ付近のバンド（鋳型ＤＮＡ）は希土類イオンの濃度が高くなるにつれて薄くなるため、検量線を作成することにより希土類イオンの定量も可能となることが示唆される。
＜試験例２：Ｔｂ及びＥｕによるＰＣＲ反応の撹乱の確認試験＞
Ｔｂ及びＥｕがＤＮＡ及びＰＣＲ反応に影響を与えるか否かについて、ＰＣＲ反応後に鋳型ＤＮＡ以外のＤＮＡに由来するバンドを検出することにより測定した。
Ｔｂ及びＥｕがＤＮＡ及びＰＣＲ反応に影響を与えるか否かについて、ＰＣＲ反応後に鋳型ＤＮＡ以外のＤＮＡに由来するバンドを検出することにより測定した。
鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。まず、リン酸カリウムバッファ（ｐＨ７．０）３０ｍＭ中に鋳型ＤＮＡを１５ｐＭ、及び希土類イオン（Ｔｂ、Ｅｕ）をそれぞれ３００ｐＭ、３ｎＭ、３０ｎＭの各濃度になるように添加し、反応液を調製した。その反応液を３７℃で１時間インキュベートした。
次に、試験例１に記載の方法に従い、上記インキュベート後の反応液にＰＣＲ反応試薬を添加することによりＰＣＲ反応を行い、その後にアガロースゲル電気泳動によりバンドの検出を行った。結果を図２に示す。尚、図２中、丸で囲んだ数字の１で示すバンドは希土類イオンを添加していないコントロールのもの、丸で囲んだ数字の２で示すバンドはＴｂの濃度が３００ｐＭのときのもの、丸で囲んだ数字の３で示すバンドはＴｂの濃度が３ｎＭのときのもの、丸で囲んだ数字の４で示すバンドはＴｂの濃度が３０ｎＭのときのもの、丸で囲んだ数字の５で示すバンドはＥｕの濃度が３００ｐＭのときのもの、丸で囲んだ数字の６で示すバンドはＥｕの濃度が３ｎＭのときのもの、丸で囲んだ数字の７で示すバンドはＥｕの濃度が３０ｎＭのときのものを示す。
図２に示されるように、希土類イオンを溶液中に含まない場合では、５００ｂｐ付近のバンド（鋳型ＤＮＡ）が増幅された（丸で囲んだ数字の１で示すバンドを参照）。一方、希土類イオンを添加した試料について、特に、Ｔｂの濃度が３００ｐＭの場合（丸で囲んだ数字の２で示すバンドを参照）、Ｅｕの濃度が３００ｐＭの場合（丸で囲んだ数字の５で示すバンドを参照）、及びＥｕの濃度が３ｎＭの場合（丸で囲んだ数字の６で示すバンドを参照）において、図２中に白色矢印で示すように、鋳型ＤＮＡ由来のバンドとは異なる１００ｂｐ以下の長さの（非特異的な）バンドが出現することが確認された。これは、Ｔｂ及びＥｕの添加によりＰＣＲ反応が撹乱されたためと考えられる。かかる短いＤＮＡ鎖を検出することにより、希土類イオンの存在の有無を検出することが可能である。
＜試験例３：種々の希土類イオンによるＰＣＲ反応の撹乱の確認試験＞
種々の希土類イオンのそれぞれがＤＮＡ及びＰＣＲ反応に影響を与えるか否かについて、鋳型ＤＮＡ以外のＤＮＡに由来するバンドを検出することにより測定した。
種々の希土類イオンのそれぞれがＤＮＡ及びＰＣＲ反応に影響を与えるか否かについて、鋳型ＤＮＡ以外のＤＮＡに由来するバンドを検出することにより測定した。
鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。まず、リン酸カリウムバッファ（ｐＨ７．０）３０ｍＭ中に鋳型ＤＮＡを１５ｐＭ及び図３中に示されている各希土類イオンをそれぞれ３ｎＭの濃度になるように添加することにより反応液を調製した。その反応液を３７℃で１時間インキュベートした。
次に、試験例１に記載の方法に従い、上記インキュベート後の反応液にＰＣＲ反応試薬を添加することによりＰＣＲ反応を行い、その後にアガロースゲル電気泳動によりバンドの検出を行った。尚、分子量マーカーとしてニッポンジーン社製のGene Ladder100を使用した。結果を図３に示す。
図３に示されるように、希土類イオンを溶液中に含まない場合（コントロール）では、５００ｂｐ付近のバンド（鋳型ＤＮＡ）が増幅された。一方、希土類イオンを添加した全ての試料について、鋳型ＤＮＡとは異なる１００ｂｐ以下の長さの（非特異的な）バンドが出現することが確認された（Ｙ，Ｇｄ，Ｙｂの場合、図３中不明瞭ではあるが存在する）。これは、希土類イオンの添加によりＰＣＲ反応が撹乱されたためと考えられる。かかる短いＤＮＡ鎖を検出することにより、希土類イオンの存在の有無を検出することが可能である。
また、図３に示されるように、１００ｂｐ以下の非特異的なバンドは、希土類イオンの種類により濃淡が相違するため、かかるバンドの濃淡の比較により希土類イオンの定性の可能性も示唆される。
＜試験例４：鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させる工程の条件検討（その１）＞
鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させる時間の長さによる影響について検討した。
鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。まず、超純水中に鋳型ＤＮＡを１５０ｐＭ、及び希土類イオン（Ｌａ）をゼロ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭの各濃度になるように添加し、反応液を調製した。その反応液を３７℃で０時間、１時間、２時間又は３時間インキュベートした。
鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させる時間の長さによる影響について検討した。
鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。まず、超純水中に鋳型ＤＮＡを１５０ｐＭ、及び希土類イオン（Ｌａ）をゼロ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭの各濃度になるように添加し、反応液を調製した。その反応液を３７℃で０時間、１時間、２時間又は３時間インキュベートした。
次に、試験例１に記載の方法に従い、上記インキュベート後の反応液にＰＣＲ反応試薬を添加することによりＰＣＲ反応を行い、その後にアガロースゲル電気泳動によりバンドの検出を行った。インキュベート時間がゼロ又は１時間の場合の電気泳動写真を図４（ａ）、インキュベート時間が２時間又は３時間の場合の電気泳動写真を図４（ｂ）に示す。
図４（ａ）及び図４（ｂ）に示されるように、Ｌａの濃度が同じであれば、鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させる時間の長さにより、５００ｂｐのバンドの消失量に差がないことが確認された。したがって、希土類イオンの検出時間の短縮の観点から、鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させる工程は、ＰＣＲ反応の前処理として行うよりもＰＣＲ反応中に行うことが好ましいこと、また前処理として行うとしてもできるだけ短時間で済ませるのが好ましいことが示唆された。
＜試験例５：鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させる工程の条件検討（その２）＞
鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させるときに使用されるリン酸緩衝液の濃度による影響について検討した。
鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させるときに使用されるリン酸緩衝液の濃度による影響について検討した。
鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。まず、超純水、３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、６０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、又は１２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に鋳型ＤＮＡを１５０ｐＭ、及び希土類イオン（Ｌａ）をゼロ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭの各濃度になるように添加し、反応液をそれぞれ調製した。その反応液を３７℃１時間でインキュベートした。
次に、試験例１に記載の方法に従い、上記インキュベート後の反応液にＰＣＲ反応試薬を添加することによりＰＣＲ反応を行い、その後にアガロースゲル電気泳動によりバンドの検出を行った。反応液の調製において超純水又は３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液を使用した場合の電気泳動写真を図５（ａ）、反応液の調製において６０ｍＭリン酸カリウム緩衝液又は１２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液を使用した場合の電気泳動写真を図５（ｂ）に示す。
図５（ａ）及び図５（ｂ）に示されるように、鋳型ＤＮＡに希土類イオンを接触させるときには超純水よりも３０ｍＭ程度の濃度のリン酸カリウム緩衝液を使用した方が、１００ｂｐのバンドの検出感度が優れることが確認された。
＜試験例６：種々の希土類イオンによるＰＣＲ反応の撹乱の確認試験＞
希土類イオンであるＬａ，Ｅｕ，Ｙ，Ｔｍのそれぞれの濃度がＰＣＲ反応に与える影響について、鋳型ＤＮＡに由来するバンドを検出することにより測定した。
希土類イオンであるＬａ，Ｅｕ，Ｙ，Ｔｍのそれぞれの濃度がＰＣＲ反応に与える影響について、鋳型ＤＮＡに由来するバンドを検出することにより測定した。
鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。まず、超純水中に鋳型ＤＮＡを１５０ｐＭ及びＬａ，Ｅｕ，Ｙ，Ｔｍの各希土類イオンをそれぞれゼロ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭの各濃度になるように添加し、反応液を調製した。その反応液を３７℃で１時間インキュベートした。
次に、試験例１に記載の方法に従い、上記インキュベート後の反応液にＰＣＲ反応試薬を添加することによりＰＣＲ反応を行い、その後にアガロースゲル電気泳動によりバンドの検出を行った。尚、分子量マーカーとしてニッポンジーン社製のGene Ladder100を使用した。使用した希土類イオンがＬａ又はＥｕの場合の電気泳動写真を図６（ａ）、使用した希土類イオンがＹ又はＴｍの場合の電気泳動写真を図６（ｂ）に示す。
図６（ａ）及び図６（ｂ）に示されるように、Ｌａ，Ｅｕ，Ｙ，Ｔｍのいずれを使用した場合も、希土類イオンの濃度に依存して鋳型ＤＮＡに対応する５００ｂｐのバンドの消失が起こることが確認された。したがって、鋳型ＤＮＡ鎖の消失を検出することにより、希土類イオンの存在の有無を検出できること、また、バンドの濃さを測定することにより、希土類イオンの定量も可能であることが確認された。また、希土類イオンの種類によりバンドの濃淡が相違するため、かかるバンドの濃淡の比較により希土類イオンの定性の可能性も示唆される。
＜試験例７：リアルタイムＰＣＲを用いた増幅ＤＮＡの検出試験＞
希土類イオンＬａが鋳型ＤＮＡに与える影響について、リアルタイムＰＣＲを用いて増幅ＤＮＡを検出することにより測定した。
希土類イオンＬａが鋳型ＤＮＡに与える影響について、リアルタイムＰＣＲを用いて増幅ＤＮＡを検出することにより測定した。
鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。まず、超純粋中に、リアルタイムＰＣＲ用試薬の他、鋳型ＤＮＡを１５０ｐＭ、及び希土類イオンＬａをゼロ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭの各濃度になるように添加し、各ＰＣＲ反応液を調製した。リアルタイムＰＣＲ用試薬は、バイオラッド・ラボラトリーズ社製のiQ SYBR Green Supermixを使用した。プライマーとしては、配列番号２，３のポリヌクレオチドからなるプライマー対を０．２〜１μＭの濃度で使用した。その他は製品記載のプロトコルに従った。
次に、リアルタイムＰＣＲ測定器（バイオラッド・ラボラトリーズ社製のリアルタイムＰＣＲ装置（Ｃｈｒｏｍｏ４））を使用し、各反応液毎にＰＣＲ反応により増幅されるＤＮＡ産物をインターカレータ試薬（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）由来の蛍光強度によりリアルタイムで測定した。リアルタイムＰＣＲを用いて得られたＰＣＲサイクル数に対する蛍光強度のモニタリングデータを図７（ａ）に示す。サイクル数が１２回、１４回又は１６回におけるＬａ濃度と蛍光強度との関係を示すグラフを図７（ｂ）に示す。
図７（ｂ）に示されるように、Ｌａ濃度と蛍光強度との間には直線的な相関関係が認められた。したがって、希土類イオンの検量線を予め作成することにより、未知試料中の希土類イオンの濃度を測定することも可能である。リアルタイムＰＣＲによる増幅途中の蛍光強度を指標にすることで、短時間且つ細かい濃度範囲で正確な希土類イオンの濃度の測定が可能であることが示唆された。
尚、リアルタイムＰＣＲ用試薬として、バイオラッド・ラボラトリーズ社製のSsoFast EvaGreen Supermixを使用した場合にも同様の結果を得ている。
＜試験例８：自然界で採取される試料によるＰＣＲ反応の撹乱の確認試験＞
自然界で採取される試料液に溶解させた希土類イオンＬａがＰＣＲ反応に与える影響について、鋳型ＤＮＡに由来するバンドを検出することにより測定した。
＜試験例８：自然界で採取される試料によるＰＣＲ反応の撹乱の確認試験＞
自然界で採取される試料液に溶解させた希土類イオンＬａがＰＣＲ反応に与える影響について、鋳型ＤＮＡに由来するバンドを検出することにより測定した。
鋳型ＤＮＡとして配列番号１に示されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを使用した。試料液として超純水、水道水、河川の上流域の水、河川の中流域において採取場所の異なる水Ａ及び水Ｂ、並びに河川の下流域において採取場所の異なる水Ａ及び水Ｂをまず用意し、これらの試料液のそれぞれに鋳型ＤＮＡを１５０ｐＭ及びＬａをゼロ、２μｍ、６μＭの各濃度になるように添加し、反応液を調製した。その反応液を３７℃で１時間インキュベートした。
次に、試験例１に記載の方法に従い、上記インキュベート後の反応液にＰＣＲ反応試薬を添加することによりＰＣＲ反応を行い、その後にアガロースゲル電気泳動によりバンドの検出を行った。尚、分子量マーカーとしてニッポンジーン社製のGene Ladder100を使用した。図８（ａ）は、超純水を除く各試料液における主なイオンの組成について示す。反応液の調製において超純水、水道水、又は河川の上流域の水を使用した場合の電気泳動写真を図８（ｂ）に示す。反応液の調製において河川の中流域の水Ａ又はＢ若しくは河川の下流域の水Ａ又はＢを使用した場合の電気泳動写真を図８（ｃ）に示す。
図８（ｂ）及び図８（ｃ）に示されるように、いずれの反応液を使用した場合も、Ｌａの濃度が同じであれば、５００ｂｐのバンドの消失量に差がないことが確認された。したがって、希土類イオンによるＰＣＲ反応の撹乱は、反応液中に存在する無機イオンの影響を受けにくいことが確認された。つまり、本発明の希土類イオンの検出方法により、自然界に存在する希土類イオンの検出の可能性も示唆される。
Claims (13)
- 試料中の希土類イオンを検出する方法であって、
前記試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程と、
前記試料を鋳型ＤＮＡに接触させる工程と同時又はその後に、前記鋳型ＤＮＡを用いてプライマーの存在下でＰＣＲ反応を行う工程と、
前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程と
からなることを特徴とする方法。 - 前記希土類イオンは、原子番号５７番〜７１番のランタノイド（但し、６１番のＰｍを除く）、原子番号２１番のＳｃ、及び原子番号３９番のＹから選ばれる少なくとも一種である、請求項１に記載の方法。
- 前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程では、希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるのと同じＤＮＡ断片が減少若しくは消失するのを検出するか、又は希土類イオンの非存在下で同じＰＣＲ反応が行われた場合に検出されるＤＮＡ断片とは異なる大きさのＤＮＡ断片を検出し、それにより、前記試料中の希土類イオンの有無又は濃度を決定する、請求項１又は請求項２に記載の方法。
- 前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程は、リアルタイムＰＣＲを用いて行われる、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程は、
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動法及びアクリルアミドゲル電気泳動法の少なくともいずれか一方を用いて分離する工程と、
前記分離されたＤＮＡ断片を検出する工程と
からなる、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程は、増幅されたＤＮＡ断片が発光、蛍光、着色及び放射性の少なくともいずれか一つを生じるプローブ導入反応を用いて行われる、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブ導入反応は、インターカレータ試薬及びシアニン系蛍光試薬の少なくともいずれか一方を用いて行われる、請求項６に記載の方法。
- 前記鋳型ＤＮＡは、配列番号１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーは、配列番号２に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドプライマーと配列番号３に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対からなる、請求項８に記載の方法。
- 前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程では、アガロースゲル電気泳動法及びアクリルアミドゲル電気泳動法の少なくともいずれか一方によって求められる塩基対の大きさが１００ｂｐ以下のＤＮＡ断片を検出する、請求項９に記載の方法。
- 前記試料は、上下水道、河川、湖沼、海又は土壌から採取したものである、請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の方法に用いられる希土類イオン検出用キットであって、
鋳型ＤＮＡ、プライマー、及び核酸増幅用試薬を含んでなることを特徴とする希土類イオン検出用キット。 - 前記核酸増幅用試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ混合液、及び核酸増幅反応バッファを含んでなる、請求項１２に記載の希土類イオン検出用キット。
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